CN1561396A - 调节病毒载体所携带的基因的表达的方法 - Google Patents

Abstract

本发明的发明者揭示了非甾体类抗炎药物和肌肉松弛剂可抑制病毒载体上所携带的基因的表达。这些制剂也抑制病毒载体的细胞毒性。本发明提供了一种方法，该方法通过使用非甾体类抗炎药物和/或肌肉松弛剂调节病毒所携带的基因的表达。这些制剂的效果是可逆的，并且在停止给药后病毒载体的基因表达和细胞毒性都会增强。本发明的制剂对于调节病毒基因和治疗性基因的表达，以及在采用病毒载体的基因治疗中抑制病毒载体的细胞毒性是有用的。

Description

调节病毒载体所携带的基因的表达的方法

技术领域

本发明涉及一种方法，该方法通过使用非甾体类抗炎药物及诸如此类的药物，来调节病毒载体上所携带的基因的表达。

背景技术

病毒载体已被应用于许多基因转移的方法，包括基因治疗，因为它们能将基因高效转入细胞中，并因此有助于转入基因的高表达。但是，目前不知道哪些方法可用于调节通过病毒载体转入细胞的基因的表达。开发用于调节病毒载体所携带的基因的表达，或是用于降低其细胞毒性的方法，是令人期待的。

Chen等报告了阿司匹林(aspirin)抑制水泡性口炎病毒(VSV)的复制(Chen，N.等.，Virology 276，44-51(2000))。但是，Chen等并没有揭示阿司匹林对于VSV病毒上所携带的基因的表达的影响。同样地，Chen等没有建议应用阿司匹林来调节基因转移中所用载体上所携带的基因的表达，也没有检验去除阿司匹林时，是否可能可逆地调节病毒复制。

在近几年里，病毒的基因操作已经促进了能在肿瘤细胞中增殖、但在正常组织中无致病性的增殖型病毒载体的发展。在这些增殖型病毒中，单纯疱疹病毒(HSV)，腺病毒和呼肠孤病毒正引起关注。免疫基因治疗和自杀基因治疗作为提高增殖型病毒充当基因表达载体的效果的方法正在吸引关注。另有人研究了组织特异性启动子在提高增殖型载体的特异性方面的用途(Fujidou，N.，Gene diagnosis and therapy for brain tumors，Front line genetherapy research，Brain tumor treatment using multipliable viral vectors，Nounokagaku(Brain Science)，Vol.23，No.5,379-387,2001)。作为一种载体，HSV的特点在于它可以瞬时表达目的基因，并且可以转染进非分裂细胞，如神经细胞。HSV载体引起关注是因为它使以下各项成为可能：1)应用HSV破坏细胞的能力；2)使用攻击特定肿瘤细胞的肝癌细胞特异性改良HSV病毒株；3)使用缺失型HSV病毒株，该病毒株使用扩增子质粒和辅助HSV(Miyatake，S.，Development and prospects of viral vectors used for gene therapy，Herpes Simplex Virus as a vector for gene therapy，Virus，Vol.47，No.2239-246，1997)。

病毒载体如单纯疱疹病毒、腺病毒和呼肠孤病毒的优点是可被积极地应用于细胞毒治疗中。但是，没有细胞就不能生产出这些载体，并且因此，当为了医学应用而大量生产时因为培养细胞不能提供充足数量的这些病毒，它们的优点就成了缺点。如果在细胞培养过程中可以使用调节细胞毒性的药物，那么添加药物有望产生病毒。

发明内容

本发明提供了一种方法，该方法使用非甾体类抗炎药物(NSAID)或/和肌肉松弛剂来调节病毒载体上所携带的基因的表达。本发明也提供了调节病毒载体上所携带的基因的表达的制剂。本发明人深入研究了将不同药物应用于哺乳动物(包括人)对病毒载体所携带的基因表达的影响。令人惊讶的是，研究结果显示NSAID和肌肉松弛剂具有显著抑制病毒载体所携带的基因的表达的活性。在转染有病毒载体的细胞中，显示此载体所携带的基因的表达被所有试验的NSAID显著抑制，包括阿司匹林、酮洛芬(ketoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、双氯芬酸(diclofenac acid)和甲芬那酸(mefenamic acid)。罂粟碱(papaverin)，一种平滑肌松弛剂，也强烈抑制病毒载体所携带的基因的表达。

这些制剂对由载体转移造成的细胞毒性的影响作用，可以在已被病毒载体转移的细胞中检测。结果表明，在这些细胞中，阿司匹林、酮洛芬、氟比洛芬以及吲哚美辛在减少细胞损伤上非常有效。在上述药物中，阿司匹林和酮洛芬在抑制细胞毒性方面尤其有效。

对于病毒载体携带基因的表达抑制的深入研究揭示出，阿司匹林的抑制作用是暂时的，在停止用药后的几天内消失。这说明给药本发明的制剂，可以可逆调节病毒载体携带基因的表达，或调节病毒载体的细胞毒性。因此，当调节不再是必需的时候，对本发明制剂的给药可以停止，继而病毒载体表达的调节作用可以被逆转。按要求停止使用该制剂，病毒载体携带基因的表达可以恢复。因此，采用本发明，可以实现对病毒载体所携带的基因的表达进行的动态调节。

本发明的药物可以快速调节病毒载体所携带的基因，如在临床安排(如基因治疗)中由病毒载体转移的治疗性基因的表达水平和细胞毒性。本发明涉及一种使用非甾类抗炎症药物(NSAID)和/或肌肉松弛剂调节病毒载体所携带的基因的表达的方法，还涉及调节病毒载体所携带的基因的表达的药物。更具体地，本发明涉及：

(1)一种抑制病毒所携带的基因的表达的方法，包括将非甾类抗炎症药物和/或肌肉松弛剂与被该病毒载体转染的细胞相接触的步骤；

(2)(1)的方法，其中病毒载体的细胞毒性被减弱；

(3)(1)的方法，其中的非甾类抗炎症药物是从包括阿司匹林、酮洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、双氯芬酸和甲芬那酸的组群中选出来的；

(4)(3)的方法，其中的非甾类抗炎症药物是从包括阿司匹林、酮洛芬、氟比洛芬和吲哚美辛的组群中选出来的；

(5)(4)的方法，其中的非甾类药物是阿司匹林和/或酮洛芬；

(6)(1)的方法，其中的肌肉松弛剂是罂粟碱；

(7)(1)～(6)的任一个方法，其中病毒载体是负链RNA病毒载体；

(8)(7)的方法，其中的负链RNA病毒是副粘病毒；

(9)(8)的方法，其中的副粘病毒是仙台病毒；

(10)一种抑制病毒载体所携带的基因的表达的制剂，其中该制剂包括非甾体抗炎症药物和/或肌肉松弛剂；和

(11)(10)的制剂，其中该制剂具有减弱该病毒载体细胞毒性的能力。

本发明提供了用于调节病毒载体所携带的基因的表达的方法。特别是，本发明的方法包括将NSAID和/或肌肉松弛剂与被病毒载体转染的细胞相接触的步骤。NSAID和/或肌肉松弛剂没有限制，所需NSAID和/或肌肉松弛剂可以单独使用或多重混合。

术语“非甾类抗炎症药物”(NSAID)是一般性术语，指除甾类外的一类具有抗炎症作用的药物，也称“阿司匹林类药物”(Goodman & Gilman′s ThePharmacological Basis ofTherapeutics，p.775)。特别是，酸性NSAID已知可以抑制前列腺素生物合成(Vane，J.R.and Botting，R.，FASEB J.1，89-96(1987)；Vane，J.R.，Nat.New Biol.231(25)，232-235(1971))。NSAID包括，例如水杨酸型(阿司匹林盐诸如水杨酸、阿司匹林以及阿司匹林DL赖氨酸、二磺酰基)，烯丙基乙酸型(吲哚美辛、双氯芬酸、舒林酸(sulindac)、萘丁美酮(nabumetone)、丙谷炎痛(progulumethacin)、法呢基吲哚美辛以及依托度酸(etodolac))，丙酸型(布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、氟比洛芬、噻洛芬(tiaprofen)、普拉洛芬(pranoprofen)、洛索洛芬(loxoprofen)、aluminoprofen以及酮洛芬)，灭酸(fenamic acid)型(甲芬那酸、甲苯灭酸(tolufenamic acid))，吡唑啉酮型(苯基保泰松(phenylbutazone)、奥芬保泰松(oxifenbutazone))，昔康(oxicam)-型(吡罗昔康(piroxicam)、替诺昔康(tenoxicam)以及安吡昔康(ampiroxicam))。非酸型NSAID包括，但不限于，依匹唑(epirizole)、噻拉米特(tiaramid)以及依莫法宗(emorfazone)。本发明中使用的NSAID优选酸型NSAID，更优选的NSAID包括阿司匹林、酮洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、双氯芬酸(包括双氯芬酸钠)以及甲芬那酸；甚至更优选NSAID包括阿司匹林、酮洛芬、氟比洛芬以及吲哚美辛；特别优选NSAID包括阿司匹林以及酮洛芬。

本发明使用的肌肉松弛剂包括，但不局限于，例如，骨骼肌松弛剂(筒箭毒碱(tubocurarine)、琥珀胆碱(suxamethonium)、decamethonium以及丹曲林(dantrolene))以及平滑肌松弛剂(罂粟碱、利托君(ritodrne)、特布他林(terbutaline)以及硫酸镁)。本发明中优选使用的肌肉松弛剂包括平滑肌松弛剂。特别包括，用作平滑肌松弛剂的鸦片碱(opium alkaloid)，优选异喹啉衍生物如罂粟碱。

上面提到的NSAID和/或肌肉松弛剂也可以采用盐的形式(如钠盐)、水合物、复合物等等。另外，它们的异构体、类似物、衍生物以及其中的酯类也包括在内。本发明的制剂可用作在被病毒转染的细胞内抑制该病毒载体所携带基因的表达的试剂及药品，或药品原料。这些制剂还可用作减弱病毒载体的细胞毒性的试剂及药品，或药品原料。

在本发明的方法中，NSAID和/或肌肉松弛剂与被病毒载体转染的细胞相接触，以便抑制病毒载体所携带的基因在细胞中的表达。这种接触可以先于、同时、或后于病毒载体对细胞的转染。所有这些实施方案都包括在本发明中。病毒载体所携带的基因在用该病毒载体转染的细胞中的表达，可以通过使本发明制剂与这些细胞接触来抑制。

在本发明中，“病毒载体所携带的基因”是指通过该载体转入细胞的基因。这些基因包括所有转入细胞的基因，如插入载体用来在细胞中表达的基因，来源于病毒载体的病毒基因，以及可能由该载体携带的标记基因。而且，术语“基因”是指遗传物质，包括核酸如RNA和DNA。基因可以编码或不编码蛋白，也可以编码功能性RNA如核酶或反义RNA。基因可以来源于天然序列或人工构建的序列。在本发明中，术语“DNA”包括单链和双链DNA。

本发明的方法适用于调节具体病毒载体中编码的外源基因的表达。例如，本发明的方法可以用于抑制能表达外源基因的病毒载体所转染的细胞中外源基因的表达。例如，在利用病毒载体进行基因治疗时，如果治疗基因的高表达可能造成不希望的副作用，可以使用本发明的方法抑制治疗基因的表达。外源基因没有限制，例如包括编码生物活性蛋白的基因，它们在载体转移后可在宿主细胞中发挥功能，尤其是如细胞因子/趋化因子、激素、酶、可溶性受体以及抗体片断。

本发明的方法也能抑制病毒载体所拥有的病毒基因的表达。已知许多由病毒基因表达的蛋白在转染后的细胞中表达时可诱导细胞损害。使用本发明的方法，通过抑制这些载体所拥有的基因的表达来降低病毒载体的细胞毒性是可能的。如上所述，基于单纯疱疹病毒、腺病毒和呼肠孤病毒的病毒载体都具有细胞毒性。本发明可用于抑制由这些病毒载体引起的细胞损伤。

本发明的方法可用于抑制所希望使用的病毒载体上所携带的基因的表达。在本发明的应用中优选可感染哺乳动物细胞的病毒载体。这些载体包括，例如，逆病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺伴随病毒载体。优选地，它们包括单纯疱疹病毒载体、腺病毒载体、逆病毒载体、塞姆利基森林病毒、新培斯病毒载体、痘苗病毒载体和禽痘病毒载体。最优选地，它们包括但不限于负链RNA病毒载体例如狂犬病毒载体、麻疹病毒载体和仙台病毒载体。此外，如上所述，细胞毒性病毒载体适合于在本发明中使用。本发明提供了减少由病毒载体引起的细胞损伤的方法，包括将NSAID和/或肌肉松弛剂与通过病毒载体转染的细胞相接触的步骤。包括NSAID和/或肌肉松弛剂的制剂可用作降低由病毒载体引起的细胞毒性的制剂。

在本发明中，“负链RNA病毒”是指一种RNA病毒，其基因组由一条负(负)链组成。负链RNA病毒包括，例如，副粘病毒科(Paramyxoviridae)的仙台病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、牛瘟病毒和犬瘟病毒(distemper virus)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)中的流感病毒；以及棒状病毒科(Rhabdoviridae)中的水泡性口炎病毒和狂犬病毒。上述提及的病毒中，本发明优选的负链RNA病毒载体是非分节段(即，单链)的负链RNA病毒，更优选副粘病毒。

在这里，“副粘病毒”定义为属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)的病毒，或其衍生物。副粘病毒是一组包含非分节段的负链RNA作为基因组的病毒，包括副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)(包括呼吸道病毒属(也叫副粘病毒属)、Rubravirus属和麻疹病毒属)以及肺病毒亚科(Pneumovirinae)(包括肺病毒属和Metapneumovirus)。可用于本发明的副粘病毒包括，例如，仙台病毒、新城疫病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、牛瘟病毒、犬瘟病毒、猴副流感病毒(SV5)，以及1、2和3型人副流感病毒。本发明的副粘病毒优选属于副粘病毒亚科(呼吸道病毒属、Rubravirus属和麻疹病毒属)的病毒，更优选属于呼吸道病毒属(也叫副粘病毒属)或其衍生物的病毒。尤其优选应用于本发明的呼吸道病毒属的病毒是，例如，1型人副流感病毒(HPIV-1)、3型人副流感病毒(HPIV-3)、3型牛副流感病毒(BPIV-3)、仙台病毒(即已知的1型鼠副流感病毒)、10型猴副流感病毒(SPIV-10)等。最优选应用于本发明的副粘病毒是仙台病毒。这些病毒可以是天然病毒株、野生型病毒株、突变病毒株、实验室传代病毒株、人工构建病毒株，以及如前所述。本发明的方法也可抑制不完整病毒(如DI颗粒)上所携带的基因的表达(J.Virol.68，8413-8417(1994))。

在本发明的“负链RNA病毒载体”是指一种源自负链RNA病毒并将基因转入宿主细胞的载体。载体是一种用来将基因转移到细胞中的运输体。采用本发明的方法，能够复制的和缺乏复制能力的负链RNA病毒载体上所携带的基因的表达，都可被抑制。本发明的方法可被用于抑制病毒载体在细胞(被能够复制的具体负链RNA病毒载体转染)中的复制。因此，病毒载体的过度增殖和传播可被抑制。

按照本发明的方法，病毒载体上所携带的基因的表达可被可逆地抑制。因此病毒载体的基因表达和由病毒载体引起的可能的细胞损伤，可以在本发明的制剂与转染细胞接触的时期中得到抑制。当停止应用该制剂时，这一抑制作用解除。本发明的方法在体内和体外(包括来自体内)都可应用。对于体内应用，本发明的制剂可通过给药到体内而与病毒转染的细胞接触。给药途径没有限制，只要制剂能与病毒转染的细胞接触。例如，根据活性成分的特性，给药可以是口服的、透皮的、鼻内的、支气管内的、肌肉的、腹腔的、静脉的、关节内的或皮下的。在体外(包括来自体内)应用中，是加入本发明的制剂使其与靶细胞接触。例如，可将制剂加到细胞培养基中。

所应用的制剂浓度并无特别限制而且可根据制剂及其盐的类型、给药途径等等适当地确定。一般而言，希望制剂抑制病毒载体上所携带的基因表达的效果是依赖于制剂量的。一些制剂的高剂量可能导致细胞毒性，但本领域技术人员可根据制剂类型和使用目的调整浓度和给药量。例如，当口服阿司匹林时，0.5～1.5g/剂以及1.5～4.5g/天是给药的标准剂量。优选不超过估计毒性限300mg/Kg(LD₅₀ 1750m/kg的1/6)。

本发明可没有任何限制地应用于任何目标个体，只要其可以用病毒载体进行转染。举例来说，目标可以包括哺乳动物和鸟类，包括小鸡、鹌鹑、小鼠、大鼠、狗、猪、猫、奶牛、兔、绵羊、山羊、猴子和人类。当本发明采用体外(包括来自体内)的方法时，应用目标包括如人、非人哺乳动物以及鸟类。当本发明采用体内方法时，非人哺乳动物和鸟类是具体目标。

本发明提供可以调节病毒载体携带基因的表达的制剂。具体地，本发明提供制剂(包括NSAID和/或肌肉松弛剂)来抑制病毒载体所携带的基因的表达。本发明的制剂可以是单独的NSAID和/或肌肉松弛剂，或是它们与无菌水、生理盐水、缓冲液、盐、稳定剂、保存剂、表面活性剂等等的组合物。这些组合物可以在用前混合，也可以在使用当时混合。本发明的制剂可以按照已知的药学方法来配制。例如，本发明的制剂可以通过将其与药物学上可接受的载体或赋形剂混合来配制，所述载体或赋形剂具体有无菌水、生理盐水、植物油、乳化剂、混悬剂、表面活性剂、稳定剂、缓释制剂等等。本发明的制剂可以制备成溶液、粉剂、细粒剂、颗粒剂、片剂、包衣片、胶囊、锭剂(troche)、口含片(buccal tablet)、酏剂(elixir)、混悬剂、糖浆、滴鼻剂、吸入剂、软膏、贴剂、栓剂等等。这些配制剂中的NSAID和/或肌肉松弛剂的量可适当确定。

例如，为配制口服药，可以根据需要将赋形剂、粘合剂、分解剂、润滑剂、着色剂、或调味剂和芳香剂加入一种或多种NSAID和/或肌肉松弛剂中，随后配制成为粉末、细粒剂、颗粒剂、片剂、包衣片剂和/或胶囊。

赋形剂的实例包括乳糖、玉米淀粉、蔗糖、葡萄糖、甘露醇、山梨醇、结晶纤维素以及二氧化硅。粘合剂的实例包括聚乙烯醇、聚乙烯醚、甲基纤维素、乙基纤维素、阿拉伯树胶、黄芪胶、明胶、羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素，和聚乙烯吡咯烷酮。分解剂包括，例如玉米淀粉、琼脂、明胶粉、结晶纤维素、碳酸钙、碳酸氢钠、柠檬酸钙、糊精以及果胶。润滑剂包括，例如硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇、硅石以及植物油等。有很多已知的可加入药品的着色剂、调味剂和芳香剂。这些药品可以为药片、微胶囊、颗粒、或者例如被糖或其它材料包衣的形式。

用于注射的组合物可按常规方法，通过将主药与pH调节剂、溶剂或等渗剂相混合来配制，可以根据需要与助剂、或稳定剂等混合。用于配制的原料可以包含通常用于药品、加药化妆品、化妆品等的原料。具体地，使用的原料包括，例如动物油、植物油、矿物油、酯油、蜡、高级乙醇、脂肪酸、硅油、表面活性剂、磷脂、醇、多元醇、可溶性高分子、粘土矿，以及纯水。此外，可按需加入添加剂，其包括但不限于pH缓冲液、抗氧化剂、螯合剂、抗菌剂、杀真菌剂、着色剂以及调味剂。

本发明的制剂可以采用所需给药途径来给药，例如口服、经皮、鼻内、支气管、肌肉、腹腔、静脉、关节内、或皮下，如上所述。所述制剂还可以全身给药或局部给药。制剂的剂量和给药方法可以变化，取决于药物组合物中活性成分造成组织转变的能力、处理的目的、以及受试者(例如病人)的体重和年龄。合适的剂量和给药方法可以由本领域技术人员选择。给药可以进行一次或多次。可以将本发明制剂应用于所需培养细胞和个体。目标个体和细胞可以来源于任何哺乳动物(包括人、猴、小鼠、大鼠、兔、绵羊、奶牛和狗)，以及其它脊椎动物。特别是，本发明的制剂可用于在采用病毒载体的人类基因治疗中，调节病毒所携带的基因的表达。本发明的制剂还可用于可逆地抑制病毒载体所携带的基因的表达。

在一种特别适宜的给药中，可以将本发明制剂给药于皮下，或直接给药于角质以下或邻近部位。可以将制剂配制成能控制载体的局部、经皮表达水平的经皮吸收药。经皮吸收药可以是软膏、泥敷剂(catalpasm)和粘带(tape)等。通常与药物和化妆品混合的成分，优选作为基材、助剂或赋形剂，通过混合来制备经皮吸收的药物。例如，这些药物也可以采用泥敷剂的形式，其主成分是一种可以在水中膨胀的聚合物，如粘性树脂(多萜类树脂、烃类树脂等等)、天然或合成的橡胶(聚异丁烯、苯乙烯-丁烯、苯乙烯-异戊二烯、苯乙烯-乙烯-丁烯、1，4-聚异戊二烯等)或半乳甘露聚糖。聚乙二醇和脂肪酸酯也可以混合。脂肪酸酯包括，如乙基油酸酯、异丙基肉豆蔻酸酯、异丙基棕榈酸酯、丁基硬脂酸酯、肉豆蔻基豆蔻酸酯、辛基十二烷基肉豆蔻酸酯、胆甾醇硬脂酸酯和二异丙基己二酸酯。聚乙二醇包括，如聚乙二醇200、聚乙二醇300、聚乙二醇400、聚乙二醇600、聚乙二醇1000、聚乙二醇1500、聚乙二醇1540和聚乙二醇4000。如有必要，这些复合物可包含吸收聚合物。例如，吸收聚合物优选在水中能吸收自重的十倍或更多重量，可膨胀并成为凝胶。吸收聚合物优选微粉末，包括羧甲基纤维素及其金属盐类、羧甲基聚合物等等(其中引入少量交联)，聚丙烯酸及其金属盐类，钠盐，羧甲基化聚乙烯醇，或皂化淀粉接枝的丙烯腈的金属盐类。

附图说明

图1显示了用于评价制剂的SeV基因的结构。

图2显示了SeV基因转录和复制的阿司匹林浓度依赖性抑制。LLC-MK2细胞以MOI＝3的SeV18+SEAP/ΔF-GFP感染，感染两天后按记录的浓度加入阿司匹林，每两天在回收的培养基中测量SeV基因转录的阿司匹林浓度依赖性抑制。图2(A)显示了HA活性，这反映了病毒颗粒数。图2(B)显示了LDH释放的量，这反映了细胞毒性。图2(C)显示了SEAP活性变化的时间进程，这反映了病毒所携带的基因的表达水平。

图3显示了荧光显微照片，这反映了加入阿司匹林四天和六天后的GFP表达量和细胞损伤度。LLC-MK2细胞以MOI＝3的SeV18+SEAP/ΔF-GFP感染，感染两天后按记录的浓度加入阿司匹林。

图4显示了Western印迹分析的照片。分析是这样进行的，以MOI＝3的SeV18+SEAP/ΔF-GFP感染LLC-MK2细胞，在感染两天后加入阿司匹林，然后在加入阿司匹林的两天、四天和六天后离心回收的培养基。Western印迹分析采用(A)抗M的抗体和(B)主要识别NP的DN-1抗体在回收的病毒颗粒上进行操作。图4(C)显示了采用抗M的抗体、DN-1抗体和抗G3PDH的抗体进行细胞的Western印迹分析，该细胞是加入阿司匹林六天后获得的。

图5显示了回收的病毒颗粒采用抗M抗体进行Western印迹的定量结果，所述病毒颗粒是在SeV18+SEAP/F-GFP以MOI＝3感染LLC-MK2细胞，感染两天后加入阿司匹林，然后在加入阿司匹林两天、四天和六天后回收培养基并离心而获得的。

图6显示了在回收的培养基中HA活性的变化，培养基是在以MOI＝3的SeV18+SEAP/ΔF-GFP感染LLC-MK2细胞、感染两天后加入5mM阿司匹林、然后每两天加入新鲜培养基而回收的，该新鲜培养基或者含有5mM阿司匹林，或者无阿司匹林(阿司匹林处理时间长度：0、2、4、6和8天)。

图7显示了在回收的培养基中LDH释放量的变化，培养基是在以MOI＝3的SeV18+SEAP/ΔF-GFP感染LLC-MK2细胞、感染两天后加入5mM阿司匹林、然后每两天加入新鲜培养基而回收的，该新鲜培养基或者含有5mM阿司匹林，或者无阿司匹林(阿司匹林处理时间长度：0、2、4、6和8天)。

图8显示了在回收的培养基中SEAP活性变化的时间进程，培养基是在以MOI＝3的SeV18+SEAP/ΔF-GFP感染LLC-MK2细胞、感染两天后加入5mM阿司匹林、然后每两天加入新鲜培养基而回收的，该新鲜培养基或者含有5mM阿司匹林，或者无阿司匹林(阿司匹林处理时间长度：0、2、4、6和8天)。

图9显示了反映GFP表达和细胞损伤的荧光显微照片，这是经过周期性观察获得的。以MOI＝3的SeV18+SEAP/ΔF-GFP感染LLC-MK2细胞，感染两天后加入5mM阿司匹林，然后每两天加入含有5mM阿司匹林或者无阿司匹林的新鲜培养基(阿司匹林处理时间长度：0、2、4、6和8天)。GFP表达量和细胞损伤度通过荧光显微镜检周期性地进行观察。

图10显示了在回收的培养基中HA的活性和LDH的释放量。以MOI＝3的SeV18+SEAP/ΔF-GFP或SeV18+/ΔF-GFP感染LLC-MK2细胞，感染两天后按照记录的浓度加入阿司匹林、酮洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、双氯芬酸钠、甲芬那酸或者罂粟碱。每两天测量回收的培养基中HA的活性及LDH的释放量。图10在图11处继续。

图11显示了在回收的培养基中HA的活性和LDH的释放量。以MOI＝3的SeV18+SEAP/ΔF-GFP或SeV18+/ΔF-GFP感染LLC-MK2细胞，感染两天后按照记录的浓度加入阿司匹林、酮洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、双氯芬酸钠、甲芬那酸或者罂粟碱。每两天测量回收的培养基中HA的活性及LDH的释放量。图11从图10处继续。

图12显示了在回收的培养基中HA的活性和LDH的释放量。以MOI＝3的SeV18+SEAP/ΔF-GFP感染LLC-MK2细胞，感染两天后按照记录的浓度加入异山梨醇二硝酸酯(ISDN)或者尼可地尔(nicorandil)。每两天测量回收的培养基中HA的活性及LDH的释放量。

图13显示了在回收的培养基中HA的活性和LDH的释放量。以MOI＝3的SeV18+SEAP/ΔF-GFP感染LLC-MK2细胞，感染两天后加入5mM阿司匹林或1mM酮洛芬，然后立即加入L-NAME。每两天测量回收的培养基中HA的活性及LDH的释放量。

实行本发明的最佳模式

本发明参考以下实施例进行具体举例说明，但不应理解为仅限于这些。另外，说明书各处提到的参考文献都引入作参考。

[实施例1]通过添加阿司匹林抑制SeV转录和复制

阿司匹林(乙酰水杨酸)首先被选作最典型的NSAID。对阿司匹林是否影响仙台病毒(SeV)的增殖(转录和复制)进行了检测。评估是从表达调节而不是抗病毒效果的角度进行。因此，阿司匹林(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，Osaka，Japan)在SeV感染两天后加入，此时病毒已经增殖到一定程度。

LLC-MK2(猴肾细胞)以5×10⁵细胞/孔的浓度接种至6孔板中，接着培养在包含10％胎牛血清(FBS：BioWhittaker，Walkersville，MD)的MEM(Gibco-BRL，Rockville，MD)培养基上，在5％CO₂孵箱中37℃培养24小时。细胞用PBS洗，然后用MOI＝3分F-缺失型SeV感染，该SeV编码分泌型碱性磷酸酶(SEAP)和绿色荧光蛋白(GFP)基因(SeV18+SEAP/ΔF-GFP：图1)。F-缺失型SeV通过Li.等(Li，H.-O.等.，J.Virology 74，6564-6569(2000)，WO00/70070)描述的方法来制备。感染以后，细胞培养继续在无血清的MEM培养基上进行。感染两天以后，该培养基用含有0.625、1.25、2.5和5mM阿司匹林或无阿司匹林的MEM培养基(无血清)替换。每两天收集每一培养物的培养基，用含有同样内容的新鲜培养基替换。测定血红素凝集活性(HA活性)作为病毒粒子形成的指示；测定乳糖脱氢酶(LDH)的量作为细胞损伤的指示；测定SEAP活性作为该载体所携基因的表达水平的指示。

GFP表达水平和细胞损伤也可采用荧光显微镜检定时地观察。

HA活性采用Kato等.，(Kato，A.等.，Genes Cells 1，569-579(1996))描述的方法来测定。也就是说，含有病毒的培养基在96圆底孔板中进行两倍系列稀释，这样使得每孔中包含50μl样品。50μl贮存的鸡血(COSMO BIO Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)，用PBS稀释至1％后加入每孔中，混合。混合物在4℃孵育1小时。观察红细胞凝集，通过挑选仍可观察到凝集的最高病毒稀释度来计算HA活性。因认为1HAU相当于1×10⁶病毒，故用病毒数表示实验值。通过病毒粒子形成的减少(图2(A))显示，添加5mM阿司匹林抑制了HA活性的增长，。LDH定量通过细胞毒性检测试剂盒(Roche，Basel，Switzerland)按照试剂盒中的方法进行。观察到了LDH释放的阿司匹林浓度依赖性降低。在细胞培养中几乎没有观察到细胞损伤，尤其是那些含有5mM阿司匹林者(图2(B))。SEAP活性用Reporter Assay Kit-SEAP(TOYOBO，Osaka，Japan)按照试剂盒方法测量。也观察到SEAP活性的阿司匹林浓度依赖性降低。最显著的活性降低可见于含5mM阿司匹林的培养物(图2(C))。

在添加阿司匹林的四和六天后(分别在SeV感染的六和八天后)获取荧光显微照片，见图3。GFP表达和细胞损伤的阿司匹林浓度依赖性降低得以确定。加入5mM阿司匹林的效果是显著的。

病毒蛋白用Western印迹进行半定量分析，以便从另一个视角评价转录和复制水平。分析了与上述相同的样品。也就是说，LLC-MK2细胞用SeV18+SEAP/ΔF-GFP以MOI＝3感染，阿司匹林在感染两天后加入，在阿司匹林加入后每隔两天收集培养基，在加入阿司匹林六天后(感染八天后)收集细胞。培养基在48,000g离心45分钟以回收病毒蛋白，细胞直接用细胞刮来回收。病毒蛋白通过SDS-PAGE及接着的Western印迹来检测，使用主要识别NP蛋白的抗-M抗体和DN-1抗体(都是兔多克隆抗体)。Western印迹如下进行：从6孔板的一个孔中收集细胞(贮存于-80℃)，从培养基中得到病毒蛋白，将它们溶于1×稀释的100ul SDS-PAGE样品缓冲液中(RedLoading Buffer Pack；New England Biolabs，Beverly，MA)。样品在98℃热处理十分钟。离心后，10ul上清液加在SDS-PAGE凝胶(Multigel 10/20；DaiichiPure Chemicals Co.，Ltd，Tokyo，Japan)上，电泳在15mA进行2.5小时。病毒蛋白通过半干法在转移至PVDF膜(Immobilon PVDF transfer membrane；Millipore，Bedford，MA)，条件是100mA转移1小时。转移后的膜接着用封闭液(Block Ace；Snow Brand Milk Products Co.，Ltd，Sapporo，Japan)于4℃封闭1小时。杂交是与第一抗体溶液4℃保温过夜，所述第一抗体含10％BlockAce和1∶4,000稀释的抗-M抗体或1∶1,000稀释的DN-1抗体。膜用含0.05％Tween20的TBS(TBST)洗3次，用TBS洗3次，然后用第二抗体溶液室温杂交1小时，所述第二抗体溶液中含10％BlockAce和1∶5,000稀释的HRP结合抗兔IgG抗体(Anti-rabbit IgG(Goat)H+L coni.；ICNP，Aurora，OH)。膜用TBST洗3次，然后用TBS洗3次，然后用化学发光法检测蛋白(ECLWestern印迹detection reagents；Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)。结果表明，在培养基和感染细胞中的病毒蛋白都减少了(图4)。另外，用抗-M抗体进行半定量分析(图5)与HA活性分析(图2(A))结果较一致。因此，可以得出结论，加入阿司匹林确实可以抑制SeV的转录和复制。

[实施例2]阿司匹林处理时间对抑制SeV转录和复制的活性的影响

对阿司匹林处理不同时间长度时，病毒增殖的差异进行了检测，从而分析其对SeV转录和复制的抑制是否受阿司匹林处理时间长短的影响，也就是分析加入阿司匹林的作用是永久的还是瞬时的。

该实验如实施例1所述进行。也就是，LLC-MK2(猴肾细胞)以5×10⁵细胞/孔的浓度接种至6孔板中，接着在含10％胎牛血清的MEM培养基中，于5％CO²孵箱中37℃培养24小时。细胞用PBS洗，然后用SeV18+SEAP/ΔF-GFP以MOI＝3感染。感染以后，细胞培养继续在无血清的MEM培养基上进行。感染两天以后，加入含5mM阿司匹林的MEM培养基(无血清)。培养基每两天回收一次，并且同时加入含或不含5mM阿司匹林的新鲜培养基。培养物用阿司匹林处理0、2、4、6或8天，然后检测。回收的培养基进行HA活性分析、LDH定量和SEAP活性分析。GFP表达和细胞损伤也用荧光显微镜进行周期性检查。

HA活性的变化(图6)说明在阿司匹林处理时期，HA活性的增加是比较低的，也就是说，病毒粒子的形成被抑制。然而，在阿司匹林处理完两天后，观察到了HA活性的增加和病毒粒子的形成。这一重要发现在于，观察到的该现象与阿司匹林处理时间的长短无关，说明加入阿司匹林引起的作用是瞬时的。LDH的反应比HA晚两天，在阿司匹林处理完成四天后开始增加。因此，LDH释放水平证实了与HA活性同样的现象，说明观察到的这种增加与阿司匹林处理时间长短无关(图7)。LDH与HA反应相比延迟两天，认为是反映了病毒转录和复制的增加(HA活性增加)，与由于细胞损伤导致LDH释放至培养基中，这两个事件之间有时间滞后。HA活性和LDH水平中观察到的敏感变化，在应答阿司匹林处理开始时和结束时的SEAP活性中却没有观察到。然而，在阿司匹林处理后SEAP活性开始降低之后，恢复看起来要花大约六天时间(从处理结束开始)(图8)。

荧光显微镜图像展示于图9。这些结果支持了上述在HA活性、LDH水平和SEAP活性中的改变：在阿司匹林处理期间，GFP表达较低且观察不到细胞损伤，然而，在阿司匹林处理完成之后，GFP表达增加并且可观察到细胞损伤。观察到的这些改变与阿司匹林处理时间长短无关。因此可确定，阿司匹林抑制SeV转录和复制的活性是瞬时的。

[实施例3]除阿司匹林外的NSAID的作用

检测除阿司匹林外的其它制剂抑制SeV转录和复制的活性。所测制剂有，酮洛芬(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，Osaka，Japan)、氟比洛酚(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，Osaka，Japan)、吲哚美辛(Wako PureChemical Industries，Ltd.，Osaka，Japan)、双氯芬酸钠(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.，Osaka，Japan)、甲芬那酸(Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，Osaka，Japan)以及作为平滑肌松弛剂的罂粟碱(Wako Pure ChemicalIndustries，Ltd.，Osaka，Japan)。罂粟碱不包括在NSAID中，但据报道能抑制巨细胞病毒增殖(Albrecht，T.等.，Proc Soc Exp Biol Med 186，41-46(1987))。

该实验如实施例1所述进行：LLC-MK2(猴肾细胞)以5×10⁵细胞/孔的浓度接种至6孔板中，接着在含10％胎牛血清的MEM培养基中，于5％CO2孵箱中37℃培养24小时。细胞用PBS洗，然后用SeV18+SEAP/ΔF-GFP或不编码SEAP的F缺失型SeV(SeV18+/ΔF-GFP)，以MOI＝3感染。感染以后，细胞在无血清的MEM培养基上培养两天，然后在含已记录浓度制剂的MEM培养基(无血清)上培养。培养基每两天收集一次，并用同体积的新鲜培养基替换。对回收的培养基进行HA活性和LDH定量分析。GFP表达和细胞损伤也用荧光显微镜进行周期性检查。

这些结果说明所有测试的制剂都可抑制SeV所携基因的表达。所测制剂总体上可分成三组：(1)酮洛芬，其按照与阿司匹林同样的方式，抑制SeV转录和复制，并减少细胞损伤；(2)氟比洛酚和吲哚美辛，在测试浓度下，其抑制SeV转录和复制，但仅适度减少细胞损伤；(3)双氯芬酸钠、甲芬那酸和罂粟碱，其抑制SeV转录和复制，并增加细胞损伤(图10～11)。这些结果说明，抑制SeV转录和复制可由很多NSAID完成，但作用机制可能不同。既抑制SeV转录和复制又降低细胞毒性的阿司匹林和酮洛芬，被认为在调节SeV携带基因的表达方面具有最有效的特性。其它制剂最终可降低表达，因此它们与阿司匹林和酮洛芬相似，也可用于调节载体所携基因的表达。

[实施例4]对这种作用的机制研究

有一种观点是，NO的抗病毒作用是阿司匹林抑制VSV增殖的作用机制(Chen，N.等.，Virology 276，44-51(2000))。也就是，它认为抑制前列腺素E2的产生是由于抑制环氧合酶(Cox)活性(该酶是NSAID的一个作用位点)，结果导致NO合成酶(NOS)的激活，这又接着导致NO的产生增强，并抑制了VSV转录和复制。还有一种观点认为，在白细胞介素-12对VSV转录和复制的抑制中有NOS的参与(Komatsu，T.等.，Viarology 259，334-341(1999))。因此，检测NSAID对SeV转录和复制的抑制中NO的参与。

检测NO的直接作用，以确定加入NO-相关制剂是否会抑制SeV的转录和复制。然而，加入异山梨醇二硝酸酯(ISDN：Sigma，St.Louis，MO)或尼可地尔(Chugai Pharmaceutical Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)并没有显著抑制转录和复制(图12)。因此，没有观察到NO直接影响抑制。而且，在Sev转录和复制的实际抑制条件中，即已加入了5mM阿司匹林或1mM酮洛芬(图13)的条件中，加入NOS抑制剂L-NAME(DOJINDO LABORATORIES，Kumamoto，Japan)没有观察到抑制的恢复。因此，上述转录和复制的抑制中NO的参与，在本发明的实施例中没有观察到，说明这里包含着不同的机制。

工业应用

本发明提供一种非甾类抗炎症药物和肌肉松弛剂的新用途。这些制剂可调节病毒载体所携带的基因的表达，或抑制病毒载体的细胞毒性。本发明在调节基因治疗过程中，由病毒载体导入的治疗性及病毒基因表达中尤其有用。

Claims (11)

1.一种用于抑制病毒载体所携带的基因的表达的方法，包括将非甾类抗炎症药物和/或肌肉松弛剂与被该病毒载体转染的细胞相接触的步骤。

2.权利要求1的方法，其中病毒载体的细胞毒性被减弱。

3.权利要求1的方法，其中的非甾类抗炎症药物选自阿司匹林、酮洛芬、氟比洛芬、吲哚美辛、双氯芬酸或甲芬那酸。

4.权利要求3的方法，其中的非甾类抗炎症药物选自阿司匹林、酮洛芬、氟比洛芬或吲哚美辛。

5.权利要求4的方法，其中的非甾类药物是阿司匹林和/或酮洛芬。

6.权利要求1的方法，其中的肌肉松弛剂是罂粟碱。

7.权利要求1～6任一个的方法，其中病毒载体是负链RNA病毒载体。

8.权利要求7的方法，其中的负链RNA病毒是副粘病毒。

9.权利要求8的方法，其中的副粘病毒是仙台病毒。

10.一种抑制病毒载体所携带的基因的表达的制剂，其中该制剂包括非甾类抗炎症药物和/或肌肉松弛剂。

11.权利要求10的制剂，其中该制剂具有减弱该病毒载体的细胞毒性的能力。

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