CN1434119A - 间充质干细胞表型的成体干细胞重建造血方法的建立及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用骨髓间充质干细胞表型的成体干细胞重建造血的方法。涉及了具有多系分化潜能的骨髓间充质源干细胞群的分离，联合G－CSF等细胞因子注射重建受超致死剂量Ce137照射后小鼠的造血功能。本发明在国际上首次利用骨髓间充质干细胞表型的成体干细胞群重建经超致死量照射骨髓衰竭动物的造血，并达到长期存活，建立间充质干细胞群联合G－CSF等细胞因子分化造血细胞的方法并可应用于造血障碍性疾病及多种造血细胞肿瘤疾病的治疗，从而为临床骨髓移植提供了新的骨髓移植途径。
Description
本发明涉及具有间充质干细胞表型的成体干细胞的多向分化等细胞生物学领域，通过分离具有多系分化潜能的骨髓间充质源干细胞群联合G-CSF等细胞因子注射建立了一种重建骨髓造血的方法，从而验证了成体干细胞在特定环境下多系分化的体内自体修复模式并提出骨髓移植新策略。
目前，临床上的移植以骨髓、外周动员血、脐血移植为主，而造血干细胞的异体骨髓移植免疫排斥问题、以及外周动员血或脐血移植的造血干细胞质和量等问题都有待于进一步解决和克服，随着对成体干细胞分化机制的认识逐步深入，我们提出成体干细胞为存在于人体组织中具有多系分化潜能亚全能干细胞群，在特定环境下可诱导分化成多种组织细胞。本发明系骨髓间充质源干细胞群分化造血干细胞造血重建自体移植模式，从新生儿、小鼠和兔骨髓，胎儿胰腺中分离出间充质干细胞群，证明其具有多能干细胞的特征，由此进行了骨髓间充质干细胞的体内移植实验。应用具有间充质干细胞表型的成体干细胞成功地重建了受超致死量照射的BALB/C小鼠的造血，并鉴定了重建受体小鼠的供体间充质干细胞造血来源。本发明为成体干细胞群在骨髓移植中新用途。
本发明的目的是在国际上首次利用骨髓间充质干细胞表型的成体干细胞群重建经超致死量照射骨髓衰竭动物的造血，并达到长期存活，建立间充质干细胞群联合G-CSF等细胞因子分化造血细胞的方法并可应用于造血障碍性疾病及多种造血细胞肿瘤疾病的治疗，从而为临床骨髓移植提供了新的骨髓移植途径。
本发明的目的是通过下述方法实现的(图1)：
一、采用液体培养分离，扩增骨髓间充质干细胞，作为供体细胞
(1)取人或动物骨髓，计数细胞，淋巴细胞分离液(Ficoll 1.077g/ml)分离单个核细胞，离心1500转/分，20分钟，取白环以上细胞部分，重悬于RPMI1640培养液(GibcoBRL公司)中，计数细胞，用含DMEM-LG/F12，MCDB-201，2％FCS(GibcoBRL公司)培养液培养，接种浓度为1-2×106/ml。置37℃，5％CO2培养箱培养，一天后换液，弃去非贴壁的细胞，以后每二天全量换液。至培养后第10天，细胞达80％融合，用0.25％胰酶(Sigma公司)消化，输注。
供体细胞的鉴定：将细胞置于有小玻片的3.5cm直径平皿中，37℃，饱和湿度，5％CO2培养12天后取出空气风干，瑞士染色，油镜下观察细胞形态。倒置显微镜下观察，大部分细胞于24小时内即贴壁，表现为成纤维细胞样，具有梭形、多角形等细胞形态。
细胞用2.5％戊二醛固定2小时，经PBS洗净，1％锇酸固定2小时，丙酮梯度脱水，经常规Ep0812包埋，聚合后超薄切片机切片。醋酸铀枸橼酸铅染色，在H-100电子显微镜下观察可见以纤维母细胞为主，特点为长形、梭形细胞，核异染色质少，核仁明显，胞浆中有扩张的粗面内质网、微管、微丝，可见内质网向外分泌微丝。少数细胞胞浆中细胞器少，胞浆少，核仁明显，可能为干细胞。
取各代细胞，消化计数，接种于24孔板内(1×104细胞/孔)，每隔一天取两孔细胞进行计数，计算均值，绘制生长曲线。在细胞生长的对数期，骨髓间充质干细胞倍增时间约为25小时。细胞每传一代细胞数约增长2倍。
(2)将细胞消化，70％冷乙醇4℃固定24小时，10mg/ml PI染色(4℃，避光30分钟)，用流式细胞仪(FACSVantage型)检测，ModFIT软件分析结果。细胞周期分析，发现超过80％的细胞都处于G0/G1期。利用流式细胞仪对培养细胞进行表型测定CD34，HLA-DR为阴性，CD44、CD29、CD13则为阳性。
SA方法证明骨髓间充质干细胞I、III型胶原、vWF因子表达阳性。
(3)测定各代细胞的端粒酶活性，证明其端粒酶高表达。
(4)体外及体内多系诱导分化，当细胞达80％融合时，以5×103/cm2接种于25cm2培养瓶和6cm直径的培养皿，成骨分化体系10-7M地塞米松、10mMβ-磷酸甘油、0.05mM维生素C和10％FCS的IMDM；脂肪分化体系含10-6M地塞米松、0.5mM3-isobutyl-1-methylxanthine(IBMX)、0.1mM维生素C和10％FCS的IMDM。成软骨分化体系DMEM-HG、MCDB、2％FCS、地塞米松10-7M、TGF-β10ng/ml。可成功诱导成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、神经细胞转化。
(5)体外诱导分化的检测，在第4天、第8天、第12天和第16天分别检测钙化小结、脂肪滴、碱性磷酸酶染色、苏丹黑染色、及骨钙蛋白、脂蛋白脂酶等基因的表达，从而鉴定间充质干细胞的成骨和成脂肪分化潜能。阿尔新蓝染色法检测蛋白多糖，免疫组化法检测II型胶原，RT-PCR法检测II型胶原基因表达等，从而鉴定间充质干细胞成软骨分化潜能。
(6)提取培养细胞RNA采用RT-PCR方法检测培养细胞中GATA-1，GATA-2，c-Myb，cKit，PU.1等mRNA的表达，证明至体内注射时均为阴性，培养体系中没有造血干祖细胞污染。
二、体内重建造血的实验研究
将12周受体BALB/C小鼠Ce137全身照射850rad后输入6×106/0.3ml/只经培养后的骨髓间充质干细胞，输注细胞后第1天上、下午各一次肌肉注射G-CSF。观察小鼠的存活情况。
小鼠在输注前查尾静脉血，计细胞总数、涂片、分类，输细胞后每周各取1只小鼠取肝、脾、股骨，固定作病理切片，另外一侧股骨冲出骨髓，计数有核细胞、涂片、测定GM-CFU值。PCR方法鉴定重建小鼠的血细胞来自供体细胞。输全骨髓组外周血有核细胞和骨髓有核细胞数及GM-CFU数在输后的第1，2周都高于单输骨髓间充质干细胞组，但单输骨髓间充质细胞组周血有核细胞恢复较快，小鼠存活好，至输注后第3周，无论周血或骨髓中的有核细胞都较第2周明显恢复，GM-CFU也明显升高，而单输造血细胞和D-hanks液组小鼠存活4-5天死亡。提示，利用骨髓间充质干细胞表型的成体干细胞群可重建经超致死量照射骨髓衰竭动物的造血，并达到长期存活。间充质干细胞群联合G-CSF等细胞因子分化造血细胞的方法可应用于造血障碍性疾病及多种造血细胞肿瘤疾病的治疗，为临床骨髓移植提供了新的骨髓移植途径。
三、具有间充质干细胞表型的骨髓成体干细胞重建造血的应用例作
采用液体培养分离，扩增骨髓间充质干细胞，作为供体细胞，取BALB/C小鼠四肢去掉肌肉筋膜，冲出骨髓，计数细胞，用含DMEM-LG/F12，MCDB-201，2％FCS(GibcoBRL公司)培养液培养，接种浓度为1-2×106/ml。置37℃，5％CO2培养箱培养，一天后换液，弃去非贴壁的细胞，以后每三天半量换液。至培养后第10天，用0.25％胰酶(Sigma公司)常规消化。供体细胞的鉴定：细胞表现为成纤维细胞样，具有梭形、多角形等细胞形态。
电镜观察可见以纤维母细胞为主，可见内质网向外分泌微丝。少数细胞胞浆中细胞器少，胞浆少，核仁明显，可能为干细胞。
生长曲线测定：在细胞生长的对数期，骨髓间充质干细胞倍增时间约为25小时。细胞每传一代细胞数约增长2倍。
细胞周期检测：超过80％的细胞都处于G0/G1期。CD34，HLA-DR为阴性，CD44、CD29、CD13则为阳性。SA方法证明骨髓间充质干细胞I、III型胶原、vWF因子表达阳性。测定各代细胞的端粒酶活性，证明其端粒酶高表达。
体外及体内多系诱导分化，可成功诱导成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、神经细胞转化。RT-PCR方法检测培养细胞中GATA-1，GATA-2，c-Myb，cKit，PU.1mRNA表达至体内注射时均为阴性，证明培养体系中没有造血干祖细胞污染。
以上证明培养的骨髓细胞为具有间充质干细胞表型的成体干细胞。可作为体内重建造血的供体细胞。
在小鼠体内进行重建造血的实验：将12周受体BALB/C小鼠分为5组，每组12只Ce137全身照射850rad后①正常小鼠照射后不经任何处理②照射后4小时内尾静脉输注6×106/0.3ml/只新鲜全骨髓③输入6×106/0.3ml/只去基质细胞的造血细胞④输入6×106/0.3ml/只经培养后的基质细胞，输注细胞后第1天上、下午各一次肌肉注射G-CSF。⑤照射后4小时内尾静脉输注6×106/0.3ml/只培养第10天的骨髓间充质干细胞。输注细胞后第1天小鼠注射G-CSF上、下午各一次。细心喂养，观察各组小鼠的存活情况。
小鼠在输注前查尾静脉血，计细胞总数、涂片、分类，输细胞后每周各组取1只小鼠取肝、脾、股骨，固定作病理切片，另外一侧股骨冲出骨髓，计数有核细胞、涂片、测定GM-CFU值。输全骨髓组周血有核细胞和骨髓有核细胞数及GM-CFU数在输后的第1，2周都高于单输骨髓成体干细胞组，但单输骨髓成体干细胞组周血有核细胞恢复较快，小鼠存活好。至输注后第3周，无论周血或骨髓中的有核细胞都较第2周明显恢复(图2，3)，GM-CFU也明显升高，而单输造血细胞和D-hanks液组小鼠存活4-5天死亡。图4显示，单输成体干细胞组GM-CFU值于第二周开始恢复并于第三周超过输全骨髓组。图5显示，通过PCR方法特异性地扩增Y染色体的sry基因，确定在重建造血的小鼠体内，造血细胞大部分来源于供体。图6显示，造血重建过程中脾集落变化情况，输注后第二周，成体干细胞输注组脾集落明显多于全骨髓输注组；输注后第三周，两者无明显差别。
本发明的优点：
1、通过对间充质干细胞源成体干细胞群重建造血的研究，证明了间充质干细胞群的多能性。
2、通过对间充质干细胞源成体干细胞群重建造血的研究，证明成体干细胞为存在于人体组织中具有多系分化潜能的亚全能干细胞群，在特定环境下可诱导分化成多种组织细胞。
图注图1：实验流程1：供者雄性骨髓2：具有间充质干细胞表型的成体干细胞3：尾静脉注射间充质干细胞表型的成体干细胞4：骨髓CFU-GM测定5：病理检测图2：1：全骨髓输注2：间充质干细胞表型的成体干细胞输注3：正常对照图3：1：全骨髓输注2：间充质干细胞表型的成体干细胞输注3：正常对照图4：1：全骨髓输注2：间充质干细胞表型的成体干细胞输注图5：1：分子量标记2：正常雌性鼠3：正常雄性鼠4：全骨髓输注5：间充质干细胞表型的成体干细胞输注图61：细胞输注后第二周2：细胞输注后第三周。右侧为全骨髓输注；左侧为间充质干细胞表型的成体干细胞输注
Claims (5)
1、利用具有间充质干细胞表型的成体干细胞在细胞因子的刺激下进行骨髓重建实验，其特征在于：体外培养和扩增骨髓间充质干细胞群，在细胞因子的诱导下进行超致死量照射后的骨髓造血重建，实现人成体干细胞造血干细胞分化，间充质干细胞表型的成体干细胞移植作为造血干细胞移植新途径。
2、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：人成体多种组织来源的间充质干细胞群体外分离，培养和扩增。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：联合注射G-CSF等干细胞诱导因子进行造血干细胞诱导从而实现骨髓造血重建。
4、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：间充质干细胞表型的成体干细胞进行体内移植重建造血的方法。
5、根据权利要求1所述的方法，其特征在于：成功地应用间充质干细胞表型的成体干细胞骨髓移植应用于造血障碍性疾病及多种造血细胞肿瘤疾病的治疗。
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-
2001
- 2001-09-19 CN CN01140511A patent/CN1434119A/zh active Pending
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