CN1470513A

CN1470513A - 一种具有抗癌活性的总生物碱及其制剂

Info

Publication number: CN1470513A
Application number: CNA03146436XA
Authority: CN
Inventors: 靳玉群
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-07-14
Filing date: 2003-07-14
Publication date: 2004-01-28

Abstract

本发明涉及具有抗癌活性的植物博落回或白屈菜总生物碱的提取方法，及以该总生物碱作为活性成分制成的药物制剂及其制备方法。白屈菜红碱是蛋白激酶C(PKC)抑制剂。PKC对多重药物抗性蛋白(MRP)基因的表达有激活作用，白屈菜红碱通过抑制PKC活性而对MRP基因表达发挥抑制作用，从而抑制了肿瘤的生长。药效实验证明，该制剂具有很强的抑制肿瘤生长的作用。

Description

一种具有抗癌活性的总生物碱及其制剂

技术领域

本发明涉及具有抗癌活性的植物博落回或白屈菜总生物碱的提取方法、以及包含其总生物碱作为活性成分的药用组合物及其用途和包含该组合物的药物制剂及其制备方法。

背景技术

博落回Macleaya cordata(Willd.)R.Br.和白屈菜Chelidonium majus L.均属罂粟科植物。博落回、白屈菜均味苦，性寒，有毒，具有消肿、解毒、杀虫功能，药用于疔毒脓肿，恶疮溃疡，烫伤、顽癣等，一般均为外用，不作内服。博落回、白屈菜总碱中含有多种成分，以血根碱(sanguinarine)和白屈菜红碱(chelerythrine)为主，其它还有原阿片碱、别隐品碱等，其中血根碱和白屈菜红碱约占总碱量的60％-80％。中药不良反应记录中，直接利用博落回或白屈菜作药用，大剂量时容易导致心脏毒性。对博落回、白屈菜总碱主要成分的研究表明，血根碱具有阻断氧化磷酸化作用和抑制反转录酶的作用。同时，血根碱在消耗癌细胞的谷光甘肽时，也使正常细胞的谷光甘肽消耗尽，显示出对正常细胞和癌细胞同样的细胞毒性。因此，在本发明植物博落回生物碱及其药物制剂中，就需要去除总碱中的无效成分，减少毒性大的成分，富集有效成分，同时应充分利用各成分的协同作用，以发挥总生物碱在抗癌中的作用。

对博落回和白屈菜的相关专利检索中，有博落回用作农药的发明，如中国专利CN1256873，博落回用于外用药的发明，如中国专利有CN1199640，还有含博落回的复方制剂。涉及到白屈菜的中国专利20多条，大多为复方制剂，中国专利CN1401368一种治疗糖尿病的中药制剂白屈菜提取液，方法简单，只适于外用。国阿奇发展有限公司申请的专利CN1255061用白屈菜红碱和放射方法联合治疗肿瘤，该专利对白屈菜红碱使用何种剂型未做说明。经检索相关文献，迄今还没有以白屈菜红碱为主要成分的博落回或白屈菜制剂在临床中应用。

发明内容

本发明的植物博落回或白屈菜总生物碱及其制剂，其特征是利用天然植物博落回、白屈菜提取物的总生物碱，经过一系列处理而形成博落回、白屈菜总生物碱的盐，主要包含有白屈菜红碱的盐和血根碱的盐。可以是无机酸盐，也可以是有机酸盐。制成的针剂中，白屈菜红碱含量范围为35％-99％(以总碱的量计)，血根碱含量范围为1％-20％。其剂型包括粉针剂、输液剂和脂肪乳注射剂。

博落回、白屈菜总碱提纯方法是通过水或20-70％酸性乙醇浸泡12-24小时，共浸泡3-5次，渗漉，收集渗漉液，浓缩，通过上大孔吸附树脂柱富集有效成分，具体步骤如下：

1)将博落回或白屈菜植物药切成1-5cm小段，加入6-10倍量水溶液或20-70％酸性乙醇，用盐酸或磷酸调节浸泡液PH至3.0-4.0，浸泡12-24小时，渗漉，收集渗漉液。

2)滤渣再加入6-10倍量PH 3.0-4.0的水溶液或酸性乙醇溶液浸泡12-24小时，渗漉，收集渗漉液。

3)合并两次渗漉液，回收乙醇，浓缩至药材量的1-2倍，调节溶液PH为9.0-10.0，加入盐溶液，静置24-48小时，使生物碱沉淀。

4)过滤收集沉淀，得博落回或白屈菜总生物碱的粗提物。

5)将上述总碱粗提物，加4-10量水溶解，调PH＝7-8，盐离子浓度为0.5-2M，上大孔吸附树脂柱，先用2-5倍柱体积的水洗，弃去水洗脱液，再用2-5倍柱体积的20％-70％的乙醇洗脱，弃去洗脱液，然后用一定比例的乙醇/氯仿解析，解析液浓缩，减压回收溶剂，得总碱提取物。在总碱提取物中加入适量乙醇溶液，配成浓度为20-200mg/ml的溶液，加热使其充分溶解，再加入适量盐酸或硫酸，调溶液PH 4.0-6.0，静置12-24小时，使生物碱结晶，收集结晶。

用于提取总生物碱的植物药是博落回全草和白屈菜全草。

用于博落回或白屈菜总生物碱提取和精制提纯过程调节PH的酸可以是无机酸，如盐酸、硫酸，也可以是有机酸，如柠檬酸。

用于博落回或白屈菜总生物碱提取和精制提纯过程中调节PH的碱可以是氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、碳酸钾、氨水中的一种或其中两种的混合溶液。

本发明的植物博落回或白屈菜总生物碱及其制剂是由博落回总碱盐、药用辅料和水组成，包括水剂、粉针剂、输液剂和脂肪乳注射剂。

制备针剂，分装前注射液内总生物碱的含量(以白屈菜红碱计)为5-50mg/ml，分装于安瓿瓶中，每支2ml或5ml，熔封，检验合格后，包装即得。

制备博落回、白屈菜总生物碱输液剂，分装前注射液中博落回总生物碱的含量(以白屈菜红碱计)为1-30mg/ml，分装为100ml、150ml、200ml于相应的输液瓶中，轧盖，检验合格后，包装即得。

制备博落回或白屈菜总生物碱粉针剂，将精制的总生物碱的盐用5-10倍量注射用水溶解后，加入计量的注射液用水溶性药用辅料充分溶解后，调PH至5.0-6.0，超滤，低温真空干燥，无菌分装于5ml西林瓶中，每瓶含博落回总生物碱50-200mg(以白屈菜红碱计)，轧盖，检验合格后，包装即得。

制备博落回或白屈菜总生物碱冻干粉针剂，将精制后的总生物碱的盐，用5-10倍量注射用水溶解后，加入计量的注射液用水溶性药用辅料，调PH至5.0-6.0，经超滤，用注射用水稀释至每毫升含博落回总碱(以白屈菜红碱计)5-50mg，分装于5ml、10ml安瓿中，经冷冻干燥后，熔封，检验合格后，包装即得。

制备博落回或白屈菜总生物碱脂肪乳剂，是将总生物碱的盐通过PH调节形成博落回或白屈菜总碱，溶于脂肪溶剂中，加入注射用水、乳化剂及药用辅料而制备的。

我们研究了抗癌物质-博落回总生物碱在体内代谢后通过细胞膜、核膜，到达细胞核，与DNA作用，抑制或干扰DNA的复制和表达，最终导致癌细胞死亡的过程。其中白屈菜红碱是蛋白激酶C(PKC)抑制剂。PKC对多重药物抗性蛋白(MRP)基因的表达有激活作用，白屈菜红碱通过抑制PKC活性而对MRP基因表达发挥抑制作用，从而抑制了肿瘤的生长。我们对从博落回中提取的总生物碱，进行一系列的药理和药效实验。现举例如下：

实验一：博落回总生物碱对小鼠宫颈癌U14肿瘤生长的抑制作用。1、实验材料：

1.1实验动物：小鼠80只，体重20-24kg，雌雄兼用。

1.2瘤株：小鼠宫颈癌(U₁₄)、小鼠肝癌(H₂₂)2、实验方法和结果：

常规无菌接种，抽取腹水型U₁₄瘤株小鼠的腹水，用生理盐水稀释。镜下记数并调节癌细胞浓度，每只小鼠接种癌细胞液0.2ml含癌细胞2×10⁶个癌细胞，注射于右腋皮下。接种后按体重随机分为6组，各组剂量是：对照组注射体积蒸馏水，环磷酰胺组10mg/kg体重，博落回或白屈菜总生物碱组30mg/kg体重、20mg/kg体重、10mg/kg体重。接种24小时后给药，每日1次，连续14天。末次给药24小时后颈椎脱臼法处死小鼠，称记体重，剥离瘤块并称重。计算各组动物试验前后体重及瘤重平均值，求其抑瘤率，进行t值检验，重复试验3次。3次试验结果一致，博落回总生物碱高剂量组对小鼠宫颈癌生长的抑制率达53.3％，与对照组相比有显著性差异P＜0.01。

实验结果：

表1 博落回总生物碱对小鼠富颈癌U₁₄肿瘤生长的影响(x±s)组别剂量动物动物体重(g) 瘤重(g) 抑制率

mg/kg 数始末％对照组 16 23.0±1.3 35.1±3.6 3.67±0.8环磷酰胺 10 16 23.1±1.3 32.0±3.2 1.98±0.7 46.1博落回总生物碱 30 16 21.9±1.9 33.3±2.9 1.57±1.3 53.3博落回总生物碱 20 16 22.4±1.5 34.5±3.1 1.77±1.1 48.9博落回总生物碱 10 16 22.1±1.7 35.6±2.2 2.12±1.3 39.4与对照组比较P＜0.05，P＜0.01实验二：博落回总生物碱对小鼠肝癌(H₂₂)肿瘤生长的抑制作用

实验材料和方法同实验一，结果相似，博落回总生物碱高剂量组对小鼠肝癌(H₂₂)生长的抑制率达50.5％，与对照组相比有显著性差异P＜0.01。

表2 博落回总生物碱对小鼠肝癌H₂₂肿瘤生长的影响(x±s)组别剂量动物动物体重(g) 瘤重(g) 抑制率％

mg/kg 数始末对照组 16 22.0±1.1 28.1±3.8 1.57±0.8环磷酰胺 10 16 21.1±1.9 26.7±3.2 0.78±0.7 47.1博落回总生物碱 30 16 21.9±1.2 25.3±3.9 0.73±1.3 50.5博落回总生物碱 20 16 21.4±1.7 26.5±3.5 0.79±1.0 46.3博落回总生物碱 10 16 22.1±1.7 27.6±3.2 1.12±1.3 26.4与对照组比较P＜0.05，P＜0.01

毒理学研究表明，博落回总碱制剂对小鼠和大鼠的急性毒性分别为：对小鼠iv的LD₅₀和95％可信限为158mg(130-178mg)/kg；对大鼠sc的LD₅₀和95％可信限为223mg(203-267mg/kg)。

博落回总碱制剂对狗长期毒性试验表明，将分别相当于成人临床拟日用剂量的15倍、10倍、5倍的博落回总碱制剂三种剂量300mg/kg、200mg/kg、100mg/kg分别肌肉注射，连续13周，观察狗的活动、食欲、大小便、被毛、体重及呼吸、心率等生命体征的变化，进行血常规、尿常规、肝功能、肾功能等生化检查，心电图、脏器系数及病理学检查结果显示：高剂量组部分狗给药13周后出现心率减慢，P-R间期延长，停药后基本恢复正常，其余组别未见明显异常。高剂量组部分狗可见心肌间轻度水肿，血管轻度扩张、充血外，其余未见异常。

博落回总碱制剂的安全性实验，采用肌肉刺激性试验、过敏试验、溶血试验、热原检查等实验方法，以评价博落回总碱制剂的安全性。结果表明，博落回注射剂肌注对家兔肌肉无刺激性，不引起豚鼠过敏，无溶血反应，不含致热原，符合注射用药的要求。

Claims

1、一种具有抗癌活性的总生物碱及其制剂，其特征在于该生物碱是由下述制备方法制成的：

1)将博落回或白屈菜植物药切成1-5cm小段，加入6-10倍量的溶液，用盐酸或磷酸调节浸泡液PH至3.0-4.0，浸泡12-24h，渗漉，收集渗漉液；

2)滤渣再加入6-10倍量PH 3.0-4.0的溶液浸泡12-24小时，渗漉，收集渗漉液；

3)合并两次渗漉液，回收乙醇，浓缩至药材1-2倍量，调节溶液PH为9.0-10.0，加入盐溶液，静置24-48小时，使生物碱沉淀，过滤；

4)过滤收集沉淀，得博落回或白屈菜总生物碱的粗提物；

5)将上述粗提物加适量水溶解，调PH＝7-8，盐离子浓度为0.5M-2.0M，上大孔吸附树脂柱，先用2-5倍柱体积的水洗，弃去水洗脱液，再用2-5倍柱体积的20％-70％的乙醇洗脱，弃去洗脱液，然后用一定比例的乙醇/氯仿解析，收集解析液，减压回收溶剂得总碱提取物，加入适量乙醇溶液，配成浓度为20-200mg/ml，加热使其充分溶解，再加入适量盐酸或硫酸，调溶液PH 4.0-6.0，静置12-24小时，使生物碱结晶，收集结晶；

2、根据权利要求书1所述的总生物碱，其特征在于；白屈菜红碱和血根碱以盐的形式存在，其中白屈菜红碱含量为20％-99％(以总碱的量计)，血根碱含量为1％-20％。

3、由上述总生物碱制成的制剂，其剂型包括水针剂、粉针剂、输液剂和脂肪乳注射剂。

4、根据权利要求书1中所述的提取药材所需要的溶液，可以是水或20％-70％的乙醇。用于提取总生物碱的植物药是博落回全草或白屈菜全草。

5、根据权利要求书1中所述的总生物碱的制备方法，其特征在于用于总生物碱提取和精制提纯过程调节PH的酸可以是无机酸：如盐酸、硫酸，也可以是有机酸：如柠檬酸等。

6、根据权利要求书1所述的总生物碱的制备方法，其特征在于使用的是AB-8，D16，H-103，NK-107，X-5，0206，D-101等各种规格和型号的大孔吸附树脂柱。

7、根据权利要求书1所述的乙醇/氯仿溶液，其中乙醇与氯仿的比例为：1∶2或1∶1或2∶1。

8、根据权利要求书1所述的总生物碱的制备方法，其特征在于用于总生物碱提取和精制提纯过程中调节PH的碱可以是氢氧化钠、碳酸钠、氢氧化钾、碳酸钾、氨水中的一种或两种的混合溶液。

9、根据权利要求书3所述的制剂，其中针剂和输液剂是由博落回或白屈菜总生物碱盐与注射用水溶性辅料和注射用水组成，其特征在于：将总生物碱盐，加入注射用水溶性辅料，以白屈菜红碱计配成5-50mg/ml，调节PH至5.0-6.0，经微孔滤膜超滤后，补充注射用水至规定量，灌装于安瓿瓶中或输液瓶中，熔封/轧盖，经检验合格后，包装即得。水针的规格可以是2ml，也可以是5ml、10ml。输液剂含博落回、白屈菜总生物碱盐(以白屈菜红碱盐计)为1-30mg/ml。分装为100ml、180ml、200ml于相应的输液瓶中，轧盖，检验合格后，包装即得。如果将以白屈菜红碱计配成5-50mg/ml的溶液，灌装10ml、5ml安瓶中，经冷冻干燥后，熔封，包装即得冻干粉针剂。每瓶含博落回总生物碱50-200mg(以白屈菜红碱计)。如果将以白屈菜红碱计制成的总生物碱盐无均粉，分装于西林瓶中后，轧盖，经检验合格后，包装即得粉针剂。每瓶含博落回总生物碱50-200mg(以白屈菜红碱计)。如果将博落回或白屈菜总生物碱盐加入脂肪乳辅料和注射用水中，以白屈菜红碱计配成5-50mg/ml，调节PH至5.0-6.0，经微孔滤膜超滤后，补充注射用水至规定量，灌装于安瓿瓶中，熔封，经检验合格后，包装即得脂肪乳注射液。脂肪乳注射液的规格可以是2ml，或5ml。