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CN1452494A - 促胰液素受体配体在治疗囊性纤维化(cf)及慢性阻塞性肺病(copd)中的用途 - Google Patents

促胰液素受体配体在治疗囊性纤维化(cf)及慢性阻塞性肺病(copd)中的用途 Download PDF

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CN1452494A
CN1452494A CN01815130A CN01815130A CN1452494A CN 1452494 A CN1452494 A CN 1452494A CN 01815130 A CN01815130 A CN 01815130A CN 01815130 A CN01815130 A CN 01815130A CN 1452494 A CN1452494 A CN 1452494A
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CN
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secretin
receptor
copd
lung
cells
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CN01815130A
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English (en)
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R·J·达维斯
K·J·佩奇
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Pharmagene Laboratories Ltd
Original Assignee
Pharmagene Laboratories Ltd
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Abstract

本发明是以促胰液素受体在人远端肺所存在的组织中表达的发现为基础的。在CF患者中，受体水平要比正常组织高。利用促胰液素对组织进行治疗可刺激阴离子在组织中的移动。本发明提供了通过给予患者有效量的药剂来治疗所述患者囊性纤维化或COPD的方法，其中所述药剂可通过激活促胰液素受体而引发呼吸组织中阴离子的流出。

Description

促胰液素受体配体在治疗囊性纤维化(CF) 及慢性阻塞性肺病(COPD)中的用途 
发明领域
本发明涉及利用或通过激活激素促胰液素或其它促胰液素受体配体而治疗囊性纤维化(CF)及慢性阻塞性肺病(COPD)。
发明背景
囊性纤维化
囊性纤维化(CF)是一种非常常见的，致命的，常染色体隐性遗传疾病，目前仅英国就有超过7000人被诊断患有这种疾病，而美国大约有30,000人。CF的发病率主要取决于人种。北欧的白种人患这种疾病的危险性最大，基于大约1/25的杂合载体率，他们患病的概率大约为1/2500。
CF是由于遍及身体的囊性纤维化跨膜调节剂(CFTR)氯离子通道基因的基因突变而产生的。CFTR中的这种突变可导致蛋白的错误折叠和/或转录蛋白从内质网到上皮质膜迁移的缺乏及随后氯离子(Cl-)通道功能的损耗。这可引起细胞和腔内的流体和电解质转运及CF肺下呼吸道容积的不平衡，其分解粘液的构造，依次损害粘液纤毛清除并引发CF患者肺部不可避免且持续的细菌感染。不同突变可引起不同严重程度的CF症状并相应导致患者存活率的改变。
几十年来，改进的药物和物理疗法已经显著提高了患者的存活时间，尽管平均预期寿命仍然比较短，目前大约为30岁。因此仍然需要继续研究治疗这种疾病的更好方法。
                         COPD
COPD的临床特征包括气喘，咳嗽和喀痰，并伴有慢性气道阻塞及肺过度膨胀，这是由慢性支气管炎和肺气肿(远端肺空间扩张)引发的。在支气管哮喘中较为显著的慢性支气管过度兴奋也是在COPD中发现的。COPD中的气道重塑可导致持续不可逆的气道变窄及粘液的过度分泌。气道变窄和高反应性的直接原因还未可知，虽然通常认为气道平滑肌功能的异常可导致松弛性的降低或减小及收缩性的增加。
与缓释口服茶碱及吸入的β2激动剂(例如，异丙阿托品，沙丁醇胺，沙美特罗)联合使用的支气管扩张药疗法，及高剂量吸入的类固醇代表了目前在COPD治疗中使用的疗法，这是由于即便是阻塞的适度改善对于COPD患者也是有益的。β2激动剂可通过刺激与特异性G-蛋白Gs偶联的特异性受体而介导气道的支气管扩张，其依次使第二信使cAMP的细胞内水平增加。
最近，Cl-的移动已经被证实与上皮依赖性气道松弛有关(Fortner等，2001)，阻断Cl-离子分泌可导致激动剂诱导的松弛的显著减少。此外，化合物如呋塞米，一种Cl-依赖性Na+/K+/2Cl-协同-转运抑制剂已经在某些研究中被证实可减少气喘时支气管的高反应性(Pendino等，1998)。此外，粘液分泌过多和气管支气管粘液的非-连续性清除也可导致持续的气流阻塞，其可与气道的高反应性同时存在。粘液堵塞可导致小气道(例如，三级支气管)阻塞，从而使最大呼吸气流减小，肺排空的推动缓慢。
促胰液素
促胰液素是一种肽激素，它是从近端小肠(特别是十二直肠和空肠)中的S细胞分泌的，并对离胃的酸性内含物有反应。相当长时间以来，猪促胰液素的结构已经为人们所知，并已经将它从猪肠中分离出来，且已经发现它是由27个氨基酸残基组成的肽构成的(Mutt等，1970)。此外，人们已经发现牛和猪促胰液素是相同的，并与犬促胰液素相似。
虽然牛和猪促胰液素与人促胰液素的表现在某些方面相同，但它们在结构上不同。这些动物促胰液素与人促胰液素在第15和16位不同。人，猪和牛促胰液素的序列对比在图1中表示。
促胰液素的生理作用是刺激水(H2O)和碳酸氢盐(HCO3 -)从胰腺分泌，中和酸性食糜。它的作用是由7个跨膜结构域介导的，G蛋白偶联受体(GPCR)，其是结构上与GPCRs超家族有关的高血糖素-促胰液素-血管活性肠肽的一员，(IUPHAR Receptor Compendium，1998)，该肽显示出毫微摩尔的亲和性。促胰液素受体的刺激可介导细胞内cAMP的增加，及蛋白激酶A(PKA)的激活。
促胰液素目前已经被FDA批准用于诊断胃泌素瘤及评估胰腺功能。促胰液素在小儿孤独症中的应用表明它可改善与孤独症，即一种交流，社会技能和发展严重受损的疾病有关的生理和行为症状(见，例如WO98/52593，US-A-6,020,310或US-A-6,020,314)。2000年3月，RepligenCorporation(USA)宣布他们已经使用促胰液素对患有孤独症的儿童开始进行II期临床试验，进行II期临床试验的地点包括Mayo Clinic，theUniversity of Rochester Medical Center和the Southwest Autism ResearchCenter及Phoenix Children’s Hospital。这些试验的初步结果表明，促胰液素的输注对于患有严重孤独症儿童的离散组是有益的。
有人已经提出促胰液素还可预防吸入性肺炎综合征(例如，EP0150760；AU3806485)。
已经报道过许多合成和/或天然存在的促胰液素肽类似物及片段(此处被称作“促胰液素受体配体”)，它们对促胰液素受体显示出广泛的效能，功效和选择性。这些包括，但不限制于单/多取代的促胰液素类似物，促胰液素片段，取代的促胰液素片段，还原肽键的类似物(Gardner等，1976；Gardner等，1979；Waelbroeck等，1981；Konig等，1984；Staun-Olsen等，1986；Robbertecht等，1988；Haffer等，1991)，和VIP/促胰液素家族天然存在及合成的类似物，片段和嵌合肽(包括VIP(血管活性肠肽)，肠抑胃肽(GIP)，PACAP(可激活垂体腺苷酸环化酶的多肽)，adrenomedullin，降钙素，CGRP(α，β和皮肤降钙素基因相关肽)，胰高血糖素，胰高血糖素样多肽(GLP)，生长激素释放因子，甲状旁腺激素(PTH)及其相关蛋白(PTHrP)，促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)和糊精。这些肽中的大多数(包括胰高血糖素，GLP，PACAP和VIP)与促胰液素共同具有有效的氨基酸同源物，特别是在氨基末端。所有这些肽可接受相似的二级结构特征，包括两亲α-螺旋状二级结构的一个或两个区，且可以较保守的方式与它们的受体相互作用(Sexton，1999)。
促胰液素-相关受体肽，及其类似物和片段也是已知的，它们对促胰液素受体显示出亲和性。
本发明的公开
我们已经研究了促胰液素受体在CF和COPD患者组织中的表达水平。我们发现，无论是在正常个体还是患有这些疾病的患者中，促胰液素受体均是在肺远端区，特别是在三级支气管和实质中表达的，在肺近端区中只有很少的或没有可测量的mRNA表达。先前没有报道过促胰液素受体在这些组织中的表达。
此外，我们惊奇地发现在CF患者三级支气管中，促胰液素受体mRNA的水平显著升高。这种升高对CF是特异性的，且不与患有其它肺病的患者共有。这种升高对于三级支气管组织是特异性的。
我们不希望受任何一种特定理论的束缚，我们相信促胰液素对细胞中离子移动的作用(见下面)可抵消与CF有关的CTFR缺乏的作用。此外，虽然本发明的实践不依赖于任何一种特定的理论，但对三级支气管组织中促胰液素受体mRNA水平升高的解释是，这是对这些细胞中离子不平衡的反应。
此外，人们逐渐认识到，对于COPD患者而言，患者肺中离子流出的作用可能是治疗干预的一个重要目标。所述促胰液素受体与G-蛋白Gs偶联，并因此推测功能性促胰液素受体的激活可导致细胞内cAMP的积聚，及随后的支气管扩张，其中所述功能性促胰液素受体是在排列于人远端支气管的上皮细胞上鉴定的(还可见Ng等，1999)。此外，在其它粘液分泌过多的肺病，如囊性纤维化和COPD中，Cl-流出的显著减少可改变水及离子的组成和随后粘液的粘度及粘液的分泌，产生稠而无味的粘液，其可损害肺的粘液纤毛清除。因此在这种患者中，刺激离子移动对于其疾病的治疗是有益的。
因此，本发明提供一种治疗CF患者囊性纤维化的方法，该方法包括给予所述患者有效量的药剂，该药剂可通过激活促胰液素受体而引发呼吸组织中阴离子的流出。
本发明还提供一种治疗COPD患者COPD的方法，该方法包括给予所述患者有效量的药剂，该药剂可通过激活促胰液素受体而引发呼吸组织中阴离子的流出。
就其中一方面而言，本发明是以发明人的意外发现为基础的，即CF患者三级支气管中促胰液素受体的mRNA水平升高，且本发明涉及促胰液素在囊性纤维化治疗中的新用途。本发明的优选方面涉及通过给予患者促胰液素受体配体来治疗CF。然而，本发明人已经预期除了直接给予促胰液素受体配体外，还可通过其它方式给予患者有效量的促胰液素。给予促胰液素的其中一个选择性方法是使用可刺激肺细胞中内源性促胰液素，或促胰液素相关肽产生或释放的正向调节的药剂。
本发明还提供了可通过激活促胰液素受体而引发呼吸组织中阴离子流出的药剂在制备治疗囊性纤维化的药物中的用途。
此外，本发明还提供了可通过激活促胰液素受体而引发呼吸组织中阴离子流出的药剂在制备治疗COPD的药物中的用途。
优选所述药剂是一种促胰液素受体配体，更特别是促胰液素，特别是人促胰液素。
附图简述
图1表示人，猪和犬促胰液素的序列对比。
图2表示对照组和CF肺区中促胰液素受体mRNA的不同表达。
图3表示对照组和CF肺区中GAPDH的mRNA表达。
图4表示在来源于16个对照组供体和25个CF组织供体的对照组和CF肺区中，促胰液素受体mRNA的不同表达。
图5表示在非-CF三级支气管中，促胰液素刺激离子移动。
图6表示在来源于非-CF供体的原始人三级支气管上皮细胞的融合单层中，促胰液素刺激非-CTFR依赖性的离子移动。
图7表示促胰液素刺激人CF三级支气管中离子的移动。
图8表示促胰液素对来源于非CF供体的原始人三级支气管上皮细胞中氯离子流出的作用。
图9表示CF患者的三级支气管和肺实质中，NeuroD mRNA的水平。
发明详述
通过激活促胰液素受体而引发呼吸组织中阴离子流出的药剂
促胰液素受体可通过很多机理而被激活。例如，已经广泛报道过促胰液素的表达被限制在小肠和结肠内分泌细胞中的S-型肠内分泌细胞及产生发育胰腺的β细胞的胰岛素中。肠内分泌细胞和胰岛均来自原始的胚胎肠内胚层。此外，一级气道是通过被称作分支形态发生的过程形成的，由此，2个腹侧的肺芽从排列在胚胎前肠内胚层底部的上皮抽芽。气道的形成是由两个肺芽的生长和反复分枝而进行的。肺神经内分泌(PNE)细胞位于第一细胞之中，从而与原始肺上皮区别，且通常，其在胎儿和新生儿肺中的含量最丰富。已知这些细胞可表达许多肽，包括降钙素，降钙素基因相关肽，血清素和内皮缩血管肽，且可通过它们对这些肽或一般的内分泌物标记物如突触小泡蛋白，嗜铬粒蛋白及蛋白基因产物9.5的免疫反应性而被目测检验。在CF支气管中，已经证实了内分泌细胞内降钙素免疫反应性的增加(Wolf等，1986)。
我们已经发现，与非-CF肺相比，在CF三级支气管部分中，嗜铬粒蛋白A的免疫反应性增加，表明CF肺中的孤立内分泌细胞数增加。人们预期CF肺三级支气管内，内分泌细胞表达的增加与所存在的内分泌肽，包括促胰液素的增加有关。同样，直接或间接刺激内分泌细胞从而在肺内局部释放促胰液素(和/或促胰液素释放肽或对促胰液素受体显示出亲和性的肽)代表了一种选择性的，用外源性促胰液素刺激促胰液素受体，或类似的并为CF提供治疗有益之处的方法。
此外，促胰液素基因还可通过提供药剂而正向调节，所述药剂可通过启动子或增强子的调节而提高基因转录的水平。促胰液素基因的增强子区含有被称为E框的顺式作用DNA共有序列(CAGCTG)，其结合属于转录因子的碱性螺旋-环-螺旋(bHLH)家族的蛋白。已经证实了被称为BETA2/NeuroD的bHLH蛋白可导致促胰液素基因转录的组织-特异性调节(Mutoh等，1997)。在剔除小鼠中，BETA2/NeuroD缺陷小鼠不能发育肠内分泌细胞或胰β细胞，从而证实了这种转录因子在源于肠内胚层的多种特异性细胞类型的正常发育中起着重要的作用。β2/NeuroD的表达已经被证实仅仅位于转基因小鼠的内分泌细胞中(Rhindi等，1999)。
此外，内源性促胰液素产生的正向调节还可通过本领域已知的各种其它方法获得(例如，见Jiang等，2001；Yang等，1998；Morse等，2001；Lewis等，1997；West & Rodman，2001；Alton & Kitson，2000)，这些方法包括但不限制于基因疗法(在病毒或非病毒载体中递送DNA或RNA，其中所述载体编码能够直接或间接刺激促胰液素受体或其细胞信号途径的肽)，基因寻靶(递送药剂，其中该药剂针对编码促胰液素或相关肽的基因启动子区上的调节序列或转录因子结合位点，由此产生能够直接或间接刺激促胰液素受体的促胰液素或相关肽)。
已知的可刺激促胰液素释放的多种机理，包括下列：
药剂如二丁酰环状-3’，5’-腺苷一磷酸，福斯高林，4β-12-O-十四酰佛波醇-13-醋酸盐，合成的丝氨酸蛋白酶抑制剂，卡莫司他，和钙离子载体，A2318，其刺激Ca2+和环状-3’，5’-腺苷一磷酸-依赖性促胰液素的释放(Xue等，1993)；
胰磷脂酶A2(PLA2)，其已经被证实本质上具有释放促胰液素的活性，而不依赖于它的消化酶活性(Chang等，1999)；
神经肽铃蟾肽，胃泌素释放肽，VIP和神经节肽已经显示出可调节产生促胰液素的细胞中促胰液素的释放(Chang等，1998)；和
长链脂肪酸，如油酸钠是从内分泌细胞释放促胰液素的有效刺激剂。它们的刺激作用是由内源性蛋白激酶A加强的，并由通过L-型通道流入的Ca2+和蛋白激酶C及Ca2+/钙调蛋白-依赖性蛋白激酶II的激活而介导(Chang等，2000)。
此外，受体活性修饰蛋白，或RAMP是新的单一跨膜结构域蛋白，其可调节促胰液素受体GPCR家族中至少两个成员的表达和/或活性。迄今为止，存在3个RAMP同种型，1-3，它们的相互作用很可能导致受体到细胞表面的运输，改变受体糖基化的程度，和/或提供与细胞表面受体有关的配体结合位点(Sexton，1999)。
RAMPS可间接改变肽对促胰液素GPCR家族特异性受体的选择性。例如，有关PTH1受体的单点突变对此受体产生促胰液素反应性，而回复突变对促胰液素受体产生PTH反应性的研究(Turner等，1996)已经暗示了，这可能是由于与受体相互作用的特异性RAMP的改变(Sexton；1999)。
同样，促胰液素受体的激动(agonism)可通过促胰液素受体家族的肽类似物或片段及特异性RAMP的同时或顺序应用而介导。
其中的促胰液素受体被激活的呼吸组织特别包括选自三级支气管和肺实质的肺远端区内的组织。
促胰液素受体配体
如上所述，优选的促胰液素受体配体是人促胰液素(hSN)。然而，也可使用其它哺乳动物的促胰液素，如紧密相关的牛，猪的促胰液素，或犬，啮齿动物，小鸡和兔子的促胰液素(其显示出与人促胰液素不同程度的同源性)，及其它天然存在或合成的促胰液素片段或类似物，如此处鉴定的那些。
各种其它的促胰液素受体配体在本领域中也是熟知的。这种配体多数是以天然促胰液素(例如，人或猪促胰液素)序列为基础的，但包含1-7(通常为1-5，常常是1，2或3)个氨基酸取代或缺失，特别但不仅仅在N-末端区。
例如，Gespach等(1986)描述了4种合成的促胰液素类似物，包括与猪促胰液素相似，但N-末端被血管活性肠肽(VIP)的序列部分取代的，即Ala4-Val5-pSN，和Tyr1-Ala2-Glu3-pSN，Gln3-pSN，Phe1-Phe2-Trp3-Lys4-pSN。Konig等(1977)描述了Ala4-pSN。Gardener等(1976)描述了促胰液素片段SN5-27及其3个变体，(9Gln-SN5-27，15Asn-SN5-27和9Gln-15Asn-SN5-27)。15-Lys-SN也已经在现有技术中描述(Gardener等，1979)。Haffer等(1991)描述了八种促胰液素变体，而八个N-末端肽键中有一个具有还原肽键(用-CH2-HN-替换-CONH-键)。Robberecht等(1988)描述了促胰液素片段2-27，3-27，5-27和7-27及所观察到的促胰液素受体的活性。Konig等(1986)把促胰液素N-末端的5个氨基酸换成人生长激素释放因子N-末端的五肽序列，从而产生1-Tyr-2，4-二Ala-5-Ile-SN，其显示出促胰液素活性。构造的其它活性变体是3-L-半胱氨酸-SN，6-D-Phe-SN，5-Allo-Thr-SN，和1-Cys-6-Cys-SN。
对促胰液素受体显示亲和性的促胰液素类似物的其它例子包括，[Ala4，Val5]和[D-Ala4，Val5]促胰液素，(D-Ala4)促胰液素；(D-Phe6)促胰液素；促胰液素5-27，促胰液素14-27[Val5]促胰液素，[D-Ala4，Val5]促胰液素(Waelbroeck等，1981)；取代片段如[Gln9，Asnl5]促胰液素(5-27)(Staun-Olsen等，1986)；含酚基的猪促胰液素类似物，包括Nalpha-酪氨酰促胰液素，[Tyrl]促胰液素，和Nalpha-β-(4-羟苯基)丙酰促胰液素(Yanaihara等，1977)；促胰液素的羧基-末端二十三肽类似物(S5-27)(9-Gln-S5-27，15-Asn-S5-27)，和9-Gln-15-Asn-S5-27)(Gardner等，1976)。
血管活性肠肽(VIP)，PACAP，胰高血糖素，胰高血糖素样多肽及其天然存在和合成的类似物及其片段，可显示出与促胰液素显著的同源性。这些的例子包括但不限制于，(D-Ala4)VIP；(D-Phe4)VIP；(D-Phe2)VIP，VIP的脂肪酰基衍生物，包括十四烷基，十六烷基，和十八酰基-[Nle17]VIP(Gourlet等，1998)，VIP2-28；VIP1-14；VIP2-14；VIP14-28；VIP15-28；VIP20-28；VIP21-28，N-末端的VIP1-6或VIP1-9已经与C-末端的VIP20-28或VIP21-28共价连接的两个序列(Couvineau等，1984)；VIP7-27，VIP11-28，VIP1-22-NH2，VIP16-28(Staun-Olsen等，1986)，VIP[10-28]和VIP[16-28]。促胰液素和VIP的类似物，其被称作vasectrins，已经由Beyerman等于1981年描述。PACAP(1-27；1-38)及类似物的例子包括PACAP(1-23，VIP-24-28)，PACAP(1-24，Cys-25)，PACAP(1-23)，PACAP(3-27)，PACAP(1-19)，PACAP(3-19)，PACAP(1-12)，和PACAP(18-38)(Schmidt等，1993)，胰高血糖素，和GLP-1，它们相关的类似物及片段包括GLP-1(7-37)GLP-1-(1-37)酰胺，-(6-37)酰胺，-(8-37)酰胺，-(7-36)酰胺(Suzuki等，1989)，N-末端1位发生改变的那些，包括N-甲基化-(N-me-GLP-1)，α-甲基化(α-me-GLP-1)，脱酰胺化的-(脱氨-GLP-1)和咪唑-乳-酸取代的GLP-1(imi-GLP-1)。(Gallwitz等，2000)。
在引入此处作为参考的上述文献中描述的促胰液素受体配体可全部用于本发明中，然而本领域的那些技术人员应认识到上述引证的参考文献不是穷举的，也可使用其它促胰液素受体配体。
候选配体的适合性可通过实验测定。例如，Charlton等(1983)报道了脑室内(intracerebroventricularly)注射的促胰液素可显著增加大鼠的澄清，减少新的目标近似值，但对定型行为没有显著的作用。这种试验可使用促胰液素受体配体在大鼠中进行，从而测定它对本发明的适合性(即，可选择通过促胰液素受体的激动显示相似作用的那些配体)。
促胰液素可从市场上购得(例如，Peninsula Laboratories Inc，USA)，或它及上述配体可参很考容易得到的公开文献获得。
本发明的组合物
此处所报道的新发现产生了新的组合物，它含有促胰液素受体配体和至少一种具有抗CF或COPD活性的其它化合物。
就CF而言，这种化合物包括粘液溶解剂，如乙酰半胱氨酸，脱氧核糖核酸酶I(dornase)或厄多司坦，及其它抗CF剂，如萘多罗米或布洛芬。
就COPD而言，这种化合物包括支气管扩张药如茶碱，异丙阿托品，β2激动剂，如沙丁胺醇或沙美特罗，或抗炎剂如类固醇。
促胰液素受体配体在这种组合物中的量为，例如，占活性成分总重量(即，不包括载体或稀释剂)的1％-99％，例如10％-90％。
在相关方面，本发明提供促胰液素受体配体与第二种具有抗CF或COPD活性的化合物的组合，它们可同时或顺序使用，分别用于治疗CF或COPD。“同时”是指同时给予两种化合物，虽然这在同一组合物中不是必须地。“顺序”是指在一段时期内给予两种化合物，这样当给予两种化合物中的第二种时，两种化合物中的第一种在患者体中仍然是活性的。优选“顺序”是指在同一24小时内，优选在同一12小时内，如在同一6，3，1，半小时或一刻钟内。
配制和给药
根据本发明对患者进行的治疗可通过给予患者药物组合物形式的促胰液素受体配体而进行，其中所述药物组合物可具有或没有其它活性成分存在(下面提到的组合物被理解为包括两种类型，虽然仅专门提到促胰液素受体配体)。该组合物还可与非-毒性的，药学上可接受的载体组合。就此而论，本发明还包括一种治疗CF的方法，包括给予所要治疗的患者治疗有效量的本发明促胰液素受体配体，或本发明的组合物。
在临床实践中，由于激素作为一种肽对生物活性环境较敏感，因此本发明的组合物可非肠道给药。然而也可口服或直肠给药，例如使用缓释类型的组合物可使活性成分达到最初的目标位点，即三级支气管。
促胰液素受体配体还可被配制成适于吸入(例如，通过气溶胶)，吹入(通过口腔或鼻)，或非肠道(通过除肠之外的途径引入)给药的形式。
通过吸入递送蛋白或肽可使用促胰液素受体配体的液体或固体制剂而完成。因此，本发明预期含有促胰液素受体配体的制剂可用于各种装置中，该装置被设计用于递送药物组合物及治疗制剂到呼吸道。在本发明的其中一个方面中，促胰液素受体的配体是以气溶胶或吸入形式给药的。与分散剂联合使用的促胰液素受体配体可作为干燥粉末以气溶胶制剂的形式给药，或以具有稀释剂的溶液或混悬液形式给药。
适宜的分散剂在本领域中是熟知的，其包括但不限制于表面活性剂等。本领域通常所用的表面活性剂可用于减少表面产生的蛋白聚集，而表面产生的蛋白聚集是由形成液体气溶胶的溶液的雾化引起的。这种表面活性剂的例子包括聚氧化乙烯脂肪酸酯和醇，及聚氧化乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯。所用表面活性剂的量通常大约占制剂重量的0.001％-4％。在特定的方面，所述表面活性剂是聚氧化乙烯脱水山梨糖醇一油酸酯或脱水山梨糖醇三油酸酯。
所述液体气溶胶制剂在生理可接受的稀释剂中含有促胰液素受体配体和分散剂。本发明干燥粉末状的气溶胶制剂包括微细分裂固体形式的促胰液素受体配体和分散剂，及选择性的膨胀剂，如乳糖，山梨糖醇，蔗糖，或甘露糖醇等，从而促进粉末分散。无论是液体还是干燥粉末状的气溶胶制剂，所述制剂必须被雾化。也就是说，必须将它破碎成液体或固体颗粒，从而确保雾化剂量能够按照所希望的，确实到达支气管和/或肺泡。通常，质量中值动态直径为5微米(μm)或更小，从而确保药物颗粒到达肺支气管或肺泡(Wearley等，1991)。
关于递送装置的结构，本领域已知的任何形式的雾化作用，包括，但不限制于液体制剂的喷雾，雾化或泵送雾化，及干燥粉末制剂的雾化，均可用于本发明的实践中。人们预期了一种独特设计的，用于给予固体制剂的递送装置。通常，液体或干燥粉末制剂的雾化作用需要推进剂。所述推进剂可以是本领域通常所用的任何一种推进剂。有效推进剂的例子包括氯氟烃，氢氟烃，氢氯氟烃和烃，包括三氟甲烷，二氯二氟甲烷，二氯四氟乙醇，和1，1，1，2-四氟乙烷及其组合。
在本发明的优选方面，用于雾化的装置是一种计量给药吸入器。给药时，计量给药吸入器可提供具体剂量，并可根据给药提供可变剂量。这种计量给药吸入器可使用液体或干燥粉末形式的气溶胶制剂。
气溶胶递送系统，如加压的计量给药吸入器和干燥粉末吸入器在Newman，Aerosols and the Lung，Clarke，S.W.和Davia，D.编辑，第197-22页中公开，并可与本发明结合使用。
还可使用其它制药方法控制本发明拮抗剂作用的持续时间。所述拮抗剂还可利用界面聚合凝聚技术而被包裹在所制备的微胶囊(例如，羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基异丁烯酸盐)微胶囊)中，包裹在胶态药物递送系统(例如，脂质体，白蛋白，微球体，微乳，毫微颗粒和毫微胶囊)中，或包裹在粗乳状液中。这种技术在Remington’sPharmaceutical Sciences，16th edition，Osol，A.，ed(1980)中公开。
对于鼻内给药而言，所述促胰液素受体配体还可被配制成通过适宜的计量或单位装置给药的溶液，或选择性地被配制成使用适当递送装置，与适宜载体混合的粉末。选择性地，促胰液素受体配体还可以类似方式透鼻递送。例如，用于透鼻给药的促胰液素制剂已经在JP60123426中描述。
用于非肠道给药的制剂包括无菌的含水或非水溶液，混悬液或乳液。非水溶剂或悬浮介质的例子是丙二醇，植物油，如橄榄油，及可注射的有机酯，如油酸乙酯。这些组合物还可含有助剂，如防腐剂，湿润剂，乳化剂和分散剂。它们可以是灭菌的，例如，通过留存细菌的过滤器过滤灭菌，通过在组合物中掺入灭菌剂灭菌，通过加热辐照灭菌。它们还可被制备成无菌固体组合物的形式，其可在使用前被立即溶解在无菌的可注射介质中。且作为更惯常使用的静脉内和肌肉内途径，所述组合物还可通过关节内注射而给药。
本发明组合物中活性成分的百分比可发生改变，只要它们组成一定的比例，从而获得所期望的，适宜剂量对胰腺的刺激作用。很明显，各种单位剂量形式大约可同时给药。通常，所述组合物应当含有大约0.1％-80％重量的活性成分。
所用剂量取决于所期望的刺激效果，给药途径和治疗持续时间。对于人类患者而言，典型剂量为10-8-10-3mg/天，优选10-6-10-4mg/天。所述促胰液素受体配体可每天给药或，根据医师的要求减少，例如，每周给药，或直到获得所期望的治疗效果。
下列实施例举例说明本发明。
实施例1：RNA的表达轮廓
检测促胰液素受体信使RNA的表达轮廓(蛋白登记号P47872；核苷酸登记号U28281)。总RNA是使用TriZolTM，一种市售的酚和胍异硫氰酸盐溶液，按照制造商(Life Technologies)所述的方法，从5个对照组供体和5个CF供体的三级/四级支气管和肺实质中分离出来的。只要利用凝胶电泳检测完整的18s和28s核糖体RNA，且如果所形成的基因组DNA少于总核酸样品的10％，那么就可使用RNA样品。总RNA样品被退火成引物探针序列和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH；登记号P04406)引物，且其是使用MuLV逆转录酶逆转录的。定量序列检测是在所得的cDNA上进行的。
申请人已经研究过使用ABI棱柱状7700序列检测系统(PerkinElmer)定量分析mRNA表达的方案。所述系统的详细描述在WO00/05409中提出。简言之，在PCR过程中，所述系统使用荧光探针产生序列特异性荧光信号。所述探针是具有荧光报道分子和猝灭剂染料的寡核苷酸。当探针完整时，报道因子荧光的强度可被猝灭剂抑制。在PCR过程中，当探针形成复制复合体的一部分时，所述猝灭剂是从导致荧光增强的报道分子染料中分离出来的，然后通过ABI7700序列检测器检测。ABI7700的热循环仪中具有一个构件(built)，和一个经由双向纤维光缆对准96样品孔中各孔的激光器。每隔几秒钟即收集一次介于520nm-660nm间的，通过光缆发射到检测器的荧光。系统软件可分析各组分染料对实验光谱的影响，并将信号校准成内标准染料。然后绘制这些校准过的‘报道分子’的峰值(Rn)对热循环数的图，从而得到放大图-使PCR产品产生的程度形象化。
靶序列(Cn)的起始拷贝数是通过测定分段PCR循环数(Ct)而确定的，其中首先检测PCR产品-该点的荧光信号超过临界基准。因此，Ct值越低，Cn越大。各样品靶mRNA量的量化是通过将实验Ct值与靶序列的标准曲线进行比较而确定的，其中所述靶序列的标准曲线是在各实验的过程中绘制的。
引物探针组是为检测促胰液素受体的mRNA而特别设计的。脱机同源性检索显示出与在基因银行登记的基因序列不明显匹配。促胰液素受体的正向和反向引物及探针序列如下：
正向  GACCAGCATCATCTGAGAGGCT  (SEQ ID NO：1)
反向  CCTTCGCAGGACCTCTCTTG  (SEQ ID NO：2)
探针  TCTCTGTCCGTGGGTGACCCTGCT  (SEQ ID NO：3)
GAPDH引物探针组如下：
正向  GAAGGTGAAGGTCGGAGTCAAC  (SEQ ID NO：4)
反向  CAGAGTTAAAAGCAGCCCTGGT  (SEQ ID NO：5)
探针  TTTGGTCGTATTGGGCGCCT  (SEQ ID NO：6)
反应条件是使用基因组DNA作为模板，然后通过探针浓度梯度实验得到引物探针浓度表格而优化的。选择能够产生最有效的基因产物扩增的引物浓度，即，产生较低的临界循环和相对较高的荧光积聚的那些。然后利用这些最佳引物浓度选择最佳的探针浓度。
促胰液素受体与呼吸疾病的关联是通过在三级支气管和实质中绘制促胰液素受体mRNA表达的轮廓而加以证实的，其中所述三级支气管和实质来源于5个完全同意的供体，所述供体在病理学和组织学上被诊断为具有下列呼吸疾病：不吸烟者对照组，吸烟者，气喘，囊性纤维化，肺炎，肺气肿，慢性阻塞性肺病(COPD)。CF肺组织是在经受心脏和肺移植的5名患者完全同意的情况下获得的。
图2表示对照组和CF肺区中，促胰液素受体的不同mRNA表达，其表明CF三级支气管中促胰液素受体的表达增加。数据是由5个对照组和5个囊性纤维组织供体的各肺区中，QRT-PCR临界循环的平均值±s.e.m.表示的。*p＝0.0246表示源于不成对T-试验的统计学显著性。作为对照，图3表示对照组和CF肺区中GAPDH的mRNA表达。数据是由5个对照组和5个囊性纤维组织供体的各肺区中，QRT-PCR临界循环的平均值±s.e.m.表示的。在两组之中和之间，没有观察到统计学差异。
促胰液素受体表达的减少是通过将5名COPD供体的肺实质与5名对照组供体进行比较而加以证实的(p＝0.0465)。然而没有其他供体组显示出促胰液素受体mRNA表达的差异。
然而在所有情况下，促胰液素受体在肺远端区组织中的任何水平的表达均是新奇的，且为本发明提供了基础。
图4表示利用源于25名CF供体和16名不吸烟对照供体的组织随后进行的表达研究的结果。数据是由25名CF供体和16名不吸烟供体的各肺区中，QRT-PCR临界循环的平均值±s.e.m.表示的。**p＝0.009表示得自方差双向分析的统计学显著性。所得结果与图2所得的那些相似，即，与对照组相比，CF三级支气管中促胰液素受体的表达显著增加，两组在实质中的表达水平相似。
实施例1所提供的数据为本发明提供了基础。即，Cl-从呼吸道细胞到气道腔流出的减少代表了CF的病因学问题。然而，离子移动和Cl-通道的这种损耗还可减少碳酸氢盐(HCO3 -)自细胞的分泌，并提高钠离子(Na+)通过上皮，阿米洛利-敏感性Na+通道，到细胞中的重吸收。
健康肺的洗涤物主要由H2O(大约95％)，和维持分泌蛋白，如可溶且惰性的粘液和消化酶的苯巴比妥HCO3 -组成。然而，由于细胞内较高的Na+和Cl-浓度，CF气道的上皮显示出异常高的表面液体吸收速率，因此患者气道内的水分含量非常低。这些可导致粘液显著增稠，及随后由CF肺的粘液纤毛清除的损害。
HCO3 -穿过肺上皮细胞顶膜的移动主要是通过生电Cl-/HCO3 -交换器进行的，水通过简单的渗透扩散或通过促进性转运机理而穿过亲水质膜，其中所述促进性转运机理是由水通道蛋白(AQP)水通道蛋白家族的成员介导的。目前认为HCO3 -和Cl-主要涉及H2O的渗透性移动。
基于促胰液素及其受体对十二指肠和胰腺中的离子调节的生理作用，申请人在本发现的基础上提出促胰液素受体mRNA及功能性表达的增加可代表人体发展的，病理学应答，从而补偿CFTR的缺损。由于促胰液素肽的合成是在十二指肠中进行的，因此肺内的促胰液素受体不与促胰液素肽接触。不受任何一种特定理论的束缚，我们提出通过药理学干预促胰液素受体激动可治疗与CF有关的生物化学呼吸问题的全部或一部分：
(a)通过Cl-通道的cAMP-依赖性激活而刺激Cl-从三级支气管呼吸细胞的流出。促胰液素受体的刺激或毛喉素-介导的cAMP的增加已经显示出可通过大鼠胰腺导管细胞的顶膜，刺激大约4pS较小的，单路Cl-选择性电导(Gray等，1988)。虽然促胰液素已经被证实可刺激CFTR和Cl-穿过非CF人上皮细胞(例如，胆囊)顶膜的流出，所报道的此Cl-电导为6-12pS。因此，Cl-代表了一种选择性的cAMP-依赖性Cl-电导。
(b)刺激cAMP增加，激活蛋白激酶，引发磷酸化作用，及随后呼吸细胞中上皮Na+通道或Na+-K+-ATP酶的调节，由此减少Na+重吸收并刺激肺液移动。这种机理已经在伴有cAMP偶联的β-肾上腺素能受体刺激的大鼠肺泡上皮细胞中被证实(Minakata等，1998)。
(c)随后腔内Cl-水平的增加可起促胰液素激活的Cl-/HCO3-交换器底物的作用，从而使HCO3-生电移动到气道腔中。促胰液素已经被广泛证实可刺激Cl-/HCO3-交换器的活性，所述Cl-/HCO3-交换器与顶端上皮(例如，胆管上皮细胞，Alvaro等，1993；1997)上的cAMP-依赖性Cl-通道(CFTR)功能性连接。这种由促胰液素介导的离子移动已经被证实可刺激生电Na+/HCO3-的协同转运，从而校正细胞内的pH(Ishiguro等，1993)。
(d)此外，已知HCO3-水平的增加可维持粘液中，可溶且惰性的分泌蛋白(Lee等，1999)。
(e)诱导AQPs到质膜中的易位和插入，使水移动到气道腔中。在大鼠cholangiocytes中，促胰液素已经被证实可通过诱导AQP-1水通道的易位而引起渗透H2O渗透性方面，60％的浓度依赖性增加(Marinelli等，1997)。由于通过先前所述机理校正了支气管细胞和气道腔中的Na+，Cl-，HCO3-和pH，因此该过程还可在H2O穿过质膜的渗透扩散的帮助下进行。
为支持这些方案，我们研究了促胰液素对三级支气管组织样品的作用。
实例例2：促胰液素受体在三级支气管中的功能活性
促胰液素受体的功能活性是在三级支气管和源于正常组织三级支气管的上皮细胞中检测的。
简言之，解剖源于非CF供体的人三级支气管的非分支区，纵向切，并将其固定在改进过的乌辛小室的两个隔室之间，从而测量穿过支气管壁的短路电流。在氧化的克雷布斯胞外溶液中浸泡腔(气道)和基底膜，将组织电压调至O，从而使短路电流的改变应答所要测量的促胰液素。开始先将10μM浓度的阿米洛利加入到腔膜中(图5，点a)(如现有技术中的那些所述)，从而部分阻断主要的钠离子流并露出基本离子流。达到稳定基线时，将3μM人促胰液素(由Sima，目录号S714)加入到腔膜中(图5，点b)。
人们发现促胰液素可按照与阴离子(Cl-和/或HCO3 -)移动相同的方式刺激离子移动(图5)。像促胰液素，将10μM ATP或UTP加入到肺上皮的顶膜中被证实可刺激相似值的类似离子移动。这些ATP和UTP介导的作用在文献中被广泛报道，其通过P2Y2 purinoceptor刺激Ca2+激活的Cl-流。所有所述的激动剂，均以高浓度产生相似值的应答。
促胰液素受体的功能性作用是在人三级支气管的上皮细胞中探测的。简言之，三级支气管上皮是通过整夜的蛋白酶消化分离的，然后进行培养直到在Snapwell(costar)可渗透载体上融合。将所述载体固定在改进过的乌辛小室中，并在氧化的克雷布斯胞外溶液中浸泡腔和基底膜。将细胞电压调至0，从而使短路电流的改变应答所要测量的促胰液素。如前所述，先将10μM阿米洛利加入到腔膜中(图6，点a)，然后将100nM促胰液素加入到腔膜中(图6，点b)。与在三级支气管中观察到的结果一致，促胰液素按照与阴离子(Cl-和/或HCO3 -)相同的移动方式刺激离子移动。此外，加入500μM格列本脲后，CFTR的识别抑制剂不能抑制促胰液素介导的离子移动，暗示在CF三级支气管的上皮细胞中可观察到类似的离子移动。
实施例3：CF支气管中离子移动的刺激
使用人CF三级支气管，和1μM促胰液素重复上述实验。所得结果在图7中表示。在点(a)，加入阿米洛利可阻断基础钠流。在点(b)，加入1μM促胰液素可刺激阴离子的离子移动，从而证实非-CF支气管中的实验观察结果。
实施例4：利用促胰液素刺激三级支气管中氯离子的流出
三级支气管上皮细胞中的离子移动是利用Cl-特异性荧光探针MQAE(正-(乙氧羰基甲基)-6-甲氧基喹啉  溴化物；Molecular Probes)表征的。简言之，按照前面所述分离原始的人三级支气管上皮细胞，并在96孔平板中培养。达到融合时，用4mM MAQE整夜装载细胞。在通过加入Cl-游离缓冲液而使Cl-被动流出之前，在含HEPES缓冲液的氯化物中清洗该细胞。加入毫微摩尔浓度的促胰液素可刺激Cl-流出，这一点是通过MQAE荧光的改变而测定的。促胰液素介导的荧光改变是通过加入非选择性Cl-通道阻断剂NPPB(5-硝基-2-(3-苯丙氨基)苯甲酸；100μM)而消除的。所得结果在图8中表示，它表示两种不同浓度促胰液素的作用(空心菱形12.5nM；实心圆圈100nM)。100nM促胰液素介导的Cl-流出是由非选择性Cl-阻断剂NPPB(空心圆圈)抑制的。未刺激过的Cl-流出是通过实心正方形加以证实的。
实施例5：CF三级支气管中嗜铬粒蛋白A的免疫反应性
将恒冷箱切片(5-7μM)从固定的低聚甲醛上切下来，用石蜡包埋5个CF和3个非-CF第四支气管的切片，并用小鼠单克隆嗜铬粒蛋白A抗体(Vector Laboratories Ltd；cat.No.NCL-CHROM)染色，然后用IgG第二抗体染色。使用Vector Universal Elite ABC试剂盒检测抗体的结合。在没有原始阴性对照且似乎没有非特异性结合的情况下，培养相邻的切片。与较少或没有染色的正常组织和对照组相比，在用嗜铬粒蛋白A抗体染色的CF组织中，观察到很多孤立的内分泌细胞。这表明S-型肠内分泌细胞的存在是促胰液素表达调节剂的靶。因此，刺激促胰液素在这种细胞中产生的药剂可用于治疗CF。
实施例6：促胰液素产生的内源性调节
检测了17个正常供体和25个CF肺供体的三级支气管和肺实质中NeuroD的mRNA表达。引物探针组是为检测NeuroD(登记号BAA76603)而特殊设计的。脱机同源性检索显示与在基因银行登记的基因序列不显著匹配。转录因子BETA2/NeuroD的正向和反向引物及探针序列如下：
正向引物  GAACGCGCCGCTAGACA  (SEQ ID NO：7)
反向引物  GTCTCGATTTTGGACAGCTTCTG  (SEQ ID NO：8)
探针      AGCAAGGCACCACCTTGCGCA  (SEQ ID NO：9)
数据(图9)是由QRT-PCR临界循环的平均值±s.e.m.表示的，临界循环越高，基因拷贝数/100ng tRNA越低。
在CF实质中可观察到NeuroD mRNA表达的显著减少，这与在对照组和CF供体三级支气管中较低的存在水平相似。功能性地，CF实质中NeuroD的这种减少可能与内源性促胰液素合成及调节的减少有关。因此，NeuroD功能性表达的提高可导致肺内促胰液素内源性水平的提高，其因此成为利用促胰液素受体的激动来治疗囊性纤维化的间接机理。
总之，促胰液素受体的刺激可用于校正CF的离子和H2O问题，减少粘液层的厚度，并改善肺的粘液纤毛清除。
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Claims (8)

1.一种治疗CF患者囊性纤维化的方法，该方法包括给予所述患者有效量的药剂，该药剂可通过激活促胰液素受体而引发呼吸组织中阴离子的流出。
2.一种治疗COPD患者COPD的方法，该方法包括给予所述患者有效量的药剂，该药剂可通过激活促胰液素受体而引发呼吸组织中阴离子的流出。
3.一种通过激活促胰液素受体而引发呼吸组织中阴离子流出的药剂在制备治疗囊性纤维化或COPD的药物中的用途。
4.根据权利要求1或2所述的方法，或根据权利要求3所述的用途，其中所述药剂是一种促胰液素受体配体。
5.根据权利要求1或2所述的方法，或根据权利要求3所述的用途，其中所述药剂是图1所示的人促胰液素。
6.根据权利要求1或2所述的方法，或根据权利要求3所述的用途，其中所述药剂是通过吸入给药的。
7.一种含有促胰液素受体配体和至少一种具有抗CF活性的其它化合物的组合物。
8.一种含有促胰液素受体配体和至少一种具有抗COPD活性的其它化合物的组合物。
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