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CN1451045A - IFN－α同系物 - Google Patents

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CN1451045A
CN1451045A CN00816713A CN00816713A CN1451045A CN 1451045 A CN1451045 A CN 1451045A CN 00816713 A CN00816713 A CN 00816713A CN 00816713 A CN00816713 A CN 00816713A CN 1451045 A CN1451045 A CN 1451045A
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CN
China
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seq
polypeptide
nucleic acid
interferon
sequence
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CN00816713A
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沃尔克·海因里希斯
特迪·陈
菲利普·A·帕滕
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Maxygen Inc
Original Assignee
Maxygen Inc
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Abstract

本发明提供了干扰素同系物(核酸和多肽)。还提供了包括这些干扰素同系物多肽和核酸的组合物，含有所述同系物多肽和核酸的重组细胞，制备新同系物的方法，针对新同系物的抗体和使用同系物的方法。还提供了含有核酸或多肽。

Description

IFN-α同系物
                         版权声明
按照37C.F.R.1.71(e)，此专利文件的一部分包含受版权保护的资料。当其出现在专利商标局的专利文档或档案中时，版权所有人不反对任何人复制专利文件或专利公开文本，在其它情况下，版权所有人将保留所有的版权。
                    与相关申请的交叉参考
本申请是1999年10月7日提交的美国专利申请流水号09/145,483的部分继续申请，并且要求09/145,483的利益和优先权，为此，09/145,483全文列入本文作为参考。
                         发明领域
本发明涉及生产新的干扰素-α同系物。
                         发明背景
干扰素-α是细胞因子基因多样螺旋束超家族的成员(Sprang，S.R.等(1993)Curr.Opin.Struct.Biol.3：815-827)。人干扰素-α由含有20多个串联复制的非等位基因的家族编码，这些基因在氨基酸水平上有85-98％的序列同一性(Henco，K.等(1985)分子生物学杂志.185：227-260)。
已证实干扰素-α可抑制多种类型的细胞增殖，尤其可用于治疗多种细胞增生性疾病，这些疾病常常与癌症，特别是血癌，如白血病相关。这些蛋白质显示出对以下疾病的抗增殖活性：多发性骨髓瘤，慢性淋巴细胞白血病，低级淋巴瘤，卡波西肉瘤，慢性髓性白血病，肾细胞癌，膀胱肿瘤和卵巢癌(Bonnem，E.M.等(1984)J.Biol.Response Modifiers3：580；Oldham，R.K(1985)Hospital Practice 20：71)。
干扰素-α也可用于抗多种类型的病毒感染(Finter，N.B等(1991)药物42(5)：749)。干扰素-α还显示出抗人乳头瘤病毒感染，乙肝病毒和丙肝病毒感染的活性(Finter，N.B.等，1991，文献同上；Kashima，H等(1988)喉镜98：334；Dusheiko，G.M.等(1986)血液学杂志3(增刊2)：S199；Davis，GL等(1989)新英格兰医学杂志.321：1501)。另外，还研究了干扰素和干扰素受体在某些自身免疫和炎性疾病的发病机理的作用(Benoit，P等(1993)免疫学杂志.150(3)：707)。
尽管这些蛋白质对多种疾病都有治疗价值，但尚未使它们最优化以用作药物。例如，限制剂量的毒性，受体交叉反应性和短的血清半寿期显著削弱了多种此类细胞因子的临床应用(Dusheiko，G.(1997)肝脏病学26：112S-121S；Vial，T和Descotes，J.(1994)Drug Experience 10：115150；Funke，I.等(1994)Ann.Hematol.68：49-52；Schomburg，A.等(1993)J.Cancer Res.Clin.Oncol.119：745-755)。与施用干扰素相伴的多种多样的严重副作用表现包括流感样症状，疲劳，神经学疾病，包括幻觉，发烧，肝酶升高和白细胞减少(Pontzer，C.H.等(1991)癌症研究，51：5304；Oldham，1985，文献同上)。
干扰素-α中大量天然序列多样性的存在(因此重组体具有大的序列空间)，连同干扰素-α/受体相互作用的复杂性，及其多种治疗和预防活性为构建高级干扰素同系物创造了机会。
                           发明简述
本发明提供了新的干扰素-α(IFN-α)同系物多肽，编码所述多肽的核酸，及其互补核苷酸序列，所述多肽和核酸的片断，抗多肽的抗体，及其用途，含有干扰素-α同系物序列特征链的多套数据和使用所述特征链的自动化系统。
一方面，本发明包括分离或重组的干扰素-α核酸同系物。包括选自SEQID NO：1至SEQ ID NO：35，或至SEQ ID NO：72至SEQ ID NO：78的多核苷酸序列及其互补的多核苷酸序列。编码选自SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：81或SEQ ID NO：79至SEQ ID NO：85的多肽的多核苷酸序列及其互补的多核苷酸序列也是本发明的特征。类似地，在高度严紧的条件下与基本上全长的上述任一多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列也是本发明的特征。另外，含有上述任一多核苷酸序列的核苷酸片断的多核苷酸序列也是本发明的特征，其中所述核苷酸片断编码一种多肽，该多肽在基于人Daudi细胞系的细胞增殖试验中具有抗增殖活性。类似地，含有本发明的上述和下述任一多核苷酸序列的核苷酸片断的多核苷酸序列也是本发明的特征，其中所述核苷酸片断编码一种多肽，该多肽在基于鼠细胞系/EMCV的试验中具有抗病毒活性。
本发明还包括分离或重组的核酸，其含有编码多肽的多核苷酸序列，其中所述多肽含有以下氨基酸序列：CDLPQTHSLG-X11-X12-RA-X15-X16-LL-X19-QM-X22-R-X24-S-X26-FSCLKDR-X34-DFG-X38-P-X40-EEFD-X45-X46-X47-FQ-X50-X51-QAI-X55-X56-X57-HE-X60-X61-QTFN-X67-FSTK-X72-SS-X75-X76-W-X78-X79-X80-LL-X83-K-X85-X86-T-X88-L-X90-QQLN-X95-LEACV-X101-Q-X103-V-X105-X106-X107-X108-TPLMN-X114-D-X116-ILAV-X121-KY-X124-QRITLYL-X132-E-X134-KYSPC-X140-WEVVRAEIMRSFSFSTNLQKRLRRKE，或其保守取代的变体，其中X11是N或D；X12是R，S或K；X15是L或M；X16是I，M或V；X19是A或G；X22是G或R；X24是I或T；X26是P或H；X34是H，Y或Q；X38是F或L；X40是Q或R；X45是G或S；X46是N或H；X47是Q或R；X50是K或R；X51是A或T；X55是S或F；X56是V或A；X57是L或F；X60是M或I；X61是I或M；X67是L或F；X72是D或N；X75是A或V；X76是A或T；X78是E或D；X79是Q或E；X80是S，R，T或N；X83是E或D；X85是F或L；X86是S或Y；X88是E或G；X90是Y，H，N；X95是D，E或N；X101是I，M或V；X103是E或G；X105是G或W；X106是V或M；X107是E，G或K；X108是E或G；X114是V，E或G；X116是S或P；X121是K或R；X124是F或L；X132是T，I或M；X134是K或R；和X140是A或S。根据本领域技术人员的一般常识，该氨基酸序列中的每一个单字母表示特定的氨基酸残基。
本发明还涉及具有上述任一序列的多肽，所述序列如SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：54。
在其它实施方案中，编码的多肽含有选自SEQ ID NO：36至SEQ IDNO：54的氨基酸序列；核酸含有选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：19的多核苷酸序列。
本发明还提供了SEQ ID NO：36-70和SEQ ID NO：72-79中任一个的多肽片断。在本发明的一个方面，所述多肽片断在基于人Daudi细胞系的细胞增殖试验中表现出抗增殖活性，或在基于鼠细胞系/EMCV的试验中表现出抗病毒活性，或者同时表现出这两种活性。以下将详细描述基于人Daudi细胞系的细胞增殖试验和在基于鼠细胞系/EMCV的试验中的抗病毒活性。另一方面，本发明提供了含有上述和下述的本发明任一核酸的核苷酸片断的多核苷酸序列，其中所述核苷酸片断编码多肽片断，正如下文所详细描述的那样，所述多肽片断在基于人Daudi细胞系的细胞增殖试验中表现出抗增殖活性，或在基于鼠细胞系/EMCV的试验中表现出抗病毒活性，或者同时表现出这两种活性。
本发明还包括分离的或重组的核酸，其含有编码多肽的多核苷酸序列，其中多肽含有含SEQ ID NO：36-70中任一个的至少20个连续氨基酸的氨基酸序列。在其它实施方案中，本发明的多肽含有包括以下一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列：(Tyr或Gln)34，Gly37，Phe38，Lys71，Ala76，Tyr90，Ile132，Arg134，Phe152，Lys160和Glu166，其中氨基酸残基的编号对应于SEQ ID NO：36氨基酸序列中的残基编号。在多个实施方案中，本发明的被编码多肽含有SEQ ID NO：36-70中任一个的至少30，至少50，至少70，至少75，至少100，至少110，至少120，至少130，至少140，至少150，至少155，至少160，或至少165个连续的氨基酸残基。在其它实施方案中，所编码的多肽长度为至少150，至少155，至少160，至少163，或至少165个氨基酸。在另一个实施方案中，所编码的多肽长度约为166个氨基酸。在其它实施方案中，所编码的多肽含有选自SEQ ID NO：36，SEQ ID N0：37，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42，SEQ IDNO：45和SEQ ID NO：46的氨基酸序列。
在其它实施方案中，本发明提供了含有选自下列的多核苷酸序列的核酸：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ IDNO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。
在其它实施方案中，由本文所述发明中的任何核酸所编码的多肽或其片断在基于人Daudi细胞系的试验中具有抗增殖活性，或在基于人WISH细胞/EMCV的试验中具有抗病毒活性。在其它实施方案中，所编码的多肽在基于人Daudi细胞系的试验中具有至少约为8.3×106个单位/毫克(1个单位是诱导50％抗增殖活性所需的以毫克(mg)计的蛋白质量)的抗增殖活性，或者在基于人WISH细胞/EMCV的试验中具有至少约为2.1×107个单位/毫克(1个单位是诱导50％抗病毒活性所需的以mg计的蛋白质量)的抗病毒活性。在其它实施方案中，所编码的多肽能结合I型干扰素受体，优选结合人I型干扰素受体，更优选结合人(例如I型)干扰素-α受体。
本发明还包括含有本文所述发明中的任何核酸，或者表达本文所述发明中的任何多肽的细胞。在一个实施方案中，所述细胞表达由本文所述发明中的核酸所编码的多肽。
本发明还包括含有上述和下述发明中的任何核酸的载体。所述载体包括质粒，粘粒，噬菌体，或病毒；载体可以是例如表达载体，克隆载体，包装载体，整合载体等。本发明还包括被本发明的载体转导的细胞。本发明还包括组合物，其含有上述和下述发明中的任何核酸和赋形剂(优选为药物可接受的赋形剂)。本发明还包括通过例如转导载体而产生的，包括上述和下述发明中的任何多肽或核酸的细胞和转基因动物。
本发明还包括通过用限制性内切核酸酶，RNA酶或DNA酶消化上述或下述发明中的一种或多种核酸而产生的组合物；以及通过在脱氧核糖核苷酸三磷酸和核酸聚合酶，如热稳定性的聚合酶的存在下，保温上述或下述发明中的一种或多种核酸而产生的组合物。
本发明还包括含有上述或下述两种或多种核酸的组合物。所述组合物可包括核酸文库，其中所述文库含有至少约5，10，20或50种核酸。
另一方面，本发明包括分离的或重组的多肽，所述多肽由上述或下述的任何核酸所编码。在一个实施方案中，所述多肽可含有选自SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：70，或SEQ ID NO：79至SEQ ID NO：85的序列。
本发明还包括多肽，其含有由多核苷酸序列所编码的蛋白质的至少50个连续的氨基酸，其中多核苷酸序列选自：(a)SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：72至SEQ ID NO：78；(b)编码选自SEQ ID NO：36至SEQ IDNO：70或SEQ ID NO：79至SEQ ID NO：85的多肽的多核苷酸序列；和(c)在高度严紧条件下，与基本上全长的多核苷酸序列(a)或(b)杂交的多核苷酸序列的互补序列。在多个实施方案中，多肽含有所编码蛋白质的至少约70，100，120，130，140，150，155，160，165或166个连续的氨基酸。
本发明还包括分离的或重组的多肽，其含有氨基酸序列，该氨基酸序列含有SEQ ID NO：36-70中任一个的至少50个连续氨基酸残基，和以下一个或多个氨基酸：Ala19，(Tyr或Gln)34，Gly37，Phe38，Lys71，Ala76，Tyr90，Ile132，Arg134，Phe152，Lys160和Glu166，其中氨基酸的编号对应于SEQ ID NO：36中的编号。在多个实施方案中，多肽含有SEQ ID NO：36-70中任一个的至少约50，70，75，100，110，120，130，140，150，155，160，163，165或166个连续的氨基酸。在更优选的实施方案中，多肽含有SEQ ID NO：36，SEQ ID N0：37，SEQ ID NO：39，SEQ IDNO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：45或SEQ ID NO：46中任一个的至少约50，70，75，100，110，120，130，140，150，155，160，163，165或166个连续的氨基酸残基。在其它实施方案中，本发明多肽的长度至少约为50，70，75，100，110，120，130，140，150，155，160，163，165或166个氨基酸残基，或优选其长度为166个氨基酸。也可以使用较长的多肽，例如含有纯化标记等的多肽。所述多肽可在基于人Daudi细胞系的试验中显示出抗增殖活性，和/或在基于人WISH细胞/EMCV的试验中显示出抗病毒活性。
本发明还包括与抗至少一种抗原的多克隆抗血清特异性结合的多肽，所述至少一种抗原含有选自SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：79至SEQ ID NO：85所示氨基酸序列或其片断的多肽序列。特别地，本发明提供了与抗至少一种抗原的多克隆抗血清结合的多肽，其中所述的至少一种抗原含有SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：79至SEQ ID NO：85所示的至少一种氨基酸序列，或上述任一氨基酸序列的片断，其中已用一种或多种已知的干扰素-α多肽或蛋白质减除(subtract)多克隆抗血清，所述多肽或蛋白质包括例如由具有或对应于下列一个或多个GenBankTM登记号的核酸和GenBank中所述的其它类似或同源的干扰素-α核酸序列所编码的多肽或蛋白质，所述GenBankTM登记号为：J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)。
上述或下述任何多肽任选在基于人Daudi细胞系的试验中具有抗增殖活性，和/或在基于人WISH细胞/EMCV的试验中具有抗病毒活性。上述或下述任何多肽在基于人Daudi细胞系的试验中具有至少约为8.3×106个单位/mg的抗增殖活性，或者在基于人WISH细胞/EMCV的试验中具有至少约为2.1×107个单位/mg的抗病毒活性。在其它实施方案中，上述或下述任何多肽能结合I型干扰素受体，优选结合人I型干扰素受体，更优选结合人干扰素-α受体。
在其它实施方案中，上述或下述任何多肽可进一步包括分泌/定位序列，如信号序列，细胞器靶向序列，膜定位序列等。本文所述的任何多肽可进一步包括有利于纯化的序列，例如表位标记(如FLAG表位)，多聚组氨酸标记，GST融合物等。任选地，多肽的N末端可包含甲硫氨酸。本文所述发明中的任何多肽任选包括一个或多个经修饰的氨基酸，如糖基化氨基酸，PEG化氨基酸，法尼基化氨基酸，乙酰基化氨基酸，生物素化氨基酸，羧基化氨基酸，磷酸化氨基酸，酰化氨基酸等。
本发明还包括组合物，其含有本文所述的任何多肽以及赋形剂，优选为药物可接受的赋形剂。
本发明还包括通过给哺乳动物施用一种或多种本文所述发明的多肽而产生的抗体或抗血清，其中所述抗体或抗血清不与已知的α-干扰素多肽或蛋白质特异性结合，所述多肽或蛋白质包括例如由具有或对应于下列一个或多个GenBankTM登记号的核酸和GenBank中所述的其它类似或同源的干扰素-α序列所编码的任何多肽或蛋白质，所述GenBankTM登记号为：J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)。
本发明还包括抗体，它能与含有选自SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：79至SEQ ID NO：85之序列的多肽特异性结合。所述抗体是例如多克隆抗体，单克隆抗体，嵌合抗体，人源化抗体，单链抗体，Fab片断，通过Fab表达文库产生的片断等。
本发明还包括生产本发明多肽的方法。一种方法包括：将本文所述的任何核酸导入细胞群体，所述核酸与能有效生产编码多肽的调节序列可操作相连，在培养基中培养细胞以生产多肽，并任选从细胞或培养基中分离多肽。核酸可以是载体的一部分，例如重组表达载体。
本发明还包括抑制肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括将肿瘤细胞与本文所述发明的多肽接触，从而抑制肿瘤细胞的生长。在一个实施方案中，本发明包括抑制肿瘤细胞群体生长的方法，所述方法包括：将肿瘤细胞群体与足以抑制所述肿瘤细胞群体中的肿瘤细胞生长的有效量的本发明多肽接触，从而抑制所述细胞群体中的肿瘤细胞生长。在多个实施方案中，肿瘤细胞可以是人癌细胞，人白血病细胞，人T-淋巴瘤细胞，人黑素瘤细胞，本文所述的其它人癌细胞等。肿瘤细胞可以是体内的，来自体内的或体外的(例如经培养的细胞)。
本发明还包括抑制被病毒感染的一个或多个细胞内的病毒复制的方法，所述方法包括：将一个或多个被感染的细胞与有效量的上述和下述发明中的多肽接触，从而抑制所述一个或多个细胞中的病毒复制，其中所述的量足以抑制所述一个或多个感染细胞内的病毒复制。在多个实施方案中，病毒可以是RNA病毒，例如人类免疫缺损病毒或丙肝病毒，也可以是DNA病毒，例如乙肝病毒。被感染的细胞可以是体内的，来自体内的或体外的(例如经培养的细胞)。
本发明还包括为有治疗需求的受试者治疗自身免疫病的方法，所述方法包括：给受试者施用足以治疗自身免疫病的，有效量的本文所述发明的多肽。在多个实施方案中，自身免疫病可以是多发性硬化，类风湿性关节炎，红斑狼疮，I型糖尿病等。本发明还包括对通过给受试者施用干扰素-α即可治疗的疾病的治疗方法的改进，所述改进包括：给受试者施用足以治疗所述疾病的，有效量的本文所述发明的多肽。通过给受试者施用干扰素-α即可治疗的疾病可以是多发性硬化，类风湿性关节炎，红斑狼疮，I型糖尿病，AIDS或AIDS-相关综合征等。
一般说来，本发明还包括通过突变本文的序列而得到的核酸和蛋白质。类似地，本发明还包括通过多样性生成或重复序列重组(RSR)法(例如DNA改组)而产生的那些核酸和蛋白质。本发明还包括使用本文所述核酸进行的突变和重组方法。例如，本发明的一种方法包括将上述和下述发明中的一种或多种核酸序列与一种或多种其它核酸(包括但不限于本文所述的那些)反复重组，一种或多种其它核酸中的每个序列编码干扰素-α同系物或其氨基酸亚序列。重组步骤任选在体内，来自体内，in silico或体外进行。所述重复重组可产生至少一个重组干扰素-α同系物核酸文库。本发明还包括通过此方法产生的重组干扰素-α同系物核酸，含有所述重组干扰素-α同系物核酸的细胞，通过此重复重组方法产生的核酸文库，含有两种或多种所述重组干扰素-α核酸的组合物，和含有所述重组干扰素-α核酸或含有所述文库的细胞群体。在一个实施方案中，所述文库含有至少10种所述重组核酸。
本发明还提供了生产经修饰的或重组的干扰素-α同系物核酸的方法，该方法包括突变本文所述发明的核酸。
本发明还提供了编码干扰素-α同系物的核酸，分别相对于人干扰素-α2a或其它已知的干扰素-α对细胞群体的生长抑制活性，细胞静止(cytostatic)活性或细胞毒活性而言，所述同系物对细胞群体(例如癌细胞)具有增加的生长抑制活性，细胞静止(cytostatic)活性或细胞毒活性。
结合附图与以下的详细描述部分，可以更清楚地了解本发明的这些和其它目的和特征。
                      附图简述
图1A-1E显示了本发明例举的成熟干扰素同系物多肽序列(SEQ IDNO：36-70和79-85)的序列对比排列。
图2显示的是：分别相对于两种对照化合物，即人干扰素α-2a(“IFN-α-2a”或“2a”)和共有人干扰素(“IFN-Conl”或“Con1”)各自的抗增殖活性和抗病毒活性而言，本发明例举的干扰素同系物在基于人Daudi细胞系的试验中的抗增殖活性，和在基于人WISH细胞/EMCV的试验中的抗病毒活性。
图3A，3B和3C阐明了IFN-α同系物3DA11(SEQ ID NO：40)和对照干扰素，人干扰素α-2a(“2a”)和共有人干扰素α(“Con1”)对一系列肿瘤细胞系的活性分布图。图3A显示了IFN-α同系物3DA11和每种对照IFN对各个细胞系的细胞总生长抑制活性，所述活性以GI50值来反映，GI50是使特定细胞系的生长50％受抑制所需的干扰素α同系物或对照IFNα的浓度(μg/ml)，该值是通过在保温期结束时，干扰素α同系物或对照IFNα实验组中净蛋白质/多肽的增加度减少50％来测定的。
图3B显示了IFN-α同系物3DA11和每种对照IFN对一系列细胞系中的各个细胞系的静止活性。静止活性指的是能抑制细胞生长和繁殖的活性。静止活性被评定为将特定细胞系的细胞的生长和/或繁殖完全抑制，以使保温期结束时细胞蛋白质的量等于保温期开始时细胞蛋白质的量(“总生长抑制”或“TGI”)所需的干扰素α同系物或对照IFNα浓度(μg/ml)的反映。
图3C阐明了IFN-α同系物3DA11和每种对照IFN对各个细胞系的细胞毒活性。药剂(如IFN同系物或IFN化合物)的细胞毒性是该药剂对某些细胞具有的特定破坏作用的程度，或指具有所述破坏作用。该术语一般指的是能导致细胞死亡的药剂，并特别地用于指免疫现象导致的细胞裂解，和选择性杀死分裂细胞的化合物药剂。在图3C中，以LC50来阐明细胞毒性，观察与保温期开始时的细胞净蛋白质量相比，在保温结束时，使对照细胞(对照IFNα)中的净蛋白质增加度降低50％所需的IFN-α同系物3DA11的浓度(μg/ml)，表示在加入特定干扰素之后的细胞净损失。细胞毒性可被评定为：相对于对照细胞而言，破坏或杀死特定细胞系总细胞数(即总群体)的50％所需的IFN-α同系物3DA11的浓度。
图4A，4B，4C和4D分别显示的是：相对于两种对照干扰素α，即人干扰素-α2a(“2a”)和共有人干扰素-α(“Con1”)对白血病细胞系(RPMI-8226)(图4A)，肺癌细胞系(NCI-H23)(图4B)，肾癌细胞系(ACHN)(图4C)和卵巢癌细胞系(OVCAR-3)(图4D)的细胞静止活性而言，选定的本发明干扰素-α同系物的相应细胞静止活性。细胞静止活性由特定干扰素α的TGI值(使细胞系的细胞生长全面受抑制所需的干扰素α浓度，其中保温期结束时的细胞蛋白质的量等于保温期开始时的细胞蛋白质的量)来反映。
图5表示在分别施用了剂量为2μg，10μg和50μg的两种例举的本发明干扰素-α同系物(被称为“IFN-CH2.2”和“IFN-CH2.3”)，剂量为2μg，10μg和50μg的鼠IFN-α-4和剂量为2μg，10μg和50μg的人IFN-α-2a之后，存活的小鼠数目(小鼠总数为6)的比较。图5所示的结果表明：在鼠模型系统中，这两种例举的IFN-α同系物的改良体外抗病毒活性可以在体内维持和延续。磷酸-缓冲盐水(PBS)被用作对照。
                           发明详述 定义
除非本说明书其余部分的上下文中另有定义，本文所用的所有技术和科学术语都与本发明所属领域的普通技术人员一般理解的含义相同。
根据上下文，“多核苷酸序列”是核酸(核苷酸(A，C，T，U，G等，或者是天然或人工核苷酸类似物)的聚合物)或表述核酸的特征链。由任何特定的多核苷酸序列可确定给定的核酸或互补核酸。
类似地，根据上下文，“氨基酸序列”是氨基酸的聚合物(蛋白质，多肽等)，或表述氨基酸聚合物的特征链。由任何特定的多核苷酸序列可确定给定的核酸或互补核酸。
当核酸，蛋白质，肽，多肽或其它组分与天然状态下与其相关联的组分(其它肽，多肽，蛋白质(包括复合物，例如与天然序列相伴随的聚合酶和核糖体)，核酸，细胞，合成试剂，细胞杂质，细胞组分等)，例如在其来源细胞中正常与其相关联的其它组分部分或完全分开时，即可认为它们是“分离的”。当核酸，多肽或其它组分与其天然环境中的其它组分部分或完全分开或从中被部分或完全回收，使得它们在组合物，混合物或组分收集物中作为占绝对优势的种类存在(即在摩尔基础上，它们比组合物中的任何其它各个种类的含量更高)时，也可以说它们是分离的。在优选实施方案中，制品由多于70％，一般多于80％，或优选多于90％的该被分离种类组成。
一方面，“基本上纯的”或“分离的”核酸(例如RNA或DNA)，多肽，蛋白质或组分也指目的种类(例如核酸或多肽)至少约占所存在的所有大分子种类之重量(在摩尔基础上)的50，60或70％。基本上纯的或分离的组分也可以至少约占组合物中所存在的所有大分子种类之重量的80，90或95％。分离的目的种类也可以被纯化成实质上为均质(通过常规的检测方法检测不到组分中的杂质种类)，其中组分实质上由单一大分子种类的衍生物组成。
术语“分离的核酸”可以指与在产生本发明核酸的生物体的天然基因组中与其紧邻的两个编码序列(即一个在5’末端，一个在3’末端)不紧邻的核酸(如DNA或RNA)。因此，该术语包括例如通过聚合酶链反应(PCR)或限制性内切核酸酶处理而产生的cDNA或基因组DNA片断，而不论该cDNA或基因组DNA片断是掺入载体，整合至与其来源生物体相同或不同物种(包括例如病毒)的基因组中，还是与其它编码序列连接形成编码嵌合多肽的杂合基因，或者是不依赖于任何其它DNA序列。DNA可以是双链或单链，有义或反义。
当核酸或多肽为人工的或经基因工程方法改造的，或者衍生自人工的或经改造的蛋白质或核酸时，可以说它们是“重组的”。当用于谈及例如细胞，核苷酸，载体或多肽时，术语“重组”一般表示已通过导入异源(或外源)核酸或改变天然核酸来修饰所述细胞，核苷酸或载体，或者表示已通过导入异源氨基酸来修饰多肽，或者表示细胞源自经如此修饰的细胞。重组细胞表达在细胞的天然(非-重组)形式中未曾发现过的核酸序列(例如基因)，或者表达可能会被异常表达，少量表达或根本不表达的天然核酸序列(例如基因)。术语“重组核酸”(例如DNA或RNA)分子指的是例如非天然的核苷酸序列，或通过至少两个一般不同时出现，彼此不相关，或者要不然彼此是分开的序列区段的参与(例如人工组合)而制备的核苷酸序列。重组核酸可含有通过将不同来源的和/或人工合成的核酸区段连接在一起或组合起来而形成的核酸分子。术语“重组产生”指的是通常通过以下方法即可实现的人工组合，所述方法包括化学合成方法，核酸区段的重复序列重组或其它核苷酸多样性的生成方法(例如改组)，或通过例如本领域技术人员已知的基因工程技术对分离的核酸区段进行操作。“重组表达”一般指在体外产生重组核酸，将重组核酸转移至体内，体外或来自体内的细胞，并在其中表达或增殖重组核酸的技术。“重组多肽”或“重组蛋白质”通常分别指由克隆或重组的基因或核酸产生的多肽或蛋白质。
“亚序列”或“片断”是完整序列的任何部分，长达和包括完整的序列。
当任何给定聚合物组分(氨基酸残基，掺入的核苷酸等)的位置通过参照选定氨基酸或核苷酸中的相同残基位置，而不是给定聚合物中的组分的实际位置来指定时，给定氨基酸或核苷酸聚合物的编号“对应于”选定氨基酸聚合物或核酸的“编号”。
载体是便于将选定核酸转导至细胞，或在细胞中表达核酸的成分。载体包括例如质粒，粘粒，病毒，YAC，细菌，多聚-赖氨酸等。“表达载体”是重组或合成产生的核酸构建体，它具有一系列允许在宿主细胞中转录特定核酸的特定核酸元件。表达载体可以是质粒的一部分，病毒或核酸片断。表达载体一般包括与启动子可操作相连的待转录核酸。
“基本上全长的多核苷酸或氨基酸序列”指至少约为全长的50％，至少约为60％，一般至少约为70％，一般至少约为80％，或一般至少约为90％，95％，96％，97％，98％或99％或更长的氨基酸序列或核酸序列。
“人α-干扰素受体”是在人细胞中被α干扰素天然激活的受体。
某一物质是“天然的”指的是可以在自然界中发现该物质这一事实。例如，存在于生物体包括病毒中，可从其天然来源中分离得到，并且未在实验室中被人为地有意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然的。在一个方面，“天然”核酸(例如DNA或RNA)分子是以与天然存在的状态相同的状态存在的核酸分子；即核酸分子不是分离的，重组的或克隆的。
本文所用的“抗体”指的是蛋白质，其含有一种或多种基本上或部分由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片断编码的多肽。公知的免疫球蛋白基因包括κ，λ，α，γ，δ，ε和μ恒定区基因，以及各种免疫球蛋白可变区基因。轻链被分为κ或λ。重链被分为γ，μ，α，δ或ε，它们反过来也将免疫球蛋白的类型分别限定为IgG，IgM，IgA，IgD和IgE。典型的免疫球蛋白(如抗体)结构单位含有四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链组成，每对多肽链具有一条“轻链”(约25kD)和一条“重链”(约50-70kD)。每条链的N-末端限定约100至110或更多个氨基酸的可变区，所述可变区主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指的是这些轻链和重链。抗体的存在形式可以是完整的免疫球蛋白，或是由多种肽酶消化产生的多个已被详细鉴定的片段。因此，例如，胃蛋白酶在绞链区中的二硫键处消化抗体，产生Fab的二聚体F(ab)’2，Fab自身是通过二硫键与VH-CH1连接的轻链。可在温和的条件下还原F(ab)’2，打断绞链区中的二硫键，从而将F(ab)’2二聚体转变为Fab’单体。Fab’单体实质上是具有部分绞链区的Fab(关于其它抗体片段的详细描述可参见“基础免疫学”，W.E.Paul编，Raven出版社，纽约(1993))。尽管通过消化完整抗体可得到多个抗体片段，但本领域技术人员仍希望可通过化学方法或利用重组DNA方法学来从头合成这些Fab’片段。因此，本文所用术语抗体也包括通过修饰完整抗体而产生的抗体片段，或使用重组DNA方法学从头合成的抗体片段。抗体包括单链抗体，所述单链抗体包括单链Fv(sFv)抗体，其中可变重链和可变轻链(直接或通过肽接头)连接在一起，形成延伸的多肽。
抗体的“抗原-结合片段”是抗体中与抗原结合的肽或多肽片段。抗体中有益于，参与，或影响与抗原的结合的那些氨基酸形成了抗原-结合位点。参见Scott，T.A和Mercer，E.I.，简明百科全书：生物化学和分子生物学(deGruyter，第3版，1997)[下文简称为″Scott，简明百科全书″]和Watson，J.D等，重组DNA(第2版，1992)[下文简称为″Watson，重组DNA″]，每篇文献都全文列入本文作为参考。
“免疫原”指的是能引起免疫应答的物质。免疫原的例子包括例如抗原，在诱导自身免疫病时起作用的自身抗原，和癌细胞上表达的肿瘤-相关抗原。
“抗原”是这样一种物质，它能在宿主中引发抗体形成，或者能产生与所述物质反应的特异性淋巴细胞群体。抗原一般是对宿主而言为外源的大分子(例如蛋白质和多糖)。
术语“免疫测定法”包括使用抗体或免疫原结合或特异性结合抗原的检测法。免疫测定法的典型特征在于利用特定抗体的特异性结合特性来分离，靶向，和/或定量抗原。
术语“同源性”一般指两种或多种结构之间的相似性程度。术语“同源序列”指大分子中具有相似的单体顺序的区域。当用于核酸序列时，术语“同源性”指的是两种或多种核酸序列(如基因)或其片段之间的相似性程度。一般说来，两种或多种核酸序列之间的相似性程度指的是：两种或多种核酸序列中的两个或多个核苷酸碱基(或其它基因型特征)的组成，顺序或排列的相似性程度。术语“同源核酸”一般指含有在核苷酸碱基组成，排列或顺序上具有一定程度相似性的核苷酸序列的核酸。两种或多种核酸可以是相同或不同的种类或组。术语“同源性百分比”当用于核酸序列时，一般指的是两种或多种核酸的核苷酸序列之间相似性的百分比程度。
当用于多肽(或蛋白质)序列时，术语“同源性”指的是两种或多种多肽(或蛋白质)序列(如基因)或其片段之间的相似性程度。一般说来，两种或多种多肽(或蛋白质)序列之间的相似性程度指的是：两种或多种多肽(或蛋白质)中的两个或多个氨基酸的组成，顺序或排列的相似性程度。两种或多种多肽(或蛋白质)可以是相同或不同的种类或组。术语“同源性百分比”当用于多肽(或蛋白质)序列时，一般指的是两种或多种多肽(或蛋白质)序列的氨基酸序列之间相似性的百分比程度。术语“同源多肽”或“同源蛋白质”一般分别指具有相似的氨基酸序列和功能的多肽或蛋白质。这种同源多肽或蛋白质的相关性体现在具有相似的氨基酸序列和功能，但使用本文所述的技术，可以从不同或相同的物种中衍生或获得它们。
本文所用术语“受试者”包括但不限于生物；哺乳动物，包括例如人，非人灵长类动物(如猴)，小鼠，猪，奶牛，山羊，兔，大鼠，豚鼠，仓鼠，马，猴，绵羊或其它非人哺乳动物；非-哺乳动物，包括例如非-哺乳类脊椎动物，如鸟类(如鸡或鸭)或鱼；和非-哺乳类无脊椎动物。
术语“药物组合物”指的是适于给包括动物或人的受试者用作药物的组合物。药物组合物一般包含有效量的活性剂和药物可接受的载体。
术语“有效量”指的是足以产生所需效果的剂量或量。所需效果包括在所述剂量或量的受体中产生的客观或主观的改善。
“预防性治疗”是给未显示出疾病迹象或症状，或仅显示出疾病的早期迹象或症状的受试者施用治疗，使得所施用的治疗能减弱，防止或减少产生疾病的风险。预防性治疗的作用是预防性地治疗疾病。“预防活性”指诸如核酸，载体，基因，多肽，蛋白质，物质，其组合物的药剂施用于未显示出疾病迹象或症状，或仅显示出疾病的早期迹象或症状的受试者后，能减弱，防止或减少受试者产生疾病的风险的活性。“可用于预防的”药剂或化合物(如核酸或多肽)指的是可用于减弱，防止，治疗或减少疾病的产生的药剂或化合物。
“治疗性治疗”是给显示出疾病的症状或迹象的受试者施用的治疗，其中给受试者施用治疗的目的是减弱或消除疾病的迹象或症状。“治疗活性”指诸如核酸，载体，基因，多肽，蛋白质，物质，或其组合物的药剂施用于显示出疾病的迹象或症状的受试者后，能消除或减弱这些迹象或症状的活性。“可用于治疗的”药剂或化合物(如核酸或多肽)指的是可用于减弱，治疗或消除疾病的迹象或症状的药剂或化合物。
术语“基因”广义地指任何与生物学功能相关的DNA区段。基因包括编码序列和/或其表达所需的调控序列。基因也包括非-表达的DNA核酸区段，例如形成其它蛋白质的识别序列的区段。
一般说来，下文所用的术语和下文所述的细胞培养，分子遗传学，分子生物学，核酸化学和蛋白质化学的实验室方法都是本领域技术人员众所周知的和常用的那些术语和方法。如Sambrook等，分子克隆-实验室手册(第2版)，Vol.1-3，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989(下文简称为″Sambrook″)和最新分子生物学方法，F.M.Ausubel等编，最新方法，Greene PublishingAssociates，Inc和John Wiley & Sons，合资公司(1999年增补)(下文简称为″Ausubel″)中所述的标准技术可用于重组核酸方法，核酸合成，细胞培养方法和转基因掺入，如电穿孔，注射和脂质转染法。一般情况下，根据说明书进行寡核苷酸合成和纯化步骤。一般根据本领域的常规方法和本文中提供的多篇普通参考文献进行技术和方法的操作。其中的方法据信是本领域技术人员众所周知的，为了方便读者，提供了这些方法。
本文定义或表征了多个其它的术语。本发明的多核苷酸 干扰素-α同系物序列
本发明提供了分离或重组的干扰素-α同系物多肽，和编码该多肽的分离或重组的多核苷酸。
如下文所详细描述的那样，根据本发明，编码新的干扰素-α同系物多肽的多核苷酸序列，编码干扰素-α同系物多肽片段的核苷酸序列(如亚序列)和编码相关融合多肽或蛋白质或其功能等同物的核苷酸序列，在本文中被统称为“干扰素-α同系物”，“干扰素同系物核酸”，“IFN-α同系物”，“IFN同系物”，“IFN核酸”，“干扰素同系物”，“干扰素核酸”，“重组干扰素-α”，“重组干扰素-α核酸”，“本发明的核酸”，“本发明的多核苷酸”或“本发明的核苷酸”。本发明的多核苷酸，核苷酸和核酸中也包括和包含上述各个术语的多核苷酸，核苷酸和核酸片段。术语“核酸”和术语“核苷酸”可以互换使用。
在经改组的干扰素-α相关序列的文库中发现了编码本发明多肽的多核苷酸。筛选文库成员对人肿瘤细胞系的抗增殖活性，并在某些情况下分析它们对感染了病毒的人细胞的抗病毒活性。在筛选出的针对感染了病毒的小鼠细胞具有抗病毒活性的经改组文库中，发现了本文提供的序列子集。按实施例中所述鉴定干扰素同系物的编码序列。
简单地说，将经改组的成熟干扰素-α编码序列的文库导入大肠杆菌。按实施例1所述，在针对人Daudi肿瘤细胞系的高-物料流通量的抗增殖活性试验中筛选菌落，选择表达活性多肽的菌落，再-筛选，测定表达水平。分离选定菌落的DNA，对其进行再-改组以产生第二代文库，将第二代文库导入大肠杆菌，在基于人Daudi细胞系的细胞增殖试验中筛选抗增殖活性。将选自第一和第二代文库筛选的菌落的DNA转导至中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，产生稳定的细胞系。按实施例1所述，纯化，定量CHO表达的蛋白质，并使用人Daudi细胞系分析其抗增殖活性，任选使用被脑心肌炎病毒(EMCV)感染的人WISH细胞分析其抗病毒活性。编码干扰素-α同系物多肽的经改组核酸的例子在本文中被鉴定为SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：35，所述多肽在基于人Daudi细胞系的试验中具有抗增殖活性，所述核酸分别编码在本文中被鉴定为SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：70的成熟干扰素-α同系物多肽。另外，在针对被EMCV感染的小鼠细胞的高物料流通量的抗病毒活性筛选试验中筛选经改组的成熟干扰素-α编码序列文库。编码在基于鼠细胞/EMCV的试验中具有抗病毒活性的多肽的经改组核酸的例子在本文中被鉴定为SEQ IDNO：72至SEQ ID NO：78，所述核酸编码在本文中被鉴定为SEQ ID NO：79至SEQ ID NO：85的成熟干扰素同系物多肽。
另一方面，本发明提供了分离或重组的核酸，其含有选自下列的多核苷酸序列：(a)SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：35，或其互补多核苷酸序列；(b)编码选自SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：71的多肽的多核苷酸序列，或其互补多核苷酸序列；(c)在至少严紧或至少高度严紧的杂交条件(或超-高度严紧或超-超-高度严紧杂交条件)下，与基本上全长的多核苷酸序列(a)或(b)，或与多核苷酸序列(a)或(b)的50，120，130，140，145，150，155，160或165个核苷酸碱基的亚序列或片段杂交的多核苷酸序列；和(d)含有(a)，(b)或(c)之片段的多核苷酸序列，所述片段编码完整或部分多肽，所述多肽在基于人Daudi细胞系的试验中具有抗增殖活性，或在本领域已知的用于测定抗病毒活性的试验中具有抗病毒活性。
另一方面，本发明提供了分离或重组的核酸，其含有选自下列的多核苷酸序列：(a)SEQ ID NO：72至SEQ ID NO：78，或其互补多核苷酸序列；(b)编码选自SEQ ID NO：79至SEQ ID NO：85的多肽的多核苷酸序列，或其互补多核苷酸序列；(c)在至少严紧或至少高度严紧的杂交条件(或超-高度严紧或超-超-高度严紧杂交条件)下，与基本上全长的多核苷酸序列(a)或(b)，或与多核苷酸序列(a)或(b)的50，120，130，140，145，150，155，160或165个核苷酸碱基的亚序列或片段杂交的多核苷酸序列；和(d)含有(a)，(b)或(c)之片段的多核苷酸序列，所述片段编码完整或部分多肽，所述多肽在基于人Daudi细胞系的试验中具有抗增殖活性，或在基于鼠细胞系/EMCV的试验中具有抗病毒活性。
本发明也包括成熟的干扰素-α同系物多肽，其含有在本文中被鉴定为SEQ ID NO：71的氨基酸，本发明还包括编码所述多肽或所述多肽的片段的多核苷酸序列，所述多肽片段在基于人Daudi细胞系的试验中具有抗增殖活性，和/或在基于鼠细胞/EMCV的试验中具有抗病毒活性。
本发明还包括分离或重组的核酸，其含有编码多肽的多核苷酸序列，其中多肽含有以下氨基酸序列：CDLPQTHSLG-X11-X12-RA-X15-X16-LL-X19-QM-X22-R-X24-S-X26-FSCLKDR-X34-DFG-X38-P-X40-EEFD-X45-X46-X47-FQ-X50-X51-QAI-X55-X56-X57-HE-X60-X61-QTFN-X67-FSTK-X72-SS-X75-X76-W-X78-X79-X80-LL-X83-K-X85-X86-T-X88-L-X90-QQLN-X95-LEACV-X101-Q-X103-V-X105-X106-X107-X108-TPLMN-X114-D-X116-ILAV-X121-KY-X124-QRITLYL-X132-E-X134-KYSPC-X140-WEVVRAEIMRSFSFSTNLQKRLRRKE，或其保守取代的变体，其中X11是N或D；X12是R，S或K；X15是L或M；X16是I，M或V；X19是A或G；X22是G或R；X24是I或T；X26是P或H；X34是H，Y或Q；X38是F或L；X40是Q或R；X45是G或S；X46是N或H；X47是Q或R；X50是K或R；X51是A或T；X55是S或F；X56是V或A；X57是L或F；X60是M或I；X61是I或M；X67是L或F；X72是D或N；X75是A或V；X76是A或T；X78是E或D；X79是Q或E；X80是S，R，T或N；X83是E或D；X85是F或L；X86是S或Y；X88是E或G；X90是Y，H，N；X95是D，E或N；X101是I，M或V；X103是E或G；X105是G或W；X106是V或M；X107是E，G或K；X108是E或G；X114是V，E或G；X116是S或P；X121是K或R；X124是F或L；X132是T，I或M；X134是K或R；和X140是A或S。根据本领域技术人员的一般常识，该氨基酸序列中的每一个单字母表示特定的氨基酸残基。所述多肽在基于人Daudi细胞系的试验中具有抗增殖活性(例如至少约为8.3×106个单位/mg)，和/或在基于人WISH细胞/EMCV的试验中具有抗病毒活性(至少约为2.1×107个单位/mg)。
如下文所详述，本发明的多核苷酸可用于多个方面，包括但不限于：在体内和来自体内地治疗多个受试者的多种疾病的方法中用作治疗剂和预防剂；用于体外方法，如诊断方法以检测，诊断和治疗多个受试者的多种疾病；用于例如基因治疗；在例如治疗性和预防性地治疗疾病的方法中用作治疗剂和预防剂；用作免疫原；用于诊断和筛选试验；用作诊断探针以探测互补或部分互补的核酸的存在(包括检测编码IFN-α的核酸)。制备本发明的多核苷酸
可根据已知的合成方法，通过标准的固相方法制备本发明的多核苷酸和寡核苷酸。一般说来，单独合成长约20，30，40，50，60，70，80，90和/或100个核苷酸碱基的片段，然后(通过例如酶促或化学连接法，或聚合酶介导的重组方法)将它们连接起来，以形成实质上任何所需的连续序列。另一方面，单独合成大于100个核苷酸碱基(如150，180，200，210，240，270，300，330，360，390，400，420，450，465，474，470，475，489，490，495，496个碱基)的核苷酸片段，然后(通过例如酶促或化学连接法，或聚合酶介导的重组方法)将它们连接起来，以形成实质上任何所需的连续序列。例如，可使用Beaucage等，(1981)四面体通讯22：1859-69所述的经典亚磷酰胺法，或Matthes等，(1984)EMBO J，3：801-05所述的方法(例如，这些方法一般在自动合成方法中实施)，通过化学合成制备本发明的多核苷酸和寡核苷酸，包括其片段(和本文所述的那些片段)。根据亚磷酰胺法，在例如自动化的DNA合成仪中合成寡核苷酸，然后进行纯化，退火，连接，并克隆至适当的载体。
另外，实质上任何核酸都可从多个商家中的任何一家订购得到，例如TheMidland Certified Reagent Company(mcrc@oligos.com)，The Great AmericanGene Company(http：//www.genco.com)，ExpressGen Inc.(www.expressgen.com)，Operon Technologies Inc.(Alameda，CA)和很多其它的公司。类似地，肽和抗体也可从多个商家中的任何一家订购得到，例如PeptidoGenic(pkim@ccnet.com)，HTI Bio-products，Inc.(http：//www.htibio.com)，BMA Biomedicals Ltd.(U.K.)，Bio.Synthesis，Inc.和很多其它的公司。
也可通过使用寡核苷酸探针筛选cDNA文库(例如通过象在典型的多样性生成法，如改组法中那样重组同源核酸而产生的文库)，得到本发明的特定多核苷酸，其中所述探针能杂交或PCR-扩增编码干扰素同系物多肽及其片段的多核苷酸。筛选和分离cDNA克隆的方法是本领域技术人员众所周知的。该技术描述于例如：Sambrook等，分子克隆-实验室手册(第2版)，Vol.1-3，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989(下文简称为″Sambrook″)和最新分子生物学方法，F.M.Ausubel等编，最新方法，Greene Publishing Associates，Inc和John Wiley & Sons合资公司(1999年增补)(下文简称为″Ausubel″)。
如本文所详述，本发明的多核苷酸包括编码新的成熟干扰素-α同系物的序列和与该编码序列互补的序列，以及该编码序列的新片段及其互补序列。多核苷酸可以是RNA的形式，或者是DNA的形式，包括mRNA，cRNA，合成RNA和DNA，和cDNA。多核苷酸可以是双链或单链，如果是单链，则可以是编码链或非-编码(反义，互补)链。多核苷酸任选包括干扰素-α同系物的编码序列(i)的分离形式，(ii)与其它编码序列联合以编码例如融合蛋白，前-蛋白质，前-蛋白质原等，(iii)与能在适当宿主中有效表达编码序列的非-编码序列，如启动子，终止元件，或5’和/或3’非翻译区域联合，和/或(iv)在载体或宿主环境中，其中干扰素-α同系物的编码序列是异源核酸序列或基因。序列也可与一般的核酸组合制剂联合，其中包括载体，缓冲液，佐剂，赋形剂等。
编码各个干扰素-α同系物多肽的术语DNA或RNA包括任何寡脱氧核苷酸或寡脱氧核糖核苷酸序列，它们通过在适当宿主细胞中表达，导致产生本发明的干扰素-α同系物多肽。DNA或RNA可在适当宿主细胞，或在无细胞(体外)系统中产生，或者可以(通过例如扩增技术，如PCR)合成或用化学方法产生。利用本发明的多核苷酸
本发明的多核苷酸有多个用途，例如：重组生产(即表达)本发明的干扰素-α同系物多肽；在例如治疗性和预防性地治疗疾病的方法中用作治疗剂和预防剂；用于基因治疗方法和相关应用领域；用作免疫原；用于诊断和筛选试验；用作诊断探针以探测互补或部分互补的核酸的存在(包括检测编码天然IFN-α的核酸)；用作其它反应，例如改组反应或突变反应的底物以产生新的和/或经改良的IFN-α同系物等。多肽的表达
根据本发明，编码新的和/或成熟的干扰素-α同系物，干扰素-α蛋白质的片段，相关融合蛋白，或其功能等同物的多核苷酸序列在本文中被统称为“干扰素-α同系物多肽”，“干扰素-α同系物蛋白质”，或“干扰素-α同系物”，“干扰素同系物”，“IFN-α同系物”，“IFN同系物”，“IFN多肽”，“IFN蛋白质”，“本发明的多肽”或“本发明的蛋白质”。本发明的多肽或蛋白质欲包括和包含上述每个术语的多肽或氨基酸片段。本发明的多核苷酸序列被用于能介导干扰素-α同系物多肽在适当宿主细胞中表达的那些重组DNA(或RNA)分子。由于遗传密码内在的简并性，也可以使用编码基本上相同或功能上等同的氨基酸序列的其它核酸序列来克隆和表达干扰素同系物。经修饰的编码序列
本领域技术人员应懂得，修饰编码序列(包括例如编码本发明的干扰素-α同系物或其片段的核苷酸序列)以增强其在特定宿主中的表达是有利的。遗传密码是丰余的，它具有64个可能的密码子，但大多数生物偏好使用这些密码子中的一部分。在物种中最常使用的密码子被称为最适密码子，那些不常使用的密码子被分为稀有或不常用密码子(例见Zhang S.P.等(1991)基因105：61-72)。可取代密码子以反映宿主的优选密码子使用情况，该方法被称为“密码子最优化”或“物种密码子偏性的控制”。
可以制备出含有特定原核或真核宿主所偏好的密码子(Murray，E.等(1989)核酸研究17：477-508)的最优化编码序列，从而使与未经最优化的序列所产生的转录物相比，能提高翻译速率，或产生具有所需特性，如较长半寿期的重组RNA转录物。也可以修饰翻译终止密码子以反映出宿主的偏好。例如，酿酒酵母和哺乳动物的优选终止密码子分别为UAA和UGA。单子叶植物的优选终止密码子是UGA，而昆虫和大肠杆菌优选使用UAA作为终止密码子(Dalphin M.E.等(1996)核酸研究24：216-218)。
为了多种原因，可对本发明的多核苷酸序列进行改造以改变干扰素同系物编码序列，所述改变包括但不限于：修饰基因产物的克隆，加工和/或表达的改变。例如，可使用本领域众所周知的技术，例如定点诱变导入改变，以插入新的限制性位点，改变糖基化模式，改变密码子的偏好，导入剪接位点等。载体，启动子和表达系统
本发明还包括重组构建体，其含有一种或多种本文所宽泛描述的核酸序列(例如编码本发明的干扰素-α同系物或其片段的核酸序列)。构建体包括载体，例如质粒，粘粒，噬菌体，病毒(包括逆转录病毒)，细菌人工染色体(BAC)，酵母人工染色体(YAC)等，其中在正向或反向上插入了本发明的核酸序列。在此实施方案的优选方面，构建体还含有调节序列，包括例如与序列可操作相连的启动子。大量适当的载体和启动子是本领域技术人员已知的，也可以商购获得。
描述本文所用分子生物学技术，包括载体，启动子的利用和很多其它相关论题的普通教科书包括：Juo，P-S.，简明生物医学和分子生物学词典(CRC出版社，1996)；Singleton等，微生物学和分子生物学词典(第2版，1994)；剑桥科学和技术词典(Walker编，1988)；Hale & Marham，HARPERCOLLINS生物学词典(1991)；Scott和Mercer，简明生物化学和分子生物学百科全书(第3版，1997)；Berger和Kimmel，分子克隆技术指南，酶学方法，第152卷，Academic出版公司，San Diego，CA(下文简称为″Berger″)；Sambrook等，分子克隆-实验室手册(第2版)，Vol.1-3，冷泉港实验室，冷泉港，纽约，1989(″Sambrook″)和最新分子生物学方法，F.M.Ausubel等编，最新方法，Greene Publishing Associates，Inc和John Wiley & Sons合资公司(1999年增补)(″Ausubel″)。足以教导熟练技术人员进行体外扩增方法，包括聚合酶链反应(PCR)，连接酶链反应(LCR)，Qβ-复制酶扩增和其它RNA聚合酶介导的技术(例如NASBA)，以产生本发明的同源核酸的技术可参见例如Berger，Sambrook和Ausubel，以及Mullis等(1987)，美国专利4,683,202；1997年7月28日公开的美国专利4,683,195；PCR方法：方法和应用指南(Innis等编)Academic出版公司，San Diego，CA(1990)(Innis)；Arnheim &Levinson(1990年10月1日)C&EN36-47；NIH研究杂志(1991)3，81-94；KWoh等，(1989)Proc.Natl Acad.Sci.USA86，1173；Guatelli等，(1990)Proc.Natl Acad.Sci.USA87，1874；Lomell等，(1989)临床化学杂志，35，1826；Landegren等，(1988)科学241，1077-1080；Van Brunt(1990)生物技术8，291-294；Wu和Wallace(1989)基因4，560；Barringer等，(1990)基因89，117以及Sooknanan和Malek(1995)生物技术13：563-564。
PCR一般指的是：通过本领域众所周知的方法扩增极少量的特定核酸，RNA和/或DNA片段的方法(参见例如美国专利4,683,195和上述其它参考文献)。一般使用所需区域末端或更远处的序列信息来设计寡核苷酸引物。所述引物的序列与待扩增模板的相反链相同或相似。相反链的5’末端核苷酸可与扩增物的末端相符。可使用PCR扩增特定的RNA或特定的DNA序列，重组DNA或RNA序列，来自总基因组DNA的DNA和RNA序列，和转录自总细胞RNA，噬菌体或质粒序列的cDNA等。PCR是使用另一种(如已知的)核酸作为引物，来扩增核酸检测样品的核酸聚合酶反应法的一个例子，但不是唯一的例子。克隆经体外扩增的核酸的改良方法描述于Wallace等，美国专利5,426,039。通过PCR扩增大核酸的改良方法简述于Cheng等，(1994)自然369：684-685和其中的参考文献，其中产生了长至40kb的PCR扩增子。本领域技术人员应懂得：实质上使用逆转录酶和聚合酶可将任何RNA转变为适于限制性消化，PCR扩展和测序的双链DNA。参见Ausubel，Sambrook和Berger，文献同上。
本发明还涉及被本发明的载体转导的宿主细胞，和通过重组技术生产本发明的多肽(包括其片段)。用本发明的载体对宿主细胞进行基因工程改造(即转导，转化或转染)，所述载体可以是例如克隆载体或表达载体。载体可以是例如质粒，病毒颗粒，噬菌体等形式。可在常规营养培养基中培养经改造的宿主细胞，必要时可对培养基成分进行改动以活化启动子，选择转化子或扩增干扰素同系物基因。如温度，pH等的培养条件与选择用于表达的宿主细胞先前所用的相同，它们对于本领域技术人员而言是显而易见的，也可参见本文提及的参考文献，包括例如Freshney(1994)动物细胞培养，基本技术手册，第3版，Wiley-Liss，纽约和其中提及的参考文献。
也可在非-动物细胞，如植物，酵母，真菌，细菌等中生产本发明的干扰素同系物多肽和蛋白质。除了Sambrook，Berger和Ausubel外，有关细胞培养的详细资料可参见Payne等，(1992)液体系统的植物细胞和组织培养，John Wiley & Sons，Inc.纽约，NY；Gamborg和Phillips(编)(1995)植物细胞，组织和器官培养；基本方法，Springer实验室手册，Springer-Verlag(BerlinHeidelberg New York)以及Atlas和Parks(编)，微生物培养基手册(1993)，CRC出版社，Boca Raton，FL。
可将本发明的多核苷酸包含在多个表达载体的任一个中以表达多肽。所述载体包括染色体，非染色体和合成的DNA序列，如SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；杆状病毒；酵母质粒；衍生自质粒和噬菌体DNA，病毒DNA，如痘苗病毒，腺病毒，禽痘病毒，假狂犬病毒，腺相关病毒，逆转录病毒和很多其它病毒之组合的载体。可以使用任何能将遗传物质转导至细胞，并且当需要复制时可以复制并在相关宿主中能存活的载体。
表达载体中的核酸序列与适当的转录控制序列(启动子)可操作相连以介导mRNA合成。所述启动子的例子包括：LTR或SV40启动子，大肠杆菌lac或trp启动子，噬菌体λPL启动子和其它已知能控制原核或真核细胞或其病毒中的基因表达的启动子。表达载体还含有用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。载体任选包括用于扩增表达的适当序列。另外，表达载体还任选含有一种或多种选择标记基因以提供表型性状，用于选择经转化的宿主细胞，如针对真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性，或针对大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
可使用含有本文所述的适当DNA序列，以及适当启动子或控制序列的载体转化适当宿主，以使宿主表达蛋白质。适当表达宿主的例子包括：细菌细胞，如大肠杆菌，链霉菌属和鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，如酿酒酵母，巴斯德毕赤氏酵母和粗糙链孢霉；昆虫细胞，如果蝇和草地夜蛾；哺乳动物细胞，如CHO，COS，BHK，HEK293或Bowes黑素瘤；植物细胞等。应理解不是所有细胞或细胞系都需要能够产生完全功能性的干扰素同系物；例如，可在细菌或其它表达系统中产生干扰素同系物的抗原性片段。本发明并不受所用宿主细胞的限制。
在细菌系统中，可根据干扰素同系物的用途来选择多种表达载体。例如，当需要大量干扰素同系物或其片段以诱导抗体时，则需要能介导易于纯化的融合蛋白高水平表达的载体。所述载体包括但不限于多功能的大肠杆菌克隆和表达载体，如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中干扰素同系物编码序列被连接至载体中，与氨基末端的Met序列和随后的β-半乳糖苷酶的7个残基位于同一读码框内，从而产生杂合蛋白；pIN载体(Van Heeke & Schuster(1989)生物化学杂志264：5503-5509)；pET载体(Novagen，Madison WI)等。
类似地，在酵母酿酒酵母中，可使用多种含有组成型或诱导型启动子，如α因子，醇氧化酶和PGH的载体来生产本发明的干扰素同系物蛋白质。有关评述可参见Ausubel等，(文献同上)和Grant等，(1987；酶学方法153：516-544)。
在哺乳动物宿主细胞中，可利用多种表达系统，如基于病毒的系统。当使用腺病毒作为表达载体时，任选将编码序列连接至腺病毒转录/翻译复合物中，所述复合物由晚期启动子和三联前导序列组成。插入病毒基因组中非必需的E1或E3区域会导致存治病毒能在被感染的宿主细胞中表达干扰素同系物(Logan和Shenk(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81：3655-3659)。另外，可使用转录增强子，如Rous肉瘤病毒(RSV)增强子来增强哺乳动物宿主细胞中的表达。其它表达元件
特定的起始信号有助于有效翻译干扰素同系物编码序列。这些信号包括例如ATG起始密码子和邻接的序列。当将干扰素同系物编码序列，其起始密码子和上游序列插入适当表达载体时，无需其它的翻译控制信号。然而，当仅插入编码序列(如成熟蛋白质的编码序列)或其部分时，必须提供外源转录控制信号，包括ATG起始密码子。另外，起始密码子必须位于正确的读码框内以确保转录完整的插入物。外源转录元件和起始密码子可以是不同的来源，可以是天然的和合成的。通过包含适于所用细胞系统的增强子，可以增强表达效力(Schaf，D.等(1994)Results Probl.Cell Differ.20：125-62；Bittner等(1987)酶学方法，153：516-544)。分泌/定位序列
本发明的多核苷酸也可以与编码分泌/定位序列的核酸融合，例如框内融合，从而将多肽表达靶向至所需的细胞区室，膜或细胞器，或者介导多肽分泌至周质间隙或细胞培养基中。所述序列是本领域技术人员已知的，其包括分泌前导肽，细胞器靶向序列(例如核定位序列，ER滞留信号，线粒体转位序列，叶绿体转位序列)，膜定位/锚着序列(如终止转移序列，GPI锚着序列)等。由本发明的多核苷酸表达的多肽包括对应于分泌和/或定位序列的氨基酸序列。表达宿主
在其它实施方案中，本发明涉及含有上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可以是真核细胞，如哺乳动物细胞，酵母细胞或植物细胞，或宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞。通过磷酸钙转染，DEAE-Dextran介导的转染，电穿孔，或其它普通技术(Davis，L，Dibner，M和Battey，I.(1986)基本分子生物学方法)，可将构建体导入宿主细胞。细胞中可包含本发明的核酸，所述核酸编码多肽，其中所述细胞表达多肽(例如通过本文所述的试验测定，具有抗病毒或抗增殖活性的干扰素-α同系物多肽)。本发明还包括含有本发明的任何核酸的载体，并包括被所述载体转导的细胞。另外，本发明还包括含有上述或整个说明书所述的任何多肽或核酸的细胞和转基因动物，例如通过转导本发明的载体而产生的细胞和转基因动物。
任选根据细胞调节插入序列的表达或按所需方式加工经表达的蛋白质的能力来选择宿主细胞株。蛋白质修饰包括但不限于：乙酰基化，羧基化，糖基化，磷酸化，脂质化和酰基化。裂解蛋白质的“前”或“前原”形式的翻译后加工对于正确插入，折叠和/或行使功能是至关重要的。对于这种翻译后的活性而言，诸如CHO，HeLa，BHK，MDCK，293，WI38等的不同宿主细胞具有特定的细胞机器和特征性的机制，可在它们中进行选择以确保正确修饰和加工导入的外源蛋白质。
为了长期，高产地生产重组蛋白质，可使用稳定的表达。例如，可使用表达载体转导能稳定表达本发明多肽的细胞系，所述表达载体含有病毒复制起点或内源性表达元件和选择标记基因。导入载体之后，使细胞在滋养培养基中培养1至2天，然后转移至选择培养基中。选择标记的目的是赋予抗性以进行选择，它的存在允许培养和回收成功表达导入序列的细胞。例如，使用适于细胞类型的组织培养技术可增殖稳定转化细胞的抗性群落。
任选在适于表达并从细胞培养物中回收编码蛋白质的条件下，培养被编码本发明多肽的核苷酸序列转化的宿主细胞。根据所用序列和/或载体的不同，由重组细胞产生的蛋白质或其片段可被分泌，与膜结合或包含在细胞内。本领域技术人员应懂得：可在含有编码本发明成熟干扰素同系物的多核苷酸的表达载体中设计信号序列，所述信号序列可介导成熟的多肽穿过原核或真核细胞膜分泌出来。其它多肽序列
本发明的多核苷酸也可包含与标记序列(例如便于纯化本发明的编码多肽的序列)融合在一个框内的编码序列。这种便于纯化的结构域包括但不限于：可以在固定化的金属上纯化的金属螯合肽，如组氨酸-色氨酸组件，与谷胱甘肽结合的序列(如GST)，血凝素(HA)标记(对应于流感病毒血凝素蛋白的表位；Wilson，I.等(1984)细胞37：767)，麦芽糖结合蛋白序列，FLAGS延伸/亲和纯化系统(Immunex Corp.，Seattle，WA)中所用的FLAG表位等。在纯化结构域和干扰素同系物序列之间包含可被蛋白酶裂解的多肽接头序列将有利于纯化。有望用于本文所述组合物和方法中的一个表达载体提供了融合蛋白的表达，所述融合蛋白含有与多聚组氨酸区域融合的本发明多肽，它们之间被肠激酶裂解位点隔开。组氨酸残基便于在IMIAC(固定化金属离子亲和层析，如Porath等(1992)蛋白质的表达和纯化3：263-281)上纯化，而肠激酶裂解位点可以使干扰素同系物多肽从融合蛋白中分离出来。也可使用pGEX载体(Promega；Madison，WI)将外源多肽表达成与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。通常，这种融合蛋白是可溶性的，通过吸附至配体-琼脂糖珠(例如，当与GST融合时，为谷胱甘肽-琼脂糖)，接着在游离配体的存在下进行洗脱，可以容易地从裂解细胞中纯化出融合蛋白。多肽的生产和回收
转导适当的宿主株(系)并将宿主株(系)培养至适当的细胞密度之后，通过适当的方式(例如温度转变或化学试剂诱导)诱导选定的启动子，将细胞再培养一段时间。一般通过离心收集细胞，用物理或化学方法破碎细胞，保留所得粗提取物以进行进一步纯化。可通过本领域众所周知的任何便利的方法破碎表达蛋白质所用的微生物细胞，包括反复冻融，超声处理，机械破碎或使用细胞裂解剂或其它方法。
如上所述，很多篇参考文献可用于培养和生产很多种细胞，包括源自细菌，植物，动物(尤其是哺乳动物)和古细菌的细胞。参见例如Sambrook，Ausubel和Berger(文献同上)，以及Freshney(1994)动物细胞培养，基本技术手册，第3版，Wiley-Liss，纽约和其中提及的参考文献，Doyle和Griffiths(1997)哺乳动物细胞培养：基本技术，John Wiley和Sons，纽约；Humason(1979)动物组织技术，第4版，W.H.Freeman和Company；和Ricciardelli等(1989)体外细胞发育生物学，25：1016-1024。关于植物细胞培养和再生，可参见Payne等(1992)液体系统中的植物细胞和组织培养，JohnWiley& Sons，Inc.，纽约，NY；Gamborg和Phillips(编)(1995)植物细胞，组织和器官培养；基本方法，Springer实验室手册，Springer-Verlag(Berlin HeidelbergNew York)和植物分子生物学(1993)R.R.D.Croy编，Bios ScientificPublishers，Oxford，U.K.ISBN 0 12 1983706。细胞培养基通常可参见Atlas和Parks(编)微生物培养基手册(1993)CRC出版社，Boca Raton，FL。有关细胞培养的其它资料可参见商家提供的文献，例如Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO)提供的生命科学研究，细胞培养目录(1998)(″Sigma-LSRCCC″)，和例如Sigma-Aldrich公司(St.Louis，MO)提供的植物培养目录和增补本(1997)(″Sigma-PCCS″)。
也可通过本领域众所周知的多种方法中的任一种，从重组细胞培养物中回收和纯化本发明的多肽，所述方法包括：硫酸铵或乙醇沉淀，酸提取，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水作用层析，亲和层析(如使用本文所述的任何标记系统)，羟基磷灰石层析和凝集素层析。必要时，在完成成熟蛋白质的构型时，可以使用蛋白质的重新折叠步骤。最终，在最后的纯化步骤中可以使用高效液相层析(HPLC)。除了上文提及的参考文献外，多种纯化方法是本领域众所周知的，包括例如Sandana(1997)蛋白质的生物分离，Academic出版公司；和Bollag等(1996)蛋白质方法，第2版，Wiley-Liss，纽约；Walker(1996)蛋白质方法手册，Humana出版社，NJ，Hahis和Angal(1990)蛋白质纯化应用：操作方法，牛津IRL出版社，牛津，英国；Harris和Angal，蛋白质纯化方法：操作方法，牛津IRL出版社，牛津，英国；Scopes(1993)蛋白质纯化：原理和实践，第3版，Springer Verlag，纽约；Janson和Ryden(1998)蛋白质纯化：原理，高分辨率的方法和应用，第2版，Wiley-VCH，纽约；和Walker(1998)CD-ROM版的蛋白质方法，Humana出版社，NJ。体外表达系统
也可使用本发明的DNA或RNA，利用无细胞转录/翻译系统生产多肽。几种这样的系统可以商购得到。体外转录和翻译方法的一般性指南可参见Tymms(1995)体外转录和翻译方法：分子生物学方法，第37卷，GarlandPublishing，纽约。经修饰的氨基酸
本发明的多肽可含有一个或多个经修饰的氨基酸。经修饰的氨基酸的存在对例如(a)延长多肽的血清半寿期，(b)降低多肽的抗原性，(c)增加多肽的储存稳定性是有利的。例如，在重组生产时可以共-翻译或翻译后修饰氨基酸(例如在哺乳动物细胞中表达时，N-X-S/T基元的N-联糖基化)，或通过合成的方式修饰氨基酸。
经修饰的氨基酸的非限制性例子包括：糖基化氨基酸，硫酸化氨基酸，异戊二烯化(如法尼基化，香叶基香叶基化)氨基酸，乙酰基化氨基酸，酰基化氨基酸，PEG化氨基酸，生物素化氨基酸，羧基化氨基酸，磷酸化氨基酸等。能详尽指导本领域技术人员修饰氨基酸的参考文献有很多，例举的方法可参见Walker(1998)CD-ROM版本的蛋白质方法，Human出版社，Towata，NJ。
本发明的多核苷酸和多肽有多个用途，包括但不限于例如：重组生产(即表达)本发明的重组干扰素-α同系物；在体内和来自体内地治疗多个受试者的多种疾病的方法中用作治疗剂和预防剂；用于体外方法，如诊断和筛选方法以检测，诊断和治疗多个受试者(如哺乳动物)的多种疾病(例如癌症，基于病毒的疾病，基于血管生成的疾病)；用作免疫原；在基因治疗方法和基于DNA或RNA的传递方法中，用于将本发明的生物活性多肽体内，来自体内或体外传递至或施用于受试者的组织，群体或细胞，器官，移植物，身体系统(如器官系统，淋巴系统，血液系统等)；用作DNA疫苗，多-成分的疫苗以用于治疗性和预防性地治疗多个受试者(如哺乳动物)的多种疾病(例如癌症，基于病毒的疾病，基于血管生成的疾病)；用作佐剂以增强或扩大受试者的免疫应答；用作多步加强免疫方法(例如包括通过传递DNA或RNA核苷酸(例如编码本发明多肽或编码另一种多肽的核苷酸)引发免疫，接着再次用多肽(例如本发明的多肽或其它多肽)加强免疫的形式)的成分；用作诊断探针以探测互补或部分互补的核酸的存在(包括检测编码天然干扰素-α的核酸)；用作其它反应，例如改组反应，突变反应或其它多样性生成反应的底物，以产生新的和/或经改良的干扰素-α同系物和编码这种同系物的新的干扰素-α核酸，例如产生新的治疗或预防特性等；用于聚合酶链反应(PCR)或克隆方法，例如包括消化或连接反应，以鉴定新的和/或经改良的天然或非天然IFN-α核酸和由其编码的多肽。任选将编码本发明干扰素同系物的多核苷酸，或该多核苷酸的互补物施用于细胞，以完成治疗或预防用的方法，或在体内，来自体内或体外表达治疗用产物。包括体内或来自体内的应用，例如基因治疗的这些应用包括多种技术，通过它们可以改变细胞中的基因表达。所述方法包括例如：导入表达例如治疗或预防用多肽，如本发明的干扰素同系物的基因。所述方法包括例如：用含有本发明的多核苷酸和/或多肽的逆转录病毒进行感染。任选地，逆转录病毒还含有其它外源的，例如治疗或预防性的基因构建体序列。一方面，如下文所详述，本发明提供了通过给需要进行治疗的受试者，包括生物或哺乳动物，包括例如人，灵长类动物，小鼠，猪，奶牛，山羊，兔，大鼠，豚鼠，仓鼠，马，绵羊；或非哺乳类脊椎动物，如鸟类(如鸡或鸭)或鱼，或无脊椎动物的一个或多个细胞体内，来自体内或体外施用一种或多种本文所述发明的核酸，预防或治疗性治疗所述受试者的疾病的基因治疗方法。
另一方面，如下文所详述，本发明提供了通过给需要进行治疗的受试者(包括本文所定义的那些)的一个或多个细胞体内，来自体内或体外施用一种或多种本文所述发明的多肽，预防或治疗性治疗所述受试者的疾病的方法。多肽表达
使用本领域技术人员众所周知的技术，编码本发明的干扰素同系物多肽的多核苷酸对体内或来自体内的治疗或预防应用特别有用。例如，用多核苷酸(DNA或RNA)对来自体内的培养细胞进行改造，然后将经改造的细胞返回至患者体内。也可对体内或来自体内的细胞进行改造，以分别在体内或来自体内地表达多肽。
已知多种病毒载体适于生物体在体内或来自体内地转导和表达。所述载体包括逆转录病毒载体(参见Miller(1992)最新微生物学和免疫学论题158：1-24；Salmons和Gunzburg(1993)人类基因治疗4：129-141；Miller等(1994)酶学方法217：581-599)和腺-相关病毒载体(参见Carter(1992)最新生物技术观点3：533-539；Muzcyzka(1992)最新微生物学和免疫学论题158：97-129)。可以使用的其它病毒载体包括腺病毒载体，疱疹病毒载体和新培斯病毒载体，一般描述于例如JollY(1994)癌症基因治疗1：51-64；Latchman(1994)分子生物技术2：179-195；和Johanning等(1995)核酸研究23：1495-1501。
基因治疗提供了多种方法用于抵抗慢性传染病(例如HIV感染，病毒性肝炎，单纯疱疹病毒(HSV)，乙肝病毒(HepB)，登革病毒等)，以及非-传染性疾病，包括癌症和变应性疾病和一些形式的先天性缺陷，如酶缺陷。已使用了几种方法将核酸导入体内，来自体内和体外的细胞。这些方法包括：基于脂质体的基因传递(Debs和Zhu(1993)WO93/24640和美国专利5,641,662；Mannino和Gould-Fogerite(1988)生物技术6(7)：682-691；Rose，美国专利5,279,833；Brigham(1991)WO91/06309；和Felgner等(1987)Proc.NatlAcad.Sci.USA84：7413-7414)；Brigham等(1989)美国医学科学杂志298：278-281；Nabel等(1990)科学249：1285-1288；Hazinski等(1991)Am.J.Resp.Cell Molec.Biol 4：206-209；以及Wang和Huang(1987)Proc.NatlAcad.Sci.(USA)84：7851-7855)；腺病毒载体介导的基因传递，例如用于治疗癌症(参见例如Chen等(1994)Proc.Natl Acad.Sci.USA 91：3054-3057；Tong等(1996)Gynecol.Oncol.61：175-179；Clayman等(1995)癌症研究5：1-6；O′Malley等(1995)癌症研究55：1080-1085；Hwang等(1995)Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.13：7-16；Haddada等(1995)最新微生物学和免疫学论题199(Pt.3)：297-306；Addison等(1995)Proc.Natl Acad.Sci.USA 92：8522-8526；Colak等(1995)脑研究691：76-82；Crystal(1995)科学270：404-410；Elshami等(1996)人类基因治疗7：141-148；Vincent等(1996)神经外科杂志85：648-654)，和很多其它疾病。另外，已使用复制-缺损的逆转录病毒载体，其携有治疗性的多核苷酸序列作为逆转录病毒基因组的一部分，其中特别应提及简单的MuLV载体，参见例如Miller等(1990)分子细胞生物学10：4239(1990)；Kolberg(1992)NIH研究杂志4：43，和Cornetta等(1991)人类基因治疗2：215)。另外，还使用了与配体-特异性的，基于阳离子的转运系统相结合的核酸转运(Wu和Wu(1988)生物化学杂志263：14621-14624)。也已描述了裸露的DNA表达载体(Nabel等(1990)，文献同上；Wolff等(1990)科学247：1465-1468)。通常，通过将编码本文所述干扰素同系物的核酸掺入适当载体，可以使这些方法适应于本发明。
描述基因治疗方法，通过将本发明的核酸导入患者而适应于本发明的普通教科书包括：Robbins(1996)基因治疗方法，Humana出版社，NJ，和Joyner(1993)基因靶向：操作方法，IRL出版社，牛津，英国。反义技术
除了表达本发明的核酸作为基因替代核酸外，一旦细胞中不再需要表达核酸时，所述核酸还可用于有义和反义地抑制表达，例如下调本发明核酸的表达。类似地，也可使用本发明的核酸，或其亚序列或反义序列阻断天然同系物核酸的表达。多种有义和反义技术是本领域已知的，例如可参见Nellen(1997)反义技术：操作方法，IRL出版社，牛津大学，牛津，英国和Agrawal(1996)反义治疗剂Humana出版社，NJ和其中提及的参考文献。药物组合物
本发明的多核苷酸和多肽(包括例如含有本发明的多核苷酸或多肽的载体，细胞，抗体等)可与适当的药物载体组合以用于治疗和预防用途。所述组合物含有治疗或预防有效量的本发明的多核苷酸或多肽，和药物可接受的载体或赋形剂。药物可接受的载体包含任何标准的药物载体，缓冲液和赋形剂。所述载体或赋形剂包括但不限于：盐水，缓冲盐水(如磷酸缓冲盐水溶液)，葡萄糖，水，甘油，乙醇，乳剂(如油/水或水/油乳剂)，多种类型的润湿剂和/或佐剂，及其组合。适当的药物载体和试剂描述于REMINGTON′S药物科学(Mack出版公司，Easton，第19版，1995)。配制方式应该与活性剂(如核苷酸，多肽，载体，细胞等)的给药模式相适应。施用核酸，多肽，载体，细胞，抗体和蛋白质的方法是本领域众所周知的，并在下文中进一步讨论。用作探针
本文还希望包括一般具有至少12个碱基，优选至少15个碱基，更优选至少20，30或50个碱基的多核苷酸(本文也称之为寡核苷酸)的用途，所述多核苷酸能在至少高度严紧(或超-高度严紧或超-超-高度严紧的条件)的条件下与上述干扰素同系物的多核苷酸序列杂交。根据上述文献中所述的方法，多核苷酸可用作探针，引物，有义和反义试剂等。序列变异 沉默变异
本领域技术人员应懂得：由于遗传密码的简并性，可产生很多种编码本发明的干扰素同系物多肽的核酸序列，其中的一些与本文清楚公开的核酸序列有很低的序列同源性。
表1    密码子表
氨基酸                                      密码子
丙氨酸       Ala       A               GCA GCC GCG GCU
半胱氨酸     Cys       C               UGC UGU
天冬氨酸     Asp       D               GAC GAU
谷氨酸       Glu       E               GAA GAG
苯丙氨酸     Phe       F               UUC UUU
甘氨酸       Gly       G               GGA GGC GGG GGU
组氨酸       His       H               CAC CAU
异亮氨酸     Ile       I               AUA AUC AUU
赖氨酸       Lys       K               AAA AAG
亮氨酸       Leu       L               UUA UUG CUA CUC CUG CUU
甲硫氨酸     Met       M               AUG
天冬酰胺     Asn       N               AAC AAU
脯氨酸       Pro       P               CCA CCC CCG CCU
谷氨酰胺     Gln       Q               CAA CAG
精氨酸       Arg       R               AGA AGG CGA CGC CGG CGU
丝氨酸       Ser       S               AGC AGU UCA UCC UCG UCU
苏氨酸       Thr       T               ACA ACC ACG ACU
缬氨酸       Val       V               GUA GUC GUG GUU
色氨酸       Trp       W               UGG
酪氨酸       Tyr       Y               UAC UAU
例如，通过密码子表(表1)可以看出：密码子AGA，AGG，CGA，CGC，CGG和CGU都编码氨基酸精氨酸。因此，在本发明核酸中每一个由一个密码子特指为精氨酸的位置处，可将密码子改变为上述相应密码子中的任一个，而不会改变编码的多肽。应理解RNA序列中的U相当于DNA序列中的T。
例如，使用相当于SEQ ID NO：1中的核苷酸1-15的核酸序列TGT GATCTG CCT CAG，该序列的沉默变异包括TGC GAC TTA CCA CAA，编码氨基酸序列CDLPQ的这两个序列相当于SEQ ID NO：36中的氨基酸1-5。
这种“沉默变异”是一种将在下文讨论的“经保守修饰的变异”。本领域技术人员会意识到：可通过标准技术修饰核酸中的每一个密码子(除了AUG，它通常是甲硫氨酸唯一的密码子)以编码功能相同的多肽。因此，在任何所述序列中暗含编码多肽的核酸的每一种沉默变异。本发明提供了编码本发明多肽的核酸序列的每一种和每一个可能变异，它们通过根据可能的密码子选择来组合。根据编码本发明的干扰素同系物多肽的核酸序列所用的标准三联体遗传密码(如表1所示)制备这些组合。通过考虑序列以及遗传密码，具体提供和描述了本文每一种核酸的上述所有变异体。保守变异
特定核酸序列的“经保守修饰的变异”或简称为“保守变异”指的是：编码相同或实质上相同的氨基酸序列的那些核酸，或当核酸不编码氨基酸序列时，指的是基本上相同的序列。本领域技术人员认为：改变，添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或小百分比的氨基酸(一般低于5％，更优选低于4％，3％，2％或1％)的各个取代，缺失或添加是“经保守修饰的变异”，其中改变导致氨基酸缺失，氨基酸添加或用化学相似的氨基酸取代氨基酸。
提供功能相似的氨基酸的保守取代表是本领域众所周知的。表2列出了6组，其含有可“保守取代”另一个氨基酸的氨基酸。
表2   保守取代的组
    1 丙氨酸(A)      丝氨酸(S)    苏氨酸(T)
    2 天冬氨酸(D)    谷氨酸(E)
    3 天冬酰胺(N)    谷氨酰胺(Q)
    4 精氨酸(R)      赖氨酸(K)
    5 异亮氨酸(I)    亮氨酸(L)    甲硫氨酸(M)    缬氨酸(V)
    6 苯丙氨酸(F)    酪氨酸(Y)    色氨酸(W)
因此，本发明所列多肽序列的“经保守取代的变异”或简称为“保守取代”包括用相同保守取代组的经保守选择的氨基酸取代多肽序列中小百分比，一般低于5％，更优选低于4％，3％，2％或1％的氨基酸。
例如，在本文中被鉴定为SEQ ID NO：36的多肽的保守取代变异会在166个氨基酸长的多肽的约8或9个残基(即约5％氨基酸)中含有根据上文所定义的6组“保守取代”。
在其它例子中，如果4个保守取代位于相当于SEQ ID NO：36的氨基酸残基141-166的区域，根据表2列出的保守取代，该区域WEVVR AEIMRSFSFS TNLQK RLRRKE的保守取代变异的例子包括：WEVVR  SEIMRSFS YS TNLQ R RLRRK D和WE LVR AEI VR SFSFS TNL NK RLR KKE等(在上述例子中，下划线的为保守取代)。本文列出的蛋白质序列结合上述取代表，提供了所有经保守取代的蛋白质的列表。
最后，添加不会改变核酸分子的编码活性的序列，例如添加非-功能性序列也是基本核酸的保守变异。
本领域技术人员应懂得：所公开的核酸构建体的很多种保守变异产生了功能上相同的构建体。例如，如上文所讨论，由于遗传密码的简并性，“沉默取代”(即核酸序列中不会改变所编码多肽的取代)是每一种编码氨基酸的核酸序列暗含的特征。类似地，用具有高度相似特性的不同氨基酸取代氨基酸序列中的一个或几个氨基酸的“保守氨基酸取代”也能容易地被鉴定为与所公开的构建体高度相似。每一种公开序列的这种保守变异也是本发明的特征。核酸杂交
当核酸相互结合(一般在溶液中进行)时即为“杂交”。核酸杂交是由于存在多种已被详细鉴定的物理-化学力，如氢键，溶剂排斥，碱基堆积等。有关核酸杂交的详尽指导可参见Tijssen(1993)生物化学和分子生物学实验室技术-与核酸探针杂交，第I部分，第2章，“杂交原理和核酸探针试验策略综述”，以及Ausubel，文献同上。Hames和Higgins(1995)基因探针1，牛津大学出版社的IRL出版社，牛津，英国(Hames和Higgins 1)和Hames与Higgins(1995)基因探针2，牛津大学出版社的IRL出版社，牛津，英国(Hames和Higgins 2)提供了有关合成，标记，检测和定量DNA和RNA，包括寡核苷酸的细节。
核酸杂交实验，如Southern和Northern杂交上下文中的“严紧杂交洗涤条件”取决于序列，在不同的环境参数下也是不同的。有关核酸杂交的详尽指导可参见Tijssen(1993)，文献同上和Hames和Higgins 1与Hames和Higgins2，文献同上。
为了本发明的目的，通常将“高度严紧的”杂交和洗涤条件选定为比特定序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃或更低(如下文所述，也可以用相当的术语描述高度严紧的条件)。Tm是50％的测试序列与精确匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。很严紧的条件被选定为与特定探针的Tm相等。
Tm是核酸双链体的温度，在此温度下，双链体在给定条件下50％变性，该温度可直接测量核酸杂合体的稳定性。因此，Tm相当于从螺旋到随机卷曲的转变中点所对应的温度；对于长的一段核苷酸序列而言，它取决于长度，核苷酸组成和离子强度。
杂交之后，可通过一系列的洗涤除去未杂交的核酸物质，可根据所需结果调整洗涤的严紧度。低严紧度的洗涤条件(例如使用较高的盐浓度和较低的温度)增加敏感性，但可产生非特异性杂交信号和强的背景信号。较高严紧度的条件(例如使用较低的盐浓度和接近杂交温度的较高温度)能降低背景信号，一般仅留下特异性信号。参见Rapley，R和Walker，J.M编，分子生物学方法手册(Humana出版公司1998)(下文称之为″Rapley和Walker″)，其全文列入本文作为参考。
使用下列等式可估计DNA-DNA双链体的Tm：
Tm(℃)＝81.5℃+16.6(log10M)+0.41(％G+C)-0.72(％f)-500/n，其中M是单价阳离子(通常是Na+)的重量摩尔浓度，(％G+C)是鸟苷(G)和胞苷(C)核苷酸的百分比，％f是甲酰胺的百分比，n是杂合体的核苷酸碱基数目(即长度)，参见Rapley和Walker，文献同上。
按下式估计RNA-DNA双链体的Tm：
Tm(℃)＝79.8℃+18.5(log10M)+0.58(％G+C)-11.8(％G+C)2-0.56(％f)-820/n，其中M是单价阳离子(通常是Na+)的重量摩尔浓度，(％G+C)是鸟苷(G)和胞苷(C)核苷酸的百分比，％f是甲酰胺的百分比，n是杂合体的核苷酸碱基数目(即长度)，文献同上。
等式1和2一般仅对长于100-200个核苷酸的杂合双链体准确，文献同上。
可按下式估计短于50个核苷酸的核酸序列的Tm：
Tm(℃)＝4(G+C)+2(A+T)，
其中A(腺嘌呤)，C，T(胸腺嘧啶)和G是相应核苷酸的数目。
在Southern或Northern印迹膜上杂交具有100个以上互补残基的互补核酸的严紧杂交条件例子是：在含1mg肝素的50％福尔马林中，42℃杂交过夜。严紧洗涤条件的例子是：0.2×SSC，65℃洗涤15分钟(有关SSC缓冲液的描述可参见Sambrook，文献同上)。经常用低严紧度的洗涤替代高严紧度的洗涤，以除去背景探针信号。低严紧度洗涤的例子是2×SSC，40℃洗涤15分钟。
通常，在特定的杂交试验中，如果信号噪声比2.5倍-5倍于(或高于)用不相关探针观察到的相应数值，则表明检测到特异性杂交。在本发明的上下文中，检测到两个序列之间至少严紧的杂交则表明：与例如本文序列表中提供的本发明的核酸具有相对较高的结构相似性或同源性。
如上所述，将“高度严紧的”条件选定为比特定序列在确定的离子强度和pH下的热解链温度(Tm)低约5℃或更低。可在高度严紧的条件下鉴定与感兴趣的核苷酸序列(例如“探针”)密切相关或相同的靶序列。较低严紧度的条件适用于互补性较差的序列，参见例如Raoley和Walker，文献同上。
可使用比较杂交来鉴定本发明的核酸，这种比较杂交法是区分本发明核酸的优选方法。在本发明的上下文中，检测到两个序列之间高度严紧的杂交表明：与例如本文序列表中提供的核酸具有相对较高的结构相似性/同源性。两个核苷酸序列之间高度严紧的杂交阐明了比通过严紧杂交条件检测到的要高的结构，核苷酸碱基组成，排列或顺序的相似性或同源性水平。特别是，在本发明的上下文中，检测到高度严紧的杂交表明：与例如本文序列表中提供的核酸具有较高的结构相似性或结构同源性(例如核苷酸结构，碱基组成，排列或顺序)。例如，需要鉴定能在严紧条件下与本文所例举的核酸杂交的受试核酸。
因此，对严紧条件的一个衡量标准是：能在高度严紧的条件(或很严紧的条件，或超-高度严紧的杂交条件，或超-超-高度严紧的杂交条件)下，与所列核酸(例如核酸序列SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：72至SEQID NO：78及其互补多核苷酸序列)之一杂交。对任何受试核酸而言，都可凭经验容易地确定严紧条件(包括例如高度严紧，超-高度严紧或超-超-高度严紧的杂交条件)和洗涤条件。
例如，在确定高度严紧的杂交和洗涤条件时，可逐渐提高杂交和洗涤条件(例如通过在杂交或洗涤过程中升高温度，降低盐浓度，提高去污剂浓度和/或提高有机溶剂，如福尔马林的浓度)，直至达到一套选定的标准。例如，逐渐提高杂交和洗涤条件，直至探针能结合精确匹配的互补靶(该靶核酸含有一种或多种选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：72至SEQ IDNO：78及其互补多核苷酸序列的核酸序列)，所述探针也含有一种或多种选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：35，SEQ ID NO：72至SEQ ID NO：78及其互补多核苷酸序列的核酸序列，此时的信号噪声比至少2.5倍，任选5倍于或更高倍于所观察到的探针与不匹配的靶杂交时的相应数值。此时，不匹配的靶是对应于已知α干扰素的核酸，例如递交本申请时，如GenBankTM的公共数据库中存在的α干扰素核酸。这种不匹配的靶核酸的例子包括例如具有下列GenBank登记号的核酸：J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)。本领域技术人员可在GenBank中鉴定其它的此类序列。人干扰素基因和蛋白质的命名分别讨论于Diaz等(1996)干扰素和细胞因子研究杂志，16：179-180和Allen等(1996)干扰素和细胞因子研究杂志，16：181-184，皆全文列入本文作为参考。
当受试核酸与探针核酸的杂交程度至少为探针与精确匹配的互补靶的杂交程度的1/2，即信号噪声比至少为探针与靶杂交的1/2时，可以说受试核酸与探针核酸特异性杂交，其中在所述杂交的条件下，精确匹配的探针与精确匹配的互补靶结合，其信号噪声比至少约2.5倍-10倍，一般5倍-10倍于所观察到的探针与任何不匹配的靶核酸杂交时的相应数值，所述不匹配的靶核酸为具有下列GenBank登记号的核酸：J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)，或GenBank中提供的其它类似干扰素-α序列。
超-高度严紧的杂交和洗涤条件是如下所述的条件，其中提高杂交和洗涤条件的严紧度，直至探针与精确匹配的互补靶核酸结合的信号噪声比至少10倍于所观察到的探针与任何不匹配的靶核酸杂交时的相应数值，所述不匹配的靶核酸为具有下列GenBank登记号的核酸：J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)，或GenBank中提供的其它类似IFN-α序列。如果靶核酸能在这种条件下与探针杂交，且信号噪声比至少为精确匹配的互补靶核酸的1/2，即可以说该靶核酸与探针能在超-高度严紧的条件下结合。
类似地，通过逐渐提高相关杂交试验的杂交和/或洗涤条件，可以确定甚至更高的严紧水平。例如，可以鉴定以下条件，其中提高杂交和洗涤条件的严紧度，直至探针与精确匹配的互补靶核酸结合的信号噪声比至少10倍，20倍，50倍，100倍或500倍或更高倍于所观察到的探针与任何不匹配的靶核酸杂交时的相应数值，所述不匹配的靶核酸为具有下列GenBank登记号的核酸：J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)，或GenBank中提供的其它类似干扰素-α序列。如果靶核酸能在这种条件下与探针杂交，且信号噪声比至少为精确匹配的互补靶核酸的1/2，即可以说该靶核酸与探针能在超-超-高度严紧的条件下结合。
能在高度，超-高度和超-超-高度严紧条件下与SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：35和SEQ ID NO：72至SEQ ID NO：78所示核酸杂交的靶核酸是本发明的特征。所述核酸的例子包括与给定核酸序列相比，具有一个或几个沉默或保守核酸取代的核酸。
如果在严紧条件下不能相互杂交的核酸所编码的多肽基本上相同，可以认为所述核酸也基本上相同。例如，当使用遗传密码所允许的最大程度的密码子简并性产生核酸拷贝时，或者当针对SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：70和SEQID NO：79至SEQ ID NO：85中的一种或多种而产生抗血清时会出现这种情况，其中已用已知的干扰素-α序列所编码的多肽减除所述抗血清，所述多肽包括例如由GenBank中的下列干扰素-α核酸序列，即GenBank登记号为：J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)的核酸序列或GenBank中提供的其它类似的干扰素-α序列所编码的多肽。在下文中可以发现有关本发明多肽的免疫学鉴定的详情。另外，为了区分序列小于约100个核苷酸的双链体，可以使用本领域技术人员已知的TMAC1杂交法，参见例如Sorg，U等，核酸研究(1991，9，11)19(17)，其全文列入本文作为参考。
一方面，本发明提供了一种核酸，它在选自SEQ ID NO：1至SEQ IDNO：35或SEQ ID NO：72至SEQ ID NO：78的核酸中含有独特的亚序列。与对应于任何已知干扰素-α核酸序列的核酸相比，这种独特的亚序列是独一无二的，所述核酸序列包括例如具有下列GenBank登记号的已知序列：J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)，或GenBank中提供的其它类似干扰素-α序列。通过将SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：72至SEQ ID NO：78中的任一个与整套核酸进行序列比对，即可测定这种独特的亚序列，所述整套核酸对应于具有例如以下GenBank登记号的已知干扰素-α核酸序列：J00210(α-D)，J00207(α-a)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)，或GenBank中提供的其它类似干扰素-α序列。使用设置为缺省参数的BLAST算法即可进行序列比对。任何独特的亚序列都可用作探针以鉴定本发明的核酸。
类似地，本发明包括一种多肽，它在选自SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：79至SEQ ID NO：85的多肽中含有独特的氨基酸亚序列。与已知干扰素-α多肽序列的氨基酸亚序列相比，这种独特的亚序列是独一无二的，所述氨基酸亚序列包括例如由对应于以下任一GenBank登记号的已知干扰素-α核酸或GenBank中提供的其它类似的干扰素-α核酸所编码多肽的氨基酸亚序列：J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)，或GenBank中提供的其它类似多肽序列的氨基酸亚序列。将多肽与整套已知的干扰素-α多肽序列进行序列比对，所述多肽是例如由对应于以下GenBank登记号的核酸或GenBank中提供的其它类似干扰素-α核酸所编码的多肽：J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)，(称为“对照多肽”)(注意当序列对应于非-翻译序列，如假基因时，只需通过在计算机中将核酸序列翻译成氨基酸序列即可产生相应的多肽，其中阅读框被选定为对应于同源α干扰素核酸的阅读框)或GenBank中提供的其它类似多肽序列。
此外，本发明提供了靶核酸，它在至少严紧或高度严紧的条件(或较高严紧度的条件)下与独特的编码寡核苷酸杂交，所述寡核苷酸编码选自SEQ IDNO：36至SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：79至SEQ ID NO：85的多肽中的独特亚序列，其中与GenBank中显示的已知干扰素-α多肽序列的氨基酸亚序列或对应于任何对照多肽的多肽相比，这种独特的亚序列是独一无二的。按上文所述测定独特的序列。
在一个实施例中，选择严紧条件以使与编码寡核苷酸精确互补的寡核苷酸能与编码寡核苷酸杂交，且其信号噪声比要比精确互补的寡核苷酸与对应于任何对照多肽的对照核酸杂交的信号噪声比至少约高5至10倍。可选择条件以在所使用的特定试验中观察到较高的信号噪声比，例如约15倍，20倍，30倍，50倍或更高倍。在此实施例中，靶核酸与独特的编码寡核苷酸杂交，且其信号噪声比要比对照核酸与编码寡核苷酸杂交的信号噪声比至少约高2倍。另外，可选择较高的信号噪声比，例如约2.5倍，约5倍，约10倍，约20倍，约30倍，约50倍或更高倍。特定的信号将取决于相关试验所用的标记，例如荧光标记，比色标记，放射性标记等。
另一方面，本发明提供了一种多肽，该多肽在选自SEQ ID NO：36至SEQID NO：70或SEQ ID NO：79至SEQ ID NO：85的多肽中含有独特的亚序列，其中与对应于已知干扰素-α多肽，如GenBank中提供的干扰素-α多肽序列的多肽序列相比，这种独特的亚序列是独一无二的。序列重组的底物和形式
本发明的多核苷酸可用作多种重组和回归重组(例如DNA改组)反应，以及其它多样性生成技术，包括例如Ausubel，Berger和Sambrook，文献同上所述的诱变技术和标准克隆方法中的底物，即用于产生具有所需特性的其它干扰素-α同系物。根据所用的筛选或选择方法，可产生并分离出重组的，例如经改组的干扰素-α同系物多肽，所述多肽被赋予多种所需特性，例如增强的抗病毒活性，增强的抗增殖活性，针对特定靶细胞的增强的生长抑制，细胞静止和/或细胞毒活性，降低的免疫原性等。
可以使用多种多样性生成方法，包括核酸改组方法，这些方法在本领域中已被详细描述。可以单独和/或联合使用这些方法，以产生一种核酸或一套核酸的一种或多种变体，以及所编码蛋白质的变体。单独和联合使用的这些方法可提供有力的，应用广泛的途径来产生多样化的核酸和核酸组合(set)(包括例如核酸文库)，用于例如改造或快速演变出具有新的和/或改良特性的核酸，蛋白质，途径，细胞和/或生物体。
尽管在下面将要进行的阐明性讨论的过程中对方法进行了区分和分类，但应理解技术经常是相互包容的。实际上，可以单独或联合，平行或依次使用多种方法，以产生各种不同的序列变体。
本文所述的任何多样性生成方法的结果可以是产生一种或多种核酸，可在其中选择或筛选出编码具有或赋予所需特性的蛋白质的核酸。通过本文所述的一种或多种方法，或本领域技术人员可以使用的其它方法生成多样性之后，可在产生的任何核酸中选择出所需活性或特性，例如增强的抗病毒活性，增强的抗增殖活性，增强的抗-血管生成活性，针对特定靶细胞的增强的生长抑制，细胞静止和/或细胞毒活性，降低的免疫原性等。测定具有增强的抗病毒，抗增殖，生长抑制，细胞静止和/或细胞毒活性或降低的免疫原性的核酸的方法包括本文所述的那些方法。所述方法可包括：通过本领域的任何试验，以例如自动化或可自动化的方式鉴定出可以检测的任何活性。可根据操作人员的意见，依次或平行地评价多种相关(或甚至不相关的)特性。
下列出版物描述了多种多样性生成方法，包括回归重组法，和/或产生经修饰的核酸序列的方法，它们可用于本发明的方法，所述出版物包括下列出版物和其中提及的参考文献：Soong，N.W等(2000)“病毒的分子繁殖”，Nature Genetics25：436-439；Stemmer，W等(1999)“用于靶向和其它临床特性的病毒分子繁殖”，肿瘤靶向4：1-4；Ness等(1999)“枯草蛋白酶亚基因组序列的DNA改组”，Nature Biotechnology17：893-896；Chang等(1999)“使用DNA家族改组演变细胞因子”，Nature Biotechnology17：793-797；Minshull和Stemmer(1999)“通过分子繁殖进行蛋白质演变”，Current Opinionin Chemical Biology3：284-290；Christians等(1999)“使用DNA家族改组定向演变AZT磷酸化所用的胸苷激酶”，Nature Biotechnology 17：259-264；Crameri等(1998)“对来自多个物种的基因家族进行DNA改组可促进定向演变”，自然391：288-291；Crameri等(1997)“通过DNA改组对砷酸盐解毒途径进行分子演变”，Nature Biotechnology15：436-438；Zhang等(1997)“通过DNA改组和筛选将半乳糖苷酶定向演变为有效的岩藻糖苷酶”，Proc.Natl Acad Sci.USA 94：4504-4509；Patten等(1997)“DNA改组在药物和疫苗中的应用”，Current Opinion in Biotechnology8：724-733；Crameri等(1996)“通过DNA改组构建和演变抗体-噬菌体文库”，天然药物2：100-103；Crameri等(1996)“通过使用DNA改组的分子演变改良绿色荧光蛋白”，Nature Biotechnology14：315-319；Gates等(1996)“通过展示于lac阻抑物‘帽子二聚体’以从肽文库中亲和选择性地分离配体”，分子生物学杂志255：373-386；Stemmer(1996)“有性PCR和装配PCR”，分子生物学百科全书，VCH Publishers，纽约，p447-457；Crameri和Stemmer(1995)“组合多重盒式诱变产生所有突变和野生型盒的变换”，生物技术18：194-195；Stemmer等(1995)“单步骤装配基因和整个质粒形成大量寡脱氧核糖核苷酸”，基因164：49-53；Stemmer(1995)“分子算法的演变”，科学270：1510；Stemmer(1995)“搜寻序列间隔”，生物技术13：549-553；Stemmer(1994)“通过DNA改组在体外快速演变蛋白质”，自然370：389-391；和Stemmer(1994)“通过随机片段化和重新装配进行DNA改组：体外重组以进行分子演变”，Proc.Natl Acad.Sci.USA91：10747-10751。
有关DNA改组和其它多样性生成方法的其它细节可见于下列美国专利，PCT申请和EP申请：Stemmer的USPN5,605,793(1997年2月25日)，“体外重组法”；Stemer等的USPN5,811,238(1998年9月22日)，“通过重复选择和重组产生具有所需特征的多核苷酸的方法”；Stemmer等的USPN5,830,721(1998年11月3日)，“通过随机片段化和重新装配进行DNA诱变”；Stemmer的USPN5,834,252(1998年11月10日)，“末端互补的聚合酶反应”；Minshull的USPN5,837,458(1998年11月17日)，“细胞和代谢工程的方法和组合物”；WO95/22625，Stemmer和Crameri，“通过随机片段化和重新装配进行诱变”；WO96/33207，Stemmer和Lipschutz，“末端互补的聚合酶链反应”；WO97/20078，Stemmer和Crameri，“通过重复选择和重组产生具有所需特征的多核苷酸的方法”；WO97/35966，Minshull和Stemmer，“细胞和代谢工程的方法和组合物”；WO99/41402，Punnonen等，“基因疫苗载体的靶向”；WO99/41383，Punnonen等，“抗原文库免疫”；WO99/41369，Punnonen等，“基因疫苗载体工程”；WO99/41368，Punnonen等，“基因疫苗免疫调制特性的最优化”；EP752008，Stemmer和Craneri，“通过随机片段化和重新装配进行DNA诱变”；EP0932670，Stemmer，“通过回归序列重组改变细胞DNA摄入”；WO99/23107，Stemmer等，“通过病毒基因组改组修饰病毒嗜性和宿主范围”；WO99/21979，Apt等，“人乳头瘤病毒载体”；WO98/31837，Del Cardayre等，“通过回归序列重组改变整个细胞和生物体”；WO98/27230，Patten和Stemmer，“多肽工程的方法和组合物”；EP0946755，Patten和Stemmer，“多肽工程的方法和组合物”；和WO98/13487，Stemmer等，“通过回归序列改组和选择最优化基因治疗的方法”；WO00/00632，“产生高度多样性文库的方法”；WO00/09679，“获得经体外重组的多核苷酸序列库的方法和所得序列”；WO98/42832，Arnold等，“使用随机或确定的引物重组多核苷酸序列”；WO99/29902，Arnold等，“产生多核苷酸和多肽序列的方法”；WO98/41653，Vind，“构建DNA文库的体外方法”；WO98/41622，Borchert等，“使用DNA改组构建文库的方法”；和WO98/42727，Pati和Zarling，“使用同源重组改变序列”。
某些美国申请提供了有关DNA改组和相关技术以及其它多样性生成方法的其它细节，这些申请包括：Patten等于1998年9月29日(USSN60/102,362)，1999年1月29日(USSN60/117,729)和1999年9月28日提交的“改组密码子有所改变的基因”；Del Cardayre等于1998年7月15日(USSN09/166,188)和1999年7月15日(USSN 09/354,922)提交的“通过回归序列重组改变整个细胞和生物体”；Crameri等于1999年2月5日(USSN60/118,813)，1999年6月24日(USSN60/141,049)和1999年9月28日(USSN09/408,392)提交的“寡核苷酸介导的核酸重组”；Welch等于1999年9月28日(USSN 09/408,393)提交的“使用基于密码子的寡核苷酸合成进行合成改组”；Selifonov和Stemmer于1999年2月5日(USSN 60/118854)和1999年10月12日(USSN 09/416,375)提交的“制备具有所需特性的特征链，多核苷酸和多肽的方法”；Patten等于1999年3月5日(USSN 60/122,943)，1999年7月2日(USSN 60/142,299)，1999年11月10日(USSN60/164,618)和1999年11月10日(USSN 60/164,617)提交的“重组插入的经修饰核酸”；和Affholter于2000年3月2日提交的USSN60/186,482“单链核酸模板介导的重组和核酸片段分离”。
正如上述出版物，专利，公开的外国申请和美国专利申请的评论所揭示的，可通过多种已建立的方法实施多样性生成方法，例如改组(或“回归(recursive)重组”)核酸以提供具有所需特性的新核酸。这些方法中的任一种都适用于本发明，可用于形成本文所讨论的α干扰素，产生具有新特性或改良特性的新α干扰素同系物。两种制备通过这些方法产生的上述干扰素(如IFN同系物)的方法也是本发明的特征。简单地说，几种不同大类别的序列修饰方法，如重组可用于本发明，这些方法描述于例如上述参考文献中。首先，可在体外通过上述参考文献中讨论的多种技术中的任一种重组核酸，包括例如用DNA酶消化待重组的核酸，然后连接和/或通过PCR重新装配核酸。第二，通过例如使细胞申的核酸之间发生重组，在体内或来自体内地回归重组核酸。第三，可以使用全基因组重组法，其中细胞或其它生物体的完整基因组被重组，任选包括掺加具有所需文库成分(例如对应于本发明途径的基因)的基因组重组混合物。第四，可使用合成重组法，其中在PCR或连接反应中合成和重装配对应于所需靶的寡核苷酸，从而产生新的重组核酸，所述寡核苷酸包括对应于一个以上亲代核酸的寡核苷酸。可通过标准的核苷酸添加法，或通过例如三-核苷酸合成法制备寡核苷酸。第五，可实施in silico重组法，其中在计算机中使用遗传学算法，以重组对应于同源(或甚至非-同源)核酸的序列链。任选通过合成对应于重组序列的核酸，例如联合使用寡核苷酸合成/基因重装配技术，而将所得重组序列链转变为核酸。可以重复进行上述一般性重组方式中的任一种，以产生一套更具多样性的重组核酸。第六，可以使用增加天然多样性的方法，例如通过使各种各样的核酸或核酸片段与单链模板杂交，接着聚合化和/或连接以再生出全长序列，任选地，再降解模板并回收所得的经修饰核酸。上述参考文献提供了这些和其它基本的重组形式以及基于这些形式的多种经改动方法。无论所用的重组形式如何，本发明的核酸可以(互相，或与相关(或甚至不相关)的核酸)重组，以产生一套具备多样性的重组核酸，包括例如同源核酸。一般说来，本文所述的序列重组技术提供了特别的好处，因为它们使SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：35和SEQ IDNO：72至SEQ ID NO：78，或其片段或变体之间能以任何可以使用的方式进行重组，从而提供了一种非常快速的方法，用以研究不同的序列组合影响所需结果的方式。
重组之后，可以在所产生的任何核酸中筛选或选择所需活性。在本发明的上下文中，包括通过任何本领域已知的试验，例如以可自动化的方式检测和鉴定可以测出的任何活性。另外，也可选择以下有用的特性，如低免疫原性，增加的半寿期，改善的溶解性，可口服的特性等。可以使用任何可用的试验来检测多种α-干扰素相关(或甚至不相关)的特性。
DNA诱变和改组提供了有力的，可广泛使用的方法用以产生多样性，所述多样性可用于改造出具有改良特性的蛋白质，途径，细胞和生物。除了上述基本方法外，有时还需要联合使用改组方法学和其它产生多样性的技术。多种多样性生成方法可与改组方法联合使用(或与之分开使用)，并且可在本发明的系统中筛选结果(即各种各样的核酸群体)。通过可导致各个核苷酸或邻接或不邻接的核苷酸组发生变化的方法，即诱变方法，可以导入其它的多样性。多种诱变方法描述于上述参考文献中；有关诱变方法的其它细节可参见下列参考文献。
产生多样性的诱变方法包括例如：重组(PCT/US98/05223；公开号WO98/42727)；定点诱变(Ling等(1997)″Approaches to DNA mutagenesis：anoverview，″Anal.Biochem.254(2)：157-178；Dale等(1996)″Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioatemethod，″Methods Mol.Biol.57：369-374；Smith(1985)″In vitro mutagenesis，″Ann.Rev.Genet.19：423-462；Botstein & Shortle(1985)″Strategies andapplications of in vitro mutagenesis，″Science 229：1193-1201；Carter(1986)″Site directed mutagenesis，″Biochem.J.237：1-7；和Kunkel(1987)″Theefficiency of oligonucleotide directed mutagenesis，″Nucleic Acids & MolecularBiology(Eckstein，F和Lilley，D.M.J编，Springer Verlag，Berlin))；使用含尿嘧啶的模板的诱变(Kunkel(1985)″Rapid and efficient site-specific mutagenesiswithout phenotypic selection，″Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 82：488-492；Kunkel等(1987)″Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypicselection，″Results Probl.Cell Differ.154，367-382；和Bass等(1988)″Mutant Trprepressors with new DNA-binding specificities，″Science 242：240-245)；寡核苷酸介导的诱变(Results Probl.Cell Differ.100：468-500(1983)；Results Probl.Cell Differ.154：329-350(1987)；Zoller & Smith(1982)″Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors：an efficient and generalprocedure for the production of point mutations in any DNA fragment，″NucleicAcids Res.10：6487-6500；Zoller & Smith(1983)″Oligonucleotide-directedmutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors，″Results Probl.CellDiffer.100：468-500；和Zoller & Smith(1987)″Oligonucleotidedirectedmutagenesis：a simple method using two oligonucleotide primers and a singlestranded DNA template，″Results Probl.Cell Differ.154：329-350)；硫代磷酸酯修饰的DNA诱变(Taylor等(1985)″The use of phosphorothioate-modified DNAin restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA，″Nucl.Acids Res.13：8749-8764；Taylor等(1985)″The rapid generation of oligonucleotide-directedmutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA，″Nucl.AcidsRes.13：8765-8787(1985)；Nakamaye & Eckstein(1986)″Inhibition ofrestriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and itsapplication to oligonucleotide-directed mutagenesis，″Nucl Acids Res.14：9679-9698；Sayers等(1988)″Y-T Exonucleases in phosphorothioate-basedoligonucleotide-directed mutagenesis，″Nucl.Acids Res.16：791802；和Sayers等(1988)″Strand specific cleavage of phosphorothioate-containing DNA byreaction with restriction endonucleases in the presence of ethidium bromide，″NuclAcids Res.16：803-814)；使用缺口双链体DNA的诱变(Kramer等(1984)″Thegapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction，″Nucl.Acids Res.12：9441-9456；Kramer & Fritz(1987)″Oligonucleotidedirected construction of mutations via gapped duplex DNA，″Results Probl.CellDiffer.154：350-367；Kramer等(1988)″Improved enzymatic in vitroreactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directedconstruction of mutations，″Nucl.Acids Res.16：7207；和Fritz等(1988)″Oligonucleotide-directed construction of mutations：a gapped duplex DNAprocedure without enzymatic reactions in vitro，″Nucl.Acids Res.16：6987-6999)。
其它适当的方法包括点错配修复(Kramer等(1984)″Point MismatchRepair，″Cell 38：879-887)，使用修复-缺损宿主株的诱变(Carter等(1985)″Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using M13 vectors，″Nucl.Acids Res.13：4431-4443；和Carter(1987)″Improved oligonucleotide-directedmutagenesis using M13 vectors，″Results Probl.Cell Differ.154：382-403)，缺失诱变(Eghtedarzadeh & Henikoff(1986)″Use of oligonucleotides to generate largedeletions，″Nucl.Acids Res.14：5115)，限制性-选择和限制性-选择与限制性-纯化(Wells等(1986)″Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing thetransition state of subtilisin，″Phil.Trans.R.Soc.Lond.A317：415-423)，通过总基因合成进行诱变(Nambiar等(1984)″Total synthesis and cloning of a genecoding for the ribonuclease S protein，″Science223：1299-1301；Sakamar和Khorana(1988)″Total synthesis and expression of a gene for the a-subunit ofbovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein(transducing)，″Nucl.Acids Res.14：6361-6372；Wells等(1985)″Cassette mutagenesis：an efficientmethod for generation of multiple mutations at defined sites，″Gene34：315323；和Grundstrom等(1985)″Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale′shot-gun′gene synthesis，″Nucl.Acids Res.13：3305-3316)，双链断裂修复(Mandecki(1986)″Oligonucleotide-directed double-strand break repair inplasmids of Escherichia coli：a method for site-specific mutagenesis，″Proc.Nat′lAcad.Sci.USA，83：7177-7181)。有关多种上述方法的其它细节可参见：Methods in Enzymology，Vol.154，其中还描述了对多种诱变方法中令人心烦的问题的有用控制手段。
也可利用使用添加或简并寡核苷酸的随机或半-随机诱变(Arkin和Youvan(1992)″Optimizing nucleotide mixtures to encode specific subsets ofamino acids for semi-random mutagenesis，″Biotechnology 10：297300；Reidhaar-Olson等(1991)″Random mutagenesis of protein sequences usingoligonucleotide cassettes，″Methods Enzvmol.208：564-86；Lim和Sauer(1991)″The role of internal packing interactions in determining the structure and stabilityof a protein，″J.Mol.Biol.219：359-76；Breyer和Sauer(1989)″Mutationalanalysis of the fine specificity of binding of monoclonal antibody 51F to lambdarepressor，″J.Biol.Chem.264：13355-60)；“步移诱变”(Crea，R；美国专利5,830,650和5,798,208，和EP专利0527809B1)产生多样性。
在本发明的一个方面，可使用易错PCR产生核酸变体。使用该技术，在DNA聚合酶的拷贝保真性低的条件下进行PCR，使得沿着全长PCR产物可获得高频率的点突变。这种技术的例子可参见上述参考文献，例见Leung等(1989)Technique1：11-15和Caldwell等(1992)PCR Methods Applic.2：28-33。类似地，在涉及由小DNA片段的混合物装配PCR产物的方法中，可以使用装配PCR。可以在相同的小管中平行进行多个不同的PCR反应，用一个反应的产物引发另一个反应的产物。可以使用有性(Sexual)PCR诱变，其中通过基于序列同源性使DNA分子随机片段化，接着在PCR反应中通过引物延伸进行交换固定，而在体外在不同的，但DNA序列相关的DNA分子之间发生同源重组。该方法描述于上述参考文献，例见Stemmer(1994)Proc.Nat′lAcad.Sci.USA 91：10747-10751。可以使用回归集团(ensemble)诱变，其中使用蛋白质诱变算法产生表型相关突变体的多样性群体，所述群体成员的氨基酸序列有所不同。该方法使用反馈机制控制连续多轮组合盒式诱变。该方法的例子见于Arkin & Youvan(1992)Proc.Nat′l Acad.Sci.USA89：7811-7815。
如上所述，在允许在任何感兴趣的核酸序列中产生位点-特异性突变的方法中可以使用寡核苷酸介导的诱变。这种技术的例子可参见上述参考文献，例如Reidhaar-Olson等(1988)Science，241：53-57。类似地，可在用合成的寡核苷酸盒替代双链DNA分子的小区域的方法中使用盒式诱变，所述寡核苷酸盒不同于天然序列。寡核苷酸可含有例如完整的和/或部分随机化的天然序列。
体内(或来自体内的)诱变可用于在任何克隆的所需DNA中产生随机突变的方法，所述方法包括在例如大肠杆菌菌株中增殖DNA，所述菌株的一个或多个DNA修复途径携有突变。相对于野生型亲代而言，这些“增变株”具有较高的随机突变率。在其中一个菌株中增殖DNA最终将在DNA内产生随机突变。
可以使用指数集团诱变以产生具有高百分比的特有、功能性突变体的组合文库，其中一小组残基被平行地随机化，以鉴定出每个有所变化的位置处导致产生功能性蛋白质的氨基酸。这种方法的例子可参见Delegrave & Youvan(1993)Biotechnology Research 11：1548-1552。类似地，可以使用随机和定点诱变。这种方法的例子可参见Arnold(1993)Current Opinion in Biotechnology4：450-455。
用于诱变，文库构建和其它多样性生成方法的试剂盒也是可以商购的。例如，试剂盒可购自例如Stratagene(如QuickChangeTM定点诱变试剂盒；和ChameleonTM双链，定点诱变试剂盒)，Bio/Can Scientific，Bio-Rad(例如使用上述Kunkel法)，Boehringer Mannheim Corp.，Clonetech Laboratories，DNATechnologies，Epicentre Technologies(如5prime 3prime试剂盒)；Genpak Inc，Lemargo Inc，Life Technologies(Gibco BRL)，New England Biolabs，PharmaciaBiotech，Promega Corp.，Quantum Biotechnologies，Amersham Intemational plc(例如使用上述Eckstein法)和Anglian Biotechnology Ltd(例如使用上述Carter/Winter法)。
任何所述的改组或诱变技术可以与在基因组中导入其它多样性的方法联合使用，所述基因组如细菌，真菌，动物或植物基因组。例如，除了上述方法外，还建议使用能产生嵌合核酸多聚体的技术，所述多聚体适于转化至多个物种(参见例如Schellenberger美国专利5,756,316和上述参考文献)。当这种嵌合多聚体由彼此趋异(例如由天然多样性或使用定点诱变，易错PCR，诱变细菌菌株途径等产生)的基因组成，并转化至适当宿主时，可以提供核酸多样性来源以使DNA多样化。
转化至宿主物种的嵌合多聚体适于用作体内(或来自体内的)改组方法的底物。或者，可将共享部分序列相似性或同源性区域的多种多核苷酸转化至宿主物种，并由宿主细胞在体内(或来自体内地)进行重组。可以使用接下来的多轮细胞分裂产生文库，所述文库的成员含有单一，均匀的单体或集中的核酸群体。或者，可通过标准技术回收单体核酸，并以任何所述改组方法进行回归重组。
也建议使用能生成多样性的链终止法(参见例如美国专利5965408和上述参考文献)。在此方法中，在存在或缺乏基因特异性引物时，使对应于一种或多种基因的双链DNA混合并变性，所述基因共享序列相似性或同源性区域。然后退火单链多核苷酸，并在聚合酶和链终止试剂(如紫外线，γ或X射线照射；溴化乙锭或其它嵌入剂；DNA结合蛋白，如单链结合蛋白，转录激活因子或组蛋白；多环芳烃；三价铬或三价铬盐；或由快速热循环介导的短缩聚合作用等)的存在下保温，导致产生部分双链体分子。然后在接下来的多轮复制或部分复制中变性和重新退火部分双链体分子，例如含有部分延伸链的所述分子，导致产生多核苷酸，所述多核苷酸共享不同程度的序列相似性或同源性，并且就最初的DNA分子群体而言为嵌合的多核苷酸。任选地，可在该方法的一个或多个阶段扩增产物或产物的部分收集物。通过例如上述链终止法产生的多核苷酸是根据任一种所述形式的多样性生成方法(例如RSR，DNA改组)的适当底物。
通过使用不基于同源性的方法和DNA改组(如上述出版物和申请所述，它可以基于同源性或不基于同源性，这取决于确切的形式)可进一步增加多样性。例如，可以使用Ostermeier等(1999)″A combinatorial approach to hybridenzymes independent of DNA homology″Nature Biotech.17：1205中描述的用于产生杂合酶的增量截短(ITCHY)产生最初的重组文库，该文库可用作一轮或多轮体外，来自体内或体内多样性生成方法(例如RSR或改组方法)的底物。
已描述了产生多物种表达文库的方法(例如美国专利5,783,431；5,824,485和上述参考文献)，有人提出这些方法可用于鉴定所需的蛋白质活性(美国专利5,958,672和上述参考文献)。一般说来，多物种表达文库含有来自多个物种或菌株的cDNA或基因组序列，所述序列在表达盒中与适当的调节序列可操作相连。任选将cDNA和/或基因组序列随机串联以进一步增加多样性。载体可以是适于转化不止一种宿主生物，如细菌物种，真核细胞并在其中表达的穿梭载体。在一些情况下，通过预先选择编码所需蛋白质，或与所需核酸杂交的序列而使文库具有偏倚性。任何此类文库都可成为本文所述任何方法的底物。
在一些申请中，在改组之前需要预先选择或预先筛选文库(例如扩增的文库，基因组文库，cDNA文库，归一化文库等)或其它底物核酸，或者使底物偏向于编码功能性产物的核酸(改组方法本身也具有这些效果)。例如，在对抗体进行改造时，可以在通过任何所述方法生成多样性(例如DNA改组)之前，利用体内(或来自体内或体外)重组事件使改组方法偏向于具有功能性抗原结合位点的抗体。例如，在根据本文所述任何方法生成多样性(例如DNA改组)之前，可以扩增得自B细胞cDNA文库的重组CDR，并将其装配至框架区域(例如Jirholt等(1998)″Exploiting sequence space：shuffling in vivo formedcomplementarity determining regions into a master framework，″Gene 215：471)。
文库可以偏向编码具有所需活性(例如结合亲和性，酶活性，抗病毒活性，诱导免疫应答的能力，抗增殖活性，佐剂特性等)的蛋白质的核酸。例如，从文库中鉴定出具有特定活性的克隆之后，可使用任何已知的导入DNA变化的方法诱变克隆，所述方法包括但不限于DNA改组或其它形式的回归序列重组或多样性生成法。然后在含有经诱变的同系物的文库中筛选所需活性，所述活性可以与最初的特定活性相同或不同。这种方法的一个例子可参见美国专利5,939,250。可通过本领域已知的任何方法鉴定所需活性。例如，WO99/10539提到：通过混合基因文库的提取物与得自代谢旺盛细胞的组分，并鉴定表现出所需活性的组合，即可筛选基因文库。也有人提出(例如WO98/58085)：通过将具有生物活性的底物插入文库样品，并使用荧光分析仪，例如流式细胞仪，CCD，荧光计或分光光度计检测对应于具有所需活性之产物的生物活性荧光，即可鉴定出具有所需活性的克隆。
文库也可偏向具有特定特征的核酸，例如与选定的核酸探针杂交的核酸。例如，申请WO99/10539提出：可以按下述方法从基因组DNA序列中鉴定出编码所需活性(例如酶活性，如脂肪酶，酯酶，蛋白酶，糖苷酶，糖基转移酶，磷酸酶，激酶，加氧酶，过氧化物酶，水解酶，水合酶，腈水解酶，转氨酶，酰胺酶或酰基转移酶)的多核苷酸。使基因组DNA群体中的单链DNA分子同与配体-缀合的探针杂交。基因组DNA可得自经培养或未经培养的微生物，或得自环境样品。或者，基因组DNA可得自多细胞生物或其组织。
可以直接由捕获中所用的杂交探针进行第二链的合成，所述探针预先可以从捕获介质上释放，也可以不释放，或者也可通过本领域已知的多种其它策略合成第二链。或者，可以使分离的单链基因组DNA群体片断化，而不进行进一步的克隆，并将它们直接用于基于-改组的基因重装配方法。在一种此类方法中，使得自基因组文库的片断群体与对应于相反链的部分，或经常是约全长的ssDNA或RNA退火。由该群体装配复杂的嵌合基因是由基于核酶除去未杂交的片断末端，聚合化以补平这些片断之间的缺口，随后进行单链连接来介导的。通过消化(如果是RNA或含有尿嘧啶)，在变性条件下进行磁分离(如果以有助于这种分离的方式标记)或其它可以使用的分离/纯化方法，即可除去亲代链。或者，任选将亲代链与嵌合链一起纯化，在随后的筛选和加工步骤中再除去亲代链。如Affholter(USSN60/186,482，2000年3月2日提交)的″Single-stranded nucleic acid template-mediated recombination andnucleic acid fragment isolation″，以及Patten和Stemmer的WO98/27230，″Methods and Compositions for Polypeptide Engineering″所述，也可进行使用单链模板和所需核酸的改组，其中所述核酸与模板的一部分结合。
在一种方法中，单链分子被转变为双链DNA(dsDNA)，dsDNA分子通过配体-介导的结合与固体支持物结合。分离出未结合的DNA之后，从支持物上释放选定的DNA分子，并将其导入适当宿主细胞以产生能与探针杂交的文库富集序列。按照此方法产生的文库为本文所述的任何改组反应提供了合乎需要的底物。
产生核酸和多肽的“非-随机”方法描述于Short，J.″Non-StochasticGeneration of Genetic Vaccines and Enzymes″WO00/46344。包括提出的非-随机多核苷酸重装配和基因位点饱和诱变的此类方法，以及本文所述的合成连接多核苷酸重装配法也可用于本发明。
易于理解的是：适用于在多样化之前富集文库的上述任何技术也可用于筛选通过多样性生成法产生的产物或产物文库。
通过回归重组本发明的一种或多种多核苷酸与一种或多种其它核酸而产生的重组核酸也构成本发明的一部分。一种或多种其它核酸可包括本发明的另一种多核苷酸；任选地，或者，或另外，一种或多种其它核酸可包括例如编码天然干扰素-α或其亚序列，或任何同源的干扰素-α序列或其亚序列，或干扰素-β序列或其亚序列(例如GenBank或其它可获得的文献中描述的干扰素-α或干扰素-β序列)的核酸，或者例如任何其它同源或非同源的核酸(上述某些重组形式，特别是用合成或in silico方法进行的重组不需要同源性)。
如上述参考文献中详细描述的那样，重组步骤可在体内，来自体内，体外或in silico中进行。本发明还包括含有任何所得重组核酸的细胞，通过多样性生成，重组或回归重组本文所述的核酸而产生的核酸文库，含有所述文库或含有任何重组核酸的细胞群体，载体，病毒，质粒等，其中所述重组核酸是通过多样性生成或重组(或回归重组)本文所述的核酸与另一种此类核酸或其它核酸而产生的。计算机系统或计算机可读介质中存在的数据库中的相应序列链也是本发明的特征。其它多核苷酸组合物
本发明还包括含有两种或多种本发明的多核苷酸的组合物(例如用作重组底物)。组合物可含有重组核酸文库，其中文库含有至少2，3，5，10，20或50或更多种核酸。任选将核酸克隆至表达载体，提供表达文库。
本发明还包括通过用限制性内切核酸酶，RNA酶或DNA酶消化一种或多种本发明的多核苷酸(在上述某些重组形式中进行)而产生的组合物；和通过用机械方式(例如超声处理，涡旋等)片断化或剪切一种或多种本发明的多核苷酸而产生的组合物，该组合物也可在上述方法中用于提供重组底物。类似地，含有多套对应于一种以上本发明核酸的寡核苷酸的组合物也可用作重组底物，并且也是本发明的特征。为了方便起见，将这些经片断化，剪切或寡核苷酸合成的混合物称为片断化的核酸套。
本发明还包括通过在核糖核苷酸-或脱氧核糖核苷酸三磷酸和核酸聚合酶的存在下保温一种或多种片断化的核酸套而产生的组合物。所得组合物形成重组混合物，可用于上述多种重组形式。核酸聚合酶可以是RNA聚合酶，DNA聚合酶或RNA-介导的DNA聚合酶(例如“逆转录酶”)；聚合酶可以是例如热稳定的DNA聚合酶(例如VENT，TAQ等)。干扰素同系物多肽
本发明提供了分离或重组的干扰素-α同系物多肽，本文也称之为“干扰素-α同系物”或“干扰素同系物”或“IFN-α同系物”或“IFN同系物”。本发明的分离或重组的干扰素同系物多肽包括：含有选自SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：70和SEQ ID NO：79至SEQ ID NO：85的序列的多肽，及其经保守修饰的变体，及其片断，所述片断在例如基于人Daudi细胞系的试验(或其它类似试验)中具有抗增殖活性，和/或在例如基于鼠细胞系/EMCV的试验(或其它类似试验)中具有抗病毒活性。图1提供了例举的本发明干扰素同系物多肽序列的序列比对。本领域技术人员使用公共数据库和序列比对程序可以容易地将本发明的多肽序列互相比对，或与已知的天然干扰素-α序列进行比对。
本发明还提供了一种多肽，其含有SEQ ID NO：36-70或SEQ ID NO：71中任一种的至少约100，120，130，140，150，155，160，163，165或166个连续的氨基酸。一方面，所述氨基酸序列含有氨基酸Lys160和Glu166，其中序列中的氨基酸编号与SEQ ID NO：36中的一一对应。
将例举的本发明序列(图1)与源自人和非人的已知的天然干扰素-α和其它I型干扰素(包括β，δ，ω，τ-干扰素)序列相比较，可以得出几个结论。这些序列可以容易地得自多个来源，如GenBank和网址为http：//www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.Shtml的Pfam(蛋白质家族)数据库。
需特别说明的是：在本发明的一些干扰素同系物多肽序列中存在下列氨基酸残基(表示为“I组”残基)，这些残基不会出现在已知的天然人或非人I型干扰素序列的等同位置上。
I组：Asp11；Pro14；Arg50；Phe55；Asp75；Asn80；Pro111；Leu124；Glu134；Ser140和Ala143；残基编号对应于SEQ ID NO：36中鉴定的成熟干扰素同系物序列。
需特别说明的是：在本发明的一些干扰素同系物多肽序列中存在下列氨基酸残基(表示为“II组”残基)，这些残基不会出现在已知的天然人干扰素-α亚型序列的等同位置上。
II组：Pro9；(Lys，Ser)12；(Thr，Val)24；Gln34；Arg40；Ser45；Arg47；Leu56；Ile60；Phe67；Ala79，Gly88；His90；Arg91；Glu95；Val101；(Gly，Ala)104；Val112；Gly114；Pro116；Lys133和His136。
在其它实施方案中，干扰素同系物多肽含有SEQ ID NO：36-70中任一个的至少20，50，100，150，155或160或更多个连续的氨基酸，和/或下列一个或多个氨基酸Ala19，(Tyr或Gln)34，Gly37，Phe38，Lys71，Ala76，Tyr90，Ile132，Arg134，Phe152，Lys160和Glu166，其中氨基酸的编号对应于SEQ IDNO：36中的编号，或下列一个或多个氨基酸Pro9，(Lys或Ser)12，(Thr或Val)24，Gln34，Arg40，Ser45，Arg47，Leu56，Ile60，Phe67，Ala79，Gly88，His90，Arg91，Glu95，Val101，(Gly，Ala)104，Val112，Gly114，Pro116，Lys133和His136，其中所述多肽序列中的氨基酸编号对应于SEQ ID NO：36的氨基酸序列中每个氨基酸的编号。因此，例如，在此实施方案中，干扰素多肽含有氨基酸序列，该序列在序列的第9位氨基酸处含有脯氨酸残基，在第12位含有赖氨酸或丝氨酸残基，在第24位含有苏氨酸或缬氨酸残基，在第34位含有谷氨酰胺残基，在第40位含有精氨酸残基等。这种多肽在基于人Daudi细胞系的增殖试验中表现出抗增殖活性(例如至少约为8.3×106个单位/mg)，和/或在基于人WISH细胞/EMCV的试验中表现出抗病毒活性(至少约为2.1×107个单位/mg)。一些这种多肽结合人α干扰素受体。一些这种多肽的长度为166个氨基酸。另一方面，这种多肽可含有选自SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：54中任一个的序列。
本发明的任何多肽的抗增殖活性一般与多肽导致细胞或其部分生长或快速地，经常重复地产生新的细胞生长的能力相关。
本发明还包括多肽(例如SEQ ID NO：36-71或SEQ ID NO：79-85中的任一个)或编码多肽的核酸(例如SEQ ID NO：1-35或SEQ ID NO：72-78中的任一个)，其中通过本领域技术人员众所周知的抗-血管生成试验测定，所述多肽具有抗-血管生成活性。
本发明还包括：
(a)含有上述一个或多个I组氨基酸残基的任何干扰素-α多肽。
(b)在人样干扰素序列(即与人干扰素显示出高水平的相似性或同源性的序列)，或与所附序列表中列出的任何序列或其片断高度相似或同源(即具有至少约为80％，90％，95％，96％，97％，98％或更高的序列同源性或序列同一性百分比)之序列的上下文中含有上述一个或多个II组氨基酸残基的任何干扰素-α多肽。
(c)含有下列残基组合的任何干扰素-α多肽，所述残基位于或接近已知或被认为与I型干扰素受体相互作用的干扰素-α分子区域，其中所述序列组合(基元)不会出现在任何已知的天然人或非人I型干扰素的等同位置上：
(i)(Tyr或Gln)34；加上Ile132或Arg134中的一个或多个；或
(ii)Asp78，Glu79或(Asp或Thr)80；加上Ile132或Arg134中的一个或多个。
在另一个实施方案中，本发明提供了含有SEQ ID NO：71所示序列：CDLPQTHSLG-X11-X12-RA-X15-X16-LL-X19-QM-X22-R-X24-S-X26-FSCLKDR-X34-DFG-X38-P-X40-EEFD-X45-X46-X47-FQ-X50-X51-QAI-X55-X56-X57-HE-X60-X61-QTFN-X67-FSTK-X72-SS-X75-X76-W-X78-X79-X80-LL-X83-K-X85-X86-T-X88-L-X90-QQLN-X95-LEACV-X101-Q-X103-V-X105-X106-X107-X108-TPLMN-X114-D-X116-ILAV-X121-KY-X124-QRITLYL-X132-E-X134-KYSPC-X140-WEVVRAEIMRSFSFSTNLQKRLRRKE，或其保守取代的变体，其中X11是N或D；X12是R，S或K；X15是L或M；X16是I，M或V；X19是A或G；X22是G或R；X24是I或T；X26是P或H；X34是H，Y或Q；X38是F或L；X40是Q或R；X45是G或S；X46是N或H；X47是Q或R；X50是K或R；X51是A或T；X55是S或F；X56是V或A；X57是L或F；X60是M或I；X61是I或M；X67是L或F；X72是D或N；X75是A或V；X76是A或T；X78是E或D；X79是Q或E；X80是S，R，T或N；X83是E或D；X85是F或L；X86是S或Y；X88是E或G；X90是Y，H，N；X95是D，E或N；X101是I，M或V；X103是E或G；X105是G或W；X106是V或M；X107是E，G或K；X108是E或G；X114是V，E或G；X116是S或P；X121是K或R；X124是F或L；X132是T，I或M；X134是K或R；和X140是A或S；或所述SEQ ID NO：71的片断的干扰素α同系物。另一方面，SEQ ID NO：71的干扰素同系物多肽或其片断在基于人Daudi细胞系的增殖试验中表现出抗增殖活性(至少约为8.3×106个单位/mg)，和/或在基于人WISH细胞/EMCV的试验中表现出抗病毒活性(至少约为2.1×107个单位/mg)。下文将详细讨论这两种试验。这种多肽可含有选自SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：54的氨基酸序列，或者可以由选自SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：19的核苷酸序列编码。
本文所述的干扰素同系物多肽的片断也是本发明的特征。本发明的干扰素α同系物片断一般含有干扰素同系物多肽，其含有SEQ ID NO：36-71或SEQID NO：79-85中任一个的至少约20，25或30，一般至少约40，50，60，70，80，90或100个连续的氨基酸。在其它实施方案中，片断通常含有SEQID NO：36-71或SEQ ID NO：79-85中任一个的至少约100，110，120，125，130，140，150，155，158，160，162，163，164或165个连续的氨基酸。这种多肽片断在基于人Daudi细胞系的试验中具有抗增殖活性，和/或在基于人或鼠细胞系/EMCV的试验中具有抗病毒活性。
在其它实施方案中，本发明提供了长度为166个氨基酸的多肽，在一些此类实施方案中，所述多肽在基于人Daudi细胞系的试验(或其它类似试验)中具有抗增殖活性，包括例如至少约为8.3×106个单位/mg，和/或在基于人WISH细胞/EMCV的试验(或其它类似试验)中具有抗病毒活性，包括例如至少约为2.1×107个单位/mg。
在其它实施方案中，本发明提供了多肽，其含有由编码多核苷酸序列编码的蛋白质的至少100，150，155或160个连续的氨基酸，所述编码多核苷酸序列含有下列中的任一个：(a)SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：35或SEQ IDNO：72至SEQ ID NO：78；(b)编码选自SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：70或SEQID NO：79至SEQ ID NO：85中任一个的第一多肽的编码多核苷酸序列；和(c)在至少高度严紧(或超-高度严紧或超-超-高度严紧条件)的杂交条件下，与基本上全长的(a)或(b)的多核苷酸序列杂交的互补多核苷酸序列。这种多肽在基于人Daudi细胞系的试验(或其它类似试验)中具有抗增殖活性，和/或在基于人WISH细胞/EMCV的试验(或其它类似试验)中具有抗病毒活性。本发明的一些这种多肽特异性地结合人α干扰素受体。本发明的多肽和核酸不必与靶分子或相关分子，包括SEQ ID NO：36-71中任一个的多肽或其片断(包括在本文所述的试验中具有抗病毒或抗增殖活性的那些)，或SEQ ID NO：1-35中任一个的核酸或其片断(包括在本文所述的试验中具有抗病毒或抗增殖活性的那些)的相应序列相同，但可以与其基本上相同。可以对多肽进行多种改变，如保守或非保守性地插入，缺失和取代，其中这种改变可为其使用提供好处。可以用多种方法修饰本发明的多肽，只要它们含有与天然或已知干扰素多肽分子的序列基本上相同(如下文所定义)，或与该序列具有一定百分比的同一性的序列即可。
比对和比较相对较短的氨基酸序列(少于约30个残基)一般是容易的。比较较长的序列需要更复杂的方法来获得两种序列的最佳比对。通过Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部同源性算法，通过Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol48：443的同源性比对算法，通过Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat′l Acad.Sci.(USA)85：2444的相似性检索法，通过用计算机运行这些算法(GAP，BESTFIT，FASTA和TFASTA，Wisconsin GeneticsSoftware Package Release 7.0，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI)，或通过检查可以进行比对比较窗口的最佳序列比对，选择通过多种方法产生的最佳比对(即导致比较窗口中的序列相似性百分比最高)。
术语序列同一性指的是：在比较窗口中两个多核苷酸序列是相同的(即在核苷酸紧接核苷酸的基础上)。术语“序列同一性百分比”是通过以下方法计算的，即在比较窗口内比较两个最佳比对的序列，测定两个序列中出现相同残基的位置数以产生匹配位置数，用匹配位置数除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小)，将结果乘以100，即得出序列同一性百分比。一方面，本发明提供了干扰素同系物核酸，它与SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：35或SEQ IDNO：72至SEQ ID NO：78中任一个的核酸或其片断具有至少约为80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高百分比的序列同一性。
当用于多肽时，术语基本上相同指的是：当通过例如使用缺省缺口加权值(下文将会详细描述)的程序GAP或BESTFIT进行最佳比对时，两个肽序列享有至少约80％的序列同一性，优选至少约90％的序列同一性，更优选至少约95％的序列同一性或更高(如97，98或99％的序列同一性)。优选地，通过保守的氨基酸取代使不同的残基位置有所不同。保守的氨基酸取代指的是具有类似侧链的残基的可互换性。例如，一组具有脂肪族侧链的氨基酸是甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸；一组具有脂肪族-羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；一组具有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一组具有芳香族侧链的氨基酸是苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸，精氨酸和组氨酸；一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，赖氨酸-精氨酸，丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。一方面，本发明提供了干扰素同系物多肽，它与SEQ ID NO：36-71或SEQID NO：79-85中任一个的多肽或其片段具有至少约为80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％，99.5％或更高百分比的序列同一性。
适于测定序列同一性百分比和序列相似性的算法的优选例子是FASTA算法，它描述于Pearson，W.R.&Lipman，D.J.，1988，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA85：2444。也可参见W.R.Pearson，1996，Methods Enzymol.266：227-258。在计算同一性百分比的DNA序列FASTA比对中使用的优选参数被最优化，BL50矩阵15：-5，k-tuple＝2；连接罚分＝40，最优化＝28；缺口罚分-12，缺口长度罚分＝-2；和宽度＝16。
另一种适于测定序列同一性百分比和序列相似性的算法的优选例子是BLAST和BLAST2.0算法，其分别描述于Altschul等，1977，Nuc.Acids Res.25：3389-3402和Altschul等，1990，J.Mol.Biol.215：403-410。使用具有本文所述参数的BLAST和BLAST2.0以测定本发明核酸和蛋白质的序列同一性百分比。公众可以从National Center for Biotechnology Information(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得进行BLAST分析的软件。该算法包括：首先通过鉴定询问序列中长度W的短字节(word)来鉴定高评分的序列对(HSP)，当与数据库序列中相同长度的字节进行比对时，所述HSP可以匹配或吻合于部分正数阈值T。T被称为相邻字节评分阈值(Altschul等，文献同上)。这些原始相邻字节热点(hit)可以用作线索来启动检索，以发现含有它们的较长HSP。热点字节沿着每个序列在两个方向上延伸，直到增加累积的比对评分。对核苷酸序列而言，可使用参数M(一对匹配残基的奖分；总是＞0)和N(错配残基的罚分；总是＜0)计算累积评分。对氨基酸序列而言，使用评分矩阵来计算累积评分。当出现下列情况时，停止在每个方向上延伸热点字节：与其可达到的最大值相比，累积比对评分下降量为X；由于一个或多个评分为负值的残基比对的积累，累积评分为零或低于零；或者已到达序列的末端。BLAST算法参数W，T和X能测定序列比对的敏感性和速度。BLASTN程序(针对核苷酸序列)使用以下缺省值：字长(W)为11，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，并对两条链都进行比较。对于氨基酸序列而言，BLASTP程序使用以下缺省值：字长为3，期望值(E)为10，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff & Henikoff(1989)Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.89：10915)序列比对(B)为50，期望值(E)为10，M＝5，N＝-4，并对两条链都进行比较。
BLAST算法也对两个序列之间的相似性进行统计学分析(参见例如Karlin & Altschul(1993)Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.90：5873-5787)。BLAST算法提供的一个相似性测量值是最小总和可能性(P(N))，它提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的可能性的指示。例如，如果在比较受试核酸与参照核酸时发现最小总和可能性低于约0.2，更优选低于约0.01，最优选低于约0.001，则可认为核酸与参照序列相似。
有用算法的另一个例子是PILEUP。PILEUP使用渐进的成对序列比对由一组相关序列产生多个序列比对，以显示关系和序列同一性百分比。该算法也能绘制树形图，显示用于产生序列比对的群集关系。PILEUP使用Feng& Doolittle(1987)J.Mol.Evol.35：351-360所述渐进序列比对法的简化方法。所用方法类似于Higgins & Sharp(1989)CABIOS5：151-153所述的方法。该程序可比对多达300个序列，每个序列的最大长度为5000个核苷酸或氨基酸。多重比对方法始于两个最相似序列的成对比对，其产生两个已比对序列的群集(cluster)。然后将该群集与下一个最相关的序列或已比对序列的群集进行序列比对。通过简单延伸两个独立序列的成对序列比对，对两个序列群集进行序列比对。通过一系列渐进的成对序列比对获得最终的序列比对。通过指明序列比较区域的特定序列及其氨基酸或核苷酸坐标，并通过指明程序参数，即可运行程序。使用PILEUP，利用下列参数比较参照序列与其它受试序列以测定序列同一性百分比关系：缺省的缺口加权值(3.00)，缺省的缺口长度加权值(0.10)，和加权末端缺口。PILEUP可得自GCG序列分析软件包，例如版本7.0(Devereaux等(1984)Nuc.Acids Res.12：387-395))。
另一种适于多个DNA和氨基酸序列比对的算法的优选例子是CLUSTALW程序(Thompson，J.D.等(1994)Nucl.Acids.Res.22：4673-4680)。ClustalW在多组序列之间进行多重成对比较，并根据同源性将它们装配成多个序列比对。缺口开放和缺口延伸罚分分别为10和0.05。对氨基酸序列比对而言，BLOSUM算法可用作蛋白质加权矩阵(Henikoff和Henikoff(1992)Proc.Nat′l Acad.Sci.U.S.A.89：1091510919)。制备本发明的多肽
上文描述了生产和分离本发明的干扰素同系物多肽的重组方法。除了重组生产以外，可通过使用固相技术直接合成肽来生产多肽(参见Stewart等(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，W.H.Freeman Co，San Francisco；Merrifield，J.(1963)J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154)。可使用人工技术或通过自动化来进行肽合成。例如，根据厂商提供的说明使用Applied Biosystems431A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer，Foster City，Calif.)即可进行自动合成。例如，可以分别化学合成亚序列，并使用化学方法将它们组合在一起以提供全长干扰素同系物。上文详细讨论的本发明干扰素同系物多肽的片段也是本发明的特征，通过使用上文所述的方法可以合成这些片段。
通过在细胞群体中导入本发明的核酸(该核酸与能有效产生编码多肽的调节序列可操作相连)，在培养基中培养细胞以生产多肽，并任选从细胞或培养基中分离多肽，即可生产本发明的多肽。
另一方面，通过在细胞群体中导入含有本发明的至少一种核酸的重组表达载体(其中至少一种核酸与能有效产生编码多肽的调节序列可操作相连)，在适当条件下在培养基中培养细胞以生产由表达载体编码的多肽，并任选从细胞或培养基中分离多肽，即可生产本发明的多肽。使用多肽 抗体
在本发明的另一方面，使用本发明的干扰素同系物多肽生产抗体，所述抗体具有例如诊断，预防和治疗用途，所述用途与例如干扰素同系物的活性，分布和表达相关。
通过本领域众所周知的方法可以产生针对本发明干扰素同系物的抗体。所述抗体包括但不限于：多克隆，单克隆，嵌合，人源化，单链抗体，Fab片段和通过Fab表达文库产生的片段。对治疗或预防用途而言，阻断受体结合的抗体是特别优选的。
用于诱导抗体的干扰素同系物多肽无需具有生物活性；然而，多肽或寡肽必须具备抗原性。用于诱导特定抗体的肽可具有由至少10个氨基酸，优选至少15或20个氨基酸组成的氨基酸序列。短的一段干扰素同系物多肽可与另一种蛋白质，如匙孔嘁血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)融合，并针对嵌合分子产生抗体。
产生多克隆和单克隆抗体的方法是本领域技术人员已知的，很多抗体是可以得到的。参见例如Coligan(1991)Current Protocols in ImmunologyWiley/Greene，NY；and Harlow and Lane(1989)Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Press，NY；Stites等(编)Basic and ClinicalImmunology(4th ed.)Lange Medical Publications，Los Altos，CA，和其中提及的参考文献；Goding(1986)Monoclonal Antibodies：Principles and Practice(2ded.)Academic Press，New York，NY；以及Kohler和Milstein(1975)Nature256：495-497。其它适当的抗体制备技术包括在噬菌体或类似载体中选择重组抗体文库，参见Huse等(1989)Science 246：1275-1281；和Ward等(1989)Nature341：544-546。特定单克隆和多克隆抗体和抗血清通常以至少约为0.1μM，优选至少约为0.01μM或更好，最常见并优选为0.001μM或更好的KD结合。
制备嵌合(人源化)抗体的详细方法可见于美国专利5,482,856。有关人源化和其它抗体生产和改造技术的其它细节可参见Borrebaeck(编)(1995)Antibody Engineering，2nd Edition，Freeman and Company，NY(Borrebaeck)；McCafferty等(1996)Antibody Engineering，A Practical Approach，IRL at OxfordPress，Oxford，England(McCafferty)，和Paul(1995)Antibody EngineeringProtocols，Humana Press，Towata，NJ(Paul)。
在一个有用的实施方案中，本发明提供了完全人源化的针对本发明干扰素同系物的抗体。在抗体被用作人患者的体内和来自体内的预防和治疗剂的应用中，人源化抗体特别合乎需要。人抗体由特征性的人免疫球蛋白序列组成。可以使用很多种方法生产本发明的人抗体(参见例如Larrick等，美国专利5,001,065以及Borrebaeck McCafferty与Paul，文献同上，有关评论)。在一个实施方案中，起初在trioma细胞中生产本发明的人抗体。然后将编码抗体的基因克隆至其它细胞，如非人哺乳动物细胞，并在其中表达。通过trioma技术生产人抗体的一般方法描述于Ostberg等(1983)，Hybridoma2：361367，Ostberg，美国专利4,634,664和Engelman等，美国专利4,634,666。通过此方法获得的抗体生产细胞系被称为trioma，因为它们是三个细胞；即两个人型细胞和一个小鼠细胞的后代。已发现与制备自人细胞的普通杂交瘤相比，trioma能更加稳定地生产抗体。佐剂
一方面，本发明的干扰素同系物多肽或其片段当与抗原一起或在传递抗原之后或之前施用时，可用作佐剂以刺激，增强，加强或扩大与抗原相关的免疫应答。另一方面，本发明提供了给受试者施用一种或多种本文所述发明之多肽的方法。治疗剂和预防剂
如下文所详细描述的那样，本发明的干扰素同系物多肽或其片段可用于预防和/或治疗性治疗多种疾病。
例如，本发明提供了干扰素-α同系物多肽(和编码这种多肽的干扰素-α同系物核酸)，所述多肽在本文所述的试验中具有抗病毒和抗增殖活性。一方面，本发明提供了干扰素-α同系物多肽(和编码这种多肽的干扰素-α同系物核酸)，其中抗病毒活性与抗增殖活性的比率大于本文所提及的其它已知干扰素-α，如GenBank中所列的那些的相应比率。所述多肽(和编码它们的核酸)可用于治疗和/或预防性治疗多种疾病，例如用于乙肝，丙肝，HIV和HSV的治疗方案中。在这种治疗方案中，一些此类多肽(和编码它们的核酸)，如干扰素-α同系物2BA8相对于已知干扰素-α化合物而言具有显著的优点，因为相对于已知的干扰素-α化合物，如干扰素-α2a而言，它们在施用后可能会表现出较低的副作用，较高的效力，因此仅需要较低的剂量，而能导致较小的免疫原性后果。序列变异 经保守修饰的变异
本发明的干扰素同系物多肽包括对SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：79至SEQ ID NO：85所公开的多肽序列的一种或多种经保守修饰的变异(或″保守变异″或″保守取代″)。这种经保守修饰的变异包括取代，添加或缺失，所述变异在SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：79至SEQID NO：85中的任一个中改变，添加或缺失了单个氨基酸或小百分比的氨基酸(一般低于约5％，更优选低于约4％，2％或1％)。
例如，在本文中被鉴定为SEQ ID NO：36的166个氨基酸长的多肽的保守修饰变异(例如缺失)的长度至少约为157或158个氨基酸，优选至少约为159或160个氨基酸，更优选至少约为162或163个氨基酸，仍更优选至少约为164或165个氨基酸，它们分别相当于缺失了低于约5％，4％，2％或1％的多肽序列。
在本文中被鉴定为SEQ ID NO：36的另一个保守修饰变异(例如″经保守取代的变异″)的例子在166个氨基酸长的多肽中的约8个残基(即低于约5％)处含有根据表2(见上文)所示的6个取代组的“保守取代”。
本发明的干扰素同系物多肽序列，包括经保守取代的序列可以作为较大多肽序列的一部分存在，这种情况发生在例如，添加一个或多个结构域以便于纯化蛋白质(例如多聚组氨酸区段，FLAG表位区段等)，例如当其它的功能性结构域对蛋白质的干扰素-α部分的活性具有很小的影响或无影响，或者通过合成后的加工步骤，例如通过用蛋白酶处理可以除去其它的结构域时。
在另一个实施方案中，本发明的干扰素同系物多肽含有在本文中被鉴定为SEQ ID NO：71的下列序列：CDLPQTHSLG-X11-X12-RA-X15-X16-LL-X19-QM-X22-R-X24-S-X26-FSCLKDR-X34-DFG-X38-P-X40-EEFD-X45-X46-X47-FQ-X50-X51-QAI-X55-X56-X57-HE-X60-X61-QTFN-X67-FSTK-X72-SS-X75-X76-W-X78-X79-X80-LL-X83-K-X85-X86-T-X88-L-X90-QQLN-X95-LEACV-X101-Q-X103-V-X105-X106-X107-X108-TPLMN-X114-D-X116-ILAV-X121-KY-X124-QRITLYL-X132-E-X134-KYSPC-X140-WEVVRAEIMRSFS FSTNLQKRLRRKE，或其保守取代的变体，其中X11是N或D；X12是R，S或K；X15是L或M；X16是I，M或V；X19是A或G；X22是G或R；X24是I或T；X26是P或H；X34是H，Y或Q；X38是F或L；X40是Q或R；X45是G或S；X46是N或H；X47是Q或R；X50是K或R；X51是A或T；X55是S或F；X56是V或A；X57是L或F；X60是M或I；X61是I或M；X67是L或F；X72是D或N；X75是A或V；X76是A或T；X78是E或D；X79是Q或E；X80是S，R，T或N；X83是E或D；X85是F或L；X86是S或Y；X88是E或G；X90是Y，H，N；X95是D，E或N；X101是I，M或V；X103是E或G；X105是G或W；X106是V或M；X107是E，G或K；X108是E或G；X114是V，E或G；X116是S或P；X121是K或R；X124是F或L；X132是T，I或M；X134是K或R；和X140是A或S；或所述SEQ ID NO：71的片段。如上文所定义，SEQ ID NO：71序列的保守修饰变异可在166个氨基酸的多肽中包括总共约8个氨基酸的缺失，插入或保守取代，其中在SEQ ID NO：71中被称为X的位置不发生变异，它们对应的是精确定义的氨基酸。
例如，如果4个保守取代位于对应于SEQ ID NO：71的氨基酸141-166的亚序列中，该亚序列WEVVR AEIMR SFSFS TNLQK RLRRKE的保守取代变异的例子包括：WEVVR  SEIMR SFS YS TNLQ R RLRRK D和WE LVRAEI VR SFSFS TNL NK RLR KKE等，其中下划线的为保守取代。
本发明的特征是干扰素同系物多肽，其含有SEQ ID NO：36-71或SEQ IDNO：79-85中任一个的至少约20，通常至少约为25，通常至少约为30，40，50，60，70，80，90或100个连续的氨基酸。在其它实施方案中，多肽一般含有SEQ ID NO：36-70或SEQ ID NO：79-85中任一个的至少约100，110，120，125，130，140，150，155，158，160，163，164或165个连续的氨基酸。
在其它实施方案中，本发明的干扰素同系物多肽含有氨基酸序列，所述序列含有下列一个或多个氨基酸残基(Tyr或Gln)34，Gly37，Phe38，Lys71，Ala76，Tyr90，Ile132，Arg134，Phe152，Lys160和Glu166，其中氨基酸的编号对应于氨基酸序列SEQ ID NO：36中的氨基酸编号。在优选实施方案中，干扰素同系物多肽含有氨基酸序列，所述序列含有SEQ ID NO：36-70中任一个的至少150，155或166个连续的氨基酸残基，并进一步含有Lys160和Glu166，其中氨基酸的编号对应于氨基酸序列SEQ ID NO：36中的氨基酸编号。一些这种多肽在基于人Daudi细胞系的试验中表现出至少约为8.3×106个单位/mg的抗增殖活性，或在基于人WISH细胞/EMCV的试验中表现出至少约为2.1×107个单位/mg的抗病毒活性。通过免疫反应性定义多肽
由于与其它α干扰素同系物相比，本发明的多肽提供了多种新的多肽序列，该多肽也提供了新的结构特征，所述特征在例如免疫学试验中能被识别。特异性结合本发明多肽的抗血清的产生，以及被这种抗血清结合的多肽也是本发明的特征。
本发明包括干扰素-α同系物多肽，所述多肽能与针对免疫原产生的抗体或抗血清特异性结合或与之发生特异性的免疫反应，所述免疫原含有选自SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：79至SEQ IDNO：85中的一个或多个的氨基酸序列。为了消除与其它干扰素-α多肽，如已知干扰素-α多肽的交叉反应性，用可获得的已知α干扰素减除抗体或抗血清，所述已知α干扰素包括例如由具有以下GenBank登记号的核酸编码的多肽：J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)，或者任何其它已知的干扰素-α多肽(一般称为“对照α干扰素多肽”)。当登记号对应于核酸时，产生由核酸编码的多肽，并将其用于减除抗体/抗血清。当核酸对应于非-编码序列，例如假基因时，产生(例如合成产生)对应于核酸阅读框的氨基酸，或者对其进行最小程度的修饰以包括起始密码子用于重组生产。
在一个典型的方法中，免疫测定法使用针对一种或多种多肽产生的多克隆抗血清，所述多肽含有一种或多种氨基酸序列，所述氨基酸序列对应于SEQID NO：36至SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：79至SEQ IDNO：85中的一个或多个，或其基本上的亚序列(即为所提供的全长序列的至少约30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，95％或98％或更长)。得自SEQ IDNO：36至SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：79至SEQ ID NO：85中的一个或多个的全套潜在多肽免疫原在下文中被统称为“免疫原性的多肽”。任选在所得抗血清中选择出对对照α干扰素多肽和/或其它已知干扰素多肽具有低交叉反应性的抗血清，通过用一种或多种对照α干扰素多肽进行免疫吸附来除去任何的交叉反应性，然后，在免疫测定法中使用多克隆抗血清。
为了产生抗血清以用于免疫测定法，按本文所述生产和纯化一种或多种免疫原性的多肽。例如，可在哺乳动物细胞系中生产重组蛋白质。使用混合有标准佐剂，如弗式佐剂的免疫原性多肽，和标准的小鼠免疫方法(参见Harlow和Lane(1998)Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPublications，New York，其中标准性描述了抗体的生成，免疫测定法的形式和用于测定特异性免疫反应性的条件)免疫小鼠近交品系(之所以在此试验中应用近交品系是因为小鼠实质上的基因同一性使得试验结果更具再现性)。或者，将得自本文所述序列的一种或多种合成的或重组的多肽与载体蛋白质缀合，再用作免疫原。
收集多克隆血清，并在免疫测定法，例如将一种或多种免疫原性的多肽固定于固体支持物上的固相免疫测定法中对免疫原性的多肽进行滴定。选择，收集滴度为106或更高的多克隆抗血清，并用对照α干扰素多肽对其进行减除以产生经减除，收集和滴定的多克隆抗血清。
检测经减除，收集和滴定的多克隆抗血清对对照α干扰素多肽的交叉反应性。优选在此测定中使用至少两种免疫原性的α干扰素多肽，优选与至少两种对照α干扰素多肽联合使用，以鉴定特异性结合免疫原性多肽的抗体。
在此比较试验中，测定经减除，滴定的多克隆抗血清的区别性结合条件，所述条件导致经滴定的多克隆抗血清与免疫原性α干扰素结合的信号噪声比相对于与对照α干扰素结合的信号噪声比而言要高至少约5-10倍。即，通过添加非特异性的竞争剂，如白蛋白和脱脂奶粉，或者通过调节盐条件，温度等来调节结合反应的严紧度。在随后的试验中使用这些结合条件以测定受试多肽是否与收集到的经减除的多克隆抗血清特异性结合。特别是，在区别性的结合条件下信号噪声比比对照多肽高至少2-5倍，与免疫原性的多肽相比，信号噪声比至少约为前者的1/2的受试多肽与已知的α干扰素相比，与免疫原性的多肽共享较高的结构相似性或同源性，因此是本发明的多肽。
在另一个例子中，使用竞争结合形式的免疫测定法来检测受试多肽。例如，如上所述，通过用对照α干扰素多肽进行免疫吸附，从收集的抗血清混合物中除去交叉反应的抗体。然后将免疫原性的多肽固定于暴露于经减除，收集的抗血清中的固体支持物上。在试验中加入受试蛋白质以竞争与收集的经减除抗血清的结合。将与固定化蛋白质相比较的，受试蛋白质竞争结合收集的经减除抗血清的能力与试验中加入的免疫原性多肽竞争结合的能力相比较(免疫原性的多肽能有效地与固定化免疫原性多肽竞争同收集的抗血清的结合)。使用标准算法计算出受试蛋白质交叉反应性的百分比。
在平行的试验中，与免疫原性多肽竞争结合抗血清的能力相比较，测定对照蛋白质竞争结合收集的经减除抗血清的能力。使用标准算法计算出对照多肽交叉反应性的百分比。当受试多肽的交叉反应性百分比至少高5-10倍时，可以说受试多肽与收集的经减除抗血清特异性结合。
一般说来，可在本文所述的竞争结合免疫测定法中使用经免疫吸附和收集的抗血清以比较任何受试多肽与免疫原性多肽。为了进行这种比较，可以检测宽范围浓度的两种多肽中的每一种，并使用标准技术测定将经减除抗血清与固定化蛋白质的结合抑制50％所需的每种多肽的量。如果所需受试多肽的量比所需免疫原性多肽的量低两倍，就可以说受试多肽能特异性结合针对免疫原性多肽产生的抗体，条件是所述量至少比对照多肽的约高5-10倍。
最后测定的是特异性，任选用免疫原性多肽(而不是对照多肽)完全免疫吸附所收集的抗血清，直至仅可检测到所得的经免疫原性多肽减除的抗血清集合与免疫吸附中所用免疫原性多肽的微弱结合或检测不到结合。然后检测经完全免疫吸附的抗血清与受试多肽的反应性。如果仅观察到微弱的反应性或无反应性(即与所观察到的经完全免疫吸附的抗血清与免疫原性多肽的结合相比，信号噪声比不超过2倍)，那么，受试多肽就能特异性结合由免疫原性蛋白质产生的抗血清。干扰素同系物的抗增殖特性
按实施例1所述，在基于人Daudi细胞系的试验中检查干扰素同系物对细胞生长的作用。图2显示了与对照干扰素，人IFN-α2a和共有的人IFN-α(Con1)相比，本发明例举的干扰素同系物的抗增殖活性，所述同系物含有SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：54的氨基酸序列。图中显示了与人IFN-α2a和共有的人IFN-α相比，一套例举的干扰素α同系物的每毫克(mg)干扰素受试样品的活性单位数(Y轴)，其中每个同系物样品在X轴上都有一个名称(克隆名称)。这些结果表明含有本发明干扰素-α同系物的组合物可用于抑制或减少肿瘤细胞增殖的方法中，所述肿瘤细胞包括但不限于：人癌细胞，造血癌细胞，人白血病细胞，人淋巴瘤细胞和人黑素瘤细胞。抑制可在体外(用于例如多种增殖试验)，来自体内或体内(用作例如治疗或预防剂)进行。
本发明的干扰素-α同系物显示出针对多种癌细胞系的各种各样的作用模式(参见例如实施例2)。使用体外细胞系筛选(描述于例如Monks，A.等(1991)J.Nat′l Cancer Inst.83：757-766)检测本发明的干扰素-α同系物的选择性生长抑制作用和/或对特定癌细胞系的细胞杀伤作用。被筛选的人癌细胞系(参见例如实施例2，表3)包括白血病，黑素瘤和肺癌，结肠癌，脑癌，中枢神经系统癌，卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌和肾癌。
在癌细胞系筛选中测定3个活性参数：1)GI50(“50％生长抑制”)，为生长抑制活性的测量值，GI50是细胞生长被抑制50％时干扰素受试样品(IFNα同系物或对照IFNα)的浓度，所述抑制是通过在保温阶段结束时，与在对照细胞(无受试样品)中观察到的相比，干扰素受试样品中净蛋白质/多肽的增加降低50％来测定的；2)TGI(“总生长抑制”)，为细胞静止活性的测量值，TGI是特定细胞系的细胞生长完全被抑制时干扰素受试样品的浓度，其中在保温期结束时细胞蛋白质的量等于在保温期开始时细胞蛋白质的量；和3)LC50，为细胞毒活性的测量值，LC50是与保温期开始时所观察到的细胞蛋白质量相比，在保温结束时，测定的细胞蛋白质的量降低50％时干扰素受试样品的浓度，它显示了在加入干扰素受试样品之后细胞的净损失。实施例2中提供了该试验和数据分析方法的其它细节。
与干扰素-αCon1和人干扰素-α2a对照相比，例举的干扰素-α同系物3DA11(SEQ ID NO：40)针对多种癌细胞系的活性参数示于图3A，3B和3C。
关于生长抑制活性，同系物3DA11和对照干扰素-αCon1特别显示出针对大多数受试细胞系的活性，干扰素-αCon1一般表现出较高的活性，干扰素-α2a一般表现出较低的整体活性，并且仅在细胞系亚集中表现出活性(图3A)。
特别地与之形成对照的是，与干扰素-Con1和人干扰素-α2a对照相比，在同系物3DA11的细胞毒和细胞静止活性中观察到显著的差异。在受试的浓度范围内，同系物3DA11显示出针对含11个细胞系的细胞群体的显著细胞静止活性，而干扰素-Con1仅显示出针对含1个细胞系的细胞群体的活性，而同系物3DA11也具有针对这群细胞的活性(图3B)。另一方面，IFN-α2a在此试验中对任何受试细胞系都不具有活性。因此，同系物3DA11比共有的人干扰素-α(Con1)和人干扰素-α2a具有更宽的细胞静止活性分布图。
与干扰素-Con1和人干扰素-α2a对照相比，同系物3DA11也显示出显著的细胞毒活性(图3C)。令人惊奇的是，同系物3DA11显示出针对含8个细胞系的细胞群体的细胞毒活性，而干扰素-Con1和干扰素-α2a对照在试验所用的浓度范围内对含任何细胞系的细胞群体都未表现出可测的活性。因此，与干扰素-Con1和人干扰素-α2a相比，同系物3DA11也具有较宽的细胞毒活性分布图。
图4A-4D阐明了本发明例举的干扰素-α同系物的细胞静止活性(由TGI值反映)。在每个图中，绘制多种干扰素-α同系物和两种对照干扰素(干扰素-Con和人干扰素-α2a)针对特定癌细胞系细胞群体的相对细胞静止活性(表示为-log TGI)图。
在受试的例举同系物中，同系物1D3(SEQ ID NO：54)和3DA11(SEQ IDNO：40)，而不是对照干扰素中的任一种在试验浓度范围内表现出针对白血病细胞系RPMI-8226细胞群体的显著细胞静止活性(图4A)。在此实施例中，相对于任一种对照(干扰素-Con1或干扰素-α2a)针对白血病细胞系细胞群体的细胞静止活性而言，1D3和3DA11同系物显示出针对细胞群体的至少约高25倍的相应活性(与至少约为1.4个log单位的TGI差异相对应)。
同系物1D3，2G5(SEQ ID NO：45)，6CG3(SEQ ID NO：52)和3DA11，而不是对照干扰素中的任一种显示出针对肺癌细胞系NCI-H23的显著细胞静止活性(图4B)。在此实施例中，相对于干扰素-Con1或干扰素-α2a针对肺癌细胞系细胞群体的细胞静止活性而言，1D3，2G5，6CG3和3DA11同系物显示出针对肺癌细胞系细胞群体的至少约高12倍的相应活性(与至少约为1.1个log单位的TGI差异相对应)。
同系物1D3，2G5和3DA11，而不是对照干扰素中的任一种显示出针对肾癌细胞系ACHN细胞群体的显著细胞静止活性(图4C)。在此实施例中，相对于干扰素-Con1或干扰素-α2a针对肾癌细胞系细胞群体的细胞静止活性而言，1D3，2G5和3DA11同系物显示出针对所述肾癌细胞系细胞群体的至少约高35倍的相应活性(与至少约为1.55个log单位的TGI差异相对应)。
同系物1D3，2G5，3DA11，2CA5(SEQ ID NO：42)和2DB11(SEQ IDNO：41)，以及干扰素-Con1对照，而不是干扰素-α2a对照显示出针对卵巢癌细胞系OVCAR-3细胞群体的显著细胞静止活性(图4D)。在此实施例中，就针对各群卵巢癌细胞系细胞的细胞静止活性而言，同系物1D3显示出比干扰素-Con1至少约高2倍的相应活性(与至少约为0.3个log单位的TGI差异相对应)，而1D3，2G5，3DA11，2CA5和2DB11同系物显示出比干扰素-α2a至少约高40倍的相应活性(与至少约为1.6个log单位的TGI差异相对应)。
从本文提供的例举数据可以明显地看出：本发明的干扰素-α同系物显示出多种细胞静止活性分布图，所述分布图与干扰素-αCon1和干扰素α-2a的显著不同。
本发明包括干扰素-α同系物，相对于人干扰素-α2a或共有的人干扰素-αCon1而言，其具有增加的细胞静止活性。在多个实施方案中，干扰素-α同系物对癌细胞系细胞群体的细胞静止活性比人干扰素-α2a的相应活性至少约高2倍(即TGI值至少约低2倍)，或者干扰素-α同系物对选自下列一个或多个癌细胞系的细胞群体的细胞静止活性比干扰素-Con1的相应活性至少约高2倍：白血病细胞系；黑素瘤细胞系；肺癌细胞系；结肠癌细胞系；中枢神经系统(CNS)癌细胞系；卵巢癌细胞系；乳腺癌细胞系；前列腺癌细胞系和肾癌细胞系。
在其它实施方案中，干扰素-α同系物对癌细胞系细胞群体的细胞静止活性比人干扰素-α2a的相应活性至约高5倍(即TGI值至少约低5倍)，或者干扰素-α同系物对选自下列一个或多个癌细胞系的细胞群体的细胞静止活性比干扰素-Con1的相应活性至少约高5倍：白血病细胞系；黑素瘤细胞系；肺癌细胞系；结肠癌细胞系；中枢神经系统(CNS)癌细胞系；卵巢癌细胞系；乳腺癌细胞系；前列腺癌细胞系和肾癌细胞系。在其它实施方案中，干扰素-α同系物时癌细胞系细胞群体的细胞静止活性比人干扰素-α2a的相应活性至少约高10倍(即TGI值至少约低10倍)，或者干扰素-α同系物对选自下列一个或多个癌细胞系的细胞群体的细胞静止活性比干扰素-Con1的相应活性至少约高10倍：白血病细胞系；黑素瘤细胞系；肺癌细胞系；结肠癌细胞系；中枢神经系统(CNS)癌细胞系；卵巢癌细胞系；乳腺癌细胞系；前列腺癌细胞系和肾癌细胞系。
本发明包括干扰素-α同系物，相对于人干扰素-α2a或干扰素-Con1而言，其具有增加的细胞毒活性。在多个实施方案中，干扰素-α同系物对选自下列一个或多个癌细胞系的细胞群体的细胞毒活性比人干扰素-α2a的相应活性至少约高2倍(即LC50值至少约低2倍)，至少高5倍，或至少高10倍：白血病细胞系；黑素瘤细胞系；肺癌细胞系；结肠癌细胞系；CNS癌细胞系；卵巢癌细胞系；乳腺癌细胞系；前列腺癌细胞系和肾癌细胞系。在其它实施方案中，干扰素-α同系物对选自下列一个或多个癌细胞系的细胞群体的细胞毒活性比干扰素-Con1的相应活性至少约高2倍(即LC50值至少约低2倍)，至少约高5倍，或至少约高10倍：白血病细胞系；黑素瘤细胞系；肺癌细胞系；结肠癌细胞系；CNS癌细胞系；卵巢癌细胞系；乳腺癌细胞系；前列腺癌细胞系和肾癌细胞系。
本发明包括干扰素-α同系物，相对于人干扰素-α2a或干扰素-Con1而言，其具有增加的生长抑制活性。在多个实施方案中，干扰素-α同系物对选自下列一个或多个癌细胞系的细胞群体的生长抑制活性比人干扰素-α2a的相应活性至少约高2倍(即GI50值至少约低2倍)，至少约高5倍，或至少约高10倍：白血病细胞系；黑素瘤细胞系；肺癌细胞系；结肠癌细胞系；CNS癌细胞系；卵巢癌细胞系；乳腺癌细胞系；前列腺癌细胞系和肾癌细胞系。在其它实施方案中，干扰素-α同系物对选自下列一个或多个癌细胞系的细胞群体的生长抑制活性比干扰素-Con1的相应活性至少约高2倍(即GI50值至少约低2倍)，至少约高5倍，或至少约高10倍：白血病细胞系；黑素瘤细胞系；肺癌细胞系；结肠癌细胞系；CNS癌细胞系；卵巢癌细胞系；乳腺癌细胞系；前列腺癌细胞系和肾癌细胞系。
本文所述的发现是可对干扰素(如本文所述的干扰素-α同系物)进行演变，修饰或重组以显示出多种活性分布图，该发现为演变和产生定制的，特异性的干扰素同系物提供了机会，所述同系物可用于治疗多种特异性的疾病，包括例如多种癌症或相关疾病。例如，经最优化以使针对特定靶癌细胞类型的效力增强的本发明的干扰素同系物也可被最优化，以使其(有利地)具有降低的针对非靶细胞的毒性，因此，对施用同系物的受试者(例如患者)产生较低的副作用。
本发明进一步提供了针对取自受试者亚群(如哺乳动物或人患者)，或甚至取自各个受试者(如哺乳动物或人患者)的肿瘤细胞最优化干扰素同系物的机会，以提供专为各个受试者定制的治疗或预防性治疗方案。本发明的最优化的干扰素同系物可提供针对癌症或相关疾病，或其它可用干扰素治疗的疾病，或对目前使用的干扰素或其它治疗方案无反应的疾病的治疗或预防效果。干扰素同系物的抗病毒特性
按实施例1所述，在人WISH细胞/EMCV试验中评价本发明干扰素同系物的抗病毒活性。图2显示了含有氨基酸序列SEQ ID NO：36至SEQ IDNO：54的本发明例举的干扰素同系物的抗病毒活性。
已证实本发明例举的IFN-α同系物的经改良的体外抗病毒活性能在鼠模型系统体内维持。以前有人证实：本发明的两种IFN-α同系物CH2.2和CH2.3(分别为SEQ ID NO：84和85)在基于鼠细胞的试验中，相对于人IFN-α2a而言，分别具有约206,000-倍和138,000-倍经改良的抗病毒活性，以及在相同的试验中，与天然鼠干扰素相比，具有显著较高的活性(Chang等(1999)Nature Biotechnol.17：793-797)。如下文实施例3所述，给用致死剂量的水泡性口炎病毒(VSV)攻击的Balb/c小鼠施用不同剂量的IFN-α同系物CH2.2和CH2.3，天然鼠干扰素Mu-IFNα4和人IFN-α2a。高体外活性与观察到的体内活性较好地相互关联(图5)。CH2.2和CH2.3同系物能完全有效地保护小鼠，使其免受致死病毒攻击，而相同剂量的天然鼠干扰素部分有效，人IFN-α2a完全无效。这些结果表明：含有本发明的干扰素同系物的组合物可用于抑制被病毒感染的受试者体内的病毒复制的方法中，所述病毒包括但不限于：人免疫缺损病毒(HIV)，丙肝病毒(HCV)，单纯疱疹病毒(HSV)和乙肝病毒(HBV)。可在体外(用于例如多种抗病毒试验)，来自体内(在本文讨论的来自体内的方法中用作例如治疗或预防剂)或体内(在本文讨论的体内方法中用作例如治疗或预防剂)进行抑制。将干扰素同系物用于治疗自身免疫和其它免疫-相关疾病
本发明的组合物可用于治疗或预防性地治疗，从而缓解多种免疫系统-相关疾病，所述疾病的特征在于过高或过低活性的免疫系统功能或其它特征。所述疾病包括变应原性过高和自身免疫病，如多发性硬化，I型(胰岛素依赖型)糖尿病，红斑狼疮，肌萎缩性侧硬化，Crohn氏病，类风湿性关节炎，口炎，哮喘，变态反应，牛皮癣等。治疗和预防组合物
根据本领域众所周知的方法，在适当的体外，来自体内和体内疾病动物模型中检测含有本发明的一种或多种干扰素同系物多肽或核酸的治疗或预防性组合物，以证实效力，组织代谢并估计剂量。特别地，通过在相关试验中比较α干扰素同系物与现有的α干扰素治疗剂或预防剂的活性，即可测定剂量。一方面，本发明提供了方法，它包括如下文所详细描述的那样，给哺乳动物或非-哺乳脊椎动物，如鸟(如鸡或鸭)施用一种或多种上文所述的本发明的干扰素同系物核苷酸或多肽(或其片段)，所述哺乳动物包括例如人，灵长类动物，小鼠，猪，奶牛，山羊，兔，大鼠，豚鼠，仓鼠，马，绵羊。所述组合物一般含有一种或多种本发明的干扰素同系物核苷酸或多肽(或其片段)和赋形剂，例如药物可接受的赋形剂。
一方面，通过用限制性内切核酸酶，RNA酶或DNA酶消化一种或多种本发明的核酸(或其片段)来产生本发明的组合物。
在本发明的另一方面，提供了通过在脱氧核糖核苷酸三磷酸和核酸聚合酶，如热稳定性的聚合酶的存在下，保温一种或多种上文所述的核酸而产生的组合物。
本发明还包括含有两种或多种上文所述核酸的组合物。所述组合物可含有核酸文库，其中文库含有至少约5，10，20，50，100，150或200或更多种核酸。
通过常用于将分子导入，最终与血液或组织细胞接触的任何途径进行给药。可以任何适当的方式，优选与药物可接受的载体一起施用本发明的干扰素-α同系物。给患者施用本发明上下文中的干扰素同系物的适当方法是可以使用的，尽管可以使用不止一种途径来施用特定的组合物，但特定的途径经常能提供比另一种途径更直接和更有效的反应。
药物可接受的载体部分由所施用的特定组合物，以及施用组合物所用的特定方法来决定。因此，有很多种适当的本发明药物组合物的配方。
可通过多种途径施用多肽组合物，以用于本文所述的预防，治疗和诊断方法中的任一种中，所述途径包括但不限于：口服，静脉内，腹膜内，肌内，经皮，皮下，局部，舌下，阴道或直肠途径，或通过吸入。也可以经由脂质体施用干扰素同系物多肽组合物。所述给药途径和适当的制剂一般是本领域已知的。
干扰素同系物多肽或核酸单独或与其它适当的组分联合也可被制成经由吸入给药的气雾剂(即它们可被“喷雾”)。气雾剂可被置于加压的可接受推进剂，如二氯二氟甲烷，丙烷，氮等中。
适于非肠道给药的制剂，例如通过关节内，静脉内，肌内，经皮，腹膜内和皮下途径给药的制剂包括含水和不含水的等渗无菌注射溶液，其含有抗氧化剂，缓冲液，抑菌剂和使制剂与给药受体的血液等渗的溶质，和含水和不含水的无菌悬浮液，它可包括悬浮剂，增溶剂，增稠剂，稳定剂和防腐剂。经包装的核酸制剂可以存在于单位剂量或多剂量的密封容器，如安锫和小管中。
非肠道给药和静脉内给药是优选的给药方法。特别是，现有的α干扰素治疗剂或预防剂已经使用的给药途径，以及目前使用的制剂是优选的给药途径，以及本发明α干扰素同系物多肽和核酸的优选制剂。
在来自体内或体内疗法的上下文中，被上文所述的干扰素同系物转导的细胞也可按上文所述静脉内或非肠道给药。应懂得将细胞传递给受试者(例如人患者)是常规技术，例如经由静脉内或腹膜内给药将细胞传递至血液。
在本发明的上下文中，施用给受试者(例如患者)的本发明干扰素同系物多肽或核酸的剂量足以在一定时间内，在受试者(例如患者)中产生有利的治疗或预防反应，或者足以抑制病原体的感染，这取决于具体的应用。通过特定载体或制剂的效力，和所用干扰素同系物的活性和患者的状况，以及待治疗的患者的体重或表面积来确定剂量。通过在特定患者中施用特定载体，制剂，转导细胞类型等相伴随的任何不良副作用的存在，特性和程度来确定剂量的大小。
在本文所述发明的治疗和预防治疗方法中，本发明干扰素-α核酸(例如DNA或mRNA)的有效量(例如核酸剂量)的一般范围是例如：约0.05微克/千克(kg)至约50mg/kg，通常约为0.005-5mg/kg。然而，应理解可以按照本领域技术人员熟知的方式，根据多个因素改变核酸(例如核酸剂量)和/或多肽(例如多肽剂量)的有效量，所述因素包括：多肽的活性或效力，所施用的任何核酸构建体(例如载体，启动子，表达系统)的活性或效力，待治疗的疾病(例如特定的癌症)和被传递核酸的受试者。
为了通过例如传递编码多肽的核酸来传递一些多肽，用例如约为0.005mg/kg至约5mg/kg的核酸剂量即可达到足够水平的翻译和/或表达。本领域技术人员根据上文提及的因素可以容易地确定其它具有已知生物活性的多肽(和编码它们的核酸)的剂量。其它已知干扰素-α针对特定疾病所用的剂量为确定本发明核酸或多肽的剂量和治疗方案提供了指南。干扰素-α同系物多肽的有效量范围为约1微克至约1毫克，更优选为约1微克至约100微克。
用于本文所述发明的治疗和预防性治疗方法的组合物可含有例如浓度为约0.1微克/毫升(ml)至约20mg/ml的本发明的干扰素-α同系物核酸(例如DNA或mRNA)，和药物可接受的载体(例如含水载体)。
用于本文所述发明的治疗和预防性治疗方法的组合物可含有例如浓度如上文和本文所述的本发明的干扰素-α同系物多肽，和药物可接受的载体(例如含水载体)。
在治疗或预防癌症或病毒疾病时，确定载体的有效量，细胞类型或所施用的制剂的过程中，医师需评价循环血浆水平，载体/细胞/制剂/干扰素同系物的毒性，疾病的进程和抗-载体/干扰素同系物抗体的产生。
给例如70千克的患者施用的剂量范围等于目前使用的干扰素-α治疗或预防性蛋白质的剂量，计算出产生干扰素同系物序列的载体或细胞的剂量，以产生相同量的干扰素同系物核酸或表达出的蛋白质。通过任何已知的常规疗法，包括细胞毒性剂，核苷酸类似物(例如当用于治疗HIV感染时)，生物反应修饰剂等，本发明的载体可补充治疗癌症和病毒-介导的疾病。
当应用于患者总的和整体的健康状况时，为了进行给药，应以一定的比率施用本发明的干扰素同系物和转导细胞，所述比率是通过干扰素同系物多肽或核酸的LD50，载体，或转导的细胞类型，和各种浓度的干扰素同系物多肽或核酸，载体或细胞类型的副作用来测定的。可以经由单剂量或分开的剂量进行给药。
为了将已被重组α-干扰素核酸转导的细胞导入受试者(例如患者)，在灌注之前获得血样，并保存血样以进行分析。在60-200分钟内静脉内灌注1×106至1×1012个经转导的细胞。密切监测生命体征并通过脉搏血氧计监测氧饱和度。在灌注后5分钟和1小时获得血样，保存该血样以随后进行分析。任选在1年内的总共4至6次治疗中，每隔2至3个月重复进行leukopheresis，转导和再灌注。第一次治疗之后，根据临床医生的判断力，主要对门诊病人进行灌注。如果对门诊病人进行再灌注，在治疗至少4小时，优选8小时后监测参与者。根据已建立的方法制备再灌注所用的经转导细胞。参见Abrahamsen等(1991)J.Clin.Apheresis 6：48-53；Carter等(1988)J.Clin.Arpheresis 4：113-117；Aebersold等(1988)，J.Immunol.Methods 112：1-7；Muul等(1987)J.Immunol.Methods101：171181和Carter等(1987)Transfusion27：362-365。培养约2至4周后，细胞数目应达到1×106至1×1012个。在此方面，细胞的生长特征随患者的不同和细胞类型的不同而不同。在再灌注转导细胞之前约72小时，取出等分试样以分析表型，和表达治疗或预防剂的细胞的百分比。
如果经受载体或转导细胞或蛋白质制剂灌注的受试者(例如患者)出现发烧，怕冷或肌肉疼痛，可以服用适当剂量的阿斯匹林，布洛芬，醋氨酚或其它解热镇痛药物。经受灌注反应，如发烧，肌肉疼痛和怕冷的受试者(例如患者)可在灌注前30分钟预先服用阿斯匹林，醋氨酚，或例如苯海拉明。杜冷丁可用于对退热剂和抗组胺剂不能快速反应的更严重的怕冷和肌肉疼痛。根据反应的严重程度，可以放慢或取消细胞灌注。治疗和预防性治疗的方法
本发明还包括治疗或预防性治疗疾病的方法，所述方法包括给受试者体内或来自体内地施用一种或多种上文所述发明的核酸或多肽(或含有药物可接受的赋形剂和一种或多种所述核酸或多肽的组合物)，所述受试者包括例如哺乳动物，包括例如人，灵长类动物，小鼠，猪，奶牛，山羊，兔，大鼠，豚鼠，仓鼠，马，绵羊；或非-哺乳类脊椎动物，如鸟类(如鸡或鸭)或鱼或无脊椎动物。
在本发明的一方面，在来自体内的方法中，从受试者体内获得或取出令人感兴趣的一种或多种细胞或细胞群体(例如肿瘤细胞，肿瘤组织样品，器官细胞，血液细胞，皮肤，肺，心脏，肌肉，脑，粘膜，肝脏，肠，脾脏，胃，淋巴系统，宫颈，阴道，前列腺，口腔，舌等的细胞)，并与一定量的能有效预防或治疗疾病的本发明的多肽接触。然后将经接触的细胞返回或传递至受试者体内获得细胞的位点，或者待治疗的受试者体内另一个令人感兴趣的位点(例如包括上文所定义的那些位点)。必要时，可使用标准的和众所周知的移植技术，将经接触的细胞移植到受试者体内令人感兴趣的组织，器官或系统位点(包括上文所述的所有位点)，或者例如使用标准的传递或注入技术将其传递至血液或淋巴系统。
本发明还提供了体内方法，其中将受试者的令人感兴趣的一种或多种细胞或细胞群体直接或间接地与一定量的能有效预防或治疗疾病的本发明的多肽接触。在直接接触/给药形式中，一般通过多种方法中的任一种，包括局部给药，注射(例如通过使用针头或注射器)，或疫苗或基因枪传递，推入组织，器官或皮肤位点，将多肽直接施用于或转移至待治疗的细胞或感兴趣的组织位点(例如肿瘤细胞，肿瘤组织样品，器官细胞，血液细胞，皮肤，肺，心脏，肌肉，脑，粘膜，肝脏，肠，脾脏，胃，淋巴系统，宫颈，阴道，前列腺，口腔，舌等的细胞)。可通过例如肌内，皮内，皮下，口服，腹膜内，鞘内，静脉内传递多肽，或将多肽置于体腔内(包括例如在外科手术过程中)，或通过吸入或阴道或直肠给药传递多肽。
在体内间接接触/给药形式中，一般通过将本发明的多肽直接接触或施用于能促进治疗的一种或多种细胞或细胞群体，而将多肽间接施用于或转移至待治疗的细胞或感兴趣的组织位点，包括上文所述的那些位点(例如皮肤细胞，器官系统，淋巴系统或血液细胞系统等)。例如，通过将血液或淋巴系统，皮肤或器官的细胞与足够量的多肽接触，以使多肽传递至感兴趣的位点(例如体内的组织，器官或感兴趣的细胞或血液或淋巴系统)，并导致有效的预防或治疗作用，即可治疗受试者体内的肿瘤细胞。通过使用上文所述的一种或多种给药途径或模式，一般即可进行这种接触，给药或转移。
另一方面，本发明提供了来自体内的方法，其中从受试者体内获得或取出令人感兴趣的一种或多种细胞或细胞群体(例如肿瘤细胞，肿瘤组织样品，器官细胞，血液细胞，皮肤，肺，心脏，肌肉，脑，粘膜，肝脏，肠，脾脏，胃，淋巴系统，宫颈，阴道，前列腺，口腔，舌等的细胞)，并通过使所述的一种或多种细胞或细胞群体与多核苷酸构建体接触来转化这些细胞，所述构建体含有编码所需生物活性多肽(例如本发明的多肽)的本发明的靶核酸序列，所述多肽能有效预防或治疗疾病。使一种或多种细胞或细胞群体与足够量的多核苷酸构建体和控制所述核酸序列表达的启动子接触，以使细胞摄入多核苷酸构建体(和启动子)，充分表达本发明的靶核酸序列，产生一定量的能有效预防或治疗疾病的生物活性多肽。多核苷酸构建体可包括控制本发明的核酸序列表达的启动子序列(例如CMV启动子序列)和/或，必要时，还包括一种或多种其它的核苷酸序列，所述序列编码至少一种或多种本发明的另一种多肽，细胞因子，佐剂或共-刺激分子，或其它所需多肽。
转染后，将经转化的细胞返回，传递或转移至受试者体内获得细胞的组织位点或系统，或者待治疗的受试者体内的另一个位点(例如肿瘤细胞，肿瘤组织样品，器官细胞，血液细胞，皮肤，肺，心脏，肌肉，脑，粘膜，肝脏，肠，脾脏，胃，淋巴系统，宫颈，阴道，前列腺，口腔，舌等的细胞)。必要时，可使用标准的和众所周知的移植技术，将细胞移植到受试者体内令人感兴趣的组织，皮肤，器官或身体系统，或者例如使用标准的传递或注入技术将其传递至血液或淋巴系统。通过使用上文所述的一种或多种给药途径或模式，一般即可传递，施用或转移经转化的细胞。靶核酸的表达可以自然发生，或者也可被诱导(下文将要详细描述)，所表达的编码多肽的量应足以和有效地治疗位点或组织系统处的疾病。
另一方面，本发明提供了体内方法，其中受试者体内一种或多种令人感兴趣的细胞或细胞群体(例如包括上文所述的那些细胞和细胞系统和受试者)被转化，转化是通过使细胞或细胞群体与多核苷酸构建体接触(或使用上文所述的一种或多种给药途径或模式施用于或转移至细胞或细胞群体)来实现的，所述构建体含有编码所需生物活性多肽(例如本发明的多肽)的本发明的核酸序列，所述多肽能有效预防或治疗疾病。
可将多核苷酸构建体直接施用于或转移至患病细胞(例如通过使用上文所述的一种或多种给药途径或模式直接接触)。或者，首先通过使用上文所述的一种或多种给药途径或模式使未患病的细胞或其它患病细胞与足够量的多核苷酸构建体直接接触(所述构建体含有编码生物活性多肽的核酸序列和控制核酸序列表达的启动子)，使得细胞摄入多核苷酸构建体(和启动子)，充分表达本发明的靶核酸序列，产生一定量的能有效预防或治疗疾病的生物活性多肽，从而使多核苷酸构建体或所得的表达多肽能自然地或自动地从受试者体内最初的传递位点，系统，组织或器官转移至受试者体内患病的位点，组织，器官或系统(例如经由血液或淋巴系统)，而将多核苷酸构建体间接施用于或转移至患病细胞。靶核酸的表达可以自然发生，或者也可被诱导(下文将要详细描述)，以使所表达的编码多肽的量足以和能有效地治疗位点或组织系统处的疾病。多核苷酸构建体可包括控制核酸序列表达的启动子序列(例如CMV启动子序列)和/或，必要时，还包括一种或多种其它的核苷酸序列，所述序列编码至少一种或多种本发明的另一种多肽，细胞因子，佐剂或共-刺激分子，或其它所需多肽。
在上文所述的体内和来自体内的治疗方法的每一种中，可以施用或传递含有赋形剂和本发明的多肽或核酸的组合物。一方面，按上文所述，将含有药物可接受的赋形剂和本发明的多肽或核酸的组合物施用于或传递至受试者，其用量能有效治疗疾病。
另一方面，在上文所述的体内和来自体内的治疗方法的每一种中，施用给细胞或受试者的多核苷酸的量可以是足以使受试者的一种或多种细胞摄入所述多核苷酸，并充分表达所述核酸序列，产生一定量的能有效增强受试者的免疫应答，包括由免疫原(如抗原)诱导的免疫应答的生物活性多肽的量。另一方面，对每种方法而言，施用于细胞或受试者的多肽量可以是足以增强受试者的免疫应答，包括由免疫原(如抗原)诱导的免疫应答的量。
另一方面，在使用多核苷酸构建体(或含有多核苷酸构建体的组合物)给受试者传递生理活性多肽的体内或体内治疗方法中，可通过使用可诱导的开启-和关闭-基因表达系统来诱导多核苷酸构建体的表达。这种开启-和关闭-基因表达系统的例子分别包括Tet-OnTM Gene Expression System和Tet-OffTMGene Expression System(有关每个系统的详细描述可参见例如ClontechCatalog2000，pg.110-111)。其它可控或可诱导的开启-和关闭-基因表达系统是本领域技术人员已知的。使用这种系统，可以精确地，可逆地和定量地调节多核苷酸构建体中靶核酸的表达。例如，可在使经稳定转染的细胞传递或转移至或接触感兴趣的组织位点，器官或系统之后，再诱导靶核酸的基因表达，其中所述细胞含有多核苷酸构建体，所述构建体含有靶核酸。这种系统对治疗方法和形式特别有利，其中它可以有利地延迟或精确控制靶核酸的表达(例如给完成外科手术和/或手术后的康复以时机；使含有靶核酸的多核苷酸构建体有时间到达待治疗的位点，细胞，系统或组织；使含有被构建体转化之细胞的移植物有时间掺入它所嫁接或贴附的组织或器官等)。集成系统
本发明提供了计算机，计算机可读介质和集成系统，它们中含有对应于本文所述多肽和核酸，包括例如本文所列的那些序列及其多种沉默取代和保守取代的序列信息的特征链。
本领域已知的多种方法和遗传学算法(GO)可用于检测不同特征链之间的同源性或相似性，或者用于行使其它所需的功能，例如控制输出文件，提供描述包括序列等的信息的基础。例如上文讨论的BLAST。
因此，可在本文的集成系统中检测和识别多种严紧度和长度的不同类型的同源性和相似性。例如，已设计出很多种同源性测定方法，用于比较性分析生物聚合物的序列，在字处理时检查拼写，从多种数据库中检索资料。已理解天然多核苷酸的4个主要核碱基中双-螺旋成对互补物的相互作用，也可将模拟互补同源性多核苷酸链退火的模型用作序列比对或其它操作的基础，所述操作一般在对应于本文序列的特征链上进行(例如字-处理操作，构建含有序列或亚序列特征链的图，输出表格等)。用于计算序列相似性或同源性，且含有GO的软件包的例子是BLAST，通过输入对应于本文序列的特征链，BLAST可适用于本发明。
类似地，通过输入对应于本发明的干扰素α同系物(核酸或蛋白质，或两者)的特征链，标准的桌面电脑应用软件，如字处理软件(如Microsoft WordTM或Corel WordPerfectTM)和数据库软件(例如电子制表软件如Microsoft ExcelTM，Corel Quattro ProTM或数据库程序，如Microsoft AccessTM或ParadosTM)可适用于本发明。例如，集成系统可包括具有适当特征链信息的上述软件，例如用于与用户界面(例如标准操作系统如Windows，Macintosh或LINUX系统中的图形用户界面)相连接以操作特征链。如上所述，也可将专门用于序列比对的程序如BLAST掺入本发明的系统以比对核酸或蛋白质(或相应的特征链)。
本发明中分析所用的集成系统一般包括装有比对序列所用GO软件的数字计算机，以及能进入含有本文所述任何序列的软件系统的数据设置。计算机可以是例如个人电脑(Intel x86或Pentium芯片兼容型DOSTM，OS2TMWINDOWSTM WINDOWS NTTM，WINDOWS95TM，WINDOWS98TM，基于LINUX的机器，MACINTOSHTM，Power PC，或基于UNIX(例如SUNTM工作站)的机器)或其它本领域技术人员已知的可商购的普通计算机。用于序列比对或操作序列的软件是可以获得的，或者本领域技术人员使用标准的编程语言，如Visualbasic，Fortran，Basic，Java等可以容易地创建这些软件。
任何控制器或计算机任选包括监视器，它经常是阴极射线电子管(″CRT″)显示器，平面显示器(例如活动矩阵式液晶显示器，液晶显示器)或其它显示器。计算机电路经常被置于盒内，盒中包括多个集成电路芯片，如微处理器，存储器，界面电路等。盒中也可任选包括硬盘驱动器，软盘驱动器，高容量的可移动式驱动器，如可写的CD-ROM和其它普通的周边设备。任选提供诸如键盘或鼠标的输入装置供用户输入和选择在相关的计算机系统中待比较或操作的序列。
计算机一般包括适当的软件用于接受用户的指令，所述指令可以是用户输入一套参数字段的形式，例如在GUI中，或者是预先编程的指令形式，例如预先为多种不同的特定操作编程。然后，软件将这些指令转变为适当的语言，指示不固定方向的操作和传送控制器进行所需要的操作。
软件也可包括(例如根据序列或本文序列的比对)控制核酸合成的输出元件，或其它发生在序列比对下游的操作，或其它使用对应于本文序列的特征链进行的操作。
在一个实施方案中，本发明提供了集成系统，其含有含数据库的计算机或计算机可读介质，所述数据库中具有一个或多个序列记录。每个序列记录含有一种或多种对应于选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：85的核酸或多肽或蛋白质序列的特征链。集成系统还含有用户输入界面，它可以使用户选择性地查看一个或多个序列记录。在一个这种集成系统中，计算机或计算机可读介质含有比对指令集，可比对特征链与一种或多种其它的，对应于核酸或多肽或蛋白质序列的特征链。
一个这种集成系统包括指令集，其含有下列中的至少一个：局部同源性比较测定，同源性序列比对测定，相似性检索测定和BLAST测定。在一些实施方案中，系统还含有可读的输出元件，它可以显示通过序列比对指令集产生的比对结果。在另一个实施方案中，计算机或计算机可读介质还含有指令集，它能将至少一种核酸序列翻译成氨基酸序列，所述核酸序列含有选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：72至SEQ ID NO：78的序列。该指令集可通过将密码子使用指令集或测定序列同一性的指令集应用于受试核酸序列来选择核酸。
本发明还提供了使用计算机系统呈现数据库中储存的多个序列记录的至少一种所固有的信息的方法。每个序列记录含有至少一种对应于SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：85的特征链。该方法包括测定至少一种对应于SEQ IDNO：1至SEQ ID NO：85中的一种或多种或其亚序列的特征链；确定用户在列出的至少一种特征链中选择哪一种；和显示每种选定的特征链，或比对每种选定的特征链和其它特征链。该方法还包括显示每种选定的特征链和其它特征链的序列比对和/或显示列表。试剂盒
在其它方面，本发明提供了使本文所述的方法，组合物，系统和仪器具体化的试剂盒。本发明的试剂盒任选包括一种或多种下列组分：(1)本文所述的仪器，系统，系统组件或仪器组件；(2)实施本文所述方法，和/或操作本文所述仪器或仪器组件，和/或使用本文所述组合物的说明书；(3)一种或多种α干扰素同系物组合物(例如含有至少一种本发明的干扰素α同系物核酸或多肽或其片断，细胞，载体等的组合物)或组分(本发明的干扰素α同系物核酸或多肽或其片断，细胞，载体等)；(4)放置一种或多种本发明的物品，包括所述组分或组合物的容器；和(5)包装材料。
另一方面，本发明提供了本文所述的任何仪器，仪器组件，组合物或试剂盒用于实施本文所述的任何方法或试验的用途，和/或任何仪器或试剂盒用于实施本文所述的任何试验或方法的用途。
实施例 实施例1：制备和筛选经改组的干扰素-α文库
通过PCR扩增和DNA酶处理制备约20个人干扰素-α亚类基因的片断(长度为25-60个碱基对(bp))，基本上按Crameri A等(1998；Nature15：288-291)所述进行重组，以产生经改组的干扰素-α成熟编码序列。通过将经改组的干扰素-α成熟编码序列亚克隆至大肠杆菌分泌载体来制备表达文库。经改组的干扰素多肽被表达成在C末端与E标记(Amersham-Pharmacia)融合的成熟蛋白质，以便于定量和从周质间隙中纯化。使用机器化菌落挑选仪(Q-Bot，Genetix Pharmaceuticals)将大肠杆菌转化子挑选至微滴板中，并制备周质提取物。
按Scarozza，A.M.等(1992)J.Interferon Res.12：35-42所述，检测周质提取物对人Daudi细胞系的抗增殖活性。
对在Daudi试验中表现出抗增殖活性的克隆进行再筛选，并通过使用抗-E标记抗体(Amersham-Pharmacia)经Western印迹测定表达水平。选择已针对表达水平标准化的最高活性的克隆进行测序，并按上文所述，将该克隆用作其它轮改组和筛选的底物。
将得自第一和第二轮改组，并在Daudi试验中具有相对较高的抗增殖活性的克隆亚克隆至CHO表达载体(pDEI-1011)，其中E-标记/6-His标记(Amersham-Pharmacia)与经改组的干扰素的C末端融合。将克隆转染至CHO细胞，用1mg/ml G418选择稳定的细胞系。在抗-E标记Sepharose柱(Amersham-Pharmacia)上纯化CHO-表达的成熟干扰素，并通过Bradford试验(Biorad)进行定量。通过Daudi试验分析CHO-纯化的经改组干扰素的抗增殖活性，按下文所述，使用人WISH细胞/EMCV试验分析抗病毒活性。人WISH细胞/EMCV抗病毒试验
在96孔培养板中的100μl添加有10％胎牛血清，青霉素(100μg/ml)和链霉素(100μg/ml)的RPMI培养基(Gibco-BRL)中，以6×104个细胞/孔的密度接种WISH细胞，于37℃保温24小时。在孔中加入含干扰素-α多肽样品的培养基(总体积为100μl)，于37℃在5％CO2的气氛中保温3小时。在孔中加入体积为50μl的EMCV(脑心肌炎病毒)稀释液，按上述保温24小时。小心除去培养基，用温磷酸缓冲盐水(PBS)将孔冲洗2次。在孔中加入中性红(用培养基按1∶50稀释，100μl/孔)，按上述保温2小时。加入戊二醛(0.5％的PBS溶液，50μl/孔)，按上述保温30分钟。用PBS将孔冲洗2次，加入100μl/孔50％甲醇，1％乙酸的溶液。使用微滴板读数器测定540纳米(nm)处的光吸收值。
图2显示了与干扰素-α2a和干扰素-αCon1相比较而言的，本发明例举的干扰素同系物的抗增殖活性和抗病毒活性。图中显示了一套例举的干扰素α同系物的每毫克同系物的活性单位数(Y轴)，其中每个同系物样品在X轴上都有一个名称。实施例2：体外癌细胞系筛选
使用体外癌细胞系筛选(描述于例如Monks，A.等(1991)J.Nat′l CancerInst.83：757-766(下文称之为″Monks″)和http：//dtp.nci.gov./branches/btb/ivclsp.html，皆全文列入本文作为参考)分析本发明的干扰素-α同系物对特定癌细胞系的选择性生长抑制和/或细胞杀伤作用。所用60种癌细胞系(表3)包括白血病，黑素瘤，和肺癌，结肠癌，脑癌，卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌，中枢神经系统癌，肾系统癌和肾癌。根据″Monks″和http：//dtp.nci.gov./branches/btb/ivclsp.html中所述的方法培养人肿瘤细胞系。
被筛选的人癌细胞系
癌症类型 细胞系
白血病 CCRF-CEM，HL-60(TB)，K-562，MOLT-4，PRMI-8226，SR
结肠癌 COLO205，HCC-2998，HCT-15，HCT-116，HT29，KM12，SW-620
CNS癌 SF-268，SF-295，SF-539，SNB-19，SNB-75，U251
肺癌 A549/ATCC，EKVX，HOP-62，HOP-92，NCI-H23，NCI-H226，NCI-H322M，NCI-H460，NCI-H522
乳腺癌 MCF-7，NCI/ADR HS578T，MDA-MB-231/ATCC，MDA-MB-435，MDA-N，BT-549，T-47D
黑素瘤 LOX IMVI，M14，MALME-3M，SK-MEL-2，SK-MEL-5，SK-MEL28，UACC-62，UACC-257
卵巢癌 IGROV1，OVCAR-3，OVCAR-4，OVCAR-5，OVCAR-8，SK-OV-3
前列腺癌 DU-145，PC-3
肾癌 786-0，A498，ACHN，CAKI-1，RXF393，SN12C，TK-10，UO-31
简单地说，根据特定细胞系的生长特性，将细胞以约5000至约40000个细胞/孔的密度接种于96孔微滴板。接种之后，于37℃将微滴板保温24小时，然后加入受试样品(例如本发明的干扰素同系物或对照干扰素)。24小时之后，用三氯醋酸(TCA)原位固定每种细胞系的两个平板，以测定在添加受试样品时(T0)每种细胞系的细胞群体。在剩下的培养板中，加入经5次10倍连续稀释，浓度为10-0.8至10-4.8μg/ml(由CHO细胞上清液亲和纯化的)的干扰素样品。
加入样品之后，将培养板再保温6天。通过加入TCA终止试验。
通过在定量蛋白质染料结合试验中测定细胞蛋白质来测定细胞群体。在每个孔中加入含0.4％(w/v)硫代罗丹明(sulforhodamine)B的1％乙酸溶液(100μl)，接着在室温下保温10分钟。通过用1％乙酸洗5次以除去未结合的染料，并使培养板风干。用10毫摩尔(mM)Tris溶解与蛋白质结合的染料，在自动化的培养板读数器上读出515纳米(nm)处的光吸收值。
每个剂量-反应试验取7份光吸收值测定结果，它们对应于：加入样品前(时间为0；T0)的细胞蛋白质量，在缺乏受试样品的条件下于保温期结束时细胞蛋白质的量(对照生长，C)，和5份对应于在存在5种浓度的干扰素受试样品时，在保温期结束时细胞蛋白质量的测定结果(检测存在5个浓度水平的干扰素受试样品时的生长，Ti)。使用这些测定结果计算出每种受试样品的下列3个参数：
GI50，或“50％生长抑制”是使细胞生长50％受抑制所需的干扰素受试样品的浓度，该值是通过在保温期结束时，干扰素受试样品中净蛋白质/多肽的增加相对于对照细胞(不含受试样品)中的而言减少50％来测定的。GI50被计算为受试样品的浓度，其中[(Ti-To)/(C-To)]x100＝50。见图3A。
TGI，或“总生长抑制”是使细胞生长全面受抑制所需的干扰素受试样品的浓度，其中保温期结束时的细胞蛋白质的量等于保温期开始时的细胞蛋白质的量。产生总生长抑制(TGI)的干扰素受试样品的浓度被计算为受试样品的浓度，其中Ti＝To。
LC50是与保温期开始时所观察到的细胞蛋白质量相比，在保温结束时，测定的细胞蛋白质的量降低50％时干扰素受试样品的浓度，它显示了在加入干扰素受试样品之后细胞的净损失。LC50被计算为受试样品的浓度，其中[(Ti-To)/To]×100＝-50。
如果对于特定的受试样品而言，在受试的浓度范围内未达到效果或者效果非常好，所述参数的值被表示为大于或小于受试的最大或最小浓度。实施例3：IFN-α同系物的体外活性与体内效力相关联
改组人干扰素-α基因片断，并按Chang等(1999)Nature Biotechnol.17：793-797所述，在基于鼠细胞的抗病毒试验中筛选活性。分离出比人干扰素-α2a针对小鼠细胞的抗病毒活性高105倍的干扰素-α同系物。多种干扰素-α同系物的抗病毒活性甚至显著超过天然小鼠干扰素，包括Mu-IFN-α4(Chang等，文献同上)的抗病毒活性。对人干扰素-α基因片断进行回归序列重组(例如DNA改组)以产生新的干扰素α同系物，随后针对鼠干扰素受体筛选这种同系物，结果可鉴定并分离出活性优于与其密切相关的鼠类的干扰素-α同系物。
在小鼠中进行剂量-反应研究以测定在体外观察到的高抗病毒活性是否也能在体内维持。在此研究中使用了两种在本文中被称为CH2.2和CH2.3(分别为SEQ ID NO：84和85)的小鼠-最优化干扰素-α同系物。CH2.2和CH2.3在体外小鼠细胞抗病毒试验中，相对于人干扰素-α2a而言，分别具有约高138,000-倍和206,000-倍的活性，相对于天然小鼠干扰素-α4而言，具有约高2.5倍和约高1.6倍的活性(Chang等，文献同上)。
几组Balb/c小鼠连续4天，以每天为2，10或50μg(总体积为50μl)的皮下剂量接受磷酸缓冲盐水(PBS)，干扰素-α同系物CH2.2，干扰素-α同系物CH2.3，鼠IFN-α4或人干扰素-α2a。在第2天，将小鼠暴露于致死鼻内剂量(10倍于LC50)的水泡性口炎病毒(VSV)中。数据被表示为能活到第21天的小鼠数目。
图5显示了在保护小鼠免受VSV感染方面，与天然小鼠干扰素Mu-IFN-α4相比，小鼠-最优化干扰素-α同系物CH2.2和CH2.3同样有效或更加有效。在保护小鼠免受病毒感染方面，受试浓度的人IFN-α2a几乎完全无效。因此，本发明的干扰素-α同系物的体内效力与在体外试验中观察到的抗病毒活性的相关性较明显。
尽管为了阐明和理解的目的，已经较详细地描述了上述发明，但本领域技术人员通过阅读此内容可以清楚地知道：对形式和细节的多种改变并不背离本发明真正的范围。例如，可以以多种组合方式使用上文所述的所有技术，方法，组合物，仪器和系统。为了所有的目的，本申请中提及的所有出版物，专利，专利申请或其它文件都全文列入本文作为参考，就象每个单独的出版物，专利，专利申请或其它文件为了所有目的被单独地提到需列入本文作为参考一样。
                                      序列
序列编号  克隆编号  序列
SEQ ID NO：1  2DH12  TGTGATCTGCCTCAGACCCACAGCCTTGGCAACAGGAGGGCCTTGATGCTCCTGGCACAAATGGGACGAATCTCTCCTTTCTCCTGCCTGAAGGACAGACAAGACTTTGGATTCCCCCAGGAGGAGTTTGATGGCAACCAGTTCCAGAAGGCTCAAGCCATCTCTGTCCTCCATGAGATGATCCAGCAGACCTTCAATCTCTTCAGCACAAAGGATTCATCTGCTGCTTGGGAACAGACCCTCCTAGAAAAATTTTCCACTGAACTCTACCAGCAGCTGAATGACCTGGAAGCCTGCGTGATACAGGAGGTAGGGGTGAAAGAGACTCCCCTGATGAATGTGGACTCCATCCTGGCTGTGAGGAAGTACTTCCAAAGAATCACTCTTTATCTAATAGAGAGGAAATACAGCCCTTGTGCATGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTCTCTTTTTCAACAAACTTGCAAAAAAGATTAAGGAGGAAGGAA
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 CTCCTAGAAAAATTTTCCACTGAACTTTACCAGCAACTGAATAACCTGGAAGCATGTGTGATACAGGAGGTTGGGATGGAAGAGACTCCCCTGATGAATGTGGACTCCATCCTGGCTGTGAGGAAGTACTTCCAAAGAATCACTCTTTATCTAATAGAGAGGAAATACAGCCCTTGTGCCTGGGAGGTTGTCAGAGCAGAAATCATGAGATCTTTCTCTTTTTCAACAAACTTGCAAAAAAGATTAAGGAGGAAGGAA
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                       序列表<110>沃尔克，海因里希斯(HEINRICHS，VOLKER)特迪，陈(CHEN，TEDDY)菲利普，A，帕滕(PATTEN，PHILLIP A.)<120>IFN-α同系物<130>02-101510/0140.002<140><141><150>09/415,183<151>1999-10-07<160>88<170>PatentIn Ver.2.0<211>498<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的DNA<220><223>克隆编号2DH12<400>1tgtgatctgc ctcagaccca cagccttggc aacaggaggg ccttgatgct cctggcacaa  60atgggacgaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac aagactttgg attcccccag  120gaggagtttg atggcaacca gttccagaag gctcaagcca tctctgtcct ccatgagatg  180atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aaggattcat ctgctgcttg ggaacagacc  240ctcctagaaa aattttccac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgcgtg  300atacaggagg taggggtgaa agagactccc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg  360aggaagtact tccaaagaat cactctttat ctaatagaga ggaaatacag cccttgtgca  420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa  480agattaagga ggaaggaa                                                498<210>2<211>498<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的DNA<220><223>克隆编号2CA3<400>2tgtgatctgc ctcagaccca cagccttggt gacaggaggg ccatgatact cctggcacaa  60atgggacgaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagat atgatttcgg attcccccag  120gaggagtttg atggcaacca gttccagaag gctcaagcca tctctgtcct ccatgagatg  180atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aaggattcat ctgctgcttg ggaacagagc  240ctcctagaaa aattttccac tgaactttac cagcagctga atgaactgga agcatgtgtg  300atacaggagg ttggggtggg agagactccc ctgatgaatg gggactccat cctggctgtg  360aagaagtact tccaaagaat cactctttat ctaatagaga ggaaatacag cccttgtgca  420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa  480agattaagga ggaaggaa                                                498<210>3<211>498<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的DNA<220><223>克隆编号4AB9<400>3tgtgatctgc ctcagaccca cagccttggc aacaggaggg ccttgatact cctggcacaa  60atgggacgaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgactttgg attcccccgg  120gaggagtttg atggcaacca gttccagaag gctcaagcca tctctgtcct ccatgagatg  180atgcagcaga ccttcaatct cttcagcaca aagaactcat ctgctgcttg ggatgagacc  240ctcctagaaa aattttccac tgaactttac cagcaactga atgaactgga agcatgtgtg  300atacaggagg ttggggtgga agagactccc ctgatgaatg aggactccat cctggctgtg  360aagaaatact tccaaagaat cactctttat ctgacagaga agaagtatag cccttgttcc  420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa  480agattaagga ggaaggaa                                                498<210>4<211>498<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的DNA<220><223>克隆编号2DA4<400>4tgtgatctgc ctcagaccca cagccttggt aacaggaggg ccttgatgct cctggcacaa  60atgggaagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac aagactttgg attcccccag  120gaggagtttg atagcaacca gttccagaag gctcaagcca tctctgtcct ccatgagatg  180atgcagcaga ccttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc  240ctcctagaaa aattttccac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgcgtg  300atacaggagg ttggggtgga agagaccccc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg  360aggaagtact tccaaagaat cactctttat ctaatagaga ggaaatacag cccttgtgca  420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa  480agattaagga ggaaggaa                                                498<210>5<211>498<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的DNA<220><223>克隆编号3DA11<400>5tgtgatctgc ctcagaccca cagccttggt aacaggaggg ccttggtact cctggcacaa  60atgggaagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagat atgatttcgg attcccccag  120gaggagtttg atggcaacca gttccagaag gctcaagcca tctctgtcct ccatgagatg  180atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aaggattcat ctgctgcttg ggatgagacc  240ctcctagaaa aattttccac tgaactttac cagcagctga atgacctgga agcctgcgtg  300atacaggagg ttggggtgga agagaccccc ctgatgaatg aggactccat cctggctgtg  360aagaaatact tccaaagaat cactctttat ctaatagaga ggaaatacag cccttgtgca  420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa  480agattaagga ggaaggaa                                                498<210>6<211>498<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的DNA<220><223>克隆编号2DB11<400>6tgtgatctgc ctcagaccca cagccttggt aacaggaggg ccttgatgct cctggcacaa  60atgggaagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagat atgatttcgg attcccccag  120gaggagtttg atggcaacca gttccagaag gctcaagcca tctctgtcct ccatgagatg  180atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aaggattcat ctgctgcttg ggatgagacc  240ctcctagaaa aattttccac tgaactttac cagcagctga atgacttgga agcctgtgtg  300atacaggagg ttggggtgga agagactccc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg  360aggaagtact tccaaagaat cactctttat ctaatagaga ggaaatacag cccttgtgca  420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa  480agattaagga ggaaggaa                                                498<210>7<211>498<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的DNA<220><223>克隆编号2CA5<400>7tgtgatctgc ctcagaccca cagccttggt aacaggaggg ccttgatact cctggcacaa  60atgggacgaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac aagactttgg attcccccag  120gaggagtttg atggcaaccg gttccagaag gctcaagcca tctctgtcct ccatgagatg  180atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aagaactcat ctgctgcttg ggaacagagc  240ctcctagaaa aattttccac tgaactctac cagcagctga atgacctgga agcctgcgtg  300atacaggagg ttggggtgga agagaccccc ctgatgaatg aggactccat cctggctgtg  360aagaaatact tccaaagaat cactctttat ctaatagaga ggaaatac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             498<210>36<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号2DH12<400>36Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Met1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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     35                  40                  45Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
 50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Thr65                  70                  75                  80Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
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            165<210>37<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号2CA3<400>37Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asp Arg Arg Ala Met Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
         20                  25                  30Arg Tyr Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
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 50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser65                  70                  75                  80Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Glu Leu
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130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>38<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号4AB9<400>38Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>39<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号2DA4<400>39Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Met1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>40<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号3DA11<400>40Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Val1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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            165<210>41<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号2DB11<400>41Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Met1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>42<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号2CA5<400>42Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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            165<210>43<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号2G6<400>43Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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            165<210>44<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号3AH7<400>44Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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            165<210>45<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号2G5<400>45Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Met1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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             85                  90                  95Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
        100                 105                 110Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
    115                 120                 125Leu Tyr Leu Ile Glu Arg Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>47<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号1F3<400>47Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1               5                  10                  15Leu Leu Gly Gln Met Gly Arg Ile Ser His Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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     35                  40                  45Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
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        100                 105                 110Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
    115                 120                 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>48<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号4BE10<400>48Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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 50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr65                  70                  75                  80Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Glu Leu
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        100                 105                 110Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
    115                 120                 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ser Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>49<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号2DD9<400>49Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Met1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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    115                 120                 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ser Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>50<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号3CA1<400>50Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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 50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asn Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr65                  70                  75                  80Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asn Leu
             85                  90                  95Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Met Glu Glu Thr Pro Leu Met
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130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>51<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号2F8<400>51Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>52<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号6CG3<400>52Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Lys Arg Ala Met Met1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Thr Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>53<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号3CG7<400>53Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Ser Arg Ala Leu Met1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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    115                 120                 125Leu Tyr Leu Ile Glu Arg Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>54<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号1D3<400>54Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser His Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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130                     135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>55<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号2G4<400>55Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Met Met1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Ser Arg Ile Ser Pro Ser Ser Cys Leu Met Asp
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 50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Thr65                  70                  75                  80Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
             85                  90                  95Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met
        100                 105                 110Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
    115                 120                 125Leu Tyr Leu Thr Lys Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ser Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>56<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号1A1<400>56Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser His Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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 50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser65                  70                  75                  80Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu His Gln Gln Leu Asn Asp Leu
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    115                 120                 125Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>57<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号1D10<400>57Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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        100                 105                 110Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
    115                 120                 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>58<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号1F6<400>58Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Thr Leu Met1               5                  10                  15Ile Met Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
         20                  25                  30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
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 50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Glu Gln Ser65                  70                  75                  80Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Asn Gln Gln Leu Asn Asp Leu
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        100                 105                 110Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
    115                 120                 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>59<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号2Al0<400>59Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser His Phe Ser Cys Leu Lys Asp
         20                  25                  30Arg Tyr Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Val Phe Asp Gly Asn Gln Phe
     35                  40                  45Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Ala Phe His Glu Met Ile Gln Gln Thr
 50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Glu Gln Ser65                  70                  75                  80Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asn Leu
             85                  90                  95Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
        100                 105                 110Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Arg Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
    115                 120                 125Leu Tyr Leu Met Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>60<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号2C3<400>60Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
         20                  25                  30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Ser
     35                  40                  45Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
 50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Asp Thr Trp Asp Ala Thr65                  70                  75                  80Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Asn Gln Gln Leu Asn Asp Leu
             85                  90                  95Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
        100                 105                 110Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
    115                 120                 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>61<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号2D1<400>61Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
         20                  25                  30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
     35                  40                  45Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Ala Phe His Glu Met Ile Gln Gln Thr
 50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Ala Trp Glu Gln Ser65                  70                  75                  80Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asn Leu
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            165<210>62<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号2D10<400>62Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ilel               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Val Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
         20                  25                  30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
     35                  40                  45Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Ala Phe His Glu Met Ile Gln Gln Thr
 50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Glu Gln Ser65                  70                  75                  80Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asn Leu
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130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>63<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号2D7<400>63Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>64<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号2D9<400>64Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>65<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号2DA2<400>65Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Pro Leu Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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        100                 105                 110Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
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130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>66<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号2DH9<400>66Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Pro Gly Asn Arg Arg Ala Leu Met1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>67<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号2G11<400>67Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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            165<210>68<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号2G12<400>68Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Thr Leu Met1               5                  10                  15Leu Met Ala Gln Met Arg Arg Ile Ser Pro Phe Pro Arg Leu Lys Asp
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            165<210>69<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号2H9<400>69Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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            165<210>70<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号6BC11<400>70Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
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130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>71<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号t19bb<220><221>MOD_RES<222>(11)<223>N或D<220><221>MOD_RES<222>(12)<223>R，S，或K<220><221>MOD_RES<222>(15)<223>L或M<220><221>MOD_RES<222>(16)<223>I，M或V<220><221>MOD_RES<222>(19)<223>A或G<220><221>MOD_RES<222>(22)<223>G或R<220><221>MOD_RES<222>(24)<223>I或T<220><221>MOD_RES<222>(26)<223>P或H<220><221>MOD_RES<222>(34)<223>H，Y或Q<220><221>MOD_RES<222>(38)<223>F或L<220><221>MOD_RES<222>(40)<223>Q或R<220><221>MOD_RES<222>(45)<223>G或S<220><221>MOD_RES<222>(46)<223>N或H<220><221>MOD_RES<222>(47)<223>Q或R<220><221>MOD_RES<222>(50)<223>K或R<220><221>MOD_RES<222>(51)<223>A或T<220><221>MOD_RES<222>(55)<223>S或F<220><221>MOD_RES<222>(56)<223>V或A<220><221>MOD_RES<222>(57)<223>L或F<220><221>MOD_RES<222>(60)<223>M或I<220><221>MOD_RES<222>(61)<223>I或M<220><221>MOD_RES<222>(67)<223>L或F<220><221>MOD_RES<222>(72)<223>D或N<220><221>MOD_RES<222>(75)<223>A或V<220><221>MOD_RES<222>(76)<223>A或T<220><221>MOD_RES<222>(78)<223>E或D<220><221>MOD_RES<222>(79)<223>Q或E<220><221>MOD_RES<222>(80)<223>S，R，T，或N<220><221>MOD_RES<222>(83)<223>E或D<220><221>MOD_RES<222>(85)<223>F或L<220><221>MOD_RES<222>(86)<223>S或Y<220><221>MOD_RES<222>(88)<223>E或G<220><221>MOD_RES<222>(90)<223>Y，H，N<220><221>MOD_RES<222>(95)<223>D，E，或N<220><221>MOD_RES<222>(101)<223>I，M，或V<220><221>MOD_RES<222>(103)<223>E或G<220><220><221>MOD_RES<222>(105)<223>G或W<220><221>MOD_RES<222>(106)<223>V或M<220><221>MOD_RES<222>(107)<223>E，G，或K<220><221>MOD_RES<222>(108)<223>E或G<220><221>MOD_RES<222>(114)<223>V，E，或G<220><221>MOD_RES<222>(116)<223>S或P<220><221>MOD_RES<222>(121)<223>K或R<220><221>MOD_RES<222>(124)<223>F或L<220><221>MOD_RES<222>(132)<223>T，I，或M<220><221>MOD_RES<222>(134)<223>K或R<220><221>MOD_RES<222>(140)<223>A或S<400>71Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Xaa Xaa Arg Ala Xaa Xaa  1               5                  10                  15Leu Leu Xaa Gln Met Xaa Arg Xaa Ser Xaa Phe Ser Cys Leu Lys Asp
         20                  25                  30Arg Xaa Asp Phe Gly Xaa Pro Xaa Glu Glu Phe Asp Xaa Xaa Xaa Phe
     35                  40                  45Gln Xaa Xaa Gln Ala Ile Xaa Xaa Xaa His Glu Xaa Xaa Gln Gln Thr
 50                  55                  60Phe Asn Xaa Phe Ser Thr Lys Xaa Ser Ser Xaa Xaa Trp Xaa Xaa Xaa65                  70                  75                  80Leu Leu Xaa Lys Xaa Xaa Thr Xaa Leu Xaa Gln Gln Leu Asn Xaa Leu
             85                  90                  95Glu Ala Cys Val Xaa Gln Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Pro Leu Met
        100                 105                 110Asn Xaa Asp Xaa Ile Leu Ala Val Xaa Lys Tyr Xaa Gln Arg Ile Thr
    115                 120                 125Leu Tyr Leu Xaa Glu Xaa Lys Tyr Ser Pro Cys Xaa Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>72<211>498<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的DNA<220><223>克隆编号CH1.1<400>72tgtgatctgc ctcagaccca cagccttggt aacaggaggg ccttgatact cctggcacaa  60atgggaagaa tctctccttt ctcctgtctg atggacagac atgactttgg atttccccag  120gaggagtttg atgacaacca gttccagaag gctcaagcca tctctgtcct ccatgagatg  180atccaacaga ccttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctacttg ggatgagaca  240cttctagaca aattctacac tgaactttac cagcagctga atgacctgga agcctgcgtg  300atacaggagg ttggggtgga agagactccc ctgatgaatg aggactccat cttggctgtg  360aagaaatact tccgaagaat cactctctat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc  420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa  480agattaagga ggaaggaa                                                498<210>73<211>498<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的DNA<220><223>克隆编号CH1.2<400>73tgtgatctgc ctcagaccca cagccttggt aacaggaggg ccttgatact cctggcacaa  60atgggaagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgactttgg attcccccag  120gaggagtttg atggcaacca gttccagaag gctcaaggca tctctgtcct ccatgagatg  180atccagcaga ccttccatct cttcagcaca aaggactcat ctgctacttg ggaacagagc  240ctcctagaaa aattttccac tgaacttaac cagcagctga atgacctgga agcctgcgtg  300atacaggagg ttggggtgga agagactccc ctgatgaatg tggactccat cctggctgtg  360aagaaatact tccgaagaat cactctttat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc  420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa  480agattaagga ggaaggaa                                                498<210>74<211>498<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的DNA<220><223>克隆编号CH1.3<400>74tgtgatctgc ctcagaccca cagccttggt aacaggagga ctttgatgat aatggcacaa  60atgggaagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgactttgg atttcctcag  120gaggagtttg atggcaacca gttccagaag gctcaagcca tctctgtcct ceatgagatg  180atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctacttg ggatgagaca  240cttctagaca aattctacac tgaactttac cagcagctga atgacctgga agcctgtatg  300atgcaggagg ttggagtgga agacactcct ctgatgaatg tggactctat cctgactgtg  360agaaaatact ttcgaagaat cactctttat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc  420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa  480agattaagga ggaaggaa                                                498<210>75<211>498<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的DNA<220><223>克隆编号CH1.4<400>75tgtgatctgc ctcagaccca cagcctgggt aataggaggg ccttgatact cctggcacaa  60atgggaagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgactttgg attcccccag  120gaggagtttg gtggcaacca gttccagaag gctcaagcca tctctgtcct ceatgagatg  180atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca gaggactcat ctgctgcttg ggatgagacc  240ctcctagaca aattctacat tgaacttttc cagcaactga atgacctgga agcctgtgtg  300atgcaggagg agagggtggg agaaactccc ctgatgaatg cggactccat cttggctgtg  360aagaaatact tccaaagaat cactctttat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc  420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa  480agattaagga ggaaggaa                                                498<210>76<211>498<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的DNA<220><223>克隆编号CH2.1tgtgatctgc ctcagaccca cagccttggt aacaggagga ctttgatgat aatggcacaa  60atgggaagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgactttgg atttcctcag  120gaggagtttg atggcaacca gttccagaag gctcaagcca tctctgtcct ccatgagatg  180atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aaggacteat ctgctacttg ggatgagaca  240cttctagaca aattctacac tgaactttac cagcagctga atgacctgga agcctgtatg  300atacaggagg ttggggtgga agagactccc ctgatgaatg aggactccat cttggctgtg  360aagaaatact tccgaagaat GaGtctctat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc  420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa  480agattaagga ggaaggaa                                                498<210>77<211>498<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的DNA<220><223>克隆编号CH2.2<400>77tgtgatctgc ctcagaccca cagccttggt aacaggaggg ccttgatact cctggcacaa  60atgggaagaa tctctccttt ctcctgtctg atggacagac atgactttgg atttccccag  120gaggagtttg atgacaacca gttccagaag gctcaagcca tctctgtcct ccatgagatg  180atccaacaga ccttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctacttg ggatgagaca  240cttctagaca aattctacac tgaactttac cagcagctga atgacctgga agcctgtatg  300atgcaggagg ttggagtgga agacactcct ctgatgaatg tggactctat cctgactgtg  360aagaaatact tccgaagaat cactctttat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc  420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tttcaacaaa cttgcaaaaa  480agattaagga ggaaggaa                                                498<210>78<211>498<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的DNA<220><223>克隆编号CH2.3<400>78tgtgatctgc ctcagaccca cagccttggt aacaggagga ctttgatgat aatggcacaa  60atgggaagaa tctctccttt ctcctgcctg aaggacagac atgactttgg atttcctcag  120gaggagtttg atggcaacca gttccagaag gctcaagcca tctctgtcct ceatgagatg  180atccagcaga ccttcaatct cttcagcaca aaggactcat ctgctacttg ggatgagaca  240cttctagaca aattctacac tgaactttac cagcagctga atgacctgga agcctgtatg  300atgcaggagg ttggagtgga agacactcct ctgatgaatg aggactceat cttggctgtg  360aagaaatact tccgaagaat cactctctat ctgacagaga agaaatacag cccttgtgcc  420tgggaggttg tcagagcaga aatcatgaga tctttctctt tctcaacaaa cttgcaaaaa  480agattaagga ggaaggaa                                                498<210>79<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号CH1.1<400>79Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Met Asp
         20                  25                  30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Asp Asn Gln Phe
     35                  40                  45Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
 50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Asp Glu Thr65                  70                  75                  80Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
             85                  90                  95Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
        100                 105                 110Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
    115                 120                 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>80<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号CH1.2<400>80Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
         20                  25                  30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
     35                  40                  45Gln Lys Ala Gln Gly Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
 50                  55                  60Phe His Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Glu Gln Ser65                  70                  75                  80Leu Leu Glu Lys Phe Ser Thr Glu Leu Asn Gln Gln Leu Asn Asp Leu
             85                  90                  95Glu Ala Cys Val Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
        100                 105                 110Asn Val Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
    115                 120                 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>81<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号CH1.3<400>81Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Thr Leu Met1               5                  10                  15Ile Met Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
         20                  25                  30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
     35                  40                  45Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
 50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Asp Glu Thr65                  70                  75                  80Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
             85                  90                  95Glu Ala Cys Met Met Gln Glu Val Gly Val Glu Asp Thr Pro Leu Met
        100                 105                 110Asn Val Asp Ser Ile Leu Thr Val Arg Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
    115                 120                 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>82<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号CH1.4<400>82Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
         20                  25                  30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Gly Gly Asn Gln Phe
     35                  40                  45Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
 50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Glu Asp Ser Ser Ala Ala Trp Asp Glu Thr65                  70                  75                  80Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Ile Glu Leu Phe Gln Gln Leu Asn Asp Leu
             85                  90                  95Glu Ala Cys Val Met Gln Glu Glu Arg Val Gly Glu Thr Pro Leu Met
        100                 105                 110Asn Ala Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Gln Arg Ile Thr
    115                 120                 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>83<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号CH2.1<400>83Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Thr Leu Met1               5                  10                  15Ile Met Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
         20                  25                  30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
     35                  40                  45Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
 50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Asp Glu Thr65                  70                  75                  80Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
             85                  90                  95Glu Ala Cys Met Ile Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
        100                 105                 110Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
    115                 120                 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>84<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号CH2.2<400>84Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Ala Leu Ile1               5                  10                  15Leu Leu Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Met Asp
         20                  25                  30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Asp Asn Gln Phe
     35                  40                  45Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
 50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Asp Glu Thr 65                  70                  75                  80Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
             85                  90                  95Glu Ala Cys Met Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
        100                 105                 110Asn Val Asp Ser Ile Leu Thr Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
    115                 120                 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>85<211>166<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<220><223>克隆编号CH2.3<400>85Cys Asp Leu Pro Gln Thr His Ser Leu Gly Asn Arg Arg Thr Leu Met1               5                  10                  15Ile Met Ala Gln Met Gly Arg Ile Ser Pro Phe Ser Cys Leu Lys Asp
         20                  25                  30Arg His Asp Phe Gly Phe Pro Gln Glu Glu Phe Asp Gly Asn Gln Phe
     35                  40                  45Gln Lys Ala Gln Ala Ile Ser Val Leu His Glu Met Ile Gln Gln Thr
 50                  55                  60Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser Ser Ala Thr Trp Asp Glu Thr65                  70                  75                  80Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr Gln Gln Leu Asn Asp Leu
             85                  90                  95Glu Ala Cys Met Met Gln Glu Val Gly Val Glu Glu Thr Pro Leu Met
        100                 105                 110Asn Glu Asp Ser Ile Leu Ala Val Lys Lys Tyr Phe Arg Arg Ile Thr
    115                 120                 125Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp Glu Val Val
130                 135                 140Arg Ala Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr Asn Leu Gln Lys145                 150                 155                 160Arg Leu Arg Arg Lys Glu
            165<210>86<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的DNA<400>86tgcgacttac cacaa                                                    15<210>87<211>26<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<400>87Trp Glu Val Val Arg Ser Glu Ile Met Arg Ser Phe Ser Tyr Ser Thr1               5                  10                  15Asn Leu Gln Arg Arg Leu Arg Arg Lys Asp
         20                  25<210>88<211>26<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：合成的氨基酸<223>人工序列的描述：合成的氨基酸<400>88Trp Glu Leu Val Arg Ala Glu Ile Val Arg Ser Phe Ser Phe Ser Thr1               5                  10                  15Asn Leu Asn Lys Arg Leu Arg Lys Lys Glu
         20                  25

Claims (123)

1.分离或重组的核酸，其含有选自下列的多核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：35，或其互补多核苷酸序列；
(b)编码选自SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：70的多肽的多核苷酸序列，或其互补多核苷酸序列；
(c)在高度严紧的杂交条件下，与基本上全长的多核苷酸序列(a)或(b)杂交的多核苷酸序列；和
(d)含有(a)，(b)或(c)的片段的多核苷酸序列，所述片段编码在基于人Daudi细胞系的试验中具有抗增殖活性的多肽。
2.分离或重组的核酸，其含有选自下列的多核苷酸序列：
(a)SEQ ID NO：72至SEQ ID NO：78，或其互补多核苷酸序列；
(b)编码选自SEQ ID NO：79至SEQ ID NO：85的多肽的多核苷酸序列，或其互补多核苷酸序列；
(c)在高度严紧的杂交条件下，与基本上全长的多核苷酸序列(a)或(b)杂交的多核苷酸序列；和
(d)含有(a)，(b)或(c)之片段的多核苷酸序列，所述片段编码在基于鼠细胞系/EMCV的试验中具有抗病毒活性的多肽。
3.分离或重组的核酸，其含有编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽含有以下氨基酸序列：CDLPQTHSLG-X11-X12-RA-X15-X16-LL-X19-QM-X22-R-X24-S-X26-FSCLKDR-X34-DFG-X38-P-X40-EEFD-X45-X46-X47-FQ-X50-X51-QAI-X55-X56-X57-HE-X60-X61-QTFN-X67-FSTK-X72-SS-X75-X76-W-X78-X79-X80-LL-X83-K-X85-X86-T-X88-L-X90-QQLN-X95-LEACV-X101-Q-X103-V-X105-X106-X107-X108-TPLMN-X114-D-X116-ILAV-X121-KY-X124-QRITLYL-X132-E-X134-KYSPC-X140-WEVVRAEIMRSFSFSTNLQKRLRRKE，或其保守取代的变体，其中X11是N或D；X12是R，S或K；X15是L或M；X16是I，M或V；X19是A或G；X22是G或R；X24是I或T；X26是P或H；X34是H，Y或Q；X38是F或L；X40是Q或R；X45是G或S；X46是N或H；X47是Q或R；X50是K或R；X51是A或T；X55是S或F；X56是V或A；X57是L或F；X60是M或I；X61是I或M；X67是L或F；X72是D或N；X75是A或V；X76是A或T；X78是E或D；X79是Q或E；X80是S，R，T或N；X83是E或D；X85是F或L；X86是S或Y；X88是E或G；X90是Y，H，N；X95是D，E或N；X101是I，M或V；X103是E或G；X105是G或W；X106是V或M；X107是E，G或K；X108是E或G；X114是V，E或G；X116是S或P；X121是K或R；X124是F或L；X132是T，I或M；X134是K或R；和X140是A或S。
4.权利要求3的核酸，所述多肽在基于人Daudi细胞系的细胞增殖试验中具有抗增殖活性，或在基于人WISH细胞/EMCV的试验中具有抗病毒活性。
5.权利要求3的核酸，其中所编码的多肽在基于人Daudi细胞系的试验中具有至少约为8.3×106个单位/mg的抗增殖活性，或在基于人WISH细胞/EMCV的试验中具有至少约为2.1×107个单位/mg的抗病毒活性。
6.权利要求3的核酸，其中所编码的多肽含有选自SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：54的氨基酸序列。
7.权利要求3的核酸，所述核酸含有选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：19的多核苷酸序列。
8.分离或重组的核酸，其含有编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽含有的氨基酸中含有：SEQ ID NO：36-70中任一个的至少20个连续的氨基酸，和Ala19，(Tyr或Gln)34，Gly37，Phe38，Lys71，Ala76，Tyr90，Ile132，Arg134，Phe152，Lys160和Glu166中的一个或多个氨基酸，其中氨基酸的编号对应于SEQ ID NO：36中的编号。
9.权利要求8的核酸，其中所编码多肽的长度为166个氨基酸。
10.权利要求8的核酸，其中所编码的多肽在基于人Daudi细胞系的试验中具有抗增殖活性。
11.权利要求8的核酸，其中所编码的多肽在基于人WISH细胞/EMCV的试验中具有抗病毒活性。
12.权利要求8的核酸，其中所编码的多肽含有氨基酸Ala19，(Tyr或Gln)34，Gly37，Phe38，Lys71，Ala76，Tyr90，Ile132，Arg134，Phe152，Lys160和Glu166。
13.权利要求8的核酸，其中所编码的多肽含有SEQ ID NO：36-70中任一个的至少50个连续的氨基酸残基。
14.权利要求8的核酸，其中所编码的多肽含有SEQ ID NO：36-70中任一个的至少100个连续的氨基酸残基。
15.权利要求8的核酸，其中所编码的多肽含有SEQ ID NO：36-70中任一个的至少150个连续的氨基酸残基。
16.权利要求8的核酸，其中所编码的多肽含有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：36，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46。
17.权利要求8的核酸，其含有选自下列的多核苷酸序列：SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQID NO：7，SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11。
18.分离或重组的核酸，其含有编码多肽的多核苷酸序列，所述多肽含有：SEQ ID NO：36-70中任一个的至少155个连续的氨基酸，所述氨基酸序列含有氨基酸Lys160和Glu166，其中氨基酸的编号对应于SEQ ID NO：36中的编号。
19.权利要求18的核酸，其中所编码的多肽含有选自下列的氨基酸序列：SEQ ID NO：36，SEQ ID N0：37，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46。
20.含有权利要求1，2，8或18的核酸的细胞。
21.权利要求20的细胞，其中所述细胞表达由所述核酸编码的多肽。
22.含有权利要求1，2，8或18的核酸的载体。
23.权利要求20的载体，其中所述载体包括质粒，粘粒，噬菌体或病毒。
24.权利要求22的载体，其中所述载体是表达载体。
25.被权利要求22的载体转导的细胞。
26.含有权利要求1，2，8或18的核酸和赋形剂的组合物。
27.权利要求26的组合物，其中赋形剂是药物可接受的赋形剂。
28.通过用限制性内切核酸酶，RNA酶或DNA酶消化权利要求1，2，3，8或18的一种或多种核酸而产生的组合物。
29.通过以下方法产生的组合物，所述方法包括在脱氧核糖核苷酸三磷酸和核酸聚合酶的存在下保温权利要求1，2，3，8或18的一种或多种核酸。
30.权利要求29的组合物，其中核酸聚合酶是热稳定性的聚合酶。
31.分离或重组的多肽，所述多肽由权利要求1，2，3，8或18的核酸编码。
32.权利要求31的分离或重组的多肽，其含有选自SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：79至SEQ ID NO：85的序列。
33.权利要求31的多肽，它在基于人Daudi细胞系的试验中具有至少约为8.3×106个单位/mg的抗增殖活性，或在基于人WISH细胞/EMCV的试验中具有至少约为2.1×107个单位/mg的抗病毒活性。
34.分离或重组的多肽，其含有以下氨基酸序列：CDLPQTHSLG-X11-X12-RA-X15-X16-LL-X19-QM-X22-R-X24-S-X26-FSCLKDR-X34-DFG-X38-P-X40-EEFD-X45-X46-X47-FQ-X50-X51-QAI-X55-X56-X57-HE-X60-X61-QTFN-X67-FSTK-X72-SS-X75-X76-W-X78-X79-X80-LL-X83-K-X85-X86-T-X88-L-X90-QQLN-X95-LEACV-X101-Q-X103-V-X105-X106-X107-X108-TPLMN-X114-D-X116-ILAV-X121-KY-X124-QRITLYL-X132-E-X134-KYSPC-X140-WEVVRAEIMRSFSFSTNLQKRLRRKE，或其保守取代的变体，其中X11是N或D；X12是R，S或K；X15是L或M；X16是I，M或V；X19是A或G；X22是G或R；X24是I或T；X26是P或H；X34是H，Y或Q；X38是F或L；X40是Q或R；X45是G或S；X46是N或H；X47是Q或R；X50是K或R；X51是A或T；X55是S或F；X56是V或A；X57是L或F；X60是M或I；X61是I或M；X67是L或F；X72是D或N；X75是A或V；X76是A或T；X78是E或D；X79是Q或E；X80是S，R，T或N；X83是E或D；X85是F或L；X86是S或Y；X88是E或G；X90是Y，H，N；X95是D，E或N；X101是I，M或V；X103是E或G；X105是G或W；X106是V或M；X107是E，G或K；X108是E或G；X114是V，E或G；X116是S或P；X121是K或R；X124是F或L；X132是T，I或M；X134是K或R；和X140是A或S。
35.权利要求34的多肽，它在基于人Daudi细胞系的试验中具有至少约为8.3×106个单位/mg的抗增殖活性，或在基于人WISH细胞/EMCV的试验中具有至少约为2.1×107个单位/mg的抗病毒活性。
36.权利要求34的多肽，其含有选自SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：54的序列。
37.一种多肽，其含有由一种编码多核苷酸序列编码的蛋白质的至少100个连续的氨基酸，其中所述多核苷酸序列选自：
(a)SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：72至SEQ ID NO：78；
(b)编码选自SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：79至SEQID NO：85的第一种多肽的编码多核苷酸序列；和
(c)在高度严紧条件下，与基本上全长的多核苷酸序列(a)或(b)杂交的互补多核苷酸序列。
38.权利要求37的多肽，所述多肽在基于人Daudi细胞系的细胞增殖试验中具有抗增殖活性，或在基于人WISH细胞/EMCV的试验中具有抗病毒活性。
39.权利要求37的多肽，其中所述多肽特异性结合人α-干扰素受体。
40.权利要求37的多肽，其含有所编码蛋白质的至少150个连续的氨基酸。
41.分离或重组的多肽，其包括含SEQ ID NO：36-70中任一个的至少50个连续氨基酸的氨基酸序列，并包括含有以下一个或多个氨基酸：Ala19，(Tyr或Gln)34，Gly37，Phe38，Lys71，Ala76，Tyr90，Ile132，Arg134，Phe152，Lys160和Glu166的氨基酸序列，其中氨基酸的编号对应于SEQ IDNO：36中的编号。
42.权利要求41的多肽，其中所述多肽结合人α-干扰素受体。
43.权利要求41的多肽，所述多肽在基于人Daudi细胞系的细胞增殖试验中具有抗增殖活性，或在基于人WISH细胞/EMCV的试验中具有抗病毒活性。
44.权利要求41的多肽，它在基于人Daudi细胞系的试验中具有至少约为8.3×106个单位/mg的抗增殖活性，或在基于人WISH细胞/EMCV的试验中具有至少约为2.1×107个单位/mg的抗病毒活性。
45.权利要求41的多肽，其中所述多肽的长度为166个氨基酸。
46.权利要求41的多肽，所述多肽含有氨基酸：Ala19，(Tyr或Gln)34，Gly37，Phe38，Lys71，Ala76，Tyr90，Ile132，Arg134，Phe152，Lys160和Glu166，其中所述多肽的氨基酸编号对应于SEQ ID NO：36中的氨基酸编号。
47.权利要求41的多肽，其含有SEQ ID NO：36-70中任一个的至少100个连续的氨基酸残基。
48.权利要求41的多肽，其含有SEQ ID NO：36-70中任一个的至少150个连续的氨基酸残基。
49.权利要求41的多肽，其含有SEQ ID NO：36-70中任一个的至少155个连续的氨基酸残基。
50.权利要求41的多肽，其含有选自下列的氨基酸序列：SEQ IDNO：36，SEQ ID N0：37，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ IDNO：41，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46。
51.分离或重组的多肽，其含有的氨基酸序列中含有：SEQ ID NO：36-70中任一个的至少155个连续的氨基酸，该分离或重组的多肽含有氨基酸Lys160和Glu166，其中氨基酸的编号对应于SEQ ID NO：36中的编号。
52.权利要求51的多肽，其含有选自下列的氨基酸序列：SEQ IDNO：36，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：40，SEQ IDNO：41，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：45和SEQ ID NO：46。
53.权利要求51的多肽，所述多肽在基于人Daudi细胞系的试验中具有至少约为8.3×106个单位/mg的抗增殖活性，或在基于人WISH细胞/EMCV的试验中具有至少约为2.1×107个单位/mg的抗病毒活性。
54.权利要求31，34，37，41或51的多肽，进一步含有分泌/定位序列。
55.权利要求31，34，37，41或51的多肽，进一步含有多肽纯化亚序列。
56.权利要求55的多肽，其中便于纯化的序列选自：表位标记，FLAG标记，多聚组氨酸标记和GST融合物。
57.权利要求31，34，37，41或51的多肽，进一步在N末端含有甲硫氨酸。
58.权利要求31，34，37，41或51的多肽，其含有经修饰的氨基酸。
59.权利要求58的多肽，其中经修饰的氨基酸选自：糖基化氨基酸，PEG化氨基酸，法尼基化氨基酸，乙酰基化氨基酸和生物素化氨基酸。
60.含有权利要求31，34，37，41或51的多肽和赋形剂的组合物。
61.权利要求60的组合物，其中赋形剂是药物可接受的赋形剂。
62.含有权利要求58的多肽和药物可接受的赋形剂的组合物。
63.与抗至少一种抗原的多克隆抗血清特异性结合的多肽，所述至少一种抗原含有SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：79至SEQ IDNO：85中的至少一种氨基酸序列，或其片断，其中用IFN-α多肽减除所述抗血清，所述IFN-α多肽由对应于下列一个或多个GenBank登记号的核酸编码：J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)。
64.通过给哺乳动物施用权利要求31，34，37，41或51的多肽而产生的抗体或抗血清，所述抗体或抗血清特异性地结合至少一种抗原，所述至少一种抗原含有的多肽中含有SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：70以及SEQ IDNO：79至SEQ ID NO：85中的至少一种氨基酸序列，或其片断，其中抗体或抗血清不能特异性地结合由对应于下列一个或多个GenBank登记号的核酸编码的IFN-α多肽：J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)。
65.一种能特异性结合多肽的抗体或抗血清，所述多肽含有选自SEQ IDNO：36至SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：79至SEQ ID NO：85的序列，其中所述抗体或抗血清不能特异性地结合由对应于下列一个或多个GenBank登记号的核酸编码的IFN-α多肽：J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)。
66.生产多肽的方法，所述方法包括：
在细胞群体中导入权利要求1，2，3，8或18的核酸，所述核酸与能有效产生编码多肽的调节序列可操作相连；和
在培养基中培养所述细胞以生产所述多肽。
67.生产多肽的方法，所述方法包括：
在细胞群体中导入含有权利要求1，2，3，8或18的核酸的重组表达载体；和
在适于生产由所述表达载体编码的所述多肽的条件下，在培养基中培养所述细胞。
68.抑制肿瘤细胞群体生长的方法，所述方法包括：
将肿瘤细胞群体与有效量的权利要求31，34，37，41或51的多肽接触，从而抑制所述细胞群体中肿瘤细胞的生长，其中所述有效量足以抑制所述肿瘤细胞群体中肿瘤细胞的生长。
69.权利要求68的方法，其中所述肿瘤细胞选自：人癌细胞，人白血病细胞，人T-淋巴瘤细胞和人黑素瘤细胞。
70.权利要求68的方法，其中所述肿瘤细胞是在培养中。
71.抑制被病毒感染的至少一个细胞内的病毒复制的方法，所述方法包括：
将所述至少一个被感染的细胞与有效量的权利要求31，34，37，41或51的多肽接触，从而抑制所述至少一个感染细胞中的病毒复制，其中所述有效量足以抑制所述至少一个感染细胞内的病毒复制。
72.权利要求71的方法，其中所述病毒是RNA病毒。
73.权利要求72的方法，其中所述病毒是人类免疫缺陷病毒或丙型肝炎病毒。
74.权利要求71的方法，其中所述病毒是DNA病毒。
75.权利要求74的方法，其中所述病毒是乙型肝炎病毒。
76.权利要求71的方法，其中所述细胞是经培养的。
77.治疗患者的自身免疫病的方法，所述方法包括：给患者施用有效量的权利要求31，34，37，41或51的多肽。
78.权利要求77的方法，其中自身免疫病选自多发性硬化，类风湿性关节炎，红斑狼疮和I型糖尿病。
79.治疗通过给受试者施用干扰素-α即可治疗的疾病的方法，所述改良方法包括：给受试者施用有效量的权利要求31，34，37，41或51的多肽。
80.权利要求79的方法，其中通过施用干扰素-α即可治疗的疾病选自硬化，类风湿性关节炎，红斑狼疮和I型糖尿病。
81.制备经修饰的或重组的核酸的方法，所述方法包括：
使权利要求1，2，3，8或18的一种或多种核酸的序列与一种或多种其它核酸的序列回归重组，所述一种或多种其它核酸的每种序列编码干扰素-α或其氨基酸亚序列。
82.权利要求81的方法，其中所述回归重组产生了重组干扰素-α同系物核酸的至少一种文库。
83.由权利要求82的方法产生的核酸文库。
84.含有权利要求83的文库的细胞群体。
85.由权利要求82的方法产生的重组干扰素-α同系物核酸。
86.含有权利要求85的核酸的细胞。
87.权利要求81的方法，其中回归重组在体外进行。
88.权利要求81的方法，其中回归重组在体内或来自体内进行。
89.含有权利要求1，2，3，8或18中的两种或多种核酸的组合物。
90.权利要求89的组合物，其中该组合物含有包括至少10种核酸的文库。
91.生产经修饰或重组的干扰素-α同系物核酸的方法，所述方法包括使权利要求1，2，3，8或18的核酸突变。
92.由权利要求91的方法生产的经修饰或重组的干扰素-α同系物核酸。
93.含有数据库的计算机或计算机可读介质，所述数据库含有序列记录，所述序列记录含有一种或多种对应于选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：85的核酸或蛋白质序列的特征链。
94.集成系统，其含有含数据库的计算机或计算机可读介质，所述数据库中含有一个或多个序列记录，每个所述序列记录含有一种或多种对应于选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：85的核酸或蛋白质序列的特征链，该集成系统还含有用户输入界面，它可以使用户选择性地查看所述一个或多个序列记录。
95.权利要求94的集成系统，其中计算机或计算机可读介质含有比对指令集，可比对特征链与一种或多种其它的，对应于核酸或蛋白质序列的特征链。
96.权利要求95的集成系统，其中指令集含有下列中的一个或多个：局部同源性比较测定，同源性序列比对测定，相似性检索测定和BLAST测定。
97.权利要求95的集成系统，其进一步含有用户可读的输出元件，可以显示通过序列比对指令集产生的比对结果。
98.权利要求94的集成系统，其中计算机或计算机可读介质还含有一种指令集，该指令集能将至少一种核酸序列翻译成氨基酸序列，所述核酸序列含有选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：72至SEQ ID NO：78的序列。
99.权利要求94的集成系统，其中计算机或计算机可读介质还含有一种指令集，该指令集能将至少一种氨基酸序列逆翻译成核酸序列，所述氨基酸序列含有选自SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：79至SEQ IDNO：85的序列。
100.权利要求99的集成系统，其中该指令集可通过将密码子使用指令集或测定序列同一性的指令集应用于受试核酸序列来选择核酸序列。
101.使用计算机系统呈现数据库中储存的多个序列记录的至少一种所固有的信息的方法，每个所述序列记录含有至少一种对应于SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：85的特征链，该方法包括：
确定对应于SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：85中的一种或多种或其亚序列的至少一种特征链的列表；
确定用户在所述列表的至少一种特征链中选择哪一种；和
显示每种选定的特征链，或将每种选定的特征链与一种另外的特征链进行比对。
102.权利要求101的方法，其进一步包括显示每种选定的特征链与另外的特征链的序列比对。
103.权利要求101的方法，其进一步包括显示列表。
104.一种核酸，它在选自SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：35或SEQ IDNO：72至SEQ ID NO：78的核酸中含有独特的亚序列，其中与已知干扰素-α核酸序列的核酸序列或对应于下列任何GenBank登记号的核酸相比，这种独特的亚序列是独一无二的：J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)。
105.一种多肽，它在选自SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：70或SEQ IDNO：79至SEQ ID NO：85的多肽中含有独特的亚序列，与已知干扰素-α多肽序列，或由对应于以下任何GenBank登记号的核酸所编码多肽的序列相比，这种独特的亚序列是独一无二的：J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)。
106.一种靶核酸，它在严紧条件下与独特的编码寡核苷酸杂交，所述寡核苷酸编码选自SEQ ID NO：36至SEQ ID NO：70或SEQ ID NO：79至SEQ IDNO：85的多肽中的独特亚序列，其中与已知干扰素-α多肽序列，或由对应于以下任何GenBank登记号的核酸所编码多肽的序列相比，这种独特的亚序列是独一无二的：J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)。
107.权利要求106的核酸，其中选择严紧条件以使与独特的编码寡核苷酸精确互补的寡核苷酸能与独特的编码寡核苷酸杂交，且其信号噪声比要比精确互补的寡核苷酸与对应于以下任何GenBank号的对照核酸杂交的信号噪声比至少约高5倍：J00210(α-D)，J00207(α-A)，X02958(α-6)，X02956(α-5)，V00533(α-H)，V00542(α-14)，V00545(IFN-1B)，X03125(α-8)，X02957(α-16)，V00540(α-21)，X02955(α-4b)，V00532(α-C)，X02960(α-7)，X02961(α-10假基因)，R0067(Gx-1)，I01614，I01787，I07821，M12350(α-F)，M38289，V00549(α-2a)和I08313(α-Con1)，其中所述靶核酸与所述独特的编码寡核苷酸杂交，且其信号噪声比要比对照核酸与该编码寡核苷酸杂交的信号噪声比至少约高2倍。
108.权利要求1，2，3，8或18中任一项的核酸，其中核酸编码干扰素-α同系物，相对于人干扰素-α2a对癌细胞群体的生长抑制活性而言，所述同系物对所述癌细胞群体的生长抑制活性有所增强。
109.权利要求108的核酸，其中所述癌细胞群体的癌细胞含有选自下列的癌细胞系：白血病细胞系；黑素瘤细胞系；肺癌细胞系；结肠癌细胞系；中枢神经系统(CNS)癌细胞系；卵巢癌细胞系；乳腺癌细胞系；前列腺癌细胞系和肾癌细胞系，生长抑制活性被测定为使癌细胞系的生长50％受抑制所需的干扰素-α同系物的浓度(GI50值)，其中干扰素-α同系物的GI50值比人干扰素-α2a的GI50值低至少2倍。
110.权利要求109的核酸，其中所编码的干扰素-α同系物的GI50值比人干扰素-α2a的GI50值低至少5倍。
111.权利要求107的核酸，其中所编码的干扰素-α同系物的GI50值比人干扰素-α2a的GI50值低至少10倍。
112.权利要求1，2，3，8或18中任一项的核酸，其中所述核酸编码干扰素-α同系物，相对于人干扰素-α2a对癌细胞群体的细胞静止活性而言，所述同系物对所述癌细胞群体的细胞静止活性有所增强。
113.权利要求112的核酸，其中癌细胞含有选自下列的癌细胞系：白血病细胞系；黑素瘤细胞系；肺癌细胞系；结肠癌细胞系；CNS癌细胞系；卵巢癌细胞系；乳腺癌细胞系；前列腺癌细胞系和肾癌细胞系，细胞静止活性被测定为导致细胞系的生长受到完全抑制所需的干扰素-α的浓度(TGI值)，其中干扰素-α同系物的TGI值比人干扰素-α2a的TGI值低至少2倍。
114.权利要求112的核酸，其中所编码的干扰素-α同系物的TGI值比人干扰素-α2a的TGI值低至少5倍。
115.权利要求112的核酸，其中所编码的干扰素-α同系物的TGI值比人干扰素-α2a的TGI值低至少10倍。
116.权利要求1，2，3，8或18中任一项的核酸，其中所述核酸编码干扰素-α同系物，相对于人干扰素-α2a对癌细胞群体的细胞毒活性而言，所述同系物对所述癌细胞群体的细胞毒活性有所增强。
117.权利要求116的核酸，其中癌细胞含有选自下列的癌细胞系：白血病细胞系；黑素瘤细胞系；肺癌细胞系；结肠癌细胞系；中枢神经系统(CNS)癌细胞系；卵巢癌细胞系；乳腺癌细胞系；前列腺癌细胞系和肾癌细胞系，细胞毒活性被测定为：使保温期之后测定的细胞系中细胞蛋白的量减少50％所需的干扰素-α的浓度(LC50值)，其中干扰素-α同系物的LC50值比人干扰素-α2a的LC50值低至少2倍。
118.权利要求116的核酸，其中所编码的干扰素-α同系物的LC50值比人干扰素-α2a的LC50值低至少5倍。
119.权利要求116的核酸，其中所编码的干扰素-α同系物的LC50值比人干扰素-α2a的LC50值低至少10倍。
120.权利要求31，34，37，41或51中任一项的多肽，相对于人干扰素-α2a对癌细胞群体的抑制活性而言，所述多肽对所述癌细胞群体的生长抑制活性有所增强。
121.权利要求120的多肽，其中癌细胞群体含有选自下列的癌细胞系：白血病细胞系；黑素瘤细胞系；肺癌细胞系；结肠癌细胞系；CNS癌细胞系；卵巢癌细胞系；乳腺癌细胞系；前列腺癌细胞系和肾癌细胞系，生长抑制活性被测定为导致细胞系的生长50％受抑制所需的多肽或人干扰素-α2a的浓度(GI50值)，其中多肽的GI50值比人干扰素-α2a的GI50值低至少2倍。
122.由权利要求81的方法产生的核酸。
123.由权利要求81的方法产生的干扰素-α多肽或其氨基酸亚序列。
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