CN1330716A - 控制细菌即发根土壤杆菌中的基因表达,来改进根瘤发育、固氮和植物生物量产生的方法 - Google Patents

Abstract

本发明描述了一种衍生自发根土壤杆菌A4菌株rolA基因的插入序列的启动内含子序列。该序列能在根瘤发育的所有阶段驱动类菌体内的基因表达,以在根瘤发育期内获得感兴趣基因的组成型表达。还描述了所述序列、衍生的载体和重组细菌的用途。

Description

控制细菌即发根土壤杆菌中的基因表达，来改进根瘤发育、固氮和植物生物 量产生的方法

                             描述

本发明涉及使用发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenens)A4菌株的rolA基因的启动内含子(promintron)DNA序列，或其衍生的启动内含子DNA序列，或其它发根土壤杆菌菌株同源基因的启动内含子DNA序列，在重组细菌中转录水平上启动基因表达，并在细菌和/或类菌体内实现例如植物激素的合成。

本发明证明，当丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae)的iaaM基因和根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的tms2基因在启动内含子序列控制下，在根瘤菌中作为双顺反子单元表达时，能改进根瘤形成过程和固氮。启动内含子特别适用于在根瘤发育的所有阶段中，在类菌体中驱动基因表达，以在根瘤发育期中获得感兴趣基因的组成型表达。因此，组成型在此意味着通过根瘤发育各阶段的不同表达模式，在植物细胞携带根瘤菌的根瘤所有部分中实现了基因表达。

本发明来源于以下未公开的证明，即土壤杆菌A4菌株rolA基因的85bp内含子序列能启动原核细胞内的基因表达。因此，该85bp DNA序列称为“启动内含子(promintron)”，表明它在真核细胞中作为内含子(Magrelli，A.等(1994)科学，266，1986-1988)和原核细胞中作为启动子的功能。术语“启动子”指转录起始，即RNA多聚酶结合所必需的核苷酸序列，还包括例如-35和-10盒，或其它调控区。

rolA启动内含子在根瘤菌中的启动子活性能在根瘤中以新颖特殊模式导致基因表达，导致组成型表达。

本发明特别用于：ⅰ)通过产根瘤的植物和/或固氮细菌改变根瘤发育并提高固氮；ⅱ)用遗传学改变的根瘤菌(在此根瘤菌用作包括根瘤菌、中华根瘤菌、固氮根瘤菌和慢生根瘤菌的总称)接种豆科植物，来改进植物生长和加速植物生物量产生。

本发明还涉及DNA构建物，其中所述启动内含子控制DNA序列表达，通过表达导致上述作用。另外，本发明涉及基因工程改造的细菌，它们能改进固氮并因而改进植物生物量产生。另外，可在对根瘤形成过程有不利影响的硝酸盐浓度存在下实现植物中固氮的提高。

在今后的25年中，世界人口将很可能增加两亿，大部分在亚洲和非洲。来自豆科植物的蛋白质实际占了人类总饮食的33％。豆科植物能通过与根瘤菌属(即根瘤菌、中华根瘤菌、固氮根瘤菌、中间根瘤菌(Mesorhizobium)和慢生根瘤菌)的固氮菌共生，来自身供氮。还存在不属于豆科植物的其它植物，也能通过让细菌寄生在固氮根瘤中。不属于豆科，能与固氮根瘤菌相互作用的植物是Parasponia(榆)。另外，弗兰克菌(Frankia)属的放线菌能与八个不同科的植物物种相互作用，并导致根瘤的产生(Pawlowski，K.等，(1998)于：21世纪的生物固氮，C.Elmerich，A.Kondorosi和W.E.Newton编，Kluwer Academic Publisher，pp.199-201)。共生固氮在氮循环中起主要作用。然而，农业利用导致从土壤中大量吸收有机氮，须通过向作物供肥料来补偿。然而施用氮肥引起严重的环境问题，因为它的过量引起水污染。施用氮肥代表了农业成本最重要的部分之一。在过去55年中，全世界氮肥的消费从3TG增加到100TG(1TG＝10¹²g)。为了生产氮肥，全世界每年要烧掉2％-5％的不可更新能源(例如石油和其它形式的燃料)。与使用合成氮肥有关的环境问题是过量硝酸盐渗入地下水。释放的硝酸盐10％以上会变成一氧化氮(一种温室气体，其能量反射量是二氧化碳的180倍)(Hardy，R.M.F.和Eaglesham，A.R.J.(1995)，于：固氮：原理和应用，I.A.Tikhonovich等(编)，pp.619-620)。工业化国家中的许多大城市正面临着饮用水的硝酸盐污染问题，人用水的价格将迅速上升。

因此，本发明代表的根本问题是，需要改进豆科植物和其它根瘤植物的种植，目的是使环境中硝酸盐的释放急剧下降。这些问题的一个解决方法是增加能固定大气中氮的作物种植，或提高其固氮能力。

自生生活(free-living)、结合、和共生固氮微生物的生物固氮作用(BNF)每年将约120,000,000吨大气中的氮转化成氨，提供了氮总需求的40％(Vance，C.P.，第三届欧洲固氮会议，Lunteren，The Netherlands，1998，p.17)；共生固氮是还原氮的主要天然机制(Franssen，H.J.等(1992)，植物分子生物学，19，89-107)。根瘤菌家族的成员(包括固氮根瘤菌)能和主要豆科作物共生，导致形成根瘤。在根瘤细胞中，细菌分化成类菌体。成熟的类菌体固定大气中的氮并通过固氮酶作用将其转化成氨。如此产生的铵盐从根瘤中输出，掺入植物氨基酸，酰脲和含氮碱基中。因此，在根瘤存在下，植物生长不依赖其它氮源。

根瘤发育是受几种因素控制的共生作用的结果。该作用早期需要在两个参与者：植物根和细菌之间交换化学信号。植物根产生化学信号，如类黄酮，它吸引根瘤菌，最重要的是诱导细菌基因(nod基因，和所谓的Nod因子产生有关)的表达。Nod因子是脂寡聚糖，它在根瘤发育早期起关键作用(Denariè，J.，Debellè，F.，和Promè，J-C.(1996)生物化学年鉴，65，503-535)。

虽然已明确了Nod因子在引发根瘤发育中的作用，但还不清楚根瘤发育中植物激素的作用，植物激素是能改变植物生长和发育的植物生长因子。因为植物激素几乎和植物的任何发育和/或生理过程有关，植物激素在根瘤发育中的作用是最合理的。然而，尽管努力对根瘤形成中植物激素作用的总体问题作了阐述，1994年Hirsch和Fang用下面的话总结了该领域中的状况：“重要的问题仍未解答：哪些激素参与根瘤形成，和它们是如何起作用的？”(A.M.Hirsch和Y.Fang，(1994)植物分子生物学，26，5-9)。

在1936年，Thimann(Thimann，K(1936)P.N.A.S.USA，22，511-514)已提出植物生长素在根瘤发育中起作用，而且根瘤含有植物生长素。另外，根据生物试验，Thimann显示根瘤内以植物生长素活性所估计的植物生长素含量比未受感染的根中高。

现在，已明确自生生活的根瘤菌确实含有植物生长素，如吲哚-3-乙酸(IAA)、吲哚-3-乙醇、吲哚-3-醛和吲哚-3-甲醇(Ernstsen，A.等(1987)Planta 171，422-428)。另外，吸引根瘤菌和刺激Nod因子合成的类黄酮(即植物根产生的化学信号)刺激液体培养中生长的根瘤菌的IAA合成(Prinsen，E.等(1991)FEBS Letters，282，53-55)。

虽然这些资料和植物生长素在根瘤发育中的可能作用一致，但Hirsch 1992年报道了“根瘤菌能合成植物激素，但它们的产生植物生长素基因中的突变不阻止根瘤形成，Nod-突变株也能产生激素”(Hirsch，A.M.(1992)新植物学家，122，211-237)。

其它研究着重于对根瘤形成过程的“植物贡献”，如Hirsch，A.M.等(P.N.A.S.USA(1989)86，1244-1248)、Allen，E.K.，O.N.和Newman，A.S.(美国植物学杂志(1953)40，429-435)和Torrey，J.G.(于：“植物和插条中的新根形成”，1986编，Jackson MB，Martinus Nijhoff Publishers，Dordrecht，31-66)，已发现极性植物生长素运输的抑制剂诱导了拟南芥根上的假根瘤。Mathesius等(植物杂志(1998)14，23-34)近来显示植物生长素运输抑制先于根瘤形成。Kijne，J.W.等(第三届欧洲固氮会议，Lunteren，The Netherlands，1998，p24)已显示：ⅰ)IAA的局部增加先于在内皮中细胞分化的诱导和ⅱ)硝酸盐抑制对IAA的反应，而不是其积聚。

其它在根瘤发育中，植物组织产生的植物生长素性植物激素的作用指标来自苜蓿(Medicago varia)的变体，其已明确为植物生长素敏感性，并常含有较高含量的植物生长素，比起不敏感的变体能形成更多的根瘤(Kondorosi，E.等(1993)于：Nester，E.W.和Verma，D.P.S.编.，植物微生物相互作用的分子遗传学进展，pp.143-150)。另外，转入rolB基因的植物更快的形成根瘤，并具有更多的根瘤(Kondorosi等，ibidem)。已知RolB能增加植物生长素敏感性。一些作者认为rolB的作用不影响植物生长素含量，并且是植物生长素IAA的膜受体，而其它人(PCT申请号WO98/28430)认为RolB蛋白是一种β-葡糖苷酶，能使吲哚乙醇-葡糖苷释放植物生长素吲哚乙醇。吲哚乙醇本身被视为植物生长素，它被转化成IAA，植物中的主要植物生长素形式(Sembdner，G.等(1980)于：植物生理学百科全书，第9卷：发育的激素调节.I.植物激素的分子方面，pp.281-444；MacMillan，J.编，Springer，Berlin，Herdelberg，New York；Sandberg，G.，Crozier，A.，Ernstsen，A.(1987)于：植物激素分析的原理和实践，卷2，pp.169-301，Riveier，L.，Crozier，A.编，Academic Press，London)。

本发明着重于与上述问题有关的三个方面：ⅰ)是否可能通过在根瘤菌内表达植物生长素合成基因改变根瘤发育？；ⅱ)根瘤菌基因修饰株形成的根瘤植物将大气中的氮还原成氨的能力是否提高？ⅲ)基因修饰的根瘤菌产生的根瘤植物是否有生长改变，和该改变是否促进植物生物量的产生？

可从植物基因组或细菌基因组中取得编码能改变植物生长素代谢的酶的基因(Spena，A.，Estruch，J.J.和Schell，J.(1992)生物技术目前观点3，159-163)。无论基因和/或编码区的起源如何，必须在正确的启动子(DNA)序列控制下通过对编码区进行定位赋予所述编码区在细菌内，和最重要的，在类菌体内正确的表达特异性。

本发明通过提供一种技术，改进重组细菌，优选根瘤菌属和最优选根瘤菌中的基因表达，来解决该优先领域的这些问题。不难利用该方法来正确控制能提高植物生长素含量的基因表达，结果促进根瘤化和固氮过程。本发明的启动内含子序列能以临时确定的表达方式在类菌体所位于的所有根瘤区带中促进原核表达。另外，该启动内含子驱动生长对数期的基因表达且在自生生活细菌的静止期中被诱导。当要在生长的对数期和静止期和在根瘤类菌体中，促进固氮土壤细菌的基因表达时，所有这些特征都是非常有利的。

特别在本发明的基因构建物中含有rolA基因的启动内含子序列，如SEQ IDNO：1，和丁香假单胞菌萨氏亚种iaaM及根癌土壤杆菌的tms2基因的编码区。这两个编码区已被构建成在rolA启动内含子控制下的双顺反子，该启动内含子的启动子活性在根瘤中以未公开的新颖表达模式发挥作用。该启动内含子和双顺反子单元联合及将其导入根瘤菌中，使本发明的作者得以显示植物生长素影响根瘤的发育和功能。这两个编码区的用途是在根瘤植物细胞中提高IAA的合成和含量，并因而也提高IAA偶联物(总称，指所有和氨基酸或和葡萄糖或其它化学基团共价偶联的IAA形式)的合成和含量。可使用其它土壤杆菌或假单胞菌菌株的iaaM和tms2基因，或使用其它能提高IAA含量的基因来实现相同效果。

由于根瘤菌通常不含有吲哚乙酰胺，也不能将色氨酸转化成吲哚乙酰胺(IAM)，更不能将IAM转化成IAA(Ernstsen等，1987，ibidem)，作者已工程改造了一种生物化学途径，它同时需要两种基因来从色氨酸有效合成IAA。然而，在不含bam基因-一种tms2基因的内源同源物(Sekine，M.，Watanabe，K.和Syono，K.(1989)细菌学杂志171，1718-1724)的那些根瘤菌(如慢生根瘤菌)中，在该启动内含子DNA序列的控制下仅表达iaaM基因这可能已经足够了。tms2的功能同源物还存在于一些高等植物中，如PCT申请WO98/28430所示。

在本发明的另一个实施例中，该启动内含子驱动的DNA序列表达是一种编码吲哚丙酮酸脱羧酶启动内含子。吲哚丙酮酸脱羧酶是IAA合成的吲哚丙酮酸途径中的关键酶，其中IAA是从色氨酸合成的。吲哚丙酮酸转化成IAA是该途径的限速步骤。例如，已从阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)克隆了一种编码合适的吲哚丙酮酸脱羧酶的DNA序列，(见例如Koga等，普通分子遗传学(1991)，226，10-16)。

术语“植物生长素”在本文中指天然存在和合成的有机物质，起植物激素的作用，即它们优选以低浓度，最优选低于10^-6M的浓度促进芽的伸长并抑制根的伸长。优选的，植物生长素对植物发育显示至少一种以下作用：刺激细胞分裂、细胞伸长、和/或细胞膨胀、顶端优势，刺激木质部分化，刺激形成层细胞的细胞伸长和细胞分化作用，刺激侧根和不定根形成，刺激根瘤化、发芽、叶子的偏上性、子房细胞生长、单性结实、雌花形成和叶子长大。更具体的，术语“植物生长素”指吲哚3-乙酸(IAA)，它最有可能在植物细胞中通过吲哚-3-丙酮酸和吲哚-3-乙醛从色氨酸合成，并通过酶催化性氧化而降解。然而，该术语也指其它天然存在的起植物生长素作用的化合物，衍生自吲哚或其它化合物，例如，非吲哚植物生长素或4-(吲哚-3-基)丁酸的天然存在的苯乙酸。另外，该术语指来自植物以外的生物体的化合物，或化学合成的化合物，它们对植物发育具有至少一种如上列出的作用。这些化合物的一个例子是(2，4-二氯苯氧基)-乙酸(2，4-D)。

在一个优选例中，和该启动内含子连接的DNA序列编码与至少一种植物生长素的生物合成天然有关的多肽。该DNA序列在根瘤菌细胞中的表达导致该多肽生物(如酶)活性的提高，并因而在根瘤植物细胞中首先提高了至少一种植物生长素在类菌体中的含量，以及随后从类菌体中输出植物生长素。因此从原理上说，通过该实施例可见，由于刺激/加速导致植物生长素合成的生物合成途径而提高了至少一种植物生长素的生物合成，可增加植物生长素含量和/或活性。在另一个优选例中，和该启动内含子连接的DNA序列编码一种天然根瘤菌中不表达的蛋白质，它在类菌体中表达后导致从细菌细胞和/或类菌体代谢物合成至少一种植物生长素，或植物生长素前体。为本发明的该目的优选使用的一种基因的例子是萨氏假单胞菌(Pseudomonas syringae subsp.Savastanoi)的iaaM基因，橄榄和夹竹桃树中植物肿瘤的病原因子(ethiologicalagent)(Spena，A.，Estruch，J.J.，Schell，J.，生物技术目前观点(1992)，3，159-163)。肿瘤发育是由该细菌合成的植物激素引起的，然后它被分泌入周围组织，并刺激植物细胞的局部化生长。在和该类肿瘤的致病机理有关的基因中，iaaM基因编码吲哚乙酰胺一氧化酶，而且它负责通过氧化将氨基酸色氨酸转化成吲哚乙酰胺。吲哚乙酰胺没有特别的植物生长素活性，但它通过萨氏假单胞菌的iaaH基因(和根癌土壤杆菌的tms2基因同源)编码的水解酶转化成IAA。在植物组织中，吲哚乙酰胺也可经化学或非特异性水解酶转化成IAA。

已知萨氏假单胞菌的iaaM基因，而且已公布了它的序列(Yamada等(1985)P.N.A.S.USA，82，6522-6526)。已知道根癌土壤杆菌的tms2基因，并公布了其序列(Klee，H等(1984)P.N.A.S.USA81，1728-1732)。根据本发明，可为了本发明的目的可使用与丁香假单胞菌的iaaM基因和根癌土壤杆菌的tms2基因功能同源的基因。本领域技术人员可使用已知方法，如采用基于丁香假单胞菌iaaM基因和/或根癌土壤杆菌的tms2基因设计的探针筛选cDNA或基因组文库，来优选分离核苷酸序列也同源的这些基因。已从例如土壤杆菌的某些菌株(即根癌土壤杆菌和根瘤土壤杆菌；见例如Klee等(1987)基因发育1，186-196；White等(1985)细菌学杂志，164，33-44；Cardarelli等(1987)，普通分子遗传学，208，457-463)克隆了与丁香假单胞菌的iaaM基因产物活性相似的这些基因。

Ri质粒A4的rolA基因的85bpDNA启动内含子序列(SEQID NO：1)能在原核系统(如大肠杆菌、根瘤菌和土壤杆菌)中，在生长的对数期、对数期后和静止期启动在它控制下(即和它的3’末端连接)的DNA序列的基因表达。另外，该启动内含子能促进根瘤内类菌体中的基因表达。本领域技术人员可不难的，而且不经创造性努力即可从其它根瘤土壤杆菌的菌株中分离启动内含子序列和/或分离功能性同源的启动子，即能在根瘤内的类菌体中和/或自生生活的细菌中以相同方式驱动基因表达的启动子。

因此本发明的一个具体目的是使用SEQ ID NO：1中的根瘤土壤杆菌rolA基因的启动内含子序列，或使用含有所述启动内含子序列的DNA序列，或其功能性同源物或其部分，在重组细菌的生长对数期、对数后期和静止期中以及在根瘤内的类菌体中，诱导DNA编码序列的表达，所述编码DNA序列是在所述启动内含子序列的控制下，或在功能同源性启动子的控制下。优选重组细菌属于阴沟肠杆菌或根瘤菌家族，更优选是大肠杆菌、根瘤菌或土壤杆菌。

在一个优选例中，重组细菌是根瘤菌属的，在共生根瘤内或自生生活状态。当细菌在共生根瘤中时，它们是I、II、III、IV、V阶段的类菌体，或质外(apoplastic)空间的根瘤菌，或衰老区的根瘤菌、或存在于固氮区的根瘤菌，或存在于侵袭区的根瘤茵。

本发明的另一个目的是一种重组DNA分子，它含有本发明的启动内含子序列，或其功能同源物或部分，和与该启动内含子序列3’末端共价连接的DNA编码序列，其中该重组DNA分子是由游离基因元件所携带或整合在细菌基因组中。优选的DNA编码序列是单顺反子或多顺反子转录单元，更优选编码和植物激素合成和/或代谢有关的蛋白质，最优选编码和植物激素植物生长素合成和/或代谢有关的蛋白质，最优选编码和植物生长素IAA和或植物生长素吲哚乙醇的合成和/或代谢有关的蛋白质，甚至更优选编码来自萨氏假单胞菌的iaaM蛋白或其同源物(即具有相似的酶活性)和/或编码根癌土壤杆菌的tms2蛋白或其同源物。在一优选方面中，本发明的重组DNA同时包含iaaM和tms2编码区。

另外，本发明的重组DNA分子含有一DNA编码序列，它编码阴沟肠杆菌的吲哚丙酮酸脱羧酶或其同源物。

本发明的另一个目的是基因工程改造含有所述重组DNA分子的细菌。细菌优选包含在下表中：如上面具体化的根瘤菌、土壤杆菌、固氮螺菌、鱼腥蓝细菌、肠杆菌。

使用重组DNA分子来增加根瘤的大小和/或活性，和/或提高植物生物量生产在本发明的范围内。

使用重组DNA分子提高根瘤的固氮能力在本发明的范围内。

本发明将在一些例子中参考下图进行描述：

图1：嵌合性报道基因的示意图。86AGUS构建物含有：ⅰ)86bp长的DNA片段，含有如SEQ ID NO：1所示85bp的长启动内含子序列，在其3’末端加一个A残基；ⅱ)对应rolA蛋白的前40个氨基酸的DNA序列，融合于ⅲ)uidA编码区。85-17GUS构建物从5’到3’末端含有：Eco RI限制性位点(GAATTC)，SEQ IDNO：1的启动内含子序列，17bp接头序列(SEQ ID NO：2)，KpnI限制性位点(GGTACC)，先于uidA编码区的ATG。ΔGUS指仅含uidA编码区的构建物，即不含任何启动内含子序列。启动内含子指含有rolA启动内含子的85bp(从-1到-86，rolA基因ATG起始密码子的A是+1)的86bp序列。rolA编码区指编码rolA蛋白NH₂端40个氨基酸的序列。GUS指uidA编码区。作为EcoRI片段在载体pG(pMB393(Gage，D.J.，Bobo，T.和Long，S.R.(1996)细菌学杂志，178，7159-7166，见材料和方法))中双向克隆了该构建物。

图2：在含有86AGUS构建物的豌豆根瘤菌(Rhizobium leguminosarum)中β-葡糖醛酸酶活性的生长期依赖性表达。使细胞在丰富培养基(富含色氨酸-酵母抽提物的培养基)中生长，直到静止期(在时间轴线负侧的第一样品)，然后用TYR培养液稀释100倍。显示了600nm处的光密度(空心方块)和特异性β-葡糖醛酸酶活性(实心方块)。数值是至少4个独立实验的平均值。SE指标准误差。构建物ΔGUS(只含有uidA(GUS)编码区)显示没有可检测水平的特异性β-葡糖醛酸酶活性，而因此在图中未表示。

图3：用含有86AGUS构建物的豌豆根瘤菌蚕豆变种(R.I.viciae)感染小巢菜(Vicia hirsuta)植株的根瘤，在不同龄对根瘤染色检测β-葡糖醛酸酶活性。栏A-D显示了一周龄的根瘤。A栏显示只有几层细胞被感染，因此就在分生组织(在E栏中用星号标出)背后着染(蓝)色。栏B显示在该发育阶段感染区正在扩大并将随后(栏C)占据整个根瘤。栏D显示同一根上三个不同感染阶段的三个根瘤。栏E显示一个两周龄的根瘤；注意所有内部组织受到表达GUS活性的类菌体侵袭的柱形根瘤区。栏F显示三周龄的固氮根瘤(其中II和III区着染(蓝)色，而衰老的IV区几乎不着色)。栏G显示四周龄的根瘤，和根最接近的衰老晚期区带染色深。栏H显示对GUS活性和淀粉沉积的双染色(见材料和方法)；注意箭头指出的间断带II-III。在间断带II-III上方可见尺寸变小，仍着染(蓝)色的侵袭区II；双箭头显示最接近根的GUS活性(蓝)斑点。

图4。栏A-E1：被含有86AGUS构建物(栏C、D和栏A和G右侧)或启动内含子-iaaM-tms2构建物(栏B、E、E1、F和栏A和G左侧)的野生型豌豆根瘤菌蚕豆变种感染的根。栏F和G是显微镜明视野影像。注意栏A左侧的根被含有启动内含子-iaam-tms2构建物的细菌感染，具有较大的根瘤，群聚在种子附近，后随一长段没有根瘤的根。根的最远端部分又有根瘤。栏A右侧的根已被含有86AGUS构建物的豌豆根瘤菌蚕豆变种感染：显示沿着根有规律的出现根瘤(在栏D中放大)。栏B和C比较了用野生型(栏C)和含有启动子-iaaM-tms2构建物基因修饰(栏B)的根瘤菌引生的根瘤大小。栏E和E1显示了携带启动内含子-iaaM-tms2构建物的细菌引发的两类根瘤形态：栏E中为二叶形，或栏E1中为高度成簇。在栏F中显示暗视野显微镜对用含有启动内含子-iaaM-tms2构建物的豌豆根瘤菌蚕豆变种接种而产生二叶根瘤(见材料和方法)的清晰图像。在栏G中，将栏F中所示的同一对根瘤与携带86AGUS构建物的豌豆根瘤菌蚕豆变种衍生的同龄根瘤的比较，并染色显示β-葡糖醛酸酶活性。

图5：在种子生长袋(Mega International，Minneapolis)中培育小巢菜，每袋5粒种子。在栏A和B左侧，和栏C中，显示了35日龄的，被携带启动内含子-iaaM-tms2构建物的豌豆根瘤菌蚕豆变种感染的植株；在栏A和B的右侧部分和栏D中显示了被含有86AGUS构建物的豌豆根瘤菌蚕豆变种感染的植株。注意在栏A和B中，被启动内含子-iaaM-tms2构建物感染的植株比被携带86AGUS构建物的根瘤菌感染的植株尺寸大。用含有86AGUS构建物的豌豆根瘤菌蚕豆变种根瘤化的植物每株具有(栏D)较小的叶子，较少的枝和更多老化叶子。由携带启动内含子-iaaM-tms2构建物的根瘤菌根瘤化的植株显示具有更深暗绿色的叶子(栏C)，另外植株具有更健康的外观(比较栏C和栏D)。

图6：乙炔还原试验(ARA)。数据比较用携带86AGUS构建物的豌豆根瘤菌蚕豆变种(对照)或用携带启动内含子-iaaM-tms2构建物的根瘤菌根瘤化的18、27和31日龄植株的ARA。在每种情况下，将对照视为100％，而数据表示为用含有启动内含子-iaaM-tms2构建物的根瘤菌根瘤化的根所获得的ARA增长百分数。各直方柱代表从50株植物获得的中位值。ARA表示成任意单位。

图7：植株干重。紧靠种子上方切下根瘤化植株茎，在85℃炉中干燥过夜。栏A显示了用携带86AGUS构建物(对照)的豌豆根瘤菌蚕豆变种根瘤化的，和用含有启动内含子-iaaM-tms2构建物的根瘤菌感染的18、27和31日龄植株的干重。在每种情况下，将对照视为100％，在横坐标轴上标为0；数据表示为用启动内含子-iaaM-tms2构建物根瘤化的植株茎获得的干重相对应于对照的变化百分数。各直方柱代表50株植物的值。

图8：根瘤土壤杆菌Ri质粒A4的rolA启动内含子核苷酸序列。序列显示和：Sigma 70-依赖性启动子的-10和-35区，ⅱ)sigma 38依赖性启动子的-10区，以及ⅲ)黑体印出的所谓的GEAR-BOX序列具有同源性。箭头标出了主要的转录起始点。

图9：野生型豌豆根瘤菌蚕豆变种RPR1105(栏1-4)或启动内含子-iaaMtms2构建物(栏5-8)在小巢菜幼苗上产生的29(栏1和5)、36(栏2和6)、43(栏3和7)和50(栏4和8)日龄的根瘤。注意5、6、7和8与栏1、2、3和4中的对照根瘤比较，根瘤大小增加和形状不同。

图10：小巢菜植株的根瘤，由豌豆根瘤菌蚕豆变种RPR1105的野生株或由其含有启动内含子-iaaM-tms2构建物的衍生物所根瘤化，在感染后14、21、28、35、42和49日从根上切下。栏B显示了每株植株平均重量图(Mnod(mg)/pp)；标出了标准误差。各点代表每株植物的平均根瘤重量，该结果来自至少200个经筛选的根瘤。栏A显示了获得的线的垂线。

图11：野生型豌豆根瘤菌蚕豆变种RPR1105(栏1和2)、启动内含子-iaaMtms2构建物(栏3和4)或86AGUS构建物(栏5)产生的5周龄根瘤的薄切片(甲苯胺蓝染色)。栏2和4分别是栏1和3所示两个根瘤的根瘤分生组织放大图。分生组织在栏5中无活性，在栏1和2的根瘤顶端有活性，在栏3和4的双侧极端活跃并扩大，其中在具有大区带的新近感染细菌的根瘤帽上有小分裂细胞(亮染色)。

下文描述了所用的材料和方法：

重组质粒的构建

使用标准技术构建了重组DNA质粒。将86AGUS、85-17GUS和ΔGUS构建物双向作为EcoRI片段亚克隆入质粒载体pG(pMB393的衍生物)中(Gage，D.J.，Bobo，T.和Long，S.R.(1996)，ibidem)，该质粒载体pG是通过除去一条750bp长的EcoRI片段而获得，然后通过电穿孔引入豌豆根瘤菌蚕豆生物变种(Rhizobium leguminosarum biovar viciae)，菌株LPR1105，一种RCR1001的利福平抗性衍生型(Hooykas P.J.J.等(1977)普通微生物学杂志，98,477-484)中。实施例3中描述了含有驱动iaaM和tms2基因的rolA启动内含子的构建物：pG-启动内含子-iaaMtms2。

生长条件和GUS试验

30℃在TYR培养液中培养携带不同构建物的豌豆根瘤菌蚕豆生物变种细胞。测量OD₆₀₀确定生长曲线。

离心收集细菌，以50mM磷酸钠缓冲液(pH7.0)、10mM β-巯基乙醇、10mMNa₂EDTA、0.1％十二烷基肌氨酸钠、0.1％Triton X-100重量、5分钟超声处理两次，4℃16.000xg离心10分钟。用上清液测试GUS活性。如Jefferson所述进行荧光GUS试验(Jefferson，R.(1987)植物分子生物学报告，5,387-405)。用Bradford试剂(BIORAD)按照厂商说明书确定细菌抽提物中的蛋白质浓度。

将携带不同构建物的根瘤菌接种在补充了100微克/毫升奇霉素的TYR丰富培养基上，并筛选，影印到含有100微克/毫升利福平的平板上。培养要接种到植物上的菌株，直到静止期，12,000g离心5分钟，用pH7.4的PBS洗涤，重悬于相同缓冲液。测定600nm的光密度，将105个细胞施用于各株秧苗，培育1小时。以5％的过氧化氢表面灭菌小巢菜种子30分钟，然后用无菌双蒸水充分洗涤。种子4℃膨胀过夜，然后在1.5％琼脂平板上避光发芽三天。感染后，发芽的幼苗在含有10毫升Jensen培养液(Vincent，J.M.(1970)I.B.P.手册第15册，Oxford，Blackwell Scientific publications)的种子发芽袋(MEGAInternational Minneapolis，USA)中生长。植物在70％湿度、16/8光/暗周期17℃或22℃中生长。

原位GUS染色

切下根瘤化植株的根，37℃在X-Gluc试剂混合物(1mM X-葡糖醛酸化物、0.1mM NaPO₄、10mM EDTA pH7.0、0.5mM亚铁氰化钾pH7.0、0.5mM亚铁氰化钾pH7.0、0.1％Triton X-100)中培养过夜，然后以含4％多聚甲醛的PBS缓冲液固定(GUS方案，Gallagher S.G.，1992，Academic Press，Inc)。然后将根在递增浓度的无水乙醇中脱水，浸入2∶1苯甲酸苯酯-苯甲醇的混合液(Sigma)中澄清。对于淀粉染色，将整个根瘤在0.1M碘化钾水溶液中浸20秒。用Nikon显微镜在亮视野和反射偏振光光路中拍摄整个根瘤。

切下根瘤化的根(每15毫升试管4个根)并在室温下注射1毫升乙炔至少1小时，进行乙炔还原试验(ARA)。从各试管取出1毫升注射入配备了PerkinElmer 561记录仪和Porapack Q柱的Perkin Elmer Sigma 3B气相色谱仪中，获得了乙炔和乙烯峰。

实施例1：根瘤土壤杆菌的rolA基因的剪接体内含子是在根瘤菌中具有活性的启动子。

跨越rolA内含子(85bp长，从位置-1到位置-86，rolA基因ATG起始密码子的A是+1)的DNA序列(下文称为启动内含子)，能驱动根瘤菌中的原核表达。通过将uidA基因(Jefferson，1987，ibidem)的编码区和一片段融合，(该片段含有编码该启动内含子(即rolA启动内含子(SEQ ID NO：1)的85个bp加上后随rolA编码区的ATG起始密码子的A)之后RolA蛋白的NH₂-末端40个氨基酸的DNA序列)构建了一报道基因构建物(86AGUS；图1)。用荧光试验检测携带构建物86AGUS的豌豆根瘤菌蚕豆生物变种抽提物中的GUS活性(图2)。用85-17GUS构建物(含有SEQ ID NO.1的启动内含子和一个17bp接头(SEQ ID NO：2)和uidA编码区(图1))获得了相似的表达模式(数据未显示)。构建物ΔGUS本身含uidA编码区(图1)，在携带该构建物的根瘤菌中不显示任何GUS活性(数据未显示)。在色氨酸-酵母抽提物(丰富培养基)中培养携带三种构建物任一种的豌豆根瘤菌蚕豆变种LPR1105至静止期，600nm光密度达1.8，然后在相同培养液中稀释100倍。在生长对数期的早、中和晚期取样，然后在静止期的早期和晚期取样。仅在携带86AGUS(图2)或85-17GUS(数据未显示)构建物的豌豆根瘤菌蚕豆变种的蛋白质抽提物中检测到GUS活性，而ΔGUS和未转化的根瘤菌一样，显示没有可检测水平的β-葡糖醛酸酶活性。获得的数据显示，在携带86AGUS(或85-17GUS构建物)的根瘤菌中，β-葡糖醛酸酶活性在生长对数期间下降，并在静止期早期升高，在生长静止期晚期达到最高值(图2)。重复同一实验，但用含有一定浓度的甘露醇作为碳源的最小极限培养液稀释在丰富培养液中生长的静止期培养物100倍。稀释后，观察到长期迟后期的延长，随后是生长对数期和光密度达到0.6的生长静止期。该0.D.的减少是使用了碳限制条件所导致的。受静止期sigma因子sigma S调控的肠细菌启动子在这些条件下特别活跃。启动内含子序列携带有类似sigma S的共有序列(图8)。在生长静止期中，携带86AGUS构建物的根瘤菌GUS活性增强，达到的值比在丰富培养基中达到的生长静止期所测的值高2倍，这是碳饥饿的结果。因此，由该启动内含子序列驱动的基因表达和生长速率呈逆相关，并在生长静止期的开始被诱导。已发现一种利用85-17GUS构建物的相同表达模式，其中用17个碱基对的如SEQ ID NO.2所示的多接头将启动内含子序列和uidA基因分开。因此，85bp长的该启动内含子在根瘤菌中具有启动子功能。空心方块代表600nm处的光密度；实心方块代表GUS活性。

实施例2：启动内含子以新颖和出乎意料的表达模式驱动根瘤内的基因表达。

用携带86AGUS构建物或85-17GUS或ΔGUS的豌豆根瘤菌蚕豆生物变种菌株LPR1105感染小巢菜植株。幼苗在温室条件下生长至种植后60天，在不同时间切下根，用聚甲醛缓冲液固定，并染色检测原位GUS活性(Jefferson，1987，ibidem)，在合适的缓冲液中过夜培育后，将根浸在递增的乙醇溶液中脱水，然后用甲苯澄清，在亮视野光学显微镜下观察。含有SEQ IDNO.1所示的启动内含子DNA序列的DNA片段在根瘤中促进共生根瘤菌的表达，具有特征性和新颖的表达模式，导致感兴趣的基因组成型表达。组成型表达是指，虽然在具体模式中是定时的，但总体上它在植物细胞含有类菌体的根瘤的所有区域发生。该表达模式与sigma54或sigma70类调控的启动子的表达模式具有明显差异，对于比较见Sharma.S.B.和E.R.Signer(1990)普通发育学，4,344-356。

当进入宿主植物时，根瘤菌即称为类菌体。已知类菌体经历5种分化形式，从阶段1-5逐渐老化。Vasse，J.，等(1990)细菌学杂志，172，pp.4295-4306描述了这些不同阶段。在不确定的根瘤如小巢菜中，最年幼的类菌体位于早期感染区II中，靠近从根伸出的分生组织尖(代表I区)，其中刚从先跨越根毛然后皮质层的感染线释放的细菌，最终达到生长的根瘤。老得多的类菌体位于晚感染区II，然后是在固氮区III，最后在衰老区IV中仅存在类菌体的痕量(ghost)膜。在任何年龄的根瘤II、III和IV区中，包括在最邻近根的非常老的衰老区中均观察到该启动内含子驱动的表达(见图3)。因此，在任何阶段的携带类菌体的所有植物细胞确实在其类菌体内具有β-葡糖醛酸酶活性。拍摄了被含有86AGUS构建物的根瘤菌感染的根瘤的照片。采用仅能得到稍弱的信号的85-17GUS构建体获得了相同的表达模式。用携带构建物ΔGUS的根瘤菌未观察到染色。在图3，I栏中存在GUS(蓝)活性和淀粉(深棕色)的双染色。在更老的根瘤中，淀粉沉积发生在III和IV区，但它是最常用的，因为其染色说明了间区II-III(见图3栏I中的箭头)。GUS染色同时在间区II-III上或下。

实施例3：质粒DG-启动内含子-iaaM-tms2的构建

在用EcoRI-KpnI切开的pG质粒中连接含有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的EcoRI-KpnI片段，跨越rolA启动内含子序列，获得重组质粒pG-启动内含子-iaaM-tms2。然后用KpnI-HindIII切开质粒pG-启动内含子，分别引入作为KpnI-SphI和SphI-HindIII片段的iaaM和tms2编码序列。1775bp(2＋53＋1671＋49)的KpnI-SphI片段跨越萨氏假单胞菌的iaaM基因的编码区。Yamada等(1985，indem)已确定了iaaM序列的特征，所用的序列含有1773bp(53＋1671＋49)，从位于ATG起始密码子前53个bp的DraI位点到TAA终止密码子后46bp的SphI位点。跨越根癌土壤杆菌pTi A6(Klee，H.等(1984)P.N.A.S.USA 81，pp.1728-1732)的tms2编码区的1452(22＋13＋1403＋14)bp的SphI-HindIII片段含有编码区的1403个bp，前有14个bp，后有5个bp，属于tms2基因的非翻译区。

因此，获得的质粒pG-启动内含子-iaaM-tms2具有以下结构特征：

-一个启动内含子片段，它含有rolA启动内含子的85个bp(SEQ ID NO.1)，加接头序列的17个bp(SEQ ID NO.2)，并在其5’末端具有EcoRI衔接头(序列为GAATTC)；

-作为KpnI位点的6个bp(序列GGTACC)加另两个额外碱基作为接头；

-萨氏假单胞菌iaaM基因5’非翻译序列的53个bp；

-萨氏假单胞菌iaaM基因编码区的1671个bp；

-以SphI位点为末端的萨氏假单胞菌iaaM基因3’非翻译尾随序列的49个bp(终止密码子的46＋3bp)；

-由多接头序列构成的22个bp(CTGCAGGTCGACTCTAGAGGAT，SEQ ID NO.3)；

-tms2基因非翻译前导区的13个bp(CCAACTCAGAGAG，SEQ ID NO.4)；

-跨越根癌土壤杆菌pTiA6的tms2基因编码区的1403个bp；

-3’末端处的14个bp，包括HindIII位点(序列TAAACATCAAGCTT，SEQ IDNO.5)，其中TAA是终止密码子，该终止密码子后的tms2编码区3’处的AC序列，和剩下的HindIII接头序列(HindIII位点是AAGCTTT)。

实施例4：启动内含子-iaaM-tms2构建物改变根瘤数，位置和大小。

用86AGUS构建物或启动内含子-iaaM-tms2构建物感染后，在第18日收集小巢菜幼苗。使用携带86AGUS构建物的根瘤菌感染植物，每株植物观察到平均22个根瘤，而用携带启动内含子-iaaM-tms2构建物的根瘤菌感染植物，该数量减少到每株植物7.5个根瘤。将对照的86AGUS构建物感染的植物看成100％，根瘤菌中存在的双顺反子操纵子使根瘤数减少了65％。和该特征相反，用携带启动内含子-iaaM-tms2构建物的根瘤菌感染的植物根瘤尺寸大大增加。在图4栏B和C中，可比较根瘤大小。不仅含有启动内含子-iaaM-tms2构建物的根瘤菌诱导尺寸更大的根瘤，而且有时候根瘤还是二叶的(栏E)。另外，携带启动内含子-iaaM-tms2构建物的根瘤菌引起的根瘤大多数位于主根上(图4，栏A左)很少象携带86AGUS构建物或不携带任何构建物的根瘤菌接种的植物那样，位于次生根上(图4，栏A，右)。最后，图4(栏A，左)显示携带启动内含子-iaaM-tms2构建物的根瘤菌引起的根瘤聚集在靠近种子的根区，然后是一大段不发生根瘤的根。这不是野生型根瘤菌引起的根瘤化模式(其均由沿根均匀分布的小根瘤组成)(图4，栏A右和栏D)。

 实施例5：携带启动内含子-iaaM-tms2构建物的根瘤菌诱导的根瘤显示乙炔还原活性(ARA)的提高。

用野生型豌豆根瘤菌蚕豆生物变种菌株LPR1105或携带86AGUS或启动内含子-iaaM-tms2构建物的相同菌株感染的根瘤化根，感染后跟踪1个月，并分析将乙炔还原成乙烯的活性。这是最常用的间接酶分析，来评估固氮酶复合物将大气中的氮还原成氨的能力。在两种不同温度(17℃和22℃)下，每点使用50株植物，进行了8个独立实验。结果显示启动内含子-iaaM-tms2构建物诱导了根瘤的形成(在22℃)，这些根瘤与野生型根瘤菌或携带86AGUS或85-17GUS的根瘤菌产生的对照根瘤相比能更有效的将乙炔还原成乙烯。因此，启动内含子-iaaM-tms2构建物的存在提高了根瘤固氮的能力。用细菌接种发芽的种子后18、27和31天采集样品。以气相色谱(见材料和方法)中跟踪乙炔还原活性(ARA)，并表示成任意单位。在图6中取对照(每种情况至少50株植物)的中位值作为100％。每根直方柱表示和对照比较，用启动内含子-iaaM-tms2构建物根瘤化的根的ARA增加百分数。在时间函数中，ARA百分数与对照相比从18天时增加30％，到31天时增加240％。

实施例6：植物生长和生物量

如图5所示，用含有启动内含子-iaaM-tms2构建物的根瘤菌根瘤化的35日龄小巢菜较大(增加20％以上)。另外，这些植物不仅更大，而且其表型也改变，与用野生型豌豆根瘤菌蚕豆变种接种的姐妹植株比较，具有暗绿色的叶子和更好的活力。在图7中列出了18、27和31日龄植物的干重。将任一日龄的对照植物干重视为100％，标为0。可观察到在18日，当种子储藏蛋白对植物生长影响仍重要时，用含有启动内含子-iaaM-tms2构建物的根瘤菌根瘤化的植物平均干重有显著下降(即24％)。相反，27和31日龄植物，当种子中所含的氮几乎耗尽时，用携带启动内含子-iaaM-tms2构建物的根瘤菌根瘤化的植物干重，与用野生型根瘤菌株或含有86AGUS或85-17GUS构建物根瘤化的植物干重相比，分别增加了35％和44％。

实施例7：乙炔还原测量

进行乙炔还原试验，比较在小巢菜上用豌豆根瘤菌蚕豆生物变种野生型菌株RPR1105或其含有启动内含子-iaaM-tms2构建物的衍生株产生的根瘤。感染后直到23日，这两种菌株以相似速率还原相同量的乙炔。感染5周后，对照根瘤中分生组织活性停止，而用含有启动内含子-iaaM-tms2构建物的细菌接种的根瘤中，直到8周后仍在产生新感染的细胞。感染39日后，当比较启动内含子-iaaM-tms2构建物和野生型菌株时，乙炔还原达到了100％增加。

实施例8：茎干重的增加

进行了小巢菜茎干重的分析，来比较用豌豆根瘤菌蚕豆生物变种野生型菌株RPR1105和其含有启动内含子-iaaM-tms2构建物的衍生株根瘤化的小巢菜植物。直到感染后23天，植物生物量基本未受影响。然而感染51天后，当启动内含子-iaaM-tms2构建物和野生型菌株比较时，观察到15％的增加。

实施例9：总氮含量分析

进行小巢菜茎干重的分析后，接着进行了矿物质化总氮含量分析。按照Dumas的方法(Simonne等，食品农业科学杂志，73，39-45)，使用氮分析仪Macro-N(Foss Heraeus Analysensysteme，Hanau Germany)测量了作为元素N的总氮含量。在用豌豆根瘤菌蚕豆生物变种野生型菌株RPR1105，和用其含有启动内含子-iaaM-tms2构建物的衍生株根瘤化的小巢菜植物上，直到感染后51日总氮浓度都未受影响。

实施例10：根瘤重量分析

进行了根瘤重量分析，来比较用豌豆根瘤菌蚕豆生物变种野生型菌株RPR1105和其含有启动内含子-iaaM-tms2构建物的衍生株根瘤化的植物。图9显示在小巢菜幼苗上由野生型豌豆根瘤菌蚕豆变种1004株(栏1-4)或启动内含子-iaaM-tms2构建物(栏5-8)所产生的29、36、43和50日龄的根瘤。用两种菌株感染后直到4周根瘤总质量都未受影响。在感染42天后，当比较启动内含子-iaaM-tms2构建物和野生型菌株时，达到2倍增加。图10B显示两种菌株直到感染49天后的根瘤重量比较数据图表。图10A栏显示了对于豌豆根瘤菌蚕豆生物变种野生型菌株RPR1105，内推线的斜率是0.26，而当使用启动内含子-iaaM-tms2构建物时，斜率值是0.46。

实施例11：分生组织活性分析

分析了用0.02％甲苯胺蓝染色的5周龄根瘤的薄切片，以比较用豌豆根瘤菌蚕豆生物变种野生型菌株RPR1105和其含有启动内含子-iaaM-tms2构建物的衍生株根瘤化的植物。图11显示在含有86AGUS的细菌产生的根瘤中没有分生组织活性和新感染的细胞。然而当使用野生型菌株RPR1105时，它们存在并限于根尖；同时，当使用启动内含子-iaaM-tms2构建物时分生组织活性仍然非常活跃，在根瘤顶部有许多分裂(小)细胞，和许多新感染(亮染色)的细胞。因此很明显，相同日龄在三个样品中产生的根瘤的大小和形状是具有统计学差异的。

实施例12：法国菜豆中乙炔还原的测量

进行了乙炔还原试验，来比较用(Rhizobuim etli)的野生型菌株E3或其含有启动内含子-iaaM-tms2构建物的衍生株根瘤化的法国菜豆植株。和根瘤的小巢菜不定型相反，法国菜豆产生定型根瘤，即缺乏持久分生组织的根瘤，这和在黄豆根上产生的类似。感染后23日，乙炔还原速率相同，与用于感染根的菌株无关。感染后43日，用含有启动内含子-iaaM-tms2构建物的细菌接种的法国菜豆植株与野生型(R.etli)CE3比较时，增加了100％。

实施例13：法国菜豆中茎干重的增加

进行了法国菜豆茎干重分析，来比较用(Rhizobuim etli)野生型菌株CE3或其含有启动内含子-iaaM-tms2构建物的衍生株根瘤化的植株。干重在感染后直到23日时还是相同的，与所用的菌株无关，而在48日后用含有启动内含子-iaaM-tms2构建物的CE3菌株根瘤化的植物茎干重与用(Rhizobuim etli)CE3野生型菌株感染的48日龄法国菜豆植株比较时，增加了15％。

实施例14：法国菜豆中根瘤重量分析

进行了法国菜豆根瘤重量分析，比较用(Rhizobuim etli)野生型菌株CE3或其含有启动内含子-iaaM-tms2构建物的衍生株根瘤化的植物。直到感染后23日，根瘤重量是相同的，与所用的菌株无关。而在48日时，用含有启动内含子-iaaM-tms2构建物的CE3菌株根瘤化的植株根瘤重量与48日龄的用(Rhizobuim etli)野生型CE3菌株感染的法国菜豆植株比较，增加了50％。

                            序列表<110>G.IN.E.ST.R.A.s.c.ar.l.

   ConSiglio Nazionale delle Ricerche

   Spena，Angelo

   Defez，Roberto<120>控制细菌即发根土壤杆菌中的基因表达，来改进根瘤发育、固氮和植物生物量产生的方法<130>PCT<140><141><160>5<170>PatentIn Ver 2.1<210>1<211>85<212>DNA<213>发根土壤杆菌<400>1gtgagtgtgg ttgtaggttc aattattact atttttgaag ctgtgtattt ccctttttct 60aatatgcacc tatttcatgt ttcag<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：接头序列<400>2gggtaggtca gtccctt                                                17<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：接头序列<400>3ctgcaggtcg actctagagg at                                          22<210>4<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：接头序列<400>4ccaactcaga gag                                                    13<210>4<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：接头序列<400>4ccaactcaga gag                                                    13<210>5<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述：接头序列<400>5taaacatcaa gctt                                                   14

Claims (22)

1.如SEQ ID NO.1的发根土壤杆菌rolA基因的启动内含子序列，或含有所述启动内含子序列的DNA序列，或其功能性同源物或其部分的用途，其特征在于，在生长对数期、对数期后和静止期的重组细菌中，和在根瘤内的类菌体中诱导DNA编码序列的表达，所述编码DNA序列在所述启动内含子序列的控制下。

2.如权利要求1所述的启动内含子序列的用途，其特征在于，所述重组细菌属于肠杆菌或根瘤菌科。

3.如权利要求2所述的启动内含子序列的用途，其特征在于，属于肠杆菌或根瘤菌科的所述重组细菌是大肠杆菌、根瘤菌或土壤杆菌。

4.如权利要求3所述的启动内含子序列的用途，其特征在于，所述重组细菌属于根瘤菌属，在共生根瘤内或自生生活状态下。

5.如权利要求1所述的启动内含子序列的用途，其特征在于，所述共生根瘤内的根瘤菌属重组细菌是I、II、III、IV、V阶段的类菌体，或质外空间中的根瘤菌，或衰老区中的根瘤菌，或固氮区中的根瘤菌，或侵袭区中的根瘤菌。

6.一种重组DNA分子，其特征在于，该DNA分子含有如权利要求1所述的启动内含子序列，或其功能性同源物或其部分，和共价连接于所述启动内含子序列3′末端的DNA编码序列，所述重组DNA分子由游离基因元件携带或整合在细菌基因组中。

7.如权利要求6所述的重组DNA分子，其特征在于，所述DNA编码序列是一种单顺反子或多顺反子转录单元。

8.如权利要求6或7所述的重组DNA分子，其特征在于，所述DNA编码序列编码与植物激素合成和/或代谢有关的蛋白质。

9.如权利要求8所述的重组DNA分子，其特征在于，所述DNA编码序列编码和植物激素植物生长素合成和/或代谢有关的蛋白质。

10.如权利要求8所述的重组DNA分子，其特征在于，所述DNA编码序列编码与植物生长素吲哚-3-乙酸或植物生长素吲哚乙醇合成和/或代谢有关的蛋白质。

11.如权利要求8所述的重组DNA分子，其特征在于，所述DNA编码序列编码萨氏假单胞菌的iaaM蛋白质或其同源物。

12.如权利要求8所述的重组DNA分子，其特征在于，所述DNA编码序列编码根癌土壤杆菌的tms2蛋白质或其同源物。

13.如权利要求8所述的重组DNA分子，其特征在于，所述DNA编码序列同时编码权利要求11和12中分别所述的iaaM和tms2编码区。

14.如权利要求8所述的重组DNA分子，其特征在于，所述DNA编码序列编码阴沟肠杆菌的吲哚丙酮酸脱羧酶或其同源物。

15.含有权利要求6-14的重组DNA分子的基因工程改造的细菌。

16.如权利要求6-14所述的重组DNA分子的用途是使植物根瘤显著增大。

17.如权利要求16所述的重组DNA分子的用途，其特征在于，根瘤大小的所述统计学显著增加是至少20％。

18.如权利要求6-14所述的重组DNA分子的用途是使根瘤化植物固氮能力显著提高。

19.如权利要求18所述的重组DNA分子的用途，其特征在于，固氮能力的所述统计学显著的增加是至少20％。

20.如权利要求6-14所述的重组DNA分子的用途是使植物生物量产生显著增加。

21.如权利要求20所述的重组DNA分子的用途，其特征在于，植物生物量生产的所述统计学显著增加是至少10％。

22.豆科植物，其特征在于，该豆科植物被携带如权利要求6-14所述的重组DNA分子的细菌感染，并在根瘤尺寸，和/或根瘤固氮能力，和/或植物生物量，和/或固氮能力上有显著提高。

Images