CN1321714C

CN1321714C - 一种用于分子烙印固相萃取的填料及其制备方法

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Publication number: CN1321714C
Application number: CNB2004100091399A
Authority: CN
Inventors: 徐筱杰; 骆宏鹏; 庄艳; 陈丽蓉
Original assignee: Peking University
Current assignee: Peking University
Priority date: 2004-05-28
Filing date: 2004-05-28
Publication date: 2007-06-20
Anticipated expiration: 2024-05-28
Also published as: CN1704140A

Abstract

本发明涉及一种用于分子烙印固相萃取的填料及其制备方法。本发明填料用的载体是经表面改性的玻璃微珠。其结构强度高、近球性好、无溶胀性，在使用不同溶剂时能够保持柱体的完整和均一性，且耐压性好。该填料的制备方法是用液膜法在载体表面形成具有分子烙印聚合物薄膜层。本方法能使聚合物在载体表面分布更加均匀、致密而且完整，结合得更为牢固，在使用过程中不易脱落；且得到的聚合物平均孔径大，从而增大扩散速度、提高萃取效率。

Description

一种用于分子烙印固相萃取的填料及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于分子烙印固相萃取的填料，具体涉及一种新型的分子烙印固相萃取填料用的载体，以及用此载体制备的分子烙印聚合物填料。本发明还涉及上述填料的制备方法。

背景技术

分子烙印技术是进行物质分离的一种较先进的手段，常与固相萃取方法结合来分离用常规手段难以分离的物质，如在成分复杂的植物粗提物中分离特定的有效成分。1972年，Wullf等最先将分子烙印技术用于葡萄糖类衍生物的手性分离(G.Wulff，A.Sarhan，Angew.Chem.，Int.Ed.Engl.，341，1972，11)。

采用分子烙印技术进行固相萃取时最为关键的是制备出分子烙印聚合物。分子烙印聚合物的用途是根据待分离物质的分子形状、大小及官能团进行分子识别，类似于生物体系中酶对底物、抗体对抗原或受体对抑制剂的作用，具有一定的选择性。

分子烙印聚合物的制备过程一般为：将待分离的分子作为模板分子，加入到致孔剂(也同时作为溶剂)中，模板分子与加入的功能单体(如含烯基的有机酸、碱、酰胺类化合物)通过化学识别作用，以共价或非共价形式形成某种复合物，再加入交联剂(通常为多烯基化合物)，使形成的复合物通过交联聚合反应固化。模板分子通过体积和形状识别被封闭在聚合物中，最后利用致孔剂形成的孔道通过酸碱洗涤将模板分子除去。这样，聚合物中就产生了若干大小、形状及功能基排列与模板分子互补的孔穴。这些孔穴可被称之为原来加入的模板分子形成的烙印。

现有技术制备分子烙印聚合物最常用的方法是本体聚合法(Jianchun Xie，Lili Zhu，Hongpeng Luo，et al.，J.Chromatogr.A，934，2001，1-11)，即直接让前述聚合反应液聚合成为一大块分子烙印聚合物，再通过研磨、过筛和沉降分选以得到适用的分子烙印聚合物颗粒作为填料使用。

使用本体聚合方法制备聚合物颗粒时，模板分子等原料用量很大，而由于扩散速度的影响，在实际过程中仅有颗粒表面较薄的一层起作用，整体的利用率不高。另外，此方法得到的聚合物颗粒往往粒径分布较宽，使用前还需要进行粒径分选，使产率更低；而且由于形状不规则，造成使用过程中的柱压很大，限制了流速(与生产效率直接相关)的提高。因此本方法成本很高，效率低，不适合于较大规模的应用。

为了减少模板分子的用量，有人采用载体来替换其内核部分，即仅在载体表面有分子烙印聚合物，方法有以下几种：

一种方法是以大孔硅胶为载体，经过表面改性(引入乙烯基)后，加入稀的聚合反应溶液中，使其在溶液中捕集沉降聚合物微粒(Sean D.，Plunkett，Frances H.，J.Chromatogr.A，708，1995，19-29)，即将分子烙印聚合物微粒附着在硅胶表面上，但此附着是很不牢固的，使用中容易发生微粒脱落，堵塞分离柱，而无法进行继续分离。

另一种方法是多步聚合法(Cacho C，Turiel E，Martin-Esteban A，et al.JCHROMATOGR B 802(2)：347-353 APR 5 2004)，使用的载体就是功能单体和交联剂自身的聚合物颗粒。即先在不加模板分子的条件下让聚合液反复进行沉降聚合和沉降分选以得到粒径均一的颗粒，然后再加入模板分子进行聚合。但此制备工艺过于复杂，也不适合于较大规模的应用。

这两种使用载体的方法还有一个共同的缺点：即在装入分离柱使用时，都依赖分子烙印材料本身来承受压力。而分子烙印聚合物从表面到内核都是多孔性结构，本身能够承受的压力不太大，尤其是对颗粒之间接触压力(反应为局部高压)的耐受性不强，在使用中容易破碎，造成识别位点的流失和柱压升高。

此外还有人在电极表面制备分子烙印薄膜(Shoji R，Takeuchi T，Kubo I，ANAL CHEM75(18)：4882-4886 SEP 15 2003)，但由于其表面积太小，仅能用于微量检测。

发明内容

本发明的目的之一是找到一种制备分子烙印聚合物填料的载体，该载体应溶胀性很小，耐压性好，避免聚合层在挤压中破碎，适用于制备大型固相萃取柱，使用不同溶剂时能够保持柱体的完整和均一性；该载体还应近球性好，使聚合物在载体表面分布均匀、致密而且完整，结合牢固，在使用过程中不易脱落。

本发明的目的之二是提供一种在载体表面形成分子烙印聚合物的新方法，及用该方法制备分子烙印聚合物填料，使用该填料进行萃取应扩散速度快、萃取效率高，以实现快速分离；还应简单易行，适合于大规模制备。

为实现上述第一发明目的，本发明选用经表面改性的玻璃微珠作为分子烙印固相萃取填料的载体。

所述经表面改性，指使用含有乙烯基的硅烷化试剂进行表面改性，以增强玻璃微珠与分子烙印聚合物之间的结合能力。所有含有乙烯基的硅烷化试剂均可使用。

上述玻璃微珠可用实心或空心的，粒径在100-2500目均可，但每批使用时应粒径大小均匀。因此可在使用前将玻璃微珠进行分选，使粒径分布范围尽可能窄。分选方法可采用在水中反复沉降或其它常规方法。

使用玻璃微珠作为载体的优点是：

1.结构强度高、近球性好、基本没有溶胀性，所以在使用不同溶剂时能够保持柱体的完整和均一性。

2.耐压性好，使用时柱压小，因而可以使用更长的柱芯，提高分离效率。

3.与本体聚合法相比，由于替换掉了填料中心那些利用率很低的部分，从而大大减少了分子烙印材料(尤其是模板分子)的用量；

为实现上述第二发明目的，本发明使用基于表面张力的液膜法，所制备的填料是在载体表面具有分子烙印聚合物薄膜层的颗粒。

用以下操作方式效果较好：

1.先用填料的载体预装柱，搭建出将来填料的主体构架，以保证产品的结构压力绝大部分由载体承受，防止聚合层在挤压中破碎；

2.将聚合反应液注入上述预装柱中。

用高压氮气将多余的聚合反应液吹出。在表面张力的作用下，载体表面仪余很薄且均匀的一层聚合反应液，以节约模板分子等原料，并同时达到除氧目的；

3.将处理好的柱子两端封口后，置水浴中聚合反应约24小时，即可得到高效分子烙印固相萃取填料。

本方法所述载体可以使用本领域技术人员常规使用的各种载体材料，如硅胶(无孔)、玻璃微珠等。

使用本发明液膜法来制备分子烙印固相萃取填料的有益效果是：

1.能使聚合物在载体表面分布更加均匀、致密而且完整，结合得更为牢固，在使用过程中不易脱落；

2.因表面张力作用，得到的聚合物具有更大的平均孔径，从而增大扩散速度、提高萃取效率，可实现快速分离的目的；

3.本方法简单易行，适合于大规模制备。

若将本发明前述的玻璃微珠作为载体材料，并使用本发明液膜法来制备分子烙印固相萃取填料，则效果更好，相得益彰：

1.由于在柱中先装填空心玻璃微珠后才加入聚合反应液，因此整个填料本身的结构压力主要由玻璃微珠来承担，而玻璃微珠本身可以承受1000个大气压，所以不管是与本体聚合法、多步聚合法相比还是与使用大孔硅胶为载体相比(它们都依赖分子烙印材料本身来承受压力，而分子烙印聚合物为多孔性结构，本身能够承受的压力不太大)，制备得到的固相萃取填料其耐压性能都要高得多(尤其适用于制备大型固相萃取柱)。

2.玻璃微珠的高近球性与表面张力的结合，能使得制备得到的聚合物表面光滑均匀，拥有更好的色谱性能(首先就是它的柱压小，因而可以使用更长的柱芯和更大的流速)。

附图说明

图1是液膜聚合物吸附速度实验结果；

图2是本体聚合物吸附速度实验结果。

上述图中，横坐标表示时间，纵坐标表示溶液吸光度。

具体实施方式

以下实施例通过分别示出了制备的分子烙印萃取填料本体聚合物和以空心玻璃微珠为载体的液膜聚合物，以进行比较。

本实施例中的分子模板以大黄素作为举例，但本发明并不限于此。实际上，只要应用本发明的材料和方法，本领域技术人员可以制备出各种所需的分子烙印萃取填料。

实施例

1.实验材料

1.1来源

大黄素购自淮安市久泰生物化学有限公司，纯度大于98％。

丙烯酰胺(AA)、三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯(TRIM)、偶氮二异丁腈(AIBN)购自百灵威化学试剂公司。TRIM在使用前用下面方法处理：TRIM用10％氢氧化钠水溶液洗后，用无水硫酸镁干燥，然后再减压重新蒸馏。AIBN使用前用甲醇重结晶。

四氢呋喃(THF)为色谱纯，使用前经过钠干燥，重蒸馏处理。甲醇、乙腈为色谱纯，醋酸为分析纯。

500目空心玻璃微珠、三乙氧基乙烯基硅烷、三乙氧基氨乙基硅烷购自青岛海大化学试剂公司。

0.75mm内径PEEK管及各种PEEK接头(凹、凸)购自迪马公司。

半径1/16英寸，孔径10um不锈钢筛网购自美国Valco Instruments Co.Inc.。

500uL及2.5mL进样针购自美国HAMILTON Co.。

500目不锈钢筛为定制。

4.6×50mm空不锈钢色谱柱为北京北化仪器试剂公司加工。

6mL聚乙烯固相萃取管为J.T.Baker的6mL C18固相萃取管掏空其中的C18填料得到。

ASAP2010快速比表面积孔径测定仪为北京大学化学学院中级仪器实验室仪器。

1.2空心玻璃微珠的预处理

取200克500目空心玻璃微珠，用清水反复沉降以除去其中半径较小的粒子和底部的黑色杂质。将沉降后得到的粒径较为均一的空心玻璃微珠置于500mL大烧杯，在其中加入2M HCl，在电磁搅拌下加热(约65度)反应4小时，以除去玻璃微珠表面的金属离子，并活化玻珠表面的硅羟基。活化后倾去上清，用蒸馏水反复漂洗至中性，沥于后置于烘箱中于110℃干燥2小时。

称取活化后的空心玻璃微珠50克置于250mL圆底烧瓶中，加入经无水处理的甲苯50mL、三乙氧基乙烯基硅烷5mL(增强玻璃微珠与分子烙印聚合物之间的结合能力)、三乙氧基氨乙基硅烷0.5mL(增强玻璃微珠与模版分子之间的结合能力)，装上回流冷凝装置，于电磁搅拌下回流反应72小时。反应后倾去上清，用丙酮反复漂洗以去掉未反应的溶液，沥干后置于真空干燥器中干燥。

2.实验步骤和实验结果

2.1用本体聚合法制备大黄素的分子烙印聚合物

将27mg大黄素溶于700uL四氢呋喃中，加入28.8mg丙烯酰胺、700uL TRIM、6.5mg AIBN，在1.5mL艾登道夫管中混合后通氮除氧，封管聚合(60℃水浴24h)。聚合产物经研磨过筛后用丙酮反复沉降，得到颗粒较为均一的产品约350mg。

2.2用液膜法制备以空心玻璃微珠为载体的大黄素分子烙印聚合物

将经表面修饰过的空心玻璃微珠装入4.6×50mm空不锈钢色谱柱中(装入约800mg)，从一端用500uL进样针注入200uL聚合反应液(组成同本体聚合)后，通氮除氧并使玻璃微珠表面形成一层反应聚合液膜。用堵头封住色谱柱两端，在60℃水浴中聚合24h。最终得到的产物约850mg。从制备工艺的角度来看，本发明所用的方法甚至比本体聚合法还要简单。

2.3大黄素浓度-吸光度标准曲线的测定

配制1.00ug/mL、4.00ug/mL、8.00ug/mL、10.0ug/mL、12.0ug/mL的大黄素甲醇溶液，以甲醇为参比，用722型分光光度计于435nm波长处分别测定它们的吸光度值(1cm吸光度池)。

表1不同浓度下大黄素甲醇溶液在435nm波长时的吸光度值(1cm吸光度池)

浓度(ug/mL)	1.00	4.00	8.00	10.0	12.0
浓度(ug/mL)	1.00	4.00	8.00	10.0	12.0	吸光度	0.032	0.148	0.290	0.357	0.446

做图得A＝0.0365C(ug/mL)，或C(ug/mL)＝27.4A。

2.4过饱和固相萃取实验

固相萃取柱的填装：本体聚合法大黄素分子烙印固相萃取柱为232.8mg经沉降后的产品装于6mL聚乙烯固相萃取管；液膜聚合法(以玻珠为载体)大黄素分子烙印固相萃取柱为4.6×50mm不锈钢色谱柱(即原始的制备体系)。

模版分子的去除：先用20mL甲醇洗上述四种大黄素分子烙印固相萃取柱，再用10mL乙腈平衡。

上样：1.00mL 100ug/mL大黄素乙腈溶液。

清洗：＞6mL乙腈(洗至流出液基本无色)。

洗脱：6mL甲醇(洗至流出液基本无色)。

测定：以甲醇为参比，用722型分光光度计于435nm波长处分别测定甲醇洗脱液的吸光度值(1cm吸光度池)，在标准曲线上求出洗脱液中大黄素浓度，再计算出上述两种大黄素分子烙印固相萃取柱的萃取量。

表2两种方法制备的大黄素分子烙印聚合物固相萃取性能比较

	填料重量(mg)	洗脱体积(mL)	洗脱液吸光度	萃取量(ug)	大黄素用量(mg/g)	萃取容量(ug/g)
	填料重量(mg)	洗脱体积(mL)	洗脱液吸光度	萃取量(ug)	大黄素用量(mg/g)	萃取容量(ug/g)	本体聚合物	232.8	5.0	0.015	2.0	36(77)^*	8.8
液膜聚合物	850	6.0	0.401	65.9	2.1	77.6	本体聚合物	232.8	5.0	0.015	2.0	36(77)^*	8.8

*括号内的数字是按照实际可用的产品(350mg)来折算时的结果。

过饱和固相萃取实验的结果表明了固相萃取填料实际可用的最大柱容量。从表2中可以看出液膜聚合物拥有比本体聚合物大得多(8.8倍)的柱容，这就突破了多步聚合法和使用大孔硅胶为载体时仅减少原料用量，但是不提高柱容的限制。此外在原料用量上本方法比本体聚合法节约了约97％。

液膜聚合法(以玻珠为载体)大黄素分子烙印固相萃取柱固相萃取回收率测定

测量时上样量均为20ug，但使用的样品浓度不同，条件如下：

高浓度上样：0.500mL 40.0ug/mL大黄素乙腈溶液。

中浓度上样：3.00mL 6.67ug/mL大黄素乙腈溶液。

低浓度上样：10.0mL 2.00ug/mL大黄素乙腈溶液。

其余固相萃取及检测步骤同上。

表3三种上样浓度下液膜法分子烙印聚合物固相萃取的回收率

填料	上样浓度(ug/mL)	洗脱体积(mL)	吸光度	萃取量(ug)	回收率
填料	上样浓度(ug/mL)	洗脱体积(mL)	吸光度	萃取量(ug)	回收率	液膜聚合物	40.0	4.0	0.172	18.9	94.4％
6.67	4.0	0.165	18.1	90.3％			40.0	4.0	0.172	18.9	94.4％
6.67	4.0	0.165	18.1	90.3％	2.00		6.0	0.105	17.2	86％

从表3中可以看到，即使上样浓度低至2ug/mL，在上样量为20ug时，液膜法制备的填料仍然能够达到86％的回收率。

2.5两种方法制备的大黄素分子烙印聚合物的BET实验

将本体聚合大黄素分子烙印聚合物和液膜法制备的大黄素分子烙印聚合物(均已洗去模版分子)各取一定量于120℃真空干燥脱气。BET实验由北京大学化学学院中级仪器实验室代为测定。脱附和吸附等温线记录采用了55点压力表，孔径分布使用了BJH模型计算。

表4两种方法制备的大黄素分子烙印聚合物的比表面积和平均孔径

	本体聚合物	液膜聚合物
	本体聚合物	液膜聚合物	比表面积(m²/g)	172.4	28.3
平均孔径(nm)	3.91	6.45	比表面积(m²/g)	172.4	28.3

从表4可以看出，本发明制备的填料其较大的柱容并不来自于比表面积的增加，而是在于表面张力作用下平均孔径的扩大。这一特征正是其它核心替代方法所没有的，这也是本发明优势的核心基础。

2.6本体聚合法和液膜法制备的大黄素分子烙印聚合物的吸附速度实验

称取139mg本体聚合制备的大黄素分子烙印聚合物置于1cm吸光度池中，用340uL乙腈润湿，待聚合物沉降完毕后，沿壁加入1mL 6ug/mL大黄素乙腈溶液，以乙腈为参比测定混合不同时间时的吸光度值。

称取139mg液膜法制备的大黄素分子烙印聚合物置于1cm吸光度池中，用340uL乙腈润湿，待聚合物沉降完毕后，沿壁加入1mL 15ug/mL大黄素乙腈溶液，以乙腈为参比测定混合不同时间时的吸光度值。

吸附速度实验的结果见附图1和附图2。这两张图表明本方法制备的聚合物拥有很快的吸附速度，而这也正是平均孔径增大带来的结果，是本发明的一个优点。

Claims

1.一种分子烙印固相萃取填料用的载体，是经表面改性的玻璃微珠，所述表面改性是用含有乙烯基的硅烷化试剂对玻璃微珠进行表面处理。

2.根据权利要求1所述的分子烙印固相萃取填料用的载体，所述玻璃微珠是实心或空心的。

3.根据权利要求1所述的分子烙印固相萃取填料用的载体，所述玻璃微珠的粒径是100-2500目。

4.一种用于分子烙印固相萃取的填料，其特征是：该填料以权利要求1～3中任一权利要求所述的分子烙印固相萃取填料用的玻璃微珠作为载体。

5.根据权利要求4所述的用于分子烙印固相萃取的填料，其特征是：用液膜法在玻璃微珠表面形成具有分子烙印聚合物薄膜层的颗粒。