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CN1319988C - 一种高亲和力免疫球蛋白结合分子及其制备方法 - Google Patents

一种高亲和力免疫球蛋白结合分子及其制备方法 Download PDF

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CN1319988C CNB2004100671572A CN200410067157A CN1319988C CN 1319988 C CN1319988 C CN 1319988C CN B2004100671572 A CNB2004100671572 A CN B2004100671572A CN 200410067157 A CN200410067157 A CN 200410067157A CN 1319988 C CN1319988 C CN 1319988C
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Abstract

本发明涉及一种重组免疫球蛋白结合分子文库、其制备方法及其应用。本发明是以来自不同种属免疫球蛋白结合分子葡萄球菌A蛋白protein A的A、B、C、D、E结构域、大消化链球菌proteinL的B1、B2、B3、B4、B5结构域、C和G群链球菌蛋白G protein G的G1、G2为结构单元，将上述结构单元随机连接，构建重组Ig结合分子文库，将该文库展示在噬菌体表面；以免疫球蛋白对噬菌体展示重组Ig结合分子文库进行3-4轮亲和筛选，获得系列高亲和力免疫球蛋白结合分子噬菌体文库。上述文库可用于筛选高亲和力Ig结合分子。

Description

一种高亲和力免疫球蛋白结合分子及其制备方法
技术领域
本发明涉及分子生物学及免疫诊断学领域，尤其涉及一种重组免疫球蛋白结合分子文库、其制备与应用。
背景技术
酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测抗体已广泛用于各种临床疾病的诊断，尤其是传染病如肝炎、HIV感染的免疫诊断、献血者筛选和流行病学调查。但目前ELISA法检测敏感度不高，往往造成漏检而影响疾病的早期诊断，贻误病情或者引起输血后丙型肝炎及HIV感染，严重危害着人们的健康。从用于献血员筛选抗-HCV及抗-HIV ELISA试剂来看，目前最新的检测试剂(第三代试剂)，仍然存在漏检。其中，这些漏检很大一部分是检测系统中另一个关键物质-酶结合物与被抗原捕获的抗体的结合数量不足引起的。因此，提高酶结合物与捕获抗体的结合是提高ELISA抗体检测试剂敏感度关键因素之一。
目前用于检测的酶结合物主要是辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗人免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)的多克隆抗体或单克隆抗体、金黄色葡萄球菌蛋白A(protein A)、C和G群链球菌蛋白G(protein G)和大消化链球菌属蛋白L(protein L)。
研究发现，一些细菌表面蛋白能与Ig结合且不影响抗体结合抗原的活性，因此被作为酶结合物应用于酶联等免疫学检测。这些Ig结合分子主要是金黄色葡萄球菌蛋白A(proteinA)、C和G群链球菌蛋白G(protein G)和大消化链球菌属蛋白L(protein L)。protein A主要与Ig的Fc段结合，与人以及几乎所有哺乳动物的IgG的Fc段都有很强的结合，但只结合其中的IgG1、IgG2和IgG4亚类，不能结合IgG3亚类，与其他类型Ig的结合活性很弱，其与IgM的结合效果不佳。与protein A结合特性相似，protein G也可与人及几乎所有哺乳动物的IgG的Fc段结合，其结合力比protein A略强，不同的是，protein G不能结合除IgG以外的其他类型的免疫球蛋白，因此，不是很适合用作免疫检测。另一种抗体结合蛋白-厌氧菌大消化链球菌属protein L与protein A及protein G的结合特性完全不同，它主要与Ig的κ轻链可变区结合，能结合不同类型Ig的Fab片段，且不影响抗原结合位点，与人以及几乎所有哺乳动物的各类及各亚型的Ig都有较强的结合，并且亲和力相当，适合用作免疫检测。
1992年，瑞典学者Kihlberg等构建了protein L和protein G的融合蛋白Protein LG，发现Protein LG有广泛的抗体结合活性能结合大多数Ig的Fc、Fab段和Ig轻链。与单一的protein L或proteinG相比，其抗体结合特性更完全，除人类Ig外，还可用于鼠源性抗体的检测。1998年，瑞典学者Svensson等将protein L的四个结合Igκ轻链的结构域与proteinA四个结合IgG的结构域融合，构建出一种新型融合蛋白Protein LA，结合谱广，不仅能结合人及一些哺乳动物的不同类型Ig和IgG所有亚类，还能结合基因工程单链抗体Fv(ScFv)片段而不影响抗体的抗原结合能力，可用于免疫检测及亲和色谱纯化各类Ig及Fv(ScFv)片段。证明Protein LA是一种多功能的抗体结合分子。目前，Protein LA可溶的、HRP标记、或结合琼脂糖形式的多种制剂已被CLONTECH公司开发成商品。国内至今未有类似产品出现。
蛋白质分子体外定向进化是近几年发展起来的一种蛋白质改造新策略，通过对编码基因的随机突变、重组和定向筛选，借以改变、优化生物大分子特性，获得具有改进功能或全新功能的蛋白质，使几百万年的自然进化过程在短期内得以实现，是改造生物活性分子的重要方法。DNA重排是目前为止最简便、最有效的体外定向分子进化技术，它将一组紧密相关的核酸序列随机片段化，再重新组装成全长核酸序列，通过序列迅速进化，可获得功能更强的新的蛋白分子。DNA重排技术在医药方面已得到广泛应用并在许多酶、抗体及重要蛋白的改造、新型毒素分子及蛋白类药物的制备上取得成功。
protein A、protein L和protein G的抗体结合区各自由多个序列高度重复的结构域组成，protein A的Ig结合区由5个(A、B、C、D、E)58-62个氨基酸残基序列高度同源的结构域串联而成；各单结构域间仅有少量的氨基酸序列差异，如A与B、B与C结构域各有5个氨基酸不同。protein L的Ig结合区也由5个(B1、B2、B3、B4、B5)72-76氨基酸残基序列高度同源的抗体结合结构域重复串联而成，各结构域氨基酸组成大多相同，仅有某些位点不同，如B2与B3结构域只有4个氨基酸不同。protein G的Ig结合活性被定位于2个高度重复的B结构域(G1、G2)，每个结构域由55个氨基酸残基组成。其中protein L的B1、B2、B3、B4、B5结构域分别具有如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5所示的基因序列；protein A的A、B、C、D、E结构域分别具有如SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10所示的基因序列；protein G的G1、G2结构域分别具有如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12所示的基因序列。实验证明上述蛋白的单个的抗体结合结构域也同样具有Ig结合能力。本发明利用DNA重排技术将12种protein L，proteinA和Protein G单结合域(B1、B2、B3、B4、B5、A、B、C、D、E、G1、G2依次代表三种蛋白protein L，protein A和Protein G的不同抗体结合结构域，共12种)为结构单位进行重新随机排列组合，构建重组Ig结合分子文库。利用该文库进行DNA重排可形成多种不同的Ig结合分子，从中可以筛选出与Ig结合能力更强的高亲和力免疫球蛋白(Ig)结合分子(highaffinity immunoglobulin binding molecules HAIBMs)，实现本发明的蛋白质分子体外定向进化。
噬菌体展示技术作为高通量的筛选方法，使得大容量组合基因文库建立后目的分子的体外筛选成为可能。噬菌体展示技术是1985年建立的一种将外源多肽基因插入噬菌体外壳蛋白PIII或PVIII基因中，将外源多肽展示于噬菌体颗粒表面的方法。它外源多肽的基因型和表型巧妙的结合起来，展示在噬菌体表面的外源蛋白直接与其编码基因相关联，通过噬菌体繁殖扩增可直接进行外源蛋白的活性鉴定与序列分析。经特定配基的筛选，可获得特异结合的目的分子，而且通过“吸附”一“洗脱”一“扩增”的重复过程使含有目的蛋白的噬菌体得到上万倍乃至108倍的富集，是一种高效分子进化研究的高通量筛选体系。我们应用的噬菌体展示载体pCANTAB5S，在《新型噬菌体展示载体pCANTAB5S的构建》，安徽医科大学学报，2004年第39卷第2期第83～86页中，以及中国专利文献-文献号1508254中具有详细描述，这里简单的说，是在引物中加入Sac I酶切位点，将用该引物扩增的IFN-αA-2b衔接片段PCR产物克隆到pMD-18T中，再将该片段插入pCANTAB5L中，经Sac I酶切，回收线性载体片段，再连接形成新型噬菌体展示载体pCANTAB5S。pCANTAB5S校正了pCANTAB5L克隆位点的读框并引入了新的限制酶切位点SacI。重组噬菌粒pCANTAB5S的结构示意见图12。pCANTAB5S可以对重组Ig结合分子文库进行展示，并可以通过Ig对噬菌体展示重组Ig结合分子文库进行亲和筛选，获得系列HAIBMs。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种重组Ig结合分子文库及其制备方法。
本发明的另一个目的是提供一种重组Ig结合分子文库的噬菌体展示方法。
本发明的另一个目的是提供一种获得高亲和力Ig结合分子噬菌体文库的方法。
本发明的另一个目的是提供本发明的重组Ig结合分子文库应用于筛选高亲和力Ig结合分子。
在本发明的第一方面，本发明涉及一种重组Ig结合分子文库，该文库以不同的Ig结合分子葡萄球菌A蛋白的A、B、C、D、E结构域，大消化链球菌L蛋白的B1、B2、B3、B4、B5结构域，G群或C群链球菌G蛋白的G1、G2结构域的单个抗体结合结构域为结构单元，以结构单元随机DNA重排形成Ig结合分子组成，其中上述结构域的核苷酸序列分别为：SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：12，单个结构域之间以核苷酸GAGCTC连接，结构单元随机DNA重排形成的Ig结合分子通过如下方法获得：
a)将Ig结合分子葡萄球菌A蛋白的A、B、C、D、E结构域，大消化链球菌L蛋白的B1、B2、B3、B4、B5结构域，G群或C群链球菌G蛋白的G1、G2结构域的单个抗体结合结构域分别经PCR扩增引入Sac I酶切位点作为连接点；
b)将PCR回收产物分别经Sac I酶切消化；
c)将步骤(2)获得的Sac I酶切消化产物混合，用T4连接酶将各单结构域进行随机连接重组。
在本发明的第二方面，本发明涉及上述文库的制备方法，包括下列步骤：
a)以Ig结合分子葡萄球菌A蛋白的A、B、C、D、E结构域，大消化链球菌L蛋白的B1、B2、B3、B4、B5结构域，G群或C群链球菌G蛋白的G1、G2结构域的单个抗体结合结构域为结构单元，分别经PCR扩增引入Sac I酶切位点作为连接点，其中所述结构域的核苷酸序列为：SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：12；
b)PCR回收产物分别经SacI酶切消化；
c)将步骤(2)获得的Sac I酶切消化产物混合，再用T4连接酶将各单结构域进行随机连接重组。
在本发明的第三方面，本发明涉及一种重组Ig结合分子文库的噬菌体展示方法及该方法所获得的重组Ig结合分子噬菌体文库，该方法将按所述Ig结合分子文库克隆于噬菌粒载体pCANTAB5S中，以该载体进行3+3形式的噬菌体展示。
在本发明的第四方面，本发明涉及一种获得高亲和力Ig结合分子噬菌体文库的方法，该方法用Ig包板，利用上述重组Ig结合分子噬菌体文库经3-4轮体外定向进化IgG亲和筛选获得高亲和力Ig结合分子噬菌体文库。
在本发明的第五方面，本发明涉及上述方法获得的高亲和力Ig结合分子噬菌体文库，被噬菌体展示的高亲和力Ig结合分子的是以葡萄球菌A蛋白的单个结构域、大消化链球菌protein L的单个结构域及G群或C群链球菌G蛋白的单个结构域为结构单元，间隔排列连接而成的Ig结合分子中的任意一种或多种。
更佳地，以ML、MA、MG分别代表大消化链球菌L蛋白的单个结构域、葡萄球菌A蛋白的单个结构域、G群或C群链球菌G蛋白的单个结构域，则上述高亲和力Ig结合分子的序列的排列方式为(ML-MA)n或(ML-MG)n或(ML-MA-MG)n或(ML-MG-MA)n或ML-(MA-ML)n或ML-(MG-ML)n，其中n为该序列的重复次数。
更佳地，上述高亲和力Ig结合分子序列的排列方式为B3-G1-B2-G2-B5，B2-D-G1-B5-C-G1，B5-A-B2-G1-B1，B3-D-B3，B3-D-B3-D-B3，B2-G2-A-B3-D-G1，B1-G1-B3-G1，B2-D-B3-D-B1，B2-C-B4-E-G1，B2-C-G2-B1-D-G1之任一种。
更佳地，上述高亲和力Ig结合分子具有SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32任一所示的序列特征。
在本发明的第六方面，本发明提供的重组Ig结合分子文库可用于筛选高亲和力Ig结合分子。筛选获得的高亲和力Ig结合分子可应用于免疫学诊断或抗体的检测和纯化。尤其是应用于酶联免疫吸附试验或免疫层析检测或免疫组化。
本发明的技术路线是采用分子生物学技术构建重组Ig结合分子文库；将该文库以3+3的方式展示丝状噬菌体上；用Ig对噬菌体展示文库进行3-4轮亲和筛选，获得系列高亲和力Ig结合分子(HAIBMs)；序列分析测定所获HAIBM的DNA序列，并确知其氨基酸序列，分析其分子的构成特点；原核表达、纯化HAIBM分子，测定其与Ig的结合能力；测定展示有HAIBM分子噬菌体与Ig的结合能力及在ELISA抗体检测中的作用。
本发明的优点是利用蛋白质分子体外定向进化的策略，通过构建重组Ig结合分子基因文库筛选到与免疫球蛋白高亲和力结合的一系列Ig结合分子(HAIBMs)，HAIBMs作为具有高亲和力的新的Ig结合分子可以广泛用于酶联免疫吸附试验、免疫层析检测、免疫组化等免疫学诊断及抗体的检测和纯化。
附图说明
图1  Protein A的A、B、C结构域基因片段的PCR扩增产物电泳示意图，其中：
     m：DL2000Marker
1-4：Mu-Protein A A结构域基因片段PCR扩增产物
5-6：Mu-Protein A B结构域基因片段PCR扩增产物
7-8：Mu-Protein A C结构域基因片段PCR扩增产物
C：空白对照
图2  Protein A的D结构域基因片段的PCR扩增产物电泳示意图，其中：
     m：DL2000Marker
1-4：Mu-Protein A D结构域基因片段PCR扩增产物
C：空白对照
图3  Protein A的E结构域基因片段的PCR扩增产物电泳示意图，其中：
     m：DL2000Marker
1-4：Mu-Protein A E结构域基因片段PCR扩增产物
C：空白对照
图4  Protein L B1-B5结构域基因片段的PCR扩增产物电泳示意图，其中：
     1：Protein L B1结构域基因片段的PCR扩增产物
     2：Protein L B2结构域基因片段的PCR扩增产物
     3：Protein L B3结构域基因片段的PCR扩增产物
     4：Protein L B4结构域基因片段的PCR扩增产物
     5：Protein L B5结构域基因片段的PCR扩增产物
     C：空白对照
     m：DL2000Marker
图5  Protein G G1-G2结构域基因片段的PCR扩增产物电泳示意图，其中：
     1：Protein G G1结构域基因片段的PCR扩增产物
     2：Protein G G2结构域基因片段的PCR扩增产物
     C：空白对照
     m：DL2000Marker
图6  Protein A单结构域+Protein L单结构域+Protein G单结构域连接反应产物电泳示意图，其中：
     1：连接前   2：连接30’  3：连接1h
     4：连接2h   5：连接4h    6：连接24h
     m：DL2000Marker
图7  PALGn/phage文库Ig筛选F1代文库中单克隆噬菌体插入片段的PCR扩增1-8：单克隆1-16#；C：阳性对照LT/pCANTAB5L；m：DL2000Marker；n：阴性对照pCANTAB5S
图8  PALGn/phage文库Ig筛选F2代文库中单克隆噬菌体插入片段的PCR扩增1-8：单克隆1-16#；C：阳性对照LT/pCANTAB5L；m：DL2000Marker；n：阴性对照pCANTAB5S
图9  PALGn/phage文库Ig筛选F3代文库中单克隆噬菌体插入片段的PCR扩增1-8：单克隆1-16#；C：阳性对照LT/pCANTAB5L；m：DL2000Marker；n：阴性对照pCANTAB5S
图10  PALGn/phage文库Ig筛选F4代文库中单克隆噬菌体插入片段的PCR扩增1-8：单克隆1-16#；C：阳性对照LT/pCANTAB5L；m：DL2000Marker；n：阴性对照pCANTAB5S
图11  各筛选轮次IgG结合分子文库中HAIBM分子中的单结构域(domain)组成分布的比例
图12  重组噬菌粒pCANTAB5S的结构示意图
具体实施方式
一、重组Ig结合分子基因文库的构建
与传统的DNA重排-将目的片段DnaseI随机消化后重组装实现体外定向进化的方式不同，本发明以不同种属的Ig结合分子的单个抗体结合结构域作为结构单位(protein A的A、B、C、D、E结构域，protein L的B1、B2、B3、B4、B5结构域和protein G的G1、G2结构域)经PCR扩增引入相同的限制酶切位点作为Linker，经酶切消化后，再用T4连接酶将各单结构域进行随机连接重组，构成重组Ig结合分子文库。在该文库中DNA重排可形成不同长度(2-5个结构域或更多)以55-76个氨基酸残基组成的抗体结合结构域为最小单位的重组Ig结合分子，其随机重复串联可产生12n以上种的不同Ig结合分子(n为重复串联的最小功能单位个数)；与Protein LA分子相比，其多样的排列形式可用P(L/A/G)n来表示，P为多肽，(L/A/G)为5种Protein L、5种Protein A及2种Protein G单结构域中的任何一种，n为重复串联的单结构域的个数。与Protein LA(LLL-AAAA)及Protein LG单一的结构形式相比，分子库中L与A/G距离的多样性、(L/A/G)重复串联数的多样性以及各种L/A/G氨基酸差异产生的序列多样性使得产生出与Ig结合能力更强的高亲和力Ig结合分子。该分子文库中各单结构域是具有一定结构的有序多肽，本身具有Ig结合能力，在新的蛋白中其基本的构架结构得以继续保存，从而保证了组合分子的Ig结合能力得到提高和优化。另外因各单结构域自身具有二级结构(α螺旋或β折叠)，重组分子的空间结构比随机片段重组分子有更高的稳定性，有利于新的蛋白空间构象的维持。为了保证重组分子的多样性，发明人通过调整各片段的浓度，使各片段比例相当，同时控制连接反应条件，将不同时间的连接产物混合，得到不同长度的各种排列的重组Ig结合分子基因文库，说明书附图图1-图6即分别显示了Protein A的A、B、C片段的PCR扩增产物电泳示意图，Protein A的D片段的PCR扩增产物电泳示意图，Protein A的E片段的PCR扩增产物电泳示意图，Protein L的B1-B5片段的PCR扩增产物电泳示意图，Protein G的G1-G2片段的PCR扩增产物电泳示意图，ProteinA单结构域+Protein L单结构域+Protein G单结构域连接反应产物电泳示意图。
二、重组Ig结合分子文库的噬菌体展示
将重组Ig结合分子文库克隆于噬菌粒载体pCANTAB5S中，以噬菌粒为载体进行3+3形式的展示。外源基因插入噬菌粒的III基因中，转化大肠杆菌TG1，M13K07辅助噬菌体拯救，构建展示Ig结合分子噬菌体文库。所建的库容量为3.4×107个菌落形成，噬菌体的滴度为4.1×1012单位转化单位/毫升(tramsformation unit/ml，TU/ml)。pCANTAB5S噬菌粒载体不仅保留原pCANTAB5L载体的多克隆位点和[G4S]3接头，保证了大分子量(＞300个氨基酸)重组Ig结合分子的功能维持和活性展示，还增加了SacI克隆位点，能更方便，有效地展示外源基因文库，有利于扩大库容量。
三、Ig体外定向分子进化筛选高亲和力Ig结合分子(HAIBMs)
利用噬菌体展示技术建立的高通量筛选结合Ig体外定向分子进化筛选。用Ig包板，噬菌体展示Ig结合分子文库经3-4轮Ig亲和筛选获得HAIBMs。我们在每轮库筛选中选用了的IgG结合实验菌落计数、插入片段PCR阳性克隆数等指标直观评价筛选的效果，结果见表1，表2，图7，图8，图9，图10，图11。
四、高亲和力ig结合分子(HAIBMs)的分子结构特点及序列
制备筛选后单克隆的重组噬菌体，提取噬菌粒DNA，用pCANTAB5S的上下游引物pCANTAB5-S1和pCANTAB5-S6双向测定其DNA序列，所测序列用DNASTAR软件分析其序列特征。高亲和力Ig结合分子序列分析显示其结构域组成的多样性：由来自不同Ig结合分子的单个抗体结合结构域-protein A的A/B/C/D/E、protein L的B1/B2/B3/B4/B5、protein G的G1/G2重组连接形成(B1-B5代表protein L的B1-B5结构域，A、B、C、D、E代表protein A的A、B、C、D、E结构域，G1、G2代表protein G的B1、B2结构域)，如B1-B2-G1-A、B3-D-B3、B1-B3-B1、G1-B2-A-B1、B1-G2-B1、D-B2-B-B3、B3-D-B3-D-B3、B-G1-B2-D-B1等。以ML、MA、MG分别代表大消化链球菌L蛋白的单个结构域、葡萄球菌A蛋白的单个结构域、G群或C群链球菌G蛋白的单个结构域，则HAIBMs所具备的分子结构特征为：(ML-MA)n或(ML-MG)n或(ML-MA-MG)n或(ML-MG-MA)n或ML-(MA-ML)n或ML-(MG-ML)n结构，HAIBMs均由protein L的单结构域(ML)、protein A的单结构域(MA)或protein G的单结构域(MG)间隔排列连接而成(n为该序列的重复次数)。其中的代表序列的连接方式为：B3-G1-B2-G2-B5，B2-D-G1-B5-C-G1，B5-A-B2-G1-B1，B3-D-B3，B3-D-B3-D-B3，B2-G2-A-B3-D-G1，B1-G1-B3-G1，B2-D-B3-D-B1，B2-C-B4-E-G1，B2-C-G2-B1-D-G1。在代表序列protein L、protein A、proteinG的单结构域之间以核苷酸以GAGCTC连接。本发明特别揭示了具有SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ IDNO：28、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32任一所示的序列的高亲和力Ig结合分子。
五、HAIBM重组噬菌体的Ig结合活性测定
用Ig包板分别对各单克隆HAIBM重组噬菌体进行Ig结合活性测定。以两种方式检测重组噬菌体与Ig的结合，第一种在重组噬菌体与抗体结合后的样孔中加入大肠杆菌TG1使其感染，将单克隆重组噬菌体感染菌液涂布于氨苄青霉素抗性平皿上计数，以辅助噬菌体为阴性对照，菌落数的多少表示噬菌体与Ig结合能力的大小；第二种在重组噬菌体Ig结合后的样孔中加入酶标抗噬菌体抗体(HRP/Anti-M13 conjugate)，TMB显色，测OD450nm值，直接检测被人Ig特异吸附的重组噬菌体的数量，结果见表3。
六、高亲和力Ig结合分子(HAIBMs)的功能
将HAIBMs克隆于原核表达载体pET32(a)，IPTG诱导表达HAIBMs蛋白，用Ni亲和层析柱纯化HAIBMs蛋白。用纯化的HAIBMs包被96孔酶标板，同时设SPA阳性对照，LT阴性对照，加入IgG HRP酶标抗体，可以检测HAIBMs与Ig的结合活性，结果见表4。
七、高亲和力Ig结合分子(HAIBMs)的应用
将HCV抗原包被于酶标排条板上，洗涤后，加入丙型肝炎病毒感染阳性病人的血清，作用后洗去未结合的抗体，加入不同的HAIBM单克隆重组噬菌体(各滴度调至同一水平)，设噬菌体阴性对照，将反应后的样品分成两组，第一组每孔加入大肠杆菌TG1使其感染，将单克隆重组噬菌体感染的菌液涂布于氨苄青霉素抗性平皿上计数，以辅助噬菌体为阴性对照；第二组每孔加入噬菌体抗体HRP/Anti-M13conjugate，TMB显色，测OD450nm值，用于检测被病人血清特异吸附的重组噬菌体的数量，结果见表4、表5、表6。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 重组Ig结合分子文库的构建
1.合成引物
1.1用于protein A、protein L、protein G单结构域基因扩增
(1)从Mu-protein A/pGEM-T easy质粒上扩增Protein A-A、Protein A-B/C、Protein A-D、Protein A-E序列的上游引物分别为：
PA-uA：5’-cacgagctcGCTGACAACAATTTCAAC-3’
PA-uB：5’-cgcgagctcGCGGATAACAAATTCAAC-3’
PA-uC：5’-cgcgagctc GCTGACAACAAATTCAAC-3’
PA-uD：5’-tccgagctcGCTGATGCGCAACAAAAT-3’
PA-uE：5’-cgcgagctcGCTCAACAAAATGCTTTT-3’
下游引物分别为：
PA-dA：5’-tctgagctcTTTCGGTGCTTGAGATTC-3’
PA-dB：5’-tctgagctcTTTTGGTGCTTGTGCATC-3’
PA-dC：5’-acggagctcTTTTGGTGCTTGAGCATC-3’
PA-dD：5’-tcggagctcAAAGCCACGAACTCTAAG-3’
PA-dE：5’-agagagctcTTTTGGAGCTTGAGAGTC-3’
(2)从Protein L/pGEM-T easy质粒上扩增Protein L的B1-B5序列的
上游引物分别为：
pLB1-u：5’-tctgagctcAAAGAAGAAACACCAGAA-3’
pLB2-u：5’-acggagctcAAAGAAAAAACCCCGGAA-3’
pLB3-u：5’-cgtagactCAAAGAAAAAACACCAGAA-3’
pLB4-u：5’-cgtagactcAAAGAAAAAACACCAGAA-3’
pLB5-u：5’-cgcagactcAAGAAAGTTGACGAAAAA-3’
下游引物分别为：
pLB1-d：5’-cgcagactcTCCAGCAAATTTAATATT-3’
pLB2-d：5’-cgcagactcTCCAGCAAATTTAATATT-3’
pLB3-d：5’-tgcgagctcACCAGCGAATTTGATGTT-3’
pLB4-d：5’--cgcagactcACCTGCAAATCTAATATT-3’
pLB5-d：5’--cgtagactcTCCAGCAAATCTAATGTT-3’
(3)从Protein G/pGEM-T easy质粒上扩增Protein G B1-B2序列的上游引物分别为：
pG1-u：5’-tctgagctcACTTACAAATTAATCCTT-3’
pG2-u：5’-tctgagctcACTTACAAACTTGTTATT-3’
下游引物分别为：
pG1-d：5’-tatgagctcTTCAGTTACCGTAAAGGT-3’
pG2-d：5’-tctgagctcTTCAGTAACTGTAAAGGT-3’
上述引物均引入了Sac I(-GAGCTC-)酶切位点。
1.2用于PCR扩增检测阳性克隆插入片段的引物序列，为pCANTAB5S克隆位点上、下游序列上游引物为：
pCANTAB5-S1：5’-CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC-3’
下游引物为：
pCANTAB5-NOT2：5’-GCCCAGCCGGCC-3’
1.3用于阳性克隆DNA测序的引物序列，为pCANTAB5E的上、下游序列上游引物为：
pCANTAB5-S1：5’-CAACGTGAAAAAATTATTATTCGC-3’
下游引物为：
pCANTAB5-S6：5’-GTAAATGAATTTTCTGTATGAGG-3’
2 各抗体结合结构域的PCR扩增
所使用的模板protein A序列见GenBank AB050857，protein L序列见GenBank M86697，protein G见GenBankY00428。以含葡萄球菌A蛋白的5个抗体结合结构域(A-E)的protein A/pGEM-T easy质粒为模板，用PA-uA/PA-d A、PA-u B/PA-d B、PA-u C/PA-d C、PA-u D/PA-dD、PA-u E/PA-d E分别扩增Protein A的A、B、C、D及E片段；以Protein L/pGEM-T easy质粒为模板，用pL B1-u/pL B1-d、pL B2-u/pL B2-d、pL B3-u/pL B3-d、pL B4-u/pL B4-d和pL B5-u/pL B5-d为引物，PCR分别扩增Protein L的B1，B2，B3，B4及B5片段；以ProteinG/pGEM-T easy质粒为模板，用pG1-u/pG1-d和pG2-u/pG2-d为引物，PCR分别扩增ProteinG的B1，B2片段。PCR反应体积50μl，加质粒模板5ng，上、下游引物各1μmol，dNTP 100μmol，Mg++ 2mmol，1U Taq酶。扩增条件为94℃ 30sec；60℃ 30sec；72℃ 30sec；35个循环。各PCR产物用申能博彩公司的胶试剂盒纯化，按说明书进行。相应的PCR扩增产物电泳图见图1-图5。
3 PCR回收产物的酶切
各PCR回收产物取40μl作Sac I酶切，反应体积80μl。Sac I4μl(40U)、10×buffer8μl，分80μl/支，37℃酶切过夜，1％琼脂糖电泳后，用手术刀片割下目的条带，用申能博彩公司的胶试剂盒回收PA-A、PA-B、PA-C、PA-D、PA-E，PL B1、PL B2、PL B3、PL B4、PL B5及PG1、PG2酶切片段。
4 Ig结合分子文库的构建
上述各酶切回收片段取5μl(1μg)，10×连接缓冲液8μl，T4DNA连接酶4μl(20U)，反应体积100μl。先将DNA片段与水一起加入管中于65℃温育5分钟，在连接反应试剂加入之前，将DNA溶液于0℃预冷5分钟，加入T4DNA连接酶，连接混合物分5支，20μl/支，16℃分别连接30min、1h、2h、4h、24h，再将不同时间的连接产物混合起来用于与pCANTAB5S DNA的连接。图6显示连接成功。
实施例2、重组Ig结合分子文库的噬菌体展示
1.噬菌粒载体pCANTAB5S DNA的制备及线性化：
pCANTAB5S噬菌粒DNA用申能博彩公司质粒回收试剂盒抽提，按说明书进行。琼脂糖电泳定量。Sac I酶切后碱性磷酸酶(CIAP)去磷酸化处理，试剂盒从溶液中胶回收线性化载体，琼脂糖电泳定量。
2.Ig结合分子文库与噬菌粒载体连接：
将12种回收的protein A的A、B、C、D、E单结合域酶切片段，protein L的B1、B2、B3、B4、B单结合域酶切片段，Protein G的G1、G2单结合域酶切片段的混合物80μl(5μg)加T4 DNA连接酶5μl(25U)，10×Buffer1.5μl，反应总体积100μl。将100μl分为20μl/支，共5支，16℃连接，分别连接30min、60min、90min、120min、150min后合并，加入载体2μl(2μg)，65℃处理10min冷却至室温，再加入T4DNA连接酶5μl(25U)，10×Buffer2μl，反应总体积120μl，分6支16℃分别连接30min、60min、90min、120min、150min和180min后合并。
3.感受态细胞的制备：
原始TG1菌划线LB平板，37℃温箱中培养过夜，挑取活化平板上单克隆菌落接种于2mlPsi培养基的试管中，37℃250rpm摇床振荡培养过夜；再将培养细菌1∶50转接于Psi培养基中，37℃ 250rpm，摇荡培养至OD值0.4。将菌液1ml/支分装于1.5ml离心管中，冰水浴15分钟，4000rpm，4℃离心10min；去除上清，用1ml 0.1M CaCl2小心将细菌悬浮起来；冰水浴15min，3500rpm，4℃离心10min；去除上清，沉淀用200μl 0.1M CaCl2将细菌小心复悬，冰浴备用。
4.重组噬菌体的制备：
120μl连接产物加入2ml感受态细胞中，轻轻混匀，冰水浴30min，42℃水浴60s，冰水浴2min，加8ml SOC培养基，37℃ 150rpm，摇床振荡培养1h，取100μl均匀涂布LB氨卞青霉素(100ng/ml)平板37℃培养过夜，计数菌落数以计算库容量，其余液体37℃ 150rpm摇床振荡培养过夜。第二天，转化培养物用100ml 2×YT(1.6％胰蛋白胨，1％酵母膏，0.5％氯化钠)活化培养1小时，加入10ml 4×1010TU/ml的M13K07辅助噬菌体拯救，37℃，250rpm振荡培养1小时，加卡那霉素至浓度50ng/ml，37℃，250rpm振荡培养过夜。培养物5000rpm离心10分钟，取上清经0.22μm滤膜过滤，获得原代(F0代)重组噬菌体PALGn库。其转化效率为3.4×107(自连对照为0)。因此，所建文库容量为3.4×107个菌落形成单位。分子文库由12种构成元件组成：protein A的A-E domain、protein L的B1-B5 domain和protein G的G1，G2 domain，如按最长可形成5个domain的PAL分子算，每个domain均有正反两种方式插入，该库应含24+242+243+244+245即8.3×106种不同排列组合方式的外源PALGn分子，因此，我们构建的PALGn-pCANTAB5S组合文库完全能较好地包含所有的随机组合PALGn分子。
5.重组噬菌体滴度测定
将重组噬菌体10倍系列稀释，各取重组噬菌体10μl感染对数生长期的大肠杆菌TG1 100μl，37℃培养1小时后涂LB(含氨卞青霉素100ng/ml)平板，置37℃培养过夜。计数不同稀释度平皿上的菌落数，生长菌落数的稀释倍数乘以100即为每毫升噬菌体的转化单位数(transformation unit，TU)。检测结果展示F0代Ig结合分子PALGn库的重组噬菌体的滴度为4.1×1012TU/ml，用相同的方法在含卡那霉素抗性的平板上计数检测的M13K07野生型噬菌体的滴度为6.1×1012TU/ml，重组噬菌体的滴度与野生型噬菌体的滴度水平基本一致。
实施例3、Ig体外定向分子进化筛选高亲和力Ig结合分子
1.重组噬菌体库的Ig亲和筛选：
用PH 9.6的碳酸盐缓冲液200μl包被人Ig(终浓度为10μg/ml)于酶标排条板上37℃，2小时，用150μl封闭液(PBS+10％脱脂奶)封闭排条板1小时，4℃保存。用洗液(PBS+0.05％Tween20)洗5遍后用于噬菌体文库的亲和力筛选。排条板每孔加100μl封闭液和100μlPALGn重组噬菌体，37℃反应3小时，洗液(0.25％Tris+0.05％ Tween20)洗涤30遍，加100μl对数生长期的大肠杆菌TG1，37℃反应1小时，收集后取10μl、1μl、0.1μl涂LB(含氨卞青霉素100ng/ml)平板37℃过夜培养计数，用以评估噬菌体文库与Ig分子的结合情况。其余菌液加入5ml 2×YT中，37℃，250rpm振荡培养1小时，加入氨卞青霉素至100ng/ml，加1ml4×1010TU/ml的M13K07辅助噬菌体，37℃，250rpm振荡培养1小时，加卡那霉素至50ng/ml，37℃，250rpm振荡培养过夜。培养物5000rpm离心10分钟，上清经0.22μm滤膜过滤，即为Ig亲和筛选后的PALGn重组噬菌体文库。设阳性对照Protein A/phage两条作IgG同步筛选(Protein A/phage的制备：取Protein A/pCANTAB5L质粒600ng转化TG1感受态细胞，其余过程同PALGn/phage)。按上述过程，Ig亲和筛选重复4轮，同时进行每轮筛选库的滴度测定。每轮筛选均设阴性对照LT/phage两孔(LT/phage制备过程同Protein A/phage)，空白对照两孔(不加phage)，作IgG结合实验，各取10μl、1μl、0.1μl涂LB(含Amp 100ng/μl)平板37℃过夜培养计数。每轮的Ig结合实验菌落计数(空白对照均为0)及滴度测定结果如表1。由表可见PALGn/phage文库与Ig的结合能力随着筛选轮次的增加而不断提高，反应了筛选过程能有效地使文库地Ig的结合能力不断进化。
表1每轮Ig筛选过程中噬菌体文库的Ig结合菌落计数
注：F表示菌落数＞300个。
2.插入片段的PCR鉴定：噬菌体原始库及每一轮噬菌体筛选库随机挑取PALGn/phage Ig结合试验平板上单克隆菌落48个至0.5ml离心管中培养5h，以培养菌液为模板，pCANTAB5-S1为上游引物，pCANTAB5-NOT1为下游引物，进行PCR扩增以检测插入片段的大小。PCR扩增条件为94℃ 30sec；53℃ 30sec；72℃ 45sec；35个循环。设阳性对照LT/pCANTAB5L，阴性对照pCANTAB5S。该实验用以了解筛选过程中噬菌体文库中所展示的Ig结合分子分子量大小的变化情况。表2与图7-11的结果显示，随着筛选轮次的不断增加，文库中大分子量的HAIBM分子的比例不断增加，反应了筛选过程使文库中的分子不断向有利于Ig结合的方向进化。
表2各筛选轮次文库中48个随机挑选HAIBM分子中的单结构域组成的分布情况
  单结构域组成   F0   F1   F2   F3   F4
  0domain1domain2domain3domain＞3domain总计   85350048   85350048   82371048   51267948   402312948
以上结果表明每轮筛选库的IgG结合实验菌落计数、插入片段PCR阳性克隆数能迅速直观地反应体外定向进化的效果。从IgG结合条件实验菌落计数看，随着筛选轮次的增加，PALGn/phage IgG结合活性接近(F3代)并高于(F4代)阳性对照IgG结合活性；插入片段PCR鉴定结果显示阳性克隆数随着筛选轮次增加而增加并趋于稳定，阳性克隆组成也有明显变化：随着筛选轮次增加，大片段(≥2个domain)数目及其阳性百分率增加，小片段数目及其阳性百分率降低。说明经过IgG筛选，与IgG亲和力低的短片段被淘汰，而与IgG亲和力高的较长片段被筛选出来。IgG结合实验结果与插入片段PCR鉴定结果一致，均与理论相符，体现了噬菌体展示技术中利用亲和力选择的强大功效。
实施例4、高亲和力Ig结合分子(HAIBMs)的分子结构特点
从第4轮筛选所得到的噬菌体文库中，挑选插入片段较大的阳性克隆进行序列分析，阳性克隆的重组噬菌粒用DNA抽提试剂盒纯化，委托上海申能博彩公司进行序列测定，测序引物为pCANTAB5E的上、下游引物pCANTAB5-S1和pCANTAB5-S6，测序结果用DNASTAR软件分析。结果见表3-6。序列分析显示其结构域组成的多样性：(1)被选择出的分子包括由来自不同种属Ig结合分子的单个抗体结合结构域-protein A的A/B/C/D/E、protein L的B1/B2/B3/B4/B5和protein G的G1/G2重组连接形成；(2)文库中单个分子中的单结合结构域的排列方式多样，包括：B1-B2-G1-A、B3-D-B3、B1-B3-B1、G1-B2-A-B1、B1-G2-B1、D-B2-B-B3、B3-D-B3-D-B3、B-G1-B2-D-B1等等。比较各HAIBMs分子结构发现他们具有一定的排列特征：(ML-MA)n或(ML-MG)n或(ML-MA-MG)n或(ML-MG-MA)n或ML-(MA-ML)n或ML-(MG-ML)n结构，由protein L的单结构域(ML)、protein A的单结构域(MA)或protein G的单结构域(MG)间隔排列连接而成(n为该序列的重复次数)。其中的代表序列的排列方式为：B3-G1-B2-G2-B5，B2-D-G1-B5-C-G1，B5-A-B2-G1-B1，B3-D-B3，B3-D-B3-D-B3，B2-G2-A-B3-D-G1，B1-G1-B3-G1，B2-D-B3-D-B1，B2-C-B4-E-G1，B2-C-G2-B1-D-G1。在代表序列protein L、protein A、protein G的单结构域之间以核苷酸GAGCTC连接。核苷酸GAGCTC可编码接头肽EL(氨基酸单字母表示)代表序列的核苷酸序列如下：
1、代表序列B3-G1-B2-G2-B5(SEQ ID NO：13)：
AAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACACAAAC
AGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCTGACTTATTAGCAAAAGAAAATGGTA
AATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCACTTACAAATTAATCCTT
AATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTGAAGCTGTTGATGCTGCTACTGCAGAAAAAGTCTTCAAACAATACGC
TAACGACAACGGTGTTGACGGTGAATGGACTTACGACGATGCGACTAAGACCTTTACAGTTACTGAAGAGCTCAAAGAAA
AAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACACAAACAGCAGAA
TTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCAGATGCATTAAAGAAGGACAATGGAGAATATAC
AGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCACTTACAAACTTGTTATTAATGGTA
AAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTAAAGCAGTAGACGCAGAAACTGCAGAAAAAGCCTTCAAACAATACGCTAACGAC
AACGCTGTTGATGGTGTTTGGACTTATGATGATGCGACTAAGACCTTTACGGTAACTGAAGAGCTCAAGAAAGTTGACGA
AAAACCAGAAGAAAAAGAACAAGTAACAATTAAAGAAAATATATATTTTGAAGATGGAACAGTACAAACTGCAACATTTA
AAGGAACATTTGCAGAAGCGACAGCAGAAGCATACAGATATGCAGATTTGTTATCAAAAGAACATGGTAAATACACAGCA
GACTTGGAAGATGGTGGATACACTATCAACATTAGATTTGCTGGA
2、代表序列B2-D-G1-B5-C-G1(SEQ ID NO：15)：
AAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACACAAAC
AGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCAGATGCATTAAAGAAGGACAATGGAG
AATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCGCTGATGCGCAACAAAAT
AACTTCAACAAAGATCAACAAAGCGCCTTCTATGAAATTTTGAACATGCCTAACTTAAACGAAGCGCAACGCAATGGTTT
CATTCAAAGTCTTAAAGACGATCCAAGCCAAAGCACTAACGTTTTAGGTGAAGCTAAAAAATTAAACGAATCTCAAGCAC
CGAAAGAGCTCACTTACAAATTAATCCTTAATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTGAAGCTGTTGATGCTGCT
ACTGCAGAAAAAGTCTTCAAACAATACGCTAACGACAACGGTGTTGACGGTGAATGGACTTACGACGATGCGACTAAGAC
CTTTACAGTTACTGAAGAGCTCAAGAAAGTTGACGAAAAACCAGAAGAAAAAGAACAAGTAACAATTAAAGAAAATATAT
ATTTTGAAGATGGAACAGTACAAACTGCAACATTTAAAGGAACATTTGCAGAAGCGACAGCAGAAGCATACAGATATGCA
GATTTGTTATCAAAAGAACATGGTAAATACACAGCAGACTTGGAAGATGGTGGATACACTATCAACATTAGATTTGCTGG
AGAGCTCGCTGACAACAAATTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATTTTACATTTACCTAACTTAACTGAAG
AACAACGTAACGGCTTCATCCAAAGCCTTAAAGACGATCCTTCAGTGAGCAAAGAAATTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTA
AACGATGCTCAAGCACCAAAAGAGCTCACTTACAAATTAATCCTTAATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTGA
AGCTGTTGATGCTGCTACTGCAGAAAAAGTCTTCAAACAATACGCTAACGACAACGGTGTTGACGGTGAATGGACTTACG
ACGATGCGACTAAGACCTTTACAGTTACTGAA
3、代表序列B5-A-B2-G1-B1(SEQ ID NO：17)：
AAGAAAGTTGACGAAAAACCAGAAGAAAAAGAACAAGTAACAATTAAAGAAAATATATATTTTGAAGATGGAACAGTACA
AACTGCAACATTTAAAGGAACATTTGCAGAAGCGACAGCAGAAGCATACAGATATGCAGATTTGTTATCAAAAGAACATG
GTAAATACACAGCAGACTTGGAAGATGGTGGATACACTATCAACATTAGATTTGCTGGAGAGCTCGCTGACAACAATTTC
AACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTGAACATGCCTAACTTGAACGAAGAACAACGCAATGGTTTCATCCA
AAGCTTAAAAGATGACCCAAGTCAAAGTGCTAACCTATTGTCAGAAGCTAAAAAGTTAAATGAATCTCAAGCACCGAAAG
AGCTCAAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACA
CAAACAGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCAGATGCATTAAAGAAGGACAA
TGGAGAATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCACTTACAAATTAA
TCCTTAATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTGAAGCTGTTGATGCTGCTACTGCAGAAAAAGTCTTCAAACAA
TACGCTAACGACAACGGTGTTGACGGTGAATGGACTTACGACGATGCGACTAAGACCTTTACAGTTACTGAAGAGCTCAA
AGAAGAAACACCAGAAACACCAGAAACTGATTCAGAAGAAGAAGTAACAATCAAAGCTAACCTAATCTTTGCAAATGGAA
GCACACAAACTGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAAAAGCAACATCAGAAGCTTATGCGTATGCAGATACTTTGAAGAAA
GACAATGGAGAATATACTGTAGATGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGA
4、代表序列B3-D-B3(SEQ ID NO：19)：
AAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACACAAAC
AGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCTGACTTATTAGCAAAAGAAAATGGTA
AATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCGCTGATGCGCAACAAAAT
AACTTCAACAAAGATCAACAAAGCGCCTTCTATGAAATTTTGAACATGCCTAACTTAAACGAAGCGCAACGCAATGGTTT
CATTCAAAGTCTTAAAGACGATCCAAGCCAAAGCACTAACGTTTTAGGTGAAGCTAAAAAATTAAACGAATCTCAAGCAC
CGAAAGAGCTCAAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGA
AAAACACAAACAGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCTGACTTATTAGCAAA
AGAAAATGGTAAATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGA
5、代表序列B3-D-B3-D-B3(SEQ ID NO：21)：
AAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACACAAAC
AGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCTGACTTATTAGCAAAAGAAAATGGTA
AATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCGCTGATGCGCAACAAAAT
AACTTCAACAAAGATCAACAAAGCGCCTTCTATGAAATTTTGAACATGCCTAACTTAAACGAAGCGCAACGCAATGGTTT
CATTCAAAGTCTTAAAGACGATCCAAGCCAAAGCACTAACGTTTTAGGTGAAGCTAAAAAATTAAACGAATCTCAAGCAC
CGAAAGAGCTCAAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGA
AAAACACAAACAGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCTGACTTATTAGCAAA
AGAAAATGGTAAATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCGCTGATG
CGCAACAAAATAACTTCAACAAAGATCAACAAAGCGCCTTCTATGAAATTTTGAACATGCCTAACTTAAACGAAGCGCAA
CGCAATGGTTTCATTCAAAGTCTTAAAGACGATCCAAGCCAAAGCACTAACGTTTTAGGTGAAGCTAAAAAATTAAACGA
ATCTCAAGCACCGAAAGAGCTCAAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCT
ATGCAGATGGAAAAACACAAACAGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCTGAC
TTATTAGCAAAAGAAAATGGTAAATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGA
6、代表序列B2-G2-A-B3-D-G1(SEQ ID NO：23)：
AAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACACAAAC
AGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCAGATGCATTAAAGAAGGACAATGGAG
AATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCACTTACAAACTTGTTATT
AATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTAAAGCAGTAGACGCAGAAACTGCAGAAAAAGCCTTCAAACAATACGC
TAACGACAACGCTGTTGATGGTGTTTGGACTTATGATGATGCGACTAAGACCTTTACGGTAACTGAAGAGCTCGCTGACA
ACAATTTCAACAAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATCTTGAACATGCCTAACTTGAACGAAGAACAACGCAATGGT
TTCATCCAAAGCTTAAAAGATGACCCAAGTCAAAGTGCTAACCTATTGTCAGAAGCTAAAAAGTTAAATGAATCTCAAGC
ACCGAAAGAGCTCAAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATG
GAAAAACACAAACAGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCTGACTTATTAGCA
AAAGAAAATGGTAAATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCGCTGA
TGCGCAACAAAATAACTTCAACAAAGATCAACAAAGCGCCTTCTATGAAATTTTGAACATGCCTAACTTAAACGAAGCGC
AACGCAATGGTTTCATTCAAAGTCTTAAAGACGATCCAAGCCAAAGCACTAACGTTTTAGGTGAAGCTAAAAAATTAAAC
GAATCTCAAGCACCGAAAGAGCTCACTTACAAATTAATCCTTAATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTGAAGC
TGTTGATGCTGCTACTGCAGAAAAAGTCTTCAAACAATACGCTAACGACAACGGTGTTGACGGTGAATGGACTTACGACG
ATGCGACTAAGACCTTTACAGTTACTGAA
 7、代表序列B1-G1-B3-G1(SEQ ID NO：25)：
AAAGAAGAAACACCAGAAACACCAGAAACTGATTCAGAAGAAGAAGTAACAATCAAAGCTAACCTAATCTTTGCAAATGG
AAGCACACAAACTGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAAAAGCAACATCAGAAGCTTATGCGTATGCAGATACTTTGAAGA
AAGACAATGGAGAATATACTGTAGATGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCACTTAC
AAATTAATCCTTAATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTGAAGCTGTTGATGCTGCTACTGCAGAAAAAGTCTT
CAAACAATACGCTAACGACAACGGTGTTGACGGTGAATGGACTTACGACGATGCGACTAAGACCTTTACAGTTACTGAAG
AGCTCAAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACA
CAAACAGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCTGACTTATTAGCAAAAGAAAA
TGGTAAATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCACTTACAAATTAA
TCCTTAATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTGAAGCTGTTGATGCTGCTACTGCAGAAAAAGTCTTCAAACAA
TACGCTAACGACAACGGTGTTGACGGTGAATGGACTTACGACGATGCGACTAAGACCTTTACAGTTACTGAA
8、代表序列B2-D-B3-D-B1(SEQ ID NO：27)：
AAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACACAAAC
AGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCAGATGCATTAAAGAAGGACAATGGAG
AATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCGCTGATGCGCAACAAAAT
AACTTCAACAAAGATCAACAAAGCGCCTTCTATGAAATTTTGAACATGCCTAACTTAAACGAAGCGCAACGCAATGGTTT
CATTCAAAGTCTTAAAGACGATCCAAGCCAAAGCACTAACGTTTTAGGTGAAGCTAAAAAATTAAACGAATCTCAAGCAC
CGAAAGAGCTCAAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGA
AAAACACAAACAGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCTGACTTATTAGCAAA
AGAAAATGGTAAATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCGCTGATG
CGCAACAAAATAACTTCAACAAAGATCAACAAAGCGCCTTCTATGAAATTTTGAACATGCCTAACTTAAACGAAGCGCAA
CGCAATGGTTTCATTCAAAGTCTTAAAGACGATCCAAGCCAAAGCACTAACGTTTTAGGTGAAGCTAAAAAATTAAACGA
ATCTCAAGCACCGAAAGAGCTCAAAGAAGAAACACCAGAAACACCAGAAACTGATTCAGAAGAAGAAGTAACAATCAAAG
CTAACCTAATCTTTGCAAATGGAAGCACACAAACTGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAAAAGCAACATCAGAAGCTTAT
GCGTATGCAGATACTTTGAAGAAAGACAATGGAGAATATACTGTAGATGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAA
ATTTGCTGGA
9、代表序列B2-C-B4-E-G1(SEQ ID NO：29)：
AAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACACAAAC
AGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCAGATGCATTAAAGAAGGACAATGGAG
AATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCGCTGACAACAAATTCAAC
AAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATTTTACATTTACCTAACTTAACTGAAGAACAACGTAACGGCTTCATCCAAAG
CCTTAAAGACGATCCTTCAGTGAGCAAAGAAATTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAACGATGCTCAAGCACCAAAAGAGC
TCAAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACTCAA
ACAGCAGAGTTCAAAGGAACATTTGCAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATACGCTGACTTATTAGCAAAAGAAAATGG
TAAATATACAGCAGACTTAGAAGATGGTGGATACACTATTAATATTAGATTTGCAGGTGAGCTCGCTCAACAAAATGCTT
TTTATCAAGTCTTAAATATGCCTAACTTAAATGCTGATCAACGCAATGGTTTTATCCAAAGCCTTAAAGATGATCCAAGC
CAAAGTGCTAACGTTTTAGGTGAAGCTAAAAGATTAAACGAATTTCAAGCACCGAAAGAGCTCACTTACAAATTAATCCT
TAATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTGAAGCTGTTGATGCTGCTACTGCAGAAAAAGTCTTCAAACAATACG
CTAACGACAACGGTGTTGACGGTGAATGGACTTACGACGATGCGACTAAGACCTTTACAGTTACTGAA
10、代表序列B2-C-G2-B1-D-G1(SEQ ID NO：31)：
AAAGAAAAAACACCAGAAGAACCAAAAGAAGAAGTTACTATTAAAGCAAACTTAATCTATGCAGATGGAAAAACACAAAC
AGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAGAAGCAACAGCAGAAGCATACAGATATGCAGATGCATTAAAGAAGGACAATGGAG
AATATACAGTAGACGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGGAGAGCTCGCTGACAACAAATTCAAC
AAAGAACAACAAAATGCTTTCTATGAAATTTTACATTTACCTAACTTAACTGAAGAACAACGTAACGGCTTCATCCAAAG
CCTTAAAGACGATCCTTCAGTGAGCAAAGAAATTTTAGCAGAAGCTAAAAAGCTAAACGATGCTCAAGCACCAAAAGAGC
TCACTTACAAACTTGTTATTAATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAACAACTACTAAAGCAGTAGACGCAGAAACTGCAGAA
AAAGCCTTCAAACAATACGCTAACGACAACGCTGTTGATGGTGTTTGGACTTATGATGATGCGACTAAGACCTTTACGGT
AACTGAAGAGCTCAAAGAAGAAACACCAGAAACACCAGAAACTGATTCAGAAGAAGAAGTAACAATCAAAGCTAACCTAA
TCTTTGCAAATGGAAGCACACAAACTGCAGAATTCAAAGGAACATTTGAAAAAGCAACATCAGAAGCTTATGCGTATGCA
GATACTTTGAAGAAAGACAATGGAGAATATACTGTAGATGTTGCAGATAAAGGTTATACTTTAAATATTAAATTTGCTGG
AGAGCTCGCTGATGCGCAACAAAATAACTTCAACAAAGATCAACAAAGCGCCTTCTATGAAATTTTGAACATGCCTAACT
TAAACGAAGCGCAACGCAATGGTTTCATTCAAAGTCTTAAAGACGATCCAAGCCAAAGCACTAACGTTTTAGGTGAAGCT
AAAAAATTAAACGAATCTCAAGCACCGAAAGAGCTCACTTACAAATTAATCCTTAATGGTAAAACATTGAAAGGCGAAAC
AACTACTGAAGCTGTTGATGCTGCTACTGCAGAAAAAGTCTTCAAACAATACGCTAACGACAACGGTGTTGACGGTGAAT
GGACTTACGACGATGCGACTAAGACCTTTACAGTTACTGAA
代表序列的氨基酸序列(氨基酸单字母表示)如下：
1、代表序列B3-G1-B2-G2-B5(SEQ ID NO：14)：
KEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAGELTYKLIL
NGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEELKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAE
FKGTFEEATAEAYRYADALKKDNGEYTVDVADKGYTLNIKFAGELTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYAND
NAVDGVWTYDDATKTFTVTEELKKVDEKPEEKEQVTIKENIYFEDGTVQTATFKCTFAEATAEAYRYADLLSKEHGKYTA
DLEDGGYTINIRFAG
2、代表序列B2-D-G1-B5-C-G1(SEQ ID NO：16)：
KEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADALKKDNGEYTVDVADKGYTLNIKFAGELADAQQN
NFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKELTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAA
TAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEELKKVDEKPEEKEQVTIKENIYFEDGTVQTATFKGTFAEATAEAYRYA
DLLSKEHGKYTADLEDGGYTINIRFAGELADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKL
NDAQAPKELTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE
3、代表序列B5-A-B2-G1-B1(SEQ ID NO：18)：
KKVDEKPEEKEQVTIKENIYFEDGTVQTATFKGTFAEATAEAYRYADLLSKEHGKYTADLEDGGYTINIRFAGELADNNF
NKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKELKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKT
QTAEFKGTFEEATAEAYRYADALKKDNGEYTVDVADKGYTLNIKFAGELTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQ
YANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEELKEETPETPETDSEEEVTIKANLIFANGSTQTAEFKGTFEKATSEAYAYADTLKK
DNGEYTVDVADKGYTLNIKFAG
4、代表序列B3-D-B3(SEQ ID NO：20)：
KEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAGELADAQQN
NFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKELKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADG
KTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAG
5、代表序列B3-D-B3-D-B3(SEQ ID NO：22)：
KEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAGELADAQQN
NFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKELKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADG
KTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAGELADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQ
RNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKELKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYAD
LLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAG
6、代表序列B2-G2-A-B3-D-G1(SEQ ID NO：24)：
KEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADALKKDNGEYTVDVADKGYTLNIKFAGELTYKLVI
NGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNAVDGVWTYDDATKTFTVTEELADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNG
FIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKELKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLA
KENGKYTVDVADKGYTLNIKFAGELADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLN
ESQAPKELTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE
7、代表序列B1-G1-B3-G1(SEQ ID NO：26)：
KEETPETPETDSEEEVTIKANLIFANGSTQTAEFKGTFEKATSEAYAYADTLKKDNGEYTVDVADKGYTLNIKFAGELTY
KLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTEELKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKT
QTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAGELTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQ
YANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE
8、代表序列B2-D-B3-D-B1(SEQ ID NO：28)：
KEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADALKKDNGEYTVDVADKGYTLNIKFAGELADAQQN
NFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKELKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADG
KTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADLLAKENGKYTVDVADKGYTLNIKFAGELADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQ
RNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKELKEETPETPETDSEEEVTIKANLIFANGSTQTAEFKGTFEKATSEAY
AYADTLKKDNGEYTVDVADKGYTLNIKFAG
9、代表序列B2-C-B4-E-G1(SEQ ID NO：30)：
KEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADALKKDNGEYTVDVADKGYTLNIKFAGELADNKFN
KEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPKELKEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQ
TAEFKGTFAEATAEAYRYADLLAKENGKYTADLEDGGYTINIRFAGELAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPS
QSANVLGEAKRLNEFQAPKELTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE
10、代表序列B2-C-G2-B1-D-G1(SEQ ID NO：32)：
KEKTPEEPKEEVTIKANLIYADGKTQTAEFKGTFEEATAEAYRYADALKKDNGEYTVDVADKGYTLNIKFAGELADNKFN
KEQQNAFYEILHLPNLTEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPKELTYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAE
KAFKQYANDNAVDGVWTYDDATKTFTVTEELKEETPETPETDSEEEVTIKANLIFANGSTQTAEFKGTFEKATSEAYAYA
DTLKKDNGEYTVDVADKGYTLNIKFAGELADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEA
KKLNESQAPKELTYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE
实施例5、展示HAIBM的重组噬菌体的抗体结合活性测定
为了测定重组噬菌体所展示的HAIBM与抗体的结合能力，将阳性单克隆重组噬菌粒转化TG1，制成单克隆HAIBM重组噬菌体(噬菌体制备方法同前)，将各单克隆重组噬菌体和M13K07辅助噬菌体用2×YT培养基调整至相同滴度(1.0×1012TU/ml)，分别取各单克隆噬菌体100μl加入人Ig抗体包板的反应孔中，37℃孵育3小时后洗涤50次。将反应后的样品分成两组，第一组在重组噬菌体和M13K07与抗体结合后的样孔中每孔加入100μl大肠杆菌TG1(OD600＝0.2)，37℃孵育1小时后，取1μl单克隆重组噬菌体感染菌液涂布于氨苄青霉素抗性平皿上计数，对照的M13K07辅助噬菌体感染菌液涂布于氨苄青霉素抗性平皿上计数，用于检测被人Ig特异吸附的重组噬菌体的数量，检测结果见表3。第二组在重组噬菌体和M13K07与抗体结合后的样孔中每孔加入噬菌体抗体HRP/Anti-M13conjugate(Amersham pharmaciabiotech公司，工作浓度为1∶5000稀释)，37℃孵育45分钟后加入TMB显色，测OD450nm值，用于检测被人IgG特异吸附的重组噬菌体的数量，检测结果见表3。
表3各HAIBM单克隆噬菌体的人IgG抗体结合试验
  单克隆噬菌体中的分子组成  大肠杆菌TG1感染菌落数   HRP抗噬菌体OD450NM检
  1234567891011121314151617   SPALB3-G1-LB2-G2-LB5LB1-A-LB3LB1-A-LB4-B-G1LB2-D-G1-LB5-C-G1LB3-B-LB3-ALB5-A-LB2-G1-LB1LB3-D-LB3LB3-D-LB3-D-LB3LB2-G2-A-LB3-D-G1LB1-G1-LB3-G1LB4-G2-LB2LB2-D-LB3-D-LB1LB2-C-LB4-E-G1LB2-C-G2-LB1-D-G1LB1-C-LB1M13K07   415＞500328453＞500272＞500＞500＞500＞500＞500398＞500＞500＞50041356   1.5382.2511.2471.6262.1191.3721.9312.0432.2512.0171.9431.4852.1962.0052.1131.4340.233
注：各噬菌体滴度均为1.0×1012TU/ml
从表3的大肠杆菌TG1感染菌落数测定结果可见，展示有单克隆HAIBM分子的噬菌体能被人IgG结合固定，并在投入噬菌体滴度在1.0×1012时存在高低不同的IgG结合活性。而对照野生型噬菌体M13K07滴度在1.0×1012时检测不到与人IgG结合的噬菌体。酶联检测显色的检测结果与上述大肠杆菌TG1感染菌落数测定结果基本一致。该结果说明融合在PIII蛋白N端的HAIBM分子具有Ig结合活性，展示具有序列B3-G1-B2-G2-B5，B2-D-G1-B5-C-G1，B5-A-B2-G1-B1，B3-D-B3，B3-D-B3-D-B3，B2-G2-A-B3-D-G1，B1-G1-B3-G1，B2-D-B3-D-B1，B2-C-B4-E-G1，B2-C-G2-B1-D-G1阳性噬菌体与人Ig结合活性都高于展示葡萄球菌A蛋白(SPA)的噬菌体。
实施例6高亲和力Ig结合分子(HAIBMs)的功能
设计引物，上游引物引入Nco I位点，下游引物引入Sal I位点，PCR扩增阳性克隆序列，酶切回收后将HAIBMs克隆于pET32a载体中的Nco I和Sal I位点中，IPTG诱导表达HAIBMs蛋白，Ni-NTA柱纯化获得纯化蛋白HAIBMs，ELISA检测纯化蛋白HAIBMs的活性，用碳酸盐缓冲液包被各种纯化HAIBM蛋白(1∶100)包被于排条板上，设阳性对照SPA(1∶100)，阴性对照LT(1∶100)37℃2h后4℃过夜，加入不同稀释度的浓度为1mg/ml的辣根过氧化物酶(HRP)标记的人免疫球蛋白分子(HRP一人Ig)，37℃孵育45分钟，PBS洗液洗涤4次，OPD显色，酶联检测仪读取492nm处OD值。由表4的结果显示各种纯化HAIBM蛋白与人Ig有特异的结合活性，其中编码序列具有B3-G1-B2-G2-B5，B2-D-G1-B5-C-G1，B5-A-B2-G1-B1，B3-D-B3，B3-D-B3-D-B3，B2-G2-A-B3-D-G1，B1-G1-B3-G1，B2-D-B3-D-B1，B2-C-B4-E-G1，B2-C-G2-B1-D-G1连接方式的融合基因编码的分子结合活性高于SPA。
表4 HAIBM纯化蛋白与人Ig结合活性检测
  纯化HAIBM   HRP-人Ig稀释度(1MG/ML)
  1∶100   1∶200   1∶400   1∶800   1∶1600   1∶3200   1∶6400   1∶12800
  阴性对照LT   0.289   0.146   0.076   0.056   0.027   0.029   0.010   0.001
  阳性对照SPA   2.073   2.055   1.429   0.820   0.430   0.224   0.172   0.090
  LB3-G1-LB2-G2-LB5   2.255   2.117   1.956   1.862   1.342   0.955   0.515   0.323
  LB1-A-LB3   1.873   1.704   1.331   0.680   0.318   0.180   0.092   0.072
  LB1-A-LB4-B-G1   1.953   1.937   1.618   1.425   0.820   0.525   0.380   0.257
  LB2-D-G1-LB5-C-G1 2.110 1.998 1.730 1.632 0.926 0.530 0.316 0.240
  LB3-B-LB3-A   1.924   1.757   1.424   0.756   0.320   0.224   0.136   0.009
  LB5-A-LB2-G1-LB1   2.123   1.996   1.755   1.628   0.910   0.572   0.328   0.225
  LB3-D-LB3   2.080   2.069   1.613   1.580   0.877   0.448   0.346   0.112
  LB3-D-LB3-D-LB3   2.366   2.359   2.018   1.912   1.765   1.230   0.856   0.512
  LB2-G2-A-LB3-D-G1 2.271 2.150 1.978 1.794 1.216 0.874 0.530 0.251
  LB1-G1-LB3-G1   2.045   1.923   1.767   1.673   1.065   0.654   0.320   0.203
LB4-G2-LB2 2.083 2.020 1.413 0.806 0.410 0.212   0.2143 0.088
  LB2-D-LB3-D-LB1   2.296   2.175   2.010   1.991   1.659   1.180   0.784   0.464
  LB2-C-LB4-E-G1   2.225   2.151   1.910   1.712   1.218   0.717   0.528   0.336
  LB2-C-G2-LB1-D-G1   2.013   2.007   1.873   1.716   1.115   0.719   0.551   0.313
  LB1-C-LB1   1.930   2.073   1.660   0.911   0.525   0.340   0.275   0.118
实施例7高亲和力Ig结合分子(HAIBMs)的应用
将HCV抗原包被于酶标排条板上，洗涤后，加入10μl丙肝病人的血清和90μl PBS，37℃ 1h作用后用洗液(PBS+0.05％Tween20)洗5遍，去除未结合的抗体，加入100μl滴度为1.0×1010TU/ml的各种HAIBM单克隆重组噬菌体37℃ 1h，设阴性对照LT/Phage，阳性对照PA/phage。再用洗液(PBS+0.05％Tween20)洗5遍，去除重组噬菌体。实验分成两组检测酶标排条板上所结合的重组噬菌体，第一组每孔加入100μl的大肠杆菌TG1，感染1h后，取单克隆重组噬菌体感染菌液100μl涂布于氨苄青霉素抗性平皿上计数；第二组每孔加100μl噬菌体抗体HRP/Anti-M13 conjugate，37℃反应1h后TMB显色，450nm处OD值检测。HCV抗原包被浓度为(2μg/ml)，结果见表5，表6。
表5应用HAIBM单克隆噬菌体检测抗-HCV试验(感染菌落数计数法)
单克隆HAIBM   大肠杆菌TG1感染菌落数
  HCV阳性血清样品   HCV阴性血清样品
  1#   2#   3#   4#   1#   2#   3#   4#
  1   阴性对照LT   5   2   0   4   3   3   2   0
  2   阳性对照SPA   79   86   53   92   5   3   3   0
  3   LB3-G1-LB2-G2-LB5   126   113   111   127   2   0   5   1
  4   LB1-A-LB3   39   78   50   64   11   8   5   0
  5   LB1-A-LB4-B-G1   93   49   39   65   3   2   0   0
  6   LB2-D-G1-LB5-C-G1   102   117   97   72   4   5   1   0
  7   LB3-B-LB3-A   74   98   50   65   0   13   0   18
  8   LB5-A-LB2-G1-LB1   93   76   134   128   9   6   14   3
  9   LB3-D-LB3   97   94   114   98   3   2   0   1
  10   LB3-D-LB3-D-LB3   171   144   128   167   1   2   3   0
  11   LB2-G2-A-LB3-D-G1   123   128   160   141   1   0   3   0
  12   LB1-G1-LB3-G1   111   131   125   96   12   4   10   9
  13   LB4-G2-LB2   64   32   56   73   3   2   0   0
  14   LB2-D-LB3-D-LB1   136   167   118   121   2   1   3   1
  15   LB2-C-LB4-E-G1   118   142   131   116   17   8   0   7
  16   LB2-C-G2-LB1-D-G1   117   124   119   158   3   0   5   1
  17   LB1-C-LB1   76   110   63   94   2   0   6   0
注：各噬菌体滴度均为1.0×1010U/ml
表6应用HAIBM单克隆噬菌体检测抗-HCV试验(酶联检测显色法)
单克隆HAIBM   HCV阳性血清样品(OD450NM)   HCV阴性血清样品(CD450NM)
  1#   2#   3#   4#   1#   2#   3#   4#
  1   阴性对照LT   0.069   0.046   0.076   0.056   0.037   0.044   0.010   0.053
  2   阳性对照SPA   1.133   1.218   0.891   1.096   0.022   0.036   0.045   0.039
  3   LB3-G1-LB2-G2-LB5   1.855   1.317   1.356   1.662   0.042   0.036   0.055   0.051
  4   LB1-A-LB3   0.873   1.104   0.710   1.280   0.038   0.032   0.022   0.035
  5   LB1-A-LB4-B-G1   1.223   0.837   1.018   1.125   0.023   0.025   0.040   0.011
  6   LB2-D-G1-LB5-C-G1   1.710   1.698   1.430   1.230   0.031   0.043   0.036   0.031
  7   LB3-B-LB3-A   0.924   0.457   0.524   0.756   0.024   0.022   0.036   0.019
  8   LB5-A-LB2-G1-LB1   1.523   1.185   1.792   1.328   0.033   0.072   0.058   0.046
  9   LB3-D-LB3   1.673   1.359   1.313   1.583   0.073   0.064   0.051   0.074
  10   LB3-D-LB3-D-LB3   1.921   1.759   1.718   1.812   0.065   0.047   0.073   0.047
  11   LB2-G2-A-LB3-D-G1   1.671   1.550   1.478   1.794   0.056   0.030   0.037   0.040
  12   LB1-G1-LB3-G1   1.545   1.633   1.567   1.373   0.045   0.024   0.022   0.054
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  14   LB2-D-LB3-D-LB1   1.796   1.615   1.578   1.761   0.059   0.014   0.065   0.074
  15   LB2-C-LB4-E-G1   1.625   1.851   1.510   1.712   0.118   0.071   0.062   0.056
  16   LB2-C-G2-LB1-D-G1   1.813   1.601   1.573   1.816   0.115   0.079   0.062   0.073
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注：各噬菌体滴度均为1.0×1012U/ml
由表5和表6可见，展示有单克隆HAIBM的噬菌体能与人抗-HCV阳性抗体反应，并在投入噬菌体滴度在1.0×1012时存在高低不同的抗体结合活性。而对照LT滴度在1.0×1012时基本无抗体结合活性。酶联检测显色的检测结果与上述大肠杆菌TG1感染菌落数测定结果基本一致。该结果证实了HAIBMs分子具有很好的人Ig结合功能，并具有可应用于酶联免疫吸附试验(ELISA法)、免疫层析检测、免疫组化等免疫学诊断及抗体的检测和纯化中的用途。
                            序列表
<110>上海润龙生物科技有限公司
<120>一种高亲和力免疫球蛋白结合分子及其制备方法
<130>040183
<160>32
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>228
<212>DNA
<213>Peptostreptococcus magnus
<400>1
aaagaagaaa caccagaaac accagaaact gattcagaag aagaagtaac aatcaaagct     60
aacctaatct ttgcaaatgg aagcacacaa actgcagaat tcaaaggaac atttgaaaaa    120
gcaacatcag aagcttatgc gtatgcagat actttgaaga aagacaatgg agaatatact    180
gtagatgttg cagataaagg ttatacttta aatattaaat ttgctgga                 228
<210>2
<211>216
<212>DNA
<213>Peptostreptococcus magnus
<400>2
aaagaaaaaa caccagaaga accaaaagaa gaagttacta ttaaagcaaa cttaatctat     60
gcagatggaa aaacacaaac agcagaattc aaaggaacat ttgaagaagc aacagcagaa    120
gcatacagat atgcagatgc attaaagaag gacaatggag aatatacagt agacgttgca    180
gataaaggtt atactttaaa tattaaattt gctgga                              216
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<211>216
<212>DNA
<213>Peptostreptococcus magnus
<400>3
aaagaaaaaa caccagaaga accaaaagaa gaagttacta ttaaagcaaa cttaatctat     60
gcagatggaa aaacacaaac agcagaattc aaaggaacat ttgaagaagc aacagcagaa    120
gcatacagat atgctgactt attagcaaaa gaaaatggta aatatacagt agacgttgca    180
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<211>216
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<213>Peptostreptococcus magnus
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aaagaaaaaa caccagaaga accaaaagaa gaagttacta ttaaagcaaa cttaatctat     60
gcagatggaa aaactcaaac agcagagttc aaaggaacat ttgcagaagc aacagcagaa    120
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<210>5
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<212>DNA
<213>Peptostreptococcus magnus
<400>5
aagaaagttg acgaaaaacc agaagaaaaa gaacaagtaa caattaaaga aaatatatat     60
tttgaagatg gaacagtaca aactgcaaca tttaaaggaa catttgcaga agcgacagca    120
gaagcataca gatatgcaga tttgttatca aaagaacatg gtaaatacac agcagacttg    180
gaagatggtg gatacactat caacattaga tttgctgga                           219
<210>6
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<212>DNA
<213>Staphylococcus aureus
<400>6
gctgacaaca atttcaacaa agaacaacaa aatgctttct atgaaatctt gaacatgcct     60
aacttgaacg aagaacaacg caatggtttc atccaaagct taaaagatga cccaagtcaa    120
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<210>7
<211>174
<212>DNA
<213>Staphylococcus aureus
<400>7
gcggataaca aattcaacaa agaacaacaa aatgctttct atgaaatctt acatttacct     60
aacttaaacg aagaacaacg caatggtttc atccaaagct taaaagatga cccaagccaa    120
agcgctaacc ttttagcaga agctaaaaag ctaaatgatg cacaagcacc aaaa          174
<210>8
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<212>DNA
<213>Staphylococcus aureus
<400>8
gctgacaaca aattcaacaa agaacaacaa aatgctttct atgaaatttt acatttacct     60
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<210>9
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gctgatgcgc aacaaaataa cttcaacaaa gatcaacaaa gcgccttcta tgaaattttg     60
aacatgccta acttaaacga agcgcaacgc aatggtttca ttcaaagtct taaagacgat    120
ccaagccaaa gcactaacgt tttaggtgaa gctaaaaaat taaacgaatc tcaagcaccg    180
aaa                                                                  183
<210>10
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<212>DNA
<213>Staphylococcus aureus
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gctcaacaaa atgcttttta tcaagtctta aatatgccta acttaaatgc tgatcaacgc     60
aatggtttta tccaaagcct taaagatgat ccaagccaaa gtgctaacgt tttaggtgaa    120
gctaaaagat taaacgaatt tcaagcaccg aaa                                 153
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<211>165
<212>DNA
<213>Streptococcus sp.
<400>11
acttacaaat taatccttaa tggtaaaaca ttgaaaggcg aaacaactac tgaagctgtt     60
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gaatggactt acgacgatgc gactaagacc tttacagtta ctgaa                    165
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<211>165
<212>DNA
<213>Streptococcus sp.
<400>12
acttacaaac ttgttattaa tggtaaaaca ttgaaaggcg aaacaactac taaagcagta     60
gacgcagaaa ctgcagaaaa agccttcaaa caatacgcta acgacaacgc tgttgatggt    120
gtttggactt atgatgatgc gactaagacc tttacggtaa ctgaa                   165
<210>13
<211>1005
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>其编码蛋白能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合基因
<400>13
aaagaaaaaa caccagaaga accaaaagaa gaagttacta ttaaagcaaa cttaatctat    60
gcagatggaa aaacacaaac agcagaattc aaaggaacat ttgaagaagc aacagcagaa   120
gcatacagat atgctgactt attagcaaaa gaaaatggta aatatacagt agacgttgca   180
gataaaggtt atactttaaa tattaaattt gctggagagc tcacttacaa attaatcctt   240
aatggtaaaa cattgaaagg cgaaacaact actgaagctg ttgatgctgc tactgcagaa   300
aaagtcttca aacaatacgc taacgacaac ggtgttgacg gtgaatggac ttacgacgat   360
gcgactaaga cctttacagt tactgaagag ctcaaagaaa aaacaccaga agaaccaaaa   420
gaagaagtta ctattaaagc aaacttaatc tatgcagatg gaaaaacaca aacagcagaa   480
ttcaaaggaa catttgaaga agcaacagca gaagcataca gatatgcaga tgcattaaag   540
aaggacaatg gagaatatac agtagacgtt gcagataaag gttatacttt aaatattaaa   600
tttgctggag agctcactta caaacttgtt attaatggta aaacattgaa aggcgaaaca   660
actactaaag cagtagacgc agaaactgca gaaaaagcct tcaaacaata cgctaacgac   720
aacgctgttg atggtgtttg gacttatgat gatgcgacta agacctttac ggtaactgaa   780
gagctcaaga aagttgacga aaaaccagaa gaaaaagaac aagtaacaat taaagaaaat   840
atatattttg aagatggaac agtacaaact gcaacattta aaggaacatt tgcagaagcg   900
acagcagaag catacagata tgcagatttg ttatcaaaag aacatggtaa atacacagca   960
gacttggaag atggtggata cactatcaac attagatttg ctgga                  1005
<210>14
<211>335
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合蛋白
<400>14
Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala
1               5                   10                  15
Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly
            20                  25                  30
Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu
        35                  40                  45
Ala Lys Glu Ash Gly Lys Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr
    50                  55                  60
Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly Glu Leu Thr Tyr Lys Leu Ile Leu
65                  70                  75                  80
Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala
                85                  90                  95
Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val
            100                 105                 110
Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr
        115                 120                 125
Glu Glu Leu Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr
    130                 135                 140
Ile Lys Ala Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu
145                 150                 155                 160
Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala
                165                 170                 175
Asp Ala Leu Lys Lys Asp Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp
             180                 185                 190
Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly Glu Leu Thr Tyr Lys
        195                 200                 205
Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala
    210                 215                 220
Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu Lys Ala Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp
225                 230                 235                 240
Asn Ala Val Asp Gly Val Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe
                245                 250                 255
Thr Val Thr Glu Glu Leu Lys Lys Val Asp Glu Lys Pro Glu Glu Lys
            260                 265                 270
Glu Gln Val Thr Ile Lys Glu Asn Ile Tyr Phe Glu Asp Gly Thr Val
        275                 280                 285
Gln Thr Ala Thr Phe Lys Gly Thr Phe Ala Glu Ala Thr Ala Glu Ala
    290                 295                 300
Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ser Lys Glu His Gly Lys Tyr Thr Ala
305                 310                 315                 320
Asp Leu Glu Asp Gly Gly Tyr Thr Ile Asn Ile Arg Phe Ala Gly
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<211>1152
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>其编码蛋白是能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合基因
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<212>PRT
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<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合蛋白
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Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala
1               5                   10                  15
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<211>1026
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>其编码蛋白是能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合基因
<400>17
aagaaagttg acgaaaaacc agaagaaaaa gaacaagtaa caattaaaga aaatatatat     60
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<223>能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合蛋白
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<223>能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合蛋白
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<223>能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合蛋白
<400>26
Lys Glu Glu Thr Pro Glu Thr Pro Glu Thr Asp Ser Glu Glu Glu Val
1               5                   10                  15
Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Phe Ala Asn Gly Ser Thr Gln Thr Ala
            20                  25                  30
Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Lys Ala Thr Ser Glu Ala Tyr Ala Tyr
        35                  40                  45
Ala Asp Thr Leu Lys Lys Asp Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp Val Ala
    50                  55                  60
Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly Glu Leu Thr Tyr
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu
                85                  90                  95
Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn
            100                 105                 110
Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr
        115                 120                 125
Phe Thr Val Thr Glu Glu Leu Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys
    130                 135                 140
Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr
145                 150                 155                 160
Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala
                165                 170                 175
Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Thr Val
            180                 185                 190
Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly Glu
        195                 200                 205
Leu Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr
    210                 215                 220
Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln
225                 230                 235                 240
Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala
                245                 250                 255
Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
            260
<210>27
<211>1050
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>其编码蛋白是能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合基因
<400>27
aaagaaaaaa caccagaaga accaaaagaa gaagttacta ttaaagcaaa cttaatctat     60
gcagatggaa aaacacaaac agcagaattc aaaggaacat ttgaagaagc aacagcagaa    120
gcatacagat atgcagatgc attaaagaag gacaatggag aatatacagt agacgttgca    180
gataaaggtt atactttaaa tattaaattt gctggagagc tcgctgatgc gcaacaaaat    240
aacttcaaca aagatcaaca aagcgccttc tatgaaattt tgaacatgcc taacttaaac    300
gaagcgcaac gcaatggttt cattcaaagt cttaaagacg atccaagcca aagcactaac    360
gttttaggtg aagctaaaaa attaaacgaa tctcaagcac cgaaagagct caaagaaaaa    420
acaccagaag aaccaaaaga agaagttact attaaagcaa acttaatcta tgcagatgga    480
aaaacacaaa cagcagaatt caaaggaaca tttgaagaag caacagcaga agcatacaga    540
tatgctgact tattagcaaa agaaaatggt aaatatacag tagacgttgc agataaaggt    600
tatactttaa atattaaatt tgctggagag ctcgctgatg cgcaacaaaa taacttcaac    660
aaagatcaac aaagcgcctt ctatgaaatt ttgaacatgc ctaacttaaa cgaagcgcaa    720
cgcaatggtt tcattcaaag tcttaaagac gatccaagcc aaagcactaa cgttttaggt    780
gaagctaaaa aattaaacga atctcaagca ccgaaagagc tcaaagaaga aacaccagaa    840
acaccagaaa ctgattcaga agaagaagta acaatcaaag ctaacctaat ctttgcaaat    900
ggaagcacac aaactgcaga attcaaagga acatttgaaa aagcaacatc agaagcttat    960
gcgtatgcag atactttgaa gaaagacaat ggagaatata ctgtagatgt tgcagataaa   1020
ggttatactt taaatattaa atttgctgga                                    1050
<210>28
<211>350
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合蛋白
<400>28
Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala
1               5                   10                  15
Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly
            20                  25                  30
Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Ala Leu
        35                  40                  45
Lys Lys Asp Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr
    50                  55                  60
Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly Glu Leu Ala Asp Ala Gln Gln Asn
65                  70                  75                  80
Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met
                85                  90                  95
Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys
            100                 105                 110
Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu
        115                 120                 125
Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Glu Leu Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu
    130                 135                 140
Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly
145                 150                 155                 160
Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala
                165                 170                 175
Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr
            180                 185                 190
Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala
        195                 200                 205
Gly Glu Leu Ala Asp Ala Gln Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln
    210                 215                 220
Ser Ala Phe Tyr Glu Ile Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln
225                 230                 235                 240
Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr
                245                 250                 255
Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys
            260                 265                 270
Glu Leu Lys Glu Glu Thr Pro Glu Thr Pro Glu Thr Asp Ser Glu Glu
        275                 280                 285
Glu Val Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Phe Ala Asn Gly Ser Thr Gln
    290                 295                 300
Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Glu Lys Ala Thr Ser Glu Ala Tyr
305                 310                 315                 320
Ala Tyr Ala Asp Thr Leu Lys Lys Asp Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp
                325                 330                 335
Val Ala Asp Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly
            340                 345                 350
<210>29
<211>948
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>其编码蛋白是能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合基因
<400>29
aaagaaaaaa caccagaaga accaaaagaa gaagttacta ttaaagcaaa cttaatctat     60
gcagatggaa aaacacaaac agcagaattc aaaggaacat ttgaagaagc aacagcagaa    120
gcatacagat atgcagatgc attaaagaag gacaatggag aatatacagt agacgttgca    180
gataaaggtt atactttaaa tattaaattt gctggagagc tcgctgacaa caaattcaac    240
aaagaacaac aaaatgcttt ctatgaaatt ttacatttac ctaacttaac tgaagaacaa    300
cgtaacggct tcatccaaag ccttaaagac gatccttcag tgagcaaaga aattttagca    360
gaagctaaaa agctaaacga tgctcaagca ccaaaagagc tcaaagaaaa aacaccagaa    420
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ttattagcaa aagaaaatgg taaatataca gcagacttag aagatggtgg atacactatt    600
aatattagat ttgcaggtga gctcgctcaa caaaatgctt tttatcaagt cttaaatatg    660
cctaacttaa atgctgatca acgcaatggt tttatccaaa gccttaaaga tgatccaagc    720
caaagtgcta acgttttagg tgaagctaaa agattaaacg aatttcaagc accgaaagag    780
ctcacttaca aattaatcct taatggtaaa acattgaaag gcgaaacaac tactgaagct    840
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ggtgaatgga cttacgacga tgcgactaag acctttacag ttactgaa                 948
<210>30
<211>316
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合蛋白
<400>30
Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala
1               5                   10                  15
Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly
            20                  25                  30
Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Ala Leu
        35                  40                  45
Lys Lys Asp Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr
    50                  55                  60
Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly Glu Leu Ala Asp Asn Lys Phe Asn
65                  70                  75                  80
Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
                85                  90                  95
Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro
            100                 105                 110
Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
        115                 120                 125
Gln Ala Pro Lys Glu Leu Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu
    130                 135                 140
Glu Val Thr Ile Lys Ala Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln
145                 150                 155                 160
Thr Ala Glu Phe Lys Gly Thr Phe Ala Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr
                165                 170                 175
Arg Tyr Ala Asp Leu Leu Ala Lys Glu Asn Gly Lys Tyr Thr Ala Asp
            180                 185                 190
Leu Glu Asp Gly Gly Tyr Thr Ile Asn Ile Arg Phe Ala Gly Glu Leu
        195                 200                 205
Ala Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Gln Val Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn
    210                 215                 220
Ala Asp Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser
225                 230                 235                 240
Gln Ser Ala Asn Val Leu Gly Glu Ala Lys Arg Leu Asn Glu Phe Gln
                245                 250                 255
Ala Pro Lys Glu Leu Thr Tyr Lys Leu Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu
            260                 265                 270
Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys
        275                 280                 285
Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr
    290                 295                 300
Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu
305                 310                 315
<210>31
<211>1161
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature
<223>其编码蛋白是能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合基因
<400>31
aaagaaaaaa caccagaaga accaaaagaa gaagttacta ttaaagcaaa cttaatctat     60
gcagatggaa aaacacaaac agcagaattc aaaggaacat ttgaagaagc aacagcagaa    120
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aaagaacaac aaaatgcttt ctatgaaatt ttacatttac ctaacttaac tgaagaacaa    300
cgtaacggct tcatccaaag ccttaaagac gatccttcag tgagcaaaga aattttagca    360
gaagctaaaa agctaaacga tgctcaagca ccaaaagagc tcacttacaa acttgttatt    420
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aaagccttca aacaatacgc taacgacaac gctgttgatg gtgtttggac ttatgatgat    540
gcgactaaga cctttacggt aactgaagag ctcaaagaag aaacaccaga aacaccagaa    600
actgattcag aagaagaagt aacaatcaaa gctaacctaa tctttgcaaa tggaagcaca    660
caaactgcag aattcaaagg aacatttgaa aaagcaacat cagaagctta tgcgtatgca    720
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ttaaatatta aatttgctgg agagctcgct gatgcgcaac aaaataactt caacaaagat    840
caacaaagcg ccttctatga aattttgaac atgcctaact taaacgaagc gcaacgcaat    900
ggtttcattc aaagtcttaa agacgatcca agccaaagca ctaacgtttt aggtgaagct    960
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<210>32
<211>387
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<221>MISC_FEATURE
<223>能与免疫球蛋白高亲和力结合的融合蛋白
<400>32
Lys Glu Lys Thr Pro Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Thr Ile Lys Ala
1               5                   10                  15
Asn Leu Ile Tyr Ala Asp Gly Lys Thr Gln Thr Ala Glu Phe Lys Gly
            20                  25                  30
Thr Phe Glu Glu Ala Thr Ala Glu Ala Tyr Arg Tyr Ala Asp Ala Leu
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Lys Lys Asp Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp Lys Gly Tyr
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65                  70                  75                  80
Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu
                85                  90                  95
Thr Glu Glu Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro
            100                 105                 110
Ser Val Ser Lys Glu Ile Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala
        115                 120                 125
Gln Ala Pro Lys Glu Leu Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr
    130                 135                 140
Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu
145                 150                 155                 160
Lys Ala Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Ala Val Asp Gly Val Trp
                165                 170                 175
Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu Glu Leu Lys
            180                 185                 190
Glu Glu Thr Pro Glu Thr Pro Glu Thr Asp Ser Glu Glu Glu Val Thr
        195                 200                 205
Ile Lys Ala Asn Leu Ile Phe Ala Asn Gly Ser Thr Gln Thr Ala Glu
    210                 215                 220
Phe Lys Gly Thr Phe Glu Lys Ala Thr Ser Glu Ala Tyr Ala Tyr Ala
225                 230                 235                 240
Asp Thr Leu Lys Lys Asp Asn Gly Glu Tyr Thr Val Asp Val Ala Asp
                245                 250                 255
Lys Gly Tyr Thr Leu Asn Ile Lys Phe Ala Gly Glu Leu Ala Asp Ala
            260                 265                 270
Gln Gln Asn Asn Phe Asn Lys Asp Gln Gln Ser Ala Phe Tyr Glu Ile
        275                 280                 285
Leu Asn Met Pro Asn Leu Asn Glu Ala Gln Arg Asn Gly Phe Ile Gln
    290                 295                 300
Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Thr Asn Val Leu Gly Glu Ala
305                 310                 315                 320
Lys Lys Leu Asn Glu Ser Gln Ala Pro Lys Glu Leu Thr Tyr Lys Leu
                325                 330                 335
Ile Leu Asn Gly Lys Thr Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Glu Ala Val
            340                 345                 350
Asp Ala Ala Thr Ala Glu Lys Val Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn
        355                 360                 365
Gly Val Asp Gly Glu Trp Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr
    370                 375                 380
Val Thr Glu
385

Claims (11)

1.一种重组Ig结合分子文库，其特征在于：所述文库是由以不同的Ig结合分子葡萄球菌A蛋白的A、B、C、D、E结构域，大消化链球菌L蛋白的B1、B2、B3、B4、B5结构域，G群或C群链球菌G蛋白的G1、G2结构域的单个抗体结合结构域为结构单元，以结构单元随机DNA重排形成的Ig结合分子组成，其中上述结构域的核苷酸序列分别为：SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：12，单个结构域之间以核苷酸GAGCTC连接，结构单元随机DNA重排形成的Ig结合分子通过如下方法获得：
(1)将Ig结合分子葡萄球菌A蛋白的A、B、C、D、E结构域，大消化链球菌L蛋白的B1、B2、B3、B4、B5结构域，G群或C群链球菌G蛋白的G1、G2结构域的单个抗体结合结构域分别经PCR扩增引入Sac I酶切位点作为连接点；
(2)将PCR回收产物分别经Sac I酶切消化；
(3)将步骤(2)获得的Sac I酶切消化产物混合，用T4连接酶将各单结构域进行随机连接重组。
2.如权利要求1所述文库的制备方法，包括下列步骤：
(1)以Ig结合分子葡萄球菌A蛋白的A、B、C、D、E结构域，大消化链球菌L蛋白的B1、B2、B3、B4、B5结构域，G群或C群链球菌G蛋白的G1、G2结构域的单个抗体结合结构域为结构单元，分别经PCR扩增引入Sac I酶切位点作为连接点，其中所述结构域的核苷酸序列为：SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：12；
(2)PCR回收产物分别经Sac I酶切消化；
(3)将步骤(2)获得的Sac I酶切消化产物混合，再用T4连接酶将各单结构域进行随机连接重组。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)后还包括将不同时间的连接产物混合起来获得重组Ig结合分子文库。
4.一种重组Ig结合分子文库的噬菌体展示方法，其特征在于将权利要求1所述的Ig结合分子文库克隆于噬菌体载体pCANTAB5S中，以该载体进行3+3形式的噬菌体展示。
5.采用权利要求4的方法所获得的重组Ig结合分子噬菌体文库。
6.一种获得高亲和力Ig结合分子噬菌体文库的方法，其特征在于：用Ig包板，利用权利要求5所述的重组Ig结合分子噬菌体文库经3-4轮体外定向进化IgG亲和筛选获得高亲和力Ig结合分子噬菌体文库。
7.用权利要求6的方法所获得的高亲和力Ig结合分子噬菌体文库。
8.如权利要求7所述的高亲和力Ig结合分子噬菌体文库，其特征在于：被噬菌体展示的高亲和力Ig结合分子是以葡萄球菌A蛋白的单个结构域、大消化链球菌protein L的单个结构域及G群或C群链球菌G蛋白的单个结构域为结构单元，间隔排列连接而成的Ig结合分子中的任意一种或多种。
9.如权利要求8所述的高亲和力Ig结合分子噬菌体文库，以ML、MA、MG分别代表大消化链球菌L蛋白的单个结构域、葡萄球菌A蛋白的单个结构域、G群或C群链球菌G蛋白的单个结构域，其特征在于：所述结构单元间隔排列连接方式为(ML-MA)n或(ML-MG)n或(ML-MA-MG)n或(ML-MG-MA)n或ML-(MA-ML)n或ML-(MG-ML)n，其中n为该序列的重复次数。
10.如权利要求9所述的高亲和力Ig结合分子噬菌体文库，其特征在于：被噬菌体展示的高亲和力Ig结合分子的序列排列方式为B3-G1-B2-G2-B5，B2-D-G1-B5-C-G1，B5-A-B2-G1-B1，B3-D-B3，B3-D-B3-D-B3，B2-G2-A-B3-D-G1，B1-G1-B3-G1，B2-D-B3-D-B1，B2-C-B4-E-G1，B2-C-G2-B1-D-G1的Ig结合分子中的任意一种或多种。
11.重组Ig结合分子文库的应用，其特征在于：用权利要求1或5或7至10中任一权利要求所述的文库筛选高亲和力Ig结合分子。
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