CN1315000A

CN1315000A - 通过检测一种ssx基因的表达、源自所述ssx基因和ny－es0－1基因的肽来确定标本中存在癌症的方法及该该方法的应用

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Publication number: CN1315000A
Application number: CN99807916A
Authority: CN
Inventors: 奥兹莱姆·图雷西; 乌格·萨欣; 迈克尔·弗鲁恩德舒; 乔格·拉门西; 斯蒂芬·斯特瓦诺维克; 陈耀桢; 阿利·古尔; 劳埃德·J·奥尔德
Original assignee: Ludwig Cancer Research
Current assignee: Ludwig Cancer Research
Priority date: 1998-06-26
Filing date: 1999-06-25
Publication date: 2001-09-26
Also published as: EP1090294B1; KR20010089128A; JP2002519013A; AU745777B2; WO2000000824A1; AU4722199A; CA2334914C; DE69942544D1; CA2334914A1; JP3572316B2; ATE472731T1; EP1090294A4; US6287756B1; EP1090294A1

Abstract

本发明涉及SSX基因家族的成员,以及它们的应用。本发明还包括衍生自SSX分子和NY－ESO－1分子的肽,其与HLA分子形成复合体,导致提呈这些复合体的细胞被细胞毒T细胞裂解。

Description

通过检测一种SSX基因的表达、源自所述SSX基因和NY-ESO-1基因的肽来确定标本中存在癌症的方法及该方法的应用

相关申请

本申请是1997年5月5日提交的申请第08/851,130号和1998年6月26日提交的申请第09/105,839号的部分继续申请，二者均被引入作为参考。

发明领域

本发明涉及对这里所讨论的“SSX”家族成员的基因的分离和克隆及其应用，包括癌症的确定。本发明还包括源自这些SSX基因以及NY-ESO-1基因的肽。这些肽刺激细胞毒T细胞的增殖，并因此可作为与HLA-A2细胞相关的异常，例如癌症存在的有效标志物以及治疗癌症的治疗剂。

背景和现有技术

现已完全确认：许多病理学状态，例如感染、癌症、自身免疫病等都是以某些分子的不适当表达为特征的。因此这些分子可作为特定病理学或异常状态的“标志物”。这些分子除了可作为诊断“靶标”，即诊断这些异常状态所必需鉴定的物质外，它们还可作为用来产生诊断和/或治疗剂的反应物。其一个绝非限制性的实例是利用癌症标志物来产生特异性针对一种特定标志物的抗体。还有另一非限制性的实例是利用与MHC分子形成复合物的肽来产生针对异常细胞的细胞毒T细胞。

当然，此类物质的制备必需有用于产生这些物质的反应物来源。从细胞进行纯化是进行该工作的一种辛苦而不可靠的方法。另一种优选的方法是分离编码一特定标志物的核酸分子，随后用分离的编码分子来表达目的分子。

目前，两种策略已被用于在例如人类肿瘤中检测此类抗原。这些将被称为遗传学方法和生物化学方法。遗传学方法由例如dePlaen等，美国科学院院刊(Proc.Natl.Sci.USA)85:2275(1988)举例说明，其被引入作为参考。在该方法中，将获自一种肿瘤的一个cDNA文库的数百份质粒集合体转染到受体细胞，例如COS细胞，或者抗原阴性的肿瘤细胞系变体中。通过转染子激发抗肿瘤的细胞毒T细胞克隆反应的能力而筛选转染子的肿瘤抗原表达。生物化学方法由例如引入作为参考的O.Mandelboim等，自然(Nature)369:69(1994)举例说明，其基于对结合于肿瘤细胞MHC-I类分子的肽的酸洗脱，及随后的反相高效液相色谱(HPLC)。抗原性肽在它们结合至抗原加工有缺陷的突变细胞系的空闲MHC-I类分子后被识别，并诱导与细胞毒性T淋巴细胞的特异性反应。这些反应包括CTL增殖的诱导、TNF的释放以及可在MTT检测法或51Cr释放检测法中检测的靶细胞的裂解。

这两种对抗原进行分子确定的方法具有下述缺点：第一，它们非常麻烦，耗时而且昂贵；第二，它们依赖于具有预定特异性的细胞毒性T细胞系(CTLs)的建立；第三，由于各种CTL不仅可以从具有相应疾病的患者中获得，而且可以从健康个体中获得，这取决于他们的T细胞组成(repertoire)，所以尚未证明它们与所讨论疾病的病理学过程的体内相关性。

这两种用于抗原的鉴定和分子确定的已知方法有其固有的问题，这一点已通过以下事实得到了最好的证实：迄今为止这两种方法在人体肿瘤中只成功确定了很少的几种新抗原。见例如van der Bruggen等，科学(Science)254:1643-1647(1991);Brichard等，实验医学杂志(J.Exp.Med.)178:489-495(1993);Coulie等，实验医学杂志180:35-42(1994)；Kawakami等，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91:3515-3519(1994)。

此外，所述方法学有赖于目的癌症类型已建立的永生细胞系的可用性。建立来自特定癌症类型的细胞系是很难的，如Oettgen等，北美免疫学和过敏症临床(Immunol.Allerg.Clin.North.Am.)10:607-637(1990)所示。还已知一些上皮细胞癌在体外对CTL的易感性极低，妨碍了常规检测。这些问题促使本领域来发展用于鉴定癌症相关抗原的其他方法。

Sahin等，美国科学院院刊92:11810-11913(1995)描述了一个关键的方法，其被引入作为参考。还可见1996年1月3日提交的美国专利申请号08/580,980以及美国专利第5,698,396号。所有这三篇文献均被引入作为参考。总之，该方法涉及cDNA文库在原核宿主中的表达。(文库均得自肿瘤标本)。然后，为了检测那些引发高滴度体液应答的抗原，用已吸附并稀释的血清对表达文库进行免疫筛选。该方法被称为SEREX方法(通过重组表达克隆进行的抗原血清学鉴定(“Serological identencation of antigens byRecombinant Expression Cloning”))。该方法学已被用来证实以前鉴定的肿瘤相关抗原的表达，以及检测新抗原。见上面参考的专利申请和Sahin等，同上，以及Crew等，欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J)144:2333-2340(1995)。

SEREX方法已被用于食管癌标本，而且目前已经鉴定出一种食管癌相关抗原，并分离和克隆了其编码核酸分子，如1996年10月3日提交的美国专利申请号08/725,182所述，其被引入本文作为参考。

一些肿瘤相关基因和被称为SSX基因的三合体(triad)基因间的关系在研究之中。见Sahin等，同上；Tureci等，癌症研究(Cancer Res)56:4766-4772(1996)。最初，将被称为SSX2的一种SSX基因确定为参与一种染色体易位事件(t(X;18)(p11.2;q11.2))的两个基因中的一个，所述的染色体易位存在于70％的滑膜肉瘤中。见Clark等，自然遗传学(Nature Genetics)7:502-508(1994);Crew等，欧洲分子生物学组织杂志14:2333-2340(1995)。后来发现SSX2在许多肿瘤细胞中表达，目前其被认为是一种肿瘤相关抗原，被Tureci等，同上，称为HOM-MEL-40。目前只是在癌症细胞和正常睾丸中观察到其表达。这与“CT”家族肿瘤抗原的其它成员一致，因为它们也只表达在癌症和睾丸细胞中。Crew等还分离和克隆了SSX1基因，其与SSX2具有89％的核苷酸序列同源性。将SSX1和SSX2的序列信息分别提供为SEQID NOS:1和2。见Crew等，同上。针对SSX基因鉴定的其它工作导致了对SSX3的鉴定，这由DeLeeuw等，细胞遗传学和遗传学(Cytogenet.Genet)73:179-183(1996)描述。SSX的提呈与其它CT抗原一致的事实提示发明人可分离其它SSX基因。母申请，同上，公开了该工作，引入作为参考的Gure等，国际癌症杂志(Int.J.Cancer)72:965-971(1997)同样也公开了该工作。

关于SSX家族的其它文献，大部分涉及SSX1。见Cooper等PCT申请W/9602641A2，关于通过检测SSX1或SSX2来确定滑膜肉瘤的具体工作。还特别提到DeLeeuw等，人类分子遗传学(Hum.Mol.Genet.)4(6):1097-1099(1995)也描述了滑膜肉瘤和SYT-SSX1或SSX2的易位。还见Kawai等，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)338(3):153-160(1998)；Noguchi等，国际癌症杂志(Int.J.Cancer)72(6):995-1002(1997),Hibshoosh等，肿瘤学讲座(Semin.Oncol.)24(5):515-525(1997),Shipley等，美国病理学杂志(Am.J.Pathol.)148(2):559-567(1996);Fligman等，美国病理学杂志147(6):1 592-1599(1995)。还见Chand等，基因组学(Genomics)30(3):545-552(1995),Brett等，人类分子遗传学6(9):1559-1564(1997),deBruyn等，癌基因(Oncogene)(13/3):643-648。SSX3基因由deLeeuw等，Cytogenet Cell Genet73(3):179-1983(1996)描述。

上述SEREX方法的修改方案的应用和其他技术一起已经用来克隆其它两个在后文被称为SSX4和SSX5的SSX基因以及SSX4基因的另一种剪接变体。特别是，虽然SEREX方法利用自体血清，但下述方法利用异基因血清。

基元分析是一种工具，其使得人们可以确定一个较长蛋白的哪些区域实际上可能作为MHC或HLA分子的结合物。基本上，对一个氨基酸基元进行分析，其在一个8-12个氨基酸的序列中通常包括至少两个，有时更多的限定的氨基酸。然后将该基元用于筛选一个较长序列以确定该较长序列内的哪些序列可组成将结合HLA或MHC分子的肽而且可能刺激对肽和MHC/HLA分子的复合物具有特异性的溶细胞性T淋巴细胞增殖。基元因MHC/HLA分子不同而不同。在该领域已做了很多的工作，但其仍在进行。在下面的公开内容中将看到，发明人利用基元分析来鉴定结合HLA分子，特别是HLA-A2分子的肽。

优选实施方案详述

实施例1

获得了一个人睾丸cDNA表达文库并用被鉴定为MZ2的黑色素瘤患者的血清对其进行筛选。见例如引入作为参考的母申请美国专利申请号08,479,328；还见引入作为参考的美国专利申请号08/725,182;Sahin等，美国科学院院刊92:11810-11813(1995)。利用在这些参考文献中所述的方法对该血清进行了处理。简言之，将血清1:10稀释，然后用转染的大肠杆菌的裂解液进行预吸附。在该预吸附步骤后，将预吸附过的血清1:10稀释，最终稀释度为1:100。最终稀释后，室温下将样品与利用上述文献方法制备的含有噬斑的硝酸纤维素膜温育过夜。对硝酸纤维素膜进行洗涤，与碱性磷酸酶偶联的山羊抗人Fc_r二抗一起温育，然后用底物5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐和氮蓝四唑观察反应。在一个二次筛选中，清除了任何编码人免疫球蛋白的噬菌粒。

对总共3.6×10⁵个噬斑形成单位进行了筛选，获得8个阳性克隆。进行标准的测序反应，并将序列与已知序列的序列库进行比较。

在8个阳性克隆中，发现2个编码已知的自身免疫病相关分子，即Golgin-95(Fritzler等，实验医学杂志178:49-62(1993))，以及人上游结合因子(Chan等，实验医学杂志174:1239-1244(1991))。发现另有3个克隆编码广泛表达于人体组织中的蛋白，即核糖体受体、Ⅵ型胶原蛋白球形结构域以及雷帕霉素结合蛋白。其余3个序列中，一个被发现与任何已知序列均不同源，但在人体组织中广泛表达(这是通过RT-PCR分析发现的，但在此未提供具体资料)。其余的2个被发现与在08/479,328中所述的全长HOM-MEL-40相同，而第八个克隆被发现几乎与DeLeeuw等，Cytogenet.Cell Genet.73:179-183(1996)所述的“SSX3”完全相同，与其只有编码区中2个碱基对的差别。这些差别本质上可能是人为造成的(artifactual)；但是，该克隆还包括一段43个碱基对的3’非翻译区。

实施例2

为了进行下述的DNA印迹(Southern blotting)实验，利用RT-PCR对SSX基因进行扩增。

为了进行RT-PCR，利用公布的SSX2序列制备2个引物，该公布序列如下

MEL-40A:5’-CACACAGGATCCATGAACGGAGA

(SEQ ID NO:3)

和MEL-40B:5’-CACACAAAGCTTTGAGGGGAGTTACTCGTCATC

(SEQ ID NO:4)

见Crew等，欧洲分子生物学组织杂志14:2333-2340(1995)。然后，在25μl反应体积中利用0.25U Taq聚合酶以60℃的退火温度进行扩增。一共进行35个循环。

实施例3

对睾丸总RNA进行上述RT-PCR方法，并将扩增产物用于DNA印迹实验。

从非肿瘤组织样品中提取基因组DNA，然后在单独的实验中利用BamHⅠ、EcoRⅠ或HindⅢ进行限制性酶消化，然后在0.7％的琼脂糖凝胶上分离，随后印迹到硝酸纤维素膜上。利用众所周知的方用³²P对上述的扩增产物进行标记，然后在高严谨度条件(65℃，水性缓冲液)下将标记物用作探针，随后进行高严谨度的洗涤，以0.2×SSC、0.2％SDS,65℃的最终洗涤结束。

DNA印迹显示在每种情况(即，BamHⅠ、EcoRⅠ和HindⅢ分别进行消化)下都超过10条带，强烈表明存在一个包括比以前鉴定的3个基因更多成员的SSX基因家族。鉴于该观察，设计了一种联合PCR克隆和限制性图谱分析的方法来鉴定其它SSX基因。

实施例4

在对SSX1、2和3的序列进行比较时，发现它们共有高度保守的5’和3’区，这解释了为何SEQ ID NOS:3和4的寡核苷酸能够在所述条件下扩增所有三个序列，而且表明了这种同源性为SSX基因家族所共有，而不论基因的大小。因此，SEQ ID NOS:3和4的寡核苷酸足以扩增SSX基因家族的其它成员。

SSX1、2和3的序列分析显示SSX1和2含有一个不为SSX3拥有的BglⅡ位点。类似地，SSX3含有一个不为其它基因所有的EcoRⅤ位点。

鉴于该信息，如上所述利用SEQ ID NOS:3和4对睾丸cDNA进行扩增，然后进行BglⅡ消化。然后对任何BglⅡ抗性序列进行克隆、测序并与已知序列进行比较。

这使得鉴定出2个以前未鉴别的序列，此后称作SSX4和SSX5，本文中列为SEQ ID NOS:5和6。GenBank数据库检索发现2个标记为登记号N24445和W00507的克隆，两者均由序列-标签-衍生的cDNA片段所组成。标记为登记号N24445的克隆含有SSX4的3’非翻译区，以及其部分编码序列，而标记为W00507的克隆含有SSX43’非翻译区的一个较短的段以及编码序列的一个较长部分。N24445具体由SSX4(SEQ ID NO:5)的344位碱基，到3’末端，加上终止密码子3’的319个碱基组成。W00507序列由显示与SSX基因无同源性的99个碱基对的序列以及随后一个相同于SEQ IDNO:5之280位核苷酸至末端，至SEQ ID NO:1之终止密码子3’的67个碱基所组成，

鉴定了SSX4(SEQ ID NO:5)的两种形式。其中一种缺少331至466位核苷酸，但其它与在SEQ ID NO:5中所示的SSX4相同。如下所述，较短的形式是另一种剪接变体。

在随后的表1中，比较了SSX家族中5个已知成员的核苷酸和氨基酸序列。该表横向为核苷酸同源性，纵向为氨基酸同源性。

表1SSXP家族成员中的核苷酸和氨基酸同源性

因此，SSX1和SSX4在核苷酸水平拥有89.4％的同源性，而在氨基酸水平拥有79.3％的同源性。

在分析截断形式的SSX4时，由于另一种剪接和下游开放阅读框的移位，其具有与其它形式完全不同的氨基酸序列。推测的蛋白长度为153个氨基酸，羧基末端的42个氨基酸显示与其它SSX蛋白无同源性。

实施例5

随后对SSX2基因的基因构成进行了研究。为了进行该研究，利用上述在DNA印迹工作的讨论中的相同方法和探针对人胎盘基因组文库(在λ噬菌体中)进行筛选。经过另外两轮克隆对任何阳性原代克隆进行纯化。

分离多个阳性克隆，对其中之一进行部分测序，并鉴定为SSX2的基因组克隆。随后为一系列进行标准亚克隆和测序工作的实验，以便确定外显子-内含子界限。

分析显示SSX2基因含有6个外显子，跨越至少8000个碱基。发现所有确定的界限均有外显子/内含子之连接的共有序列，即GT/AG。

发现上述SSX4的交替剪接变体在编码区缺少第五外显子。通过将其与SSX2基因组克隆进行比较对此进行了确定，并由此得出相关性。

实施例6

然后对各SSX基因在正常和肿瘤组织中的表达进行了检测。这需要基于已知的序列构建特异性的引物，这些如下为SEQ ID NOS:7-16：

表2对各SSX基因的基因特异性PCR引物序列

SSX1A(5′): 5′-CTAAAGCATCAGAGAAGAGAAGC [nt.44-66]

SSX1B(3′): 5′-AGATCTCTTATTAATCTTCTCAGAAA [nt.440-65]

SSX2A(5′): 5′-GTGCTCAAATACCAGAGAAGATC [nt.41-63]

SSX2B(3′): 5′-TTTTGGGTCCAGATCTCTCGTG [nt.102-25]

SSX3A(5′): 5′-GGAAGAGTGGGAAAAGATGAAAGT [nt.454-75]

SSX3B(3′): 5′-CCCCTTTTGGGTCCAGATATCA [nt.458-79]

SSX4A(5′): 5′-AAATCGTCTATGTGTATATGAAGCT [nt.133-58]

SSX4B(3′): 5′-GGGTCGCTGATCTCTTCATAAAC [nt.526-48]

SSX5A(5′): 5′-GTTCTCAAATACCACAGAAGATG [nt.39-63]

SSX5B(3′): 5′-CTCTGCTGGCTTCTCGGGCCG [nt.335-54]

通过扩增以前鉴定的SSX1至SSX5的cDNA对克隆的特异性进行证实。对SSX1和4在60℃，对SSX2、3和5在65℃使用Taq聚合酶。除了发现SSX2引物扩增微量(不及SSX2的1/20)的SSX3质粒DNA外，每组引物对都是特异性的。

一旦证实了特异性，便利用上述的RT-PCR方法将引物用于分析睾丸mRNA。

在所有5例中均发现了预期的PCR产物，用SSX4对进行的扩增产生两种扩增产物，其与另一种剪接变体一致。

然后对SSX基因在黑色素培养细胞中的表达进行了研究。利用上述的方法进行RT-PCR。未发现PCR产物。再次扩增产生少量的SSX4产物，包括两种形式，表明SSX4在培养的黑素细胞中的表达是不一致的，而且表达时水平很低。

然后将该研究扩展至一组共12种黑色素瘤细胞系。这些结果列于下表中。

表3通过RT-PCR检测的SSX在黑色素瘤种的表达*

SSX1 SSX2 SSX3 SSX4 SSX5

MZ2-Mel2.2 + + - - -

MZ2-Mel3.1 + + - - -

SK-MEL-13 - - - - -

SK-MEL-19 - - - - -

SK-MEL-23 - - - - -

SK-MEL-29 - - - - -

SK-MEL-30 -* -* - -* -

SK-MEL-31 - - - - -

SK-MEL-33 - - - - -

SK-MEL-37 + + - + +

SK-MEL-179 - - - - -

M24-MET - - - - -

*阳性(+)表示高表达。在SK-MEL-30中观察到SSX1、2和4的弱阳性不一致，可能代表低水平表达。

实施例7

进行其它实验来分析在各种肿瘤中SSX家族成员的表达。为此，按照引入作为参考的Chomczynski等，生物化学纪事(Ann.Biochem.)162:156-159(1987)所述，利用异硫氰酸胍变性随后进行酸性酚抽提和异丙醇沉淀从冰冻组织标本中提取细胞总RNA。按照标准的方法利用寡聚DT(18)引物探测总RNA样品(4μg)，并进行反转录。如Tureci等，癌症研究(Canc.Res.)56:4766-4772(1996)所述，对由此获得的cDNA的完整性通过在25个循环的标准PCR中扩增β-肌动蛋白(B-acin)转录子进行检测。

为了进行PCR分析，利用上述列为SEQ ID NOS:5-14的引物以及SEQID NOS:17和18，即：

ACAGCATTAC CAAGGACAGC AGCCACC

GCCAACAGCA AGATGCATAC CAGGGAC

为了检测由Clark等(同上)和Crew等(同上)对滑膜肉瘤所报道的SYT/SSX融合转录子，将这两条序列的每条都与SEQ ID NOS:6和8一起使用。通过在30μl的反应中以各10pMol的dNTP以及1.67mN的MgCl₂扩增1μl的第一链cDNA来进行扩增。于94℃12分钟将酶活化后，进行35个循环的PCR。每个循环由退火1分钟(对SEQ ID NOS:7和8为56℃，对SEQ ID NOS:9和10为67℃，对SEQ ID NOS:11和12为65℃，对SEQ IDNOS:13和14为60℃，对SEQ ID NOS:15和16为66℃，对SEQ IDNOS:17和18以及18和10为60℃)，随后的72℃2分钟，94℃1分钟，以及72℃8分钟的一个最后延伸步骤所组成。将每个反应取15μl在2％的琼脂糖凝胶上进行大小分离，用溴化乙啶染色使其显像，并确定预期的大小。预期的大小对于SEQ ID NOS:7和8为421个碱基对；对于SEQ ID NOS:9和10为435个碱基对；对于SEQ ID NOS:11和12为381个碱基对；对于SEQ IDNOS:13和14为413个碱基对；而对于SEQ ID NOS:15和16为324个碱基对。所选的条件是严谨的，以便防止引物与SSX家族其它成员的交叉退火。还采取了其它的步骤以保证RT-PCR产物来自cDNA而不是污染的DNA。每个实验均进行3次。一共分析了325个肿瘤标本。结果列于随后的表4和5中。

需注明的是，虽然大部分SSX阳性肿瘤只表达SSX家族的一个成员，但数种肿瘤类型显示两种或以上基因的共表达。

由于文献报道分析的所有滑膜肉瘤病例都显示携带SYT/SSX1或SYT/SSX2易位，所以在由本文所讨论的引物组为侧翼的断裂点处对SSX基因在滑膜肉瘤中的表达进行了分析，其中所述的引物组为SEQ IDO:17/SNEQ ID NO:8;SEQ ID NO:17/SEQ ID NO:10;SEQ ID NO:18/SEQID NO:8;SEQ ID NO:18/SEQ ID NO:10。上述PCR工作显示在所检测滑膜肉瘤标本中3例发现SYT/SSX1易位，1例发现SYT/SSX2易位。发现SYT/SSX2易位的一例也发现SYT/SSX1。SSX的表达似乎不依赖于易位。表4：人类肿瘤中SSX基因的表达

肿瘤	受检组织	SSX1	SSX2	SSX3	SSX4	SSX5	至少一个阳性	％
肿瘤	受检组织	SSX1	SSX2	SSX3	SSX4	SSX5	至少一个阳性	％	淋巴瘤	11	-	4	-	-	-	4	36
乳腺癌	67	5	5	-	10	-	16	23	淋巴瘤	11	-	4	-	-	-	4	36
乳腺癌	67	5	5	-	10	-	16	23	子宫内膜癌	8	1	2	-	1	1	1	23
结直肠癌	58	3	7	-	9	1	16	27	子宫内膜癌	8	1	2	-	1	1	1	23
结直肠癌	58	3	7	-	9	1	16	27	卵巢癌	12	-	-	-	6	-	6	50
肾细胞癌	22	-	1	-		-	1	4	卵巢癌	12	-	-	-	6	-	6	50
肾细胞癌	22	-	1	-		-	1	4	恶性黑色素瘤	37	10	13	-	10	2	16	43
胶质瘤	31	-	2	-	3	-	5	16	恶性黑色素瘤	37	10	13	-	10	2	16	43
胶质瘤	31	-	2	-	3	-	5	16	肺癌	24	1	4	-	1	1	5	21
胃癌	3	-	-	-	1	-	1	33	肺癌	24	1	4	-	1	1	5	21
胃癌	3	-	-	-	1	-	1	33	前列腺癌	5	-	2	-	-	-	2	40
膀胱癌	9	2	4	-	2	-	5	55	前列腺癌	5	-	2	-	-	-	2	40
膀胱癌	9	2	4	-	2	-	5	55	头颈部癌	14	3	5	-	4	1	8	57
滑膜肉瘤	4	-	2	-	1	1	3	75	头颈部癌	14	3	5	-	4	1	8	57
滑膜肉瘤	4	-	2	-	1	1	3	75	白血病	23	-	-	-	-	-	0	0
平滑肌肉瘤	6	-	-	-	-	-	0	0	白血病	23	-	-	-	-	-	0	0
平滑肌肉瘤	6	-	-	-	-	-	0	0	甲状腺癌	4	-	-	-	-	-	0	0
精原细胞癌	2	-	-	-	-	-	0	0	甲状腺癌	4	-	-	-	-	-	0	0
精原细胞癌	2	-	-	-	-	-	0	0	合计	325	25	50	0	48	7	89

表5：各SSX基因在SSX阳性肿瘤标本中的表达模式。

乳腺癌(67份标本)	SSX1	SSX2	SSX4	SSX5
乳腺癌(67份标本)	SSX1	SSX2	SSX4	SSX5	51份标本	-	-	-	-
7份标本	-	-	+	-	51份标本	-	-	-	-
7份标本	-	-	+	-	4份标本	-	+	-	-
2份标本	+	-	-	-	4份标本	-	+	-	-
2份标本	+	-	-	-	2份标本	+	-	+	-
1份标本	+	+	+	-	2份标本	+	-	+	-

黑色素瘤(37份标本)	SSX1	SSX2	SSX4	SSX5
黑色素瘤(37份标本)	SSX1	SSX2	SSX4	SSX5	21份标本	-	-	-	-
5份标本	+	+	+	-	21份标本	-	-	-	-
5份标本	+	+	+	-	4份标本	-	+	-	-
2份标本	-	+	+	-	4份标本	-	+	-	-
2份标本	-	+	+	-	1份标本	+	-	-	-
1份标本	+	+	-	-	1份标本	+	-	-	-
1份标本	+	+	-	-	1份标本	+	-	+	-
1份标本	+	-	-	+	1份标本	+	-	+	-
1份标本	+	-	-	+	1份标本	+	+	-	-

子宫内膜癌(8份标本)	SSX1	SSX2	SSX4	SSX5
子宫内膜癌(8份标本)	SSX1	SSX2	SSX4	SSX5	7份标本	-	-	-	-
1份标本	+	+	+	+	7份标本	-	-	-	-

胶质瘤(31份标本)	SSX1	SSX2	SSX4	SSX5
胶质瘤(31份标本)	SSX1	SSX2	SSX4	SSX5	25份标本	-	-	-	-
3份标本	-	+	-	-	25份标本	-	-	-	-
3份标本	-	+	-	-	2份标本	-	-	+	-

表5：(续)

肺癌(24份标本)	SSX1	SSX2	SSX4	SSX5
肺癌(24份标本)	SSX1	SSX2	SSX4	SSX5	19份标本	-	-	-	-
3份标本	-	-	-	-	19份标本	-	-	-	-
3份标本	-	-	-	-	1份标本	-	-	-	+
1份标本	+	+	+	-	1份标本	-	-	-	+

结直肠癌(58份标本)	SSX1	SSX2	SSX4	SSX5
结直肠癌(58份标本)	SSX1	SSX2	SSX4	SSX5	42份标本	-	-	-	-
7份标本	-	+	-	-	42份标本	-	-	-	-
7份标本	-	+	-	-	5份标本	-	-	-	-
3份标本	+	-	+	-	5份标本	-	-	-	-
3份标本	+	-	+	-	1份标本	-	-	+	+

膀胱癌(9份标本)	SSX1	SSX2	SSX4	SSX5
膀胱癌(9份标本)	SSX1	SSX2	SSX4	SSX5	4份标本	-	-	-	-
2份标本	-	+	-	-	4份标本	-	-	-	-
2份标本	-	+	-	-	1份标本	-	-	-	-
1份标本	+	+	-	-	1份标本	-	-	-	-
1份标本	+	+	-	-	1份标本	+	+	-	-

头颈部癌(14份标本)	SSX1	SSX2	SSX4	SSX5
头颈部癌(14份标本)	SSX1	SSX2	SSX4	SSX5	6份标本	-	-	-	-
2份标本	+	-	-	-	6份标本	-	-	-	-
2份标本	+	-	-	-	2份标本	-	+	+	-
1份标本	-	+	-	-	2份标本	-	+	+	-
1份标本	-	+	-	-	1份标本	-	-	+	-
1份标本	+	+	-	-	1份标本	-	-	+	-
1份标本	+	+	-	-	1份标本	-	+	-	+

表5：(续)

滑膜肉瘤(4份标本)	SSX1	SSX2	SSX4	SSX5	SYT/SSX1	SYT/SSX5
滑膜肉瘤(4份标本)	SSX1	SSX2	SSX4	SSX5	SYT/SSX1	SYT/SSX5	Sy1	-	-	+	-	-	-
Sy2	-	+	-	+	+	-	Sy1	-	-	+	-	-	-
Sy2	-	+	-	+	+	-	Sy3	-	-	-	-	-	-
Sy4	-	+	-	-	+	-	Sy3	-	-	-	-	-	-

实施例8

该实施例进一步详细描述了设计用于鉴定结合HLA-A2分子并刺激CTL增殖的其它肽的实验。

首先，利用标准的Ficoll-Hypaque方法从健康HLA-A^*0201⁺供者的血液中分离外周血单个核细胞(此后为“PBMC”)。然后通过在塑料表面上将细胞于37℃温育1-2个小时对这些PBMC进行处理，将贴壁的单核细胞与非贴壁的外周血淋巴细胞(“PBL”)分离。将任何非贴壁的PBL冻存直至进一步的实验需要。通过将贴壁细胞在补充有1000U/ml的IL-4和1000U/ml的GM-CSF的AIMV培养基中进行温育以刺激它们分化成树突状细胞。将细胞温育5天。

开始温育7天后，树突状细胞样品(8×10⁵个)中加入50μg/ml外原肽。(肽的细节在下面提供)。在含有1000U/ml的TNF-α和10,000U/ml的IL-1β的培养基中于37℃继续培养2个小时。在不含该肽的过量培养基中洗涤添加了肽的树突状细胞两次。将如上所述获得的自体PBL解冻，然后在含有5ng/mlIL-7和20U/mlIL-2的培养基中将4×10⁷个PBL与8×10⁵个肽引导的树突状细胞(比例50:1)合并。然后将培养物在37℃进行温育。

按照与在7天后所进行的实验相同的方式，在14、21和28天时对淋巴细胞培养物进行再刺激。如由引入作为参考的Blomberg等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth.)114:191-195(1988)所述，利用铕释放检测法或者市售的检测IFN-γ释放的ELISPOT检测法在14、21和28天时进行细胞毒性检测。

受试的肽均源自Chen等在引入作为参考的美国专利第5,804,381号中所述的NY-ESO-1的氨基酸序列或者SSX-4的氨基酸序列。受试的肽为：源自NY-ESO-1的RLLEFYLAM (SEQ ID NO：)和

SLAQDAPPL (SEQ ID NO：)

以及源自SSX-4的STLEKINKT(SEQ ID NO：)。在ELSPOT检测中对两种NY-ESO-1来源的肽进行了测试。结果如下。总之，共进行了三个实验。按照在用所述肽对HLA-A2阳性细胞进行刺激时所获的斑点(阳性)数减去利用未刺激的细胞所获的斑点数给出结果。如所指出的，在14、21和28天时进行检测。

下面为肽RLLEFYLAM的结果。

检测的天数

(刺激的细胞-未刺激的细胞)

14 21 28

实验1 30 8 *

实验2 22 * 12

实验3 6 * 12

*未确定

实施例9

在随后的实验中，将上述T细胞培养物在由编码HLA-A^*020l的cDNA转染并如上所述用内源性肽刺激的COS细胞上或者由HLA-A^*0201和NY-ESO-1的编码序列所转染的COS细胞上进行测试。对于两种类型的COS转染物再次利用ELISPOT检测法。以每个培养物两次实验对6个不同的T细胞培养物进行了测试。

肽刺激内源产生NY-ESO-1

培养物1 实验1 64 44

实验2 44 52

培养物2 实验1 48 45

实验2 100 64

培养物3 实验1 20 37

实验2 16 16

培养物4 实验1 17 40

实验2 28 34

培养物5 实验1 36 26

实验2 4 36

培养物6 实验1 12 62

实验2 44 96

内源性NY-ESO-1导致裂解的事实表明NY-ESO-1是由HLA-A2阳性细胞加工成该肽的。

用第二种NY-ESO-1衍生的肽，即SLAQDAPPL进行相似的实验。这些结果如下：

肽刺激内源性产生NY-ESO-1

培养物1 实验1 28 16

实验2 30 14

培养物2 实验1 31 75

实验2 30 70

培养物3 实验1 32 44

实施例10

在进一步的实验中，通过将前面实验中产生的CTL与由HLA-A^*0201编码序列转染且随后用肽刺激的COS细胞混合，检验这些CTL的特异性。首先，在三个实验中对肽RLLEFYLAM进行测试，然后在6个实验中对SLAQDAPPL进行测试。如上所述对铕释放进行检测，并确定裂解的靶细胞的百分比。结果如下：

裂解百分比(％)

加入肽无肽

肽RLLEFYLAM

实验1 43 0

实验2 8 0

实验3 9 0

肽SLAQDAPPL

实验1 11 0

实验2 13 0

实验3 13 0

实验4 21 0

实验5 12 0

实验6 42 0

在其它的实验中，特异性针对RLLEFYLAM/HLA-A2复合物的CTL还识别并裂解已知表达HLA-A2和NY-ESO-1的黑色素瘤细胞系SK-Mel-37。通过将靶细胞与结合HLA-A2的单克隆抗体BB7.2预温育而抑制了这种识别。这证实了CTL对于肽和HLA-A2复合物是HLA-A2特异性的。

实施例11

以检验NY-ESO-1衍生肽的相同方法对源自SSX-4的另一种肽，即STLEKINKT(SEQ ID NO：)也进行了检验。首先利用表达HLA-A^*0201并且由于用编码全长SSX-4的cDNA转染而表达全长SSX-4蛋白或者用所述的肽刺激的COS细胞进行ELISPOT检测。在两个实验中对三种培养物进行测试。结果如下：

肽刺激内源性产生NY-ESO-1

培养物1 实验1 50 100

实验2 20 138

培养物2 实验1 8 12

实验2 6 14

培养物3 实验1 15 47

实验2 14 54

如同对NY-ESO-1肽，利用上述相同的检测进一步确证CTL的特异性，即将所产生的抗该复合物的CTL与由HLA-A^*0201转染并用肽刺激的COS细胞合并。利用上述的铕释放检测法。结果如下：

裂解百分比

加入肽无肽

实验1 22 0

实验2 14 0

实验3 46 0

实验4 16 0

如同对NY-ESO-1衍生肽，通过与单克隆抗体BB7.2的预温育而抑制CTL的识别，证实了CTL对于HLA-A2和肽的复合物的特异性。

实施例12

对于源自SSX-2的肽，即KASEKIFYV和源自NY-ESO-1的肽，即SLLMWITQCFL、SLLMWITQC以及QLSLLMWIT进行额外的实验。在每种情况下进行与在实施例8-11中所进行的相同类型的检测。结果具有可比性，因为对于每种肽，产生了对各种肽/HLA-A2复合物特异的CTL。

实施例13

分析SSX基因所编码蛋白的氨基酸序列中与HLA结合基元相应的肽序列。利用由引入作为参考的Parker等，免疫学杂志142:163(1994)所教授的算法进行分析，并通过利用第2位为Thr或Ala以及第9位为Thr或Ala的九聚体作为一种附加基元进行扩增。在随后的资料中，给出了HLA分子可能结合的氨基酸序列以及在相关SSX分子中的位置。所获的复合物应激发细胞毒T细胞应答。这可以由本领域的技术人员按照例如引入作为参考的van derBruggen等，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)24:3038-3043(1994)所教授的方法以及在上面实施例8-11中列举的方法来确定。

SSX-5

A2 KASEKIIYV 41-49

DAFVRRPRV 5-13

QIPQKMQKA 16-24

MTKLGFKAT 58-66

MTFGRLQGI 99-107

NTSEKVNKT 146-154

YVYMKRKYEA 48-57

YMKRKYEAMT 50-59

EAMTKLGFKA 56-65

MTKLGFKATL 58-67

RLQGIGPKIT 103-112

QLRPSGKLNT 138-147A3 GIFPKITPEK 106-115

KLNTSEKVNK 144-153A24 KYEAMTKLGF 54-63B7 HPQMTFGRL 96-104

GPQNNGKQL 131-139B8 RVRERKQL 167-174B44 YEAMTKLGF 55-63

RERKQLVIY 169-177B52 KQLVIYEEI 172-180

MTFGRLQGIF 99-108SSX-4A2 KSSEKIVYV 41-49

VMTKLGFKV 57-65

YVYMKLNYEV 48-57

KLNYEVMTKL 52-61

FARRPRDDA 7-13

QISEKLRKA 16-24

MTFGSLQRI 99-107

SLQRIFPKI 103-111

KIVYVYMKL 45-53

KLRKAFDDI 20-28

KLRKAFDDIA 20-29

YMKLNYEVMT 50-59

MTKLGFKVTL 58-67

QLCPPGNPST 138-147A3 KLNYEVMTK 52-60A24 NYEVMTKLGF 54-63B7 RPQMTFGSL 96-104

KPAEEENGL 115-123

GPQNDGKQL 131-139

CPPGNPSTL 140-148B8 RLRERKQL 167-174B35 RPRDDAQI 10-17

KPAEEENGL 115-123B44 YEVMTKLGF 55-63

RERKQLVVY 169-177B52 KQLVVYEEI 172-180

MTFGSLQRIF 99-108SSX-2A2 KIQKAFDDI 20-28

KASEKIFYV 41-49

AMTKLGFKA 57-65

RLQGISPKI 103-111

RLRERKQLV 167-175

DAFARRPTV 5-13

FARRPTVGA 7-15

QIPEKIQKA 16-24

MTFGRLQGI 99-107

ELCPPGKPT 138-146

YVYMKRKYEA 48-57

EAMTKLGFKA 56-65

MTKLGFKATL 58-67

RAEDFQGNDL 75-84

ELCPPGKPTT 138-147A3 TLPPFMCNK 66-74

KIFYVYMKRK 45-54A24 KYEAMTKLGF 54-63B7 RPQMTFGRL 96-104

GPQNDGKEL 131-139B8 RLRERKQL 167-174B35 FSKEEWEKM 32-40B44 YEAMTKLGF 55-63

RERKQLVIY 169-177B52 LQGISPKIM 104-112

KQLVIYEEI 172-180SSX-1A2 AMTKLGEKV 57-65

AMTKLGFKV 56-65

FAKRPRDDA 7-15

KASEKRSKA 16-24

YVYMKRNYKA 48-57

KAMTKLGFKV 56-65

MTKLGFKVT 58-66

MTKLGFKVTL 58-67

RIQVEHPQMT 91-100

MTFGRLHRI 99-107A3 TLPPFMCNK 66-74A24 NYKAMTKLGF 54-63B7 HPQMTFGRL 96-104

GPQNDGKOL 131-139B8 RLRERKQL 167-174B44 RERKQLVIY 169-177B52 KQLVIYEEI 172-180

MTFGRLHRH 99-108NY-ESO-1A2 SISSCLQQL 148-156

GTGGSTGDA 7-15

RASGPGGGA 52-60

GARGPESRL 79-87

ATPMEAELA 97-105

FTVSGMLT 126-134

LTAADHRQL 137-145

QLSLLMWIT 155-163

LMWITQCFL 159-167

FATPMEAEL 96-104

TVSGNILTI 127-135

ATGGRGPRGA 39-48

GAPRGPHGGA 59-68

LARRSLAQDA 104-113

ITQCFLPVFL 162-171

前面的实施例描述了对SSX4、SSX4的剪接变体以及SSX5基因的核酸分子的分离和克隆，以及用于确定各种SSX基因表达作为癌症的可能指标的方法。如上所示，这些基因表达于肿瘤细胞中，由此使本领域的技术人员能够利用这些进行例如癌症的检测。可以通过例如经聚合酶链式反应等核酸杂交确定一或多种SSX基因的转录子来确定表达。在一优选的实施方案中，通过将样品与同转录子特异性杂交的核酸分子相接触确定一种SSX基因转录子的存在。

核酸分子与靶的杂交表明SSX基因有表达，而且可能存在癌症。优选利用如在聚合酶链式反应中一样的两种引物分子进行杂交。通过这些检测法确定样品中一种以上本文的SSX基因的表达也属于本发明的一部分。为了技术人员的方便，在此提供已知的SSX1和SSX2的核苷酸序列为SEQ IDNOS:1和2。

其它的检测也为本发明的一部分。已知CT家族的成员在表达CT家族成员的个体中激发抗体。因此，可以通过例如检测取自目的受试者的样品中的抗体进行本文所述的检测方法。被分析的样品最优选为血清。以任何检测抗体的标准方法可以进行此类检测，例如通过将样品与一定量的蛋白或数种蛋白以及任何其他必需试剂相接触来确定抗体是否结合。一种方法包括利用固定化的蛋白，其中以任何本领域已知的标准方法将蛋白固定，然后与样品以及随后的例如抗IgG、抗Fc抗体等相接触。反过来，利用抗体代替上述检测法中的蛋白也可以确定SSX蛋白的存在。

SSX表达与癌症间的相关性还提示在治疗与SSX异常表达相关的状况中有效的各种治疗方法和组合物。“SSX的异常表达”在本文中可能意指表达本身或者与在正常个体中不同的水平，即它们可以较低或较高。

本发明设想一些治疗方法，例如利用反义分子来抑制或阻断表达。该反义分子为与所述核酸分子杂交并抑制其表达的寡核苷酸。优选这些的长度为17-50个核苷酸。优选将这些反义寡核苷酸与适当的载体例如阳离子脂质体联合给药。

其它治疗方法包括施予SSX蛋白本身、一种或多种由其衍生的抗原性肽、以及所谓的多元疫苗。这些包括多种抗原性肽的组合，优选通过连接序列组合。所获的肽可以结合MHC-Ⅰ类或Ⅱ类分子。这些蛋白、肽或多元疫苗可以与适当的佐剂联合施药。还可以将它们以设计来可以表达蛋白、肽、多元结构等的遗传学构建体的形式施予。肽和多元结构可以由所谓的“微型基因”来表达，所述的微型基因即为如上所述将设计来表达整个SSX分子的一些部分或该分子的各种部分的DNA分子连接在一起。人们可以制定治疗性组合物以及本文所述的方法，以便将一种或一种以上的SSX蛋白用作组合物的来源。换句话说，如果利用完整蛋白的方法，那么在一个配方中可以利用一种SSX分子，或者可以联合两个或更多。对于肽，这些可以均取自一种SSX分子，或者可以联合取自一种以上SSX分子的肽。本文所述的多元结构也可以由一种或一种以上SSX分子的组分所组成。

制剂的施予量及施予方法将根据所处理的情况和个体的不同而不同。可使用标准施药形式，如静脉、皮内、皮下、经口、直肠和穿皮施药。就制剂而言，蛋白质和或肽可与佐剂和/或载体如皂苷、GM-CSF、一或多种白细胞介素、一种乳化油如维生素E、一或多种热休克蛋白等联合使用。

当使用核酸方法时，可使用各种载体如基于痘病毒或腺病毒的载体。可使用任何能有效转染真核细胞如转染人的细胞的载体。这些载体可用于产生如树突状细胞等细胞，它们在其表面提呈相关肽/MHC复合体。然后可在施药前用常规方法使这些细胞不再增殖。

本发明还包括由对应于SSX分子、或NY-ESO-1分子的一部分的氨基酸序列，如上述肽序列所组成的肽。如已示，这类肽与MHC分子如HLA-A2结合，并激发能针对所形成之复合体的细胞毒T细胞增殖。如所示，表达全长分子(NY-ESO-1或SSX分子)的细胞确实可由相关肽脉冲进入细胞后所产生的CTL识别。该结果说明，所述肽和CTL均应是有效的治疗剂。因此，本发明另一方面是单独或联合(如以抗原“鸡尾酒”的形式)施予一或多种衍生自上述NY-ESO-1或SSX分子的肽。这类“鸡尾酒”可包括已根据特定患者的HLA型别而特别配制的肽的混合物。类似地，可根据全长分子内源性表达后所提呈的肽的识别，将体外产生的CTL施予患者。

需指出，当提及一种MHC分子，如HLA-A2时，将包括该分子的所有等位变体形式。HLA-A2分子有各种已知的类型，它们之间仅相差少数氨基酸，差异程度通常在全长分子中不到10个氨基酸，且不认为这些差异能影响这种分子形式与肽的结合能力。因此，可假设结合HLA-A^*0201分子的肽能结合HLA-A^*0202、HLA-A^*0204、HLA-A^*0205、HLA-A^*0206、HLA-A^*0207、HLA-A^*0209等。

本发明的其它方面对本领域技术人员而言是显而易见的，无需在此赘述。

所用术语和表达方式只为说明，并非限制，也不想用这类术语和表达方式排除所示和所述特点的任何等价变体形式或其部分，应理解各种修饰均有可能包括在本发明的范围内。序列表<110> Tureci,Ozlem

陈耀桢

Sahin,Ugur

Gure,AliO,

old,Lloyd J.

Pfreundschuh,Michael<120> 通过检测一种SSX基因的表达而确定标本中存在癌症的方法<130> LUD 5556.1 PCT<140> PCT/US99/14493<141> 1999-06-25<150> US 09/105,839<151> 1998-06-26<150> US 08/851,130<151> 1997-05-05<160> 22<210> 1<211> 766<212> DNA<213> 人<220><400> 1cactttgtca ccaactgctg ccaactcgcc accactgctg ccgcaatcgc 50aaccactgct ttgtctctga agtgagactg ctcctggtgc catgaacgga 100gacgacacct ttgcaaagag acccagggat gatgctaaag catcagagaa 150gagaagcaag gcctttgatg atattgccac atacttctct aagaaagagt 200ggaaaaagat gaaatactcg gagaaaatca gctatgtgta tatgaagaga 250aactataagg ccatgactaa actaggtttc aaagtcaccc tcccaccttt 300catgtgtaat aaacaggcca cagacttcca ggggaatgat tttgataatg 350accataaccg caggattcag gttgaacatc ctcagatgac tttcggcagg 400ctccacagaa tcatcccgaa gatcatgccc aagaagccag cagaggacga 450aaatgattcg aagggagtgt cagaagcatc tggcccacaa aacgatggga 500aacaactgca ccccccagga aaagcaaata tttctgagaa gattaataag 550agatctggac ccaaaagggg gaaacatgcc tggacccaca gactgcgtga 600gagaaagcag ctggtgattt atgaagagat cagtgaccct gaggaagatg 650acgagtaact cccctggggg atacgacaca tgcccttgat gagaagcaga 700acgtggtgac ctttcacgaa catgggcatg gctgcggctc cctcgtcatc 750aggtgcatag caagtg 766<210> 2<211> 931<212> DNA<213> 人<220><400> 2aactttctctc tctttcgatt cttccatact cagagtacgc acggtctgat 50tttctctttg gattcttcca aaatcagagt cagactgctc ccggtgccat 100gaacggagac gacgcctttg caaggagacc cacggttggt gctcaaatac 150cagagaagat ccaaaaggcc ttcgatgata ttgccaaata cttctctaag 200gaagagtggg aaaagatgaa agcctcggag aaaatcttct atgtgtatat 250gaagagaaag tatgaggcta tgactaaact aggtttcaag gccaccctcc 300cacctttcat gtgtaataaa cgggccgaag acttccaggg gaatgatttg 350gataatgacc ctaaccgtgg gaatcaggtt gaacgtcctc agatgacttt 400cggcaggctc cagggaatct ccccgaagat catgcccaag aagccagcag 450aggaaggaaa tgattcggag gaagtgccag aagcatctgg cccacaaaat 500gatgggaaag agctgtgccc cccgggaaaa ccaactacct ctgagaagat 550tcacgagaga tctggaccca aaagggggga acatgcctgg acccacagac 600tgcgtgagag aaaacagctg gtgatttatg aagagatcag cgaccctgag 650gaagatgacg agtaactccc ctcagggata cgacacatgc ccatgatgag 700aagcagaacg tggtgacctt tcacgaacat gggcatggct gcggacccct 750cgtcatcagg tgcatagcaa gtgaaagcaa gtgttcacaa cagtgaaaag 800ttgagcgtca tttttcttag tgtgccaaga gttcgatgtt agcgtttacg 850ttgtattttc ttacactgtg tcattctgtt agatactaac atttcattga 900tgacgaagac atacttaatc gatatttggt t 931<210> 3<211> 23<212> DNA<213> 人<220><400> 3cac aca gga tcc atg aac gga ga 23<210> 4<211> 33<212> DNA<213> 人<220><400> 4cacacaaagc tttgagggga gttactcgtc atc 33<210> 5<211> 576<212> DNA<400> 5atgaacggag acgacgcctt tgcaaggaga cccagggatg atgctcaaat atcagagaag 60ttacgaaagg ccttcgatga tattgccaaa tacttctcta agaaagagtg ggaaaagatg 120aaatcctcgg agaaaatcgt ctatgtgtat atgaagctaa actatgaggt catgactaaa 180ctaggtttca aggtcaccct cccacctttc atgcgtagta aacgggctgc agacttccac 240gggaatgatt ttggtaacga tcgaaaccac aggaatcagg ttgaacgtcc tcagatgact 300ttcggcagcc tccagagaat cttcccgaag atcatgccca agaagccagc agaggaagaa 360aatggtttga aggaagtgcc agaggcatct ggcccacaaa atgatgggaa acagctgtgc 420cccccgggaa atccaagtac cttggagaag attaacaaga catctggacc caaaaggggg 480aaacatgcct ggacccacag actgcgtgag agaaagcagc tggtggttta tgaagagatc 540agcgaccctg aggaagatga cgagtaactc ccctcg 576<210> 6<211> 576<212> DNA<220><400> 6atgaacggag acgacgcctt tgtacggaga cctagggttg gttctcaaat accacagaag 60atgcaaaagg ccttcgatga tattgccaaa tacttctctg agaaagagtg ggaaaagatg 120aaagcctcgg agaaaatcat ctatgtgtat atgaagagaa agtatgaggc catgactaaa 180ctaggtttca aggccaccct cccacctttc atgcgtaata aacgggtcgc agacttccag 240gggaatgatt ttgataatga ccctaaccgt gggaatcagg ttgaacatcc tcagatgact 300ttcggcaggc tccagggaat cttcccgaag atcacgcccg agaagccagc agaggaagga 360aatgattcaa agggagtgcc agaagcatct ggcccacaga acaatgggaa acagctgcgc 420ccctcaggaa aactaaatac ctctgagaag gttaacaaga catctggacc caaaaggggg 480aaacatgcct ggacccacag agtgcgtgag agaaagcaac tggtggatta tgaagagatc 540agcgaccctg cggaagatga cgagtaactc ccctca 576<210> 7<211> 23<212> DNA<220><400> 7ctaaagccatg cagagaagga agc 23<210> 8<211> 26<212> DNA<220><400> 8agatctctt attaatcttc cagaaa 26<210> 9<211> 23<212> DNA<220><400> 9gtgctcaaat accagagaag atc 23<210> 10<211> 22<212> DNA<220><400> 10ttttgggtcc agatctcctcg tg 22<210> 11<211> 24<212> DNA<220><400> 11ggaagagtgg gaaaagatga aagt 24<210> 12<211> 22<212> DNA<220><400> 12ccccttttgg gtccagatat ca 22<210> 13<211> 25<212> DNA<220><400> 13aaatcgtcta tgtgtatatg aagct 25<210> 14<211> 23<212> DNA<220><400> 14gggtcgctga tctcttcat aac 23<210> 15<211> 23<212> DNA<220><400> 15gttctcaaataccacagaag atg 23<210> 16<211> 20<212> DNA<220><400> 16ctctgctggc ttctcgggcg 20<210> 17<211> 27<212> DNA<220><400> 17acagcattac caaggacagc agccacc 27<210> 18<211> 27<212> DNA<220><400> 1gccaacagca agatgcatac cagggac 27<210> 19<211> 752<212> DNA<220><400> 1atcctcgtgg gccctgacct tctctctgag agccgggcag aggctccgga gcc 53ATG CAG GCC GAA GGC CGG GGC ACA GGG GGT TCG ACG GGC GAT GCT 98Met Gln Ala Glu Gly Arg Gly Thr Gly Gly Ser Thr Gly Asp Ala1 5 10 15GAT GGC CCA GGA GGC CCT GGC ATT CCT GAT GGC CCA GGG GGC AAT 143Asp Gly Pro Gly Gly Pro Gly Ile Pro Asp Gly Pro Gly Gly Asn

20 25 30GCT GGC GGC CCA GGA GAG GCG GGT GCC ACG GGC GGC AGA GGT CCC 188Ala Gly Gly Pro Gly Glu Ala Gly Ala Thr Gly Gly Arg Aly Pro

35 40 45CGG GGC GCA GGG GCA GCA AGG GCC TCG GGG CCG GGA GGA GGC GCC 233Arg Gly Ala Gly Ala Ala Arg Ala Ser Gly Pro Gly Gly Gly Ala

50 55 60CCG CGG GGT CCG CAT GGC GGC GCG GCT TCA GGG CTG AAT GGA TGC 278Pro Arg Gly Pro His Gly Gly Ala Ala Ser Gly Leu Asn Gly Cys

65 70 75TGC AGA TGC GGG GCC AGG GGG CCG GAG AGC CGC CTG CTT GAG TTC 323Cys Arg Cys Gly Ala Arg Gly Pro Glu Ser Arg Leu Leu Glu Phe

80 85 90TAC CTC GCC ATG CCT TTC GCG ACA CCC ATG GAA GCA GAG CTG GCC 366Tyr Leu Ala Met Pro Phe Ala Thr Pro Met Glu Ala Glu Leu Ala

95 100 105CGC AGG AGC CTG GCC CAG GAT GCC CCA CCG CTT CCC GTG CCA GGG 413Arg Arg Ser Leu Ala Gln Asp Ala Pro Pro Leu Pro Val Pro Gly

110 115 120GTG CTT CTG AAG GAG TTC ACT GTG TCC GGC AAC ATA CTG ACT ATC 458Val Leu Leu Lys Glu Phe Thr Val Ser Gly Asn Ile Leu Thr Ile

125 130 135CGA CTG ACT GCT GCA GAC CAC CGC CAA CTG CAG CTC TCC ATC AGC 503Arg Leu Thr Ala Ala Asp His Arg Gln Leu Gln Leu Ser Ile Ser

140 145 150TCC TGT CTC CAG CAG CTT TCC CTG TTG ATG TGG ATC ACG CAG TGC 548Ser Cys Leu Gln Gln Leu Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys

155 160 165TTT CTG CCC GTG TTT TTG GCT CAG CCT CCC TCA GGG CAG AGG CGC 593Phe Leu Pro Val Phe Leu Ala Gln Pro Pro Ser Gly Gln Arg Arg

170 175 180taa gcccagcctg gcgccccttc ctaggtcatg cctcctcccc tagggaatgg 646tcccagcacg agtggccagt tcattgtggg ggcctgattg tttgtcgctg gaggaggacg 706gcttacatgt ttgtttctgt agaaaataaa actgagctac gaaaaa 752<210> 20<211> 9<212> PRT<213> 人<220><400> 20Arg Leu Leu Glu Phe Tyr Leu Ala Met1 5<210> 21<211> 9<212> PRT<213> 人<220><400> 21Ser Leu Ala Gln Asp Ala Pro Pro Leu1 5<210> 22<211> 9<212> PRT<213> 人<220><400>Ser Thr Leu Glu Lys Ile Asn Lys Thr5

Claims

1．一种检测受试者体内既非黑色素瘤也非滑膜肉瘤的癌症的可能存在的方法，其包括分析取自该受试者的样品以确定一种SSX基因的表达，并确定该表达以作为对该样品中癌症的可能存在的确定。

2．权利要求1的方法，其中所述SSX基因为SSX1、SSX2、SSX4或SSX5。

3．权利要求2的方法，其中所述SSX基因为SSX1。

4．权利要求3的方法，其中所述癌症为乳腺癌、子宫内膜癌、结直肠癌、肺癌、膀胱癌、或头颈部癌。

5．权利要求2的方法，其中所述SSX基因为SSX2。

6．权利要求5的方法，其中所述癌症为淋巴瘤、乳腺癌、子宫内膜癌、结直肠癌、肾细胞癌、胶质瘤、肺癌、前列腺癌、膀胱癌、或头颈部癌。

7．权利要求2的方法，其中所述SSX基因为SSX4。

8．权利要求7的方法，其中所述癌症为乳腺癌、子宫内膜癌、结直肠癌、卵巢癌、胶质瘤、肺癌、胃癌、膀胱癌、或头颈部癌。

9．权利要求2的方法，其中所述SSX基因为SSX5。

10．权利要求9的方法，其中所述癌症为子宫内膜癌、结直肠癌、肺癌、或头颈部癌。

11．权利要求1的方法，其包括使所述样品与至少两种核酸分子接触，这两种核酸分子分别与一种不同的SSX基因特异性杂交。

12．权利要求11的方法，其中所述癌症为乳腺癌。

13．权利要求11的方法，其中所述癌症为子宫内膜癌。

14．权利要求11的方法，其中所述癌症为肺癌。

15．权利要求11的方法，其中所述癌症为结直肠癌。

16．权利要求11的方法，其中所述癌症为膀胱癌。

17．权利要求11的方法，其中所述癌症为头颈部癌。

18．权利要求1的方法，其包括通过使所述样品与一种特异性杂交所述SSX基因的核酸分子接触而测定表达，并测定杂交作为所述样品中癌症之可能存在的确定。

19．权利要求18的方法，其包括聚合酶链式反应。

20．权利要求1的方法，其包括测定所述样品中特异性结合所述SSX蛋白的抗体。

21．权利要求20的方法，其中所述样品为血清。

22．权利要求1的方法，其包括测定由所述SSX基因表达的SSX蛋白。

23．一种监控情况之进展的方法，该情况以一种SSX基因的异常表达水平为特征，其中所述情况不是黑色素瘤，也不是滑膜肉瘤，该方法包括分析有所述情况的受试者的样品，以确定一种SSX基因的表达水平，并比较该水平与该受试者中该SSX基因的在先表达水平，它们的差异说明上述情况的改变。

24．权利要求23的方法，其中所述情况为黑色素瘤或滑膜肉瘤，其不是一种癌症。

25．权利要求23的方法，其中所述受试者正接受针对该情况的一种治疗剂。

26．一种分离的肽，其由8-12个氨基酸组成，其中所述氨基酸对应于一种SSX或NY-ESO-1分子的邻近氨基酸，其中该分离的肽结合至一种HLA分子以形成复合体。

27．权利要求26的分离的肽，其中所述复合体刺激细胞毒T细胞的增殖。

28．权利要求26的分离的肽，其中所述HLA分子为HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24、HLA-B7、HLA-B8、HLA-B35、HLA-B44、或HLA-B52分子。

29．权利要求28的分离的肽，其中所述HLA分子为HLA-A2。

30．权利要求28的分离的肽，其中所述肽在其第二位和末位均为苏氨酸或丙氨酸残基。

31．权利要求30的分离的肽，其由氨基酸序列STLEKINKT组成。

32．一种刺激细胞毒T细胞增殖的方法，其包括将表面提呈MHC或HLA分子的细胞与权利要求28的分离的肽，以及含T细胞的样品在适于形成该HLA分子与该肽的复合体的条件下混合，并使特异于该复合体的细胞毒T细胞增殖。

33．权利要求32的方法，其中所述HLA分子为HLA-A2。

34．权利要求33的方法，其中所述肽为

RLLEFYLAM，

SLAQDAPPL，

STLEKINKT，或

KASEFIFYV。

35．权利要求32的方法，其包括向需要刺激细胞毒T淋巴细胞的受试者施予所述肽。

36．权利要求35的方法，其中所述受试者为癌症患者。

37．权利要求36的方法，其中所述癌症为黑色素瘤。

38．权利要求34的方法，其包括将所述细胞、所述肽、以及含所述T细胞的样品体外混合。

39．分离的细胞毒T细胞，其特异性识别由MHC或HLA分子与权利要求26的分离的肽形成的复合体。

40．权利要求39的分离的细胞毒T细胞，其中所述HLA分子为HLA-A2。

41．权利要求39的分离的细胞毒T细胞，其中所述分离的肽为

RLLEFYLAM，

SLAQDAPPL，或

STLEKINKT。

42．组合物，其包括由8-12个氨基酸组成的各种分离的肽和一种可药用载体，其中所述肽对应于SSX或NY-ESO-1分子的一个邻近氨基酸序列，并可结合HLA或MHC分子。

43．一种分离的核酸分子，其由编码权利要求26之分离的肽的核苷酸序列组成。

44．权利要求43的分离的核酸分子，其中所述肽为STLEKINKT。

45．一种分离的核酸分子，其由编码含8-12个氨基酸的不同分离肽的一种核苷酸序列组成，所述肽对应于SSX或NY-ESO-1分子的一个邻近氨基酸序列，并结合至少一种HLA或MHC分子。

46．表达载体，其包含权利要求43的分离的核酸分子，可操作连接至一个启动子。

47．表达载体，其包含权利要求45的分离的核酸分子，可操作连接至一个启动子。

48．重组细胞，其包含权利要求43的分离的核酸分子。

49．重组细胞，其包含权利要求45的分离的核酸分子。

50．权利要求48的重组细胞，进一步包含编码一种HLA分子的核酸分子。

51．权利要求49的重组细胞，进一步包含编码一种HLA分子的核酸分子。