CN1312174C

CN1312174C - 一种钠/质子反向转运器及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN1312174C
Application number: CNB021463107A
Authority: CN
Inventors: 王学臣; 陈敏; 陈珈; 陈受宜
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS; China Agricultural University
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS; China Agricultural University
Priority date: 2002-10-18
Filing date: 2002-10-18
Publication date: 2007-04-25
Anticipated expiration: 2022-10-18
Also published as: CN1490331A

Abstract

本发明公开了一种钠/质子反向转运器及其编码基因与应用。本发明所提供的钠/质子反向转运器来源于玉米，名称为zmNHX1，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。钠/质子反向转运器zmNHX1的编码基因，是下列核苷酸序列之一：1)序列表中序列1的DNA序列；2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。本发明的基因对培育抗盐植物品种，提高农作物产量具有重要意义。

Description

一种钠/质子反向转运器及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域中的钠/质子反向转运器及其编码基因与应用。

背景技术

盐渍对农业生产有极其严重的影响。盐胁迫是抑制植物生长，降低农作物产量的主要环境因素之一。中国15亿亩耕地中盐碱地大约有一亿亩，中低产田约10亿亩，大部分是由于干旱盐碱所致，另外还有3亿亩盐碱荒地。而且，在灌溉地区次生盐渍化田地还在继续增加。

Na⁺/H⁺反向转运器(Na⁺/H⁺antiporter)在细胞膜和液泡膜上都有分布。Na⁺/H⁺反向转运器与盐生植物的抗盐性有很大关系，它保证了Na⁺在液泡中的区域化，大大降低了液泡的渗透势，又减轻了Na⁺对细胞质的伤害。Na⁺/H⁺反向转运器还可以将进入根中的Na⁺泵出，维持体内低浓度的离子环境，这种机制在许多农作物中普遍存在。高等植物中Na⁺流出的主要机制是质膜上的H⁺/ATPase把H⁺泵出细胞，产生的电化学势可激活质膜上的Na⁺/H⁺反向转运器，H⁺进入细胞，Na⁺逆电化学势流出。从生理生化角度，在许多高等植物及藻类上都证明了Na⁺/H⁺反向转运器的活动。

许多植物的Na⁺/H⁺反向转运器载体的活性很低，因此他们在高盐环境中会失水最终死亡。在高盐环境中，Na⁺/H⁺反向转运器的合成及其活动都会受到抑制，但是通过提高细胞膜上不饱和脂肪酸的含量，可以消除这种阻碍因素的影响或通过转基因的方法增加Na⁺/H⁺反向转运器在植株中的含量来达到抗盐的目的。

1999年Apse用农杆菌介导的方法将AtNHX1转入拟南芥中，得到抗盐植株。这一结果给培育抗盐品种带来了美好的前景。

发明内容

本发明的目的是提供钠/质子反向转运器及其编码基因。

本发明所提供的钠/质子反向转运器来源于玉米，名称为zmNHX1，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将序列2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与序列2的氨基酸残基序列相同活性的由序列2衍生的蛋白质。

序列表中序列2氨基酸残基序列是由539个氨基酸残基组成的蛋白质。

以玉米EST设计引物，通过5’、3’RACE方法克隆到zmNHX1基因的全长cDNA。钠/质子反向转运器zmNHX1的编码基因，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中序列1的DNA序列；

2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。

序列表中序列1的DNA序列由2035个碱基组成，该基因的读码框为自5’端第1到第1617位碱基。

本发明所提供的钠/质子反向转运器及其编码基因，可以来自所有单子叶和双子叶植物，如烟草，拟南芥，草坪草，杨树，大豆，小麦，水稻，棉花和番茄等。利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的编码钠/质子反向转运器zmNHX1的基因导入植物细胞，可获得对高盐胁迫耐受力增强的转基因细胞系及转基因植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子，Ubiqutin启动子，增强子既可以是转录增强子，也可以是翻译增强子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素，卡那霉素等)。携带有本发明钠/质子反向转运器zmNHX1基因的表达载体可以是Ti(Tumor-induced-癌诱导)质粒、Ri(Root-induced-根诱导)质粒、植物病毒载体等，转化可通过农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法等常规生物技术方法实现，被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，如：水稻，小麦，玉米，大豆，棉花，蔬菜，树木和草坪草等。本发明的基因对培育抗盐植物品种，提高农作物产量具有重要意义。

附图说明

图1为Northern杂交分析结果。

具体实施方式

实施例1、钠/质子反向转运器zmNHX1的克隆

营养生长阶段的玉米(生长2周，4到5叶期)用150mmNaCl处理3小时。用TRIZLO(PROMAGA)提取根总RNA。根据玉米EST序列设计并合成基因特异引物

GSP1：5’agcgtgcacacagaatccgttgcag

GSP2：5’tgctgaatatcgctattgcgccgag

GSP3：5’ctcggcgcaatagcgatattcagca

GSP4：5’ctgcaacggattctgtgtgcacgct

具体操作按SMART RACE(CLONTECH)试剂盒进行。首先进行逆转录。反映体系为：1ul盐处理玉米根总RNA，1ul 5’-CDS或3’-CDS，1ul SMATII OLIGO引物(10um/L)，2ul灭菌水。混匀后，于70℃加热2min。置冰上冷却2min，离心使液体沉底。加入2ul 5X第一链缓冲液，1ul DTT(20mm/L)，1ul dNTP(10mm/L)和1ul MMLV逆转录酶(20U/ul)，42℃逆转录1.5小时，加入100ul灭菌水，于72℃加热2min终止反应。

随后，以通用引物混合物(UPM)和GSP1，UPM和GSP3分别进行5’，3’“TOUCHDOWN”PCR扩增。在PERKIN-ELMOR(PE)DNA THERMAL CYCLER 9700启动PCR反应。条件为5X(94℃30S，72℃3min)，5X(94℃30S，70℃10S，72℃2min)，20X(94℃30S，63℃30S，72℃30S)72℃min。以该次反应为模板，分别使用通用引物(NUP)和GSP2，GSP4进行巢式PCR。5’RACE获得400bp大小的条带，3’RACE获得1.6Kb大小的条带。分别回收纯化后，5’RACE片段连在PGEM-T EASY载体上，3’RACE直接测序。测序结果和已知EST序列进行拼接，并结合测序峰图进行校正。获得拼接好的序列zmNHX1基因，如序列表中的序列1所示，全长共2035bp，其中3’非编码区为418bp，编码区为1617bp。编码产物为539个氨基酸，如序列表中的序列2所示。

实施例2、zmNHX1基因在逆境胁迫条件下的表达特征

玉米种于含蛭石的花盆中，待长到3叶一心时期进行不同浓度的盐胁迫处理：50mM，150mM NaCl进行浇灌至土壤饱和。3小时后收取，提取根、叶总RNA，进行Northern blot分析。结果如图3所示，图中R：对照根；L：对照叶；50mmR：50mMNaCl处理根；50mmL：50mM NaCl处理叶；150mmR：150mM NaCl处理根；150mmL：150mMNaCl处理叶。从图中可以看出，zmNHX1基因在根中表达，在叶中不表达。50mMNaCl处理后，zmNHX1表达量大幅度升高。在100mM NaCl处理时，zmNHX1转录水平高于50mM NaCl处理时的转录水平。表明zmNHX1在根中表达并受盐胁迫诱导。

序列表

<160>2

<210>1

<211>2035

<212>DNA

<213>玉米属玉米(Zea mays.L)

<400>1

atggggctgg gtgcgggggc ggagctggtg cggctgggcg tgctgagctc gacctctgac 60

cacgcgtcgg tggtgtccat caacctgttc gtcgcgctgc tctgcgcctg catcgtcctg 120

ggccacctcc tggaggagaa ccgctgggtt aacgagtcca tcaccgcgct catcatcggg 180

ctgtgcaccg gcgtcgtgat cctgctgacc accaagggga agagctcgca catcctcgtc 240

ttcagcgagg acctcttctt catctacctc ctacctccca tcatcttcaa tgccgagttc 300

caggtgaaga agaaacggtt cttccggaat ttcatgacaa tcacactgtt gcagtgctgt 360

tggcacaatg atatccttct tcacatctct ctcggcgcaa tagcgatatt cagcagaatg 420

aacattggga cgctagatgt cggggatttt ctcgctattg gagctatctt ttctgcaacg 480

gattctgtgt gcacgctgca ggttctccat caggatgaga cgcccttttt gtacagtctc 540

gtgttcggtg agggagtcgt gaacgatgcc acgtctgttg tgctcttcaa cgcactccag 600

aacttcgatc ttaaccacat cgatgtagcc gttgtgctga atttcttggg aaacttctgt 660

tacttattcg tgtcaagcac cttacttgga gtgtttactg gattgctcag tgcctacata 720

attaagaagc tatatatagg aaggcattcc actgaccgtg aggttgcgct tatgatgctc 780

atggcttacc tctcctacat gctggccgag ctgctagatc tgagtggcat tcttaccgta 840

ttcttctgcg gcatcgtgat gtcgcattac acctggcaca atgtgacaga gagctcaaga 900

gtcacaacca agcatgcctt tgctactttg tccttcatcg ccgagacttt tctcttcctg 960

tatgttggga tggatgccct cgacatcgag aagtgggagt ttgccagtga cagcccgggc 1020

aaatccattg gcattagctc gattttgcta ggattggttc tgctggggag agctgcattt 1080

gttttcccat tgtcgttttt gtccaacctg acaaagaagt ctccattgga gaaaataaca 1140

tttagacagc aaattgtaat atggtgggcc ggactgatga gaggtgccgt gtccattgct 1200

ctcgcttaca acaagttcac gagatctgga cacactgagc tgcacggcaa cgcgataatg 1260

atcaccagca cgatcactgt ggtcctgttt agcactatgg tgtttgggat gatgacgaag 1320

ccattgatcc ggctgctgct ccctgcctgc agcaacacgg ccacctccga gccgtcctca 1380

cccaagtccc tgcactcgcc tctcctgacg agcatgcagg gctcggacat cgagacgggg 1440

tcggcacaga ttgtgaggcc gtccagcctc cggatgctcc taagcaagcc aacccacacg 1500

gtgcactact actggcgcaa gttcgacgac gcgctcatgc ggcccatgtt tggcggccgc 1560

gggttcgtgc ccttctcccc tggatcgccc actgagcaga gcgtccacga cggacggtga 1620

acaaagccgc gtctgacacc aagagacgag caggacatgc ttttggctgc taatggtcag 1680

atgatgatgt ttttgtttgt tgacagcttc tgatggtgcg ttagcaatgg caaggaggtg 1740

tcagtttgtt tggattagca ggatgaagaa gagcaaccct ggtaactggg gctgggggat 1800

tgagtttgtg catgacaagg ctgcaaactt ttgtatgtag ataaaaagaa cacccatttg 1860

gccatttgta ttgtatgtta ttgtatgtaa gctagcaggc ctgtacaact gcttttaggt 1920

cttcgtttgg atgggcgaaa ttctggcaaa cagcagcaca tccactctgt gttctgatct 1980

aagcatcttg gtttgatttt tgaaatggac tcggtgtgta ggataagctt ttgga 2035

<210>2

<211>539

<212>PRT

<213>玉米属玉米(Zea mays.L)

<400>2

Met Gly Leu Gly Ala Gly Ala Glu Leu Val Arg Leu Gly Val Leu

1 5 10 15

Ser Ser Thr Ser Asp His Ala Ser Val Val Ser Ile Asn Leu Phe

20 25 30

Val Ala Leu Leu Cys Ala Cys Ile Val Leu Gly His Leu Leu Glu

35 40 45

Glu Asn Arg Trp Val Asn Glu Ser Ile Thr Ala Leu Ile Ile Gly

50 55 60

Leu Cys Thr Gly Val Val Ile Leu Leu Thr Thr Lys Gly Lys Ser

65 70 75

Ser His Ile Leu Val Phe Ser Glu Asp Leu Phe Phe Ile Tyr Leu

80 85 90

Leu Pro Pro Ile Ile Phe Asn Ala Glu Phe Gln Val Lys Lys Lys

95 100 105

Arg Phe Phe Arg Asn Phe Met Thr Ile Thr Leu Leu Gln Cys Cys

110 115 120

Trp His Asn Asp Ile Leu Leu His Ile Ser Leu Gly Ala Ile Ala

125 130 135

Ile Phe Ser Arg Met Asn Ile Gly Thr Leu Asp Val Gly Asp Phe

140 145 150

Leu Ala Ile Gly Ala Ile Phe Ser Ala Thr Asp Ser Val Cys Thr

155 160 165

Leu Gln Val Leu His Gln Asp Glu Thr Pro Phe Leu Tyr Ser Leu

170 175 180

Val Phe Gly Glu Gly Val Val Asn Asp Ala Thr Ser Val Val Leu

185 190 195

Phe Asn Ala Leu Gln Asn Phe Asp Leu Asn His Ile Asp Val Ala

200 205 210

Val Val Leu Asn Phe Leu Gly Asn Phe Cys Tyr Leu Phe Val Ser

215 220 225

Ser Thr Leu Leu Gly Val Phe Thr Gly Leu Leu Ser Ala Tyr Ile

230 235 240

Ile Lys Lys Leu Tyr Ile Gly Arg His Ser Thr Asp Arg Glu Val

245 250 255

Ala Leu Met Met Leu Met Ala Tyr Leu Ser Tyr Met Leu Ala Glu

260 265 270

Leu Leu Asp Leu Ser Gly Ile Leu Thr Val Phe Phe Cys Gly Ile

275 280 285

Val Met Ser His Tyr Thr Trp His Asn Val Thr Glu Ser Ser Arg

290 295 300

Val Thr Thr Lys His Ala Phe Ala Thr Leu Ser Phe Ile Ala Glu

305 310 315

Thr Phe Leu Phe Leu Tyr Val Gly Met Asp Ala Leu Asp Ile Glu

320 325 330

Lys Trp Glu Phe Ala Ser Asp Ser Pro Gly Lys Ser Ile Gly Ile

335 340 345

Ser Ser Ile Leu Leu Gly Leu Val Leu Leu Gly Arg Ala Ala Phe

350 355 360

Val Phe Pro Leu Ser Phe Leu Ser Asn Leu Thr Lys Lys Ser Pro

365 370 375

Leu Glu Lys Ile Thr Phe Arg Gln Gln Ile Val Ile Trp Trp Ala

380 385 390

Gly Leu Met Arg Gly Ala Val Ser Ile Ala Leu Ala Tyr Asn Lys

395 400 405

Phe Thr Arg Ser Gly His Thr Glu Leu His Gly Asn Ala Ile Met

410 415 420

Ile Thr Ser Thr Ile Thr Val Val Leu Phe Ser Thr Met Val Phe

425 430 435

Gly Met Met Thr Lys Pro Leu Ile Arg Leu Leu Leu Pro Ala Cys

440 445 450

Ser Asn Thr Ala Thr Ser Glu Pro Ser Ser Pro Lys Ser Leu His

455 460 465

Ser Pro Leu Leu Thr Ser Met Gln Gly Ser Asp Ile Glu Thr Gly

470 475 480

Ser Ala Gln Ile Val Arg Pro Ser Ser Leu Arg Met Leu Leu Ser

485 490 495

Lys Pro Thr His Thr Val His Tyr Tyr Trp Arg Lys Phe Asp Asp

500 505 510

Ala Leu Met Arg Pro Met Phe Gly Gly Arg Gly Phe Val Pro Phe

515 520 525

Ser Pro Gly Ser Pro Thr Glu Gln Ser Val His Asp Gly Arg

530 535 539

Claims

1、钠/质子反向转运器，是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质。

2、权利要求1所述钠/质子反向转运器的编码基因，是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中序列1的DNA序列；

3、根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述钠/质子反向转运器的编码基因是序列表中序列1的DNA序列。

4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于：该基因的读码框为自5’端第1到第1617位碱基。

5、含有权利要求3所述基因的表达载体。

6、含有权利要求3所述基因的转基因细胞系。

7、权利要求3所述基因在培育抗盐植物品种中的应用。