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CN1304584C - 农作物秸秆发酵同时制取乳酸和饲料的方法 - Google Patents

农作物秸秆发酵同时制取乳酸和饲料的方法 Download PDF

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Abstract

农作物秸秆发酵同时制取乳酸和饲料的方法，它涉及一种农作物秸秆发酵同时制取乳酸及优质饲料的方法。本发明同步糖化发酵：在预处理后的秸秆中加入重量为固体底物2～3倍的水，121℃灭菌后，添加步骤(2)中制得的纤维素酶曲，使总底物中的纤维素酶曲酶活以纤维素滤纸酶活计达到42～50IU/g，接种活化后的耐高温乳酸菌，接种量为总底物重量的5～10%，于45～50℃条件下发酵72～108小时，发酵期间调节发酵底物的pH值为5.0～6.0。本发明大大缩短了发酵时间，提高了发酵效率，同步发酵72～108小时，即可得到每100g干秸秆产6～8g的乳酸和60～70g的优质饲料。具有生产成本低、投资少、无污染、能耗低、无废渣、无废液，充分利用资源的优点。

Description

农作物秸秆发酵同时制取乳酸和饲料的方法
技术领域：
本发明涉及一种农作物秸秆发酵同时制取乳酸及优质饲料的方法。
背景技术：
乳酸不仅在食品工业、医药工业中用途广泛，还可作为工业原料用于皮革、纤维行业。特别是近年来聚乳酸作为生物降解性塑料，具有很多优良性能，其原料乳酸的制造更为引人注目。以前，用于乳酸发酵的原料，一般是玉米、木薯、小麦、马铃薯等农作物的淀粉。但这些农作物，既是乳酸发酵的理想原料，同时又是宝贵的粮食。从资源有效利用和降低乳酸生产成本的角度看，利用其他廉价的碳源进行发酵是乳酸生产的研究热点之一。农作物秸秆是粮食生产的主要副产物，约占作物生物量的50％，是一类极丰富的能直接利用的生物资源。公开号为CN 1310949，CN 1294861，CN 1277813公开了由秸秆制作蛋白饲料的方法，这些方法只能从秸秆中得到一种饲料产物。日本特许公开2003-310243和1997-308494分别公开了利用废纸和污水处理厂污泥发酵制乳酸的方法，还有利用玉米渣、土豆渣、麦糠、麸皮，以及废弃的甜菜叶、甘蔗渣、制做马铃薯沙拉后的残渣、干酪工厂的下脚料、面包废弃物、造纸污泥以及贝类加工后的废弃物等生产乳酸的研究。上述这些方法只能制取乳酸，但不能既制取乳酸同时又生产饲料，特别是用农作物的秸秆制取乳酸同时生产饲料。
发明内容：
本发明的目的是提供一种农作物秸秆发酵同时制取乳酸和饲料的方法，它具有生产成本低、投资少、无污染、能耗低、无废渣、无废液，充分利用资源的特点。本发明所采取的步骤是：(1)农作物秸秆预处理：将秸秆粉碎至80～140目后，用稀碱液浸泡12～36小时，过滤，洗涤至洗涤液为中性。预处理产生的废液利用双极膜电渗析法回收木质素和碱液。(2)固态发酵制备纤维素酶曲：选用产纤维素酶的木霉、真菌作为出发菌株，在25～30℃的条件下固态发酵60～108小时，发酵产生的纤维素酶曲直接利用到后续的同步发酵中。制备纤维素酶曲的具体步骤为：a、将产纤维素酶的出发菌株，接种到斜面培养基培养，从活化的斜面刮几环孢子接入带玻璃珠的无菌水中，振荡，分散孢子，测定孢子浓度，使孢子悬浮浓度达106～107个/mL；b、于容器中添加秸秆粉、麸皮(糖蜜，豆腐渣)、缓冲营养液配制成培养基，秸秆粉与麸皮重量比为1∶1～1.5∶1，固液重量比为1∶2～1∶3，缓冲营养液pH值为4.0～6.0，其中添加硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁，其浓度分别为2％、0.1％、0.05％；c、将b步骤中的培养基灭菌，冷却后接种总重量的5～8％的孢子悬液，于25℃～30℃条件下培养60～108小时后得到纤维素酶曲。(3)乳酸菌活化：选用能在45～50℃条件下产酸良好的耐高温乳酸菌，用MRS培养基活化12～24小时。(4)同步糖化发酵：在预处理后(未烘干)的秸秆中加入重量为固体底物2～3倍的水，121℃灭菌后，添加步骤(2)中制得的纤维素酶曲，使总底物中的纤维素酶曲酶活以纤维素滤纸酶活计达到42～50IU/g，接种活化后的耐高温乳酸菌，接种量为总底物重量的5～10％，于45～50℃条件下发酵72～108小时，发酵期间调节发酵底物的pH值为5.0～6.0。(5)固液分离及产物的后处理：固液分离，收集上清液中的乳酸，采用电渗析等方法进一步提纯。提纯乳酸后的残液可回用于同步发酵过程。固液分离后得到的发酵残渣直接作饲料，或进一步在发酵残渣中，添加5～40％(wt％)的复合工程菌群和10～30％的辅料；在10～35℃条件下固态发酵48～240小时，将发酵产物在自然条件下或45℃条件下烘干，制得蛋白含量在10～40％的高蛋白饲料。本发明实现了秸秆同步发酵转化并同时得到乳酸和饲料两种产品，它具有如下优点：本发明利用产纤维素木霉、真菌等作为出发菌株，固态发酵生产纤维素，产酶量高，而且省去了纯化、制备纤维素酶制剂的过程，同时产纤维素酶曲所利用的培养基以秸秆为主，仅添加少量低成本的麸皮和硫酸铵等，不仅利用了秸秆，而且大大降低了制备酶的成本；选用耐高温的酵母，解决了酵母最适宜生长温度与纤维素酶解的最适温度不一致的技术难题，满足了同步发酵的要求；通过对同步发酵条件的研究，得到了优化的发酵工艺路线，大大缩短了发酵时间，提高了发酵效率，同步发酵72～108小时，即可得到每100g干秸秆产6～8g的乳酸和60～70g的优质饲料(干重)。利用本方法不仅可以将秸秆等农业废弃物同时转化为乳酸和优质饲料，生产成本低、投资少，而且整个工艺过程能耗低、无二次污染，是绿色环保的农作物秸秆利用方法。秸秆中含有丰富的纤维素类物质，以秸秆作为原料发酵生产乳酸，不仅可以从根本上改变目前乳酸以淀粉类物质为原料的生产状况，而且可以同时得到质优价廉的秸秆饲料，其中含有较丰富的蛋白质和部分还原糖类，还富含活性乳酸菌(但使用非食品乳酸菌后饲料需灭菌)和各种消化酶以及纤维素酶，具有较大的经济效益和应用前景。
附图说明：
图1为本发明中纤维素酶曲的制备工艺流程图，图2为本发明用秸秆同步发酵生产乳酸和饲料的工艺流程图。
具体实施方式：
具体实施方式一：(参见图1、图2)本实施方式是按如下步骤实现的：(1)农作物秸秆预处理：将秸秆粉碎至80～140目后，用稀碱液浸泡12～36小时，过滤，洗涤至洗涤液为中性。预处理产生的废液利用双极膜电渗析法回收木质素和碱液。(2)固态发酵制备纤维素酶曲：选用产纤维素酶的木霉、真菌作为出发菌株，在25～30℃的条件下固态发酵60～108小时，发酵产生的纤维素酶曲直接利用到后续的同步发酵中。制备纤维素酶曲的具体步骤为：a、将产纤维素酶的出发菌株，接种到斜面培养基培养，从活化的斜面刮几环孢子接入带玻璃珠的无菌水中，振荡，分散孢子，测定孢子浓度，使孢子悬浮浓度达106～107个/mL；b、于容器中添加秸秆粉、麸皮(糖蜜，豆腐渣)、缓冲营养液配制成培养基，秸秆粉与麸皮重量比为1∶1～1.5∶1，固液重量比为1∶2～1∶3，缓冲营养液pH值为4.0～5.0，其中添加硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁，其浓度分别为2％、0.1％、0.05％；c、将b步骤中的培养基灭菌，冷却后接种总重量的5～8％的孢子悬液，于25℃～30℃条件下培养60～108小时后得到纤维素酶曲。(3)乳酸菌活化：选用能在45～50℃条件下产酸良好的耐高温乳酸菌，用MRS培养基活化12～24小时。(4)同步糖化发酵：在预处理后(未烘干)的秸秆中加入重量为固体底物2～3倍的水，121℃灭菌后，添加步骤(2)中制得的纤维素酶曲，使总底物中的纤维素酶曲酶活以纤维素滤纸酶活计达到42～50IU/g，接种活化后的耐高温乳酸菌，接种量为总底物重量的5～10％，于45～50℃条件下发酵72～108小时，发酵期间调节发酵底物的pH值为5.0～6.0。(5)固液分离及产物的后处理：固液分离，收集上清液中的乳酸，采用电渗析等方法进一步提纯。提纯乳酸后的残液可回用于同步发酵过程。固液分离后得到的发酵残渣直接作饲料，或进一步在发酵残渣中，添加5～40％(wt％)的复合工程菌群和10～30％的辅料；在10～35℃条件下固态发酵48～240小时，将发酵产物在自然条件下或45℃条件下烘干，制得蛋白含量在10～40％的高蛋白饲料。所述农作物秸秆是玉米秸秆、大豆秸秆、水稻秸秆、高粱秸秆或小麦秸秆。所述纤维素酶曲制备过程中，所用产纤维素酶的菌种为康氏木霉、绿色木霉、土曲霉、嗜热纤维梭状芽孢杆菌中的任何一种或它们的混合菌群。所述步骤(4)中发酵期间调节发酵底物pH值所用的碱为氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾或氨水其中的一种或两种以上的混合物。为进一步制取高蛋白饲料而进行的固态发酵中，所添加的辅料是甜菜渣、甘蔗渣、豆渣、麦麸或谷糠中的至少一种。所述的复合工程菌群为热带假丝酵母菌、白地霉菌、康氏木霉菌和植物乳酸菌的混合物。
具体实施方式二：(参见图1、图2)本实施方式是按如下步骤实现的：(1)将大豆秸秆粉碎至140目后，用10％浓度的氨水室温浸泡24小时，过滤，洗涤至洗涤液为中性。预处理产生的废液利用双极膜电渗析法分离木质素和碱液。(2)将康氏木霉接种到斜面培养基培养至菌丝生长旺盛，从斜面刮几环孢子接入带玻璃珠的无菌水中，振荡，分散孢子，测定孢子浓度，使孢子悬浮浓度达107个/mL。(3)于容器中添加秸秆粉、麸皮、醋酸-醋酸钠缓冲溶液等配制成培养基，使秸秆粉与麸皮重量比为1∶1，固液重量比为2∶5，醋酸-醋酸钠缓冲溶液pH值为4.5，添加硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁，其浓度分别为2％、0.1％、0.05％，混合均匀，灭菌，冷却后接种总重量的5％的孢子悬液，于30℃条件下固态发酵96小时后得到纤维素酶曲，其纤维素酶活力为798.84FPU/ml。(4)斜面保存的耐高温乳酸菌株1环于MRS液体培养基中，50℃条件下120r/min培养16小时，然后按5％的接种量依次扩大培养。(5)在预处理后的湿秸秆中加入重量为固体底物2.5倍的水，121℃灭菌后，添加步骤(2)中制得的纤维素酶曲，使总底物中的纤维素酶曲酶活以纤维素滤纸酶活计达到42IU/g，接种活化后的耐高温乳酸菌，接种量为总底物重量的5％，于50℃条件下发酵96小时，发酵期间调节发酵底物的pH值为5.0～6.0。(6)用高速离心机进行固液分离，分析发酵液中的乳酸含量，可得到每100g干秸秆产出的乳酸6.2g。可采用电渗析等方法进行的提纯和精制。(7)分析固液分离所得发酵残渣中的粗蛋白、纤维素、半纤维素、木质素等含量见表1。若需要进一步提高蛋白含量可在所得发酵残渣中，添加5～40％(wt％)的复合工程菌群和10～30％的辅料；在10～35℃条件下固态发酵48～240小时，将发酵产物在自然条件下或45℃条件下烘干，制得蛋白含量在1540％的高蛋白饲料。
            表1预处理和乳酸发酵过程对秸秆成分的影响
  粗蛋白(％)   纤维素(％)   半纤维素(％)   木质素(％)   纤维素酶活(IU/g)
预处理前   5.83   24.99   11.91   17.64
预处理后(乳酸发酵前)   6.22   42.55   6.97   12.32
乳酸发酵后   12.77   17.62   5.31   20.32   24.39
具体实施方式三：(参见图1、图2)本实施方式是按如下步骤实现的：(1)将玉米秸秆粉碎，过80目的筛，室温下用8％浓度的氨水浸泡24小时，固液比为1∶10，之后过滤，洗涤至洗涤液为中性。预处理产生的废液利用双极膜电渗析法分离木质素和碱液。(2)将康氏木霉接种到斜面培养基培养至菌丝生长旺盛，从斜面刮几环孢子接入带玻璃珠的无菌水中，振荡，分散孢子，测定孢子浓度，使孢子悬浮浓度达107个/mL。(3)于容器中添加预处理后的秸秆粉、麸皮、水、硫酸铵，使秸秆粉与麸皮的重量比为1∶1，固液重量比为1∶3，营养液中硫酸铵浓度为2％，混合均匀，灭菌，冷却后接种总重量的5％的孢子悬液，于27℃条件下固态发酵96小时后得到纤维素酶曲，其产生的纤维素酶活力可达到1392.93FPU/(g.秸秆)。(4)斜面保存的耐高温乳酸菌株1环于液体培养基中，50℃条件下120r/min培养16小时，然后按5％的接种量依次扩大。(5)在预处理后的秸秆粉中添加纤维素酶曲，使总底物中的纤维素酶曲酶活以纤维素滤纸酶活计达到50IU/g，加入固体底物2.5倍重量的水；接种活化后的耐高温乳酸菌，接种量为总底物重量的5％。于50℃条件下发酵84小时。调节发酵底物的pH值为5.5～6.0。(6)用高速离心机进行固液分离，分析发酵液中的乳酸含量，可得到每100g预处理后的干秸秆产出的乳酸7.35g。可采用电渗析等方法进行的提纯和精制。(7)分析固液分离所得发酵残渣中各种成分的含量，得知乳酸发酵后残渣粗蛋白含量提高，纤维素降低，并具有较高酶活。结果见表2。若需要进一步提高蛋白含量可在所得发酵残渣中，添加5～40％(wt％)的复合工程菌群和10～30％的辅料；在10～35℃条件下固态发酵48～240小时，将发酵产物在自然条件下或45℃条件下烘干，制得蛋白含量在15～40％的高蛋白饲料。
                      表2预处理和乳酸发酵过程对秸秆成分的影响
  粗蛋白(％)   纤维素(％)   半纤维素(％)   木质素(％)   纤维素酶活(IU/g)
  预处理前   3.92   28.56   26.79   22.08
  预处理后(乳酸发酵前)   4.82   40.96   28.57   18.83
  乳酸发酵后   12.56   15.82   20.38   25.88   25.42

Claims (5)

1、农作物秸秆发酵同时制取乳酸和饲料的方法，其特征在于它的步骤是：(1)大豆秸秆预处理：将大豆秸秆粉碎至80～140目后，用稀碱液浸泡12～36小时，过滤，洗涤至洗涤液为中性，预处理产生的废液利用双极膜电渗析法回收木质素和碱液；(2)固态发酵制备纤维素酶曲：选用产纤维素酶的木霉作为出发菌株，在25～30℃的条件下固态发酵60～108小时，发酵产生的纤维素酶曲直接利用到后续的同步发酵中；(3)乳酸菌活化：选用能在45～50℃条件下产酸良好的耐高温乳酸菌，用MRS培养基活化12～24小时；(4)同步糖化发酵：在预处理后的大豆秸秆中加入重量为固体底物2～3倍的水，121℃灭菌后，添加步骤(2)中制得的纤维素酶曲，使总底物中的纤维素酶曲酶活以纤维素滤纸酶活计达到42～50IU/g，接种活化后的耐高温乳酸菌，接种量为总底物重量的5～10％，于45～50℃条件下发酵72～108小时，发酵期间调节发酵底物的pH值为5.0～6.0；(5)固液分离及产物的后处理：固液分离，收集上清液中的乳酸，采用电渗析方法进一步提纯，提纯乳酸后的残液可回用于同步发酵过程，固液分离后得到的发酵残渣直接作饲料。
2、根据权利要求1所述的农作物秸秆发酵同时制取乳酸和饲料的方法，其特征在于所述纤维素酶曲制备过程中，所用产纤维素酶的菌种为康氏木霉或绿色木霉。
3、根据权利要求1所述的农作物秸秆发酵同时制取乳酸和饲料的方法，其特征在于所述步骤(4)中发酵期间调节发酵底物pH值所用的碱为氢氧化钠、氢氧化钙、氢氧化钾或氨水其中的一种或两种以上的混合物。
4、根据权利要求1所述的农作物秸秆发酵同时制取乳酸和饲料的方法，其特征在于在所得发酵残渣中，添加wt5～40％的复合工程菌群和10～30％的辅料；在10～35℃条件下固态发酵48～240小时，将发酵产物在自然条件下或45℃条件下烘干，制得蛋白含量在15～40％的高蛋白饲料，其中所述的复合工程菌群为热带假丝酵母菌、白地霉菌、康氏木霉菌和植物乳酸菌的混合物，辅料是甜菜渣、甘蔗渣、豆渣、麦麸或谷糠中的至少一种。
5、根据权利要求1所述的农作物秸秆发酵同时制取乳酸和饲料的方法，其特征在于制备纤维素酶曲的具体步骤为：a、将产纤维素酶的出发菌株，接种到斜面培养基培养，从活化的斜面刮几环孢子接入带玻璃珠的无菌水中，振荡，分散孢子，测定孢子浓度，使孢子悬浮浓度达106～107个/mL；b、于容器中添加秸秆粉、麸皮、缓冲营养液配制成培养基，秸秆粉与麸皮重量比为1∶1～1.5∶1，固液重量比为1∶2～1∶3，缓冲营养液pH值为4.0～5.0，其中添加硫酸铵、磷酸二氢钾、硫酸镁，其浓度分别为2％、0.1％、0.05％；c、将b步骤中的培养基灭菌，冷却后接种总重量的5～8％的孢子悬液，于25℃～30℃条件下培养60～108小时后得到纤维素酶曲。
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CN1310949A (zh) * 2001-01-17 2001-09-05 中国科学院微生物研究所 利用微生物秸秆发酵剂生产秸秆蛋白饲料的方法

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