CN1303221C - 使用亲和放大的集成信号基团的靶核酸检测法 - Google Patents

Abstract

本发明总地涉及检测样品中靶核酸的方法。更具体地说，本发明涉及使用亲和放大的集成信号基团的靶核酸检测方法。本发明的方法显著地改善了信号的发生，因而在不降低特异性的条件下，显著地提高了检测效率和灵敏度。

Description

使用亲和放大的集成信号基团的靶核酸检测法

发明领域

本发明总地涉及检测样品中靶核酸的方法。更具体地说，本发明涉及使用亲和放大的集成信号基团的靶核酸检测方法。本发明的方法显著地改善了阳性信号的发生，因而在不降低特异性的条件下，显著地提高了检测效率和灵敏度。

发明背景

目前，检测RNA或DNA样品中靶核酸存在的方法基本上都是以互补核酸杂交方法为基础的。在这些方法中，一般都是使用在特定条件下产生化学发光或电化学发光的，并且以单个分子形式存在的物质，借以标记与靶核苷酸的至少一部分互补的寡核苷酸探针。在杂交条件下，当标记的探针与含有靶核苷酸序列的样品接触时，靶序列将与所说标记的探针杂交。然后，通常是在分离杂交的和未杂交的探针后，借助报道分子产生的光或光电信号指示与试验样品杂交的被标记物的存在和量，从而定量或定性地确定样品中靶核酸序列的存在。

现有技术中，一般都是将单个信号标记连接到核苷单体上，然后再将一个或多个这样的单体掺入到探针中。例如，目前已化学合成了含有生物素部分的脱氧尿嘌呤核苷三磷酸(dUTP)类似物并已掺入到多核苷酸中，然后可再将此生物素标记的核苷酸掺入到核酸探针中。另外，有人提出使标记物随机连接到核苷酸上的标记核苷酸探针的方法，或在寡核苷酸探针的单个核苷单体上连接多个标记，以期提高标记探针的可检测性。

然而已证明，在探针上使用许多这种标记的核苷酸可降低探针序列与靶核苷酸序列形成的杂交体的稳定性。有证据表明，这种杂交体稳定性的降低，同样也见于连有多个生物素分子的核酸探针。

迄今已描述了许多将多个报道分子掺入到寡核苷酸中的方法，例如其中包括线性加入标记的磷酯酰胺或类似物，以及引入氨基基团的方法。然而，这些方法都比较繁复而且普通实验室难以完成。

“分支”DNA，特别是“分支”核苷酸寡聚体的生产为引入多个标记提供了条件，例如可以使用非核苷磷酯酰胺类化合物向新生寡聚体中引入有两个5’末端的“分支”结构，从而可在经过n次合成后，使所加入的标记数目增加到n²个。或者可使用具有较高偶联效率和标记物产率的多功能试剂。但非核苷磷酯酰胺类化合物和所谓多功能试剂的合成均需要使用复杂的多核苷酸合成技术。

发明目的

本发明的一个目的是提供一种检测样品中靶核酸存在的方法，该方法包括以下步骤：

(1)以化学或物理学方法将俘获探针固定在固相载体上；

(2)加入靶核酸样品并使之与已固定的俘获探针接触并杂交，然后洗去游离的俘获探针和不与俘获探针杂交的其他核酸序列；

(3)在杂交条件下，加入一种或多种末端亲和基团化的，并且含有与靶核酸互补的核苷酸序列的检测探针；

(4)在适于亲和结合的条件下，向上述混合物中加入通过接头臂或直接与亲和基团连接的信号基团；

(5)检测所说的信号基团所发射的信号的强度，借以判断所说的靶核酸与所说的报道探针的特异性杂交并确定样品中靶核酸的存在及其量。

根据本发明方法的一个优选实施方案，其中步骤(2)和(3)可同时进行，即所说的靶核酸样品可与所说的报道探针同时加入。

根据本发明方法的一个优选实施方案，其中步骤(2)、(3)和(4)可同时进行，即所说的靶核酸样品可与所说的报道探针及所说的信号基团同时加入。

根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的一个或多个报道探针的靶核酸互补序列与所说的俘获探针的靶核酸互补序列是彼此不相重叠的。

根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的多个报道探针的靶核酸互补序列是彼此不相重叠的。

根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的检测探针与靶核酸序列上已与俘获探针杂交的区域以外的一个或多个互补区域杂交。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的亲和基团是生物素和亲和素。

根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的报道基团是可在所说的靶核酸与所说的报道探针杂交的条件下产生可检测的化学发光或电化学发光的基团。

根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的报道基团是可在所说的靶核酸与所说的检测探针杂交的条件下，通过亲和对例如生物素/亲和素之间的结合产生可检测的信号的基团。

根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的报道基团是高聚物微球，该微球通过包埋或交联等方式，携带大量产生可检测信号的物质，例如荧光物质。

根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的接头臂是两端分别共价连接亲和基团(例如亲和素)和信号基团的具有1-20个碳原子的直链烷烃或其衍生物。

根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的固相载体是微量滴定板的小孔，或高聚物微球或生物芯片。

根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的俘获探针是以化学偶联方法固定于固相载体上的。

本发明的另一个目的是提供用于检测样品中靶核苷酸存在的试剂盒，所说的试剂盒包括(1)固定于固相载体上的能够与靶核苷酸杂交的单链核苷酸俘获探针，(2)可与靶核苷酸链的不同区段杂交的一个或多个亲和基团化的单链核苷酸检测探针；(3)通过接头臂或直接与亲和基团连接的可检测基团。

根据本发明试剂盒的一个优选实施方案，其中所说的接头臂是两端分别共价连接亲和基团(例如亲和素)和信号基团的具有1-20个碳原子的直链烷烃或其衍生物。

根据本发明试剂盒的一个优选实施方案，其中所说的信号基团是高聚物微球，该微球通过包埋方式携带大量可产生信号的物质.例如荧光物质。

附图简要说明

附图1是显示本发明靶核酸检测方法之原理的示意图。

发明的详细描述

本发明涉及检测和定量分析样品中核酸的方法，特别是涉及使用多个探针和亲和放大的集成报道基团作为检测试剂，在固相检测系统中检测和定量分析特异性靶核酸的方法及试剂盒。本发明的方法可在无须对靶核酸进行扩增的情况下，借助放大了的集成信号检测靶核酸，因而可在不至于降低特异性的条件下，显著地提高检测效率和敏感性。

本说明书中使用的术语“靶核苷酸”或“靶”是指样品中存在的并可被定性或定量检测的任何含核酸物质。对于自然状态下以双链形式存在的靶核苷酸，可在酸或碱存在下经加热处理制成单链后再按照本发明的方法进行检测。

术语“寡核苷酸探针”或“探针”是指能够优先识别样品中特定核苷酸序列的任何含核酸化合物。一般说来，探针主要包括用于DNA操作(分离、扩增和切接)或检测(如检测特定病原体)中的寡或多核苷酸探针。术语“俘获探针”是指可以并能够被固定的，可与另一个核苷酸片段杂交的核苷酸序列。俘获探针可通过共价键直接结合到固相表面上，或通过离子键、吸附或双特异性结合对(如抗原/抗体、激素/受体、生物素/亲和素等)间接结合到固相上。术语“检测探针”是指可与靶核酸序列中俘获探针的互补杂交区段以外部分的核苷酸序列杂交的，并且末端亲和基团化(例如生物素化)的寡核苷酸序列。

本说明书中使用的术语“接头臂”或“接头”是指能够连接两个分子或功能基团，并且不干扰其所连接的功能性基团的性质或功能的分子或基团。为本发明目的，适用的接头臂或接头分子是包括1-20个碳原子的、两末端均带有适当的反应基团的直链烷烃和其衍生物。

本说明书中使用的术语“信号基团”是指可用任何可定量的物理方法检测的化学发光或电化学发光信号的发生源。所说的信号例如可以是散射光、发射光、荧光以及电磁波。本发明中优选的是由荧光物质受激发后产生的特定波长的荧光。特别是，本发明中优选的信号基团是包埋了时间分辨荧光铕络合物的微颗粒，特别是纳米颗粒。并且，其中所说的信号基团是指集成了在特定条件下产生各类发光分子的集合体。

本说明书中使用的术语“亲和基团”是指选自抗原/抗体、激素/受体、生物素/亲和素的特异性亲和结合对。术语“亲和基团化”则是指分子(例如本发明中的靶核酸和/或检测探针)的末端分别结合了所说的特异性亲和结合对。其中，本发明优选的特异性亲和结合对是生物素和亲和素(抗生物素蛋白)。

根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的信号基团是可在所说的靶核酸与所说的检测探针杂交的条件下，通过生物素/亲和素结合对之间的结合产生可检测的荧光的基团。并根据反应后所产生的荧光强度，结合标准曲线判断被检样品中特异核酸的存在及其量。

某些生物学分子对另一些分子的特异亲和性常常在各种诊断和筛选方法中得以利用。当某种生物学分子对另一种分子表现有结合特异性时，两种分子间就形成配体/受体键合。这种配体/受体键合包括抗原和其抗体、受体和其配体、生物素和亲和素(抗生物素蛋白)之间的键合。其中，一个极好的例子是蛋白质亲和素与小分子生物素之间的非共价相互作用。生物素和亲和素间的相互作用已被广泛用于核酸和蛋白质的定量分析和纯化。在生物技术领域中，生物素是常用于标记、检测和纯化蛋白质及核酸的重要试剂。而这些标记、检测和纯化方法都是建立在生物素与亲和素之间的显著亲和性基础上的。两者间的解离常数约为10^-15M，是已知的双特异性结合对中结合最强的对之一。生物素与其结合对象之间的紧密结合主要由分子中酰脲氮的氢键结合贡献的。

本发明的一个目的是提供一种检测样品中靶核酸存在的方法，该方法包括以下步骤：

(1)以化学或物理学方法将俘获探针固定在固相载体上；

(2)加入靶核酸样品并使之与已固定的俘获探针接触并杂交，然后洗去游离的俘获探针和不与俘获探针杂交的其他核酸序列；

(3)在杂交条件下，加入一种或多种末端亲和基团化(例如生物素化)并含有与所说的俘获探针杂交的靶核酸区段以外的其他不同区段之互补核苷酸序列的检测探针；

(4)在适于亲和结合的条件下，向上述混合物中加入通过接头臂或直接与亲和基团例如亲和素连接的信号基团；

(5)检测所说的信号基团所发射的信号的强度，借以判断所说的靶核酸与所说的报道探针的特异性杂交并确定样品中靶核酸的存在及其量。

根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的检测是在固相体系中进行的。固相可以是以任何形式存在的，例如可以是反应容器如试管壁或其部分，也可以是滤膜如硝酸纤维滤膜或各种高聚物颗粒或乳胶颗粒。其中优选的是高分子聚合物颗粒。对载体颗粒的大小没有严格限制，但颗粒大小应是易于以离心等方法分离的。一般说来，平均颗粒大小范围应在1nm-100μm之间。

特别是，为了实现高通量检测，可以在任何市售的商用生物芯片上完成依据本发明的靶核酸检测。

可用各种已知的方法将预先设计并制备的寡核苷酸探针固定在所说的固相载体例如上述高聚物颗粒上。适用于本发明方法的探针包括双链DNA、RNA和蛋白核酸(PNA)，以及含有不带电荷的骨架的其他核酸类似物。根据本发明方法的一个优选实施方案，探针序列的长度一般为8-40个碱基，因为在这个范围内，原核和真核生物体以及人的最小特有DNA序列均可被找到。但特别优选的探针长度是大约15-30个碱基。

然后向含有已固定探针的反应体系内加入得自待检生物学样品的靶核酸。一般说来，在大约15-25℃下反应大约1-5分钟即可完成互补碱基之间的杂交并形成杂交复合物。

由于本发明的方法相当灵敏，所以一般不需要对靶核酸进行PCR扩增。但在某些特定的情况下，如有较多污染或样品量过少(例如浓度低于10^-8M)时，亦可适当地加入PCR扩增步骤。

为了除去未杂交的样品靶核酸并尽可能地减少本底信号，可在杂交反应完成之后和加入本发明的与信号基团亲和连接的检测探针之前，最好包括一个充分洗涤过程。可使用具有标准盐浓度的杂交缓冲液完成洗涤步骤。然后向体系中加入本发明的末端生物素化的检测探针。

所说的检测探针具有与所说的俘获探针杂交的靶核酸区段以外的其他不同区段的互补核苷酸序列。为了提高检测的准确性和灵敏度，可以在反应体系中加入一个以上的检测探针。这些检测探针各自具有不同的核苷酸序列，并且分别互补于靶核苷酸的不同区段。一般说来，对应于一个小于100bp的靶核苷酸序列，例如可选择使用2-3个长度约15bp的末端生物素化的检测探针。在使用一个以上检测探针的情况下，可以使用发射不同颜色光的不同荧光物质标记与不同的检测探针亲合结合的信号基团，以利于提高检测的特异性。

根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的信号基团是可在所说的靶与所说的探针杂交的条件下产生化学发光或电化学发光的基团。本发明特别优选的信号基团是以物理或化学的方法与聚合物微颗粒结合的一组或多组荧光物质，并且所说的聚合物微颗粒还连接有双特异性亲和结合对的成员-亲和素。

所说的微颗粒一般是指直径在1nm-100nm之间，较好在20nm-20微米之间，最好在20nm-5微米之间的纳米颗粒。

与前述载体颗粒一样，用于本发明的纳米颗粒最好也是由聚苯乙烯或聚丙烯酸等聚合物材料制成的。颗粒中可含有适当量(如1-3％)的交联剂如二乙烯苯。颗粒可含有利于与接头臂或直接与嵌入剂连接的附加表面功能基团，例如羧酸、酯、醇、醛、胺等基团。实践中，可以在聚合物中掺入含有羧基的物质如丙烯酸或异丁烯酸以在颗粒中加入这些基团，并利用聚合物表面的这些基团连接含有反应性胺或巯基的化合物。

用于本发明的荧光物质是发射光波长约为614nm的时间分辨荧光铕络合物。但在任何特定条件下，各种可发光的物质均可使用。适用于本发明的染料例如包括但不只限于铕络合物、酞青染料、克酮酸衍生物、环丁烯二酮衍生物等。可以根据荧光的光发射和吸收性质以及疏水特性来选择适当的发光物质。可根据需要，使用下列三种不同的已知方法制备荧光颗粒：(1)将发光物质共价结合到颗粒的表面上；(2)在聚合物聚合形成颗粒期间内部掺入发光物质；(3)颗粒聚合后以扩散法着染颗粒(分别参见美国专利4,774,189、4,717,655和5,723,218号)。例如，可在圆底烧瓶内搅拌纳米颗粒的1％溶液，然后向其中加入溶于有机溶剂的染料。当颗粒不再吸附染料溶液时，停止加染料并减压除去溶剂。

可以使用本领域技术人员已知的化学方法将亲和素分子直接偶联到如上制得的荧光颗粒上，或者通过一个接头臂并借助其末端反应性基团连接到同样带有反应性基团(例如羧基)的荧光颗粒上。

根据本发明方法的一个优选实施方案，其中所说的接头臂是两末端可共价连接嵌入分子和信号基团的具有1-8个碳原子的直链烷烃和其衍生物，如醇、醛、酸、酯和胺等。为本发明的目的，特别优选的接头分子是戊二醛。

本发明的基本方法包括如上文所述的(2)-(4)三个反应步骤：即首先使固相化的俘获探针与核酸靶杂交；然后是检测探针与核酸靶杂交；最后是检测探针连接的生物素与信号基团结合的亲和素间的结合反应。然而为了方便起见，实践中也可以按两步骤法完成基于本发明基本原理的检测。即在固定俘获探针后，同时向反应体系内加入靶核酸和末端连接有生物素的检测探针，然后再加入连接有亲和素的标记基团如荧光染料着染的纳米微球。或者，更为简便的是，亦可以按一步骤法完成基于本发明基本原理的检测。即在固定俘获探针后，同时向反应中加入样品靶核酸、生物素连接的检测探针和亲和素连接的标记基团如荧光染料着染的纳米微球，然后根据微球受激发后发出之荧光的颜色(波长)和强度，确定被检靶核酸的存在和相对量。

本发明的另一个目的是提供用于检测样品中靶核苷酸存在的试剂盒，所说的试剂盒包括置于一个或多个容器中的(1)能够与靶核苷酸杂交的单链核苷酸俘获探针，(2)可靶核苷酸连链的不同区段杂交的一个或多个生物素化的单链核苷酸检测探针；(3)通过接头臂或直接与亲和素连接的检测基团。

根据本发明试剂盒的一个优选实施方案，其中所说的接头臂是两端分别共价连接亲和素和信号基团的具有1-8个碳原子的直链烷烃或其衍生物。

根据本发明试剂盒的一个优选实施方案，其中所说的信号基团是携带于纳米颗粒上的荧光染料。

在本发明的实施例1中，所使用的信号基团是直接与亲和素偶联的时间分辨荧光纳米颗粒。

由于改良了核酸检测系统中的信号生成和呈递元件，即利用了分别与检测探针和信号基团结合的双特异性结合对-生物素/亲和素，从而有效地实现了系统的信号放大，加之由于上述集成信号基团的使用，足可使信号强度提高数千倍甚至更多。另外，依据本发明的方法，由于可以适当地增加包括靶核酸不同区段之互补序列的检测探针的数目，从而显著地提高了检测方法的灵敏性和检测效率。再者，实践中可以结合具体情况，将本发明的三步骤方法合并为二步骤或一步骤方法，从而可进一步简化检测程序，提高检测速度和效率。

本发明的方法特别适于检测样品中低浓度靶核酸的存在及其可能的碱基错配，从而得以鉴定野生或变异的病原微生物及各种遗传性疾病，为临床提供可靠的诊断依据。由于改进了检测系统中的信号发生和呈递元件，即杂交信号的发生不再依赖于嵌入剂嵌入后的荧光辐射，并且不再仅仅依赖少数分子作为检测方法中的信号发生基团，而是代之以其强度高出数百甚至数千倍的集成信号基团。所以，本发明的方法不仅保留了其固有的特异性，而且显著提高了检测的灵敏性和检测效率。另外，由于本发明方法的高灵敏度，所以在多数情况下不必如常规方法那样进行费时费力的PCR扩增，即可以高灵敏度、低成本和高通量(例如在芯片上)完成检测。

下列实施例旨在进一步举例阐述本发明，但这些实施例并不以任何方式构成对本发明待批权利要求的限制。

实施例

实施例1：

本实施例以含有乙型肝炎病毒(HBV)的待检样品为例，举例描述本发明方法的高检测效率和灵敏性。

(1)单链寡核苷酸探针(俘获探针和检测探针)的制备和固定

基于乙型肝炎病毒的已知核苷酸序列设计并合成具有下示序列的俘获探针P1：5’-AGA CCA CCA AAT GCC CCT ATC-3’和P2：GTATCT TTT GGA ATG TGG ATT CGC ACT CCT CCC GCT TAC AGACCA CCA AAT GCC CCT ATC TTA TCA ACA CTT CCG GAA ACTACT ATT GTT AGA CGA CGA GGC，以及检测探针5’-生物素-TCCCCT AGA AGA AGA ACT C-3’。

用2×SSC溶液将硝酸纤维素滤膜浸湿并夹在两片玻璃板之间37℃烘干。然后，即可在干燥的滤膜上滴加含有适当浓度(66μg/ml)俘获探针P1和P2的溶液。加样后，将滤膜夹在两片玻璃板之间80℃烘烤约2小时备用。

(2)待检样品的予处理

取临床病人的血清样品0.5ml，向其中加入等体积样品提取液(1％TrionX-100、1％NP40、10mM Tris-HCl PH8.0)，96℃水浴10分钟，12000rpm离心取上清进行试验。

实验中，以已确诊的乙型肝炎病人血清样品为实验组；以经过PCR扩增和同样处理的探针溶液作为阳性对照组；以经过同样处理的正常人血清样品作为阴性对照组。

(3)预杂交和杂交反应

然后，将0.5ml与处理过的样品与1ml杂交溶液(由2ml二甲基甲酰胺、1ml 20×SSC缓冲液、0.4ml 50×Denhardts溶液、0.2ml1M PBS，pH 6.4组成)充分混合后，取0.1ml滴加在上述硝酸纤维素滤膜上并在密封条件下37℃预杂交30分钟。预杂交完成后，用含有2×SSC和0.1％SDS的溶液将上述硝酸纤维素滤膜37℃下洗涤3次，然后再用含0.1×SSC和0.1％SDS的溶液洗涤三次。

洗涤后，将0.5ml(1μg/ml)检测探针与1ml上述杂交溶液充分混合后，取0.1ml滴加在上述硝酸纤维素滤膜上并在密封条件下37℃杂交30分钟。杂交完成后，用含有2×SSC和0.1％SDS的溶液将上述硝酸纤维素滤膜37℃下洗涤3次，然后再用含0.1×SSC和0.1％SDS的溶液洗涤三次。洗涤后，使用含有2％BSA的Tris-HCL，pH 7.5的封闭溶液将滤膜37℃下封闭30分钟。封闭后，用上述同样洗涤溶液再洗涤三次(每次5分钟)。

(4)亲和反应

将洗过的滤膜风干后，在适当的加样位置点加亲和素联结合的时间分辨荧光铕纳米颗粒。震荡混匀后，于室温下避光反应约15分钟。反应完成后，分别用洗涤溶液A和B将滤膜洗涤各洗3次。

(6)时间分辨荧光强度的检测及其结果

洗涤后，使用时间分辨荧光读数仪对样品进行检测(激发光340nm，发射光614nm)。结果如下列表1和图2所示。

表1.使用本发明信号放大的核酸检测方法检测HBV血液样品的结果

时间分辨荧光强度	空白对照	阴性样品	阳性标本1	阳性标本2
					长探针P2	420	529	8649	794734
短探针P1	431	608	9854	1003261
PCR结果	0拷贝/ml	0拷贝/ml	105.4拷贝/ml	107.9拷贝/ml

从表1所示的结果可以看出，使用本发明的信号放大的核酸检测方法检测病原体(乙肝病毒)核酸时，在不必进行烦琐的PCR扩增的条件下，即可高特异性和高敏感性地获得预期检测结果。与现有技术中的已知方法相比，本发明的方法大大提高检测速度和效率，特别有益于高危人群的大范围使用。

                     序列表

<110>英科新创(厦门)科技有限公司

<120>使用亲和放大的集成信号基团的靶核酸检测法

<140>

<141>

<160>2

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>1

AGACCACCAA ATGCCCCTAT C

<210>2

<211>100

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。

<400>2

GTATCTTTTG GAATGTGGAT TCGCACTCCT CCCGCTTACA GACCACCAAA

TGCCCCTATC TTATCAACAC TTCCGGAATA CTATTGTTAG ACGACGAGGC

Claims (10)

1，一种检测样品中靶核酸存在的方法，该方法包括以下步骤：

(1)以化学或物理学方法将俘获探针固定在固相载体上；

(2)加入靶核酸样品并使之与已固定的俘获探针接触并杂交，然后洗去游离的俘获探针和不与俘获探针杂交的其他核酸序列；

(3)在杂交条件下，加入末端亲和基团化并含有与所说的俘获探针杂交的靶核酸区段以外的其他不同区段之互补核酸序列的检测探针；

(4)在适于亲和结合的条件下，向上述混合物中加入通过接头臂或直接与亲和基团连接的集成信号基团；

(5)检测所说的信号基团所发射的信号的强度，借以判断所说的靶核酸与所说的检测探针的特异性杂交并确定样品中靶核酸的存在及其量。

2，根据权利要求1的方法，其中所说的步骤(2)和(3)可同时进行，即所说的靶核酸样品可与所说的检测探针同时加入。

3，根据权利要求1的方法，其中所说的步骤(2)、(3)和(4)可同时进行，即所说的靶核酸样品可与所说的检测探针及所说的信号基团同时加入。

4，根据权利要求1的方法，其中所说的一个或多个检测探针的靶核酸互补序列与所说的俘获探针的靶核酸互补序列是互不重叠的。

5，根据权利要求1的方法，其中所说的多个检测探针的靶核酸互补序列是彼此互不重叠的。

6，根据权利要求1的方法，其中所说的信号基团是可在所说的靶核酸与所说的检测探针杂交的条件下产生可检测的化学发光或电学发光的集成基团。

7，根据权利要求1的方法，其中所说的信号基团是可在所说的靶核酸与所说的检测探针杂交的条件下，通过亲和基团对之间的结合产生可检测的信号基团。

8，根据权利要求1的方法，其中所说的信号基团是携带于微颗粒上可检测的信号基团。

9，根据权利要求1的方法，其中所说的接头臂是两端分别共价连接亲和基团和集成的信号基团的具有1-20个碳原子的直链烷烃或其醇、醛、酸、酯和胺。

10，用于检测样品中靶核苷酸存在的试剂盒，所说的试剂盒包括置于一个或多个容器中的(1)能够与靶核酸杂交的单链核酸俘获探针，(2)可与靶核酸链的不同区段杂交的一个或多个生物素化的单链核酸检测探针；(3)通过接头臂或直接与亲和基团连接的可检测基团。