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CN1302873A - 编码支链氨基酸的输出蛋白的核苷酸序列及其分离方法和应用 - Google Patents

编码支链氨基酸的输出蛋白的核苷酸序列及其分离方法和应用 Download PDF

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CN1302873A
CN1302873A CN00129891A CN00129891A CN1302873A CN 1302873 A CN1302873 A CN 1302873A CN 00129891 A CN00129891 A CN 00129891A CN 00129891 A CN00129891 A CN 00129891A CN 1302873 A CN1302873 A CN 1302873A
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CN
China
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polynucleotide
sequence
gene
seq
amino acid
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CN00129891A
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妮科尔·肯纳克内希特
赫尔曼·扎姆
洛塔尔·埃格林
瓦尔特·普费弗勒
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Forschungszentrum Juelich GmbH
Evonik Operations GmbH
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Forschungszentrum Juelich GmbH
Degussa GmbH
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Abstract

本发明涉及分离的多核苷酸,其含有选自如下一组的至少一个多核苷酸序列:a)与编码含有SEQ ID NO:3或5至少一个氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70%相同的多核苷酸,b)编码含有与SEQ ID NO:3或5的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸,c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸,以及d)含有a),b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸,其中所述多肽显示出brnE或brnF基因编码的酶的生物学活性。本发明还涉及经扩增所述基因而发酵生产支链L－氨基酸的方法。

Description

编码支链氨基酸的输出蛋白的核苷酸序列及其分离方法和应用
本发明涉及编码支链氨基酸的输出蛋白的核苷酸序列，该序列的鉴别和分离方法，和用棒状细菌发酵生产支链氨基酸的方法，其中该棒状细菌中编码支链氨基酸的输出蛋白的基因是扩增的。
支链氨基酸L-异亮氨酸、L-缬氨酸和L-亮氨酸用于制药工业及人用药物和动物营养。
已知支链氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产。由于其极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组成如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物如异亮氨酸类似物异亮氨酸hydroxyamate(Kisumi M,Komatsubara S,Sugiura,M,Chibata I(1972)细菌学杂志110:761-763)，缬氨酸类似物2-噻唑丙氨酸(TsuchidaT,Yoshinanga F,Kubota K,Momose H(1975)日本农业和生物化学39:1319-1322)或亮氨酸类似物α-氨基丁酸酯(Ambe-Ono Y,Sato K,Totsuka K,Yoshihara Y,Nakamori S(1996)生物科学生物工程生物化学60:1386-1387)有抗性或重要的调节氨基酸缺陷的并产生支链氨基酸的菌株(Tsuchida T,Yoshinanga F,Kubota K,Momose H(1975)日本农业和生物化学；Nakayama K,Kitada S,Kinoshita S(1961)日本普通及应用微生物学杂志7:52-69；Nakayama K,Kitada S,Sato Z,Kinoshita(1961)日本普通及应用微生物学杂志7:41-51)。
一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于棒杆菌生产支链氨基酸的菌株的改良，其通过扩增各个支链氨基酸生物合成基因，并研究对支链氨基酸生产的作用而进行改良。此方面的综述文章见Kinoshita(″谷氨酸细菌″，工业微生物的生物学，Demain和Soloman编辑，Benjamin Cummings，英国伦敦，1985,115-142),Hilliger(生物技术2,40-44(1991)),Eggeling(氨基酸6:261-272(1994)),Jetten和Sinskey(生物技术的关键回顾15,73-103(1995))和Sahm等(纽约科学协会年报782,25-39(1996))。
本发明人目的在于为改良支链氨基酸的发酵生产而提供新措施。
支链氨基酸用于制药工业及人用药物和动物营养，因此提供生产支链氨基酸的新改良方法总是令人感兴趣的。
当下文提及支链氨基酸时，是指L-异亮氨酸，L-缬氨酸或L-亮氨酸。
本发明提供了含有选自如下一组的至少一个多核苷酸序列的分离的多核苷酸：
a)与编码含有SEQ ID NO:3或5至少一个氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，
b)编码包括与SEQ ID NO:3或5的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及
d)含有a),b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸。
本发明还提供了能在棒状细菌中复制并源自棒杆菌的优选为重组的DNA，其至少含有如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:6所示的编码brnF和/或brnE的核苷酸序列。
本发明还提供了如权利要求1的能复制的DNA，其含有：
(ⅰ)编码brnF和/或brnE的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的核苷酸序列，或
(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于(ⅰ)序列的至少一个序列，或
(ⅲ)与互补于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地，
(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有义突变。
本发明还提供了
权利要求2的多核苷酸，其含有选自SEQ ID NO:1,2,4或6的至少一个核苷酸序列，
权利要求2的多核苷酸，其编码含有SEQ ID NO:3或5所示的氨基酸序列的至少一个多肽，
含有权利要求1的多核苷酸或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6的DNA序列的载体，
以及作为宿主细胞的含有所述载体的棒状细菌。
本发明还提供了多核苷酸，其基本上由一个多核苷酸序列组成，其可通过用含有SEQ ID NO:1,2,4或6所述多核苷酸或其片段的序列的探针杂交合适的基因文库，并分离所述的DNA序列来筛选获得，所述的文库包括具有SEQ ID NO:1,2,4或6的多核苷酸序列的完整基因。
本发明的多核苷酸序列适用作RNA、cDNA和DNA的杂交探针，以分离编码异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸输出蛋白的全长cDNA，以及分离与brnF和/或brnE基因具有高度序列相似性的cDNA或基因。
本发明的多核苷酸序列还适用作通过聚合酶链反应(PCR)制备编码异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸输出蛋白的基因DNA的引物。
作为探针或引物的这种寡核苷酸包括至少30个、优选至少20个、特别优选至少15个连续碱基。具有至少40或50个碱基对的寡核苷酸也是合适的。
“分离的”是指从其天然环境中分离出来。
“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。
“多肽”应理解为包括经肽键结合的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。
本发明的多肽包括SEQ ID NO:3和/或5的多肽，特别是具有运输支链氨基酸生物学活性的多肽，以及与SEQ ID NO:3和/或5的多肽至少70％相同的多肽，优选地与SEQ ID NO:3和/或5的多肽至少80％、特别是90-95％相同并具有所述活性的多肽。
本发明还提供了用所述能复制的DNA转化的棒状微生物，尤其是棒杆菌属。
本发明另外还提供了用尤其已生产支链氨基酸的棒状细菌发酵生产支链氨基酸的方法，在该棒状细菌中编码支链氨基酸的输出蛋白的基因brnE和/或brnF的核苷酸序列是扩增的，尤其是过表达的。
文中术语“扩增”是指微生物中由相应DNA编码的一或多种酶(蛋白质)的胞内活性的提高，例如通过提高基因的拷贝数，或用强启动子或编码高活性相应酶(蛋白质)的基因，及如果需要组合使用这些方法。
本发明的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或从甘油和乙醇中生产支链氨基酸，此微生物可以是棒状细菌的代表菌，尤其是棒杆菌属。在棒杆菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。
适当的棒杆菌菌属，尤其谷氨酸棒杆菌菌株，是例如已知的野生型菌株：
谷氨酸棒杆菌ATCC13032
黄色短杆菌ATCC14067
乳发酵短杆菌ATCC13869和
扩展短杆菌ATCC14020
和从中获得的生产支链氨基酸的突变体或菌株，
如生产异亮氨酸的菌株：
谷氨酸棒杆菌ATCC14309
谷氨酸棒杆菌ATCC14310
谷氨酸棒杆菌ATCC14311
谷氨酸棒杆菌ATCC15168
产氨棒杆菌ATCC6871
如生产亮氨酸的菌株：
谷氨酸棒杆菌ATCC21885
黄色短杆菌ATCC21889
或如生产缬氨酸的菌株：
谷氨酸棒杆菌DSM12455
谷氨酸棒杆菌FERM-P9325
乳发酵短杆菌FERM-P9324
乳发酵短杆菌FERM-P1763
本发明人已成功地分离谷氨酸棒杆菌的新基因brnE和brnF。这些基因是通过首先产生brnF或brnE缺陷的谷氨酸棒杆菌突变体而分离的。为此，将合适的起始菌株，如ATCC14752或ATCC13032进行诱变过程。经典的诱变过程是用化学物质如N-甲基-N-硝基-N-硝基胍或紫外辐射进行处理。这种起始突变的方法是已知的并参见Miller(细菌遗传学简要教程，大肠杆菌及相关细菌实验室手册(冷泉港实验室出版社，1992))，或美国细菌学学会的手册“普通细菌学方法手册”(美国华盛顿特区，1981)。
另一种诱变方法是转座子诱变方法，其是利用转座子“跳”入DNA序列的特征，从而破坏或抑制所涉及的基因的功能。本领域技术人员已知棒状细菌的转座子。红霉素抗性转座子Tn5432(Tauch等，质粒(1995)33:168-179)和氯霉素抗性转座子Tn5546已相应地从干燥棒杆菌菌株M82B中分离。Tauch等(质粒(1995)34:119-131和质粒(1998)40:126-139)证实用这些转座子可进行诱变。
另一种转座子是Ankri等(细菌学杂志(1996)178:4412-4419)所述的转座子Tn5531，其在本发明中作为例子应用。转座子Tn5531含有aph3卡那霉素抗性基因并可以质粒载体pCGL0040的形式应用，所述质粒如图1所示。转座子Tn5531的核苷酸序列可从国立生物技术信息中心(NCBI,Bethesda,MD,USA)以登录号U53587免费获得。
进行诱变优选转座子诱变后，搜索brnF或brnE缺陷的突变体。brnF或brnE缺陷的突变体的识别是基于其在极限培养基琼脂上生长良好，但在补加含有支链氨基酸的寡肽如异亮氨酸-异亮氨酸二肽的极限培养基琼脂上生长较差。
这种突变体的一个例子是菌株ATCC14752brnE::Tn5531。
如此产生的菌株可用于克隆和测序brnF和/或brnE基因。
为此，可建立所涉及的细菌的基因文库。可根据通常已知的教材和手册建立基因文库。例如由Winnacker所著教材：基因与克隆，基因工程入门(Verlag Chamie,Weinheim，德国，1990)，或由Sambrook等所著手册：分子克隆实验手册(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)。一非常熟知的基因文库是已由Kohara等(细胞50,495-508(1987))在λ载体中建立的E.coli K-12菌株W3110的基因文库。Bathe等(分子及普通遗传学，252:255-265,1996)阐述了借助于粘粒载体SuperCos I(Wahl等，1987,Proceeding of theNational Academy of Sciences USA,84:2160-2164)，在E.coli K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16:1563-1575)中建立的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库。适用于本发明的载体是在棒状细菌优选谷氨酸棒杆菌中复制的载体，这种载体是现有技术已知的，一个例子是质粒pZ1，其由Menkel等(应用及环境微生物学(1989)64:549-554)所述。如此获得的基因文库然后经转化或电穿孔转移进brnF或brnE缺陷的指示菌株，并选择能在存在含支链氨基酸的寡肽的极限培养基琼脂上生长的转化子。
当使用由棒状细菌的Tn5531诱变产生的突变体如菌株ATCC14752brnE::Tn5531时，通过其所含的卡那霉素抗性基因aph3可直接克隆和分离brnE::Tn5531等位基因。已知的克隆载体如pUC18(Norrander等，基因(1983)26:101-106和Yanisch-Perron等，基因(1985)33:103-119)可用于此目的。合适的克隆宿主尤其是限制和重组缺陷的大肠杆菌菌株，一个例子是菌株DH5αmcr，如Grant等(美国科学院院报7(1990)4645-4649)所述。在卡那霉素存在下选择转化子。然后对所得转化子的质粒DNA进行测序。Sanger等的双脱氧链终止法(美国科学院院报74:5463-5467,1977)可用于此目的。使用这一方法，可获得位于Tn5531插入位点上游和下游的基因。然后用商购序列分析软件如Lasergene软件包(用于Windows的Biocomputing软件，DNASTAR,Madison,USA)或HUSAR软件包(释放版本4.0，EMBL,Heidelberg，德国)分析和装配获得的核苷酸序列。
这是用于获得谷氨酸棒杆菌的编码支链氨基酸的输出蛋白的新DNA序列的方法，并在本发明中示作SEQ ID NO:1。SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4显示了基因brnF和brnE的编码区。SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5示出了从SEQ ID NO:1或从SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4获得的基因产物的氨基酸序列。
通过遗传密码的简并性产生的编码DNA序列也是本发明的一部分。同样，与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的部分杂交的DNA序列也是本发明的一部分。另外，保守氨基酸置换，如用丙氨酸置换甘氨酸，或用谷氨酸置换天冬氨酸，本领域已知是“有义突变”，其不引起蛋白质活性的任何基本改变，即是中性有功能的。另外已知蛋白质N和/或C-末端的改变基本不影响其功能，或者甚至可以稳定其功能，本领域技术人员可在以下文献中发现对此的论述，参见Ben-Bassat等(细菌学杂志169:751-757(1987))O’Regan等(基因77:237-251.(1989)),Sahin-Toth等(蛋白质科学3:240-247(1994)),Hochuli等(生物/技术6:1321-1325(1988))，及已知关于遗传和分子生物学的教材。以相应方式产生自SEQ IDNO:2或SEQ ID NO:4的氨基酸序列也是本发明的一部分。
用SEQ ID NO:1的核苷酸序列可以合成合适的引物，用这些引物进行聚合酶链反应(PCR)可扩增各种棒状细菌和菌株的brnF和brnE基因。本领域技术人员可在Gait的手册：寡核苷酸合成实用方法(IRL出版社，英国牛津，1984)及Newton和Graham:PCR(Spektrum Akademischer Verlag,Heidelberg，德国，1994)中找到指导。或者，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列或其部分可用作探针在基因文库特别是棒状细菌的基因文库中搜索brnF和/或brnE基因。本领域技术人员在宝灵格曼海姆有限公司的手册“用于滤膜杂交的DIG系统用户指南”(曼海姆，德国，1993)以及Liebl等(系统细菌学国际杂志(1991)41:255-260)中找到指导。然后克隆和测序以此方式扩增的含有brnE和brnF基因的DNA片段。
以此方式获得了如SEQ ID NO:6所示的菌株ATCC13032的brnE和brnF基因的DNA序列，并是本发明的一部分。
本发明人发现，在brnF和/或brnE输出蛋白基因过表达后，棒状细菌以改良方式生产支链氨基酸。
为获得过表达，可提高相应基因的拷贝数，或可使位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点突变。掺入结构基因上游的表达盒以同样方式工作。通过可诱导启动子，在支链氨基酸发酵生产期间增强表达也是可能的。通过目的在于延长mRNA寿命的措施，也可改良表达。通过防止酶蛋白的分解也可提高酶活性。基因或基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中，或可在染色体中整合与扩增。或者，通过改变培养基的组分和培养条件，也可获得相关基因的过表达。
本领域熟练技术人员从以下文献中可发现对此的详述，参见Martin等(生物/技术5,137-146(1987)),Guerrero等(基因138,35-41(1994)),Tsuchiya和Morinaga(生物/技术6,428-430(1988)),Eikmanns等(基因102,93-98(1991))，欧洲专利EP-B0472869，美国专利4,601,893,Schwarzer和Puhler(生物/技术9,84-87(1991)),Reinscheid等(应用及环境微生物学60,126-132(1994)),LaBarre等(细菌学杂志175,1001-1007(1993))，专利申请WO96/15246,Malumbres等(基因134,15-24(1993))，日本特许公开JP-A-10-229891,Jensen和Hammer(生物技术及生物工程58,191-195(1998)),Makrides(微生物学综述60:512-538(1996))及已知关于遗传及分子生物学的教材。
例如，本发明的基因brnF和brnE可借助于质粒过表达。合适的质粒是在棒状细菌中复制的质粒。许多已知的质粒载体，例如pZ1(Menkel等，应用和环境微生物学(1989)64:549-554),pEKEx1(Eikmanns等，基因102:93-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等，基因107:69-74(1991))是基于隐蔽性质粒pHM1519,pBL1或pGA1。其他质粒载体如pCG4(US-A4,489,160)或pNG2(Serwold-Davis等，FEMS微生物学通信66,119-124(1990))或pAG1(US-A5,158,891)可如此应用。
另外，除了新brnF和brnE基因之外，编码支链氨基酸的已知生物合成途径的其他酶或回补代谢的酶或柠檬酸循环的酶的一或多种基因的过表达，对支链氨基酸的生产可以是有益的。
因此，例如为生产L-异亮氨酸：
·编码高丝氨酸脱氢酶的hom基因(Peoples等，分子微生物学2,63-72(1988))或编码“抗反馈”高丝氨酸脱氢酶的homdr等位基因(Archer等，基因107,53-59(1991))可以同时过表达，或
·编码苏氨酸脱水酶的ilv基因(Mockel等，细菌学杂志(1992)8065-8072)或编码“抗反馈”苏氨酸脱水酶的ilvA(Fbr)等位基因(Mockel等，(1994)分子微生物学13:833-842)可以同时过表达，或
·编码乙酰羟酸合酶的基因ilvBN(Keilhauer等，(1993)细菌学杂志175:5595-5603)可以同时过表达，或
·编码二羟酸脱水酶的ilvD基因(Sahm und Eggeling(1999)应用和环境微生物学65:1973-1979)可以同时过表达，或
·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(DE-A-19 831 609)可以同时过表达，或
·编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等，欧洲生化杂志254,395-403(1998))可以同时过表达。
因此，例如为生产L-亮氨酸，
·编码异丙基苹果酸酯合酶的leuA基因(Patek等，应用及环境微生物学60(1994)133-140)或编码“抗反馈”异丙基苹果酸酯合酶的等位基因可以同时过表达，或
·编码异丙基苹果酸酯脱水酶的leuC和leuD基因(Patek等，应用及环境微生物学60(1994)133-140)可以同时过表达，或
·编码异丙基苹果酸酯脱氢酶的leuB基因(Patek等，应用及环境微生物学60(1994)133-140)可以同时过表达，或
·编码乙酰羟酸合酶的基因ilvBN(Keilhauer等，(1993)细菌学杂志175:5595-5603)可以同时过表达，或
·编码二羟酸脱水酶的ilvD基因(Sahm und Eggeling(1999)应用和环境微生物学65:1973-1979)可以同时过表达，或
·编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等，欧洲生化杂志254,395-403(1998))可以同时过表达。
因此，例如为生产L-缬氨酸，
·编码乙酰羟酸合酶的基因ilvBN(Keilhauer等，(1993)细菌学杂志175:5595-5603)可以同时过表达，或
·编码二羟酸脱水酶的ilvD基因(Sahm und Eggeling(1999)应用和环境微生物学65:1973-1979)可以同时过表达，或
·编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等，欧洲生化杂志254,395-403(1998))可以同时过表达。
除brnE和/或brnF基因的过表达之外，排除非所需的二级反应对支链氨基酸的生产也是有益的(Nakayama：“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl,Sikyta,Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦，英国，1982)。
根据本发明产生的微生物可连续培养或在分批方法，或在补料分批方法或重复补料分批法中分批培养以生产支链氨基酸。已知的培养法由Chmiel(Bioprozesstechnik l.Einfuhrung in dieBioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991)所著教材，或由Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(ViewegVerlag,Brunswick/Wiesbaden,1994))所著教材中提供。
所用培养基必须以适当方式符合各菌株的需求，关于各种微生物培养基的阐述见于，美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D.C.,USA,1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸，这些物质可单独或混合使用，可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用，可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素，此外，可将适当前体加入培养基中上述物质可以单批形式或在培养期间以适当方式加入培养物中。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH,KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的PH值，抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃～40℃，持续培养直至支链氨基酸形成最大量。此目的通常在10～160小时范围达到。
支链氨基酸的分析可通过阴离子交换层析，随后经如Speckman等(分析化学，30,(1958),1190)所述茚三酮衍生化作用进行，或经反相HPLC进行，如Lindroth等(分析化学(1979)51:1167-1174)。
以下微生物根据布达佩斯条约，已保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不伦瑞克，德国)：
·大肠杆菌菌株GM2929pCGL0040，保藏号DSM12839。
本发明借助于以下提供的实施例得以更详述阐述。
根据Sambrook等(分子克隆实验手册(1989)，冷泉港实验室出版社)进行从大肠杆菌分离质粒DNA，限制消化，Klenow和碱性磷酸酶处理。除非另有说明，根据Chung等(美国科学院院报(1989)86:2172-2175)进行大肠杆菌的转化。
实施例1谷氨酸棒杆菌ATCC14752的brnF和brnE基因的克隆和测序1、转座子诱变
用转座子Tn5531诱变谷氨酸棒杆菌菌株ATCC14752，该转座子的序列见国立生物技术信息中心(Bethesda,USA)的核苷酸数据库，登录号为U53587。含有装配的转座子Tn5531的质粒pCGL0040(Ankri等，细菌学杂志(1996)178:4412-4419)是从甲基化酶缺陷的大肠杆菌菌株GM2929pCGL0040(E.coli GM2929:Palmer等，基因(1994)143:1-12)中分离的。经电穿孔法(Haynes等，FEMS微生物学通信(1989)61:329-334)用质粒pCGL0040转化谷氨酸棒杆菌菌株ATCC14752。通过在含有15微克/毫升卡那霉素的LBHIS琼脂板(Liebl等，FEMS微生物学通信(1989)65:299-304)上的卡那霉素抗性鉴别转座子Tn5531已整合进基因组的克隆。以此方式获得2000个克隆，测试它们在异亮氨酸-异亮氨酸存在下的延迟生长。为此，将所有克隆单独转移至具有或不具有3mM异亮氨酸-异亮氨酸的CGXⅡ极限培养基琼脂板上。该培养基与Keilhauer等(细菌学杂志(1993)175:5593-5603)所述的CGXⅡ培养基相同，但另外含有25微克/毫升卡那霉素和15克/升琼脂。Keilhauer等所述的该培养基的组成见表1。
表1培养基CGXⅡ的组成
    组分     浓度
    (NH4)2SO4     20g/L
    尿素     5g/L
    KH2PO4     1g/L
    K2HPO4     1g/L
    MgSO4×7H2O     0.25g/L
    3-吗啉代丙磺酸     42g/L
    CaCl2     10mg/L
    FeSO4×7H2O     10mg/L
    MnSO4×H2O     10mg/L
    ZnSO4×7H2O     1mg/L
    CuSO4     0.2mg/L
    NiCl2×6H2O     0.02mg/L
    生物素     0.2mg/L
    葡萄糖     40g/L
    原儿茶酸     30mg/L
琼脂板在30℃保温，并在12、18和24小时后检查生长。获得一转座子突变体，其在缺少异亮氨酸-异亮氨酸时以与起始菌株谷氨酸棒杆菌ATCC14752相当的方式生长，但在存在3mM异亮氨酸-异亮氨酸时生长延迟。该突变体命名为ATCC14752brnF::Tn5531。2、ATCC14752brnF::Tn5531中Tn5531插入位点的克隆和测序
为克隆实施例1.1中所述的突变体的转座子Tn5531下游的插入位点，首先如Schwarzer等(生物/技术(1990)9:84-87)所述分离这一突变体菌株的染色体DNA，并用限制性内切酶EcoRⅠ切割400ng染色体DNA。将完全限制的产物连接进购自Roche Diagnostics的同样用EcoRⅠ线性化的载体pUC18(Norander等，基因(1983)26:101-106)。然后将连接混合物经电穿孔(Dower等，核酸研究(1988)16:6127-6145)转化进大肠杆菌菌株DH5αmcr(Grant,1990，美国科学院院报87:4645-4649)。经在含有50微克/毫升羧苄青霉素和25微克/毫升卡那霉素的LB琼脂板上的羧苄青霉素和卡那霉素抗性鉴别其中转座子Tn5531的插入位点以克隆形式存在于载体pUC18上的转化子。从3个转化子中制备质粒并经限制分析确定克隆的插入片段的大小。用Sanger等的双脱氧链终止法(美国科学院院报(1977)74:5463-5467)确定具有约7.2kb大小插入片段的一个质粒上的插入位点的核苷酸序列。为此，以下列寡核苷酸引物出发测序1.3kb插入片段：
5′-CGG GTC TAC ACC GCT AGC CCA GG-3＇。
为鉴别转座子上游的插入位点，用限制性内切酶PstⅠ切割突变体的染色体DNA并连接进已用PstⅠ线性化的载体pUC18中。其余的克隆操作如上所述。用Sanger等的双脱氧链终止法(美国科学院院报(1977)74:5463-5467)确定具有约4.8kb大小插入片段的一个质粒上的插入位点的核苷酸序列。为此，以下列寡核苷酸引物出发测序1.6kb插入片段：5′-CGG TGC CTT ATC CAT TCA GG-3＇。
用Lasergene软件包(用于Windows的Biocomputing软件，DNASTAR,Madison,USA)分析和组装获得的核苷酸序列。这一核苷酸序列再现为SEQ ID NO:1。分析鉴别了长度为753bp和324bp的两个开放读框，其示作SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4。相应的基因命名为brnF和brnE。相关的基因产物包括251和108个氨基酸并再现为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5。
实施例2从谷氨酸棒杆菌ATCC13032中克隆和测序brnF和brnE基因
将来自菌株ATCC13032的基因brnF和brnE克隆进大肠杆菌克隆载体pUC18(Norander等，基因(1983)26:101-106,Roche Diagnostic，曼海姆，德国)中。克隆以两步进行，首先用衍生自SEQ ID NO:1的下述寡核苷酸引物经聚合酶链反应(PCR)扩增来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因。
brnE,brnF，-正向：
5′-[AGC GCT GTC TGC TTA AGC CTT TTC]-3′
brnE,brnf，-反向：
5′-[GCG CGA TCA ATG GAA TCT AGC TTC]-3′
PCR反应在200μM脱氧核甘酸三磷酸(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)，1μM相应寡核苷酸，100ng谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA，1/10体积的10×反应缓冲液和2.6单位的热稳定Taq/PwoDNA聚合酶混合物(来自Roche Diagnostics的扩充高可靠性PCR系统，曼海姆，德国)存在下在一热循环仪(PTC-100,MJ研究公司，Watertown,USA)中在如下条件下进行30个循环：94℃30秒，58℃30秒和72℃2分钟。
然后用SureClone连接试剂盒(Amersham Pharmacia Biotech,Uppsala，瑞典)根据厂商指导将约1.3kb大小的扩增片段连接进载体pUC18的SmaⅠ限制位点中。用连接混合物转化大肠杆菌菌株DH5αmcr(Grant,1990，美国科学院院报87:4645-4649)。经在含有50微克/毫升羧苄青霉素的LB琼脂板上的羧苄青霉素抗性鉴别转化子。从8个转化子中制备质粒并经限制分析确定1.3kb PCR片段的插入片段的存在。以后将得到的重组质粒命名为pUC18brnEF。
用Sanger等的双脱氧链终止法(美国科学院院报(1977)74:5463-5467)质粒pUC18brnEF中的1.3kb PCR片段的核苷酸序列。为此，用购自Roche Diagnostics(曼海姆，德国)的下述引物测序pUC18brnEF的完整插入片段。
通用引物：
5′-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3′
反向引物：
5′-GGA AAC AGC TAT GAC CAT G-3′
所得核苷酸序列再现为SEQ ID NO:6。用Lasergene软件包(用于Windows的Biocomputing软件，DNASTAR,Madison,USA)分析所获得的核苷酸序列。
实施例3谷氨酸棒杆菌ATCC13032的brnEF基因的表达
将brnEF基因克隆进大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pJC1(Cremer等，分子和普通遗传学220:478-480)中。克隆以两步骤进行。首先用衍生自SEQ ID NO:6的下述寡核苷酸引物经聚合酶链反应(PCR)扩增来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因。brnEF-正向：
5′-GCT CTA GAA CCT TGT CAG CCA GTG CG-3′brnEF-反向：
5′-GCT CTA GAA AAA ATC CGC ATC CCC TCA-3′
这些寡核苷酸引物另外还含有位于5’一侧的XbaⅠ识别位点。PCR反应在200μM脱氧核苷酸三磷酸(dATP,dCTP,dGTP,dTTP)，1μM相应寡核苷酸，100ng谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA，1/10体积的10×反应缓冲液和2.6单位的热稳定Taq/Pwo DNA聚合酶混合物(来自Roche Diagnostics的扩充高可靠性PCR系统，曼海姆，德国)存在下在一热循环仪(PTC-100,MJ研究公司，Watertown,USA)中在如下条件下进行30个循环：94℃30秒，58℃30秒和72℃2分钟。然后约1.3kb大小的扩增片段用限制酶XbaⅠ根据厂商Roche Diagnostics(曼海姆，德国)的指导处理并用RapidLigation试剂盒(Roche Diagnostics)连接进载体pJC1的XbaⅠ限制位点。用连接混合物转化大肠杆菌菌株DH5αmcr(Grant,1990,美国科学院院报87:4645-4649)。经在含有50微克/毫升卡那霉素的LB琼脂板上的卡那霉素抗性鉴别转化子。从8个转化子中制备质粒并经限制分析确定1.3kb PCR片段的插入片段的存在。以后将得到的重组质粒命名为pJC1brnEF。经电穿孔(Haynes等，FEMS微生物学通信(1989)61:329-334)将质粒pJC1和pJC1brnEF导入形成异亮氨酸的谷氨酸棒杆菌菌株DM368-2中。菌株DSM368-2的描述见EP-B-0 385 940并已根据布达佩斯条约保藏在德意志微生物保藏中心，保藏号DSM5399。通过在含有15微克/毫升卡那霉素的LBHIS琼脂平板上的卡那霉素抗性(Liebl等，FEMS微生物学通信(1989)65:299-304)鉴别转化子。以此方式获得谷氨酸棒杆菌菌株DM368-2/pJC1和DM368-2/pJC1brnEF。
实施例4用谷氨酸棒杆菌生产L-异亮氨酸
通过在50毫升含有50微克/ml卡那霉素的脑心浸液培养基(Difco Laboratories,Detroit,USA)中于30℃预培养菌株DM368-2/pJC1和DM368-2/pJC1brnEF 14小时而研究其产生异亮氨酸的情况。然后细胞用0.9％(w/v)氯化钠溶液洗2次，并用此悬液接种60毫升CgⅫ培养基使OD600(在600nm处的光密度)为0.1。该培养基与Keilhauer等(细菌学杂志(1993)175:5593-5603)所述培养基相同，但额外含有50微克/毫升卡那霉素。两个菌株均在30℃和130rpm下培养。24和48小时后取样品，短暂离心细胞(用购自Heraeus(Osterode，德国)的Biofuge pico在13000rpm离心5分钟)。
用反相HPLC(Lindroth等，分析化学(1979)51:1167-1174)定量测定培养物上清中的胞外氨基酸浓度。使用附有荧光检测仪(G1321A)的HP1100系列HPLC层析(惠普，Waldbronn，德国)；用HP-Chem-Station(惠普)控制该系统并进行数据评价。在自动化柱前衍化中，1微升待分析的氨基酸溶液与20微升制备好的正苯二醛/2-巯基乙醇试剂(Pierce Europe BV,Oud-Beijerland，荷兰)混合。使用具有升高的非极性相(甲醇)的梯度程序经组合前置柱(40×4mm Hypersil ODS5)和主柱(Hypersil ODS5，两个柱均购自CS-Chromatographie Service GmbH,Langerwehe，德国)而分离得到的荧光物质硫取代的异吲哚(Jones等，层析学杂志(1983)266:471-482)。极性洗脱剂是乙酸钠(0.1M,pH7.2)；流速是0.8毫升/分钟。在激发波长230nm和发射波长450nm对衍化的氨基酸进行荧光检测。经与外标和作为额外内标的天冬酰胺比较而计算氨基酸浓度。
所得结果示于表2。
表2
    L-异亮氨酸(mM)
菌株     24小时     48小时
DM368-2/pJC1     0.7     1.1
 DM368-2/pJC1brnEF     1.4     1.8
本发明包括如下附图：
图1：含有转座子Tn5531的质粒pCGL0040图。转座子以未涂黑的箭头示出。
图中所示长度应被认为是大约值。所采用的缩写和术语有如下含义：
EcoRⅠ：来自大肠杆菌的限制酶
XbaⅠ：来自Xanthomonas badrii的限制酶
ClaⅠ：来自Caryophanum latum的限制酶
SalⅠ：来自Streptomyces albus的限制酶
ScaⅠ：来自Streptomyces caespitosus的限制酶
SmaⅠ：来自Serratia marcescens的限制酶
Amp：氨苄青霉素抗性基因
Kan：卡那霉素抗性基因
oriBR322：质粒pBR322的复制源点序列表<110>德古萨-于尔斯股份公司
 于利希研究中心有限公司<120>编码支链氨基酸的输出蛋白的核苷酸序列及其分离方法和应用<130>990128 BT<140><141><160>6<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1271<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌ATCC14752<220><221>基因<222>(101)..(853)<223>brnF<220><221>基因<222>(853)..(1176)<223>brnE<400>1gcgcgatcaa tggaatctag cttcatatat tgcacaatag cctagttgag gtgcgcaaac 60tggcaacaaa actacccggc aattgtgtga tgattgtagt gtgcaaaaaa cgcaagagat 120tcattcaagc ctggaggtgt cgccatccaa ggcagccctg gaaccagatg ataaaggtta 180tcggcgctac gaaatcgcgc aaggtctaaa aacctccctt gctgcaggtt tgggcatgta 240cccgattggt attgcgtttg gtctcttggt tattcaatac ggctacgaat ggtgggcagc 300cccactgttt tccggcctga ttttcgcggg ctccaccgaa atgctggtca tcgccctcgt 360tgtgggcgca gcgcccctgg gcgccatcgc gctcaccaca ttgctggtga acttccgcca 420cgtattctat gcgttttcat tcccgctgca tgtggtcaaa aaccccattg cccgtttcta 480ttcggttttc gcgcttatcg acgaagccta cgcagtcact gcggccaggc ccgcaggctg 540gtcggcgtgg cgacttatct caatgcaaat agcgtttcac tcctactggg tattcggcgg 600tctcaccgga gtggcgatcg cagagttgat tccttttgaa attaagggcc tcgagttcgc 660cctttgctct ctctttgtca cgctgacttt ggattcctgc cgaacgaaaa agcagatccc 720ttctctgctg ctcgcaggtt tgagcttcac cattgctctt gtggtaattc caggtcaggc 780cctatttgcg gcgctgctga tcttcttggg tctgttgacc atccggtact tcttcttggg 840aaaggctgct aaatgacaac tgatttctcc tgtattctcc ttgttgtcgc agtatgtgca 900gtcattactt ttgcgctccg ggcggttccg ttcttaatcc ttaagcccct acgtgaatca 960caatttgtgg gcaaaatggc gatgtggatg ccagcaggaa tccttgccat tttgaccgca 1020tcaacgtttc gcagcaatgc gatagatctg aagactctaa cctttggtct cattgccgtt 1080gcgattacag tggtggcgca tcttcttggc ggtcgacgca ccttgttgag cgttggcgct 1140ggcaccatcg tttttgttgg actggtgaat cttttctaaa actgcataaa taacaaaaat 1200ccgcatgccc tcaatttgaa ggggatgcgg attttttaag gaacctagaa aaggcttaag 1260cagacagcgc t                                                      1271<210>2<211>753<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌ATCC14752<220><221>CDS<222>(1)..(753)<223>brnF<400>2gtg caa aaa acg caa gag att cat tca agc ctg gag gtg tcg cca tcc    48Val Gln Lys Thr Gln Glu Ile His Ser Ser Leu Glu Val Ser Pro Ser1               5                  10                  15aag gca gcc ctg gaa cca gat gat aaa ggt tat cgg cgc tac gaa atc    96Lys Ala Ala Leu Glu Pro Asp Asp Lys Gly Tyr Arg Arg Tyr Glu Ile
         20                  25                  30gcg caa ggt cta aaa acc tcc ctt gct gca ggt ttg ggc atg tac ccg    144Ala Gln Gly Leu Lys Thr Ser Leu Ala Ala Gly Leu Gly Met Tyr Pro
     35                  40                  45att ggt att gcg ttt ggt ctc ttg gtt att caa tac ggc tac gaa tgg    192Ile Gly Ile Ala Phe Gly Leu Leu Val Ile Gln Tyr Gly Tyr Glu Trp
 50                  55                  60tgg gca gcc cca ctg ttt tcc ggc ctg att ttc gcg ggc tcc acc gaa    240Trp Ala Ala Pro Leu Phe Ser Gly Leu Ile Phe Ala Gly Ser Thr Glu65                  70                  75                  80atg ctg gtc atc gcc ctc gtt gtg ggc gca gcg ccc ctg ggc gcc atc    288Met Leu Val Ile Ala Leu Val Val Gly Ala Ala Pro Leu Gly Ala Ile
             85                  90                  95gcg ctc acc aca ttg ctg gtg aac ttc cgc cac gta ttc tat gcg ttt    336Ala Leu Thr Thr Leu Leu Val Asn Phe Arg His Val Phe Tyr Ala Phe
        100                 105                 110tca ttc ccg ctg cat gtg gtc aaa aac ccc att gcc cgt ttc tat tcg    384Ser Phe Pro Leu His Val Val Lys Asn Pro Ile Ala Arg Phe Tyr Ser
    115                 120                 125gtt ttc gcg ctt atc gac gaa gcc tac gca gtc act gcg gcc agg ccc    432Val Phe Ala Leu Ile Asp Glu Ala Tyr Ala Val Thr Ala Ala Arg Pro
130                 135                 140gca ggc tgg tcg gcg tgg cga ctt atc tca atg caa ata gcg ttt cac    480Ala Gly Trp Ser Ala Trp Arg Leu Ile Ser Met Gln Ile Ala Phe His145                 150                 155                 160tcc tac tgg gta ttc ggc ggt ctc acc gga gtg gcg atc gca gag ttg    528Ser Tyr Trp Val Phe Gly Gly Leu Thr Gly Val Ala Ile Ala Glu Leu
            165                 170                 175att cct ttt gaa att aag ggc ctc gag ttc gcc ctt tgc tct ctc ttt    576Ile Pro Phe Glu Ile Lys Gly Leu Glu Phe Ala Leu Cys Ser Leu Phe
        180                 185                 190gtc acg ctg act ttg gat tcc tgc cga acg aaa aag cag atc cct tct    624Val Thr Leu Thr Leu Asp Ser Cys Arg Thr Lys Lys Gln Ile Pro Ser
    195                 200                 205ctg ctg ctc gca ggt ttg agc ttc acc att gct ctt gtg gta att cca    672Leu Leu Leu Ala Gly Leu Ser Phe Thr Ile Ala Leu Val Val Ile Pro
210                 215                 220ggt cag gcc cta ttt gcg gcg ctg ctg atc ttc ttg ggt ctg ttg acc    720Gly Gln Ala Leu Phe Ala Ala Leu Leu Ile Phe Leu Gly Leu Leu Thr225                 230                 235                 240atc cgg tac ttc ttc ttg gga aag gct gct aaa                        753Ile Arg Tyr Phe Phe Leu Gly Lys Ala Ala Lys
            245                 250<210>3<211>251<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌ATCC14752<400>3Val Gln Lys Thr Gln Glu Ile His Ser Ser Leu Glu Val Ser Pro Ser1               5                  10                  15Lys Ala Ala Leu Glu Pro Asp Asp Lys Gly Tyr Arg Arg Tyr Glu Ile
         20                  25                  30Ala Gln Gly Leu Lys Thr Ser Leu Ala Ala Gly Leu Gly Met Tyr Pro
     35                  40                  45Ile Gly Ile Ala Phe Gly Leu Leu Val Ile Gln Tyr Gly Tyr Glu Trp
 50                  55                  60Trp Ala Ala Pro Leu Phe Ser Gly Leu Ile Phe Ala Gly Ser Thr Glu65                  70                  75                  80Met Leu Val Ile Ala Leu Val Val Gly Ala Ala Pro Leu Gly Ala Ile
             85                  90                  95Ala Leu Thr Thr Leu Leu Val Asn Phe Arg His Val Phe Tyr Ala Phe
        100                 105                 110Ser Phe Pro Leu His Val Val Lys Asn Pro Ile Ala Arg Phe Tyr Ser
    115                 120                 125Val Phe Ala Leu Ile Asp Glu Ala Tyr Ala Val Thr Ala Ala Arg Pro
130                 135                 140Ala Gly Trp Ser Ala Trp Arg Leu Ile Ser Met Gln Ile Ala Phe His145                 150                 155                 160Ser Tyr Trp Val Phe Gly Gly Leu Thr Gly Val Ala Ile Ala Glu Leu
            165                 170                 175Ile Pro Phe Glu Ile Lys Gly Leu Glu Phe Ala Leu Cys Ser Leu Phe
        180                 185                 190Val Thr Leu Thr Leu Asp Ser Cys Arg Thr Lys Lys Gln Ile Pro Ser
     195                 200                 205Leu Leu Leu Ala Gly Leu Ser Phe Thr Ile Ala Leu Val Val Ile Pro
210                 215                 220Gly Gln Ala Leu Phe Ala Ala Leu Leu Ile Phe Leu Gly Leu Leu Thr225                 230                 235                 240Ile Arg Tyr Phe Phe Leu Gly Lys Ala Ala Lys
            245                 250<210>4<211>324<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌ATCC14752<220><221>CDS<222>(1)..(324)<223>brnE<400>4atg aca act gat ttc tcc tgt att ctc ctt gtt gtc gca gta tgt gca    48Met Thr Thr Asp Phe Ser Cys Ile Leu Leu Val Val Ala Val Cys Ala1               5                  10                  15gtc att act ttt gcg ctc cgg gcg gtt ccg ttc tta atc ctt aag ccc    96Val Ile Thr Phe Ala Leu Arg Ala Val Pro Phe Leu Ile Leu Lys Pro
         20                  25                  30cta cgt gaa tca caa ttt gtg ggc aaa atg gcg atg tgg atg cca gca    144Leu Arg Glu Ser Gln Phe Val Gly Lys Met Ala Met Trp Met Pro Ala
     35                  40                  45gga atc ctt gcc att ttg acc gca tca acg ttt cgc agc aat gcg ata    192Gly Ile Leu Ala Ile Leu Thr Ala Ser Thr Phe Arg Ser Asn Ala Ile
 50                  55                  60gat ctg aag act cta acc ttt ggt ctc att gcc gtt gcg att aca gtg    240Asp Leu Lys Thr Leu Thr Phe Gly Leu Ile Ala Val Ala Ile Thr Val65                  70                  75                  80gtg gcg cat ctt ctt ggc ggt cga cgc acc ttg ttg agc gtt ggc gct    288Val Ala His Leu Leu Gly Gly Arg Arg Thr Leu Leu Ser Val Gly Ala
             85                  90                  95ggc acc atc gtt ttt gtt gga ctg gtg aat ctt ttc                    324Gly Thr Ile Val Phe Val Gly Leu Val Asn Leu Phe
        100                 105<210>5<211>108<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌ATCC14752<400>5Met Thr Thr Asp Phe Ser Cys Ile Leu Leu Val Val Ala Val Cys Ala1               5                  10                  15Val Ile Thr Phe Ala Leu Arg Ala Val Pro Phe Leu Ile Leu Lys Pro
         20                  25                  30Leu Arg Glu Ser Gln Phe Val Gly Lys Met Ala Met Trp Met Pro Ala
     35                  40                  45Gly Ile Leu Ala Ile Leu Thr Ala Ser Thr Phe Arg Ser Asn Ala Ile
 50                  55                  60Asp Leu Lys Thr Leu Thr Phe Gly Leu Ile Ala Val Ala Ile Thr Val65                  70                  75                  80Val Ala His Leu Leu Gly Gly Arg Arg Thr Leu Leu Ser Val Gly Ala
             85                  90                  95Gly Thr Ile Val Phe Val Gly Leu Val Asn Leu Phe
        100                 105<210>6<211>1271<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌ATCC13032<220><221>基因<222>(101)..(8 53)<223>brnF<220><221>基因<222>(853)..(1176)<223>brnE<400>6gcgcgatcaa tggaatctag cttcatatat tgcacaatag cctagttgag gtgcgcaaac 60tggcaacaaa actacccggc aattgtgtga tgattgtagt gtgcaaaaaa cgcaagagat 120tcattcaagc ctggaggtgt cgccatccaa ggcagccctg gaaccagatg ataaaggtta 180tcggcgctac gaaatcgcgc aaggtctaaa aacctccctt gctgcaggtt tgggcatgta 240cccgattggt attgcgtttg gtctcttggt tattcaatac ggctacgaat ggtgggcagc 300cccactgttt tccggcctga ttttcgcggg ctccaccgaa atgctggtca tcgccctcgt 360tgtgggcgca gcgcccctgg gcgccatcgc gctcaccaca ttgctggtga acttccgcca 420cgtattctat gcgttttcat tcccgctgca tgtggtcaaa aaccccattg cccgtttcta 480ttcggttttc gcgcttatcg acgaagccta cgcagtcact gcggccaggc ccgcaggctg 540gtcggcgtgg cgacttatct caatgcaaat agcgtttcac tcctactggg tattcggcgg 600tctcaccgga gtggcgatcg cagagttgat tccttttgaa attaagggcc tcgagttcgc 660cctttgctct ctctttgtca cgctgacttt ggattcctgc cgaacgaaaa agcagatccc 720ttctctgctg ctcgcaggtt tgagcttcac cattgctctt gtggtaattc caggtcaggc 780cctatttgcg gcgctgctga tcttcttggg tctgttgacc atccggtact tcttcttggg 840aaaggctgct aaatgacaac tgatttctcc tgtattctcc ttgttgtcgc agtatgtgca 900gtcattactt ttgcgctccg ggcggttccg ttcttaatcc ttaagcccct acgtgaatca 960caatttgtgg gcaaaatggc gatgtggatg ccagcaggaa tccttgccat tttgaccgca 1020tcaacgtttc gcagcaatgc gatagatctg aagactctaa cctttggtct cattgccgtt 1080gcgattacag tggtggcgca tcttcttggc ggtcgacgca ccttgttgag cgttggcgct 1140ggcaccatcg tttttgttgg actggtgaat cttttctaaa actgcataaa taacaaaaat 1200ccgcatgccc tcaatttgaa ggggatgcgg attttttaag gaacctagaa aaggcttaag 1260cagacagcgc t                                                      1271

Claims (14)

1、分离的多核苷酸，其含有选自如下一组的至少一个多核苷酸序列：
a)与编码含有SEQ ID NO:3或5至少一个氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，
b)编码含有与SEQ ID NO:3或5的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及
d)含有a),b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸。
2、权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是能在棒状细菌中复制的优选为重组的DNA。
3、权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是RNA。
4、权利要求2的能复制的DNA，含有
(ⅰ)如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:6所示的一个核苷酸序列，或
(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于的(ⅰ)序列的至少一个序列，或
(ⅲ)与互补于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地
(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有义突变。
5、衍生自权利要求1或2的核苷酸序列的蛋白质氨基酸序列，示于SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4
6、通过导入权利要求2或5的一或多个能复制的DNA而转化的棒状微生物，尤其棒杆菌属。
7、经棒状细菌发酵生产支链L-氨基酸的方法，其中使用如下细菌，该细菌中brnE和/或brnF基因或编码这些基因的核苷酸序列是扩增的，尤其是过表达的。
8、权利要求7的方法，其中使用如下细菌，该细菌中所需氨基酸生物合成途径的其它基因是额外扩增的。
9、权利要求7的方法，其中所用的细菌中，降低所需L-氨基酸生成的代谢途径至少被部分抑制。
10、权利要求8-10任一项的方法，其中使用经一或多个质粒载体转化的菌株，且所述质粒载体携带编码brnE和/或brnF基因的核苷酸序列。
11、权利要求8-10任一项的方法，其中使用产生L-异亮氨酸、L-缬氨酸或L-亮氨酸的棒状细菌。
12、生产支链L-氨基酸的方法，其中进行以下步骤：
(a)将前述一或多项权利要求的微生物发酵，该微生物中至少brnE和/或brnF是扩增的特别羧基过表达的，其任选地与其它基因一起扩增特别是过表达，
(b)富集培养基或微生物细胞中的所需L-氨基酸，及
(c)分离L-氨基酸。
13、前述一或多项权利要求的方法，其中使用棒杆菌属微生物。
14、分离brnE或brnF基因的方法，其特征在于获得在含异亮氨酸和/或亮氨酸和/或缬氨酸的寡肽的营养培养基上不生长或微弱生长的这一/这些基因缺陷的突变体，优选棒状细菌，作为指示菌株，及
a)在建立基因文库后鉴别并分离brnE或brnF基因，或
b)在转座子诱变情况中，选择优选含有抗生素抗性的转座子，从而获得所需基因。
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