CN1301267C

CN1301267C - Muc1粘蛋白的一个模拟表位肽及其编码dna与应用

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Publication number: CN1301267C
Application number: CNB2005100776174A
Authority: CN
Inventors: 张立新; 潘进勇; 王祥卫; 路浩军; 李春海
Original assignee: Affiliated Hospital of Academy of AMMS
Current assignee: Affiliated Hospital of Academy of AMMS
Priority date: 2005-06-21
Filing date: 2005-06-21
Publication date: 2007-02-21
Anticipated expiration: 2025-06-21
Also published as: CN1699418A

Abstract

本发明公开了MUC1粘蛋白的一个模拟表位肽及其编码DNA与应用。其目的是提供MUC1粘蛋白的一个模拟表位肽及其编码DNA与其在制备抗肿瘤疫苗和药物中的应用。它是具有下述氨基酸残基序列之一的多肽：1)序列表中的SEQ ID №：1；2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有诱导产生MUC1粘蛋白特异性的细胞和体液免疫应答作用的多肽。其编码DNA是下述核苷酸序列之一：1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本发明可作为活性成份制备成疫苗或药物，起到抑制或清除表达MUC1的肿瘤细胞的作用，在医药领域具有广阔的应用前景。

Description

MUC1粘蛋白的一个模拟表位肽及其编码DNA与应用

技术领域

本发明涉及生物制药和基因工程领域，特别是涉及MUC1粘蛋白的一个模拟表位肽及其编码DNA与其在制备抗肿瘤疫苗和药物中的应用。

背景技术

肿瘤疫苗是肿瘤生物学治疗的一种手段，其研究已有近百年历史。1991年Boon等首次成功分离了CTL特异性识别的人恶性黑色素瘤抗原MAGE-1，为肿瘤疫苗的研究创立了新的里程碑(Boon等，A gene encoding an antigen recognized bycytolytic T lymphocytes on a human melanoma.Science.1991Dec13；254(5038)：1643-7.)。肿瘤疫苗主要是通过诱导免疫应答来打破机体对肿瘤细胞的免疫耐受而起作用。用作肿瘤疫苗的免疫原主要包括：完整的自体或异源性肿瘤细胞、修饰的肿瘤细胞、肿瘤相关抗原、合成糖链抗原、肿瘤抗原肽、肿瘤抗原刺激或转染的树突状细胞、抗独特型抗体及其衍生物、重组病毒或细菌疫苗和核酸疫苗等。目前有多个肿瘤相关抗原被用于肿瘤疫苗的制备。

MUC1粘蛋白(以下简称MUC1)是表达于细胞表面的一种高分子量(＞200kD)膜糖蛋白，具有两个基本特征：(1)糖链含量占全分子量的50％以上，多以O型糖苷键与多肽骨架上的糖基化位点连接；(2)多肽骨架中含有20-125个由“HGVTSAPDTRPAPGSTAPPA”共20个氨基酸残基组成的连续重复序列(variablenumbers of tandem repeats，VNTRs)，所有O型糖基化位点均位于VNTRs中。研究表明，MUC1在多种上皮来源恶性肿瘤(乳腺、胰腺、卵巢、结肠、肺、胃、膀胱、肾脏、食管)中异常表达，主要表现在：(1)表达量增高：较正常可提高100倍以上；(2)表达部位改变：在正常组织中表达于细胞近管腔或腺腔一侧，即呈顶端表达(apical expression)，不与机体免疫系统接触，而在肿瘤中，整个细胞表面均表达，因此，可与免疫系统接触；(3)结构异常：主要由于糖基化不全，出现新的糖链及肽表位。

自80年代中期，Finn等发现肿瘤患者体内存在可特异识别肿瘤MUC1的CTL细胞以来(Finn等，Specific，major histocompatibility complex-unrestrictedrecognition of tumor-associated mucins by human cytotoxic T cells.Proc NatlAcad Sci USA.1989Sep；86(18)：7159-63.)，MUC1一直是肿瘤疫苗研究的一个热点分子，用MUC1制备的肿瘤疫苗主要有多肽疫苗、DNA疫苗、树突状细胞疫苗、重组牛痘病毒疫苗、糖链疫苗等，有些疫苗的研究已进入I/II/III期临床。研究表明，MUC1糖链瘤苗在体内主要诱导产生体液免疫应答；MUC1多肽疫苗虽然在动物模型中可诱导较强的CTL应答，但在人体中却主要以体液免疫应答为主，且个别病例出现自身免疫现象。另外，肿瘤患者血循环中含有较高水平的MUC1蛋白，会对注入体内的单抗或瘤苗所诱导产生的抗体起封闭作用，从而大大降低了疗效。

因此，制备新的基于MUC1分子的肿瘤疫苗，将有助于解决上述问题。模拟表位(mimotopes)肽疫苗就是其中的一种。模拟表位是指一级结构完全不同的两种物质由于具有相同的空间构象，能与同一抗体或T细胞表面受体的抗原结合区相结合。模拟表位能模拟各种天然抗原的抗原决定簇，目前常用的有多肽模拟蛋白表位和多肽模拟多糖或糖脂表位两种。与天然的表位相比，理论上模拟表位具有如下优势：①在天然表位未知的情况下也能获得模拟表位用于预防和治疗；②通过分子改造，能增强模拟表位与MHC分子的结合，更有利于T淋巴细胞的激活；③模拟表位一般为非自身蛋白，有望增强肌体对原表位的免疫应答，或打破对原表位的免疫耐受状态[131415]。最近研究表明，用肿瘤抗原的模拟表位作为免疫原可在转基因小鼠及人体内诱导出特异性细胞免疫应答，且未发现自身免疫现象。

模拟表位的获得有多种方法，其中基于噬菌体展示技术建立的噬菌体随机肽库是目前最常用的筛选模拟表位的技术之一。其基本思路是：将化学合成的随机寡核苷酸序列与噬菌体衣壳蛋白III或VIII基因进行融合，使各种氨基酸排列的短肽表达于不同的噬菌体表面，构建噬菌体随机肽库；通过生物淘洗(biopanning)筛选出能与抗体或淋巴细胞表面受体相结合的短肽配体，测序鉴定插入的编码序列，获得模拟表位的氨基酸序列。

发明内容

本发明的目的是提供MUC1粘蛋白的一个模拟表位肽及其编码DNA。

本发明所提供的MUC1粘蛋白的模拟表位肽，名称为M1，来源于M13噬菌体(PhageM13)，是具有下述氨基酸残基序列之一的多肽：

1)序列表中的SEQ ID №：1；

2)将序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有诱导MUC1粘蛋白特异性细胞和体液免疫应答作用的多肽。

序列表中的SEQ ID №：1由12个氨基酸残基组成。

本发明同时提供编码本发明MUC1粘蛋白的模拟表位肽M1的DNA(M1)，它是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID №：2的DNA序列；

2)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID №：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件可为用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID №：2由36个碱基组成，编码具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的蛋白质。

含有本发明DNA的表达载体、转基因细胞系及宿主菌均属于本发明的内容。

扩增M1中任一片段的引物对也为本发明的内容。

本发明的另一个目的是提供一种表达上述MUC1粘蛋白的模拟表位肽的方法。

本发明所提供的表达上述MUC1粘蛋白的模拟表位肽的方法，是将含有上述MUC1粘蛋白的模拟表位肽编码DNA的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到MUC1粘蛋白的模拟表位肽。

所述宿主为任一可表达外源基因的原核或真核细胞。

所述原核细胞可为大肠肝菌，如E.coli BL21、E.coliM15、E.coli JM109或E.coliDH5α等。

所述真核细胞可为哺乳动物细胞、酵母细胞和植物细胞等。包括COS-7、CHO、BHK-21或Pichia pastoris等。

用于构建含有MUC1粘蛋白的模拟表位肽编码DNA的重组表达载体的出发载体可为pET系列、pGEX系列、pMAL系列、pBluescript SK-、pTrx、pTrxFus、pQE-30、pCAT3系列、pβ-gal系列、pcDNA3.1(+/-)、pCMV系列、pCMVScript、pd2EGFP系列、pGL3系列、pIND(SP1)/V5-HisA、pTET-Splice、pVgRXR或pPIC系列等。

培养含有本发明的MUC1粘蛋白的模拟表位肽编码DNA的宿主细胞的培养基和培养条件，均可为培养出发宿主的培养基和培养条件。

本发明还提供了一种抗肿瘤疫苗和一种抗肿瘤药物。

本发明所提供的抗肿瘤疫苗和抗肿瘤药物，活性成分均为上述MUC1粘蛋白的模拟表位肽。

需要的时候，在上述抗肿瘤药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体等。

本发明的药物可以与抗生素、免疫刺激剂等进行组合治疗，并可通过选择合适的抗原递呈细胞(如树突状细胞)、佐剂或细胞因子(如IL-2)联合应用来强化特异性细胞免疫应答。

本发明的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述药物的用量一般为0.5-2mg MUC1粘蛋白的模拟表位肽/kg体重/day，疗程为10-20天。

本发明通过MUC1单抗筛选噬菌体随机肽库获得的模拟表位肽M1，可作为活性成份制备成疫苗或药物用于体内，诱导出针对MUC1的细胞免疫应答或体液免疫应答，抑制或清除表达MUC1的肿瘤细胞。本发明也可以与其它药物联合使用，预防和治疗多种肿瘤疾病。本发明在医药领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为浓度为100、200、400、800μg/mL M1肽分别与Ma695单克隆抗体混合后和乳腺癌细胞MCF7的竞争性抑制检测结果。

图2为流式细胞仪检测免疫小鼠血清与MUC1+肿瘤细胞结合实验的结果。

图3为ELISPOT技术检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞中M1肽特异性T细胞比例实验结果。

图4为以BST739、BST739-MUC1为靶细胞、效靶比为50∶1、100∶1时的靶细胞溶破率统计结果。

图5为肿瘤预防模型各组肿瘤大小比较结果。

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所有测序工作均由上海生物工程技术服务有限公司完成。

实施例1、MUC1粘蛋白的模拟表位肽M1的获得

噬菌体随机12肽库(Ph.D.-12)：购自New England Biolabs公司。

一、Ph.D.-12肽库的生物淘洗(Biopanning)

选择可识别肿瘤MUC1糖肽表位的Ma695单克隆抗体(购自北京中杉生物技术有限公司)作为靶分子对噬菌体随机12肽库进行筛选，得到MUC1的模拟表位肽M1，具体方法如下：

第一轮筛选：用包被液(0.1M NaHCO₃，pH8.6)将Ma695单克隆抗体的浓度调为约10μg/mL，每孔加入100μL上述抗体液包被酶标板，在4℃、湿盒中放置12-24小时；弃掉包被液，用力拍掉残留液，每孔加满封闭液(0.1M NaHCO₃(pH8.6)，1％BSA)，4℃放置1小时，弃掉封闭液，用TBST(TBS+0.1％Tween-20(V/V))快速洗6次.每次拍掉残留液，不要使孔干燥；用100μL TBST稀释10μL(4×10¹⁰pfu)噬菌体库液，加入孔中，室温轻摇60min；弃掉未结合的噬菌体液，拍掉残留液；用TBST洗10次，每次6min，并用吸管上下剧烈吹打；加入100μL洗脱液(0.2M Glycine-HCl，pH2.2，1mg/ml BSA)，室温孵育8min，将洗脱液移到1.5mL离心管中，立即加入30μL中和液(1M Tris-HCl，pH9.1)，混匀；取经10^-1，10^-2，10^-3，10^-4梯度稀释的洗脱液各10μL测滴度。剩余洗脱液进行扩增，方法同上。

第二-四轮筛选：方法同第一轮，加入2×10¹¹pfu扩增噬菌体，TBST中Tween-20的浓度提高到0.5％(V/V)。

二、噬菌斑的扩增

取经培养12-24小时的大肠杆菌XL1-blue，按1∶100的比例用LB稀释(含10μg/mL Tet(Sigma))，每个试管中加入1mL经稀释的菌液，用枪头挑取单个第四轮扩增后测定滴度后的蓝斑，接种于上述含10μg/mL Tet的LB培养基中，37℃260rpm培养4.5h；培养结束后，将培养液4℃10000rpm离心30sec，取上清重复离心一次，取80％上清，4℃保存或加入甘油至终浓度为50％后于-20℃保存。

三、用ELISA法对获得的噬菌体克隆进行分析

将Ma695单克隆抗体用包被液稀释成10μg/mL，包被双条可拆酶标板，每孔100μL，平行作两孔，4℃静置12-24小时；弃掉包被液，每孔加满封闭液，37℃封闭1h；用TBST(含0.5％Tween-20，下同)洗6次，取步骤二经扩增后的噬菌体克隆，每个取50μL+150μL TBST，混匀，加入板孔中，同时取2μL原库+200μL TBST作为对照，RT轻摇1h；用TBST洗8次，每孔加入用封闭液(含1mg/mL BSA)按1∶5000比例稀释的HRP/AntiM13单抗(amercham pharmacia biotech)100μL，室温轻摇1h，TBST洗8次；每孔加入100μL TMB显色液，37℃下显色10-15min，再加入50μL 2MH₂SO₄终止显色，测定OD450值，结果如表1所示，挑选与对照比值大于2的噬菌体克隆提取ssDNA进行测序和分析。

表1噬菌体克隆的ELISA分析结果

编号	O.D.450
	O.D.450		MUC1噬菌体	阴性对照蛋白
	123456789101112131415原库对照	0.0870.0960.0920.1110.0880.0830.0820.1010.0880.0970.1220.1390.1170.0980.1230.066	MUC1噬菌体	阴性对照蛋白	0.0430.0430.0410.0420.0420.0410.0380.0380.0410.0310.0520.0620.0540.0530.0430.065

四、M1的获得

选取结合活性最强的噬菌体克隆进行测序，根据测序结果推导出与Ma695抗体结合的肽表位序列，共获得5种各含12个氨基酸的肽表位，将其中一个命名为M1，M1具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列，序列表中SEQ ID №：1由12个氨基酸残基组成，编码M1的DNA具有序列表中SEQ ID №：2的核苷酸，序列表中的SEQID №：2由36个碱基组成。选择M1用下述方法作进一步研究。

实施例2、M1肽、Ma695与MCF7的竞争性结合实验

将浓度为100、200、400、800μg/mL M1肽分别与经稀释浓度为0.25μg/mL的Ma695单克隆抗体混合，冰上放置5min，再与乳腺癌细胞MCF7(ATCC)混合，冰上放置45min，再以2％PBA洗涤两次，加入1∶100稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的第二抗体，避光、冰上放置45min；以PBS洗涤两次后，用预冷的PBS 200μl重悬细胞，用流式细胞仪检测，荧光强度检测结果如图1所示(纵坐标为阳性细胞数，横坐标为相对荧光强度)，表明M1肽竞争性抑制Ma695与MCF7细胞的结合，抑制效应具有剂量依赖性，当细胞数为2×10⁵个、Ma695浓度为0.25μg/mL、M1肽浓度分别为100、200、400、800μg/mL时，阳性细胞百分比分别为92.7％、87.7％、86.7％和82.5％，相对荧光强度分别为3.85、3.20、3.20、2.80。根据相对荧光强度变化情况，按公式计算抑制率：抑制率＝(抑制前荧光强度-抑制后荧光强度)/抑制前荧光强度×100％。抑制率分别为11％、26％、26％和34％，表明M1肽能竞争性抑制Ma695抗体与原表位的结合，是真正的模拟表位。

实施例3、流式细胞仪检测免疫小鼠血清与MUC1+肿瘤细胞的结合实验

1、用负载M1肽的树突状细胞(DC)免疫小鼠

脾脏树突状细胞的培养：T739小鼠断颈处死，无菌取脾，磨碎，过200目不锈钢滤网，制成单细胞悬液；裂解红细胞，PBS洗涤3次后，按2×10⁶/ml的细胞密度加入塑料培养皿，4小时后弃悬浮细胞，贴壁细胞加入DC专用培养基及细胞因子(IL-41000U/mL，GM-CSF 1000U/mL)，隔日半量换液；第六天收集悬浮和疏松贴壁细胞转入新培养皿中，加入LPS(1μg/mL)刺激DC成熟。

收集成熟DC，按10μg/mL的浓度加入M1肽或TAT-M1，37℃、5％CO₂浓度和饱和湿度下培养1小时，其间间断摇动数次。洗涤两次后，根据成熟DC纯度，以PBS调整至DC密度为2×10⁶个/mL。4～8周龄雌性T739随机分为四组，每组2-4只，尾静脉注射0.1mL成熟DC悬液(2×10⁵/鼠)，或空DC，或相应体积的PBS。每周免疫一次，共三次；TAT-M1肽只免疫一次。

2、DC+PBS免疫小鼠

方法同1，用PBS替换M1肽。

3、PBS免疫小鼠

方法同2，不加DC。

4、流式细胞仪检测免疫小鼠血清与MUC1+肿瘤细胞(指细胞表面表达有MUC1的肿瘤细胞)的结合情况

取步骤1-3免疫小鼠的眼球收集血清，三种血清分别按1∶20比例稀释后与不表达MUC1的小鼠来源膀胱癌细胞BST739(MUC1-小鼠来源膀胱癌细胞BST739(蒋锋，周性明，张忠林等.可移植性小鼠膀胱移行细胞癌模型的建立[J].中华泌尿外科杂志，1993，14(2)：184-186))、乳腺癌细胞MCF7(MUC1+乳腺癌细胞MCF7，ATCC)和前列腺癌细胞PC-3(MUC1+前列腺癌细胞PC-3，ATCC)以及BST739-MUC1(在BST739细胞中转入人MUC1全长cDNA(GenBank：J05582)，该细胞稳定表达MUC1)结合，对照为正常小鼠血清，用流式细胞仪检测阳性细胞数和相对荧光强度(异硫氰酸荧光素(FITC)标记)。结果如图2所示(纵坐标为阳性细胞数，横坐标为相对荧光强度。1为负载M1肽的DC免疫后的小鼠血清；2为DC+PBS免疫后的小鼠血清。A为MUC1-小鼠来源膀胱癌细胞BST739，B为MUC1+乳腺癌细胞MCF7，C为MUC1+前列腺癌细胞PC-3，D为BST739-MUC1，负载M1肽的成熟DC免疫T739小鼠后，小鼠血清能与MUC1+乳腺癌细胞MCF7、MUC1+PC-3和BST739-MUC1结合，但不与MUC1-BST739结合；用DC+PBS免疫获得的小鼠血清与来源于人的MUC1+MCF7和MUC1+PC-3部分结合(阳性率分别为26％和13.5％)，但不与同系小鼠来源的MUC1-小鼠来源膀胱癌细胞BST739和BST739-MUC1结合；以PBS免疫后的小鼠血清不与上述任何一种细胞结合。

实施例4、ELISPOT技术检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞中M1肽特异性T细胞比例

用与实施例3相同的方法得到负载M1肽的成熟DC，并将其免疫T739小鼠，以DC+PBS免疫的小鼠为对照(与实施例3相同)；用同样方法将TAT-M1肽(化学合成，HPLC纯化)免疫T739小鼠。用ELISPOT技术检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞中M1肽特异性T细胞比例(所用ELISPOT检测试剂盒购自荷兰U-Cytech公司)：用50μL稀释好的包被抗体包被96孔板，添加PBS至100μL，用粘纸封口防止蒸发，4℃孵育12-24小时，弃上清，PBST(PBS+0.05％Tween-20)洗5-10次，每次1分钟，每次洗涤后在吸水纸上反复拍干。200μL封闭液(含1％BSA的PBS)封闭每孔，37℃孵育1h或4℃孵育12-24小时。弃上清，勿洗。每孔加入100μL制备的单层细胞悬液(抗原刺激5×10⁴个细胞/孔)。盖上盖子，37℃、5％CO₂浓度和饱和湿度下孵育5h，期间保持孵箱震动，防止影响斑点形成。弃上清，每孔加入200μL冰冷的去离子水，冰上放置10min，PBST洗10次，拍干。弃上清，每孔加入100μL经稀释的生物素检测抗体，37℃孵育1h或4℃孵育12-24小时。弃上清，PBST洗5-10次，拍干。每孔加入50μL经稀释的抗生物素抗体(GABA)，37℃孵育1h。弃上清，PBST洗5-10次，拍干(孔内不要残留洗液)。每孔加入30μL新鲜配制的显色剂(冰上加)，室温、暗处放置，孵育15-30min。显微镜下观察斑点形成情况，当斑点清晰可见时，自来水冲洗终止反应。室温干燥96孔板，ELISPOT斑点成像分析仪(BIOSYS产品)计数每孔斑点数。结果判断：阳性斑点直径中央密度较高、向周围逐渐弥散；每次实验中，与阴性对照组相比，斑点数增加2倍以上认为有意义。检测结果如图3所示(图中A，A1，A2，A3为M1肽实验组同一样品的平行4孔；B，B1，B2，B3为空DC对照组同一样品的平行4孔)，测定脾脏细胞分泌γ-干扰素的M1特异性活化T淋巴细胞的数量，测定结果如表1所示(n为该组的小鼠数量)，体外不经抗原刺激，每10⁵个脾细胞的斑点数为52±8.5(也可表示为52±8.5/10⁵脾细胞)；体外经10μg/mL M1肽刺激40h后，斑点数明显增加，达112.5±16.2/10⁵脾细胞，表明脾脏细胞中，M1肽特异性活化的T淋巴细胞的比例为0.11％；DC+PBS免疫后小鼠脾脏淋巴细胞体外经或不经M1肽刺激，斑点均少于10/10⁵脾细胞，与PBC免疫者类似。

表2 ELISPOT检测脾脏细胞分泌γ-干扰素的M1特异性活化T淋巴细胞

1，n＝4		2，n＝4		3，n＝6
1，n＝4		2，n＝4		3，n＝6			DC+M1	DC+PBS	DC+M1	DC+PBS	DC+M1	DC+TAT-M1	DC+PBS
不刺激预刺激	52.5±8.5112.5±16.2	4.5±2.16.5±2.1	61.5±9.2105.5±13.4	＜10＜10	46.5±7.9116.3±20.4	34.8±6.240.8±10.5	DC+M1	DC+PBS	DC+M1	DC+PBS	DC+M1	DC+TAT-M1	DC+PBS	＜10＜10

结果以每10⁵个脾细胞形成的阳性斑点数表示。表中所列为3次实验的结果。DC为小鼠尾静脉内注射。

实施例5、体外细胞毒活性检测

用非放射性乳酸脱氢酶法进行体外细胞毒活性检测，其中，靶细胞和效应细胞的制备方法如下：

1、靶细胞的制备：将BST739和BST739-MUC1细胞消化后记数，调整细胞密度为2×10⁵个/mL，96孔板每孔中加入上述细胞悬液50μL，每组设4个复孔。

2、效应细胞的制备：用与实施例4相同的方法制备脾脏淋巴细胞。淋巴细胞以含3％人AB血清的完全1640培养基调整为不同的细胞密度(降低血清浓度可减少培养基背景)。按效靶比为1∶1、10∶1、50∶1、100∶1在各靶细胞的孔中加入50μL上述系列稀释密度的效应细胞，总体积为100μL。

小鼠以负载M1肽的成熟DC免疫三次后(方法同前述)，以DC+PBS免疫组为对照，检测脾淋巴细胞CTL效应(系列1：靶细胞为BST739-MUC1；系列2：靶细胞为BST739)，结果如图4所示。效靶比为50∶1和100∶1时，小鼠脾脏淋巴细胞对BST739-MUC1细胞具有一定的细胞毒效应，但靶细胞溶破率不超过30％；效靶比低于50∶1无明显溶破效应。以DC+PBS免疫或靶细胞为BST739时均无CTL效应。CTL是以BST739-MUC1为靶细胞、效靶比为50∶1时的靶细胞溶破率。

实施例6、肿瘤预防模型中观察M1肽诱导的抗肿瘤效应

T739小鼠24只，随机分为3组，每组6只，分别以DC+M1肽、DC+TAT-M1肽和DC+PBS进行免疫(方法同前述)，最后一次免疫后一周，在相同的淋巴结引流区域皮下接种BST739-MUC1细胞2×10⁵个/只；第8天观察成瘤率；16天去眼球取血并处死，仔细剥离肿瘤，称重。将肿瘤与皮肤粘连紧密者连同粘连皮肤一同取下。标本以4％福尔马林固定，常规病理切片。血清-20℃保存，用于检测M1肽特异性抗体。每组随机选择一只小鼠，在无菌条件下取脾脏制成单细胞悬液，测定预防模型中肿瘤大小，并进行ELISA、ELISPOT和细胞毒活性检测。其中，ELISA法检测时，将血清按1∶100稀释，测定450nm处吸光度值，所用的二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG(购自北京中杉生物技术有限公司)，显色底物为TMB(SIGMA)。预防模型中肿瘤大小比对结果如图5所示(1为DC+PBS免疫组，2为DC+TAT-M1肽免疫组，3为DC+M1肽免疫组)，具体数值如表2所示(n为该项检查的小鼠数量)，其余各项免疫学检测结果也如表2所示，检测结果表明M1肽孵育的DC免疫小鼠后可诱发M1特异性细胞和体液免疫应答，并可在体内外对表达MUC1的肿瘤细胞具有一定的杀伤作用。

表3预防模型中肿瘤大小及免疫学检查指标结果

	成瘤率(％)n＝6	瘤重(mg)n＝6	ELISAn＝6	ELISPOT(1/10⁵)n＝1	CTT(％)n＝1
	成瘤率(％)n＝6	瘤重(mg)n＝6	ELISAn＝6	ELISPOT(1/10⁵)n＝1	CTT(％)n＝1	DC+PBSDC+TAT-M1肽DC+M1肽	1006767	11.84.81.7	0.571.471.52	3.841.8131.5	7.813.817.3

注：经ELISA法检测，正常小鼠血清OD450nm处吸光度值为0.009，ELISPOT法检测结果以每10⁵个脾脏淋巴细胞形成的阳性斑点数表示；CTL是以BST739-MUC1为靶细胞、效靶比为50∶1时的靶细胞溶破率。

序列表

<160>2

<210>1

<211>12

<212>PRT

<213>M13噬菌体(Phage M13)

<400>1

Lys His Tyr Asp Pro Phe His His Arg Met Pro Gln

1 5 10

<210>2

<211>36

<212>DNA

<213>M13噬菌体(Phage M13)

<400>2

aagcattatg atccgtttca tcatcggatg ccgcag

Claims

1、一种MUC1粘蛋白的模拟表位肽，是序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列的多肽。

2、编码权利要求1所述MUC1粘蛋白的模拟表位肽的DNA。

3、根据权利要求2所述的DNA，其特征在于：所述DNA为序列表中SEQ ID №：2的DNA序列。

4、含有权利要求2或3所述DNA的表达载体。

5、含有权利要求2或3所述DNA的转基因细胞系。

6、含有权利要求2或3所述DNA的宿主菌。

7、一种表达权利要求1所述MUC1粘蛋白的模拟表位肽的方法，是将含有所述MUC1粘蛋白的模拟表位肽DNA的重组表达载体导入宿主细胞，表达得到MUC1粘蛋白的模拟表位肽。

8、一种抗肿瘤疫苗，它的活性成分为权利要求1所述MUC1粘蛋白的模拟表位肽。

9、一种抗肿瘤药物，它的活性成分为权利要求1所述MUC1粘蛋白的模拟表位肽。