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CN1394232A - 改进的发酵方法 - Google Patents

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CN1394232A
CN1394232A CN01803479A CN01803479A CN1394232A CN 1394232 A CN1394232 A CN 1394232A CN 01803479 A CN01803479 A CN 01803479A CN 01803479 A CN01803479 A CN 01803479A CN 1394232 A CN1394232 A CN 1394232A
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CN01803479A
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K·W·安德森
J·D·温泽尔
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Cognis Corp
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Abstract

一种发酵培养基，它含有：(a)可代谢的碳源和能源；(b)无机氮源；(c)磷酸盐源；(d)至少一种选自碱金属、碱土金属、过渡金属及其混合物组成的组的金属；和(e)基本上不含颗粒物质和细菌的生物素。可以将脂肪物质加入到含有至少一种二羧酸的含水混悬液中以便改变该混悬液的流变学特性。

Description

改进的发酵方法
发明背景
本发明涉及改进的发酵培养基和使用所述培养基制备脂肪族聚羧酸的方法。
长链α、ω-二羧酸类(即那些带有9个或9个以上碳原子的二羧酸类)被用作合成各种化学产物和聚合物中的原料。
目前在大多数情况下仅通过非生物转化方法来生产带有4个以上碳原子的二酸类。这些类型的用于生产二酸类的化学方法具有许多局限性和缺点。每种方法基于所用原料而限于生产特定碳链长度的二酸类。例如，十二烷二酸(dodecandioic acid)法以丁二烯作为原料，由此该反应过程的产物限于具有4的倍数的链长的酸类。此外，该方法基于不可再生的石化原料且多重反应转化过程产生了不需要的副产物，它们可导致产量损耗、产生重金属废物和必须在还原炉中破坏的氧化氮。
用于生产二酸类的生物转化方法比现存的非生物转化方法有许多潜在的优点。在这些优点中最主要的特征是可再生的原料作为起始物质的应用和产生所述二酸而不会形成必须以昂贵方式进行废物处理加工的有害化学副产物。
通过使用生物方法获得的另一个重要优点在于可以易于将这类方法用于使用相同生物催化剂和相同设备生产各种二酸类。因为目前的有机化学合成法仅适合于生产单一二酸，所以几种不同二酸的合成需要开发针对每种二酸的新合成流程。另一方面，可以将酵母生物催化剂用于使用相同设备、培养基和仅通过为所述酵母提供不同底物的方案而生产不同长度的二酸类。
美国专利US6,004,784中公开了一种半合成发酵培养基，它使用了玉米浆和酿造酵母提取物以便降低含有昂贵、高标准化酵母提取物和酵母氮碱的常规发酵培养基的成本，将该文献的全部内容引入本文作为参考。
与使用这类低廉替代品有关的困难是成倍的。在喷入空气时它们使得发酵肉汤散发出明显的气味。在玉米浆和粗酵母提取物中含有的颗粒物质、尤其是结合了高浓度细菌的颗粒物质难以使得它们自身保持无菌并使培养基灭菌设备染菌。这些替代品还含有许多不可代谢的可产生颜色和颜色稳定性困难的成分，这些困难  需要使用其它纯化步骤来解决并且固然会使产物损耗。对这些替代品进行选择、同时降低培养基成本的考虑反而又增加了加工成本。因此，对可为维持酵母生物催化剂生长提供营养物的低成本生物发酵培养基，从而得到高特定产率的聚羧酸类、多元醇类和聚羟基酸类存在需求。
尽管长链二羧酸类以其未离解或部分盐形式具有有限的水溶性，但是存在许多必须在含水培养基中处理它们的情况。实例包括用于生产二羧酸类的发酵和回收方法、界面聚合反应、乳液聚合反应和酶促反应。
处理二羧酸类的含水混悬液易具有高度粘性且因此难以处理。用于制备二羧酸类的发酵反应中的主要操作问题包括氧的转运、热转移、发酵肉汤中气体的维持和各自受到该肉汤流变学特性影响的存在气体(发泡)中肉汤的维持。同样，在用于从发酵肉汤中回收二羧酸类的过滤方法中，高粘度可导致不实际的滤过率。在聚合反应和酶反应中，粘度对质量转运的影响因需要具有快速、可预测接触的试剂而可能成为主要问题。
在DE 29 09 420 A1中，Watanabe等描述了一种在不含细胞的发酵肉汤中处理长链二羧酸类混悬液的方法以便改善滤过率和回收的二酸类的纯度。他证实他可以通过在pH4或pH4以下将含水二羧酸混悬液加热至50℃以上1小时或1小时以上而控制颗粒大小分布和颗粒形态。他描述了他可以通过使所述颗粒生长至40-50μm的平均颗粒大小而获得改善的滤过率、使滤饼水分降低而滤饼中二羧酸的纯度较高。令人遗憾的是，这种方法对在遇到长链二羧酸类含水混悬液的许多应用而言应用有限。
许多发酵和酶反应在较宽pH范围和低于50℃下发生。在许多情况中，在Watanabe等所述的条件下酶和微生物的活性可能降低或受到破坏。涉及二羧酸含水混悬液的界面和乳液聚合反应可能仅限于热稳定性试剂。因此，对控制长链二羧酸类含水混悬液的流变学特性的供替代方法存在需求。
发明概括
本发明在一个方面中涉及一种发酵培养基和使用所述培养基制备聚羧酸类、多元醇类和聚羟基酸类的方法。所述的发酵培养基含有：
(a)可代谢的碳源和能源；
(b)无机氮源；
(c)磷酸盐源；
(d)至少一种选自碱金属、碱土金属、过渡金属及其混合物组成的组的金属；和
(e)基本上不含颗粒物质和细菌的生物素源。
本发明还涉及一种聚羧酸类、多元醇类和聚羟基酸类的制备方法，该方法包括下列步骤：
(a)提供一种能够产生聚羧酸、多元醇和聚羟基酸的有机体；
(b)提供一种能够通过该有机体转化成聚羧酸、多元醇和聚羟基酸的底物；
(c)提供一种含有下列组成的发酵培养基：
(i)可代谢的碳源和能源；
(ii)无机氮源；
(iii)磷酸盐源；
(iv)至少一种选自碱金属、碱土金属、过渡金属及其混合物组成的组的金属；和
(v)基本上不含颗粒物质和细菌的生物素源；以及
(d)使该有机体在所述的发酵培养基中发酵。
本发明还涉及一种含有至少一种二羧酸的含水混悬液，它还包括水和导致有效形成基本上盘形、基本上部分球形或基本上球形二羧酸颗粒的用量的脂肪物质。
本发明还涉及一种用于改变含有二羧酸的含水混悬液的流变学特性的方法，该方法包括下列步骤：向所述混悬液中添加使二羧酸颗粒有效成形的用量的脂肪物质以便使具备某种形状的二羧酸颗粒形成，其中所述的形状选自基本上盘形、基本上部分球形或基本上球形组成的组。
附图简述
附图1是使用改变肉汤流变学特性的脂肪物质的7％二羧酸类含水发酵肉汤混悬液的布氏粘度的图形描述。
发明详述
将表示组分用量和/或反应条件的所有数字理解为在所有情况中可改变的术语″约″。
本发明通过正确选择维持微生物生长的可替代营养物而提供了一种培养基，该培养基可以使得使用生物转化方法以商业化方式生产大量重要的多功能物质成为可能。本发明提供了现有技术培养基的低成本替代品及其易于制备和灭菌的使用方法、具有程度较低的气味、为随后的下游工艺提供了较低的杂质负载分布、也使得产品的产量至少与现有技术的常规方法获得的产量同样高。令人意外的是玉米浆和酵母提取物中包含的无数不确定的成分可以被相对极少的成分所代替而不会损害微生物的生长质量和多功能化合物的产率。
因此，本发明的一个方面提供了一种能够有利于不同类型有机底物生物转化的经济的发酵培养基。该发酵培养基含有下列必不可少的成分：(i)可代谢的碳源和能源；(ii)无机氮源；(iii)磷酸盐源；(iv)至少一种选自碱金属、碱土金属及其混合物组成的组的金属；和(v)基本上不含颗粒物质和细菌的生物素源。这些物质可以单独满足微生物生长的基本营养需求、还可以产生足以进行生物转化用量和质量的生物质。
可代谢的碳源和能源的合适来源包括但不限于葡萄糖、果糖、麦芽糖、甘油、乙酸钠、甲醇、短链醇类及其混合物。可代谢的碳源和能源的优选来源是葡萄糖、优选液体葡萄糖糖浆、例如95％葡萄糖当量糖浆乃至95％以下葡萄糖当量糖浆。这类物质含有少量的二糖类、三糖类和可以在发酵过程中通过添加诸如淀粉酶、葡糖淀粉酶和纤维素酶这样的淀粉酶而水解的多糖类。因此，可以在与生物氧化同时进行的反应中在原位提供葡萄糖。
无机氮源包括但不限于：诸如硝酸钠或硝酸钾这样的碱金属硝酸盐；诸如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和乙酸铵这样的铵盐。优选的无机氮源是氨或氢氧化铵。
本发明发酵培养基中另一种必不可少的成分是包括含磷酸盐的任意化合物在内的磷酸盐源。其实例包括但不限于磷酸钾、磷酸钠和磷酸铵。用于本发明的特别优选的磷酸盐源是磷酸钾。
用于所述发酵培养基的合适的金属包括碱金属、碱土金属、过渡金属及其混合物。特别优选的金属包括组合形式的钾、钙和镁。
所述发酵培养基中最关键的成分是基本上不含颗粒物质和细菌的生物素。
所述培养基成分中的任意一种可以作为部分原始无菌培养基进料、作为随后向发酵培养基中添加的浓缩水溶液进行灭菌或可以大量过量地包含在发酵罐接种物中以便于将其携带入生产发酵罐。
为了避免与散发气味、颜色不稳定性和污染相关的问题，必需使生物素不含可使这类问题加重并需要其它工艺纯化步骤的颗粒物质和细菌。所需生物素的量低于它替代现有技术培养基中的有机氮源几个数量级。
本发明的发酵培养基在水溶液中含有：(a)约10g/l-约60g/l、优选约20g/l-约40g/l的可代谢的碳源和能源、优选葡萄糖；(b)约50ppm-约2000ppm、优选约50ppm-约250ppm且最优选约100ppm-约250ppm的由包含的无机氮源提供的氮；(c)约1g/l-约10g/l、优选约1g/l-约7g/l的磷酸盐源、优选磷酸钾；(d)约0.01g/l-约2g/l、优选约0.01g/l-约1g/l的至少一种选自碱金属、碱土金属及其混合物组成的组的金属、优选钙与镁的混合物；和(e)约1μg/l-约2000μg/l、优选约4μg/l-约200μg/l且最优选约4μg/l-约20μg/l的生物素，其中该生物素基本上不含有害的颗粒物质和细菌。
发酵培养基中含有的水可以是通过蒸馏、去离子化或软化而纯化的生产用水。优选的水源包括那些来自城市水分布系统、生产用再循环水流的水或因这些水源中已经含有的矿物而需要考虑调节矿物含量的井水。例如，水与其它所需组分中可能已经含有足以为有机体生长提供全部或基本上全部所需矿物的矿物成分。
本发明的发酵培养基满足了微生物生长的基本营养物需求，同时将需要因作为废物处理和产生工艺气味散发而需要从产物中分离的有机和无机成分的添加量减少到最低限度。与本领域中公知的发酵培养基组成相反，本发明的培养基不含颗粒物质、特别适合于在自动培养基制备工艺中的连续灭菌且非常低廉。尽管本发明提供了营养程度极低的培养基组成，但是在配制培养基方面存在很大的灵活性，同时可获得高产率的聚羧酸类、多元醇类和聚羟基酸类。
在本发明发酵培养基中还可以使用不同类型的辅助成分以便进一步加速生物发酵过程。其实例包括但不限于不同类型的微量金属、螯合剂、消泡剂等。
本发明的发酵培养基中可以使用任意的产聚羧酸、产多元醇和产聚羟基酸的酵母和各种底物。例如，在所需产物是诸如二酸这样的聚羧酸的情况中，可以使用任意类型的脂肪酸、脂肪酸酯或烷烃底物。用于生产二酸类的合适底物的实例包括但不限于月桂酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、棕榈油酸及其甲酯及其混合物。烷烃的实例包括十二烷、十二碳烯、十三烷、十四烷、十八烷等。
因此，本发明的另一个方面提供了一种聚羧酸、多元醇和聚羟基酸的制备方法。仅为了举例目的，以制备所需终产物聚羧酸类、多元醇类和聚羟基酸类为基础描述本发明的方法。
可以在微生物可以生长和催化所需转化反应的任意pH范围内实施该方法。优选且特别有利的pH范围是在酸性环境中，即pH约为7或7以下。尽管可以将低pH改善用于任意发酵方法，但是当将它用于生产聚羧酸类的发酵方法时特别有利。合适的pH调控试剂是氨水、氢氧化铵溶液、浓氢氧化钾或氢氧化钠。
有机底物可以是可生物氧化成一-或聚羧酸的任意有机化合物。这类化合物可以是饱和或不饱和的脂肪族化合物或带有至少一个末端甲基、末端羧基和/或通过生物氧化而氧化成羧基的末端官能基的任意羧酸或杂环芳香化合物。属于羧基衍生物的末端官能基可以存在于底物分子上且可以通过非生物氧化的反应而被转化成羧基。例如，在发酵步骤中可以添加例如脂酶以便从其它不可代谢的酯中释放游离脂肪酸。
烷烃类是用于实施本发明方法的饱和有机底物的类型。烷烃类可以是线性或环状、支链或直链、取代或不被取代的。特别优选的烷烃类是那些带有约4-约25个碳原子的烷烃，它们的实例包括但不限于丁烷、己烷、辛烷、壬烷、十二烷、十三烷、十四烷、十八烷等。
可以用于本发明方法的不饱和有机底物的实例包括但不限于：内烯烃类，诸如2-戊烯、2-己烯、3-己烯、9-十八烯等；不饱和羧酸类，诸如包括具有相对高油酸含量的甘油三酯类在内的2-己烯酸及其酯类、包括具有相对高芥酸含量的甘油三酯类在内的芥酸及其酯类、包括具有相对高蓖麻油酸含量的甘油三酯类在内的蓖麻油酸及其酯类、包括具有相对高油酸含量的甘油三酯类在内的亚油酸及其酯类；不饱和醇类，诸如3-己烯-1-醇、9-十八烯-1-醇等；不饱和醛类，诸如3-己烯-1-醛、9-十八烯-1-醛等。除上述物质外，可以用于本发明方法的有机底物还包括带有至少一个内部碳-碳双键和至少一个末端甲基、末端羧基和/或通过生物氧化而氧化成羧基的末端官能基的脂环族化合物。这类化合物的实例包括但不限于3，6-二甲基-1，  4-环己二烯、3-甲基环己烯、3-甲基-1，4-环己二烯等。
可以用于本发明方法的芳香化合物的实例包括但不限于：芳烃类，诸如邻-二甲苯、间-二甲苯、对-二甲苯；邻甲基-苯甲酸、间-甲基苯甲酸、对-甲基苯甲酸；二甲基吡啶等。有机底物还可以含有可生物氧化成羧基的其它官能基、诸如醛基或醇基。有机底物还可以含有不会生物氧化成羧基且不会干扰生物氧化的其它官能基，诸如卤素、醚类。
当培养物主动将底物氧化成产物时，可以在发酵阶段过程中给该培养物提供共底物。这种情况特别正确，即如果不能从底物反应自身中回收纯粹可利用的碳或能量，那么这种碳和能量由所述的共底物提供。
共底物是一种可发酵的诸如葡萄糖、果糖或麦芽糖这样的碳水化合物或例如甘油、乙酸钠、甲醇或短链醇类这样可发酵的其它有机化合物或其混合物。优选的共底物是葡萄糖、优选液体葡萄糖糖浆、例如95％葡萄糖当量糖浆乃至95％以下葡萄糖当量糖浆。这类物质含有少量的二糖类、三糖类和可以在发酵过程中通过添加诸如淀粉酶、葡糖淀粉酶和纤维素酶这样的淀粉酶而水解的多糖类。因此，可以在与生物氧化同时进行的反应中在原位提供葡萄糖。
如果用于使生物质生长的碳源和能源与用于启动氧化转化反应的共底物相同，那么是便利的、但并非绝对必要。实际益处在于需要处理较少的原料且可以充分整合不同的发酵阶段。因此，可以将单一共底物灭菌和转运系统用于转运碳源和能源以便使启动氧化反应的生物质和共底物生长。
可以用于本发明方法的微生物是能够使本文所定义的底物生物氧化的任意微生物。微生物可以是：任意的微生物，其中通过使一种或多种酰基辅酶A氧化酶基因受到破坏、失活或缺失而部分或完全阻断β氧化；任意的酵母，其中使一种或多种酰基辅酶A氧化酶基因受到失活或缺失而部分或完全中断β氧化；任意的假丝酵母属菌株，其中使一种或多种酰基辅酶A氧化酶基因受到失活或缺失而部分或完全中断β氧化反应。当发酵方法包括使底物生物氧化成羧酸时，所述的微生物通常是酵母。这类微生物能够以形成的一-和/或二羧酸类不会进一步被导致链缩短的降解所氧化的方式使底物氧化。然而，本发明的方法涉及任意微生物的应用。
当在作为碳源的烷烃或脂肪酸上培养时，已知分泌α、ω-二羧酸类作为副产物的酵母菌株是美国专利US5,254,466中所列的酵母菌株，将该文献的全部内容引入本文作为参考。这些菌株是部分或完全氧化阻断的菌株；即将它们进行遗传修饰，使得染色体POX4A、POX4B和两种POX5基因受到破坏。在该菌株上的底物流重新定向于ω-氧化途径作为通过POX基因破坏而使竞争性B-氧化途径发生功能性失活的结果。完全氧化阻断的菌株是热带假丝酵母菌株，即美国专利US5,254,466中所述的菌株H5343(ATCC20962)。
另一种合适的菌株是这样一种菌株，其中一种或多种还原酶基因被扩增、从而导致限速ω-羟化酶用量通过P450基因扩增而增加且底物流比例通过ω-氧化途径而增加。选择性增加已知对脂肪酸氧化重要的酶的量的菌株也是优选的。这类菌株含有增加的CYP和CPR基因拷贝。已经将这些基因鉴定为那些与催化氧化途径中第一个步骤的ω-羟化酶复合物产生相关的基因。菌株HDC1是含有整合入菌株H5343基因组的CYP52A2A基因的多拷贝。该菌株和类似菌株描述在05/01/98提交的未审申请顺序号60/083,798中，将该文献的全部内容引入本文作为参考。可以在本发明方法中使用的其它菌株是如PCT/US99/20797中所述的热带假丝酵母菌株HDC1、HDC5、HDC10、HDC15、HDC20、HDC23、HDC23-1、HDC23-2和HDC23-3，将该文献的全部内容引入本文作为参考。
无机氮的合适来源包括任意的含铵的化合物。其实例包括但不限于碱金属硝酸盐或诸如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和乙酸铵这样的铵盐。优选的氮源是铵盐或通过有机体的代谢作用产生氨的化合物、诸如脲。特别优选的用于本发明的无机氮源是氨。
通过使用甘油三酯脂肪或油作为有机底物和共底物的来源可以改变发酵方法。使用发酵肉汤配制的脂酶将所述的脂肪或油水解或裂解成脂肪酸和甘油。有机体消耗甘油用于促使裂解反应至完全，同时提供将游离脂肪酸转化成其相应的二元酸类所必不可少的能量。属于油特异性的脂酶是特别优选的。油特异性脂酶对具有高油酸含量的甘油三酯表现出高选择性并选择性地催化油酸酯部分的水解。这类油特异性脂酶的实例包括但不限于由假单胞菌属的种类、腐质霉属(Humicolalanuginosa)、皱摺假丝酵母、白地霉和假单胞菌属(Burkholderia)产生的脂酶。特别优选的脂酶是来自美国专利US5,470,741中所述白地霉ATCC No.74170的UNLipase，将该文献的全部内容引入本文作为参考。
发酵步骤优选按照生长阶段、诱导阶段和转化阶段这三个阶段进行。可以在温度、pH、通风等相同或不同的发酵罐条件下进行每个阶段。当将细胞培养物导入发酵罐时生长阶段开始且快速生长阶段随后发生。生长随所用培养基组成的不同而可以成指数状态或亚指数状态。这种过程持续至培养物达到通过耗氧减少而测定的线性生长为止。当生长受到向培养基添加关键营养物的速率的限制时，发生线性生长；由此生长与提供有限营养物的速率成正比。在本发明的方法中，所述的关键营养物通常是共底物。第二个阶段是诱导阶段。在诱导阶段中，开始将所需底物转化成产物的关键代谢活性被启动。在诱导培养物前可以将该培养物在线性生长阶段维持一定的时间期限。诱导剂通常是底物本身，但就不会启动其自身转化的化合物而言，可以将另一种诱导剂与底物同步使用。可以将诱导阶段用于使快速生长阶段过渡到转化阶段。当将底物转化成产物时，发酵过程进入下一阶段、即转化阶段。
在转化阶段中，发酵肉汤处于2-7的酸性pH范围内。优选的操作pH范围约为3.5-7.0、甚者更优选约5.0-约6.5的范围。可以通过使用强碱自动滴定来控制pH，所述强碱的实例是氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、氢氧化铵溶液或氨气。注意通过在该pH环境下进行发酵与可以将氨用于pH控制的现有技术的方法相比较，这是由于氨反应形成不挥发性含水铵离子。在碱性pH环境下操作时，制备二羧酸的现有技术的方法不会有效地形成含水铵离子，由此导致肉汤中累积的废气和毒性氨中挥发出不需要的氨蒸汽。发酵可以在约26℃-约40℃的温度下进行。
在第一个阶段中，给培养基接种诸如热带假丝酵母菌株这样β-氧化阻断的微生物活性培养物，其中发生快速指数生长期。通过添加碱来控制培养基的pH，所述碱的实例包括但不限于氢氧化铵、氢氧化钾、氢氧化钠或氨气。向发酵罐中添加的共底物优选是转化阶段中的补料分批添加。指数生长阶段的终点以葡萄糖耗尽、溶解的氧快速增加和最敏感的是废气中氧快速增加和废气中CO2减少为标志。在没有诱导底物存在的情况下，生物质以与葡萄糖进料速率成正比的速率持续累积(即线性生长)。需要在指数生长结束或当达到所需生物质水平时启动转化阶段。如果生产容器中氧转运特征使得可能不能通过以指数生长方式维持培养物而达到所需生物质的水平，那么可以将指数生长、随后是线性葡萄糖受限生长阶段(诱导阶段)以组合方式用于获得给定的生物质水平。
为了在过渡到葡萄糖受限线性生长过程中维持健康状态的培养物，需要在生长过程中开始葡萄糖进料，使得在培养物中始终可利用葡萄糖。以使生长过程中投入的微生物用量较少所需的总葡萄糖为基准来选择最初培养基进料中的葡萄糖浓度。可以从生长开始时的任意时间点开始葡萄糖进料。然而，因为在给生产容器接种后在接种液质量和延迟期方面存在一定的可变性，所以优选在指数生长过程中以通过直接生物质测定值或类似于光密度、二氧化碳放出率或氧摄取率的间接方法判定的某些预定生物质浓度开始葡萄糖进料。葡萄糖可以是精制或未精制的玉米浆。可以将葡萄糖从容器上部经过蒸汽空间作为连续蒸汽或作为连续系列脉冲或冲击方式进料。还可以使葡萄糖进入容器表面下、尤其是进入接近搅拌器的高剪切区以便使进料在整个容器中快速分布。在大容器中，在相同容器内可以存在多个葡萄糖进料点。
氧化底物的转化阶段通过添加诱导剂和含有可氧化甲基的底物而启动。就烷烃而言是脂肪酸、脂肪酸甲酯和脂肪酸盐；这些物质及其组合诱导其自身氧化成二羧酸类且可以用于诱导其它物质的氧化。可以分批或作为连续进料或作为系列连续脉冲或冲击方式进料来添加底物。可以从容器上部经蒸汽空间添加底物或将底物加入到容器表面下、尤其是使其进入高剪切区。在大容器中，可以存在多个底物进料点。氧化在低于7的酸性pH下进行且优选在接近或低于通过氧化形成的羧基的pKa下进行或存在于底物中。
当转化进行至防止生物质和三酰基甘油酯类累积时，优选逐步降低对发酵罐的葡萄糖进料比例。由于转化了商品油酸，所以胞内储存液泡的累积是需要调整的葡萄糖进料比例的有用的指标。通过在转化阶段每24小时将进料比例减少约5％-25％且通常约为10％来进行调整。还可以使用其它指标，诸如碱的利用率、CO2放出率或呼吸商。
发酵过程中通常遇到的一个难题是形成羧酸皂和作为在传统碱性pH范围内操作结果的发泡。在碱性环境中，羧酸形成导致发酵肉汤中不需要的发泡的皂。形成皂的结果是通过向肉汤中添加诸如强碱这样的碱以将该肉汤的pH维持在所需值下而调节的肉汤pH降低。此外，向碱性环境中添加葡萄糖这一步骤导致形成影响发酵肉汤pH的碳酸盐。为了补偿对皂pH和碳酸盐形成的影响，必须加入大量碱以便维持所需水平的肉汤pH。
已经令人意外地发现通过在2-7、优选3-7且甚至更优选5-6.5的酸性pH范围而非强碱pH范围内进行发酵过程，发泡现象基本上得到减少且由在葡萄糖代谢过程中产生的二氧化碳形成碳酸盐的反应减少，由此基本上减少了控制发酵肉汤pH所需原料的用量。通过在酸性pH下进行发酵过程，这些问题基本上得到减少，从而使发酵过程中所用的碱的用量降低。在导致培养基pH下降的生长反应过程中对存在的阳离子当量的净消耗超过阴离子当量。需要在生长过程中通过在控制pH时添加碱而将该培养基的pH控制在2-7且优选约3-6.5的范围。在这些用于该目的的碱中有氢氧化铵、氨、氢氧化钠和氢氧化钾。需要选择可提供在生长过程中消耗的一种或多种主要营养物的诸如氢氧化铵、氨、氢氧化钠或氢氧化钾这样的碱的组合物。对生长培养基制品的调节要考虑到添加pH控制试剂。使用控制pH的NH4OH或氨气减少了通过将pH控制试剂与氮源合并成添加到发酵罐中的一种原料而使微生物生长所需的原料数量。
就使用诸如氨或氢氧化铵这样的氮源而言，在培养基中必须仅含有250ppm或250ppm以下的氮源以便启动生长和消耗这些pH控制试剂。氨的浓度由此在培养物生长过程中几乎保持恒定。因此，可以通过向最初培养基装料中添加氨或铵盐而方便地预选诱导时培养基中氨的所需浓度。用于最初发酵罐装料的氨型氮的有用来源包括磷酸氨(ammoniaphosphate)、硫酸铵、硝酸铵、氨、脲和氢氧化铵。
本发明的另一个方面涉及一种用于繁殖热带假丝酵母的发酵培养基制品且获得了将带有可氧化甲基的底物转化成羧酸的高产率。通过调节进入发酵肉汤中物质的进料速率可以控制微生物的生长。微生物在葡萄糖上生长过程中消耗的主要营养物是氨型氮、钾、镁、磷酸盐和硫酸盐。并不消耗钠和钙，不过，随接种培养基制品的不同，钙应以约5-50ppm或5-50ppm以上的浓度存在以便获得正常生长。在培养基中还包括微量矿物和生物素。这种生物素可以是相对纯的等级或作为诸如生物素酵母、酵母提取物或玉米浆形式这样的较粗制的等级提供。
有用的磷酸盐来源是磷酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸三钾、磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和磷酸三钠以及磷酸。有用的钾来源是硫酸钾、磷酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和苛性钾。
可以将发酵助剂用于烷烃类的氧化和/或脂肪酸类的氧化。优选的发酵助剂是脂肪酸酯，特别优选的发酵助剂是甲酯。使用这类发酵控制试剂的一个主要益处在于控制泡沫和控制发酵肉汤的液体特性。如果产物的链长分布在最终产物的性能上是重要的，那么需要选择与烷烃或脂肪酸相似的甲酯的链长，这是因为还可以将所述甲酯转化成产物。可以将这种酯分批加入或混入进料。如果混入进料，那么它在进料中可以占到约10％或10％以下且优选约1％或1％以下。某些商品脂肪酸天然含有一定的甲酯类且可以将它们直接用作二羧酸生产的底物。例如，EMERSOL267(Cognis Corporation)是一种含有约1％或1％以下甲酯类的商品油酸且已经发现它在本发明中是一种良好的底物。典型的工业用油酸、即用于本方法的EMERSOL267具有下列近似组成：0.3％C12、2.4％C14、0.6％C14∶1、4.7％C16、4.6％C16∶1、0.2％C17、0.8％C18、69.9％C18∶1、10.5％C18∶2、0.3％C18∶3。
就烷烃氧化成二羧酸类而言，已经进一步发现有用的是使用脂肪酸或脂肪酸盐作为发酵助剂。这种情况会使得所述烷烃在整个发酵肉汤中具有较好的分布。可以将脂肪酸分批加入或可以将其配制成烷烃进料。如果配制成进料，那么脂肪酸或脂肪酸盐在所述进料中一般可以占到约10％或10％以下且优选约5％或5％以下。这里再次强调，如果产物的链长分布在最终产品性能上是重要的，那么需要选择与烷烃相似的脂肪酸的链长分布，这是因为还可以将所述脂肪酸转化成产物。
已经令人意外地发现例如脂肪酸类和脂肪酯类这样的脂肪物质的特定组合在低于50℃的温度下使长链二羧酸类的精制含水混悬液形成高度精细的颗粒。还可以单独或以组合方式使用包括脂肪醇类、脂肪醚类等在内的其它脂肪物质并将它们看作是本发明的组成部分。所得的混悬液具有理想的有利于其操作和实际应用的剪切稀化特性。要求在所述混悬液中如此形成的颗粒具有很窄的大小分布内的大小。本发明的该方面充分适合于在大规模生产设备中应用。实际上，在这类设备中出现的性能优于在实验室规模的设备中出现的性能。这一结果提示壁效应可能在颗粒生长过程中起作用。
有用的脂肪物质包括C10-C20的饱和和不饱和脂肪酸类及其酯类，它们包括但不限于向日葵脂肪酸类、向日葵脂肪酸甲酯类、动物脂肪酸类和动物脂肪酸甲酯类。这些物质的典型商品组合物的实例如表1中所示。
下面所列的每种组合物均商购自Cognis Corp.，Cincinnati，OH。
                      表1.添加剂实例的组成
    添加剂 高级油酸向日葵脂肪酸类 牛油酸甲酯 高级油酸向日葵脂肪酸甲酯类 油酸甲酯
    商品名     Emery244EdenorPK1805     Emery2203  EdenorME-V05    Emery2301
    脂肪酸                        脂肪酸分布(％)
    C10     0.05     -
    C12     0.11     0.65     -
    C14     0.11     2.80     -     3.0
    C14：1     -     0.47     -     2.0
    C15     0.15     0.45     0.29
    C15：1     0.21     -
    C16     3.87     23.82     4.17     4.0
    C16：1     0.09     2.46     0.10     6.0
    C17     -     1.26     -     1.0
    C17：1     0.68     -
    C18     4.73     19.00     4.48
    C18：1     84.45     42.20     87.4     76.0
    C18：2     5.24     2.54     2.91     7.0
    C18：3     0.43     0.25     -     1.0
    C20：1     0.30     0.33     -
在发酵肉汤中制备的二羧酸类一般作为1-10μm长的针状晶体存在。该二酸类的组成反映出所氧化底物的链长。这类发酵肉汤可以高度粘化成固体点。当将本文所述的脂肪物质用于这类发酵时，它能够在低于约50℃的温度下在原位生长成基本上盘形、基本上部分球形(例如杯形)和/或基本上球形的约15-40μm或15-40μm以上直径和约1-5μm厚度的二羧酸颗粒。在本发明的一个实施方案中，产生具有约1cm直径的基本上球形的颗粒。因此，关注的是按照本发明生产的二羧酸颗粒可以具有约1μm-约1cm或1cm以上范围的直径和/或厚度。当将本文所述的脂肪物质用于生产或含有二羧酸类的发酵时，所得肉汤具有低表观粘度，使得可以在最佳条件下持续处理发酵肉汤。为方便起见，本文所用的术语″盘形″还可以指基本上部分球形的颗粒。本文所用的″基本上″指的是近似精确。
就产生二羧酸类的发酵反应而言，使用这类脂肪物质的有益之处在于也能够将这些试剂添加剂转化成二羧酸类。这一结果简化了从肉汤中回收二羧酸类的步骤，使得不再需要为除去添加剂而进行其它加工处理。
可以直接使用某些商购脂肪酸制品以便形成盘形颗粒，这是因为在其制备过程中，导致发酵过程中所需颗粒生长和大小分布的脂肪衍生物被遗留下来。这些脂肪酸制品的实例包括含有低浓度甲酯的Emersol267 Oleic acid(商购自Cognis Corp.，Cincinnati，Ohio)和含有低浓度甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯的部分水解的脂肪酸类。就二羧酸发酵而言，可以由此使得从由本发明方法获知的商购底物中正确选择底物成为可能。
关注的是可以在本文所述的各种发酵培养基中与诸如硅氧烷聚丙二醇这样的消泡剂一起使用脂肪物质而不会对颗粒生长产生抑制作用。
可以按照分批或批量进料方式向二羧酸含水混悬液中添加脂肪物质。一般来说，以二羧酸的质量为基准，所用脂肪物质的浓度可以在约10ppm-约5％或5％以上、而优选约50ppm-约1％的范围。颗粒开始生长，条件是含有最低浓度的添加剂。认为脂肪酸添加剂有助于二羧酸颗粒生长，而脂肪酸酯类和其它脂肪衍生物有助于提供很窄的颗粒大小分布。
就由烃类生产二羧酸类的发酵而言，需要添加包括脂肪酸类和脂肪酸甲酯类在内的脂肪衍生物的组合。最适宜的是将这些物质混入烃类进料以便简化进入发酵的添加剂的准备、灭菌和进料步骤。
同样，就由脂肪酸生产二羧酸类的发酵而言，需要添加类似相应的甲酯。因此，添加剂不会改变二羧酸产物的链长分布。
在实施具有使二羧酸盘形颗粒生长并描述对所述混悬液流变学特性益处的公开的这些方法的本发明过程中许多组合和应用是可能的。
已经令人意外地发现通过将溶解的氧浓度水平维持在占饱和空气的约25％以下且优选20％以下，在转化阶段中所需的共底物的用量减少。当溶解的氧的浓度低于这些水平时，葡萄糖更有效地用于提供氧化用能量。添加过多葡萄糖的结果包括在转化阶段中生物质和三酰基甘油酯类进一步累积，而产生的二羧酸减少。
可以部分通过调节最初培养基进料中镁的浓度或镁与磷酸盐的比例来控制含油酵母中三酰基甘油酯的形成或将其减少到最低限度。优选的镁在发酵接种物中的浓度约为0.1-约1.0gm/L且更优选约0.2-约0.8g/L的浓度。优选的磷酸盐∶镁之比为20∶1-约2∶1、优选15∶1-约3∶1。
还令人意外地发现在转化阶段中发酵肉汤中累积了可消耗H2O2的热不稳定性过氧化氢酶样活性。这种情况可能干扰测定由葡萄糖氧化酶产生的H2O2的葡萄糖浓度试验。
本发明方法的一个优选的实施方案是通过对油酸进行生物氧化来制备9-十八碳烯二酸(octadecenedioic acid)。尽管可以将任意等级的油酸用作底物，但是典型的工业用油酸由下列羧酸组成：0.42％C12；2.7％C14；0.86％C14：1；6.3％C16；4.6％C16：1；0 93％C17；2.8C18；71.8％C18：18.3％C18：2；0.58％C18：3。该油酸还可以是获自例如美国专利US4,627,192中所述向日葵(Helianthus annuus)(向日葵籽油)种类脂肪油的高等级油酸，将该文献的全部内容引入本文作为参考。还可以将其它油籽变种的高级油酸用于本方法。这类油富含大量油酸且至少含有70-80％(重量)的油酸。
根据下列实施例可以更好地理解本发明，所有这些实施例仅用于解释目的而不意味着以任何方式来过度限制本发明的范围。在所有的实施例中，成分的浓度以其无水形式表示。可以使用所列成分的商购水合物，条件是适当调节该浓度以便包括水合物中的水。
实施例1
制备本发明的发酵培养基，其中的成分如下面的表2和3中所列。
                          表2
合成成分                           生产培养基浓度(g/L)
葡萄糖                                 27.0
硫酸铵                                 7.0
磷酸二氢钾                             5.1
硫酸镁                                 0.5
氯化钙                                 0.1
柠檬酸                                 0.06
氯化铁                                 0.023
生物素                                 0.0002
微量金属：
硼酸                                   0.0009
硫酸铜                                 0.00007
碘化钾                                 0.00018
氯化铁                                 0.00036
硫酸锰                                 0.00072
钼酸钠                                 0.00036
硫酸锌                                 0.00072
水                                     平衡
SAG471(E)消泡剂                        0.8ml
以合适的方式对表2中的培养基成分进行加热灭菌以避免任何沉淀反应，然后将它们混入无菌发酵罐容器、同时冷却。发现完整的未接种培养基完全澄清并带有轻度的稻草色且没有强烈的气味。添加消泡剂产生轻度浑浊。使热带假丝酵母H5343ALK2-1在无菌条件下的搅拌、充气发酵罐内在表2中所列培养基上生长，该发酵罐中最初的液体体积为12L。给该无菌培养基接种5％的热带假丝酵母H5343ALK2-1接种液并使其在35℃和pH5.8下生长约10小时，同时搅拌并通气，其比例足以使溶解的氧保持在20％以上。当培养物停止以指数方式生长且溶解的氧开始增加时，通过以0.7g/L/小时的速率开始通入混有发酵助剂1.25％Emersol267(工业用油酸)和1.25％Emery2203(工业用牛油酸甲酯)的Exxon Developmental Fluid137(含有约94.4％十三烷的烃，用于平衡的主要是十二烷)的连续进料流而启动转化阶段。同时发酵罐中的温度从35℃降低至30℃、通风率降低至0.4vvm并将0.4巴的反压施用于容器。在生长和转化阶段中用6N KOH将pH维持在5.8-5.9。当生物质的浓度达到约10g/L时，开始向发酵罐中以1.58g/L/小时的速率通入连续的葡萄糖进料流。根据显微镜观察和对酵母细胞内累积储存液泡的估计发现基于每天转化过程中的葡萄糖进料比例减少了0-15％。在转化过程中向发酵罐中添加7ml的PPG(聚丙二醇)消泡剂以控制轻度发泡。在50小时的转化阶段后，发酵罐中的全部肉汤含有41.5g/Kg1，13-十三烷二酸。
实施例2
                      表3
合成成分                            生产培养基浓度(g/L)
葡萄糖                                  27.0
磷酸二氢钾                              4.9
硫酸镁                                  0.6
氯化钙                                  0.1
柠檬酸                                  0.06
氯化铁                                  0.023
生物素                                  0.000012
微量金属：
硫酸铜                          0.00007
硫酸锰                          0.00432
硫酸锌                          0.00072
柠檬酸盐                        0.00708
水                              平衡
SAG471(E)消泡剂                 0.6ml
以合适的方式对表3中的培养基成分进行加热灭菌以避免任何沉淀反应并将它们混入无菌发酵罐容器。发现完整的未接种培养基完全澄清并带有轻度的稻草色且没有强烈的气味。使热带假丝酵母H5343 HDC23-3在无菌条件下的搅拌、充气发酵罐内在表3中所列培养基上生长，该发酵罐中最初的液体体积为12L。给该无菌培养基接种3％的热带假丝酵母H5343 HDC 23-3接种液并使其在35℃下生长约12小时，同时搅拌并通气，其比例足以使溶解的氧保持在20％以上。在该生长阶段中通过添加6N NH4OH将pH调节至并维持在5.8-5.9，其中6N NH4OH也是培养基中无机氮的来源。当培养物停止以指数方式生长且溶解的氧开始增加时，通过添加诱导进料且同时以2.0g/L/小时的速率开始通入高油酸向日葵脂肪酸(High Oleic Sunflower Fatty Acids)(含有84.4％油酸、5.2％亚油酸、4.7％硬脂酸、3.9％棕榈酸，其中平衡物包括少量二十烷酸(20∶0)、二十碳烯酸(eicosaenoic acid)(20∶1)、十五烷酸、月桂酸和肉豆蔻酸)的连续进料流而启动转化阶段。同时发酵罐中的温度从35℃降低至30℃、通风率降低至0.4vvm并将pH控制试剂由NH4OH切换成NaOH。在转化阶段用6N NaOH将pH维持在5.8-5.9。当生物质的浓度达到约10g/L时，开始向发酵罐中以1.22g/L/小时葡萄糖的速率通入连续的葡萄糖进料流。根据显微镜观察和对酵母细胞内累积储存液泡的估计发现基于每天转化过程中的葡萄糖进料比例减少了0-45％。在转化阶段中没有再使用消泡剂。在50小时的转化阶段后，发酵罐中的全部肉汤含有71g/Kg总二羧酸类。实施例3
                      表4合成培养基制品
培养基成分                     浓度(g/L)
葡萄糖                          20.0
硫酸铵                          0.5
磷酸二氢钾                      5.1
硫酸镁                          0.9
NaCl                            0.5
氯化钙                          0.1
生物素                          0.0002
微量金属：
硼酸                            0.00075
硫酸铜                          0.00006
碘化钾                          0.00015
硫酸铁                          0.04
氯化铁                          0.0003
硫酸锰                          0.0006
钼酸钠                          0.0003
硫酸锌                          0.0006
水                              平衡
SAG 471(E)消泡剂                2滴
以合适的方式对表4中的培养基成分进行加热灭菌以避免任何沉淀反应，然后将它们混入无菌发酵罐容器。发现该培养基完全澄清而带有轻度颜色且几乎没有气味。添加消泡剂产生轻度浑浊。最初使用6N氢氧化铵溶液将该培养基的pH调节至pH5.8。使用在具有相似组成的培养基中制备的4％接种液使热带假丝酵母H5343(ATCC 20962)在搅拌和通风的发酵罐内的该培养基上生长。在短暂延迟期后开始指数生长。当通过光密度测定值判定培养物中含有约5g/L干重的生物质时，基于最初培养基的体积以1.25g/L/小时的速率开始葡萄糖进料。指数生长持续了约9小时，此时葡萄糖使生长达到极限而同时在该期限内指数生长率仅轻度降低。
在该快速生长期限结束时，将pH控制试剂改变成6N氢氧化钾溶液并在接下来的110小时中使葡萄糖进料保持恒定。在该期限过程中，在整个指数生长过程中浓度保持恒定的铵从培养基中耗尽且磷酸盐的浓度下降至低水平。尽管消耗了这些关键营养物，但是生物质以恒定的线性速率持续在培养基中累积。存活细胞计数也以线性方式增加至铵从培养基中耗尽为止。此后它们保持恒定。最终该发酵过程产生了71.5g/L干重的生物质。对比例1
生产培养基成分                   浓度(g/L)
葡萄糖                            40.0
硫酸铵                            8.0
玉米浆                            9.0
磷酸二氢钾                        2.0
磷酸氢二钾                        1.0
硫酸镁                            0.5
NaCl                              0.5
氯化钙                            0.1
微量金属：
硼酸                              0.00075
硫酸铜                            0.00006
碘化钾                       0.00015
氯化铁                       0.0003
硫酸锰                       0.0006
钼酸钠                       0.0003
硫酸锌                       0.0006
SAG471(E)消泡剂              2滴
以合适的方式对对比例1中的培养基成分进行加热灭菌以避免任何沉淀反应并将它们混入无菌发酵罐容器。发现完整的未接种培养基颜色极暗且带有强烈的玉米浆的气味特征。使热带假丝酵母H5343(ATCC20962)在无菌条件下的搅拌、充气发酵罐内在表4中所列培养基上生长，该发酵罐中最初的液体体积为10L。给该无菌培养基接种6％的热带假丝酵母H5343(ATCC 20962)接种液并使其在35℃下生长约9.5小时，同时搅拌并通气，其比例足以使溶解的氧保持在20％以上。在生长过程中向发酵罐中添加5ml的SAG471消泡剂以控制培养物中的发泡现象。在生长阶段中通过添加6N NH4OH将pH维持在5.8-5.9。当培养物停止以指数方式生长且溶解的氧开始增加时，通过以2.0g/L/小时的速率开始通入Emersol267(含有71.8％油酸、8.3％亚油酸、6.3％棕榈酸、4.6％棕榈油酸、2.8％硬脂酸、2.7％肉豆蔻酸、0.93％C17∶0酸、0.86％肉豆蔻脑酸、0.58％亚麻酸和0.42％月桂酸的商品级油酸)的连续进料流而启动转化阶段。同时发酵罐中的温度从35℃降低至30℃、通风率降低至1.2vvm并将pH控制试剂由NH4OH切换成KOH。在转化阶段用6N KOH将pH维持在5.8或5.8以上。在即刻开始转化阶段的指数生长结束时以1.8g/L/小时葡萄糖的速率开始使葡萄糖进料流连续进入发酵罐。在整个转化阶段对发酵罐维持这种相同的葡萄糖进料速率。在转化阶段的前3小时过程中向发酵罐中添加17ml的SAG471消泡剂以控制极为明显的发泡现象。在50小时的转化阶段后，发酵罐中的全部肉汤含有64g/Kg总二羧酸类。实施例4十二烷二酸含水混悬液的改变
首先通过使用过量KOH将12.5克的Dupont产品(AldrichChemical Company)十二烷二酸(99％)溶于水而形成水-可溶性二羧酸盐来制备25g/l长链二羧酸的细粒含水混悬液。然后使用H2SO4将该溶液快速滴定至pH6以便沉淀所述的二酸。
将20毫升该混悬液分散入各8只安装了搅棒的平底螺丝帽小瓶中。因此，各小瓶中含有悬浮于水中的0.5克的细粒十二烷二酸。在30℃下将它们置于磁搅拌器上的水浴中并通过搅拌过夜使该混悬液达到平衡。
通过在平衡小瓶中分批加入不同浓度的测试物质来测试不同添加剂对混悬液特性的影响。商品测试物质的组成如表1中所示。
各小瓶中的纯净制品如表5中所示。
                         表5
    表5：对二羧酸含水混悬液的添加剂作用测试
    测试体积＝20ml测试温度＝30℃
    混悬液中的十二烷二酸＝0.5克
    小瓶     添加剂   量(μg) 添加剂/DDDA之比(ppm)
    1     油酸     44     88
    2     油酸     88     176
    3   牛油酸甲酯     44     88
    4   牛油酸甲酯     88     176
    5   油酸甲酯     44     88
    6   油酸甲酯     88     176
    7   无(对照)     0     0
在加入测试添加剂后4小时、24小时或24小时以上观察该混悬液的外观和特性并与对照品(小瓶7)进行比较。正如在相衬显微镜下观察到的，作为混悬液的对照品中出现一定程度的各个颗粒的结合。
两种甲酯添加剂在两种浓度下使得DDDA更好地与相似大小的分散颗粒结合(小瓶3-6)。这种情况在将它们从搅拌的小瓶中取出并使之沉降时是明显的。含有甲酯添加剂的混悬液的沉降远比对照品迅速。剩余的水相比对照品澄清，而对照品保持了浑浊，因为在混悬液中保留了较小的DDDA颗粒。
使用含有4小时后颗粒开始结合成大团块的油酸添加剂的混悬液获得了最令人意外的结果。在20小时时，小瓶1在接近底部有较大的DDDA密集团块且在小瓶上部有一些较小的团块。在20小时时，小瓶2中含有约1cm直径的单个DDDA球且水相澄清。
当将小瓶1和2持续保温超过20小时时，数块较大团块已经破碎。然后这些团块粘附在搅拌棒自身上。最终所有的DDDA在搅拌棒上生长，使得小瓶中的澄清水中含有涡动的DDDA大团块。
本实施例表明了如何将脂肪酸类和脂肪酸衍生物的添加用于使二羧酸类的含水混悬液更适合于通过使用过滤、沉降或大小分级的方法的分离。
实施例5二羧酸含水混悬液的粘度：颗粒形态的影响
在30℃下使用微生物的来自高级油酸向日葵油的发酵肉汤中制备约12％(117.0g/kg)的饱和和不饱和的主要为C16-C18的二羧酸类的含水混悬液。在发酵过程中，以一定速率向发酵肉汤中分批加入油酸甲酯以使油酸甲酯与二羧酸类之比约为1％。收集肉汤样品以用于相衬显微镜观察和如表6中所示的粘度测定。
为了进行比较，接着将样品加热至70℃并快速冷却至室温以破坏在原始肉汤中形成的盘形结构。然后也如表6中所示进行类似分析。
    表6.颗粒形态对约12％二羧酸含水发酵肉汤混悬液的布氏粘度的影响
    样品     颗粒外观 转轴/转速(rpm) 粘度(cP)@21℃
    发酵肉汤 杯形圆片，20-30μm直径，5μm厚   转轴2/3rpm     5,000
加热然后冷却的发酵肉汤 针状晶体   转轴4/0.3rpm     1,000,000
在不同浓度水平的二羧酸混悬液下进行的一系列相似实验证实了上述结果，因为它们表现出基本上相似形式的特性。就热杀样品而言，这类浓度如下：27.6g/kg、57.3g/kg、83.2g/kg、95.8g/kg、100.9g/kg、117.0g/kg和117.0g/kg。
这些结果表明脂肪酸衍生物对发酵肉汤中二羧酸形态和粘度具有惊人的影响。
实施例6不同脂肪酸衍生物和浓度对二酸沉淀形态的影响
按照与实施例5类似的发酵方式测试不同浓度和类型的脂肪酸衍生物并用显微镜检测样品以确定对二羧酸颗粒生长的影响。表7表示了用于二羧酸生产的几种底物组合、添加剂脂肪酸衍生物的组合和对二羧酸混悬液的相衬显微镜观察所得到的外观。
             表7.脂肪酸衍生物添加剂对发酵肉汤中混悬液形态的影响
氧化成二羧酸类的底物 添加的混悬液改性剂(与二酸类之比)   悬浮的二羧酸颗粒的外观
高级油酸向日葵脂肪酸类     1.0％油酸甲酯 盘形至杯形、约30μm直径×5μm厚度的有限分布
高级油酸向日葵脂肪酸类     0.1％油酸甲酯 约15μm直径的单一盘形有限分布
部分水解的高级油酸向日葵油1 含有5％脂肪酸甘油酯类 约15μm直径的单一盘形有限分布
高级油酸向日葵脂肪酸类 无(用于原位脂肪酸氧化的比较用对照品) 集中在约5-10μm直径的盘形大小的双态分布
    烃类混合物2   2.5％ Emersol267+2.5％牛油酸甲酯     直径为20μm的盘形颗粒
    烃类混合物2     1.25％ 油酸甲酯+1.25％油酸 约15μm直径的单一盘形有限分布
    烃类混合物2 无(用于原位烃氧化的比较用对照品) 几乎没有盘形颗粒，大部分颗粒＜2μm
1高压蒸汽水解的具有酸值＝188.3且皂化值＝198.5的油，表示95％的脂肪酸三甘油酯类水解，得到甘油一酯、甘油二酯和甘油三酯的混合物用作沉淀改性剂。2NORPAR13 SOLVENT：含有标准脂肪烃C11  ＜1％、C12＝13％、C13＝50％、C14＝35％、C15  ＜ 1％的Exxon Corporation产品。
实施例7二羧酸类含水混悬液的粘度：剪切-稀化特性
在使用各1.25％的油酸甲酯和油酸的发酵肉汤中制备70.3g/kg(#7％)剪切稀化特性的C11-C15饱和二羧酸的含水混悬液。对该肉汤进行的相衬显微镜检查表明二酸混悬液含有15μm直径的盘形二羧酸颗粒。附图1表示该含水混悬液的剪切稀化特性。在不同浓度水平的二羧酸混悬液下进行的一系列相似实验证实了上述结果，因为它们表现出基本上相似形式的特性。这类浓度为17.8g/kg、26.4g/kg和59.9g/kg。

Claims (29)

1.一种含有至少一种二羧酸的含水混悬液，它包括水、至少一种二羧酸和有效导致基本上盘形、基本上部分球形或基本上球形二羧酸颗粒形成的用量的脂肪物质。
2.一种权利要求1的含有至少一种二羧酸的含水混悬液，其中所述的二羧酸颗粒的直径大于约15μm。
3.一种权利要求2的含有至少一种二羧酸的含水混悬液，其中所述的二羧酸颗粒的直径在约15μm-约1cm的范围。
4.一种权利要求1的含有至少一种二羧酸的含水混悬液，其中所述的基本上盘形或基本上部分球形二羧酸颗粒的厚度在约1μm-约5μm的范围。
5.一种权利要求1的含有至少一种二羧酸的含水混悬液，其中将该混悬液的温度维持在约50℃以下。
6.一种权利要求1的含有至少一种二羧酸的含水混悬液，其中所述的脂肪物质是脂肪酸。
7.一种权利要求1的含有至少一种二羧酸的含水混悬液，其中所述的脂肪物质是脂肪酸酯。
8.一种权利要求7的含有至少一种二羧酸的含水混悬液，其中所述的脂肪酸酯是甲酯。
9.一种权利要求1的含有至少一种二羧酸的含水混悬液，其中以二羧酸的质量为基准，所述脂肪物质的含有量大于约10ppm。
10.一种权利要求9的含有至少一种二羧酸的含水混悬液，其中以二羧酸的质量为基准，所述脂肪物质的含有量在约10ppm-约5％的范围。
11.一种权利要求10的含有至少一种二羧酸的含水混悬液，其中以二羧酸的质量为基准，所述脂肪物质的含有量在约50ppm-约1％的范围。
12.一种权利要求1的含有至少一种二羧酸的含水混悬液，其中所述的脂肪物质包括脂肪酸与脂肪酸酯的组合。
13.一种权利要求12的含有至少一种二羧酸的含水混悬液，其中所述的脂肪酸酯是甲酯。
14.一种权利要求1的含有至少一种二羧酸的含水混悬液，其中该含水混悬液是包括下列组成的发酵培养基：
(a)可代谢的碳源和能源；
(b)无机氮源；
(c)磷酸盐源；
(d)至少一种选自碱金属、碱土金属、过渡金属及其混合物组成的组的金属；和
(e)基本上不含颗粒物质和细菌的生物素源。
15.一种用于改变含有二羧酸的含水混悬液的流变学特性的方法，该方法包括下列步骤：向所述混悬液中添加使二羧酸颗粒有效成形的用量的脂肪物质以便使具备某种形状的二羧酸颗粒形成，其中所述的形状选自基本上盘形、基本上部分球形或基本上球形组成的组。
16.一种权利要求15的用于改变含有二羧酸的含水混悬液的流变学特性的方法，其中所述的颗粒具有约大于15μm的直径。
17.一种权利要求16的用于改变含有二羧酸的含水混悬液的流变学特性的方法，其中所述的二羧酸颗粒的直径在约15μm-约1cm的范围。
18.一种权利要求15的用于改变含有二羧酸的含水混悬液的流变学特性的方法，其中所述的基本上盘形或基本上部分球形二羧酸颗粒的厚度在约1μm-约5μm的范围。
19.一种权利要求15的用于改变含有二羧酸的含水混悬液的流变学特性的方法，进一步包括将该混悬液的温度维持在约50℃以下的步骤。
20.一种权利要求15的用于改变含有二羧酸的含水混悬液的流变学特性的方法，其中所述的脂肪物质是脂肪酸。
21.一种权利要求15的用于改变含有二羧酸的含水混悬液的流变学特性的方法，其中所述的脂肪物质是脂肪酸酯。
22.一种权利要求21的用于改变含有二羧酸的含水混悬液的流变学特性的方法，其中所述的脂肪酸酯是甲酯。
23.一种权利要求15的用于改变含有二羧酸的含水混悬液的流变学特性的方法，其中加入的脂肪物质占二羧酸质量的约10ppm以上。
24.一种权利要求23的用于改变含有二羧酸的含水混悬液的流变学特性的方法，其中所述的用量占二羧酸质量的约10ppm-约5％。
25.一种权利要求24的用于改变含有二羧酸的含水混悬液的流变学特性的方法，其中所述的用量占二羧酸质量的约50ppm-约1％。
26.一种权利要求15的用于改变含有二羧酸的含水混悬液的流变学特性的方法，其中所述的脂肪物质是脂肪酸与脂肪酸酯的组合。
27.一种权利要求26的用于改变含有二羧酸的含水混悬液的流变学特性的方法，其中所述的脂肪酸酯是甲酯。
28.一种权利要求15的用于改变含有二羧酸的含水混悬液的流变学特性的方法，其中该含水混悬液包括发酵培养基。
29.一种权利要求28的用于改变含有二羧酸的含水混悬液的流变学特性的方法，其中所述的发酵培养基包括：
(a)可代谢的碳源和能源；
(b)无机氮源；
(c)磷酸盐源；
(d)至少一种选自碱金属、碱土金属、过渡金属及其混合物组成的组的金属；和
(e)基本上不含颗粒物质和细菌的生物素源。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101270374B (zh) * 2008-05-23 2011-06-29 中国科学院微生物研究所 微生物转化油脂生产饱和及不饱和α,ω-二羧酸的方法

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020061566A1 (en) * 2000-03-20 2002-05-23 Eirich L. Dudley Biooxidation capabilities of candida sp
US7270947B2 (en) * 2003-01-14 2007-09-18 Cognis Corporation Method for controlling biooxidation reactions
US7381559B2 (en) * 2004-06-09 2008-06-03 Scientific Plastic Products, Inc. Fermentation flask for cultivating microorganisms
US7785848B2 (en) * 2006-05-23 2010-08-31 Activa Biogreen, Inc. Biomass conversion performance using igneous phyllosilicate minerals with high emission of far-infrared light
US20080103340A1 (en) * 2006-10-27 2008-05-01 Archer-Daniels-Midland Company Applications of biobased glycol compositions
FR2921362B1 (fr) * 2007-09-20 2012-09-21 Arkema France Procede de synthese d'acides gras omega-insatures
FR2921363B1 (fr) * 2007-09-20 2009-11-06 Arkema France Procedes de synthese de diacides gras par metathese de diacides insatures obtenus par fermentation d'acides gras naturels
FR2921364B1 (fr) * 2007-09-20 2009-11-06 Arkema France Procede de coproduction de 7-oxoheptanoate de methyle et d'acide undecylenique a partir d'acide ricinoleique
US8497090B2 (en) 2007-10-23 2013-07-30 Indian Institute Of Science Fungal strains and a process for production of insecticide thereof
WO2009068242A2 (en) * 2007-11-26 2009-06-04 Cognis Ip Management Gmbh Polyamides prepared from long-chain dicarboxylic acids and methods for making the polyamides
FR2932807B1 (fr) 2008-06-20 2011-12-30 Arkema France Polyamide, composition comprenant un tel polyamide et leurs utilisations.
FR2933696B1 (fr) * 2008-07-10 2010-08-20 Arkema France Procede de synthese d'acides omega-amino-alcanoiques ou de leurs esters a partir d'acides gras naturels.
FR2941694B1 (fr) 2009-02-05 2011-02-11 Arkema France Procede de synthese d'un omega-aminoacide ou ester a partir d'un acide ou ester gras mono-insature.
US8669397B2 (en) 2009-06-13 2014-03-11 Rennovia, Inc. Production of adipic acid and derivatives from carbohydrate-containing materials
BRPI1013087B1 (pt) 2009-06-13 2018-05-15 Rennovia, Inc. Processo para preparar um produto de ácido glutárico
CA2763777C (en) 2009-06-13 2017-10-17 Rennovia Inc. Production of adipic acid and derivatives from carbohydrate-containing materials
CN102482638A (zh) 2009-07-02 2012-05-30 微德赞股份有限公司 制备己二酸的生物学方法
US8669393B2 (en) 2010-03-05 2014-03-11 Rennovia, Inc. Adipic acid compositions
US9770705B2 (en) 2010-06-11 2017-09-26 Rennovia Inc. Oxidation catalysts
US8343752B2 (en) 2011-05-03 2013-01-01 Verdezyne, Inc. Biological methods for preparing adipic acid
US8728798B2 (en) 2011-05-03 2014-05-20 Verdezyne, Inc. Biological methods for preparing adipic acid
CN110218746A (zh) * 2018-03-01 2019-09-10 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 发酵生产长链二元酸的方法及发酵液、发酵处理液、污水
CN110218745A (zh) * 2018-03-01 2019-09-10 上海凯赛生物技术研发中心有限公司 发酵生产长链二元酸的方法及其得到的长链二元酸
US11091742B2 (en) 2018-04-04 2021-08-17 Cathay Biotech Inc. Directed evolution of CYP52A12 gene and its use in dicarboxylic acid production
CN110541008A (zh) * 2018-05-29 2019-12-06 上海凯赛生物技术股份有限公司 一种长链二元酸铵的制备方法及其应用
CN111850060A (zh) * 2019-04-25 2020-10-30 上海凯赛生物技术股份有限公司 一种发酵生产十六碳二元酸的方法、十六碳二元酸及其制备方法

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5325032B2 (zh) * 1972-06-08 1978-07-24
JPS57206394A (en) * 1981-06-16 1982-12-17 Mitsui Petrochem Ind Ltd Preparation of dicarboxylic acid
DE3540834A1 (de) * 1985-11-18 1987-05-21 Henkel Kgaa Verfahren zur herstellung von dicarbonsaeuren
US4818425A (en) 1986-05-28 1989-04-04 Akzo N.V. Process for the preparation of diperoxydodecanedioic acid-containing agglomerates and compositions in which these agglomerates are used as bleaching component
US5254466A (en) * 1989-11-06 1993-10-19 Henkel Research Corporation Site-specific modification of the candida tropicals genome
WO1991014781A1 (en) * 1990-03-19 1991-10-03 Henkel Research Corporation METHOD FOR INCREASING THE OMEGA-HYDROXYLASE ACTIVITY IN $i(CANDIDA TROPICALIS)
US5733774A (en) * 1995-02-02 1998-03-31 Ecoscience Corporation Method and composition for producing stable bacteria and bacterial formulations
US5962285A (en) 1995-09-08 1999-10-05 Henkel Corporation Process for making polycarboxylic acids
US6004784A (en) 1998-09-14 1999-12-21 General Electric Co. Fermentation medium and method for producing α, ω -alkanedicarboxylic acids
US6066480A (en) * 1998-09-21 2000-05-23 General Electric Company Method for high specific bioproductivity of α,ω-alkanedicarboxylic acids

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101270374B (zh) * 2008-05-23 2011-06-29 中国科学院微生物研究所 微生物转化油脂生产饱和及不饱和α,ω-二羧酸的方法

Also Published As

Publication number Publication date
JP2003519484A (ja) 2003-06-24
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JP4666867B2 (ja) 2011-04-06
CA2396300A1 (en) 2001-07-19
US6569670B2 (en) 2003-05-27
AU2768601A (en) 2001-07-24
EP1244771A1 (en) 2002-10-02
ES2300315T3 (es) 2008-06-16

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