CN1387037A - 生物大分子分离或同时复性及纯化色谱饼 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生物化工或工程装置,特别是一种生物大分子分离或同时复性及纯化的色谱饼。其技术关键是色谱介质两端由压板固定,侧部环形柱体上设置有侧孔,压板和柱体组成色谱饼的腔体,厚度与径向长度之比小于或等于1,腔体内色谱介质两端设置有分布器、筛板。该装置可以使色谱填料由柱体侧孔装填。装填的色谱饼柱效高表面平整,工艺简单劳动强度低。
Description
本发明涉及一种生物化工或工程装置，特别是一种生物大分子分离或同时复性及纯化的色谱饼。
色谱法与毛细管电泳法是目前所知的最有效的两种生物大分子分离手段，后者仅能用于分析规模，而前者可用于分析、制备和生产规模，是目前生物工程中最重要、最好的分离手段。传统的观念是色谱的分离效果与柱塔板数即与柱长成正比。然而，柱子太长不仅色谱柱昂贵，而且，柱压升高，必须使用价值昂贵的高效液相色谱仪。虽然人们从经验上知道，生物大分子的分离基本上与柱长无关，但仍然不知道柱子可短到什么程度。有文献报道，由液相色谱中的溶质计量置换模型可得出使用短柱子进行生物大分子的有效分离，并采用柱长仅为2mm装填柱和从连续棒上切割的2mm厚的薄片形成的膜色谱进行了生物大分子分离，效果很好，但只能用于分析规模。用于制备规模或工业规模的高效液相色谱柱一般装填直径为20-30μm的粒状填料，以避免在高流速条件下柱压过高，从而降低分离效果。而且其柱的长/径比以10为佳。Phamacia公司以生产常压色谱介质著名于世界(现也生产一些中压色谱介质)。为了不因柱长增加而使软基质填料本身因受压使柱床体积变得愈来愈小，从而使柱压愈来愈高，也曾提供厚度较小，直径较大的饼型色谱柱，然而在使用时是将几个这样的饼型色谱柱串联在一起使用的，使实际这些串联在一起的柱长之和还是比柱径大许多倍，因此，如前所述，使用时流速不能高。在生物工程中用E.coli表达的许多蛋白因其疏水性太强，在E.coli中常以包含体的形式存在。虽然蛋白质的一级结构是正确的，然而其三级或四级结构基本是错误的。这些包含体的疏水性一般都很强，这就要求用高浓度变性剂如7.0mol/L盐酸胍(GuHCl)或8.0mol/L脲溶解包含体，然后再进行蛋白复性。常用的透析法和稀释法进行蛋白复性，不仅复性效率低(一般为5％-20％)，而且耗时且不能达到分离杂蛋白的目的。有人曾提出用高效液相疏水色谱(HPHIC)实现变性蛋白同时复性及纯化的工艺，但是，在进样时如果遇到蛋白遇水形成沉淀，则色谱柱就会被堵塞或毁坏。有人也曾设计和使用过变性蛋白复性及同时纯化装置或多功能蛋白纯化器。但只是表明其使用效果并未对该装置或色谱饼本身的主要参数预以说明，更未对其进行优化。因此，目前生物工程下游的分离纯化中存在的主要不足可以归纳如下：生物大分子的分离纯化通常是在装填有大颗粒软基质色谱介质的玻璃柱、塑料柱或不锈钢柱中进行的。其缺点是柱效低，需要填料多，消耗流动相的量大，生产周期长；当用色谱柱分离小分子物质时，其分离度与柱长成正比，其柱径与柱长比一般为1∶10。而生物大分子的分离度受柱长的影响较小，通常选用柱长为5cm的柱子，当其装填小颗粒填料后，色谱系统压力显著增大，需要高压液相色谱仪与之配套，使生产成本增大，影响充分发挥小颗粒填料柱效高，容量大，重现性好的优点；通常的色谱柱不允许高粘度的样品进入柱子，也不许少量样品沉淀在柱头，并且在使用中要固定流动相的进出口，给操作带来不便；通常的分离纯化工艺要经过复性、除去变性剂、粗纯化和多步精纯化才能获得较纯的产品。工艺路线长，质量和活性损失大，回收率低(通常为5～20％)；通常的复性方法采用稀释法或透析法。而稀释法又得采用逐渐降低浓度的分步稀释步骤，对样品几十倍、甚至上百倍的稀释会给随后的分离纯化带来许多困难；透析法耗时较长(一步透析通常需要24小时)，而且需多次更换透析液。另外两种方法均容易使目标产物在复性过程中发生聚合沉淀而影响复性效率；由于分离纯化步骤多，含目标产品溶液体积不断增加。而且，每一步都需要与之配套的设备，因此，设备投资大，生产成本高。
本发明的目的是提供一种生物大分子分离或同时复性及纯化的色谱饼，在生物工程下游的分离纯化中，能在中常压力下充分利用和发挥小颗粒填料柱效高、容量大、重现性好等优点，充分克服现有技术的不足，降低成本，提高产量，并且将生物大分子的分离纯化及复性中除去变性剂、粗纯化和多步精纯化合并为一步完成。
本发明的实现：下面结合附图做进一步说明。
附图1、本发明色谱饼结构构造示意图。
附图2、本发明柱体AA剖视图。
附图3、分布器结构构造示意图
附图4、分布器BB剖视图。
如附图1、2所示，色谱介质(10)两端是多边形或圆形并设置有进出口(1、2)的压板(3、4)，侧部是环形并有侧孔(9)的柱体(5)，压板(3、4)和柱体(5)组成色谱饼的腔体；压板(3、4)和柱体(5)组成的腔体厚度为0.2～50mm，直径为5.0～1,000mm，厚度与径向长度之比小于或等于1；压板(3、4)和柱体(5)组成的腔体内色谱介质(13)两端设置有分布器(7)、筛板(6)；压板(3、4)和柱体(5)组成的腔体可耐压20Mpa以上，主要选用耐酸碱、耐压力的不锈钢、钛合金或各种工程塑料；如附图3、4所示，分布器(7)主要选用耐酸碱的各种工程塑料，其上表面或双面设置有放射状和环状的导流槽(11)，导流槽(11)的横截面为三角形或半圆形，放射状和环状导流槽(11)的交汇处设置有圆形的分布孔(12)，孔径按与分布器(7)中心距离的增加而逐渐增加。筛板(6)为微孔不锈钢板或塑料板，其孔径介于色谱介质(10)颗粒的直径和生物大分子的直径之间，筛板(6)直径大于腔体的直径。密封圈(8)为各种耐腐蚀的工程塑料。色谱饼腔体内表面的粗糙度小于1.6μm，以便密封和减少对生物大分子的不可逆吸附。
本发明与已有技术比较具有以下优点和积极效果：色谱饼可耐压20Mpa以上，柱体的厚度L与直径φ之比即L/φ≤1，L≤50mm，分布器和筛板受力较小，在使用过程中不变形，可确保进样端色谱介质表面的平整性，有利于提高分离效率；分布器的一面或两面皆可有导流槽，而且从分布器的中心开始呈放射状，并与环形导流槽相交，在相交处有一个小孔，从分布器中心到其周边，小孔直径逐渐增大，这样的分布器有利于流动相的均匀分布；分离速度快，系统压力低(一般小于5.0Mpa)，其性能与灌注色谱相似，有利于工业化生产；柱体侧面上有一个小孔可作为流动相备用进出口。当柱体长度可调时，采用侧向加压密封；允许进高粘度的样品和产生少许沉淀。在进行色谱分离时，不需要固定进、出口；可使通常的复性及纯化工艺至少简化了三倍，使与之相关的生产周期缩短数倍，设备投资也节省很多；可减少对目标产物的不可逆吸附，使目标产物的回收率显著提高；可同时进行变性蛋白的复性、纯化、分离杂蛋白和可回收变性剂。一方面可重复使用变性剂，另一方面可减少变性剂对环境的污染；在相同柱体积时，与一般柱子比较，可用高压匀浆法装入较多的填料，具有较大的质量负载和体积负载。
Claims (4)
1、生物大分子分离或同时复性及纯化色谱饼，其特征在于：
A、色谱介质(10)两端是多边形或圆形并设置有进出口(1、2)的压板(3、4)，侧部是环形并有侧孔(9)的柱体(5)，压板(3、4)和柱体(5)组成色谱饼的腔体；
B、压板(3、4)和柱体(5)组成的腔体厚度为0.2～50mm，直径为5.0～1,000mm，厚度与径向长度之比小于或等于1；
C、压板(3、4)和柱体(5)组成的腔体内色谱介质(10)两端设置有分布器(7)、筛板(6)；
D、压板(3、4)和柱体(5)组成的腔体可耐压20Mpa以上，主要选用耐酸碱、耐压力的不锈钢、钛合金或各种工程塑料。
2、按照权利要求1所述的生物大分子分离或同时复性及纯化色谱饼，其特征在于分布器(7)主要选用耐酸碱的各种工程塑料，其上表面或双面设置有放射状和环状的导流槽(11)，导流槽(11)的横截面为三角形或半圆形，放射状和环状导流槽(11)的交汇处设置有圆形的分布孔(12)，孔径按与分布器(7)中心距离的增加而逐渐增加。
3、按照权利要求1所述的生物大分子分离或同时复性及纯化色谱饼，其特征在于筛板(6)为微孔不锈钢板或塑料板，其孔径介于色谱介质(10)颗粒的直径和生物大分子的直径之间，筛板(6)直径大于腔体的直径。
4、按照权利要求1所述的生物大分子分离或同时复性及纯化色谱饼，其特征在于密封圈(8)为各种耐腐蚀的工程塑料。
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