CN1385527A - 一种受化学除草剂诱导的启动子及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属基因工程技术领域,具体涉及一种分离和利用核酸的启动子片段,该启动子来源于水稻等植物中对磺酰脲类化合物(如绿黄隆、胺苯黄隆)及其相关化合物敏感的一些基因。将编码所希望的目的产物基因的核酸序列和一个上述启动子片段融合得到重组DNA,用这种重组DNA转化植物,将得到新的转基因植物。在新的植物中该重组DNA中的目的基因的表达受合适的化学诱导物调控。

Description

一种受化学除草剂诱导的启动子及其应用

技术领域

本发明属基因工程技术领域，具体涉及一种分离和利用核酸的启动子片段，该启动子来源于水稻等植物中对磺酰脲类化合物(如绿黄隆、胺苯黄隆)及其相关化合物敏感的一些基因。将编码所希望的目的产物基因的核酸序列和一个上述启动子片段融合得到重组DNA，用这种重组DNA转化植物，将得到新的转基因植物。在新的植物中该重组DNA中的目的基因的表达受合适的化学诱导物调控。

背景技术

转基因技术已成为解决多细胞有机体生物所遇问题的强有力的工具，在植物领域亦是如此，这包括将内源或外源基因引进植物以修饰某种功能或改变基因的表达模式。转基因技术的成功往往依赖于有效的启动子来控制转入基因的表达。

在真核体系中，基因的表达是受一段称为启动子的DNA调控的。一般来说，启动子被认为是位于基因编码区上游的DNA部分，包含起始转录的位置。启动子区域同时包含其他调控基因表达的元件，其中包括大约位于转录起始位点上游30bp(-30)位置的TATAbox，以及位于上游75 bp位置的CAAT box。启动子中包含的其他调控元件可以感应诸如光、营养条件、热、缺氧、重金属等环境因素而对基因表达进行调控。启动子内的其他DNA顺序也许与发育的时序或基因表达的组织特异性有关。而且，真核体系中类似于增强子的顺序可以大大提高附近基因的表达水平，且与其所处的位置和方向没有多大关系。植物中也存在类似于增强子的序列。基本上，启动子可分为组成型表达和诱导型表达两种类型。真核生物启动子功能上的多样性为分离受严谨调控的启动子用于在转基因植物中适时调控基因的表达提供了条件。

利用合适的外源性化学物质调控大田生长作物中某些基因的表达，对于农业生产和粮食生产相当关键，尤其是对于以下几类在转基因植物中有较高应用价值的基因：(1)延长目的营养物质在种子、根、茎中的积累；(2)在植物生长发育周期内某一时段产生某产物并集聚于某一植物组织内以便于收集或/和分离；(3)在病原攻击的位置启动对于某一虫害有特异毒性的毒素的表达。第二点可使生物反应器具有更高的效率，而最后一点也许能提供一种避免有毒物质对食品的污染以及通过对毒素的选择性或组织特异表达而非组成型表达来降低虫害对毒素产生抗性的几率。由于至今没有较成熟的在大田中可操作的外源控制植物基因表达的手段，以上及其他优点至今尚未很好地体现。

现今已有不少将目的基因转化植物的方法，这些基因或是在植物的生命周期内持续表达(受控于组成型启动子)，或是受控于器官、组织、细胞固有的发育程序(时序或组织特异的启动子)而使目的基因得到表达。持续表达无法控制基因在特定的生长阶段、在特定的组织或是感应环境变化后表达。再者，如此组成型的表达会对产量产生不利的影响，因为这样长期高表达单个基因的产物会大大增加对能量的消耗。组织特异性或时序特异性的表达虽然有利于在特定的时间和空间积累特定的产物，但它亦受到不同植物各自内在的发育和时空调控程序的影响。因此，若要应用于实际生产，需要分离到各种在不同植物的不同组织或不同生长阶段特异发挥作用的启动子，尤其是我们感兴趣的农作物品种。

理想的条件下，人们希望通过可诱导信号来刺激目的基因在植物生命周期中的任意时刻及任何组织内的表达，以获得对转基因植物中目的基因表达的外源性调控。这一调控作用可以通过对诱导信号感应灵敏的启动子控制结构基因表达的方式实现。理想的诱导物和启动子的组合可适用于广泛的植物种类，并且诱导物对植物正常的生长、发育和形态没有太大的影响。符合以上要求的化学物质可在已有条件下方便地应用于大田农业生产。例如，化学诱导物可以由在种植者中广泛应用的设备喷洒。理想的诱导物/启动子组合可适用于转基因植物的任何生长阶段或任何组织，以调控各种目的基因的表达。

在细菌和动物系统中已有不少能调控外源基因表达的诱导物/启动子组合。许多细菌内的诱导体系是基于能够响应代谢物或其类似物的启动子的。用包含相关启动子的目的基因转化细菌后，在其培养基中加入合适的诱导物，便可以引起目的产物的表达。这些诱导物/启动子组合的例子有3-β-吲哚乙酸/色氨酸启动子，IPTG/lac启动子，磷酸盐/磷酸盐饥饿诱导的启动子，以及L-阿拉伯糖/ara B启动子等。类似的，重金属/metallothionine启动子，热/热休克等启动子已应用于动物细胞的培养系统中，调控外源基因的表达。

现在已知有不少源于植物的诱导物/启动子组合。这些启动子的活化大多通过环境因子，比如光、热击和缺氧等。这些可诱导基因的启动子被深入地研究过。然而，利用受环境因素调控的启动子调控外源基因难以实际应用，因为这些诱导信号在农业生产的条件下难以控制。其他有一些植物基因据报道可以为病原侵染和/或伤害时所产生的寡糖所诱导。例如，在大豆中由葡聚糖受体诱导产生的苯丙氨酸脱氨酶和查尔酮合成酶(Ebel，J.，et al.，Arch.Biochem.Biophys.232，240-248，1984)，以及在土豆中受伤害诱导的抑制剂基因(Cleveland，T.E.et al.，Plant Mol.Biol.8，199-208 1987)等。只是这些启动子在转化的植物中对调控外源基因的表达没有多大作用，原因或是因为缺乏可操作的诱导方法(伤害)，或是因为在植物生长过程中需要分散能量来合成大量对抗病原侵染所造成不利影响的物质(寡糖诱导物)。

有许多化合物，包括天然化合物与合成化合物，都具有调控植物基因表达的潜力。然而，任何能够作为诱导物用于大田的化合物必须对环境无害，对植物的生长发育及形态没有很大影响，并便于以现有的手段用于农业生产。

有一些天然产物已知可以影响基因的表达。这些化合物大多是植物生长调节因子，比如生长素，细胞激动素，赤霉酸，乙烯和脱落酸等(c.f.，Davies，P.(Ed.)Plant Hormones andTheir roles in Plant Growth and Development，Martinus Nijhoff Publ.1987)，其他如水杨酸等的化合物也有很强的作用(Hooft Vanhuijsduijnen et al.，J.Gen.Virol.，67：235-2143，1986)。当上述这些生长调节因子用于不同植物的细胞、组织或器官后，可以观察到代谢状态的变化，这至少在一定程度上与新的基因表达有关。一些基因产物以及基因本身已经得到分离和鉴定。然而，鉴于这些化合物诱导的基因通常是与调节植物生长和发育相关的，它们难以用作为转基因植物中化学可诱导基因的诱导剂。其直接原因是这一类物质会同时激活不必需的植物内源性对激素敏感的发育程序，从而造成不必要的多效性。例如，对在发育过程中的植物用脱落酸激活外源基因的表达会同时激活不必需的激素效应，影响植物的代谢(Milborrow，B.V.An.Rev.Plant Physiol.25，259-207 1974)，造成生长大大迟缓以及在成熟前嫩叶和果实的脱落。其他植物激素也有类似的对植物生长发育不利的影响，因此也无法应用于调控转基因植物中外源基因的表达。更综合的有关诸如脱落酸、乙烯、细胞激动素和生长素之类的植物激素对食用植物影响的综述可见Phytohormones andRelated compounds：A Comprehensive Treatise Vols I&II(Letham，D.S.，Goodwin，P.S.，andHiggis，T.G.V.eds.Elsevier/North Holland，1978)。

在所有可作为诱导剂的候选化合物中有一类被称为除草剂及除草剂安全剂的化合物最有可能在大田应用中调控转基因植物中目的基因的表达。安全剂在功能上被定义为当与除草剂同时使用时可以增加作物对除草剂毒性耐受能力的化合物。安全剂的“安全”作用与植物加快对除草剂代谢能力有关(Sweetser，P.B.，Proceedings of the 1985 British CropProtection Society Conference-Weeds.3：1147-1153，1985)。例如，对玉米及其他谷物用如二氯酰胺等安全剂处理后增加了作物对几类除草剂的耐受能力(Lay，M.M.，and Casida，J.E.Pest.Biochem.Physiol.6：422-456，1976，Parker，C.Pesticide Science 14：533-536，1983)。Hershey HP等人用安全剂2-CBSU处理水溶液培养的玉米后可以诱导产生新的RNA(In2-1，In2-2)，其启动子已被用于发展新的适用于实际农业生产的植物基因可诱导表达方法(Hershey HP，Stoner ID，Plant Molecular Biology，1993，Vol.23，No.3：679-690；De Veylder Letc.，Plant Cell Physiology，1997，Vol.38，No.5：568-577)。而除草剂亦可诱导一些特异性基因的表达。Bridges；Ian G.等人报道了安全剂诱导的GST-II-27基因启动子系统，并申请了专利(PCT No.PCT/GB92/01187，1994年)。而Chua，Nam-Hai等人对Glucocorticoid等化学物质的诱导系统亦有深入研究(美国Patern Appl.No.014592，1998年)。

磺酰脲类除草剂(如绿黄隆，Chlorsulfuron)是在水稻中广泛使用的除草剂，具有低毒性、选择性好等特点，通过阻碍支链氨基酸合成而发挥作用，对人、畜无害。除草剂可诱导一些相关基因的表达(A.Willian Rutherford and Anja Krieger-Liszkay，Trends inBiochemical Sciences，Vol.26，2001)，但对其相关基因启动子的研究尚未见报道。而除草剂/除草剂诱导的启动子组合也许能够用于在转基因植物中调控外源基因的表达。然而至今为止，尚无在转基因植物内通过除草剂或除草剂类似物调控能感应除草剂的启动子和结构基因组合的可诱导体系的报道。

本发明集中在来源于植物中受除草剂诱导的DNA启动子片段。这些启动子片段被用于建立一套除草剂/除草剂诱导基因的系统，并在转基因植物中调控外源基因的表达。这一体系可用于在大田中生长的转基因植物中外源性调控目的基因的表达。它的优势包括这些启动子片段在用合适的化学诱导物处理后表现出的高活性，在所有实验的植物组织中都有明显的表达，以及没有用化学物质处理后产生的多效性等。

化学诱导启动子在转基因植物系统中应用的可行性方面，许多工作从不同角度进行了研究。

Ebert等人开始了对包含nopaline合成酶启动子的DNA片段的研究(Ebert et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5745-5749，1987)。该启动子源于细菌，为组成型而非诱导型，且广泛地用于植物组织中。构建载体，使该启动子调控下游报告基因CAT。作者发现一段33bp的DNA片段(-97--130)对CAT的表达是必需的。同时他们发现2个该片段可以使CAT表达水平上升3倍。这一在烟草组织中稳定转化的结果在烟草原生质体中的瞬间表达分析得到了重复。比较稳定转化和瞬间表达的CAT在烟草组织和原生质体中受该33 bp片段调控的表达水平情况，两者表现相同。作者无疑是想表明瞬间表达分析对于研究启动子在稳定转化体系的表现是很有帮助的。

已有对缺氧诱导的玉米乙醇脱氢酶Adh I基因的研究，通过电穿孔的方法将Adh I基因片段转化源于悬浮培养的玉米原生质体(Howard，et al.，Planta，170：535-450 1987)。转化后的原生质体置于低氧含量处，并于20小时后分析Adh I的表达。为便于测量缺氧诱导的Adh I表达，将天然Adh I基因5’调控片段(1096 bp)与CAT相连。他们的结果显示，在源于同源的培养细胞的原生质体中，标准的缺氧条件可以调控单子叶植物玉米的AdhI启动子/CAT基因。同时，他们又发现，在玉米原生质体中，单单Adh I的启动子片段足以受缺氧条件诱导而调控外源基因表达，而无需编码区和3’区的存在。

其他一些研究者(Lee et al.，Plant Physiology 85：327-330 1987)进一步确定了玉米AdhI基因与缺氧诱导相关的DNA片段。这些研究者在玉米原生质体中转入包含CAT编码顺序和Adh I启动子的重组基因，并于24小时后检测CAT活性。通过改变启动子片段的长度，Lee等人确定从转录起始位点上游146 bp的启动子顺序足以在缺氧状态下启动CAT的表达。然而启动子顺序向5’端继续延伸到266或955 bp后，CAT表达量上升了5或8倍。

Walker等人继续用瞬间表达方法研究玉米Adh I基因上游受缺氧诱导启动基因表达的顺序(Walker et al.，proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：6624-6628 1987)。他们确定了启动子中与缺氧诱导的基因表达相关的2段顺序：-133--124和-113--99(转录起始位点上游)。这2段顺序对于诱导是必须的。在一无关联的病毒启动子前添加这段40 bp的元件后可以受缺氧诱导。

另外有人发现在稳定转化的烟草细胞内，如果用玉米Adh I基因-1094-+106这一段调控CAT基因，在合适的缺氧条件下，有非常低的CAT基因表达(Ellis et al.，EMBOJournal 6：11-16 1987)。事实上，只检测到CAT的mRNA。然而，将octopine合成酶基因或花椰菜镶嵌病毒(CaMV)的启动子元件接在Adh I启动子的5’端，可刺激CAT的表达，并在缺氧诱导后检测到CAT。包含与Adh I基因转录起始位点5’相邻顺序247 bp的片段，足以将CAT基因的表达置于缺氧调控之下。因此，即使在有组成型的octopine合成酶或CaMV 35S启动子片段存在的条件下，这段247 bp的顺序的存在仍使基因的表达受缺氧调控。Howard、Lee以及Walker等人通过瞬间表达分析获得的受缺氧诱导调控的Adh I启动子区域与Ellis等人通过稳定转化植物所获得的一致或类似。

已有在动物和微生物体系中化学诱导目的基因表达的专利获得批准。美国专利号为4579821的专利授予Palmiter和Brinster，他们分离了小鼠金属硫因-1(metallothionein-1)基因的调控序列并将其与特定的DNA序列连接，在有重金属或胆固醇的条件下控制基因表达。在分化后的成年鼠细胞用钙离子或地塞米松处理后，受金属硫因-1启动子调控的胸苷激酶表达。美国专利号4703005的专利授予Nakata和Shinagawa，他们分离了一个磷酸盐结合蛋白的基因phoS，在其3’端连上一个外源基因。在培养基上，该外源基因可由磷酸盐调控。以上这些发明都难以应用于大田作物。可激活金属硫因启动子的重金属离子不仅对植物有毒，而且会对土地造成巨大的污染。类似的，受如磷酸盐等营养物调控的启动子也无法用于大田，因为大田中难以维持营养物水平的稳定。

有些报道试图在转基因植物中调控基因的表达。欧洲专利申请号85302593.0的专利从大豆中分离到4个热休克基因的启动子并声称它们可以促使转基因植物中外源基因的表达。在申请书中，作者声称使用这些启动子可以暂时活化外源基因的表达，比如Basillusthuringenesis的crystalline毒素蛋白的结构基因，或是在体内对热击响应而表达的抗除草剂基因。然而，如此将基因表达与热休克启动子相联系的办法难以适用于大田中每天温度的变化。

Marcotte和Quatrano(J.Cellular Biochem.Supplement 12C，1988；Marcotte，W.R.，Bayley，C.C.，and Quatrano，R.S.，Nature 335，454-457 1988)报道了对一融合基因的可诱导性研究的最初数据。该融合基因的转录受来源于2个小麦中ABA诱导的基因Em和7S球蛋白的基因启动子调控。在用ABA诱导后，整个植株都有该基因的表达。看来诱导性至少是部分地发生在转录水平上。将包含不同长度的Em基因的5’区域的启动子片段和GUS基因编码区以及CaMV 35S转录子的poly A信号相连，通过在单子叶植物(水稻)和双子叶植物(烟草)原生质体内的瞬间表达检测ABA诱导的GUS活性。他们发现Em编码区上游的一段区域(650 bp)和7S球蛋白编码区上游的区域(1800 bp)足以在水稻原生质体中受ABA诱导后控制GUS的表达。Em启动子在双子叶植物的瞬间表达体系中对ABA没有任何响应，暗示这一启动子在双子叶植物中没有功能。然而，我们前面已经详细讨论过包括ABA在内的植物激素的诱导作用具有多效性，这样就排除了利用其在大田生长的转基因植物中调控基因表达的可能性。

欧洲对De Danske Sukkerfab A/B批准的专利(CC87-106623)宣称找到一种用根/节特异性基因启动子调控目的基因表达，以在豆科植物中改进固氮系统。发明者特别指出氯霉素乙酰转移酶基因(CAT)受源于大豆豆血红蛋白基因的启动子调控，在转基因植物的根中表达的诱导性与其它根特异基因表达类似，都受生节作用(nodulation)的影响。这个方法的局限性是明显的，基因的表达只能通过生节作用诱导，而且诱导是根特异性的。它无法在任何时候或任何组织中通过外源调节的方法对大田生长的转基因植物的基因表达进行调控。

美国曾批准一个除草剂安全剂诱导的启动子的专利(美国专利号：5364780)，研究者以第一个“适用于大田生产的化学物质诱导而在转基因植物中调控目的基因表达的启动子”得到了专利(1991年)。在进一步的应用中，他们将In2-2启动子与报告基因GUS相连，转化拟南芥植物，通过组织化学的方法分析发现对于不同类型的除草剂安全剂，GUS分别表达于根、苗等不同组织(De Veylder L etc.，Plant Cell Physiology，1997，Vol 38，No.5：568-577)。但磺酰脲类除草剂诱导系统的研究方面未见有专利申请。

适用于大田生产的化学物质诱导而在转基因植物中调控目的基因表达的启动子，其表达的特异性必须便于对植物的外源性调节，所用的化学物质应当能有多种使用的方法，且仅能诱导特异目的基因的表达。而除草剂在大田中的应用已很普遍。有关除草剂诱导的启动子应用于转基因植物方面的工作还未见报道。除草剂诱导启动子的应用，将使人们能有效调控具有农业价值的基因在转基因植物中适时表达。

发明内容

本发明的目的在于应用化学物质控制转基因植物和植物组织中基因的选择性表达。

本发明提供源于水稻且对一系列磺酰脲类化合物的诱导作出应答的核酸启动子片段及其下游顺序。这些核酸启动子片段已构建到含有非植物来源基因的重组载体中，转化植物后发现结构基因的表达水平受化学物质的调控。特别地，本发明的一个方面是核酸启动子片段受化合物绿黄隆{1-(2’-氯苯基磺酰-3-(4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪-2-基)脲，Chlorsulfuron}和胺苯黄隆{2-[(4-乙氧基-6-甲胺基-1，3，5-三嗪-2-基)氨基甲酰基氨基磺酰基]苯甲酸甲酯，ethanetsulfuron}等诱导。因此在用化合物诱导后，具有启动子片段的转基因植物中与该启动子片段连接的编码特定基因的DNA的表达水平将会上升。

所涉及的核酸启动子从植物中获得，单子叶植物如水稻、玉米、燕麦、粟、小麦、草、大麦、高粱、苋、洋葱、芦笋和甘蔗；双子叶植物如苜蓿、大豆、矮牵牛花、棉花、甜菜、向日葵、胡萝卜、芹菜、卷心菜、黄瓜、胡椒、canola、番茄、小扁豆、亚麻、椰菜、烟草、扁豆、莴苣、花椰菜、菠菜、甘蓝、菊芋、豌豆、秋葵、南瓜、雨衣甘蓝、茶和咖啡等。最主要的是从水稻中获得的核酸启动子，尤其是与XIG-1启动子同源的那些。

本发明的另一个方面是一种分离出的cDNA分子，它编码具有水稻中受绿黄隆和胺苯黄隆等磺酰脲类除草剂诱导表达的核苷酸序列XIG-1(见SEQ ID No.4)。所述核苷酸序列在中度严紧条件下(5×SSC，5×Denharts，0.5％SDS，50℃～65℃)能与固定在固体支撑膜上的核苷酸SEQ ID No.4第29-758位的核苷酸杂交，于50℃～65℃经0.1×SSC，0.1％SDS洗脱后，在-80℃对X-光片曝光24小时后可获得放射自显影信号。

本发明的另一方面包括一个核酸启动子片段，它是与特定XIG-1 cDNA克隆高度同源的基因5’上游启动子区域的核苷酸顺序组成，带有所述启动子片段的转基因植物在用化合物绿黄隆和胺苯黄隆处理会引起连接在所述启动子3’末端的一个编码特定基因产物的DNA顺序表达升高。该基因5′上游启动子区域的核苷酸序列可以为2.2kb(SEQ ID No.7)、1.2kb(SEQ ID No.8)、0.8kb(SEQ ID No.9)等。这些序列包含受化学除草剂绿黄隆诱导的调控元件和不同的组织特异性表达元件等，所述核苷酸序列能在中度严紧条件下(5×SSC，0.1％SDS，50℃～65℃)与固定在固体支撑膜上的SEQ ID No.6的核苷酸杂交，经0.1×SSC，0.1％SDS于50℃～65℃洗脱后，在-80℃对X-光片曝光24小时后可获得放射自显影信号。

本发明的另一方面是与一重组DNA载体相关。该载体含有上述核苷酸序列作为启动子。该载体可转化植物，包含本发明中的一个核酸启动子片段、与该启动子相连编码特定基因的DNA顺序及合适的3’下游序列，使转化该重组载体后的植物在有化合物绿黄隆和胺苯黄隆之一的作用下，特定基因产物水平上升。选择的基因有编码GUS基因，编码抗病基因如白叶枯病、稻瘟病等抗性基因，编码抗昆虫的基因，编码蛋白酶抑制剂基因，编码Bacillus thuringenesis昆虫内毒素的基因，编码植物乙烯生物合成酶的基因，编码植物激素生物合成酶的基因，编码雄性不育/育性表型的基因等。

本发明的另一方面包括用发明的重组DNA结构转化植物，这种转基因植物用化合物绿黄隆和胺苯黄隆处理引起编码选择的基因产物的DNA顺序表达增高，该DNA顺序经操作连接在所述启动子片段的3’端。这样的转基因植物的种子同样认定为该发明的体现。

这个发明的最后一方面包括在植物中引起所选择的基因产物表达增高的方法，它有几个步骤组成：a)用上述描述的重组DNA结构转化植物；b)用化合物绿黄隆和胺苯黄隆处理转基因植物；c)使转基因植物在期望的时候增加所选择的基因产物的表达。

具体实施方式

实施例1：探针的制备

根据玉米In2-1 cDNA的核苷酸顺序设计一对引物：

5’端引物XIG 52：5’CCAGGCTGTACATCTGCTA 3’(SEQ ID No.1)

3’端引物XIG 31：5’AACTGTCTCTTCTCAGCATC 3’(SEQ ID No.2)

再以水稻根cDNA文库的重组λZAP Express DNA为模板进行PCR，反应条件为94℃变性4min，再按94℃40s，48℃60s，72℃90s进行30个循环，最后72℃保温10min。电泳检测并回收PCR产物。

将上述PCR产物与GEM-T Easy Vector连接，并转化大肠杆菌DH5α，获得重组子。用High Pure Plasmid Purification试剂盒纯化质粒，将确实含有正确插入片段的克隆进行测序。详细序列见SEQ ID No.3。实施例2：XIG cDNA的分离鉴定

接种大肠杆菌XL1-Blue MRF’于含有50μg/ml四环素的LB液体培养基中培养过夜。次日将菌液以1∶100的比例接种于不含抗生素的50ml液体LB中，培养至菌液OD₆₀₀＝0.5。1000g离心，去上清，加入8ml10mmol/L的硫酸镁溶液重悬细胞。取5ml菌液与水稻根cDNA文库的λZAP Express噬菌体(至少2.7×10⁵个噬菌体，相当于包含一个水稻基因组)混合，37℃保温15min使噬菌体充分吸附。取适量混合液与48℃预热的0.8％顶层琼脂9ml混匀，迅速铺在37℃预热的15cmLB平板上。待顶层琼脂凝固后，将平板倒置于37℃培养过夜。

等噬菌斑长满平板后把平板取出，4℃中放置2h使平板表面变硬。将噬菌体DNA转移至Hybond-N+尼龙膜上，做好定位标记。将膜依次放入变性液(1.5M NaCl，0.5MNaOH)、中和液(1.5MNaCl，0.5M pH7.4的Tris-Cl)和2×SSC溶液中处理3min，5min，1min后，置于干净滤纸上晾干，再进行紫外交联。

取实施例1中制备的带有PCR扩增片段的质粒为模板，XIG 52/XIG 31为引物作PCR，经胶电泳分离回收的扩增片段，用随机引物法α-³²P-dATP标记该片段作为探针。

杂交膜于68℃预杂交1-2h(预杂交液为6×SSC，5×Denhart’s，0.5％SDS，100μg/ml变性小牛胸腺DNA)，然后将热变性的探针加至预杂交液中，于68℃杂交14h。杂交膜依次用2×SSC，1×SSC，0.5×SSC(均含有0.1％的SDS)溶液于60℃漂洗后，于-70℃中放射自显影。根据放射性的强弱，压片时间在24小时至一星期不等。

洗片后，根据X光片上的阳性斑点在平板上找出相应的阳性噬菌斑，分离并置于含有1ml SM溶液和40μl氯仿的离心管中。振荡打散后于4℃保存。取适量噬菌体悬液，按相同的方法再进行两轮筛选，以保证分离到纯的噬菌体克隆。

将250-500μl筛选到的单噬斑悬液及1μl ExAssist辅助噬菌体加入到200μl XL1-BlueMRF’(OD₆₀₀＝2.0)中，37℃保温15min。加3ml LB液体培养基，37℃，240rpm培养2-2.5h后取出，置于70℃水浴15min，然后4000g离心5min，保留上清。

接种大肠杆菌XLOLR于含有50μg/ml四环素的LB液体培养基中，37℃，240rpm培养过夜。次日将菌液以1∶100的比例接种于不含抗生素的50ml液体LB中，37℃，300rpm培养至菌液OD₆₀₀＝1.0，作为质粒切离的受体菌。

将100μl上清液与上述新制备的XLOLR受体菌混合，37℃保温15min。再加入300μl液体LB，37℃，240rpm培养45min。取出后涂布于含有50μg/ml卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养过夜，在抗性平板上筛选切离的pBK-CMV质粒(带有cDNA插入片段)。

碱法抽提pBK-CMV质粒，T3/T7引物作PCR鉴定插入片段大小。用多种限制酶切，构建插入片段的物理图谱。将酶切片段插入到pBlueScript II SK+质粒，构建亚克隆。利用位于pBlueScript II SK+质粒多克隆位点两侧的T3/T7引物序列进行测序，各亚克隆的核苷酸顺序按物理图谱拼接即得cDNA的全序列(见SEQ ID No.4)。推测的氨基酸序列为242氨基酸(见SEQ ID No.5)。实施例3：Northern blot分析XIG的诱导表达

取适量稻种，用自来水浸泡片刻，去除不成熟的种子。再用3％的过氧化氢溶液消毒30min，经无菌水洗涤数次，在30℃中用无菌水浸泡3天。待种子露白后，均匀地铺在衬有无菌纱布的搪瓷盘上。30℃，光照16h/黑暗8h周期下培养7天。将不同盘中的水稻分别用自来水(空白对照)、0.2g/L绿黄隆、1.0g/L绿黄隆、20mg/L胺苯磺隆处理，处理方式是根部溶液浸泡与叶面喷施相结合。按处理后2h、6h、9h、15h、24h、48h、72h的时间梯度，收集水稻的根、叶组织。置于-70℃保存。

抽提RNA所用的一切器皿均用0.1％的DEPC水处理或200℃烘烤，以去除RNase。

将适量水稻组织从冰箱中取出，迅速于液氮中研磨成细粉。放入加有1ml TRIzol试剂(Gibco公司产品)的1.5ml离心管中，用力摇匀后室温静置5min，加0.2ml氯仿并摇匀，室温放置3min，4℃中13,000g离心15min，取上层水相转移至一个新的离心管。水相中加0.5ml异丙醇，室温沉淀10min，于4℃中13,000g离心15min，去上清。加1ml75％的乙醇洗涤沉淀，13,000g离心5min，去尽上清。沉淀于室温干燥5min以彻底去除乙醇。加15μl无菌DEPC水溶解RNA，取1μl RNA稀释至1000μl，测定OD₂₆₀与OD₂₈₀值检测RNA的质量和含量。同时另取1μl RNA进行电泳，进一步验证RNA的浓度与纯度。

取RNA样品30μg，加入甲醛(终浓度2.2mol/L)、甲酰胺(终浓度为50％)，MOPS电泳缓冲液(终浓度0.5×)，混匀，置于65℃水浴15min，取出后迅速放在冰上静置3min。经处理的RNA样品加入上样缓冲液，经甲醛变性胶电泳分离(4℃，1×MOPS电泳缓冲液，电压为3-4V/cm)。电泳结束后将胶取出，用DEPC水淋洗数次，放入20×SSC溶液中浸泡45min去除甲醛。将凝胶中的RNA吸印转移至Hybond-N尼龙膜，并在膜上标记上样孔位置与凝胶剥离。杂交膜放入6×SSC溶液中漂洗，晾干后紫外交联固定。

利用上述筛选cDNA文库所用探针与固定在尼龙膜上的RNA杂交，杂交后放射自显影7天，观察杂交信号。杂交膜过的膜用煮沸的0.1％SDS溶液漂洗1-3次，直至探针被完全洗下(通过测膜的放射性来验证)。然后将膜与18 S rRNA基因探针于68℃杂交，放射自显影后检测各泳道的RNA上样量。实施例4：XIG-1基因和启动子的分离与鉴定

用实施例2中筛选cDNA文库的相似方法从水稻基因文库中筛选XIG-1全基因克隆。其中，噬菌体和受体菌分别为λEMBL 3和E.coli p2392，筛选到的阳性克隆不需作质粒切离。

将分离获得的阳性克隆进行扩增，以得到足够的噬菌体。按实施例2中所述的方法制备受体菌p2392的感受态。取10⁵pfu的阳性λEMBL 3噬菌体与0.1ml受体菌混合，37℃吸附15min，加入3ml 0.7％顶层琼脂并混匀后，倒入一块新鲜的LB平板。37℃培养6-8h至噬菌斑长满平板，加入5ml SM溶液，置于4℃数小时，间歇摇动，使噬菌体浸出。吸出SM，往平板上再加入1ml SM；平板斜放15min，将吸出的SM与第一次的合并。在收集的噬菌体液中加入0.1ml氯仿，轻微振荡，4℃中以4000g离心10min，回收上清，加40μl氯仿，4℃保存。

以低复数感染法扩增噬菌体，经甘油梯度离心纯化后制备噬菌体DNA。先接种受体菌p2392的单菌落于50ml液体LB中，37℃、240rpm培养过夜。次日根据菌液的OD₆₀₀值，按1 OD＝8×10⁸个细胞计算细菌浓度。取2份菌液，每份含有10¹⁰个细菌，4000g离心10min，去上清，加3ml SM重悬沉淀。两份样品中分别加入5×10⁷和5×10⁸pfu的重组噬菌体，37℃保温20min，间或振荡。再将每份样品加入到250ml经37℃预热的液体LB中，37℃、300rpm培养8-12h，直至细菌培养物接近完全裂解。再往菌液中加入5ml氯仿，继续培养10min后将培养物取出。

培养物冷却至室温后，加入胰DNase I与胰RNase酶(终浓度均为1μg/ml)，室温下消化30min。加入固体氯化钠和固体聚乙二醇(PEG 6000)至终浓度分别为1mol/L和10％。待固体溶解后，冰浴1.5h使噬菌体沉淀。4℃下以11000g离心10min，弃上清，将噬菌体沉淀重悬于10ml TM溶液中(50mmol/L pH 7.8 Tris-Cl，10mmol/L MgSO₄。)。向悬浮液中加入等体积氯仿，振荡30s，4℃下以3000g离心15min，回收含噬菌体的水相。按下列步骤制备甘油分级梯度：

i)    将3ml含40％甘油的TM溶液加入超离心管底部。

ii)   在40％甘油-TM溶液上小心地铺上4ml含有5％甘油的TM溶液。

iii)将噬菌体悬液小心地铺在5％甘油-TM溶液的上面。

iv)  将离心管的剩余空间用TM溶液加满。4℃，35000rpm超离心60min。弃上清，加入1ml TM溶液重悬沉淀。即得纯化的重组噬菌体。

在噬菌体悬液中加入5μg胰DNA酶，1μg胰RNA酶，37℃消化30min。再加入0.5mol/L pH 8.0的EDTA溶液40μl、蛋白酶K 50μg、10％SDS溶液50μl，混匀后于56℃保温1h。消化液冷至室温后，加入等体积的平衡酚(pH 8.0)，翻转数次混匀。3000g离心5min，回收上层水相；再分别用等体积的1∶1的酚∶氯仿和24∶1的氯仿∶异戊醇抽提水相各一次。然后加入1/10体积的3mol/L pH 7.0的乙酸钠溶液，2倍体积的无水乙醇，室温放置30min。4℃下以13000g离心10min，弃上清并加入1ml 70％乙醇洗涤沉淀；再于4℃下以13000g离心2min，去尽上清。DNA沉淀室温干燥后，加100μl pH 7.5的TE缓冲液溶解。

用Sal I等多种限制酶对重组λDNA作酶切分析，构建插入片段的物理图谱。同时将电泳胶中的DNA酶切片段转移至Hybond-N⁺膜，以文库筛选所用的探针作Southern blot分析，确定XIG-1基因在插入片段中的位置。将各酶切片段插入到pBlueScript II SK+质粒，构建亚克隆。以T3/T7引物进行测序，并将各亚克隆的核苷酸顺序进行拼接，得到XIG-1全基因和启动子区的序列(SEQ ID No.6)。实施例5：DNA序列数据的处理和分析

使用Wisconsin GCG软件包(7.0版)中的相关软件，完成DNA序列的同源比较、酶切位点分析、蛋白质一、二级结构的预测、PCR引物设计等工作。利用互联网资源(NCBI、PubMed、SWISS-Model、BioSupplynet等服务网站)进行DNA及蛋白质序列的同源搜索、蛋白质三级结构的预测、启动子中转录因子结合位点与其他特征位点的寻找等分析工作。实施例6：带XIG启动子的植物转基因载体的构建与转基因研究

比较XIG基因上游区和双元转基因载体pCAMBIA 1301(含GUS报告基因)上的酶切位点。分别挑选出合适的双酶切组合，使载体上原有的CaMV 35 S启动子能被完全切除，且使酶切后的目的片段与载体片段有相同的粘性末端。分别使用Sac I-Nco I、Pst I-Nco I、EcoR I-Nco I的双酶切组合，可以获得长度约2.2 kb、1.2 kb、0.8 kb的XIG-1基因的上游调控顺序(SEQ ID No.7、8、9)。

酶切产物经胶电泳回收后4℃连接过夜。次日将连接反应产物转化大肠杆菌TOP 10感受态细胞，涂布于带有合适抗生素(卡那霉素或氨苄青霉素)的LB平板上，37℃培养14h。从平板上挑单菌落接种，37℃培养过夜，碱法抽提质粒，即得重组后的转基因载体，分别包含不同长度的XIG基因上游调控序列。

选用新鲜的洋葱表皮为材料，取出靠近核心部分的瓣片，0.1％的HgCl消毒5min，再以无菌水洗涤。用镊子撕下瓣片的内表皮，平铺于含0.7％琼脂的GM培养基平板上(用于诱导组的平板内含200mg/L的绿黄隆)。

称取100mg金粉或钨粉(颗粒直径1.5-3.0μm)放入1.5ml离心管，加1ml无水乙醇，充分振荡混匀；13000g离心1min，去上清。以1ml无菌水重悬沉淀，超声处理1min，再以13000g离心1min，去上清。沉淀用无水乙醇洗涤数次后，重悬于1ml无水乙醇中。将金粉悬液振荡混匀，吸取30μl，加入转基因载体(浓度为1μg/μl)60μl和2.5mol/L氯化钙溶液75μl，振荡混匀。再加入0.1mol/L亚精胺30μl，振荡混匀。冰浴20min，期间不时取出振荡。13000g离心1min，弃上清；沉淀用乙醇洗涤两次，重悬于30μl无水乙醇中。

在使用基因枪转化前先用75％乙醇对基因枪(Bio-Rad公司产品)进行消毒。按Bio-Rad公司提供的操作规程，将带有转基因载体的金粉(每皿10μl金粉悬液)打入植物组织中。选用的氦气压力为1100kPa。

转化后的洋葱表皮在25℃、白光中培养1天后切成1cm左右见方的小片，置于培养皿中，加入X-Gluc染色液，37℃染色约5小时后观察显色结果，洋葱表皮经3％的甲醛溶液固定，在显微镜下拍照。

37℃染色约5小时后，含1.2kb XIG-1上游顺序且经绿黄隆诱导的实验组可以由肉眼观察到蓝色的斑点，为诱导表达的GUS蛋白与其底物作用的结果；而未诱导组没有观察到任何细胞内蓝色反应产物。另外分别含0.8kb和2.2kb启动子顺序的实验组无论诱导与否皆未观察到类似的蓝色斑点。进一步37℃染色过夜后，1.2kb诱导组仍有深蓝色斑点，未诱导组没有类似现象；2.2k组无论有无诱导都出现蓝色斑点；0.8kb组无论有无诱导都无蓝色斑点。该组结果说明，2.2kb元件可组成型调控基因表达，但基因表达量较代；1.2kb元件受除草剂诱导，且诱导后基因表达量较高；而0.8kb元件已不能调控下游基因的表达。本发明涉及的序列SEQ ID No：1的信息

长度：19碱基

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：寡核苷酸

序列描述：SEQ ID No：1

CCAGGCTGTACATCTGCTASEQ ID No：2的信息

长度：20碱基

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：寡核苷酸

序列描述：SEQ ID No：2

AACTGTCTCTTCTCAGCATCSEQ ID No：3的信息

长度：270碱基

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA序列描述：SEQ ID No：3CCAGGCTTTACATTTGCTACTTCTGCCCGTTTGCTCAGCGCGCTTGGATTATCAGGAACTTCAAGGGCTTGCAGGACAAGATCGAGCTAGTCGGCATTGATCTGCAGGACAAACCAGCTTGGTACAAAGAGAAGGTTTACGAACAGGGCACGGTGCCTTCTCTAGAGCACAACGGCAAGATCATGGGGGAGAGTTTAGATTTGATCAAGTACATCGACAGCCATTTCGAAGGCCCTGCACTGCTCCCTGAAGATCCTGAGAAGAGACAGTSEQ ID No：4的信息

长度：1058碱基

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：cDNA

序列描述：SEQ ID No：4

1  ATCACTCCTC CCTCTCCCAG CTCATCGCC

GCCGCAGC TGCAGCACCG 50

51  CGTAGCTCCG GGAAAGAAGC GCTTCCCGCT GCGCTCGGCT CCGCCTCTGA 100

101 GCCCCCTCGC CTCTTCGACG GCACCACCAG GCTTTACATT TGCTACTTCT 150

151 GCCCGTTTGC TCAGCGCGCT TGGATTATCA GGAACTTCAA GGGCTTGCAG 200

201 GACAAGATCG AGCTAGTCGG CATTGATCTG CAGGACAAAC CAGCTTGGTA 250

251 CAAAGAGAAG GTTTACGAAC AGGGCACGGT GCCTTCTCTA GAGCACAACG 300

301 GCAAGATCAT GGGGGAGAGT TTAGATTTGA TCAAGTACAT CGACAGCCAT 350

351 TTCGAAGGCC CTGCACTGCT CCCTGAAGAT CCTGAGAAGA GACAGTTTGC 400

401 TGATGAGCTT ATTGCGTATG CCAATGCGTT TACCAAAGCA CTCTACTCAC 450

451 CCTTAATCTC CAAAGCAGAT TTGTCAGCTG AGACGGTTGC TGCTCTGGAC 500

501 AAGATAGAAG CTGCCCTGTC GAAGTTCGGT GATGGTCCAT TCTTCCTTGG 550

551 ACAATTTAGC TTGGTGGACA TTGCGTATGT GACAATTATT GAAAGGATTC 600

601 AGATATACTA CTCTCATATA AGGAAATACG AGATCACCAA TGGCCGGCCC 650

651 AACCTCGAGA AATTCATCGA GGAAATCAAC AGAATCGAAG CATATACACA 700

701 AACAAAAAAT GACCCGCTTT ACTTGCTCGA TCTTGCGAAG ACGCATCTTA 750

751 AGGTTGCC AGATGTTGA GCCAGCGATG TACTGAATGA CAGAATGATG 800

801 ATGATCCATG CCCCGCCCCC CCCCCCCCCC CCACACACAC ACAAAAAAAA 850

851 TCAATACTCT TTTCTTGCTA CTCCAGTTGA TAGTACATGT TTTGCAGCTT 900

901 TTGCTTCCAA TAAACCGAAG TTGACATGTG GTGTAAAAGT CATGTTTGAG 950

951 TAATAAAATA CTGGTGTAAT TCTATGTTAC TCAATGTCGT TGGTCTTAAA 1000

1001 TATACTTTCA TGTCATTGAA

CTTTTGTTGTCAAA CTTAAAAAAA 1050

1051 AAAAAAAA                            1058SEQ ID No：5的信息

长度：242个氨基酸

类型：氨基酸

拓扑结构：线性

分子类型：多肽

序列描述：SEQ ID No：5

MAAAA APRSS GKEAL PAALG SASEP PRLFD GTTRL YICYF

CPFAQ RAWII RNFKG LQDKI ELVGI DLQDK PAWYK EKVYE

QGTVP SLEHN GKIMG ESLDL IKYID SHFEG PALLP EDPEK

RQFAD ELIAY ANAFT KALYS PLISK ADLSA ETVAA LDKIE

AALSK FGDGP FFLGQ FSLVD IAYVT HERIQ IYYSH IRKYE

ITNGR PNLEK FIEEI NRIEA YTQTK NDPLY LLDLA KTHLK

VA*SEQ ID No：6的信息

长度：4925碱基

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

序列描述：SEQ ID No：6

1    GCGGCCGCCCCCGCGGCAGCGGTAGGGTTTTGGGCTGGCGTGGCGGCCGA 50

51   CGCGGGGTTCGGAGCCGGCGGCGCCTCCCCCGCTGCTGCGGTGGCCGCCG 100

101  GCGGGGACGGCTCGGCGGCGGCCTGCGCGGGCTTGGTGCTCTGCGACGCC 150

151  ATCGAGGGGGGAGCTCTCGTCGGGGGGAGAGACTAGAGAGAGAGGTAGAG 200

201  AGGTCGCACCGTCGCAGACTCGCAGTGGGCGGAGTGCGGCCGAGAGTCGC 250

251  CTGGTTTCTTTCTCCTTTTCCGCGATTTTTTTTCTGTGTTTTTTGCTTTG 300

301  TCCGCTTGCGTTCCCCCGTTTCGACACCTGCACTTCGCATATGTGCTACC 350

351  AAATGGGCCCTTGGGCCATTGTAGATGGGCCATAATGCTCCTTATATAGG 400

401  AGAAATTGCATTTTTGGAATTTTTTATTTAATTTTTTTAATATTTAGTAG 450

451  AAAATAAATTCGTATTTTAAAATTTTGCAGAAATATATTCCTCCGACGAT 500

501  ATTGTAGGACATGGCATGTAAATTGCCCTATGAGATGGCAATTTATTTGA 550

551  CGTGACACACCACGAGAGATGCGTCGTGCCAAGTTTTTAGGTGGCCTCCT 600

601  CTGTGATAAACCGCTCTCCCCTAGGACGATTTATCAAAATTGTCATGGCA 650

651  CGACCCATGCATCATCAAACTTTGCGTCGTGGCAATTTTGCAGCCACCCC 700

701  CACAATAAATTGCCCTATGGGAGATGTTACATAGGGAGATAAATCATCGG 750

751  GAGGGGGGCACCTACAAAATTGTCGTGTTACATAGATTGCTCTATGCCCC 800

801  TCCCTAAGGTAGAGCGGGAGGAGATTTTTGCAAAACTTTGAAATTGTAAT 850

851  TGTATTTTTTATTCTTTTAAAAAATAAATATATTTTTTTCTTAAAAAATC 900

901  ACAACACTGTTGTTGTGAGTAAGGCATAAAACCTGGTAGCACAAGCATGC 950

951  TATCTAAATCGTATGGTATATGGATATGCTGGGAAAATATGTGGTGGAAA 1000

1001 TCACATATGTACTTATGTAGGGCCTGTTCGGCCGCTTGGTACAGCCGCTG 1050

1051 CGCTGCCACAGCCGAAAGAAACAACACACTGTGCTAGTTGGCTGCAGCAC 1100

1101 AGTGAAAATAATGGCAGTCGAACATAGCCGTAGTGGAAACTCGGAAACTA 1150

1151 CCGATGGATTGAAAAATGGACATCCGAGATTCGTCCATGTCATCACGAGT 1200

1201 AAAAATGTTGCTCACGGATATATTGCGAGATTTTTACTCGTAATGATGTG 1250

1251 GACGAATCTCACAAGTCAATTTTTCCATCCAATGGTTGTTTCCAAATTTC 1300

1301 CACTACATATGTGGTTTCCACCACATATTTTCCCGGATATGCTACCTAGT 1350

1351 TTTTAATAAGATGGCATCGTTAATTTTTAACGCATGTTTAACTGTTTATC 1400

1401 TTATTTCTTAAAAATATGTAATTATTATTTATTCTGTTGTGAGTTGTTTT 1450

1451 ATTACTAAAAATATTAACAATGATGATTTATCTCTTATGTATTTGTATAA 1500

1501 TTTTTTTACTGGAGGAATTCTATCCTTACTCATTTTTTTATATAATTGCC 1550

1551 TGGCGAAATTTTCGTTTATAATTAGATCGCATAAAACACTACTCACTATG 1600

1601 TCCCAAATTATAAAGCCTATATTTTTTACATGGTCTTTAATAACATATTT 1650

1651 TAACCAATATTTTATTCTATTATATGATCCCAACAAATATAAAATTAGCA 1700

1701 TCACATGAAAGTACTTCACAATAAATCTAGTAATATAACGTACATAATAC 1750

1751 TTAAATCTAGTGATATAATATATATAATACTTAGTATAGATATAGTTAGT 1800

1801 ATGATTATTAGTCAAAATATTCCGAATTTGATTCTCTTAAAAAAAAAGAG 1850

1851 CGTCCTATAATTTTGGACGGACGGAGTATAACGCTATCAGTGACTAAGCT 1900

1901 ACTCAAGATGACATAATCAGTTATGTCACAGGAGACCACCAAACAAAAGC 1950

1951 TATAGAAATTAGAAAAGGGCCAAAAGGCAGGTTACATTCTTCAGCCACAA 2000

2001 AACCTACCACTTAAAACATAAAGATGACCCAATCAGTTGTGTCACCCTGC 2050

2051 CATTACGCATCTCAACACACCATTAGTCCAGTCAATGATTGGAGCTAATG 2100

2101 AACTTGGTTTGCCAAGTGCCCTCGCCGCCACGGACACAGACGTTTCCAAA 2150

2151 CCATTTGTCCAAACAACTGCGACCCAATACACAATGTGTTAACTAATCAA 2200

2201 CTCGTCTCCCATCTCCTGCAAGTATAAAAATACTCACCCAGATCAACCAC 2250

2251 GAATCACTCAGCATATCACATTCACAGGCCACATAATTGGCCCC......2290

2291 ATCACTCCTCCCTCTCCCAGCTCATCGCC

GCCGCAGCTGCAGCACCG 2340

2341 CGTAGGTAAGCCATCATTTATTAGTAGTAGTGCTGTGAACCAACTACTGA 2390

2391 TTAGCTACGGAAAATGGCAAAGTTTTTACCCTAATGACGATCTCTGTGAT 2440

2441 TAATTACGGGCTTCGGCGTGTGATGCAAGCTCCGGGAAAGAAGCGCTTCC 2490

2491 CGCTGCGCTCGGCTCCGCCTCTGAGCCCCCTCGCCTCTTCGACGGCACCA 2540

2541 CCAGGTGAGGTTAACTTACGTGACAGATAATTAATTACCATGCCTCTAAA 2590

2591 TCCCTTTTTTTTTCTTTTTAACTTCTGCGTCGAAGTAAATCTTCTTTTGT 2640

2641 GACTCTTGTGAAGGCTTTACATTTGCTACTTCTGCCCGTTTGCTCAGCGC 2690

2691 GCTTGGATTATCAGGAACTTCAAGGTGTTTGTTTCTGAACTTCTCTGACC 2740

2741 TTTGGCTGCAGAGTTTCATACTCCTTTTACTCCTCCTGCTAAAAACCTGA 2790

2791 ATTTTTTTTGTACTTTTTTTTGGCTGTCAATTTGGCCAGGGCTTGCAGGA 2840

2841 CAAGATCGAGCTAGTCGGCATTGATCTGCAGGACAAACCAGCTTGGTACA 2890

2891 AAGAGAAGGTTTACGAACAGGGCACGGTACAGTACACCTGTTCTTCCTTC 2940

2941 CTGCATGTCATCTGAATCTCTTCATGTATAATTTTTGTCGATGAACAATT 2990

2991 GAGTAGTATGGATGTTGTTGTCTTTCTCGATAGGTGCCTTCTCTAGAGCA 3040

3041 CAACGGCAAGATCATGGGGGAGAGTTTAGATTTGATCAAGTACATCGACA 3090

3091 GCCATTTCGAAGGCCCTGCACTGCTCCCTGAAGTAAGGCAGAGAAATTCA 3140

3141 GTGTAACACGTGACAGTGATGCAGTTTTTTTAGGGAGTGACAATGATGCA 3190

3191 GTTTTCTTTTTTTGGGAGTGACAATGATGCAGTTTTTTTTTCTCTGAGAC 3240

3241 GTGGTTTACAGCTTATAATAATGTTTGGATCTGGAAAATGACAGGATCCT 3290

3291 GAGAAGAGACAGTTTGCTGATGAGCTTATTGCGTATGCCAATGCGTTTAC 3340

3341 CAAAGCACTCTACTCACCCTTAATCTCCAAAGCAGATTTGTCAGCTGAGA 3390

3391 CGGGTAAGAGCTACTCCCTCCGTTCCACAATATAAGTCATTCTAACATTT 3440

3441 CTCATATTCATATTGATGCTAATGAATCTAAACATATATATCTATCTAAA 3490

3491 TTCATTAGCATCAATATGAATATGGAAAATACTAGAATGACTTATACTGT 3540

3541 GGAACGGAGGAAGTAGTTGTGTCAATCTAGCATTGCAGCATCTATGCCAT 3590

3591 GTTTGTAGATAAGGAGATTTGCAGTTTTAATTCATTTGCATGCTGTTCGA 3640

3641 GAAAATTCATTTGCATACATGCTGATTTACTGAAATTATGTATCATCATC 3690

3691 AGTTGCTGCTCTGGACAAGATAGAAGCTGCCCTGTCGAAGTTCGGTGATG 3740

3741 GTCCATTCTTCCTTGGACAATTTAGCTTGGTATGTCGATTCGGTTTGTTA 3790

3791 CAATGTGGTTCATTTTCCTTTCCAATGTTTAGGATGTGTCGAAGGTAAGG 3840

3841 GTTGGGAACTTCTTTCCCGCGTACATAAAACGGAGTAATTCATTAGCGCA 3890

3891 TAAGTAATTAAGTACTCCCTCCGGTTCTATAATTCTTCATGTTTTAGACA 3940

3941 ACTATACGGTCTCCAAATATATCTTTCACTATGTTTTTTATTATAATATG 3990

3991 TAAATTAAATAAATAAAATTTTACTTTTATTATAAGTACTTTGTAGGTAA 4040

4041 ATCTATTGCTCTAGTGACTTTAACTAAATATCTTTAAAGGTATTGATAGT 4090

4091 CAAAGGTATATAAAACATTGTTCAAAATGTCAAGAGTAATAAAATCGGAG 4140

4141 AGAGTATTAGCTAAAAATACTTGAAAAATGAATCAATATGATTTTTGATT 4190

4191 TTTTAAGTAACTTTCGACATATTTTTTTTAAGAAAAAACAATGCATCCTT 4240

4241 TAGTGGCTCGGAAGGTGTGCGGAAAAAAAAACAGAGAGTAGAAGTTGAAA 4290

4291 CTCCTACGGAGCACACCCTTAATTTCTCCTAAAAAACTTGTGGCCATTCT 4340

4341 TCGATTTCCAGGTGGACATTGCGTATGTGACAATTATTGAAAGGATTCAG 4390

4391 ATATACTACTCTCATATAAGGAAATACGAGATCACCAATGGCCGGCCCAA 4440

4441 CCTCGAGAAATTCATCGAGGAAATCAACAGAATCGAAGCATATACACAAA 4490

4491 CAAAAAATGACCCGCTTTACTTGCTCGATCTTGCGAAGACGCATCTTAAG 4540

4541 GCAAGACCACTTCCTGAAACAAATGCTCAGCCTCCGCAACTTTGATCTGC 4590

4591 CAGTTTTATAGTCACTTGACAATTGCACTTCTTTAATTTCCAGGTTGCCT 4640

4641 GAAGATGTTGAGCCAGCGATGTACTGAATGACAGAATGATGATGATCCAT 4690

4691 GCCCCGCCCCCCCCCCCCCCCCCACACACACACAAAAAAAATCAATACTC 4740

4741 TTTTCTTGCTACTCCAGTTGATAGTACATGTTTTGCAGCTTTTGCTTCCA 4790

4791 ATAAACCGAAGTTGACATGTGGTGTAAAAGTCATGTTTGAGTAATAAAAT 4840

4841 ACTGGTGTAATTCTATGTTACTCAATGTCGTTGGTCTTAAATATACTTTC 4890

4891 ATGTCATTGAAAATAATCTTTTGTTGTCAAACTTA                4925SEQ ID No：7的信息

长度：2158碱基

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

序列描述：SEQ ID No：7GAGCTCTCGTCGGGGGGAGAGACTAGAGAGAGAGGTAGAGAGGTCGCACCGTCGCAGACTCGCAGTGGGCGGAGTGCGGCCGAGAGTCGCCTGGTTTCTTTCTCCTTTTCCGCGATTTTTTTTCTGTGTTTTTTGCTTTGTCCGCTTGCGTTCCCCCGTTTCGACACCTGCACTTCGCATATGTGCTACCAAATGGGCCCTTGGGCCATTGTAGATGGGCCATAATGCTCCTTATAGGAGAAATTGCATTTTTGGAATTTTTTATTTTAATTTTTTAATATTTAGTAGAAAATAAATTCGTATTTTAAAATTTTGCAGAAATATATTCCTCCGACGATATTGTAGGACATGGCATGTAAATTGCCCTATGAGATGGCAATTTATTTGACGTGACACACCACGAGAGATGCGTCGTGCCAAGTTTTTAGGTGGCCTCCTCTGTGATAAACCGCTCTCCCCTAGGACGATTTATCAAAATTGTCATGGCACGACCCATGCATCATCAAACTTTGCGTCGTGGCAATTTTGCAGCCACCCCCACAATAAATTGCCCTATGGGAGATGTTACATAGGGAGATAAATCATCGGGAGGGGGGCACCTACAAAATTGTCGTGTTACATAGATTGCTCTATGCCCCTCCCTAAGGTAGAGCGGGAGGAGATTTTTGCAAAACTTTGAAATTGTAATTGTATTTTTTATTCTTTTAAAAAATAAATATATTTTTTTCTTAAAAAATCACAACACTGTTGTTGTGAGTAAGGCATAAAACCTGGTAGCACAAGCATGCTATCTAAATCGTATGGTATATGGATATGCTGGGAAAATATGTGGTGGAAATCACATATGTACTTATGTAGGGCCTGTTCGGCCGCTTGGTACAGCCGCTGCGCTGCCACAGCCGAAAGAAACAACACACTGTGCTAGTTGGCTGCAGCACAGTGAAAATAATGGCAGTCGAACATAGCCGTAGTGGAAACTCGGAAACTACCGATGGATTGAAAAATGGACATCCGAGATTCGTCCATGTCATCACGAGTAAAAATGTTGCTCACGGATATATTGCGAGATTTTTACTCGTAATGATGTGGACGAATCTCACAAGTCAATTTTTTCCATCCAATGGTTGTTTCCAAATTTCCACTACATATGTGGTTTCCACCACATATTTTCCCGGATATGCTACCTAGTTTTTAATAAGATGGCATCGTTAATTTTTAACGCATGTTTAACTGTTTATCTTATTTCTTAAAAATATGTAATTATTATTTATTCTGTTGTGAGTTGTTTTATTACTAAAAATATTAACAATGATGATTTATCTCTTATGTATTTGTATAATTTTTTTACTGGAGGAATTCTATCCTTACTCATTTTTTTATATAATTGCCTGGCGAAATTTTTCGTTTATAATTAGATCGCATAAAACACTACTCACTATGTCCCAAATTATAAAGCCTATATTTTTTACATGGTCTTTAATAACATATTTTAACCAATATTTTATTCTATTATATGATCCCAACAAATATAAAATTAGCATCACATGAAAGTACTTCACAATAAATCTAGTAATATAACGTACATAATACTTAAATCTAGTGATATAATATATATAATACTTAGTATAGATATAGTTAGTATGATTATTAGTCAAAATATTCCGAATTTGATTCTCTTAAAAAAAAAGAGCGTCCTATAATTTTGGACGGACGGAGTATAACGCTATCAGTGACTAAGCTACTCAAGATGACATAATCAGTTATGTCACAGGAGACCACCAAACAAAAGCTATAGAAATTAGAAAAGGGCCAAAAGGCAGGTTACATTCTTCAGCCACAAAACCTACCACTTAAAACATAAAGATGACCCAATCAGTTGTGTCACCCTGCCATTACGCATCTCAACACACCATTAGTCCAGTCAATGATTGGAGCTAATGAACTTGGTTTGCCAAGTGCCCTCGCCGCCACGGACACAGACGTTTCCAAACCATTTGTCCAAACAACTGCGACCCAATACACAATGTGTTAACTAATCAACTCGTCTCCCATCTCCTGCAAGTATAAAAATACTCACCCAGATCAACCACGAATCACTCAGCATATCACATTCACAGGCCACATAATTGGCCCCATCACTCCTCCCTCTCCCAGCTCATCGCCATGSEQ ID No：8的信息

长度：1227碱基

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

序列描述：SEQ ID No：8CTGCAGCACAGTGAAAATAATGGCAGTCGAACATAGCCGTAGTGGAAACTCGGAAACTACCGATGGATTGAAAAATGGACATCCGAGATTCGTCCATGTCATCACGAGTAAAAATGTTGCTCACGGATATATTGCGAGATTTTTACTCGTAATGATGTGGACGAATCTCACAAGTCAATTTTTCCATCCAATGGTTGTTTCCAAATTTCCACTACATATGTGGTTTCCACCACATATTTTCCCGGATATGCTACCTAGTTTTTAATAAGATGGCATCGTTAATTTTTAACGCATGTTTAACTGTTTATCTTATTTCTTAAAAATATGTAATTATTATTTATTCTGTTGTGAGTTGTTTTATTACTAAAAATATTAACAATGATGATTTATCTCTTATGTATTTGTATAATTTTTTTACTGGAGGAATTCTATCCTTACTCATTTTTTTATATAATTGCCTGGCGAAATTTTCGTTTATAATTAGATCGCATAAAACACTACTCACTATGTCCCAAATTATAAAGCCTATATTTTTTACATGGTCTTTAATAACATATTTTAACCAATATTTTATTCTATTATATGATCCCAACAAATATAAAATTAGCATCACATGAAAGTACTTCACAATAAATCTAGTAATATAACGTACATAATACTTAAATCTAGTGATATAATATATATAATACTTAGTATAGATATGTTAGTATGATTATTAGTCAAAATATTCCGAATTTGATTCTCTAAAAAAAAAAGAGCGTCCTATAATTTTGGACGGACGGAGTATAACGCTATCAGTGACTAAGCTACTCAAGATGACATAATCAGTTATGTCACAGGAGACCACCAAACAAAAGCTATAGAAATTAGAAAAGGGCCAAAAGGCAGGTTACATTCTTCAGCCACAAAACCTACCACTTAAAACATAAAGATGACCCAATCAGTTGTGTCACCCTGCCATTACGCATCTCAACACACCATTAGTCCAGTCAATGATTGGAGCTAATGAACTTGGTTTGCCAAGTGCCCTCGCCGCCACGGACACAGACGTTTCCAAACCATTTGTCCAAACAACTGCGACCCAATACACAATGTGTTAACTAATCAACTCGTCTCCCATCTCCTGCAAGTATAAAAATACTCACCCAGATCAACCACGAATCACTCAGCATATCACATTCACAGGCCACATAATTGGCCCCATCACTCCTCCCTCTCCCAGCTCATCGCCATGSEQ ID No：9的信息

长度：804碱基

类型：核酸

链性：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

序列描述：SEQ ID No：9GAATTCTATCCTTACTCATTTTTTTATATAATTGCCTGGCGAAATTTTCGTTTATAATTAGATCGCATAAAACACTACTCACTATGTCCCAAATTATAAAGCCTATATTTTTTACATGGTCTTTAATAACATATTTTAACCAATATTTTTATTCTATTATATGATCCCAACAAATATAAAATTAGCATCACATGAAAGTACTTCACAATAAATCTAGTAATATAACGTACATAATACTTAAATCTAGTGATATAATATATATAATACTTAGTATAGATATAGTTAGTATGATTATTAGTCAAAATATTCCGAATTTGATTCTCTTAAAAAAAAAGAGCGTCCTATAATTTTGGACGGACGGAGTATAACGCTATCAGTGACTAAGCTACTCAAGATGACATAATCAGTTATGTCACAGGAGACCACCAAACAAAAGCTATAGAAATTAGAAAAGGGCCAAAAGGCAGGTTACATTCTTCAGCCACAAAACCTACCACTTAAAACATAAAGATGACCCAATCAGTTGTGTCACCCTGCCATTACGCATCTCAACACACCATTAGTCCAGTCAATGATTGGAGCTAATGAACTTGGTTTGCCAAGTGCCCTCGCCGCCACGGACACAGACGTTTCCAAACCATTTGTCCAAACAACTGCGACCCAATACACAATGTGTTAACTAATCAACTCGTCTCCCATCTCCTGCAAGTATAAAAATACTCACCCAGATCAACCACGAATCACTCAGCATATCACATTCACAGGCCACATAATTGGCCCCATCACTCCTCCCTCTCCCAGCTCATCGCCATG

Claims (8)

1、一种分离出的cDNA分子，其特征在于，它编码具有水稻中受化学绿黄隆和胺苯黄隆等磺酰脲类除草剂诱导表达的核苷酸序列，所述核苷酸序列在中度严紧条件下能与固定在固体支撑膜上的核苷酸SEQ ID No.4第29-758位的核苷酸杂交，于50℃～65℃经0.1× SSC，0.1％SDS洗脱后，在-80℃对X-光片曝光24小时后可获得放射自显影信号。

2、基于权利要求1所述的核苷酸序列在转基因植物中的应用。

3、一种基因组DNA分子，其特征在于，它编码调控权利要求1所述cDNA表达的基因5’上游2.2 kb、1.2 kb、0.8 kb等核苷酸序列，这些序列包含受化学除草剂绿黄隆诱导的调控元件和不同的组织特异性表达元件等。所述核苷酸序列能在中度严紧条件下与固定在固体支撑膜上的SEQ ID No.6的核苷酸杂交，经0.1×SSC，0.1％SDS于50℃～65℃洗脱后，在-80℃对X-光片曝光24小时后可获得放射自显影信号。

4、一组载体，其特征在于它们含有权利要求3所述的核苷酸序列作为启动子。

5 、根据权利要求4所述的载体，其特征在于该载体含有上述核苷酸序列作为启动子，该载体可转化植物，它包含一个核酸启动子片段、与该启动子相连编码特定基因的DNA顺序及合适的3’下游序列，使转化该重组载体后的植物在有化合物绿黄隆和胺苯黄隆之一的作用下，特定基因产物水平上升；选择的基因有编码GUS基因，编码抗病基因如白叶枯病、稻瘟病等抗性基因，编码抗昆虫的基因，编码蛋白酶抑制剂基因，编码Bacillusthuringenesis昆虫内毒素的基因，编码植物乙烯生物合成酶的基因，编码植物激素生物合成酶的基因，编码雄性不育/育性表型的基因等。

6、一种用权利要求3的DNA结构转化的植物，这种转基因植物用化合物绿黄隆和胺苯黄隆处理引起编码选择的基因产物的DNA顺序表达增高，该DNA顺序经操作连接在所述启动子片段的3’端。

7、一种由权利要求6所述的转基因植物的种子。

8、一种在植物中引起所选择的基因产物表达增高的方法，其特征在于具体如步骤如下：a)用上述描述的重组DNA结构转化植物；b)用化合物绿黄隆和胺苯黄隆处理转基因植物；c)使转基因植物在期望的时候增加所选择的基因产物的表达。