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CN1384874A - 培养细胞的方法,膜组件,膜组件的应用和培养细胞的反应系统 - Google Patents

培养细胞的方法,膜组件,膜组件的应用和培养细胞的反应系统 Download PDF

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CN1384874A
CN1384874A CN00813105A CN00813105A CN1384874A CN 1384874 A CN1384874 A CN 1384874A CN 00813105 A CN00813105 A CN 00813105A CN 00813105 A CN00813105 A CN 00813105A CN 1384874 A CN1384874 A CN 1384874A
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CN
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H·马克尔
K·玛尔
G·艾斯博伦纳
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Abstract

本发明涉及一种利用一个反应系统培养细胞的方法,其中,所述反应系统包括一个用于透析液的室、一个用于培养细胞的室和一个膜组件,所述膜组件连通这两个室,每个膜组件具有至少两个由所述膜彼此隔开的室,所述室之一充满透析液而另一室则充满含有细胞的培养液。将第一气体引入用于细胞培养的所述室中的所述培养液,而将第二气体引入膜组件中的所述培养液。所述膜是一种功能性透析膜。

Description

培养细胞的方法，膜组件，膜组件的应用 和培养细胞的反应系统
本发明涉及一种利用一个反应系统培养细胞的方法，其中，所述反应系统包括一个透析液容器、一个用于培养细胞的空间和一个膜组件，所述膜组件使所述两个空间彼此连通并且该膜组件具有至少两个由一个膜隔开的空间，一种透析液流过其中的一个空间而一种含有细胞的培养液流过第二个空间，并且将第一气体引入用于培养细胞的空间中的培养液。本发明还涉及一种膜组件，一种膜组件的应用和一种用于培养细胞的反应系统。
透析膜在微生物或动物细胞的培养中的应用就可达到的细胞密度或获得的产物的浓度而言具有某些优势。R.Prtner和H.Mrkl给出了关于其中使用膜的不同生物技术生产方法的综述[Appl.Microbiol.Biotechnol.(1998)50：403-414]。使用透析膜的基本效果基于这一事实，即，借助一种膜脱除了所用生物体在生长过程中或生产过程中产生的生长抑制性代谢产物。在此，输送是由所述代谢产物的浓度差异驱动的。欧洲专利EP 0 632 827 B1描述了一种方法和一种装置，其中阐述了这一构思的工业应用。更准确地说，描述了一种反应系统，它包括至少两个借助于至少一个膜而相互连接的室，而且其中微生物或植物或动物细胞的培养物位于一个室并且来自该室的生长抑制性代谢产物到达另一室的溶液中。
所述的将透析膜直接结合入为培养生物体而提供的空间，已经在实验室规模(2升规模)上在技术上成功地实施过(同样参见，R.Prtner和H.Mrkl，出处同上)。然而，将该方法放大到高达数立方米的生产规模就会涉及到至今尚未解决的难题。问题的根源可得到简单的解释。人们努力开发壁厚很小(从数个μm到高达100μm)的膜，因为这样的膜具有很高的透析能力。然而，所述膜仅具有有限的机械强度。而对迅速生长的需氧生物体而言，培养空间中的机械应变很高，因为需要引入大量空气或氧气供给所述生物体。同时，必须脱除大量二氧化碳。这就需要通过搅拌提供大约10kW/m3的高能量输入，从而引起对薄膜的巨大应变。
在这方面问题要少得多的是另一种同样已知的设置，如图1所示。在这种设置中，透析膜3置于培养空间2之外的单独的膜组件8中。借助泵10将培养液泵送通过膜组件8。相应地，借助第二个泵9从容器1向膜组件8提供透析液。将该设置放大为大生产规模是不成问题的，因为该设置主要包括三个相互独立的单元，即，两个容器和一个膜组件，其尺寸可相互独立地设计。然而，正如Ogbonna，J.Ch.和Mrkl，H.(Biotechnology and Bioengineering，Vol.41，pp.1092-1100(1993))用浓稠大肠埃希氏菌(E.coli)培养物的实例已经表明的那样，所述设置具有一个明显的缺陷，即，部分微生物离开培养空间2一段时间并且在膜组件8中进行透析过程中没有氧气供应。在引用的实例中，特定的生物体途径位于有气体供应的培养空间之外的透析组件所花费的时间据称是11秒。该重复发生的时间受限的供应不足的一个后果是，可达到的细胞密度降低到110克干重/升的数值。然而，在一种不能被放大而且具有一个与培养空间相结合的膜的设置中，即，连续氧供应，在其它条件相同的条件下，达到160克干重/升的生物体密度。
本发明的一个目的是进一步开发现有技术已知的按照图1的用于培养细胞的反应系统，该反应系统包括至少一个用于培养细胞的空间(2)、一个透析液容器(1)和一个插于二者之间的膜组件(8)，来自培养液的生长抑制性物质通过该膜组件到达透析液，于是获得了较高的细胞密度。
另一目的是提供一种适合于实施本发明方法的反应系统。
根据本发明，该目的是通过一种利用一个反应系统培养细胞的方法来实现的，其中，所述反应系统包括一个透析液容器、一个用于培养细胞的空间和一个膜组件，所述膜组件使两个空间彼此连通并且该膜组件具有至少两个由一个膜隔开的空间，一种透析液流过其中一个空间而一种含有细胞的培养液流过其中第二个空间，并且将第一气体引入用于培养细胞的空间中的培养液而将第二气体引入膜组件中的培养液。
该目的特别是通过一种利用一个反应系统培养细胞的方法来实现的，其中，所述反应系统包括一个透析液容器、一个用于培养细胞的空间和一个膜组件，所述膜组件使两个空间彼此连通并且该膜组件具有至少两个由一个膜隔开的空间，一种透析液流过其中一个空间而一种含有细胞的培养液流过其中第二个空间，并且将第一气体引入用于培养细胞的空间中的培养液而将第二气体引入膜组件中的培养液，而且所述膜功能上是一个透析膜。
本发明方法的一个实施方案保证通过将第二气体直接引入膜组件中的培养液而将气体直接通入存在于膜组件中的培养液。
本发明方法的一个替代性实施方案保证通过将第二气体引入透析液容器中的透析液而且气体从那里经由膜组件的膜到达存在于膜组件中的培养液而将气体间接通入存在于膜组件中的培养液。
在本发明方法的一个优选实施方案中，将气体同时直接和间接地引入。
在一个实施方案中，所述膜组件包括至少一个供气装置，并且所述供气装置向由膜隔开并且携带一种液体的空间中的至少一个空间提供第二气体。
就此而论，优选所述供气装置具有一个出口，该出口特别是位于携带培养液的膜组件空间。
在一个特别优选的实施方案中，所述供气装置是一个管。
在一个非常特别优选的实施方案中，所述供气装置具有喷嘴的形状。
一个实施方案保证所述膜组件的膜由一种选自再生纤维素、聚酰胺、聚丙烯和聚砜的材料制成。
另一个实施方案保证所述膜组件是一种板式组件。
本发明方法的一个实施方案以及本发明膜组件的一个实施方案保证所述膜组件的膜是一种透析膜。
就此而论，特别优选所述透析膜材料是铜纺(Cuprophan)。
在本发明方法的一个优选实施方案中，所述膜组件由于其面积/体积比和其气体渗透性系数而为细胞提供充分的气体交换。
这方面的一个实施方案保证所述面积/体积比是至少大约5平方米/升，特别是至少10平方米/升。
在一个优选实施方案中，所述面积/体积比是大约13平方米/升。
在一个进一步的实施方案中，所述氧气渗透性系数是大约0.066厘米/分钟或更高。
一个实施方案可以保证所述透析液容器具有一个用于提供气体和用于脱除气体的装置。
此外，本发明方法可以保证所述膜组件、所述用于培养细胞的空间和/或透析液容器具有升高的压力。
本发明方法可以保证所述第一气体和第二气体各自相互独立地选自空气、氧气、氮气、二氧化碳及其混合物。
在一个优选的实施方案中，所述第二气体是氧气。
在一个替代性实施方案中，所述第二气体是二氧化碳。
本发明方法可以保证所述细胞选自微生物细胞、真菌细胞、动物细胞和植物细胞。
非常特别优选所述细胞是大肠埃希氏菌(Escherichia coli)细胞。
此外，本发明的目的是通过一种膜组件来实现的，所述膜组件包括至少两个由一个膜隔开的空间，每个空间有一种液体流过，一个空间中的液体是透析液而另一个空间中的液体是培养液，而且其中该膜组件包括至少一个供气装置而且在由膜隔开的这些空间中的至少一个空间中的供气装置具有一个出口。
一个实施方案保证所述膜具有一个管的形状而且其容积形成两个空间之一。
就此而论，可进一步保证由所述管状膜形成的空间的直径是大约3至10毫米，优选6至8毫米。
在一个实施方案中，本发明的膜组件包括由一个管状膜形成的许多空间。
在一个进一步的实施方案中，所述供气装置的一个出口位于由所述管状膜形成的空间中的至少一个空间。
就此而论，可进一步保证所述供气装置的出口位于由所述管状膜形成的空间之外的一个空间。
在一个优选实施方案中，所述供气装置是一个管。
在一个非常特别优选的实施方案中，所述管以同心的方式排列于所述空间。
本发明的膜组件可保证所述管的内径为0.2毫米至3毫米。
在一个特别优选的实施方案中，所述供气装置的出口形状做得像一个喷嘴。
根据本发明，该目的还是通过本发明的膜组件在本发明方法中的应用而实现的。
此外，该目的是通过使用一种膜组件而实现的，所述膜组件具有这样一个气体渗透性系数，该系数足够高以便确保培养液经过该膜组件过程中充分的供气或者位于该膜组件中的培养液中的充分的气体交换，和/或具有一个适当高的面积/体积比以便确保培养液经过该膜组件过程中充分的供气或者位于该膜组件中的培养液中的充分的气体交换。
关于所述这两个因素以及关于如何测定所述因素的更为详尽的资料可参见对附图的描述，也可参见对本文公开的方法的描述。
此外，该目的根据本发明是通过一个用于培养细胞的反应系统来实现的，所述反应系统包括一个透析液容器、一个用于培养细胞的空间和至少一个插于两者之间的膜组件，所述膜组件确保培养液经过该膜组件过程中充分的供气或者位于该膜组件中的培养液中的充分的气体交换。
在一个优选的实施方案中，所述膜组件是本发明的膜组件。
在一个进一步的实施方案中，所述透析液容器包含至少一个气体引入装置。在这方面，一个技术前提条件是，该容器包含至少一个用于供气的管线和至少一个用于脱除气体的(第二)管线。
在又一个实施方案中，所述膜组件的膜具有这样一个气体渗透性系数，该系数足够高以便确保培养液经过该膜组件过程中充分的供气或者位于该膜组件中的培养液中的充分的气体交换，和/或具有一个适当高的面积/体积比以便确保培养液经过该膜组件过程中充分的供气或者位于该膜组件中的培养液中的充分的气体交换。
本发明基于这样一个惊人的发现，即，在经过膜组件的过程中向待培养的细胞引入气体避免了所述细胞的时间受限的供气(在需氧或兼性需氧细胞的情况下特别是供氧)不足，从而导致较高的细胞密度。
在本发明方法范围内使用的反应系统的基本结构如图2所示。尽管图2仅表示出一个膜组件，该反应系统当然可以包括许多平行插入的膜组件单元。
在本发明方法的范围内，可保证需要的气体得以交换或提供，例如在需氧或兼性需氧的生物体的情况下以直接向膜组件中所含培养液中提供氧气的形式。这在本文中被称作直接引入气体。在这方面，可将气体直接引入从而经由结合在膜组件中的供气装置(15，16)将气体直接提供给通常含有细胞的培养液。为此，在本发明的范围内可能使用本发明的膜组件或者使所述膜组件包括于该反应系统(当在本发明方法的范围内使用它时)。
或者，如本文所述，可通过间接引入气体而在本发明的方法中进行在膜组件所含培养液中需要的气体交换或其需要的气体供应。气体的间接引入或提供是通过将气体引入透析液容器1中的透析液18而进行的。这里应用供气管线21和脱气管线22并且通常还有搅拌器23。借助泵9将富含气体的透析液泵送通过膜组件8并且可经由膜3将气体释放到培养液。对间接引入气体而言重要的参数，除了将气体引入透析液容器的能力外，还有膜组件的膜对所述气体(即，被引入的气体)的渗透性系数，以及膜组件的面积/体积比。
在这方面，在本发明的方法中同时应用这两种引入气体的形式是属于本发明的范围之内的，但在培养细胞的过程中，很可能有这样的阶段，其中仅应用两种引入气体的形式之一。
因此，仅直接引入气体和仅间接引入气体都是极端的情况。
根据引入气体所能利用的膜面积的比例，其对待输送气体的渗透性以及将有气体引入其中、并存在于膜组件8中的培养体积，气体的直接引入(经由供气装置15，16)和间接引入(经由膜3)的比例将有所不同。在这方面，理论上还有必要考虑所述气体(它可被引入带有透析液的容器，更精确地说，引入含于其中的透析液)的量。
如果，例如，由于膜组件的高面积/体积比和/或所用膜对所述气体的高渗透性系数，通过膜组件8间接引入气体(在需氧和兼性需氧细胞的情况下，特别是氧气)使经由膜的充分气体供应成为可能，就可以省去经由特殊供气装置或使用本文公开的膜组件的直接气体引入。
与气体引入方式无关，所述膜组件中采用的膜通常可包括铜纺(再生纤维素)、聚酰胺、聚丙烯、聚砜或其它天然或合成的物质。该膜可以是一种透析膜(截断值：10000道尔顿)、微孔膜(截断值：0.2μm)或者其渗透性(截断值)介于两者之间的膜。
在本发明的范围内，所述膜在功能上也是本发明膜组件中和/或本发明反应系统中的一种透析膜。
就本发明方法以及本发明膜组件和反应系统而言，所有的膜都有透析膜的特征。
现有技术中，由再生纤维素(例如铜纺)制成的膜通常被称为透析膜。该膜不适合用作过滤器，因为没有通过该(透析)膜的水力穿流。在跨膜压差下在透析膜(例如铜纺膜)中发生的水力流动非常低。所述(透析)膜的实际功能基于这样的事实，即，通过扩散可借助膜平衡掉浓度差。
例如，如果采用孔小于0.2μm的微孔膜并避免了跨膜压差的形成，那末也是在这种情况下，借助扩散机理进行通过膜的输送。在所述条件下，基本上避免了水力穿流。
在本发明方法(它通常在没有跨膜压差的情况下进行)的范围内，多孔膜、特别是微孔膜与水力密封膜(实际的透析膜)没有区别。
本文选用的术语，即，“该膜功能上是一个透析膜”，应根据所述上下文加以理解。换句话说，在本发明方法或本发明膜组件或本发明反应系统的范围内，使用一种本义意义上的透析膜。然而，也可以这样规定，使用多孔模、特别是微孔膜，只要该膜在功能上像透析膜那样发挥功能即可，即，只要它不表现水力穿流，或者，如果发生水力穿流，其程度与通过扩散经由膜进行的物质输送相比总体上较小。多孔膜或微孔膜的特性的所述变化可能是由于利用或操作膜的方式，更准确地说，可能是由于不像例如在灌注系统中那样施加通过膜的任何压力。
实施例阐述了本领域技术人员在这方面必须考虑的事项。
现将以附图为基础，在下文进一步阐述本发明，所述附图产生本发明进一步的优点和实施方案。附图中，
图1表示一个根据现有技术的用于培养细胞的反应系统，该系统包括一个培养空间2、一个透析液容器1和一个包含透析膜3的独立的膜组件8；
图2表示本发明的反应系统，它是在本发明方法的范围内使用的；
图3表示本发明的膜组件；和
图4表示得自Gambro Medizintechnik GmbH的板式组件。
在说明书引言部分已经简要讨论了图1，它描述了普通反应系统的基本结构，在所示类型的反应系统中，包含透析膜3的膜组件8位于培养空间2之外。
培养空间2含有培养液17，而且在接种状态下含有待培养的细胞，这些细胞经由供应管线5而提供氧气。可提供氧气，以便提供空气、空气/氧气混合物或者纯氧。供应管线5出口处形成的气泡7在培养液中向上移动并进一步被培养空间2中的搅拌器4分散。于是，残留的气体，合适时与气态反应产物一起，经由排放管线6从培养空间脱除。培养空间2经由管线13和14与包含透析膜3的膜组件8相连。借助泵10，培养液从培养空间2泵送到膜组件并从那里再次经由管线14送入培养空间2。透析液容器1充满透析液并经由管线11和12与包含透析膜3的膜组件8相连。利用泵9将透析液从透析液容器1泵送通过膜组件8并经由管线12再次引入透析液容器1。
在该示意性的阐述中没有表示出用于反应系统的其它装置，因为它们是本领域技术人员所熟悉的，例如，测量装置、采样装置、用于提供和排放培养基并且还用于提供和排放基质的装置、用于更换透析液的装置等。
在这方面，本发明的方法可采用图2中所示的本发明反应系统，该系统是从图1中所示反应系统进一步开发的。它包括一个透析液容器、一个用于培养细胞的空间和一个插于两者之间的膜组件，所述膜组件充当透析组件。该膜组件可以是如图3中一个实施方案中所示的本发明的膜组件，也可以是这样一个膜组件，即，它具有足够高的气体渗透性系数以确保充分的间接供气而培养液流经该膜组件，和/或具有适当高的面积/体积比以确保充分的供气而培养液流经该膜组件(根据本发明该膜组件用于本发明的反应系统)。然而，也有可能同时采用这两种引入气体的方式，于是，反应系统如图2所示设置。
下面讨论各种可实现的引入气体的方式。在这方面，如果空气或氧气是所述的气体，那末在各种情况下所述的这个方面并不限于所述的特定气体，而仅用于通过实例加以阐述。原则上，在本发明范围内可能使用任何气体。
在这方面，直接引入气体的方式是这样的：作为供气装置的管16在膜组件中管状膜的底部同心排列。在这种情况下，这些管代表供气装置。在本实施方案中，在提高的压力下将含氧气体通过所述管引入膜的内部空间(即，由管状膜形成的空间)，该空间含有培养液以及待培养的细胞。在本例中，这些管通过供应管线15相互连接。内径为0.2-3mm的这些管可以在气体出口区域中包括一个变窄区，该变窄区可形成一个喷嘴以便限制逸出气体的量。供应管线15为生物体培养物提供空气，所述空气也可混有氧气。也可采用纯氧作为引入的气体。还可使膜组件完全经受提高的压力以便提高所述气体混合物中氧气的分压，从而同样提高进入含生物体的悬浮液中的氧气供应。
在本发明的方法中，通过经由供气管线2 1将气体引入透析容器1并由此将透析液中的氧气浓度提高，从而实现气体的间接引入。氧浓度降低了的气体经管线22离开透析容器。含氧气的透析液经泵9输送到膜组件8，氧气在此处经由透析膜释放到含有待培养的细胞(例如微生物)的悬浮液中。所述间接供气(即，间接供氧)主要取决于膜输送(本例中)氧的能力，和/或取决于相对于待供气的体积而言的可提供的膜面积。
如图4中示意性描述的得自Gambro的膜组件具有上述性质。图4中，这些平板膜3以一定的距离排列，在每种情况下，由两个膜形成一个有培养液17流过的空间。透析液18流经外部。这些膜由一个支撑结构19支撑。
结合图4给出了对膜组件的详细描述。
正如已经描述过的那样，在本发明方法的范围内，除了直接引入气体之外，还可以通过采用图4所示膜组件来间接引入气体。在这方面，当直接引入气体已经是充分的情况下，同样可以省掉经由透析液的间接引入气体。相反，当膜组件因其高的面积/体积比和有利的输送性能而确保充分的供气时，也可以省掉经由配有供气装置的膜组件(如图3所示)的直接气体引入。
所述反应系统的操作、其技术设备和培养细胞的方法(它可通过利用所述反应系统来实现)在其它方面分别类似于如关于图1中发明装置所阐述的反应系统、设备和方法。在这方面，将几乎相同的流体静压优选施加到由膜形成的两个空间。另外，优选这两个容器(它们的容积与所述膜相连)中的压力水平几乎是相同的。
在我们的实验中，实验实际上已经产生了优异的结果，这些实验涉及大肠埃希氏菌培养物和图2中所示的设置并且使用图4中描述的膜组件以及其中讨论过的氧气供应。所获得的160克干重/升的细胞密度相当于使用一种其中将膜直接结合入反应空间的反应系统所获得的细胞密度。实验表明，生长不受时间受限的氧气缺乏的损害。
如果在一种情况下希望进一步提高经由膜的氧气供应，可为其提供进一步的措施。例如，可以另外经由管线20在透析液侧向膜组件引入氧气(图2)。在穿过膜的过程中，将所述氧气溶于透析液。于是，提高了对供氧至关重要的负浓度梯度(C1-C2)平均。
通过提高图2设置的整体压力水平也可提高透析液中的氧浓度。在将压力加倍(例如，从105Pa的常压到2×105Pa)的情况下，透析液中的相应氧含量也可加倍。其结果是，相应地提高了膜组件或透析膜中的培养基的氧气供应(此处，术语“膜组件”和“透析组件”可以作为同义语使用)。
本发明用于培养细胞的方法包括下列步骤中的一个或多个，在这种普通反应系统中培养的方法原则上是本领域技术人员已知的：a)提供一个反应系统，该系统包括一个培养容器(培养空间)、一个包括本发明的装置的外部膜组件(即，本发明的膜组件)或者一个具有所需性质(面积/体积比、氧渗透性系数)的可商购的膜组件，以及一个透析液容器，并且所述反应系统以及含于其中的液体都优选被灭菌；b)用待培养的细胞接种培养容器；c)提供合适的温度、基质供应和氧气供应；d)将含有待培养细胞悬浮液的培养液从培养容器引导通过透析装置并将培养液引导返回培养容器，同时将透析液从透析液容器通过透析装置循环回透析液容器，其中优选将两股液流逆流引导，和e)收获培养的细胞。
尽管上述实施方案大部分是在培养微生物、特别是大肠埃希氏菌方面进行的，但本发明装置、反应系统或方法的应用决不限于此。
在本发明装置、应用、反应系统和方法中使用的细胞还可以是光合细胞，而不管它们是原核细胞还是真核细胞，因而可以是具有光合活性的微生物或植物细胞。
于是，本发明的一个方面涉及为细胞提供氧气。
本发明的另一方面涉及在气体或气态代谢产物在细胞培养物中出现时将它们脱除的方法。在这方面，这样的一个想法起到这样的作用，即，引入气体的方法原则上，至少对于涉及的物化过程而言，与脱除气体的方法相似。在这方面，可能在引入、特别是鼓入一种气体的影响下，从液体中脱除另一种气体或同一种气体。本例中，所述液体可以是培养空间液体(培养基)和/或透析液。就此而论，可以使用本发明的装置从反应系统或其一个部分中的液体中脱除气体。对本发明的膜组件的使用情况也是如此。
将通过实例给出一些培养系统，在这些系统中，已经证明除去气态代谢产物是有利的。
在光合活性细胞(例如植物细胞或藻类)的情形中，通常向培养基中加入二氧化碳。这可通过使用一种适当设计的膜组件或者本发明的装置进行，为设计气体引入装置或使用的膜组件而进行计算，这些计算类似于上面对大肠埃希氏菌培养物的供氧所做的计算并且能使本领域技术人员为培养物提供所需用量的二氧化碳。同时，在这类细胞的高密度培养物的情形中，有必要从培养基中脱除因细胞的光合活性而产生的氧气。这也可通过使用本发明的装置或通过使用一种膜组件来实现。典型的情况是，将使用空气和二氧化碳的混合物并设定合适的分压而将气体引入。
本发明涉及按本发明从液体脱除气体的这个方面的另一个实例是培养火球菌属(Pyrococcus)。这里，引入氮气或者一种氮气和二氧化碳的混合物在产生高细胞密度方面是成功的。此处以参考文件的形式引入关于该内容的相应的公开内容，Krahe，M.FEMS Microbiologyreviews 18(1995)271-285。
无论何时，对培养细胞来说提供或脱除气体是有用的或必要的时候，或换句话说，培养物的气体代谢对培养细胞至关重要的时候，本领域技术人员就将(能够)使用本发明的装置、应用、反应系统和方法。
上述反应系统可用于本发明的方法。在这方面，可以保证含有透析液的容器1或实际的培养容器(即，培养空间)或者这两者间歇、半连续或连续操作。除了将气体引入本发明的装置外，可将气体引入培养空间和/或引入透析液容器，更精确地说，引入透析液(或透析物18)。原则上，可以在培养容器中培养任何形式的细胞，即，原核细胞和真核细胞，特别是微生物、真菌细胞、动物细胞和植物细胞。细胞通常以悬浮液的形式存在于培养容器中。关于操作，特别是培养容器的操作，任何想象得到的供料策略都是可能的，例如，特别是还有流加或分流加料策略，它已描述于例如，Ogbonna，J.Ch.and Mrkl，H.；Biotechnoloy and Bioengineering Vol.41，pp.1092-1100(1993)，其全部公开内容引入本文作参考。否则，根据营养条件，向培养物中选择性地添加限制性基质，例如，碳源、氮源和/或特定的盐。
图3表示本发明的膜组件，例如，它可以作为膜组件8结合入图1或图2中所示的反应系统中，即，它可以作为单独的膜组件8插在培养空间2和透析液容器1之间。
膜组件8由总共两组空间构成，在每种情况下，这些空间中有两个或更多个是存在的，一方面是那些培养液17位于其中或有所述培养液流过的空间，另一方面是那些含有透析液的空间。本例中，膜组件8中的透析膜形成管，此处简称为管状膜，培养液通过该管状膜导入。透析液流经位于两者之间并且由膜材料与培养液隔开的空间。膜组件经由进料管线13和排放管线14与培养容器连接。在培养空间2中的悬浮培养物的情况下，此处细胞从底部到顶部流经管状膜的内部。经由管线11和12与透析液容器1交换的透析液围绕膜的外壁流动。在这方面，在每种情况下，进料管线13和排放管线14以及进料管线11和排放管线12形成一个构造，该构造分别用于将液体培养基提供给由管状膜形成的空间和从该空间排放出来，和将液体培养基提供给位于由管状膜形成的空间之外的空间和从该空间排放出来。在这方面，本实施方案在每种情况下，仅保证将一个进料管线和排放管线分别提供给透析组件的两侧，即，分别是，透析液，和待透析的液体，即，培养液。然而，在每种情况下，还可以在每一侧提供许多所述进料管线和排放管线。
如果本发明的膜组件以结合的形式存在于本发明的反应系统中，就有利地通过同时提高透析液容器1和培养空间2中的压力来提高膜组件中的压力。正像我们的实验已经证明的那样，这种措施能毫无问题地在要求的5-15g/(1h)[即，kg O2/m3培养液/小时]范围内提供氧气。
气体或气体混合物流经供应管线15通过膜3的内部空间，通过排放管线14离开膜组件，从那里到达培养容器2并且与培养空间2(它同样有氧气供应)的废气一起通过培养空间2的盖中的孔6离开所述培养容器。
气体以一定的过压经由管16引入膜3的内部空间。根据过压的量，气体获得一定的速度，它以该速度进入含有微生物的悬浮液。因为液体使气体减慢速度，所以液体受到一种冲击，这造成将液体输送进管状膜3内部。另一种输送作用由于膜内部空间中形成的高气体含量而引起。由于所述气体含量在相应高的气体供应下比实际培养空间2中的高，形成了另一种输送作用(巨大的输送作用)。为此，在适宜大量的气体被引入膜组件的情况下，有可能省掉包含本发明装置的反应系统中的泵10。
通常将膜组件8置于离培养空间2尽可能近的地方，以便在培养空间和膜组件之间的没有引入氧气的进料管线13尽可能短，于是，仅使培养液中所含细胞经受非常短暂的非最适的气体供应条件。
图4表示贯穿膜组件的截面，所述膜组件可按照本发明用于将气体引入培养细胞用的培养液。图4中具体表示的截面来源于可商购的板式组件，称作Gambro LunDia：Alpha 600，Gambro MedizintechnikGmbH。膜材料是Cuprophan。膜的壁厚为8μm(干燥状态)，膜面积是1.3m2，每个组件的膜层数是70。按本发明操作过程中含有培养液和细胞的空间17的体积为100ml。
目前，这种膜组件只用于血液透析并且为该目的而制备，但没有用于培养细胞，特别是没有如图1和图2所示用于普通类型的反应系统，本文的图1和图2示意性地表示作为独立的单元设置的膜组件的情况。
在研究范围内，本发明人意外地发现，在特定的前提条件下，也可使用所述可商购的膜组件，如果因其面积/体积比和对氧气的渗透性系数而确保了对细胞而言充分的间接供氧的话。
为此，必须考虑下述几个因素，特别是必须测定对氧气的渗透性系数，但这可在本领域普通技术人员的能力范围内进行。例如，对化合物甘油的渗透性系数的测定描述于Mrkl，H.等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.(1993)39：48-52。
在作为实例在此提到的板式组件Gambro LunDia Alpha 600中，预定的构造可以保证极高的膜面积对体积的比值。
在LunDia Alpha 600的方案中，有效膜面积是1.3m2。有待氧气供应的空间的体积是100ml，于是面积/体积比为：
                 F/V＝13m2/l(LunDia)。
为进行比较，要论述如图2所示设置中使用的膜管的相应的面积/体积比。本例中，必须提供该管的内部空间。可利用的输送面积是圆柱状膜面积的周向表面积。例如，对直径为5mm的管的计算得到：
               F/V＝0.8m2/l(5mm管)。
对仅为1mm的管直径，得到如下的一个值：
                F/V＝4m2/l(1mm管)。
一个例举性的计算表明，利用膜组件LunDia Alpha 600实际上可能经由膜实现充分的间接供氧：
基于待供应的体积，氧气输送为：
                  S＝F/V★P★(c1-c2)平均。其中，F/V＝13m2/l。
P是渗透性系数。在我们的实验中，对一个Cuprophan类型的膜，当它在提到的膜组件中应用时测得所述系数为P＝0.066cm/min。该数值对厚度为20μm的膜是有效的(厚度是在干燥状态下测定的)。膜组件LunDia Alpha 600采用一种厚度为8μm的Cuprophan膜，从而实际的渗透性系数相当大而且上面给出的计算给出相当“低”的数值。
跨过膜的负浓度梯度(c1-c2)假定为：
                  (c1-c2)平均＝11.45mg/l。
该计算实例假定，氧含量为30mg/l的透析物从透析液容器1流到膜组件。此处假定，将纯氧引入该容器(纯氧的饱和浓度大约为32mg/l)。在膜组件中，将透析物稀释至4mg/l的浓度。透析物以所述浓度输送返回容器。于是，在透析物侧，预计到一个氧含量c1，该氧含量从30mg/l(组件入口)降低到4mg/l(组件出口)。培养物侧，氧含量应为c2＝1mg/l的常数值，它对生物体的生长来说是足够的。利用这些假定，
Figure A0081310500261
基于培养物体积，假定的数据给出如下的对供氧的数值：
                   S＝5.9g/(l★h)。
既然表示膜对氧气的渗透性的实际的渗透性系数实际上比计算中假定的数值0.066cm/min要大得多(这是由于仅为8μm的低的膜厚度)，膜中生物体悬浮液的供氧事实上将比此处由计算所指出的情况好。由此可以假定，经由膜对外部膜组件中的微生物的供氧在可视为“充分”的范围内，如果面积/体积比足够大并且膜具有良好的氧气渗透性的话。
术语“充分”是针对特定细胞的需要或者针对在培养容器2中提供的供应量而言的。例如，对大肠埃希氏菌的工业培养物而言，通常的数值在5-15g/(lh)的范围内。
由于有这些关系，本领域普通技术人员如果知道每种情况下使用的组件的氧气渗透性系数以及面积/体积比或者对其进行测定后，就有可能轻易地确定所述膜是否适合于本发明的应用。在膜组件不能确保所需的气体供应的情况下，可使用一种按照图3的膜组件，接着是间接供氧和直接供氧。
本发明人完全意外地认识到上述的关系，特别是将本来只是用于血液透析的系统用作普通反应系统中的一个独立的膜组件的可能性，所述普通反应系统中，如同关于图2进一步阐释的那样，将氧气引入透析液容器1，用该方式富集了的透析液输送足够的氧气以便提供给培养空间2和其中所含的细胞，并且在又一方面，以便特别是将氧气以充分而必要的方式提供给那些经过膜组件时氧气受到限制的细胞，以便细胞经过膜组件时培养液中可得到的细胞密度不受所述氧气限制的限制。尽管象开始时已经阐述过的那样，应用透析膜脱除毒性代谢产物是已知的，但人们不知道的是，使用适当的膜时，可能同时确保上述的氧气供应。因此，在本发明的装置和本发明的应用之间存在者一个关系，于是，待解决的问题是避免细胞经过膜组件时所述细胞的氧气限制。在本发明装置的情形中，这是通过优选向膜状膜的内部空间鼓入氧气而实现的；而在可商购的板式组件的本发明应用中，选择那些具有足够高的面积/体积比和足够高的氧气渗透性系数的组件，以便透析液容器1中的富含氧气的透析液可以经由透析膜释放所述氧气到经过膜组件的细胞。在这两种情形中，经过膜组件的细胞的氧气限制问题得到解决。
前述的图4中示意性表示的膜组件可用于普通的反应系统，例如，如图2中所表示的。
对于以各种实施方案实现本发明来说，上述说明书以及 书和附图中公开的本发明的特征(单独的和以任何需要的组合形式)，可能是必不可少的。
                      参考标号一览表
    1           透析液容器
    2           培养空间
    3           透析膜
    4           搅拌器(在培养空间中)
    5           供气管线
    6           排出空气管线
    7           气泡
    8           膜组件
    9           泵(用于透析液)
    10          泵(用于培养液)
    11          管线(用于透析液)
    12          管线(用于透析液)
    13          管线(用于培养物悬浮液)
    14          排放管线(用于培养物悬浮液)
    15          供应管线(用于管16)
    16          管
    17          培养液
    18          透析液
    19          支撑结构
    20          管线(至膜组件)
    21          供气管线
    22          排出空气管线
    23          搅拌器(在透析液容器中)

Claims (38)

1.一种利用一个反应系统培养细胞的方法，其中，所述反应系统包括一个透析液容器、一个用于培养细胞的空间和一个膜组件，所述膜组件使所述两个空间彼此连通并且该膜组件具有至少两个由一个膜隔开的空间，一种透析液流过其中一个空间而一种含有细胞的培养液流过其中第二个空间，并且将第一气体引入用于培养细胞的空间中的培养液，其特征在于，将第二气体引入膜组件中的培养液，而且所述膜功能上是一个透析膜。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，通过将第二气体直接引入膜组件中的培养液而将气体直接通入存在于膜组件中的培养液。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，通过将第二气体引入透析液容器中的透析液而且气体从那里经由膜组件的膜到达存在于膜组件中的培养液而将气体间接通入存在于膜组件中的培养液。
4.根据权利要求2或3的方法，其特征在于，将气体同时直接和间接地引入。
5.根据权利要求1至4任一项的方法，其特征在于，所述膜组件包括至少一个供气装置，并且所述供气装置向由膜隔开并且携带一种液体的空间中的至少一个空间提供第二气体。
6.根据权利要求5的方法，其特征在于，所述供气装置具有一个出口，该出口特别是位于携带培养液的膜组件空间。
7.根据权利要求5或6的方法，其特征在于，所述供气装置是一个管。
8.根据权利要求5至7任一项的方法，其特征在于，所述供气装置具有喷嘴的形状。
9.根据权利要求1至8任一项的方法，其特征在于，所述膜组件的膜由一种选自再生纤维素、聚酰胺、聚丙烯和聚砜的材料制成。
10.根据权利要求1至4和9的方法，其特征在于，所述膜组件是一种板式组件。
11.根据权利要求10的方法，其特征在于，所述膜组件的膜是一种透析膜。
12.根据权利要求11的方法，其特征在于，所述透析膜材料是铜纺。
13.根据权利要求1至12任一项的方法，其特征在于，所述膜组件由于其面积/体积比和其气体渗透性系数而为细胞提供充分的气体交换。
14.根据权利要求13的方法，其特征在于，所述面积/体积比是至少大约5平方米/升，特别是至少10平方米/升。
15.根据权利要求14的方法，其特征在于，所述面积/体积比是大约13平方米/升。
16.根据权利要求13至15任一项的方法，其特征在于，所述氧气渗透性系数是大约0.066厘米/分钟或更高。
17.根据权利要求1至16任一项的方法，其特征在于，所述透析液容器具有一个用于提供气体的装置和/或一个用于脱除气体的装置。
18.根据权利要求1至17任一项的方法，其特征在于，所述膜组件、所述用于培养细胞的空间和/或透析液容器具有升高的压力。
19.根据权利要求1至18任一项的方法，其特征在于，所述第一气体和第二气体各自相互独立地选自空气、氧气、氮气、二氧化碳及其混合物。
20.根据权利要求19的方法，其特征在于，所述第二气体是氧气。
21.根据权利要求19的方法，其特征在于，所述第二气体是二氧化碳。
22.根据权利要求1至21任一项的方法，其特征在于，所述细胞选自微生物细胞、真菌细胞、动物细胞和植物细胞。
23.根据权利要求22的方法，其特征在于，所述细胞是大肠埃希氏菌细胞。
24.一种膜组件，它包括至少两个由一个膜隔开的空间，每个空间有一种液体流过，一个空间中的液体是透析液而另一个空间中的液体是培养液，其特征在于，该膜组件包括至少一个供气装置而且在由膜隔开的这些空间中的至少一个空间中的供气装置具有一个出口。
25.根据权利要求24的膜组件，其特征在于，所述膜具有一个管的形状而且其容积形成两个空间之一。
26.根据权利要求25的膜组件，其特征在于，由所述管状膜形成的空间的直径是大约3至10毫米，优选6至8毫米。
27.根据权利要求25或26的膜组件，其特征在于，所述膜组件包括由一个管状膜形成的许多空间。
28.根据权利要求27的膜组件，其特征在于，一个供气装置出口位于由所述管状膜形成的空间中的至少一个空间。
29.根据权利要求24至28任一项的膜组件，其特征在于，所述供气装置出口位于由所述管状膜形成的空间之外的一个空间。
30.根据权利要求24至29任一项的膜组件，其特征在于，所述供气装置是一个管。
31.根据权利要求30的膜组件，其特征在于，所述管以同心的方式排列于所述空间。
32.根据权利要求30或31的膜组件，其特征在于，所述管的内径为0.2毫米至3毫米。
33.根据权利要求24至32任一项的膜组件，其特征在于，所述供气装置出口形状做得像一个喷嘴。
34.权利要求24至33任一项的膜组件作为膜组件在权利要求1至23任一项的方法中的用途。
35.一个用于培养细胞的反应系统，它包括一个透析液容器、一个用于培养细胞的空间和至少一个插于两者之间的膜组件，所述膜组件确保培养液经过该膜组件过程中充分的供气或者位于该膜组件中的培养液中的充分的气体交换。
36.根据权利要求35的反应系统，其特征在于，所述膜组件是如权利要求24至33任一项所述的膜组件。
37.根据权利要求35或36的反应系统，其特征在于，所述透析液容器包含至少一个气体引入装置。
38.根据权利要求35或37的反应系统，其特征在于，所述膜组件的膜具有这样一个气体渗透性系数，该系数足够高以便确保培养液经过该膜组件过程中充分的供气或者位于该膜组件中的培养液中的充分的气体交换，和/或具有一个适当高的面积/体积比以便确保培养液经过该膜组件过程中充分的供气或者位于该膜组件中的培养液中的充分的气体交换。
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