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CN1373800A - 一种进行液体的生物学改变的装置和方法 - Google Patents

一种进行液体的生物学改变的装置和方法 Download PDF

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CN1373800A
CN1373800A CN98808474A CN98808474A CN1373800A CN 1373800 A CN1373800 A CN 1373800A CN 98808474 A CN98808474 A CN 98808474A CN 98808474 A CN98808474 A CN 98808474A CN 1373800 A CN1373800 A CN 1373800A
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E·N·米特兰尼
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Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
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Abstract

一种进行液体的生物学改变的装置,特别是为了辅助或替代正常行使这种改变的器官的功能,它包含肝微器官培养物集合。本发明的装置优选地直接与患者相连接,以进行这种改变。

Description

一种进行液体的生物学改变的装置和方法
发明领域和背景
本发明涉及进行液体的生物学改变的装置和方法，更具体而言涉及辅助或替代正常进行液体的这种改变的器官的装置和方法。
体内的许多器官如肝脏改变液体如血液。肝脏是特别复杂的器官，因为它既充当滤器又充当活性代谢单位。作为滤器，肝脏从血液中去除毒性物质。另外，肝脏行使许多生物化学功能，如将氨解毒为尿素、胆红素代谢、糖原贮存、脂合成、药物代谢、清蛋白分泌和凝血因子分泌。因此，肝脏在体内具有许多重要的功能，这使其成为必需的。如果肝脏衰竭，身体将不能继续工作。
肝脏衰竭有许多原因，包括接触毒性物质、肝炎和遗传缺陷(Kasai等人，人造器官(Artif.Organs)，18：348-54，1994)。当前，70％的急性肝脏衰竭患者由于未得到治疗而死亡(Kasai等人，人造器官，18：348-54，1994)。另外，10-30％的患者在等待供者的肝脏器官时死亡(LePage等人，美国危急护理杂志(Am.J.Crit.Care)，3：224-7，1994；Sussman等人，人造器官，18：390-6，1994；以及Uchino和Matsushita，Asaio J.40：74-7；1994)。
一种能在肝脏衰竭期间暂时行使肝脏功能的护理生命支持装置叫做体外肝脏辅助装置(ELAD)。这种装置的发展和商品化由于许多原因明显地具有巨大的好处(Fox等人，美国胃肠病学杂志(Am.J.Gastroenterol)，88：1876-81，1993)。在美国一个ELAD每年使约2000名暴发性肝脏衰竭(FH)患者受益(Hoofnagle等人，肝脏病学(Hepatology)，21：240-52；1995)。它也能作为肝脏移植的桥梁用于等待供者器官的患者。
可运行数周的ELAD另外能使患者自己的肝脏恢复正常功能。因为在损伤的肝脏中不可能每个肝细胞都被破坏，两至三周的适当的肝脏支持能使存活的肝细胞种群恢复损伤的肝脏。在致死性肝脏疾病的动物模型中种群恢复肝脏只需要少于十二个的肝细胞(Sandgren等人，细胞(Cell)，66：245-56，1991)。90-95％肝脏坏死的患者应能够恢复足够的功能，仅在支持几天后即独立存活(Sussman等人，人造器官，18：390-6，1994)。
在提供这种ELAD的尝试中，发展了几个纯粹机械的、非生物学的血液处理装置。以最基本的形式，这些装置的目的是选择性地去除毒素，并且通过具有相对小的孔径的膜加入养分。HemocleanseTM发展了一种最先进的这类非生物学装置，并在最近得到FDA的批准。在使用HemocleanseTM装置的随机化的、控制的临床试验中，代谢物的去除是有限的，对血氨水平没有显著影响(Hughes等人，国际人造器官杂志(Int.J.Artif.Org.)，17：657-662，1994)。显然，肝脏功能是非常复杂的，现在不可能用一个单独的机械或化学装置替代它。
当前可获得的其它ELAD使用生物材料作为起点。例如，一种最常临床试验的ELAD使用转化的人无限增殖细胞系作为肝细胞样细胞的来源(Sussman等人，人造器官，18：390-6，1994)。该装置的最初试验在“未经批准的医学装置的紧急应用”或“研究性装置豁免”下进行。未测定效能，但除可用药物治疗处理的凝血之外未观察到严重不利的副作用。尽管由于无限增殖的人细胞系提供可增加的细胞来源因而其应用是便利的，但仍存在为什么它不是理想的两个主要原因。首先，在临床实践中使用无限增殖细胞系有明显的安全性和调控上的顾虑。其次，特别是在工业规模放大后，预期无限增殖细胞不能保留原代肝细胞的所有正常生理特征(Sussman等人，人造器官，18：90-6，1994)。
获得肝细胞来源用于ELAD的第二种普通方法是从完整肝脏中分离肝脏细胞或组织。在以前的尝试中，通常使用酶如破坏肝脏正常微结构的胶原酶使肝脏的细胞分离。某些尝试曾使用肝脏切片，但没有为了最佳组织维持所必需的适当的表面积体积比而设计这些切片的形状(Lie等人，实验医学研究(Res Exp Med(Berl))185：483-94，1985)。
当前的一个局限性是培养哺乳动物肝细胞的现有方法提供使细胞聚集为组织的条件的能力，这种组织模拟完整生物体中实际组织的立体三维形式。由于相似的原因，常规的组织培养方法限制了培养的组织表达高度功能性特化或分化状态的能力，这种能力被认为对于哺乳动物细胞的分化和用于研究及药物目的的特化生物活性分子的分泌是关键的。不象微生物，高等生物如哺乳动物的细胞自身形成高度有序的多细胞组织。尽管这种自我装配的确切机制还不清楚，但在迄今研究的情况中，已发现细胞发育为组织依赖于细胞与细胞之间或与其它锚定底物之间的细胞的定向和/或某种物质如激素的存在或不存在。总之，至今用于器官辅助装置的常规培养方法不能在体外实现细胞的适当功能的同时维持关键的细胞/细胞/底物相互作用和适当的微环境，以允许构建体内器官组织结构和功能的出色模型。
在肝脏中，与血管结构相符的不同细胞群和基质成分的独特相邻产生精巧的生态系统。因此肝细胞的标准细胞培养物不可能行使甚至最少的肝功能。如前所述，高等生物如哺乳动物的细胞自身形成高度有序的多细胞组织。细胞与非细胞底物(基质)间物理接触的一个实例是上皮细胞与其基底层间的物理接触。一个细胞与另一个细胞间功能性接触的实例包括细胞间的电或化学通讯。例如，心肌细胞通过电脉冲与其它心肌细胞通讯。另外，许多细胞通过化学信息如激素与其它细胞通讯，激素可局部扩散(旁分泌信号传导和自分泌信号传导)，或由血管系统运送至更远的位置(内分泌信号传导)。细胞间旁分泌信号传导的实例是消化道的多种细胞(称为肠内分泌细胞)如分泌促生长素抑制素的幽门D细胞所产生的信息，促生长素抑制素随后抑制附近的幽门胃泌素(G)细胞释放胃泌素。
对于器官的组织外植块在如不含外源血清或生长因子的基本培养基中的维持，微结构是非常重要的，因为在这种基本培养基中微器官内特异细胞相互作用产生的旁分泌和自分泌因子能维持肝组织。
美国专利申请系列号08/482,364中描述了这种微器官培养物的制备，在此引入作为参考。在微器官培养物的制备中，从肝脏分离组成外植块的细胞群，所采用的方式保持了一个细胞对另一个细胞的天然亲和力，例如，保持了对器官自身中存在的不同细胞的亲和力。例如，在皮肤微器官培养物中，表皮的角质细胞与基质保持结合，并保持正常的组织结构包括毛囊和腺体。这种基本结构对于例如包含一种上皮成分的所有器官是共同的。而且，这种结合有利于细胞间的通讯。这在分化的细胞中是特别重要的，其中诱导被定义为一个组织或细胞(诱导的)与另一个(应答的)组织或细胞间的相互作用，因此应答的细胞经历分化方向的改变。此外，诱导性相互作用发生于胚胎和成熟细胞中，并能用来建立和维持形态发生模式以及诱导分化(Gurdon等人，细胞，68：185-199，1992)。
此外，根据美国专利申请系列号08/482,364制备的微器官培养物，甚至在培养延长的一段时间后仍保持正常的肝结构。因为这些培养物能在受控制的和相同的条件下维持，并仍非常类似于体内组织，所以它们在体外提供功能性肝细胞的独特连续来源。
不幸地，现有技术中的器官辅助装置或现有技术中的相关装置没有一个使用微器官培养物来进行液体的生物学改变。
因此，本领域中明确地需要一种进行液体的生物学改变的装置和方法，特别是用于辅助或替代患者的衰竭器官，该装置能行使此器官的功能，其包括一种微器官培养物。
发明概述
根据本发明，提供了一种进行液体的生物学改变的装置，该装置包括：(a)一种腔，其具有一个用于液体进入的入口和一个用于液体流出的出口；和(b)进行液体的生物学改变的器官的微器官培养物集合，集合中的每一单个微器官培养物包含细胞并具有尺寸，以使在单个微器官培养物中定位最深的细胞与单个微器官培养物的最近表面距离至少约150微米并且不超过约225微米，由此在每一单个微器官培养物内维持器官单位(例如肝脏的腺泡单位)的体内器官结构，微器官培养物集合位于腔内，并且微器官培养物集合可与至少一部分流经该腔的液体接触。
当在此使用时，术语“MC”指微器官培养物。
优选地，该器官是肝脏。同样优选地，微器官培养物集合包含来源于该器官的细胞，以便保持细胞之间的细胞间接触。最优选地，每个微器官培养物集合特征在于至少约2.6mm-1的Aleph。
根据本发明的优选实施方案，基本用生物相容的多聚体片层封装微器官培养物，该片层基本位于腔内。优选地，该片层具有约30cm到约90cm的第一种尺寸、约30cm到约80cm的第二种尺寸和约300微米到约900微米的第三种尺寸。同样优选地，以基本平行的方向将多个片层加入腔内，以使液体在片层之间自由流动。
根据本发明的另一种实施方案，提供了一种进行患者液体的生物学改变的装置，包括：(a)一种腔，其具有一个用于液体进入的入口和一个用于液体流出的出口；(b)进行液体的生物学改变的微器官培养物集合，集合中的每一单个微器官培养物包含细胞并具有尺寸，以使在单个微器官培养物中定位最深的细胞与单个微器官培养物的最近表面距离至少约150微米并且不超过约225微米，由此在每一单个微器官培养物内维持器官单位的体内器官结构，微器官培养物集合位于腔内，并且微器官培养物集合与至少一部分流经该腔的液体接触；(c)具有第一个和第二个末端的第一种管，第一个末端用于连接患者以接受患者的液体，第二个末端连接入口；以及(d)具有第一个和第二个末端的第二种管，第一个末端用于连接出口，第二个末端用于连接患者，以便在生物学改变后使液体返回患者。
根据本发明的另一种实施方案，提供了一种对来自患者的液体进行生物学改变的方法，该方法包括用患者的液体灌注包含微器官培养物集合的腔的步骤，以便微器官培养物集合进行液体的生物学改变，其中集合的每一单个微器官培养物包含细胞并且具有尺寸，以使在单个微器官培养物中定位最深的细胞与单个微器官培养物的最近表面距离至少约150微米并且不超过约225微米，由此在每一单个微器官培养物内保持器官单位的体内器官结构。
根据本发明的又一种实施方案，提供了一种制备连续平面器官的方法。该方法包括步骤(a)获得器官的单个微器官培养物集合，以使集合中的每一单个微器官培养物包含细胞并且具有尺寸，以使在单个微器官培养物中定位最深的细胞与单个微器官培养物的最近表面距离至少约150微米并且不超过约225微米，由此在每一单个微器官培养物内保持器官单位的体内器官结构；和(b)将来源于该器官的细胞悬液加入(例如涂层于)微器官培养物中，在微器官培养物集合存在下共培养细胞悬液，以使由来源于微器官培养物的细胞和悬液中细胞的混合物形成连续平面器官。
根据本发明的一种优选实施方案，在肝微器官培养物集合存在下通过培养肝细胞形成的连续肝平面器官内提供了肝微器官培养物集合，以使由来源于微器官培养物的细胞和肝细胞的混合物形成连续肝平面器官。
根据本发明的又一种实施方案，提供了一种制备连续肝平面器官的方法。该方法包括步骤(a)获得单个肝微器官培养物集合，以使集合的每一单个微器官培养物包含肝细胞并且具有尺寸，以使在单个微器官培养物中定位最深的细胞与单个微器官培养物的最近表面距离至少约150微米并且不超过约225微米，由此在每一单个微器官培养物内保持腺泡单位的体内肝结构；和(b)将肝细胞悬液加入(例如涂层于)微器官培养物中，在肝微器官培养物集合的存在下共同培养细胞悬液，以使由来源于微器官培养物的细胞和肝细胞的混合物形成连续平面肝器官。
本发明的其它特征在以下描述。
附图简述
在此仅以举例的方式、参照附图描述本发明，其中：
图1A-1D是用于容纳代谢活性微器官培养物的示范性生物反应器的示意图；
图2A和2B是微器官培养物的免疫隔离室的示意图；
图3A-3C是本发明的第二种生物反应器的示意图；
图4是示范性操作线路的示意图，其用于应用图1或图3所示生物反应器的装置；
图5显示在几种微器官培养物中细胞增殖的测定；
图6显示微器官培养物中小鼠肝细胞产生的清蛋白的测定；
图7显示在小鼠肝微器官培养物中由氨向尿素的转化；
图8显示人微器官肝培养物在很长一段时间内将大量氨转化为尿素；
图9显示人肝微器官培养物有代谢活性；
图10显示冻藏的微器官肝培养物在37℃生长时仍具功能性；
图11显示冻藏的人微器官肝培养物在37℃生长时仍具功能性；
图12显示当被封装于藻酸盐片层时小鼠肝微器官培养物仍有代谢活性；
图13显示在100％胎牛血清中培养时小鼠肝微器官培养物仍具功能性；
图14A和图14B显示当被封装于藻酸盐片层、冷冻、然后解冻时，大鼠肝微器官培养物仍有代谢活性；
图15显示正常大鼠能安全地连接于本发明装置的一个实例；以及
图16显示小鼠肝微器官培养物的最佳厚度是450微米。
优选实施方案描述
本发明是关于一种进行液体的生物学改变的装置，特别是为了辅助或替代正常行使这种改变的器官的功能。在此使用时，短语“液体的生物学改变”指液体的生物学成分的改变，这是通过在血液中正常进行这种体内改变的器官分泌、吸收或由于发挥催化活性的结果，使生物学成分定期地引入液体、从液体中去除或在液体内改变。本发明的装置优选地直接连接于这些患者，以进行患者液体的这种改变。在此使用时，术语“患者”指本发明的装置所连接的人或低等动物，或对其施行本发明方法的人或低等动物。
本发明的装置包括来源于希望增强功能的组织的微器官培养物。待生物学改变的液体如全血或血浆进入本发明的装置，并与微器官培养物相联系。于是微器官培养物生物学改变该液体。例如，使用肝微器官培养物能增强解毒和肝脏的其它生物学活性。
此外，显然根据微器官培养物的组织来源，能增强其它器官的功能。例如，使用胰微器官培养物能增强用于胰岛素或胰高血糖素产生的旁分泌功能。类似地，能使用前叶垂体腺微器官培养物增加调节甲状腺、生殖腺、肾上腺皮质和其它内分泌器官适当功能的激素的产量，后叶垂体腺微器官培养物能用来增加具有抗利尿和催产作用的激素的产量。
如以下进一步详述的，这些微器官培养物的应用的一个显著特征是保持了原始器官细胞微结构。本发明的装置部分地基于这一发现，即在指定的环境下，器官外植块的不同组织层如间充质和上皮层中细胞的生长可以被激活，以在培养中增殖、分化和发挥作用。在此使用时，术语“外植块”指从器官中取出的组织。
此外，外植块自身具有细胞-细胞和细胞-基质的相互作用足以支持细胞的稳态，由此使器官的微结构和功能维持延长的一段时间。在此使用时，术语“稳态”被定义为细胞增殖和细胞损失间的平衡。
细胞稳态的保障维持了例如在来源器官中存在的细胞-细胞和细胞-基质的自然相互作用。因此，细胞与细胞之间或与其它锚定底物之间的细胞定向，以及调节物质如激素的存在与否，允许来源器官的生物化学和生物学活性适当地保持。而且，能在培养中将微器官培养物维持相对长的一段时间，优选地至少约24小时，而没有明显的坏死，尽管一般至少培养48天或更长。
尽管能使用本发明的装置来辅助或替代生物学改变液体的任何器官的功能，但为了说明的目的以下讨论完全集中于肝脏。用于微器官培养物的外植块的来源
为了在本发明的装置中使用而能从中分离肝微器官培养物的动物的实例包括：人和其它灵长类、猪如完全或部分近交的猪(例如小型猪和转基因猪)、啮齿类动物，等等。在一种优选的实施方案中，肝组织的来源可以是同种异体的肝组织，如不适合移植但仍包含活肝细胞的人肝脏小叶。
在另一种优选的实施方案中，一种更可靠的来源是异种的来源，包括但不限于母牛、山羊或优选地猪的肝脏。尽管长期接触异种抗原将导致免疫学反应，但在短期内在最初的临床经验中免疫应答不是问题，因为患者的血细胞被阻止与肝微器官培养物接触。生长介质
存在大量的组织培养基用于培养来源于动物的细胞。其中一些是复杂的一些是简单的。尽管预期肝微器官培养物可在复杂培养基中生长，但美国专利申请系列号08/482,364显示，在简单培养基如Dulbecco基本必需培养基中能维持培养物。此外，尽管培养物可生长于含血清或其它生物提取物如垂体提取物的培养基中，但美国专利申请系列号08/482,364显示，血清和其它任何生物提取物都不是必需的。而且，在不含血清的情况下能将器官培养物维持延长的一段时间。在本发明的优选实施方案中，在体外培养物的维持过程中培养基中不包含生长因子。
关于在基本培养基中生长的观点是重要的。目前，用于哺乳动物细胞延长生长的大多数培养基或系统掺入了不确定的蛋白质，或者使用饲养细胞提供维持这种生长所必需的蛋白质。因为这种不确定蛋白质的存在可干扰患者肝微器官培养物的预期最终用途，通常希望在使不确定蛋白质的存在减至最小的条件下培养外植块。
在此使用时，术语“基本培养基”指化学确定的培养基，其仅包含细胞在培养中生存和增殖所需的养分。一般地，基本培养基不含生物提取物，例如生长因子、血清、垂体提取物或其它支持细胞群在培养中生存和增殖所不需要的物质。例如，基本培养基通常包含至少一种氨基酸、至少一种维生素、至少一种盐、至少一种抗生素、至少一种指示剂如用来确定氢离子浓度的酚红、葡萄糖和至少一种抗生素，以及细胞的生存和增殖必需的其它多种成分。基本培养基是不含血清的。多种基本培养基可从Gibco BRL，Gaithersburg，MD购得，作为基本必需培养基。
然而，尽管生长因子和调节因子不必加入培养基中，但这些因子的加入或其它特化细胞的接种可用来增强、改变或调节培养物中的增殖和细胞成熟。多种生长因子可影响培养中细胞的生长和活性，如胰岛素、生长激素、生长调节素、集落刺激因子、促红细胞生成素、表皮生长因子、肝红细胞生成因子(hepatopoietin)和肝细胞生长因子。调节增殖和/或分化的其它因子包括前列腺素、白细胞介素和天然发生的负生长因子、成纤维细胞生长因子和转化生长因子-β家族的成员。培养容器
微器官培养物可在任何合适的培养容器中维持，并可在37℃5％CO2中维持。可振摇培养物以改善通气。
至于其中优选地具有微器官培养物的培养容器，应当指出在一种优选的实施方案中，这种培养容器通常可以是任何材料和/或任何形状的。可使用许多不同的材料制成该容器，包括但不限于：尼龙(聚酰胺)、涤纶(聚酯)、聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯化合物(如聚氯乙烯)、聚碳酸酯(PVC)、聚四氟乙烯(PTFE，特氟隆)、thermanox(TPX)、硝化纤维素、棉花、聚羟基乙酸(PGA)、肠线缝合线、纤维素、明胶、葡聚糖，等等。任何这些材料可编织成孔网。
当培养物要长期维持或冻藏时，不可降解的材料如尼龙、涤纶、聚苯乙烯、聚丙烯酸酯、聚乙烯、特氟隆、棉花等等是优选的。根据本发明能使用的一种便利的尼龙网是Nitex，它是具有210mm平均孔径和90mm平均尼龙纤维直径的一种尼龙滤网(#3-210/36，Tetko，Inc.，纽约)。外植块的尺寸
除分离保持原始组织的细胞-细胞、细胞-基体和细胞-基质结构的外植块以外，外植块的尺寸对于其中细胞的生存力是重要的，例如，当打算将微器官培养物维持延长的一段时间如7-21天或更长时。
因此，选择组织外植块的尺寸，以使适当的养分和气体如氧气扩散至三维微器官中的每一个细胞，以及使细胞废物扩散至外植块外，以便将由于微器官中废物的局部化引起的细胞毒性和伴随死亡减至最小。因此，根据无特化输运结构或合成底物存在下每个细胞可接近的最低水平的需要来确定外植块的尺寸。
如美国专利申请系列号08/482,364所述，已发现如果表面积体积比指数降至一定范围内则能维持这种可接近性。
所选表面积体积比指数的范围使细胞通过有些类似于单层细胞的扩散方式而接近养分并进入废物处理途径。如果表面积体积比指数，在此称为“Aleph或Aleph指数”，至少约2.6mm-1，那么能达到并保持这种可接近性的水平。在确定表面积体积比指数中忽视第三种尺寸，因为在第三种尺寸的变化引起体积和表面积的比例变化。然而，当确定Aleph时，a和x应当被定义为组织切片的两个最小尺寸。
在此使用时，“Aleph”指通过公式1/x+1/a得出的表面积体积比指数，其中x＝组织厚度，a＝组织宽度，单位为mm。在优选的实施方案中，外植块的Aleph在约2.7mm-1到约25mm-1的范围内，更优选地在约2.7mm-1到约15mm-1的范围内，甚至更优选地在约2.7mm-1到约10mm-1的范围内。
表1提供了Aleph的实例，其中，例如厚度(x)为0.1mm宽度(a)为1mm的组织具有11mm-1的Aleph指数。
表1：表面积体积比指数“Aleph”的不同值，为a(宽度)和x(厚度)的函数，单位为mm-1
x(mm)                     Aleph的值
 a＝1  a＝2  a＝3  a＝4  a＝5
 0.1  11  10.51  10.33  10.2  10.2
 0.2  6  5.5  5.33  5.25  5.2
 0.3  4.3  3.83  3.67  3.58  3.53
 0.4  3.5  3  2.83  2.75  2.7
 0.5  3  2.5  2.33  2.25  2.2
 0.6  2.66  2.16  2  1.91  1.87
 0.7  2.4  1.92  1.76  1.68  1.63
 0.8  2.25  1.75  1.58  1.5  1.45
 0.9  2.11  1.61  1.44  1.36  1.31
 1.0  2  1.5  1.33  1.25  1.2
 1.2  1.83  1.3  1.16  1.08  1.03
 1.3  1.77  1.26  1.1  1.02  0.96
 1.6  1.625  1.13  0.96  0.88  0.83
 2.0  1.5  1  0.83  0.75  0.7
因此，例如，在单个微器官培养物或外植块中定位最深的细胞与单个微器官培养物的最近表面距离至少约150微米并且不超过约225微米，由此保持体内结构，而同时确保没有细胞距离气体和养分来源大于约225微米。
一个世纪以来，认为肝脏的基本结构和功能单位是小叶，它是一个直径约700微米、长约2mm的多边形的单位。五十年代以来，公认一种称为腺泡的更小单位是肝脏中的基本结构和功能单位。腺泡是大概卵球形的实质细胞的集群，排列于终动脉、小静脉和从门管区横向分支的胆管周围。在腺泡的任一端是被称为终端肝小静脉的血管(在旧的小叶命名法中该血管被称为中央静脉)。腺泡是约300-450微米较小尺寸的小单位，它包括两个相邻的经典小叶的部分。应当指出，自从该发现以来，已知腺泡是肝脏的最小结构和功能单位，并且也确定了任何肝细胞与气体和养分来源的最大距离。因此，用腺泡说明的肝脏的微结构确定，肝脏内没有细胞距离养分来源超过约150-225微米。实际上，对于任何其它身体器官这都是事实，因为显然约150-225微米确定了气体和养分有效扩散的上限。在任何组织学教科书中均能发现腺泡结构和功能的其它描述性数据。例如，《组织学教科书》，Bloom和Fawcett编，第12版，Chatman和Hall，纽约-伦敦，1994，652-656页。
不受任何特殊理论所限，三维培养系统提供的许多因素可助于其成功。
首先，外植块尺寸的适当选择，例如通过以上Aleph计算的应用，提供适当的表面积体积比，使养分向外植块所有细胞充分扩散，以及细胞废物向外植块中所有细胞外充分扩散。
其次，由于外植块的三维度，多种细胞持续活跃地生长，这与单层培养的细胞相反，后者生长至汇合，显示接触抑制，且停止生长和分裂。外植块通过复制细胞的生长和调节因子的作用可部分地担负刺激培养中的细胞增殖及调节其分化，例如，甚至对于总体积为静态的微器官培养物也如此。
第三，外植块的三维基质保留了细胞元件的空间分布，这十分近似于在体内对应器官中所发现的。
第四，细胞-细胞和细胞-基质的相互作用可允许有助于细胞成熟的局部微环境的建立。已认识到分化的细胞表型的维持不仅需要生长/分化因子，而且需要适当的细胞相互作用。本发明有效地模拟了组织微环境。肝微器官培养物的生物学活性
相信本发明的装置包含的肝微器官培养物能行使所有种类的“肝脏特异性”生物学功能。示范性功能包括进行氨和尿素代谢以及清蛋白产生的能力。对将用于肝脏辅助装置(LAD)的细胞，这些肝脏特异性生物学功能是特别重要的。
为了以相对短期的LADS形式支持患者，如暴发性肝衰竭(FHF)患者、等待肝脏移植的患者或无功能的肝脏移植患者，上述肝脏特异的生物学功能相信是十分重要的。然而，尽管以上所述，仍可以有同等重要的或更加重要的其它功能。用其它方法(如通过葡萄糖的供应和葡萄糖水平的监测)可提供其它功能性不足，或者其不需要密切关注(例如，胆汁酸或胆色素产生的结合，或药物代谢活性)。
“足以支持”患有肝衰竭或机能不全患者的肝脏特异生物学活性的水平，将产生正常或接近正常水平的血清蛋白质、氨向尿素的转化、凝固因子、氨基酸和其它肝脏中产生的或肝脏代谢的代谢物。
可生物化学测定或根据患者临床状况的好转确定这些改善。这些不同的分子、代谢和临床参数和产物以及其浓度或水平的生理学和病理学范围在本领域中众所周知，并在例如Zakim和Boyer的《肝脏病学：肝脏疾病教科书》，W.B.Saunders Company；Harcourt，Brace，JovanovichInc.，费城、伦敦、多伦多、蒙特利尔、悉尼、东京(1990)中有描述，该书在此引入作为参考。微器官培养物的贮存
优选地制备用作本发明一部分的微器官培养物，例如在10％DMSO(二甲亚砜)和20％血清存在下通过将其逐渐冷冻而冻藏，并贮存于-160℃待用。在一种优选实施方案中，将肝微培养物封装于一种半透性基质如藻酸盐的片层内，如图2B所示，并例如在标准培养基如含10％DMSO和20％血清的Ham’s F12存在下通过将其逐渐冷冻而冻藏。然后将冷冻的片层贮存于-160℃。作为一个实例，能将包含微器官培养物的平面片层插入无菌的合成塑料袋中，该塑料袋的所有侧面密封并且具有非常类似于该片层的尺寸。该塑料袋包括一个在袋的一端的塑料管状入口和一个在相对端的塑料管状出口。然后用标准培养基如含10％DMSO和20％血清的Ham’s F12灌注这种包含具有微器官培养物的平面片层的塑料袋，逐渐冷冻并贮存于-160℃。
当需要时，解冻冷冻的片层或冷冻的微器官培养物，并装配入本发明的装置，优选地就地装配，然后与系统连接。微器官培养物形成连续人造平面器官的应用
本发明基于如下发现，如果保持器官的微结构，并选择条件(如其尺寸)以确保所有细胞都在与气体和养分来源的合理距离内，那么细胞能离体地起作用，与其在体内类似。
在以下实施例部分(见实施例13)描述的实验显示肝MC培养物的行为为厚度的函数。根据当将外源基因转导入离体培养物时，由肝MC培养物表达此外源基因的能力确定功能。清楚地显示450微米厚的MC得出最佳结果。培养物的组织学检查证实了该数据。
因此，能把根据本发明的MC片层看作平面器官，每个片层基本代表一个解旋的器官。当从体内取出时，正常成熟器官缺乏系统支持和为器官中每个细胞提供充分的养分和气体交换所需的循环。另一方面，在此描述的离体的平面器官确保(i)保持器官结构，尽管是平面构型，而同时(ii)在器官中没有细胞距离养分来源超过约150-225微米。
根据本发明的另一实施方案，制备一种连续的平面器官，并用来实行根据本发明的方法和装置。
如下制备连续的平面器官。将如述制备的单个微器官集合用作饲养或底物层，以支持或维持来源于相同器官但在悬液中生长的细胞。因此饲养层给悬液细胞提供了一个表面，细胞可粘附于其上、增殖和行使其生物学功能。来源于粘附细胞的细胞与单个MC的集合一起，最后产生平面器官的粘附的和连续的片层。例如，通过协同培养单个肝微器官培养物集合和肝细胞，制备一种连续的肝平面器官。
因此，连续的平面器官构成了一种重新改造的粘附器官，其中保持基本的器官微结构。由于其平面尺寸，根据本发明的连续平面器官确保没有细胞距离养分来源超过约150-225微米，由此消除了对循环的需要。
应当理解，使用单层细胞作为饲养或底物层，使其它细胞型能在其上生长不是一个新的概念，在过去曾广泛和成功地使用过。
然而，使用微器官集合作为饲养或底物层或者尤其是作为一种“饲养器官”却是一个新的概念，并且具有几个优点，主要是给在饲养器官上生长的细胞提供非常复杂的底物的事实，这种底物更类似于当细胞在体内增殖时所遇到的底物。
参照以下给出的实施例、阐述和附图能更好地理解本发明的装置和方法。现在参看附图，图1A-1C显示一种适合本发明的装置使用的生物反应器。生物反应器2是一个腔4，具有一个灌注入口6和一个灌注出口24，其中间限定了液体的流动路径。液体通过入口6流入，如箭头8所示，并通过出口24流出，如箭头10所示。优选地，至少一个、优选地多个灌注室18被置于腔4的流动路径中。每个室18由至少一个、优选地多个多孔膜19所围成。每个室18包括至少一个、优选地集合的微器官培养物20，如肝微器官培养物。有一个或多个托架16附着于固定夹板14，或在腔4的液体路径中支持灌注室18的其它固定装置。优选地，导流板22在腔4内导流。腔4内的液流方向以箭头指示。同样优选地，包括一种返回器21，用于将微器官培养物集合20的至少一种产物返回患者(未显示)。
在图1A-1C所述的实施方案中，每个灌注室18的流动路径和压力基本上是相同的。因此，简单界面扩散原则如浓度梯度、布朗运动等等限制了通过多孔膜19向室18中的扩散。当这种扩散不足时，可增加液体向腔4中的液体渗透速度，例如通过应用跨过室18的压差。例如，图1D显示图1A的生物反应器2，它被改装以在腔4中提供两个独立的流动路径，“液体”室4A和“滤液”室4B，仅通过灌注室18并因此通过微器官培养物集合20发生液体联系。在说明的生物反应器2中，例如，通过如使用阀门限制液体出口24A的下游流速，能形成跨过灌注室18的压差。正压差(P液体-P滤液)将形成从液体室4A向滤液室4B的液体流，允许液体通过腔4以与微器官培养物集合20联系，并因而被其生物学改变。通常，优选地在返回患者之前将滤液室4B的输出物24B与液体室4A的输出物24A再混合。
构成微器官灌注室的合适的基质材料包括聚酰胺，包括尼龙如聚己内酰胺和聚己二酸亚己基酯、聚酰胺-二酰亚胺、聚碳酸酯、聚丙烯酸酯包括聚甲基丙烯酸甲酯和聚乙基丙烯酸甲酯和聚苯乙烯。对于某些应用，合适的基质材料也可以是不同类型的角蛋白(丝、毛、发)、胶原蛋白、聚烯烃如聚乙烯、聚丙烯和聚丁烯、聚酯如聚对苯二甲酸乙二醇酯和聚己二酸亚乙基酯、聚尿烷如聚尿烷酯和聚尿烷醚、玻璃包括玻璃纤维、不锈钢、聚硅氧烷、有机聚硅氧烷和石墨及其组合。角蛋白基质是角蛋白、含角蛋白或类似角蛋白的。其它材料在本领域中已知。见，例如，美国专利5,344,454；美国专利号4,883,666；美国专利号4,892,538和5,106,627；美国专利号4,391,909；和美国专利号4,353,888。
优选地，将微器官培养物集合20封装于半透性的基质中形成一个隔离的腔，例如可以由本领域已知的多种半透性材料构成。薄膜等允许在微器官培养物与所处理的液体之间的养分和必需的小分子包括氧、葡萄糖和激素通过，但不允许免疫系统的介质通过，如白细胞和如需要时的抗体。在此使用时，术语“颗粒”包括分子、细胞和蛋白质。
更具体而言，当微器官培养物来源于另一个动物种时(即，相对于被治疗的患者是异种的)，孔径必须足以阻止来自宿主的炎症细胞和分子免疫原性因子两者通过它进入植入物的组织腔。在本说明书中使用时，“分子免疫原性因子”指如抗体和补体的分子。足以阻止人的炎症细胞和分子免疫原性因子两者通过的孔径处于约0.015微米的范围内。当微器官培养物来源于相同动物种但具有不同遗传组成时(即同种异体)，孔径通常必须足以仅阻止来自宿主的炎症细胞通过它进入植入物细胞腔。足以阻止人的炎症细胞通过的孔径处于低于约0.8微米的范围内。在大多数实施方案中，希望在免疫隔离室中提供的微器官培养物，例如选择孔径和膜厚度以提供约40,000Da到约250,000Da的分子量(MW)截断值，以使能通过的分子具有低于约40,000Da到约250,000Da的分子量。
作为这种免疫隔离室的一种说明性实施方案，图2A显示至少一个、优选地集合的微器官培养物26，其被置于由两个相对的半透膜片层30所构成的免疫隔离室28中。微器官培养物集合26置于两个膜片层30之间，或如下所示直接封装于膜片层中(图2B)。例如通过螺丝34将相对的夹板32固定在一起，以便每个夹板32内面凸起的脊36能在微器官培养物26周围形成基本上不透液体的密封。另外和优选地，代替夹板32，能用胶、热、超声粘接或本领域适合的其它密封技术密封膜片层30的边缘。
更优选地，将微器官培养物集合26直接封装于规定尺寸的平面藻酸盐片层中。这种构造显示于图2B中，具有多个平面藻酸盐片层38。作为一个实例，可制备具有约40cm的第一种尺寸、约60cm的第二种尺寸和约350微米的第三种尺寸的平面藻酸盐片层。每个这种片层包含约1-2×1010个细胞。因此，为了获得约相同数量的细胞作为人肝脏，例如，需要的片层数量将在约4个到约10个片层的范围内。
显然，患者生物反应器的液体/滤液实施方案的其它构型能用于多种灌注室系统。也可用上述片层构型之一的方式使用这些构型。
例如，图3A-3C说明了一种基本柱体40，它能与其它柱体40串接，形成含多个灌注腔的生物反应器(未显示)。在示范性实施方案中，微器官培养物集合20被置于灌注室18中。通过将灌注室18夹于两个基板42和44之间，其间至少配备一个隔板46，在灌注室18的相对的两侧可形成一个液体室48和一个滤液室50。在操作中，通过至少一个、优选地多个液体入口52进入的液体，能流经液体室48，从而沿灌注室18的通透性表面流动，经至少一个、优选地多个液体管54流出液体室48，液体管54是穿过灌注室18的横向连接的孔。液体管54提供的液体然后经至少一个、优选地多个液体出口56流出柱体40，出口56不允许与滤液室50中的任何液体接触。进入至少一个、优选地多个滤液入口58的滤出液，以相似的方式直接与至少一个、优选地多个滤液管60联系，而不接触液体室48中的任何其它液体。
然而，滤液管60向滤液室50中释放滤出液，在其中直接接触灌注室18的另一个(通透性)表面。透析液经至少一个、优选地多个滤液出口62流出室50。从本描述中明显地看出，从液体室48流出的液体也能透过灌注室18，被微器官培养物集合20作用，并作为代谢衍生物返回滤液室50。
实际上，通过将两个相邻柱体的第二个旋转180°能串联排列柱体40，以使第二个柱体40的液体入口52和滤液入口58分别对准第一个柱体40的液体出口56和滤液出口63。重复该装配能提供许多顺序连接的柱体40，其实际上具有中间排列有多个微器官培养物的一个液体腔和一个滤液腔。通过加盖，或用其它方式密封该系列的第一个柱体40的滤液入口，滤液室提供的液体流是从灌注腔流出的处理后液体的产物。
图4进一步说明了图1-3的上述生物反应器2在本发明的装置中的应用。为了便于理解，按照应用肝微器官培养物的肝脏辅助装置(ELAD)描述了该优选实施方案。然而，如上所述，用本发明的装置能进行其它的器官增强。
图4显示本发明的装置的另一种实施方案，其优选地包括图1D、2B或3A-3C的生物反应器2。该实施方案仅准备作为实例，而不意在限制。也列出了该实施方案的使用方法。
显示了动脉管64，通过它从患者的双腔静脉导管(或类似物)输送血液。优选地例如通过蠕动泵66控制流入ELAD系统的血流。优选地用注射器68将一种抗凝剂如肝素等输送至动脉管64中。也可向血液中加入尿素、凝血因子、其它肝细胞衍生的蛋白质或转化产物等等。血液进入动脉滴注腔70，在其中监测前置柱压力(PI)。血液流出滴注腔70进入生物反应器2，以致用患者的血液灌注生物反应器2(它是包含微器官培养物集合的腔)。如果希望，可在滴注腔70和生物反应器2之间放置一个滤器或类似物(例如，可商品获得的1mm滤网)以防止装置堵塞。生物反应器2具有一个入口管状装置72，从动脉管64流出的含或不含抗凝剂的血液被输送至该装置中。生物反应器2，特别是其中包含的微器官培养物集合处理该血液。
在通过生物反应器2的过程中，优选地大小为约10,000Da到约250,000Da、最优选地为约60,000Da到约80,000Da的分子能穿过免疫隔离膜扩散，并接触微器官培养物。血液中没有细胞物质直接与微器官培养物接触。低于分子量截断值的小分子和蛋白质流回至血液中。
生物反应器2将处理的(例如改变的或解毒的)血液输送至可以是血气检测器一部分的静脉滴注腔74中，并输送至静脉管76。另外，该系统能监测滴注腔74中的压力，这是静脉压(Pv)。因此，能计算出柱压力(PI-Pv)。
通过微器官培养物，优选地同时使用通过生物反应器2的血流超滤血浆。泵78吸引血浆穿过微器官培养物腔，进入滤液腔，在此处集中，并进入滤液滴注腔80，然后通过细胞过滤单元82(例如0.45μm的滤膜)，装备该单元是确保细胞或大分子不进入患者。测定该腔80中的压力(P2)，于是提供了膜压力(PI-P2)。滤器82检测并包含细胞从微器官培养物的任何渗漏。然后将滤出液与从生物反应器2流出的血流再混合。
优选地，滤器82的出口连接于第一个三通(如Y形或T形的)管状装置，该装置在一端具有一个充氧器管线装置，用于连接充氧器以对液体充氧。
因此图4说明的过滤流程提供跨过微器官培养物室的正压差，以便增加血清通过微器官培养物的流量。优选地，在动脉管64和注射器68之间也能串联放置一个压力传感器84。压力传感器84可监测从患者抽至生物反应器2的动脉血的压力。另外和优选地，在将肝素或类似的抗凝剂抽至动脉管线中后，压力传感器可监测与生物反应器2相连接的入口管处的压力。其它压力传感器优选地包含于出口静脉管线中，以测定液体向患者的返回，以及为了增加的安全，包含于不同位置的再循环管状装置中。因此，压力传感器用于监测患者的进入和返回压力，以及通过该装置的压力，以检测其堵塞或破裂的问题。此外，滤器82每一侧的压力传感器能监测细胞或大颗粒从该装置中的任何释放。
一个完整的管状装置86包括以上实施方案中使用的所有管。优选地，管状装置86由模压的聚氯乙烯(PVC)管或此等级的一类物质制成，这类物质一般用于在血液透析、治疗性血浆交换和心脏直视手术中使用的系统中。优选地设计该管的泵部分，使其以约100ml/分钟到500ml/分钟、优选地250ml/分钟的血流速度工作约120小时，而不发生导致患者失血的故障。在管状装置86中使用的模制部分可包含硬质PVC、Lexan HP树脂或其它类似的材料，目的是在符合上述应用的环境中显示与PVC管的长期高强度的结合。用于管状装置86的灭菌方法包括氧化乙烯以完成管状装置86的灭菌。
如图4所进一步显示的，控制系统88控制整个系统的工作。在单个综合系统中控制系统88可包括许多组件，或作为分开的组件。其中一个组件操作双泵系统。这种控制组件可以商业化获得(例如，可从CGH，Inc.，Lakewood，Colo.商业化获得的BSM-22双泵血液安全组件)。
控制系统88的另一种组件是辅助监控单元(AMU)，它用来监控压力、接受操作者通过键盘的警报设置等等，随后，如果达到一定的警报限度则通报操作者。
控制系统88的第三种组件是静脉压力监控器(VPM)，它在治疗期间监控体外循环中返回患者的静脉压力。也可从CGH，Inc.商业化获得的VPM可包括两种警报。第一种警报具有一个限制窗口，以便当压力值比选择的值低40mmHg或更低或高70mmHg或更高时触发警报。第二种警报是所谓的“越界警报”，当压力值高于+450mmHg或低于+10mmHg时触发警报。当警报触发时，血液泵停止。VPM包括压力传感元件和一个电源。
该说明性装置的管及其连接优选地能承受3个大气压(2,300mmHg)的正压力(外部腔)和0.75个大气压的负压力，而没有灾变性的故障或在管状装置的内部和外部之间发生渗漏。这种设计起因于以下考虑，用于体外处理的标准泵和管在约0.7个大气压的负压力和1.5个大气压的正压力时达到其运输极限。制定的压力限度与这些限度一起，提供了一个合理的安全限度。
血流速度优选地是在0-500ml/分钟范围内可调节的。其基本原理有多种。非常确实的是，以150ml/分钟的血流连续血液透析是有效的。这与约1000ml/分钟的静止正常肾流速形成对比。人们相信肝脏比肾脏具有更低的储备容量，因此最大流速是约1500ml/分钟的静止正常肝血流速度的较高分数。同样非常确实的是，使用标准血液进入装置如单腔或双腔锁骨下导管，则这种体外流速是可达到的。使用更高的血流速度，可增强治疗效果。
再循环管状装置的再循环流速如抽气流速为约5ml/分钟到约120ml/分钟，优选地为约20ml/分钟到约80ml/分钟。也可根据血流的分数限定流量。例如，抽出流速为血流速度的约5％到约30％，优选地为血流速度的约10％到约20％。优选地给操作者提供一张与血流速度相关的再循环流速表，或者另外预想能将其优选地存储于控制器88的存储器中。
另外或备择地，并且优选地，如果血液是被生物学改变的液体，可在过滤线路中使用血红蛋白检测器，以指示穿过微器官培养物腔的任何渗漏。血红蛋白检测器也能用来指示细胞或颗粒从毛细管外间隙的任何丢失，因为这些细胞散射光线从而相应地减少了监控器的输出。进而，血红蛋白监控器能与不同的警报线路相结合，以指示需要操作者的注意。能将压力传感器加入类似的警报系统中，或具有在此专用的警报系统中。血红蛋白检测器和压力传感器两者都能与控制器相结合，并能用来关闭闭环系统的一个或多个泵。光学血红蛋白检测器优选地能检测60份血浆中1份压紧红细胞的再循环线路中的血液丢失。这种检测方法优选地用于在检测器中产生完整红细胞的两种丢失，或用于指定数量的完全溶血的细胞。
此外，能更改系统构造以包含动静脉瘘管，其中去除了连接于动脉管64的泵。进而，通过在生物反应器2的任一端加入一个储存器并在返回线路上包括一个血液泵，能使该构造适宜于以单针入口的方式使用。
为建立本发明的装置的操作，施行普通医学程序，认为设备装配在普通技术人员掌握的知识之中。简要地，负责设备装配的操作者将管状装置86装载于控制单元88上，将泵的集管适当地穿入泵66和78中(如果存在)，把压力监控管附加于压力监控器74上(如果存在)，将警报装置设置成对引发模式适当的值，用规定的肝素剂量充满抗凝剂(例如肝素)注射器68，把肝素注射器68附加于管72上，将肝素注射器68固定于控制单元88，并向动脉管64中加入引发溶液。引发溶液可以是正常盐水。
对于血液通路，负责该程序的医生将建立适当的程序并进行血液进入。该血液通路必须能输送达到希望的对患者的治疗输入所需的上述血流速度。必须如上所述用肝素或类似物适当地抗凝处理该血液通路。本发明的装置的工作原理依赖于某些运载血液的物质向容纳微器官培养物的灌注室的无阻碍通过，以及溶质从微器官培养物向血液的相似通过。要避免由于不适当的抗凝而损害此运载能力。在循环开始时要特别关注的是准备过程中通路内由淤积引起的凝固。
进行的第一个连接是患者进入线路如动脉管64。以足够确保返回管76和返回线路连接中不含残存空气的速度将引发溶液通入动脉管64中。当完成该连接时，停止引发溶液的流动，以便医生能操纵该管，确保在连接处没有不能接受的量的空气。然后连接动脉管64。
起动泵66以开始该程序。松开静脉管76，注射肝素。检查压力监控室水平，必要时加以调节。继续此程序，操作者和服务人员应定期检查该装置的渗漏、旁路管状装置的血细胞积累证据和监控室的适当水平。如果监控室水平从正常水平变化超过0.5cm，应当重新调节，正常水平是滴注室的50％或更高。特定监控室水平的频繁调节应使操作者充分检查该管的细微渗漏。应对注射器68监测剩余抗凝剂的量，并在适当时替换。
当该过程终止并且装置停止时，依次停止泵66和肝素注射，并夹住动脉管64。使用液体或空气置换使系统中剩余的血液返回每个方案中的患者，并夹住静脉管76。在这一点上，具有附加的管状装置86和治疗装置的控制单元88能从使用它的重病监护室或区域中移除。
以上描述集中于本发明的装置和方法。以下是本发明的装置和方法能使用的微器官培养物成功制备的实施例，以及本发明的装置体内应用的一个实施例。这些实施例仅准备用于说明目的，并不是限制。
如以下说明性实施例所述，已分离了来源于肝脏的微器官培养物，并在培养中生长可达48天。然而，使培养物维持超过48天的延长的一段时间在本发明的范围之内。
                       实施例1
                 肝微器官培养物的制备
如下制备小鼠的肝微器官培养物。取出器官，用剪子剪切为适当的2mm宽、3mm长，并用组织刀或其它合适的剪切工具将其切成300微米厚的切片。将这些微器官置于24孔微量培养板中，在400ml不含胎牛血清(FCS)的Dulbeco基本必需培养基(DMEM)中，于5％CO2 37℃、12转/分恒定振摇下放置1-8天。每孔生长20个微外植块。
                      实施例2
          肝微器官培养物中细胞增殖的测定
如实施例1所述，剖开来源于几个小鼠器官的微器官培养物，使用微器官细胞培养技术，在不含血清的情况下将其在湿润的培养箱中37℃培养。使用标准方案测定含氚胸苷的掺入以评估细胞分裂(Kobayashi等人，1994，生物材料科学杂志，多聚体版(J Biomater Sci Polym Ed)6(4)：325-42)。结果显示DNA合成发生于培养期(图5)。另外，如实施例1所述使小鼠肝微器官培养物生长14天，用溴脱氧尿苷脉冲标记4小时，固定，用抗溴脱氧尿苷的荧光抗体染色，以标记有丝分裂的核(Sigma Chemical)。在这些培养物中观察到正在活跃地合成DNA的核(数据未显示)。
                        实施例3
           在微器官培养物中小鼠肝细胞产生清蛋白
如实施例1所述在微器官培养物中生长的原代小鼠肝细胞，保持功能性至少4周，正如通过清蛋白的分泌和尿素的产生而测定的(见图6)。用Eliza和比色法(试剂盒631号，Sigma Chem.Co.St.LouisMo)检测，微器官培养物中的小鼠肝细胞产生相对大量的清蛋白。以下所示的直方图显示了每小时每106个细胞分泌的清蛋白的量。注意到特别是与另外两种常规培养条件相比，甚至在培养一个月后，清蛋白的产生率仍然很高。A是取自Nyberg等人(细胞移植(Cell Transplant)2：441-52，1993)的数据，B数据来自Shatford等人(外科研究杂志(J.Surg.Res.)，53：549-57，1992)。
                       实施例4
           在小鼠肝微器官培养物中氨向尿素的转化
如实施例1所述解剖小鼠肝脏，使用微器官细胞培养技术在不含血清或外源生长因子的情况下体外培养。使用尿素-氮试剂盒640-A号(Sigma Chem.Co.St.Louis Mo)用标准比色法测定上清液中的尿素和氨。图7显示的数据说明，甚至在培养48天后微器官培养物中的小鼠肝细胞仍产生大量的尿素。与此相对比，Dixit等人(移植(Transplantation)，55：616-22，1993)曾报道对于体外微封装的大鼠肝细胞，培养1天后尿素合成的值为14.6mg/小时/百万个细胞，培养10天后值为11.7mg/小时/百万个细胞。
                       实施例5
         人微器官肝培养物长期地将大量氨转化为尿素
如下制备人肝微器官培养物。由肝脏楔形活组织检查获得人肝脏切片，将这些切片剪切为适当的2mm宽、3mm长，并用组织刀切成300微米厚的切片。将这些切片置于24孔微量培养板中，在0.4ml含或不含胎牛血清(FCS)的DMEM中，于5.5％CO2 37℃、12转/分恒定振摇下。每孔生长20个微外植块。每两天更换培养基，并取出样品进行尿素和氨的测定。图8以主观性单位描述了分泌至培养基中的尿素的量，但代表10-25微克尿素/小时/百万个细胞的值。
人每天产生11.2克尿素，而在人的肝脏中有至少1011个肝细胞。因此人的肝细胞在体内产生约5mg/小时/百万个细胞的尿素。可以看出，如果在体外以不高于正常体内环境中的肝细胞的速度，则人肝微器官培养物以大约相同的速度将氨转化为尿素。
                        实施例6
                 人肝微器官培养物有代谢活性
如实施例5所述制备人肝微器官培养物。结果显示于图9中。
                         实施例7
        冻藏的微器官肝培养物在37℃生长时仍具功能性
如实施例1所述制备微器官小鼠肝培养物，在10％DMSO中逐渐冷冻至-80℃，然后转移至液氮中。几天后，快速解冻微器官培养物，冲洗，并在10％FCS中生长数天。如下图所示，根据其甚至在培养几天后将氨转化为尿素的能力确定，微器官培养物中的肝细胞仍存活并具功能性。获得的值显示于图10中，并可与从相似条件下生长的新鲜微器官培养物所获得的值相比。
                        实施例8
       冻藏的人微器官肝培养物在37℃生长时仍具功能性
如实施例5所述制备微器官人肝培养物，在10％DMSO中逐渐冷冻至-80℃，然后转移至液氮中。几天后，快速解冻微器官培养物，冲洗，并在10％FCS中生长几天。如图11所示，根据其甚至在培养几天后将氨转化为尿素的能力确定，微器官培养物中的肝细胞仍存活并具功能性。获得的值可与从相似条件下生长的新鲜微器官培养物所获得的值相比。
                      实施例9
   当封装于藻酸盐片层中时，肝微器官培养物仍有代谢活性
如实施例1所述制备小鼠肝微器官培养物。其中一半封装于由藻酸盐制成的薄片层中(约400微米厚)。将封装于藻酸盐片层中的微器官培养物在DMEM加10％FCS中离体地培养12天。每两天更换培养基，并取出样品进行尿素和氨的测定。图12以主观性单位描述了分泌至培养基中的尿素的量，代表10-15微克尿素/小时/百万个细胞的值。左侧为单独的微器官培养物，右侧为藻酸盐中的微器官培养物。
                      实施例10
    当在100％胎牛血清中培养时，小鼠肝微器官培养物仍具功能性
如实施例1所述制备微器官小鼠肝培养物。一半培养物在DMEM和10％FCS中生长(左)，另一半在100％FCS(右)中生长5天。每两天更换培养基，并取出样品进行氨和尿素的测定。结果显示于图13中，并且是特别相关的，因为它们确定肝微器官培养物不仅在体外条件下而且在100％血清存在下很好地工作，100％血清更接近于全血，在体外通常对细胞有毒性。
                        实施例11
  当封装于平面藻酸盐片层中、冷冻并贮存于-80℃、并进而在37℃培
            养时，大鼠肝微器官培养物仍具功能性
如实施例1所述制备小鼠肝微器官培养物。其中一半封装于由藻酸盐制成的薄片层中(约400微米厚)。将微器官培养物和封装于藻酸盐片层中的微器官培养物在10％DMSO中逐渐冷冻至-80℃，然后转移至液氮中。几天后，快速解冻微器官培养物，冲洗，并在10％FCS中生长数天。每两天更换培养基，并取出样品进行尿素和氨的测定。图14以主观性单位描述了分泌至培养基中的尿素(a)和清蛋白(b)的量。
                       实施例12
  正常的体内大鼠能与包含藻酸盐片层中肝微器官培养物的生物反应
                      器安全地连接
通过右颈动脉和左颈静脉的导管插入将大鼠与上述样机相连接。血液灌注数小时。监测几个生物化学参数，当然包括整个动物的健康。将微器官培养物处理的血液重新引入由蠕动泵辅助的颈静脉中(见图15，为清楚所见而略述的有大鼠的照片)。使动物在实验期间保持存活，大约8小时。
                     实施例13
            肝微器官培养物的最佳厚度的确定
如下制备小鼠的肝微器官培养物。取出器官，用剪子剪切为适当的2mm宽、3mm长，并用组织刀或其它合适的剪切工具将其切成厚度为150-700微米不等的切片。将这些微器官置于35mm培养皿中，在2ml含10％胎牛血清(FCS)的F12培养基中，于5％CO2 37℃、12转/分恒定振摇下放置可达三周的时间。每个培养皿包含特定厚度的微器官培养物。每两天取出样品，处理后进行常规组织学观察和尿素产生。另外，在培养6天后，用1千万CFU/ml的腺衍生的病毒构建体转导微器官，该构建体经改造以转录lac-z基因(见临床研究杂志(J.Clin.Invest)90：2598-2607，1992)。转导两周后，取出样品，固定，处理后用于重组β-半乳糖苷酶衍生的β-半乳糖产生。图16显示β-半乳糖产生的量为厚度的函数。请注意当使用450微米厚的微培养器官时获得最高水平的产量。同样，与150、300和700微米厚的微培养器官相比，450微米厚的微培养器官在培养三周后测定的组织学和尿素产生都是最佳的。

Claims (66)

1.一种进行液体的生物学改变的装置，该装置包括：
(a)一种腔，其具有一个用于液体进入的入口和一个用于液体流出的出口；和
(b)进行液体的生物学改变的肝微器官培养物集合，该集合中的每一单个肝微器官培养物包含肝细胞并具有尺寸，以使在单个肝培养物中定位最深的肝细胞与单个微器官培养物的最近表面距离至少约150微米并且不超过约225微米，由此在每一单个微器官培养物中保持腺泡单位的体内肝结构，该肝微器官培养物集合位于所述腔内，并且该肝微器官培养物集合与至少一部分流经该腔的液体接触。
2.根据权利要求1的装置，其中在连续肝平面器官内提供该肝微器官培养物集合，该器官是在该肝微器官培养物集合存在下通过协同培养肝细胞而形成的，以使由来源于该微器官培养物的细胞和所述肝细胞的混合物形成所述连续肝平面器官。
3.根据权利要求1的装置，其中用生物相容的多聚体片层封装肝微器官培养物集合，该片层位于所述腔内。
4.根据权利要求3的装置，其中该片层具有范围约30cm到约90cm的第一种尺寸、约30cm到约80cm的第二种尺寸和约300微米到约900微米的第三种尺寸。
5.根据权利要求3的装置，其中多个所述片层以基本平行的方向加入腔内。
6.根据权利要求1的装置，其进一步包含一个基本位于腔内的多孔膜，该膜实现了所述液体与肝微器官培养物集合的接触。
7.根据权利要求6的装置，其中该膜允许分子量低于约40,000Da到约250,000Da的颗粒的通过。
8.根据权利要求6的装置，其中该膜限制白细胞、红细胞和免疫球蛋白的通过。
9.根据权利要求1的装置，其进一步包括多个连接患者的管，管中包含待生物学改变的液体，该管中至少一个与入口连接，并且至少另一个管与出口连接。
10.根据权利要求1的装置，其中所述肝微器官培养物集合的特征在于在置于腔内之前被冻藏。
11.根据权利要求3的装置，其中该片层的特征在于在置于腔内之前被冻藏。
12.一种进行患者液体的生物学改变的装置，包括：
(a)一种腔，其具有一个用于液体进入的入口和一个用于液体流出的出口；
(b)进行液体的生物学改变的微器官培养物集合，该集合中的每一单个肝微器官培养物包含肝细胞并具有尺寸，以使在单个肝培养物中定位最深的肝细胞与单个微器官培养物的最近表面距离至少约150微米并且不超过约225微米，由此在每一单个微器官培养物内保持腺泡单位的体内肝结构，肝微器官培养物集合位于所述腔内，并且肝微器官培养物集合与至少一部分流经该腔的液体接触；
(c)具有第一个和第二个末端的第一种管，其第一个末端用于连接患者以从患者接受液体，其第二个末端用于连接入口；以及
(d)具有第一个和第二个末端的第二种管，其第一个末端用于连接出口，其第二个末端用于连接患者，以便在生物学改变后使液体返回患者。
13.根据权利要求12的装置，其中在连续肝平面器官内提供该肝微器官培养物集合，该器官是在肝微器官培养物集合存在下通过协同培养肝细胞而形成的，以使由来源于所述微器官培养物的细胞和肝细胞的混合物形成该连续肝平面器官。
14.根据权利要求12的装置，其中将多个片层以基本平行的方向加入腔内。
15.根据权利要求14的装置，其中该片层具有范围约30cm到约90cm的第一种尺寸、约30cm到约80cm的第二种尺寸和约300微米到约900微米的第三种尺寸。
16.根据权利要求14的装置，其中将多个片层以基本平行的方向加入腔内。
17.根据权利要求12的装置，其进一步包含一个基本位于腔内的多孔膜，该膜实现了所述液体与肝微器官培养物集合的接触。
18.根据权利要求17的装置，其中该膜允许分子量低于约40,000Da到约250,000Da的颗粒的通过。
19.根据权利要求17的装置，其中该膜限制白细胞、红细胞和免疫球蛋白的通过。
20.根据权利要求17的装置，其中该片层的特征在于在被基本上置于腔内之前被冻藏。
21.一种进行患者液体的生物学改变的方法，该方法包括用患者的液体灌注含肝微器官培养物集合的腔的步骤，以使该肝微器官培养物集合对液体进行生物学改变，其中该集合中每一单个肝微器官培养物包含肝细胞并且具有尺寸，以使在单个肝培养物中定位最深的肝细胞与单个微器官培养物的最近表面距离至少约150微米并且不超过约225微米，由此在每一单个微器官培养物内保持腺泡单位的体内肝结构。
22.权利要求21的方法，其中该液体是血液。
23.根据权利要求21的装置，其中在连续肝平面器官内提供肝微器官培养物集合，该器官是在肝微器官培养物集合存在下通过协同培养肝细胞而形成的，以使由来源于微器官培养物的细胞和肝细胞的混合物形成该连续肝平面器官。
24.根据权利要求21的方法，其中用生物相容的多聚体片层封装肝微器官培养物集合，该片层位于所述腔内。
25.根据权利要求24的方法，其中该片层具有范围约30cm到约90cm的第一种尺寸、约30cm到约80cm的第二种尺寸和约300微米到约900微米的第三种尺寸。
26.根据权利要求24的方法，其中将多个片层以基本平行的方向加入腔内。
27.根据权利要求21的方法，其中该腔包含位于其中的多孔膜，该膜实现了所述液体与肝微器官培养物集合的接触。
28.根据权利要求27的方法，其中该膜允许分子量低于约40,000Da到约250,000Da的颗粒的通过。
29.根据权利要求27的方法，其中该膜限制白细胞、红细胞和免疫球蛋白的通过。
30.根据权利要求27的方法，其中该片层的特征在于在基本置于腔内之前被冻藏。
31.根据权利要求21的方法，其进一步包括使液体返回患者的步骤。
32.根据权利要求31的方法，其进一步包括使肝微器官培养物集合分泌的至少一种产物返回患者的步骤。
33.一种制备连续平面器官的方法，包括步骤：
(a)获得器官的单个微器官培养物集合，以使该集合的每一单个微器官培养物包含细胞并且具有尺寸，以使在单个微器官培养物中定位最深的细胞与单个微器官培养物的最近表面距离至少约150微米并且不超过约225微米，由此在每一单个微器官培养物内保持体内结构；和
(b)将来源于该器官的细胞悬液加入微器官培养物中，在微器官培养物集合存在下协同培养该细胞悬液，以便由来源于微器官培养物的细胞和悬液中细胞的混合物形成连续平面器官。
34.一种制备连续肝平面器官的方法，包括步骤：
(a)获得单个肝微器官培养物集合，以使该集合的每一单个微器官培养物包含肝细胞并且具有尺寸，以使在单个微器官培养物中定位最深的细胞与单个微器官培养物的最近表面距离至少约150微米并且不超过约225微米，由此在每一单个微器官培养物内保持腺泡单位的体内肝结构；和
(b)将肝细胞悬液加入肝微器官培养物中，在肝微器官培养物集合存在下协同培养该细胞悬液，以便由来源于微器官培养物的细胞和肝细胞的混合物形成连续平面肝器官。
35.一种进行液体的生物学改变的装置，该装置包括：
(a)一种腔，其具有一个用于液体进入的入口和一个用于液体流出的出口；和
(b)进行液体的生物学改变的器官的微器官培养物集合，该集合中的每一单个微器官培养物包含细胞并具有尺寸，以使在单个微器官培养物中定位最深的细胞与单个微器官培养物的最近表面距离至少约150微米并且不超过约225微米，由此在每一单个微器官培养物中保持器官单位的体内器官结构，微器官培养物集合位于所述腔内，并且微器官培养物集合与至少一部分流经该腔的液体接触。
36.根据权利要求35的装置，其中在连续平面器官内提供微器官培养物集合，该器官是在微器官培养物集合存在下通过协同培养来源于该器官的悬液中的细胞而形成的，以使由来源于微器官培养物的细胞和悬液中细胞的混合物形成该连续平面器官。
37.根据权利要求35的装置，其中用生物相容的多聚体片层封装微器官培养物集合，该片层位于所述腔内。
38.根据权利要求37的装置，其中该片层具有范围约30cm到约90cm的第一种尺寸、约30cm到约80cm的第二种尺寸和约300微米到约900微米的第三种尺寸。
39.根据权利要求37的装置，其中将多个片层以基本平行的方向加入腔内。
40.根据权利要求35的装置，其进一步包含一个基本位于腔内的多孔膜，该膜实现了所述液体与微器官培养物集合的接触。
41.根据权利要求40的装置，其中该膜允许分子量低于约40,000Da到约250,000Da的颗粒通过。
42.根据权利要求40的装置，其中该膜限制白细胞、红细胞和免疫球蛋白的通过。
43.根据权利要求35的装置，其进一步包括多个用于连接患者的管，管中包含待生物学改变的液体，这些管中至少一个与入口连接，并且至少另一个管与出口连接。
44.根据权利要求35的装置，其中微器官培养物集合的特征在于在置于腔内之前被冻藏。
45.根据权利要求37的装置，其中该片层的特征在于在置于腔内之前被冻藏。
46.一种进行患者的液体的生物学改变的装置，包括：
(a)一种腔，其具有一个用于液体进入的入口和一个用于液体流出的出口；
(b)进行液体的生物学改变的器官的微器官培养物集合，该集合中的每一单个微器官培养物包含细胞并具有尺寸，以使在单个微器官培养物中定位最深的细胞与单个微器官培养物的最近表面距离至少约150微米并且不超过约225微米，由此在每一单个微器官培养物内保持器官单位的体内器官结构，微器官培养物集合位于腔内，并且微器官培养物集合与至少一部分流经该腔的液体接触；
(c)具有第一个和第二个末端的第一种管，其第一个末端用于连接患者以从患者接受液体，其第二个末端用于连接入口；以及
(d)具有第一个和第二个末端的第二种管，其第一个末端用于连接出口，其第二个末端用于连接患者，以便在生物学改变后使液体返回患者。
47.根据权利要求46的装置，其中在连续平面器官内提供微器官培养物集合，该器官是在微器官培养物集合存在下通过协同培养来源于该器官的悬液细胞而形成的，以使由来源于微器官培养物的细胞和悬液细胞的混合物形成该连续平面器官。
48.根据权利要求46的装置，其中用生物相容的多聚体片层封装微器官培养物集合，该片层位于所述腔内。
49.根据权利要求48的装置，其中该片层具有范围约30cm到约90cm的第一种尺寸、约30cm到约80cm的第二种尺寸和约300微米到约900微米的第三种尺寸。
50.根据权利要求48的装置，其中将多个片层以基本平行的方向加入腔内。
51.根据权利要求46的装置，其进一步包含一个基本位于腔内的多孔膜，该膜实现了所述液体与微器官培养物集合的接触。
52.根据权利要求51的装置，其中该膜允许分子量低于约40,000Da到约250,000Da的颗粒通过。
53.根据权利要求51的装置，其中该膜限制白细胞、红细胞和免疫球蛋白的通过。
54.根据权利要求51的装置，其中该片层的特征在于在基本上置于腔内之前被冻藏。
55.一种进行患者液体的生物学改变的方法，该方法包括用来自患者的液体灌注含器官的微器官培养物集合的腔的步骤，以使微器官培养物集合对液体进行生物学改变，其中该集合中每一单个肝微器官培养物包含细胞并且具有尺寸，以使在单个微器官培养物中定位最深的细胞与单个微器官培养物的最近表面距离至少约150微米并且不超过约225微米，由此在每一单个微器官培养物内保持器官单位的体内器官结构。
56.权利要求55的方法，其中该液体是血液。
57.根据权利要求55的装置，其中在连续平面器官内提供微器官培养物集合，该器官是在微器官培养物集合存在下通过协同培养来源于该器官的悬液细胞而形成的，以使由来源于微器官培养物的细胞和悬液细胞的混合物形成该连续平面器官。
58.根据权利要求55的方法，其中用生物相容的多聚体片层封装微器官培养物集合，该片层位于所述腔内。
59.根据权利要求58的方法，该片层具有范围约30cm到约90cm的第一种尺寸、约30cm到约80cm的第二种尺寸和约300微米到约900微米的第三种尺寸。
60.根据权利要求58的方法，其中将多个片层以基本平行的方向加入腔内。
61.根据权利要求55的方法，其中该腔包含位于其中的多孔膜，该膜实现了所述液体与微器官培养物集合的接触。
62.根据权利要求61的方法，其中该膜允许分子量低于约40,000Da到约250,000Da的颗粒通过。
63.根据权利要求61的方法，其中该膜限制白细胞、红细胞和免疫球蛋白的通过。
64.根据权利要求61的方法，其中该片层的特征在于在基本上置于腔内之前被冻藏。
65.根据权利要求61的方法，其进一步包括使液体返回患者的步骤。
66.根据权利要求65的方法，其进一步包括使微器官培养物集合分泌的至少一种产物返回患者的步骤。
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