CN1364087A - 治疗方法和药物筛选方法 - Google Patents

Abstract

一种防止和减少患者体内巨噬细胞形成泡沫细胞,或去除泡沫细胞的方法,该方法包括给患者使用有效量的PPARδ活性抑制剂。一种预防或治疗与斑块形成和/或血管血栓阻塞相关血管疾病的方法,该方法包括给患者使用有效量的PPARδ活性抑制剂。

Description

治疗方法和药物筛选方法

本发明涉及治疗方法和药物筛选方法，具体地，本发明涉及心血管药物的设计和治疗用的化合物。

在正常发育和身体健康中脂质代谢动态平衡受到严格的调控，然而，一旦脂肪代谢发生紊乱就会导致动脉粥样硬化、肥胖症、糖尿病和癌症等许多疾病。脂肪动态平衡中的关键调节物包括脂肪转录识别因子家族，已知的有过氧化物酶体增生激活受体(PPARs)。PPARs属于类固醇激素/核受体亚家族的成员，它可以被结构多样的化学物质如脂肪酸、前列腺素、低脂血症药物、非类固醇抗炎症药物、胰岛素感光剂和环境污染物激活(1，2)。PPARα是最早被描述的PPAR类物质，它能调节肝脏的脂质代谢，可以被降脂类药物如降固醇酸激活(3，4)。如果小鼠体内编码PPARα的基因断裂的话，PPARα就不能对低脂血症药物(4)作出反应发变形并分泌肝脂，肝细胞中就会积累大量的脂质小滴。在脂质激活脂肪细胞发育过程中需要另外一种PPARγ。PPARγ是对前列腺素具有高度亲合力的核受体(5)，同时也是噻唑类抗糖尿病剂例如rosiglitazone(BRL49653)(国际公布号为WO94/05659)(6)的药理性靶，该基因的遗传切除是致死的(7)。

另一种形式PPAR的PPARδ的功能还未知。有报道称PPARδ在所有检测的组织中以极低水平表达(8)，然而在单核细胞/巨噬细胞系的细胞中，我们观察到PPARδ是选择性表达的，当佛波醇脂诱导巨噬细胞分化时，和PPARγ一样，PPARδ也是进行增量调节。PPARδ是脂肪酸感应器，可以被作为单核细胞分化中重要信号化合物的脂肪酸激活，如亚油酸和油酸类不饱和脂肪酸。纤维化药物如安妥明、thiazolidinediones如BRL49653等不能激活PPARδ。

WO9728149(Merck & Co.Inc)描述了PPARδ激动剂有利于提高哺乳动物体内高密度脂蛋白(HDL)的血浆水平，可以防止、中断或减慢粥样硬化心血管疾病的进程。

已知高脂肪食物是导致粥样硬化的主要因素，许多用于治疗该病的药物均是为了调节脂质代谢。巨噬细胞充满脂质小滴后被高度活化，其分化成的泡沫细胞中脂质与粥样硬化的病理学密切相关。血管病变时高密度存在的泡沫细胞形成斑块，最终斑块裂解导致血管血栓堵塞。这种堵塞临床上表现为心脏病发作、中风、外周血管疾病。我们现已证明由佛波醇脂激活的小鼠巨噬细胞和人类的THP-1型单核细胞系可以表达PPARδ。活化的THP-1细胞发生粘连，散布于培养皿中。在合适的脂肪酸条件下，当用Oil Red O染色法检测时，会发现这些细胞充满了脂质，并形成了泡沫细胞。这些细胞表达与体内泡沫细胞相关的基因，如IL-1β、TNFα、IGF-1、CD36、MCP-1和血栓合成酶基因。这些细胞提供了一种脂质诱导泡沫细胞形成的模型。候选抗硬化药物如BRL49653可以防止这种积累，因此证明了药物的一种抗动脉硬化特性，这种模型可用于鉴定抗粥样硬化的药物。这种方法可以在标准的微量滴定盘上进行，且脂质染色通过在微量滴定盘阅读器进行目测。

我们采用一个可选择的表达载体修饰的THP-1型细胞表达PPARδ反义RNA。这种细胞系在培养物上能正常地生长，然而用佛波醇酯处理的细胞系不能再进行分化。佛波醇酯处理后，细胞系再经锥虫蓝染色，结果表明这些细胞已经死亡。因此，PPARδ功能的抑制切断细胞对炎症刺激物从分化到死亡的应答。粥样硬化斑块中充满了来源于高度活化巨噬细胞的泡沫细胞，并且含有高浓度的炎症介质。不被其它的理论所束缚，我们认为泡沫细胞中PPARδ功能的抑制如动脉粥样损坏，将有利于在斑块中造成一连串的自我破坏。最近，采用反义治疗抗BCL-X(Pollman，1998，Nature Medicine 4，222-227)来调节无炎症或坏疽的去除泡沫细胞已经作为改善斑块衰退的一种有效手段。我们认为活化巨噬细胞中PPARδ的靶象是高度特异性的，因为这种反应依赖于活化泡沫细胞的特定表型形态。

本发明的一个目的是提供或筛选出一种化合物，该化合物能扰乱泡沫细胞发育形成或导致潜在泡沫细胞的去除。这种化合物能利于斑块的衰退，因而减少了心脏病、中风或血栓症发生的危险。

我们已经证实PPARδ在巨噬细胞活化中起了关键作用，而且有选择地抑制PPARδ的活性能防止泡沫细胞的形成。

我们也证实了PPARγ兴奋剂抑制了脂质积累，PPARδ和PPARγ在泡沫细胞形成中是相互对立的。

本发明的第一方面提供了一种阻止或减少巨噬细胞及其它细胞形成泡沫细胞或去除泡沫细胞的方法，该方法包括有效量的PPARδ活性抑制剂与巨噬细胞、泡沫细胞及其它细胞接触。

合适的，巨噬细胞及其它细胞是包含在粥样硬化病理学中的细胞。

尽管这种方法已经用于与培养物中巨噬细胞和泡沫细胞相关的研究，该方法特别适于防止和减少泡沫细胞的形成及去除泡沫细胞，尤其是在人体或其它哺乳动物体内。泡沫细胞是一种负载脂质的细胞，如白细胞，通常是巨噬细胞，它们使脂质内在化并以细胞质小滴的形式贮存起来，从而使得它们在显微镜下呈现泡沫状的外观形态。

本发明的第二个方面是提供一种阻止或减少巨噬细胞及其它细胞发育成泡沫细胞，或是去除泡沫细胞的方法，该方法包括给患者使用有效量的PPARδ活性抑制剂。

相应地，巨噬细胞及其它细胞是涉及粥样硬化病理学中的细胞。

形成泡沫细胞的细胞不仅包括巨噬细胞，还包括平滑肌细胞。优选为防止和减少巨噬细胞发育成泡沫细胞，或是去除来源于巨噬细胞的泡沫细胞的PPARδ的活性抑制剂。特别优选的，该方法能阻止或减少巨噬细胞发育成泡沫细胞。

没有偏重于本发明的任何一方面，当没有被与本发明相关的其它理论限制时，我们认为巨噬细胞发育成泡沫细胞是与各种疾病状态相关的，而且一种PPARδ活性的抑制剂可以阻止或减少巨噬细胞发育成泡沫细胞，至少是到一个安全的程度。与泡沫细胞相关的疾病包括但不只限于周粥样硬化、心脏病、中风、外周血管疾病和绞痛。

该方法也适用于防止心瓣手术后的再狭窄和动脉粥样化衰退。

关于抑制PPARδ活性可以防止巨噬细胞活化的发现也暗示了该方法可以治疗炎症紊乱。炎症紊乱的例子包括类风湿性关节炎、全身性硬化及狼疮。非类固醇抗炎症药物sulindac能阻止PPARδ的转录活性，但不能防止缺乏PPARδ的小鼠被乙酸肉豆蔻佛波醇诱导后的表皮增生和发炎，这说明了PPARδ在炎症中起作用(Peters JM等人(2000)Mol.和Cell Biol.，20，5119-5128)。

因此，进一步地说，本发明提供了一种防止或治疗炎症紊乱的方法，该方法包括给病人施用有效量的PPARδ活性抑制剂。

各种各样的紊乱通过病理学上的粥样硬化而引起的包括咽痛、冠心病、中风、外周血管疾病、老年性痴呆、血管痴呆、全身硬化和视网膜血管退化变质。

本发明的第三个方面是提供了一种防止或治疗与斑块形成和/或血管血栓堵塞相关的血管疾病的方法，该方法包括给病人施用有效量的PPARδ活性的抑制剂。该方法尤其适合于防止和治疗粥样硬化、冠心病、中风及外周血管疾病。

我们发现抑制PPARδ活性抑制了PMA刺激的细胞的增殖。因此，本发明的第四个方面是提供了防止和减少细胞增生的方法，该方法包括有效数量PPARδ活性的抑制剂接触细胞。能被PMA刺激增殖的细胞包括皮肤细胞、结肠细胞、乳房细胞和前列腺细胞。最近有实验证明非类固醇抗炎症剂具有抗癌活性，它们通过在源于结肠的细胞中阻断PPARδ的转录活性和促进编程性细胞死亡起作用(He T-C等，1999，细胞，99，335-343)这些显示了PPARδ在肿瘤发生中起一定的作用。

PPARδ涉及肿瘤启动子PMA的作用之中。

因此，本发明的第五个方面是提供了一种治疗或预防癌症的方法，该方法包括给病人使用有效量的PPARδ活性抑制剂。

此方法特别适用于与皮肤癌相关的疾病。

此方法也特别适用于与乳腺癌相关的疾病。

此方法也特别适用于与结肠癌相关的疾病。

此方法也特别适用于与前列腺癌相关的疾病。

本发明的第六个方面是提供了一种治疗和预防老年性痴呆症的方法，该方法包括给病人使用有效量的PPARδ活性抑制剂。

PPARδ的抑制剂可以防止在正常老化时神经胶质细胞形成泡沫细胞导致的神经恶化。通常认为高脂肪食物刺激了泡沫细胞的形成(Mato M.等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 93，3269-3274)。

已知阿朴脂蛋白E(ApoE)在治疗老年性痴呆症方面给予了保护，我们从实施例中得出ApoE是被脂肪酸和PPARδ压制的。不受其它理论的束缚，我们认为高脂食物引发了痴呆可以是一种机制，这个过程中的对抗性是有益的。(Kalmijn S等，1997，Annual of Neurology，42，776-782)。

“有效量的PPARδ活性抑制剂”包括能有效防止巨噬细胞及其它细胞形成泡沫细胞或去除泡沫细胞的一定的数量的抑制剂，尤其是有效预防疾病(包括防止从无症状状态发展到有症状状态)或是治疗疾病(包括改善和减轻症状)到临床有益程度的一定数量的抑制剂。临床有益程度可以直接由内科医师很容易地决定。

“一种PPARδ活性的抑制剂”意味着任何可以减少如患者细胞中PPARδ活性的适宜的抑制剂。特别优选的PPARδ活性抑制剂是能抑制巨噬细胞或来源于巨噬细胞的泡沫细胞中PPARδ活性的抑制剂。术语“PPARδ活性的抑制剂”包括阻断PPARδ兴奋剂作用的化合物。

优选的PPARδ活性抑制剂对于PPARδ是可选择的。特别优选的抑制剂能有效抑制PPARδ的活性，但不能完全抑制其它PPAR异构体如PPARα或PPARγ的活性。虽然希望PPARδ活性抑制剂不能改变其它PPAR型的活性，但如果该分子是PPARγ活性的一种兴奋剂或激活剂的话将是有益的。同时希望PPARδ活性的抑制剂不能改变其它类固醇激素受体家族受体的活性。“可选择性”意味着化合物抑制PPARδ的活性比改变其它PPAR型活性至少有效10倍，优选至少是能达到100倍的可选择性。

抑制剂可以是抑制细胞中PPARδ表达的一类。发明中的“抑制表达”意味着完全抑制表达或是至少降低PPARδ表达的水平到一个有益的程度。典型地，抑制细胞中PPARδ表达的化合物是基于核酸的分子。

如实施例中所述，我们已证实了采用包含非翻译区的全长人类PPARδ的编码序列的反义核酸，可以抑制巨噬细胞形成泡沫细胞。估计PPARδ cDNA上尤其是与PPARδ蛋白翻译起始区域相关的的一小部分可以用作反义剂。

反义分子可以参考PPARδ序列进行设计，人类的序列已经由Schmidt等给出(1992，Mol.Endocrinol.，6，1634-1641，GenBank序列号为L07592).

PPARδ反义剂包括与PPARδmDNA进行结合尤其是抑制其转录的试剂。“反义剂”是基于核酸的分子，它可以和PPARδ基因组序列形成三联体，并且阻止基因进行选择性转录和翻译。

反义分子可以是RNA(在本发明中它由设计好的能产生反义转录本的载体转录而来)，或可以是DNA，或是类似DNA的分子，如反义寡核苷酸。

相应于人类PAC RNA库第109F14克隆的第67886到139948间的部分人类基因组序列，已证实其反义RNA的过量表达能有效抑制PPARδ的活性。该克隆可以从剑桥(CB10 1SB，UK)HGMP资源中心基因组校园Hinxton处获得，PPARδ基因序列号为AL022721。

反义寡核苷酸可以参考PPARδ cDNA或其基因序列进行设计。

寡核苷酸能被内源性的核酸酶降解和灭活。为了解决这个问题，可以对寡核苷酸进行修饰，例如可以改变核苷键，将天然存在的磷酸二酯键替换成其它的健。举例来说，Agrawal等(1988，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，85，7079-7083)证实寡核苷酸亚硫酰胺和硫代硫酸酯在HIV-1组织培养物中能增强抑制性。Sarin等(1988，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，85，7448-7451)证明寡核苷酸甲基硫酸酯能增强对HIV-1的抑制性。Agrawal等(1989，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，86，7790-7794)表明包含特异性核苷酸序列的寡核苷酸硫代硫酸酯可以抑制早期受感染和长期被感染细胞培养物中的HIV-1的复制。Leither等(1990，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，87，3430-3434)报道了寡核苷酸硫代硫酸酯在流感病毒组织培养物中具有抑制性。

含有人工键的寡核苷酸被显示能抵制体内的降解。例如，Shaw等(1991，Nucleic Acids Res.，19，747-750)报道了要不是没加修饰的寡核苷酸在3’端被特定帽子结构阻断的话，否则它们对核酸酶会具有更强的抗性，没有加帽的寡核苷酸硫代硫酸酯在体内也不会被降解。

Agrawa和Tang(1990，Tetrahedron Letters，31，7541-7544)对用H-硫酸酯的方法合成寡核苷酸硫代硫酸酯作了详细的描述，引入本发明作为参考。关于寡核苷酸甲基硫酸酯、硫代硫酸酯、亚硫酰胺、磷酸酯、桥接亚硫酰胺和桥接硫代硫酸酯的合成已在文献中记载(Agrawa和Goodchild，1987，Tetraedron Letters，28，3539；Nielsen等，1988，Tetraedron Letters，29，2911；Jager等，1988，Biochemistry，27，7237；Uznanski等，1987，Tetrahedron Letters，28，3401；Bannwarth，1988，Helv.Chim.Acta.，71，1517；Crosstick和Vyle，1989，Tetraedron Letters，30，4693；Agrawa等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，87，1401-1405)，引入本发明作为参考，当然也可能存在其它合成和生产的方法。优选的寡核苷酸为脱氧核糖核苷酸(DNA)，当然核糖核苷酸(RNA)也可以被合成和应用。

优先的用于本发明的寡核苷酸能抗内源性核酸酶的降解。寡核苷酸在体内降解后形成寡核苷酸断裂产物，这些产物更多地进行非特异性的杂交，相对于全长片断，其效果大大地降低。因此，优选的寡核苷酸不仅能抗体内的降解，同时还能到达靶细胞。该寡核苷酸天然的磷酸二酯键被人造核苷键替换后，在体内能表现出更强的抗降解能力，其中人造键可以是硫代硫酸酯、甲基硫酸酯、砜、硫酸盐、羰基、二硫代磷酸盐、各种亚硫酰胺、磷酸酯、桥接亚硫酰胺和桥接硫代硫酸酯。人造核苷键的例子不只限于此，象Cohen(1990，Trends inBiotechnology)报道了其它的核苷键。我们从文献中得知合成的寡核苷酸可以包含一个或更多的替换磷酸二酯键的核苷键，包括含有混合核苷键的寡核苷酸的合成途径。

内源性酶在寡核苷酸5’或3’端核苷酸上加上帽子或其它相似结构，从而阻止了它的延伸。添加帽子的试剂象Amino-Link IIT^TM可以从Applied Biosystems Inc(Foster City，CA)得到，Shaw等(1991，Nucleic Acids Res.，19，747-750)和Agrawal等(1991，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，88(17)，7595-7599)描述了添加帽子的方法，该方法引入本发明作为参考。

Tang等描述了增强寡核苷酸对核酸酶抗性的另一种方法是寡核苷酸的“自身稳定”(1993，Nucl.Acids Res.，21，2729-2735)。自身稳定的寡核苷酸在3’端具有发夹结构且显示增加的对蛇毒磷酸二酯酶、磷酸二酯酶、DNA聚合酶I和牛胎儿血清的抗性。寡核苷酸的自身稳定区域不介入与互补核酸序列的杂交，对小鼠的药物动力学和稳定性的研究表明，自身稳定的寡核苷酸相对于以线性存在的拷贝要稳定持续得多。

与本发明相一致，在允许使用较低剂量和减少整体效应时，通过限制体内反义化合物靶位点的有效性，增强了具有典型碱基配对的反义寡核苷酸固有的结合特异性。因此，本发明应用寡核苷酸可以获得预期效应。在目标位点的寡核苷酸浓度要远远高于寡核苷酸为全身性地施加时的，并且用显著低的总量就能达到治疗效果。高浓度的寡核苷酸提高了靶细胞的渗透性，有效地阻止了靶核苷酸序列的转录。

寡核苷酸可以通过一切可能的药物定位调节被递送至位点。例如，可以采用直接注射至靶目标或通过输液管灌输释放，也能将寡核苷酸装入一个可植入的装置，当把该装置植入目标位置时，寡核苷酸能被释放出来，进入周围的位点。

寡核苷酸最优先通过水凝胶给药，该凝胶是非炎性的、生物可降解的。这种物质许多还未知，包括自然存在的和聚合合成的。在一种优选的方案中，该方法开发出一种低于体温的液体状的水凝胶，但胶在接近体温时是能保持形状的半固态水凝胶。优选的水凝胶是乙烯丙稀氧化物重复单位的聚合物。聚合物的特性依赖于本身的分子量及聚乙烯氧化物和聚丙烯氧化物在聚合物中的相对百分含量。优选水凝胶中包含10-80％的乙烯氧化物和20-90％的丙稀氧化物。特别优选的水凝胶含70％的聚乙烯氧化物和30％的聚丙烯氧化物。这种水凝胶是可以从如BASF Corp.(Parsippany，NJ，under the tradenamePluronic^TM获得。

在本发明中，水凝胶降温至液体状态，并将寡核苷酸混合加入至浓度为每克水凝胶中含1mg的寡核苷酸。然后将此混合物加到被处理的表面，如采用外科手术时的喷射或平敷，或是采用导管或内窥镜检查程序。当聚合物略微变热就固化成凝胶，一段时间之后，寡核苷酸就从凝胶中扩散入凝胶准确放置位置周围的细胞。

寡核苷酸可以用其它植入物进行处理，这些植入物既可以通过商业途径获取，也可以参考相关的科技文献，包括脂质体、微型胶囊和植入装置。例如，用来传递寡核苷酸的植入物可以包括以下两种，一种是由生物可降解的物质如聚合酐、聚原酯、聚乳酸、聚乙醇酸与关于胶原蛋白共聚物及蛋白共聚物组成的，另一种是由生物不可降解的物质如乙烯基乙烯乙酸(EVAc)、聚乙烯乙酸、乙烯基乙醇乙酸及其中的一些衍生物组成。用熔化或溶解蒸发技术，或是用物质的机械混合方法可以将寡核苷酸混合入聚合或固化的物质中。在本发明的方案中，将寡核苷酸混合进或添加入可移植装置如由葡聚糖包衣的硅珠、移植片固定模或导管的包被中。

寡核苷酸的剂量取决于寡核苷酸的大小和被应用的目的。一般地，这个范围基于治疗组织的表面积来计算。虽然寡核苷酸的有效剂量一定程度上取决于寡核苷酸的长度和化学组成，但其使用的一般范围为每平方厘米组织表面积30-3000ug左右。

为了治疗和预防的目的，可以给患者系统地使用寡核苷酸，也可以用任何有效的方法给药，例如，非肠胃的(如静脉，皮下，肌肉)或通过口、鼻或其它允许寡核苷酸进入血液循环的方法。系统使用寡核苷酸优选为局部使用，但不在局部使用时也能发挥效用。成年人每次给药的有效剂量在0.1克到10克左右。

除了上述的反义因子外，基于PPARδ cDNA或其基因序列进行设计的核酶，尤其是榔头型核酶，将会有利于抑制PPARδ的活性。

核酸编码的核酶可以被递送到靶点已经在文献中公开报道(Cech和Herschlag，“单链DNA的位点特异性剪切”，US5180818；Altman等，“RNA酶P对靶RNA的裂解”，US5168053；Cantin等，“核酶对HIV-1RNA的裂解”，US5149796；Cech等，“RNA核酶限制性核糖核酸酶和方法”，US5116742；Been等，“RNA核酶聚合酶、去磷酸化酶、限制性内切核糖核酸酶和方法”，US5093246；Been等，“RNA核酶聚合酶、去磷酸化酶、限制性内切核糖核酸酶和方法；通过酯基转移在特异性位点裂解单链RNA”，US4987071)，这些均引入本文作为参考。适合于核酶的靶包括转录因子，如c-fos，c-myc和bcl-2。Durai等(1997，Anucancer Res.，17，3307-3312)描述了一个抑制bcl-2的榔头型核酶。

本发明中采用的表达核酶的遗传结构或反义化合物可以直接制备出来。合适的遗传结构适宜于在靶细胞中传递和表达核酶或反义分子。因此，本发明的方法包括基因治疗方法。

可以依照常规方法进行基因治疗，例如，Friedman(1991)描述了一种能在靶细胞内复制的病毒或质粒载体，该载体上带有一个拷贝的编码核酶和反义分子的基因，该基因与表达调控元件相连。专利文献US5252479和WO9307282中公开了适合使用的载体。载体被注入患者体内，可以施加在局部或全身。如果转染的基因不能永久地融进每个靶细胞的基因组的话，治疗就必须阶段性地重复。

文献中记载的基因转移系统用于本发明基因治疗方法的实践中。这包括了病毒和非病毒转移方法。已经有一部分病毒被用作基因转移载体，包括乳多空病毒，egSV40(Madzak等，1992)，腺病毒(Berkner，1992；Berkner等，1988)；Gorziglia和Kapikian，1992；Quantin等，1992；Rosenfeld等，1992；Wilkinson等，1992；Stratford-Perricaudet等，1990)，痘苗病毒(Moss，1992)，类腺病毒(Muzyczka，1992；Ohi等，1990)，疱疹病毒包括HSV和EBV(Margolskee，1992；Johnson等，1992；Fink等，1992；Breakdield和Geller，1987；Freese等，1990)，和鸟类反转录病毒(Brandyopadhyay和Temin，1984；Petropoulos等，1992)，鼠的(Miller，1992；Miller等，1985；Sorge等，1984；Mann和Baltimore，1985；Miller等，1988)，和人源的(Shimada等，1991；Helseth等，1990；Page等，1990；Buchschacher和Panganiban，1992)。基于修饰的鼠逆转录病毒的许多人类基因治疗方案已经形成，其中优选基于慢性毒属的载体。

有文献报道的非病毒性基因转移方法有化学方法，如磷酸钙共沉淀(Graham和van der Eb，1973；Prllicer等，1980)；机械方法，如微注射(Anderson等，1980；Gordon等，1980；Brinster等，1981；Constantini和Lacy，1981)；脂质体膜融合介导的转移(Felgner等，1987；Wang和Huang，1989；Kaneda等，1989；Stewart等，1992；Nabel等，1990；Lim等，1982)；DNA直接吸收和受体介导的DNA转移(Wolff等，1990；Wu等，1991；Zenke等，1990；Wu等，1989b；Wolff等，1991；Wagner等1990；Wagner等1991；Cotten等1990；Curiel等，1991a；Curiel等，1991b)。脂质体递送能将病毒介导的基因转移与体内基因的直接转移结合起来，从而可以指病毒载体到达肿瘤细胞而不是旁边无关的细胞。也可以将逆转录载体生产细胞系注射入肿瘤细胞(Culver等，1992)，从而可以连续提供载体微粒，这项技术已经批准用于不宜动手术的大脑肿瘤。

其它适合的系统包括Feng等(1997，Nature Biotechnology 15，866-870)描述的逆转录病毒-腺病毒杂交系统，或是带有靶配体象合适的单链Fv片断的病毒系统。

在一种结合生物和物理基因转移方法的途径中，任何大小的质粒DNA片断可以结合一个对腺病毒己醣氨蛋白具有特异性的共扼聚赖氨酸抗体，最终形成的联合体限制在腺病毒载体上。将这个三联体感染细胞，腺病毒载体可以在双链DNA被破坏之前有效地结合、内在化和退化成内涵体。

已证实脂质体/DNA联合体在体内能有效地介导基因转移。然而标准脂质体准备基因转移的过程是非特异性的，瘤堆积物局部的吸收和表达已有报道，例如在直接地体外给药后(Nabel，1992)。

靶DNA直接为巨噬细胞的基因转移技术是优选的。受体介导的基因转移可以通过如DNA(通常以共价键闭合超带状形式存在)与一个蛋白配体经聚赖氨酸配对来完成。根据靶细胞/组织型的细胞表面存在相应配体的受体来选择配体。甘露糖受体对巨噬细胞和靶DNA/甘露糖变构体具有较高的特异性已经被证实。如果需要，这些成对的配体-DNA可以被直接注射进血液内或导入与受体结合的和DNA一蛋白联合体发生内在化的靶组织中。用腺病毒共染细胞，破坏内涵体的作用，可以解决细胞内DNA被破坏的问题

更进一步地说，本发明的化合物可以抑制PPARδ蛋白的活性。

适合的化合物可以用下文描述的方法进行选择。

采用任何适宜的方式方法给病人施加有效数量的PPARδ活性抑制剂是可行的。任何处理手段和方式合适性可以由技术人员根据抑制剂的特性来选择。例如现有技术中基于核酸的抑制剂可以用不同方法制备和处理成小型的基于分子的抑制剂。

本发明前面提到的化合物或在方法中使用的化合物或包括在其中的一种处方均可以采用传统手段来给药，包括通过口或非肠胃的(如静脉，皮下，肌肉)注射。治疗包括单剂量或是一段时间的多剂量使用。

常用的剂量在0.01-20mg/kg之间。

本发明中的化合物也可能单独使用，优选的为包含一种药物制剂与适宜于药用的载体。这种载体必须“适宜”的意思是与发明中的化合物是兼容的，并且对使用者没有害处。典型的载体可以是既无毒又热源丰富的水或盐水。

这种药物制剂可以方便地存在于单位制剂形式里，可以用制药学的常用技术来制备。这些技术包括将活性成分(发明中的化合物和方法中使用的化合物)与由一种或多种辅助成分组成的载体结合的措施。通常制剂是统一紧密地与液体载体或精细的固体载体或同时包括两种载体中的活性成分结合，如果需要，可以将产物成型。

与本发明相一致的适宜于口服的制剂可以是包含预计有效活性成分的离散单位，如胶囊或药块；可以是粉末或颗粒；可以是溶液或是水溶液或非水溶液中的悬浮物；可以是油溶于水的液体乳剂或水溶于油的液体乳剂。活性成分也可以制成大丸药，干药糖剂或糊。

药块可以随意地与一种或多种辅助成分混合后，再经过压缩或模子成型制成。压制药块是在适配的机器上将混合物压缩制成，该混合物包括以自由形态存在的如粉末或颗粒的活性成分，任选地与粘合剂(如聚维酮，凝胶，羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、分解质(如钠淀粉糖原，交联聚维酮，交联羧甲基钠糖原)、表面活性或疏散剂混合。模子成型的药块可以用在适配机器上的模型将粉末状成分与一种惰性液体稀释剂混合。药块可以随意地被包裹或划分，可以结构化，从而便于在使用时能让活性成分缓慢地或有控制地释放。例如，羟丙基甲基纤维素有着多种特性，可以提供想要的释放形式。

适宜于肠胃外给药的药剂包括溶液，此种溶液含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和药剂均匀溶解于容器血液中形成的溶液；和包含悬浮剂和增稠剂的水溶性和非水溶性无毒注射悬浮液。药剂可以存在于单位剂量或多剂量的包含物中，例如密封的针剂和小瓶，也可以只贮存在冷冻和干燥(冻干的)的只有无毒液体载体的环境，例如预先直接用水注射。临时的注射溶液和悬浮液可以通过前面描述的无毒粉末，颗粒和药片来准备。

优选的单位剂量药剂包含每天的剂量或单位，每天的亚剂量或其中含有一种活性成分的所需的片段。

除了以上着重描述的成分外，本发明的药剂可以包括现有技术中被正被讨论的看作是药剂一类的其它常用介质。例如，适于口服的药剂中可以包含感兴趣的介质。

本发明提及的药剂都是用标准方法实现的，象英国和美国的教科书，Remington′s Pharmaceutical Science，Mark Publishing Co；Martindale The Extra Pharmacopoeia，London，The PharmaceuticalPress。

本发明的治疗方法可以用于治疗包括人类在内的一切哺乳动物。因此，我们设想该方法可以用于治疗如家养动物猫和狗，农业动物马、牛、绵羊、山羊和猪，或是其它的经济重要动物。当PPARδ活性抑制剂是基于核酸的分子时，最好参考哺乳动物PPARδ基因或cDNA的序列来设计。

该方法优选对人类患者进行治疗。

本发明进一步提供了用于药物的PPARδ活性抑制剂。

该抑制剂被包被后用于药物。特别地，它被包被后用于治疗动脉粥样硬化，心脏病、疾病的中风、外周血管疾病、伴随着斑块形成的血管疾病，血管的血栓性阻塞，老年性痴呆或是癌症。

本发明进一步提供了一种包括PPARδ活性抑制剂和适宜于药用的载体的药物组合物。

本发明还进一步提供了PPARδ活性抑制剂在制备药剂中的用途，从而可阻止或减少病人体内巨噬细胞及其它细胞形成泡沫细胞或去除泡沫细胞，防止或治疗伴随着斑块形成的血管疾病和/或血管的血栓性阻塞，治疗和防止癌症，治疗和防止老年性痴呆。

合适地，巨噬细胞及其细胞是包含在粥样硬化病理学上的细胞。

在本发明以前，人们并没有预期到PPARδ活性抑制剂的效用，尤其在制备药剂中的用途。本发明也包括鉴别抑制PPARδ活性的化合物的方法，尤其是抑制巨噬细胞或泡沫细胞中PPARδ活性的化合物的方法。所鉴别出的化合物可以是自身能用于药中或是作为引导性的化合物，用于进一步开发出便于药用的化合物。本发明的这些方法或实现这些方法的手段可以被认为是“药物筛选方法”或“药物筛选验定法”。

本发明一方面提供了一种鉴别化合物的方法，该方法鉴别出的化合物可以是自身能用于药中或是作为引导性的化合物进一步开发出便于药用的化合物，该方法包括挑选抑制PPARδ活性的化合物。典型的方法可以包括筛选出大量的出现在试验化合物库中的试验化合物。因此，本发明的另一方面提供了一种鉴别抑制PPARδ活性化合物的方法，该方法包括从试验化合物库中挑选出的一切能抑制PPARδ活性的化合物。

上述方法可以用于选择能抑制PPARδ基因表达或细胞中PPARδ蛋白产物(如翻译)或是抑制PPARδ蛋白活性的化合物。

合适的方法是本领域技术人员公知的，本发明的实施例3对其中的一些技术作了详细的描述。

与鉴别抑制PPARδ基因表达的化合物相关，优选的方案包括采用PPARδ基因启动子与一个如荧光素酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶或相似的报道基因相连。报道基因在细胞中是否表达可以通过看一种试验化合物的存在与否来衡量。将能选择性地减少报道基因表达量的试验化合物挑选出来，这些化合物能有效抑制或减少PPARδ基因的表达，从而抑制PPARδ的活性。

与抑制PPARδ蛋白活性的化合物相关，其中期望被抑制的活性是PPARδ蛋白转录激活受它控制的基因的作用。因此，在一个方案中，如上列举的一个报道基因与一个在PPARδ控制下的启动子或增强序列相连。在PPARδ控制下的基因包括CYP4A6、酰基CoA氧化酶、脂蛋白脂酶基因；因此，这些基因的启动子均可以用于本发明的技术方案中。合成的来源于这些基因的增强序列与异源启动子相连，象HSV胸苷激酶基因可以用于本发明中。将一个包含启动子或增强子/报道基因的遗传结构转染合适的细胞，如单核细胞或巨噬细胞，COS-1或CV-1细胞及非洲绿猴肾细胞也可以使用。编码PPARδ的遗传结构也转染细胞，这样可以评估出试验化合物抑制报道基因表达的能力。在特别优选的方案中，被转染的细胞与一种已知的PPARδ兴奋剂如化合物F(参见WO97/28149第9页)与试验化合物一起温育，其中需要考虑到试验化合物干扰兴奋剂的能力。选择出能减少或抑制报道基因表达的化合物用于进一步的研究。

实施例3描述了进一步的方案，一种共催化剂/受体/配体互作检验(CARLA)方法，这种检验依赖于一种相应配体存在时共受体结合的独立性。在CARLA检验中，存在一种兴奋剂，可以评估出试验化合物干扰兴奋剂的能力。

本发明特别优选的化合物，是那些经无效转录与已经结合配体的PPARδ蛋白结合，从而抑制了PPARδ兴奋性配体作用的化合物。

作为本发明优选的一个技术方案，能在断定与PPARδ结合的化合物是否是一种PPARδ活性的抑制剂或兴奋剂变体前，通过一个“预筛选”步骤鉴别出这种化合物。受体配体结合检验已记载在文献中，本领域技术人员可以直接应用。

进一步优选的方案中，“预筛选”步骤实质上是泡沫细胞检验，该检验方法将在下面描述。因此，用这种方法可以挑选出阻止或减少巨噬细胞及其它细胞形成泡沫细胞或去除泡沫细胞的化合物，及PPARδ的抑制剂。

适宜地，巨噬细胞及其细胞是处于动脉粥样硬化病理学上的。

另一个方案中，PPARδ抑制剂可以通过控制PPARδ与共催化剂如SRC-1的互作的二次杂交的方法加以鉴别。本方案中，PPARδ(或是其中的一段功能性片段)与一个DNA结合蛋白(如GAL4的DNA蛋白结合域)融合，共催化剂分子或其一段功能部分(如SRC-1)与一个反式激活蛋白(如VP16的反式激活域)融合。这样，酵母将表达这些融合体，整合报道基因(如β-半乳糖苷酶)受到依赖于蛋白(如依赖于GAL4)的DNA结合启动子的调控。

酵母在PPARδ兴奋剂和大范围试验化合物存在时方能生长。低β-半乳糖苷酶活性的培养物表明了PPARδ兴奋剂的存在。

上述鉴别化合物的方法也能用于鉴别出可以或能产生化合物的引导化合物，其最终产生的化合物可以：(1)阻止或减少巨噬细胞及其它细胞形成泡沫细胞或去除泡沫细胞，(2)预防或用于治疗伴随着斑块形成的血管疾病和/或血管的血栓性阻塞，(3)预防或用于治疗癌症，(4)预防或用于治疗老年性痴呆。

本发明的其它方案，一旦挑选出能抑制或降低PPARδ活性的化合物，就可以方便地对它们进行进一步的筛选鉴定，例如，它们是否能阻止或减少巨噬细胞及其它细胞形成泡沫细胞或去除泡沫细胞，是否能预防或用于治疗伴随着斑块形成的血管疾病和/或血管的血栓性阻塞，是否能预防或用于治疗癌症，是否能用于治疗老年性痴呆。

相应地，巨噬细胞及其它细胞是包含在粥样硬化病理学上的细胞。

决定这些特性的筛选方法可以在申请文件(与泡沫细胞由巨噬细胞发育而来相关)或是文献中得知。

其它，进一步的有效筛选是在考虑了如化合物的稳定性、药理特性及药物代谢过程后进行的选择。相似地，筛选是在考虑了化合物选择性地抑制PPARδ活性后进行的选择。例如，筛选是在考虑了特定化合物是否可以改变其它PPAR型的基础上再进行选择，通常优选完全不改变其它PPAR型的化合物。然而，当选择的化合物能抑制PPARδ活性，但对于PPARγ是兴奋剂或催化剂时也许是有利的。同样，选择的化合物能抑制PPARδ的活性，但对于PPARα来说是激动剂或催化剂时也许也是有利的。

用本发明的筛选方法选择的化合物可以是一种类药物化合物。

对技术人员来说，术语“类药物化合物”可以包括有适用于药物特性的化合物，如药物中的活性成分。因此，这种类药物化合物可以是通过有机化学合成的分子，最好不是生物或生化分子，优选为分子量小于5000道尔顿的水溶性的小分子。类药物化合物能显示出有选择地与蛋白颗粒或蛋白互作、和/或渗入靶细胞膜的的特性，但这些特性不是关键的。

同样，术语“引导化合物”对于技术人员来说是公知的，即它本身不适合于用作药物(例如因为它对靶标是弱效的，作用是非选择性的，不稳定，不易溶解，难以合成或是弱的生物实用性)，但可以给其它有着众多有益特性的化合物提供一个设计的起点。

术语“类药物化合物”和“引导化合物”主要相对地指小的有机分子，而不是相对来说大的基于核酸的分子。不过，本发明筛选方法的许多技术方案适宜于鉴定基于核酸的分子，尤其是那些抑制PPARδ基因表达或PPARδ蛋白翻译的分子。

已知在药物发明中，通过一次筛选的引导化合物可以被修饰，修饰的化合物可以进一步被筛选鉴定它的活性。

本发明也涉及与特定脂肪诱导的泡沫细胞形成的体外模型，该模型可以用于鉴别出有用的化合物。

泡沫细胞的形成是第一步，其中当细胞受到炎症刺激物如PMA的刺激或直接与合适的生长因子如GMCSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)接触时，细胞转化成泡沫细胞的前体。第二步，前体细胞在适宜脂肪酸浓度时形成泡沫细胞。

因此，本发明的另一个方面提供了一种化合物的鉴定方法，该化合物作为产生所需化合物的引导化合物，所需化合物可以(1)阻止或减少巨噬细胞及其它细胞形成泡沫细胞，相应地，巨噬细胞及其它细胞是处于粥样硬化病理学上的，或阻止或减少这些去除泡沫细胞(2)预防或用于治疗伴随着斑块形成的血管疾病和/或血管的血栓性阻塞，该方法包括以下选择的步骤：

(a)一个合适的原始细胞群或细胞系，

(b)给细胞系提供一种炎症刺激物或能促进其分化成泡沫细胞前体的生长因子，

(c)给泡沫细胞前体一个合适的脂肪酸浓度，

(d)估测有无化合物时细胞中脂肪酸的积累量。

一个合适的原始细胞群或细胞系是处于动粥样硬化病理学上的。

细胞类型可以是任何适合的细胞类型，优选为白细胞，特别优选为巨噬细胞或巨噬细胞前体的白细胞系。

典型的细胞是THP-1或U937。THP-1可以从ECACC细胞保存号85011440获得，和U937可以从ECACC细胞保存号88081201获得。当然，任何合适的白细胞均可以使用，然而优选单核细胞或巨噬细胞。THP-1细胞是“类白细胞”，可以在佛波醇酯(PMA)刺激下分化成类似于巨噬细胞的细胞。

“提供给细胞一种炎症刺激物”包括任何有利于刺激细胞形成泡沫细胞的适合的炎症刺激物。

“能促进其分化成泡沫细胞前体的生长因子”包括任何适合的生长因子，象GMCSF和，在本发明中，优选PMA，或是一种与佛波醇酯具有相似功能的分子。

典型地，佛波醇酯是PMA，但它可以是任何合适的有利于细胞分化的佛波醇酯。

典型地，PMA使用的浓度在0.1到10ng/ml。

将脂肪酸供给血清中正在生长的细胞，我们发现来源于GibcoBRL的加热的惰性牛胎儿血清中脂质积累很低，因此采用标记控制程序性血清置换(CPSR-3)方法获得了高水平的脂质积累。可选择的，脂肪酸可以以合适的浓度供给(如被加到生长培养介质中)。合适的脂肪酸包括链长在18-22的单一或多聚不饱和脂肪酸，包括亚油酸。合适用于供给的脂肪酸浓度在10到100μM之间。

细胞中脂肪酸的积累可以用特定的方法测定出。尤为便利的方法包括脂肪酸染色技术，如Nile Red或Oil Red O染色，这可以在体外进行并通过可读盘读出。其它的方法包括TLC、HPLC和LC-MS。

测定存在或没有待测化合物的细胞中脂肪酸的积累，从中选出导致细胞中脂肪酸积累的化合物用于进一步的试验。

由于细胞能在多细胞培养盘(如64细胞培养盘)中生长，染色的脂质可以被定量化，如从微量计数板上直接目测出，所以很容易想到将筛选方法形成高效率的自动化筛选。

本发明进一步提供了用发明的筛选方法可以确定的化合物，该化合物用于药物，这些化合物的药物组合物还包括适宜于药用的载体。

我们认为用本发明的筛选方法鉴定出的和可以确定的化合物可以用于发明的治疗方法中。

以下的说明书、实施例和附图将对发明作进一步详细的描述。

附图1说明了PPARs在THP-1细胞中的表达。对PPARα及PPARδmRNA的RNA酶分析在从小鼠、人类肝脏和几种人类细胞系的总RNA中进行。Huh7细胞系是一种人类肝脏细胞系，包含了相对于从人类肝脏(＞1％肌动蛋白)中提取出来的总RNA可确定数量的PPARδ(黑带)和PPARα(白带)mRNA。Huh7和人类肝脏在脂质代谢和由包含受体结构的PPRE转录而来方面对过氧化物酶体增生并不起作用。单核细胞系如U937和THP-1细胞表达相对高水平的PPARδ(5％-6％的肌动蛋白)。其它人类组织如结肠、卵巢、睾丸、肾和肾上腺用于分析PPARα及PPARδ的表达。在所有的实施例中PPARα及PPARδ的表达水平小于1％肌动蛋白(数据未给出)。然而，这些复杂组织的个体细胞也可能表达出显著水平的这些受体。

附图2说明了粥样化遗传基因在THP-1细胞中的表达。为了验证伴随粥样化遗传过程各种基因产物的表达，使用RT-PCR技术分析了THP-1细胞中的总RNA。利用琼脂糖凝胶溴化乙锭染色法分析了正常生长条件(-PMA)时的THP-1细胞，及在亚油酸存在时经佛波醇酯(+PMA)处理的粘连的THP-1细胞。所有的探针均设计成跨外显子/内含子的交界，从而不能扩增基因组DNA。

附图3说明了脂肪酸和rexinoids促进了被rosiglitazone抑制的泡沫细胞的形成。Rexinoids是一种药物，特别是一种RXR类药物，象9-顺式类维生素A酸和配体药用化合物LG100268(Mukherjee R等，1997，Nature，386，407-410)。Rosiglitazone由SmithKlineBeecham制成，也被称为Avandia，BRL49653。

A.脂肪酸和rexinoids在泡沫细胞形成中的共同作用。

用5ng/ml的PMA和DMSO(二甲基亚砜：0.5％)、亚油酸(30μM)、LG 100268(5μM)和含有LG 100268的亚油酸连续处理THP-1细胞三天后，将细胞混入0.66M的多聚甲醛，用饱和的Oil Red O染色，接着用苏木精复染色。增加的脂质积累在亚油酸或LG 100268的处理下可以观察出来。两种化合物的添加对脂质积累产生了一种加性效应。

B.Rosiglitazone促进了脂质的清除。

PMA处理的THP-1细胞用20μM的BRL49653连续处理三天，脂质积累的染色如上所述。

附图4说明了rosiglitazone在THP-1细胞中对基因的调节。

A.rosiglitazone降低了IL-1β的表达。

采用RNA酶保护法分析在受控的由PMA处理的THP-1细胞(+PMA)、PMA和亚油酸处理的细胞(+PMA+FA)、PMA与BRL49653处理的细胞(+PMA+BRL)中白细胞介素1βmRNA的水平。同样通过肌动蛋白标准信号表现出来。

B.rosiglitazone降低了TNFα的表达。

采用RNA酶保护法分析在受控的THP-1细胞(-PMA)、PMA处理的细胞(+PMA)、PMA和亚油酸处理的细胞(+PMA+FA)、PMA与BRL49653处理的细胞(+PMA+BRL)中TNFαmRNA的水平。同样通过肌动蛋白标准信号表现出来。

C.rosiglitazone增强了CD36的表达。

采用活性细胞分类(FACS)分析在受控的THP-1细胞(-PMA)、PMA与BRL49653处理的细胞(+PMA+BRL)中的CD36抗原的表达。细胞从培养板上刮下，与结合CD36(犁刀免疫法)的FITC(异硫氰酸荧光素)混合温育。FACS分析用一个犁刀EPICV型细胞分类器进行。

附图5说明了连续表达PPARδ细胞系的产生。编码人类PPARδ的全长序列亚克隆进真核表达载体pCLDN(Brighty等，1991，Proc.Natl.Acid.Sci.，USA，88，7802-7805)。用一个修饰的DEAE-右旋糖苷程序(Fujita等，1986，Cell，46，401-407)将上述质粒转染进THP-1细胞。细胞保存在含有1mg/mlG418和10％THP-1的介质中，并用严格的洗涤程序将死细胞除去，直到可以观察到细胞死亡停止、生长旺盛时为止。我们观察了六个分别包含载体pCLDN(空载体)、pCLDNPPARδ、pCLDNPPARδAS、pCLDNPPARα、pCLDNPPARαAS的细胞系。“AS”意味着反义结构。所有这些细胞系基本上同一地生长和存活。最早的分化试验是在选择介质中的PPARδ细胞系上进行的。所有包含空载体结构的对照系均是阴性的。除了PPARδ反义系显示出锥虫蓝吸收外，PMA处理后的其它各种结构的细胞仍然存活。细胞接着培养在没有G418的条件下，直到空载体对照系对PMA作出反应，与亲代调控模型相似。这些揭示了pCLDNPPARδ系可以用相似的模型区别，但pCLDNPPARδAS却不能。

通过PPARδ反义细胞系获得RNA及蛋白，并进一步采用RNA酶保护法(B)分析PPARδmRNA及通过蛋白质印迹法(C)分析PPARδ蛋白。6个系PPARδmRNA的表达要比亲代细胞系高出10％，远远超出由PMA处理的细胞中观察到的表达水平。高水平的PPARδ蛋白在指定的δ-1和δ-2细胞系中观察到。其它4个细胞系没有采用蛋白质印迹法进行分析，故接下来的试验在这些细胞系中进行。

图六说明了PPARδ的过量表达促进了泡沫细胞的形成。

A.亲代THP-1细胞和pCLDNPPARδ系细胞用5ng/mlPMA和DMSO(0.5％)或BRL49653(50μM)连续处理3天，将细胞混入0.66M的多聚甲醛，用饱和的Oil Red O染色，接着用苏木精复染色。随后的试验表明BRL49653在微摩浓度下时是有效的。

B.培养物按如上处理，然后用甲醇/氯仿/PBS(体积比为1∶1∶1)抽提。有机相连续分布于硅胶TCL板(水银∶硅胶浓度比为60)上，缓冲液成分为庚烷(80％)，二乙基以太(18％)及乙酸(2％)。脂质在甲醇中被磷钼酸气雾剂染色。游离胆固醇(FCHOL)、游离花生四烯酸(FFA)、高度不饱和三酰甘油(TG)、脂肪酸甲基酯(FAME)和胆固醇酯(CE)及丁化羟苯甲醚(BHT)的相对迁移率可以从缓冲液中显示出来。

图7说明了脂肪酸流出物出现在被激活的PPARδ过量表达的细胞中。A.脂肪酸吸收

含有1百万个细胞的2ml介质与5μCi³H-油酸一起过夜温育，其中可以添加100μM亚油酸(即分别造成高脂肪和低脂肪两种条件)。然后将细胞沉淀、洗涤和重悬在不含脂肪酸的澄清介质中。采用一种等分试验介质和洗净细胞的闪烁记数法来确定渗入脂肪酸的百分率。B.脂肪酸分泌

洗涤的细胞继续温育50个小时，放射性的释放受到全程监控。亲本细胞在高脂时呈棱形，低脂时呈方形。PPARδ过量表达的细胞在高脂时呈三角形，低脂时呈圆形。C.PMA活化细胞中脂肪酸的分泌

用PMA处理细胞，并如上所述与放射性标记的油酸一起温育。洗涤粘连的细胞，细胞放射性的释放受到全程监控。亲本细胞系(方形)比PPARδ过量表达的细胞(棱形)的放射活性要强。

图8说明了ApoE基因的表达受到经由PPARδ的脂肪酸的调控。

总RNA从由PMA(THP-1)或PMA与亚油酸(THP-1+FA)处理的亲本YHP-1细胞系、没加处理的PPARδ过量表达的细胞中提取。CDNA从RNA样本中提取，用TAQMAN程序分析ApoE序列。β-肌动蛋白的表达表明该结果是一种相对正常的表达，阴性条带代表了相同样本中的标准差。

图9表明了PPARδ抑制剂防止了泡沫细胞形成。用5ng/mlPMA对细胞进行过夜处理，对其分化(附着于培养盘)和成活力(锥虫蓝排除法)进行评分。亲本THP-1细胞和PPARδ过量表达细胞(有义)在PMA存在时能很好地分化。然而，PPARδ反义表达细胞(反义)根本不进行分化，变得能高度浸透锥虫蓝。PPARδ反义细胞在不存在PMA时有着高成活力，能正常生长。

图10表明了PPARδ阻止死亡不处于PKC下游。亲本和PPAR δ反义细胞与PMA、PKC的(抑制剂Bis)、PLA2活性的抑制剂(OBAA和麦帕克林)一起温育。这些抑制剂包括以一定的浓度用于前面对抑制的研究。

抑制剂可以从Sigma公司购得。OBAA是3-(4-十八烷基)苯甲酰丙烯酸可以以Calbiochem购得。麦帕克林是6-氯-9-[(4-二乙氨基)-1-甲基丁基]氨基-2-甲氧基-吖啶可以从Calbiochem公司获得。

所有的抑制剂防止了亲本THP-1细胞(A)的分化。这证实了在佛波醇酯作用过程中PKC所起的作用。PLA2抑制剂的作用显示出了巨噬细胞分化的新的一面。然而，当用锥虫蓝排除法(B)来检测这些细胞的成活力时，我们发现这些抑制剂并不能阻止PMA诱导的PPARδ反义细胞系(黑带)的“死亡”。只有麦帕克林在亲本细胞系(白带)中表现出一些毒性的迹象。

图11表明了PPARδ的一种兴奋剂化合物F能促进脂质积累。

图12表明了化合物F，PPARδ的一种兴奋剂，促进了THP-1神经胶质细胞形成巨噬泡沫细胞。

图13表明了化合物F促进了人类初级单核细胞形成巨噬泡沫细胞。

图14表明了PPARδ促进了神经胶质细胞中脂质的积累。

图15表明了化合物F刺激了前列腺癌细胞系的增殖。

        说明书：PPARδ在泡沫细胞形成中的作用

组织培养

星形恶性胶质细胞瘤U373细胞在RPMI1640培养介质中生长，该介质补充了体积比为10％的热激牛胎儿血清(GibcoBRL，Paisley，Scotland)、青霉素(5000IU/ml)(GibcoBRL，Paisley，Scotland)和链霉素(5000μg/ml)(GibcoBRL，Paisley，Scotland)。培养物在37℃和5％的CO₂环境下生长，直到达到100％的融合。

细胞系的药物处理

融合的细胞铺在充满2ml如上组织培养介质的六孔检测盘中，并用5μM和10μM的PPARδ特异性的兴奋剂——化合物F进行处理，DMSO用于调控。化合物和介质每三天更换一次，连续处理一个星期。

染色实验

Oil Red O染色、苏木精复染色实验在如上所述的每个处理中的细胞中进行。倒掉介质，用PBS(2ml)冲洗样孔。细胞和10％福尔马林(1ml)混合一个小时，然后用PBS漂洗两次，再用60％的异丙基乙醇简单漂洗。添加Oil Red O溶液(1ml)(Sigma)处理三个小时后将之去掉。接着用PBS冲洗样孔两次。用苏木素复染色(1∶10，1ml)五分钟后用PBS漂洗两次将之去掉，但第二次的洗涤液留在样孔内。

结果

一周后，处理的细胞没有发生脂质积累。而由化合物F处理的细胞，可以观察到呈巨大囊状的脂质积累，如，脂质积累不仅发生在核周区域，而且在星形胶质细胞形成过程中。

实施例1：PPARδ在动脉粥样硬化泡沫细胞形成过程中的作用

活化的巨噬细胞表达所有三种形式的过氧化物酶体增殖激活受体，即所谓的α、γ和δ。在本实施例中，我们证明了PPARδ的表达是佛波醇酯激活巨噬细胞所必需的，同时PPARδ促进了巨噬泡沫细胞的形成。前面已经说明PPARγ兴奋剂有着极强的抗炎症作用，对巨噬细胞的活化起着负调节效应。本实施例显示PPARγ的兴奋剂rosiglitazone能抑制巨噬泡沫细胞的形成。因此，PPARγ和PPARδ在巨噬细胞脂质代谢和分化过程中起着相反的调节作用。令人惊讶的是结果表明PPARδ的抵制拮抗性配体是治疗心血管疾病的非常有效的候选药物。实验物质和方法已经在图例中描述。结果泡沫细胞模型的确定

单核细胞系广泛用于粥样硬化形成的基础研究。我们已经研究了脂质和食物脂肪的影响，及重压和炎症的影响。人类THP-1细胞系是这种研究中最常用的细胞系。正常条件下，这种细胞系在悬浮液中生长，然而在细胞发生粘连、更类似于巨噬细胞处，炎症刺激物如佛波醇酯促使有力的分化和炎症反应。脂肪酸及氧化LDL促使细胞系改变基因表达，氧化LDL显示出能促进细胞质的脂质积累。这些调节现象看作是动粥样硬化斑块形成过程的初始事件。

我们观察到佛波醇酯刺激THP-1细胞、导致PPARδmRNA水平大幅度提高的现象，因此认为炎症过程与这些细胞脂质病理学之间具有联系。其它的组表明炎症刺激物并不调节小鼠和人类巨噬细胞和来源于单核细胞的细胞系如THP-1和U937细胞中PPARγ的表达(13-15)。PPARδ也能在硫代乙醇酸盐引起的小鼠腹膜巨噬细胞中表达(13)。我们同时证明了活化的THP-1细胞表达许多与动脉粥样化有关的炎症基因产物如MCP(化学引诱剂蛋白)、IL-8、II-1β和凝血噁烷合成酶(图2)，并且这种产物的表达受到脂肪酸的调控。阿朴酯蛋白E的表达提高了活化作用，其受到脂肪酸严格的抑制是重要的。这些结果表明，体系在适宜方式中对脂肪酸和炎症刺激物的反应被认为是人类血管疾病的一种好的模型。我们也观察到用多聚不饱和脂肪酸如亚油酸处理粘连的THP-1细胞，导致了细胞质中脂质小滴的积累(图3A)。这些负载脂质的巨噬细胞被称之为泡沫细胞。活化的维生素AX受体(LG100268)的配体与脂肪酸共同作用促进了泡沫细胞的形成，表明了在泡沫细胞形成中存在过一个PPAR/RXR的异二聚体。亚油酸不是PPARδ的特异性配体，但却发现它能有效地激活PPARα和δ，但是它对PPARγ是一种相当差的兴奋剂。用PPARα激活剂Wy14643处理细胞后并没产生任何效果，相应的这种PPAR型在巨噬细胞中表达量很少(图1)。使用rosiglitazone，即BRL49653也没有导致泡沫细胞的形成；然而，这些细胞包含有PPARγ。实际上，用BRL4965处理的细胞中脂质的积累相对于没处理的细胞减少了(图3A)，同时BRL4965可以抑制亚油酸和rexinoid促进泡沫细胞的形成(数据未给出)。综合这些数据，第一次表明了在泡沫细胞形成中，PPARδ是脂肪酸的靶分子，PPARγ是泡沫细胞形成机制中的负调节剂。Rosiglitazone(BRL49653)阻止泡沫细胞的形成

我们的数据支持了PPARγ在巨噬细胞活化和脂质积累中的对抗性作用。我们已经观察到用BRL49653处理后的THP-1细胞比没有处理的细胞的细胞粘连要慢(数据未给出)。这种抑制作用也在Nature上的两篇文献中提到了，其中论证了由PPARγ负调节的炎症中介物(13，14)。通过检验BRL49653在IL-1β表达中的效用，我们进一步证实了TZD′s的抗炎症作用。实际上BRL49653的处理导致了IL-1βmRNA水平的降低(图4A)。相对于肌动蛋白的TNFαmRNA的减少也被观察到，然而这种减少不是很显著(图4B)。在THP-1细胞中通过清除受体CD36的脂质的吸收受到PPARγ的调节(16，17)，我们发现CD36受到活化的THP-1细胞中TZD的调节，然而这些细胞不形成泡沫细胞(图2)。因此CD36过量调节对于泡沫细胞形成是不够的，PPARγ活化作用的总体效应是阻止泡沫细胞形成。TZD′s是包括BRL49653在内的噻唑烷类药物。泡沫细胞模型的遗传调节

为了证实PPARδ是否存在于脂肪酸诱导的泡沫细胞形成中，选择从过量表达PPARδ或表达PPARδ反义mRNA的THP-1细胞产生的细胞系。将编码PPARδ的cDNA克隆进一个在来源于人类细胞巨化病毒增强子调控下指导转录的载体(pCLDN)(图5A)中。这个载体包含对靶细胞具有选择性的新霉素抗性基因。CDNA从两个方向上插入，为了促使PPARδ蛋白从有义DNA上表达(PCLDNPPARδ-S)及反义方向上阻止PPARδ表达(PCLDNPPARδ-AS)。将PCLDNPPARδ-S或PCLDNPPARδ-AS转染THP-1细胞，并用1mg/mlG418进行选择，直到观察到细胞在G418中旺盛地生长。然后根据G418选择出细胞，而单独调控载体在G418存在时不进行分化。已知G418是一种蛋白激酶C活性的抑制剂，因此G418也能抵制佛波醇酯的作用。G418选择后，采用RNA酶保护(图5B)和蛋白质印迹法(图5C)证实了在六个独立转染的多克隆细胞系中PPARδ的过量表达。这些细胞系正常生长，并不表现出对组织培养瓶的任何附着；然而当用PMA处理时，与野生型细胞相比，它们开始发生粘连，并积聚大量的细胞内脂，即使是在没有添加脂肪酸的情况下(图6)。BRL69453处理细胞后能防止PPARδ引起的泡沫细胞的形成。脂肪酸分析表明细胞内增加的脂质主要是三酰甘油，通过BRL69453的作用减少了脂质的总量(图6B)。使用氰化的油酸我们分析了亲本细胞和PPARδ过量表达的细胞中脂肪酸的吸收和分泌。我们发现在非激活状态时，两种细胞系的脂肪酸的吸收和分泌实质上是相同的(图7A和B)。然而在激活状态时，PPARδ过量表达的细胞中脂肪酸的分泌显著要弱(图7C)。

PPARδ过量表达的细胞相对于亲本细胞的ApoE mRNA的水平是显著降低(35％)的(图8)。重要的是注意到ApoE降到了与观察到的经亚油酸处理的亲本细胞系的相同水平。数据揭示了PPARδ介入了脂肪酸抑制ApoE基因表达的过程。表达PPARδ反义RNA(PPARδAS)的细胞也能正常生长，然而，当用PMA处理后，这些细胞不进行分化(图9A)。在任何PMA浓度(0.1ng-25ng/ml)时分化均看不见。锥虫蓝对经PMA处理的PPARδAS的细胞过夜染色，结果表明细胞死亡了(图9B)。这里没有当由DAPI(4N，6-二酰胺-2-phenylindole，Molecular Probes，俄勒冈州)染色鉴定DNA浓缩的证据(数据未给出)。

对死亡细胞中提取的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳，看不到的DNA的断裂(数据未给出)。因此，PMA处理PPARδ反义细胞并不表现出细胞的程序性死亡。我们证实使用PKC和磷脂酶A的抑制剂，可以阻断亲本THP-1细胞的分化(图10A)；然而，在佛波醇酯和这些抑制剂存在时，PPARδ反义细胞发生了死亡(图10B)。这表明在分化过程中死亡的原因不是处于PKC活性的下游。

我们已经证实PPARδ是巨噬细胞炎症性激活所需要的(如通过活化的THP-1细胞证实的)，同时PPARδ促进了泡沫细胞的形成。PPARδ的过量表达显著改变了这些细胞中脂质的储存，其中部分是通过改变了编码阿朴酯蛋白基因地表达完成的。PPARδ活性的抑制剂可以阻止泡沫细胞的形成和药物的发展，这些药物属于PARδ活性的抑制剂，能用于防止和/或治疗表现为动脉粥样化结果的一大批紊乱。实施例2：一种PARδ的反作用剂促进了脂质积累

一种PPARδ的选择性的反作用剂(化合物F，专利文件WO9728149第9页)促进了在实施粒1描述的THP-1鉴定中的脂质积累和泡沫细胞的形成。虽然WO9728149提出了采用这种PPARδ反作用剂(同其它公开的化合物)治疗心血管疾病，我们却证实了这种化合物能促进泡沫细胞的形成。这种结果是显著的，至少在500nM和最大在5μM和10μM之间(见图11A)。化合物F与RXR配体LG100268共同作用，促进泡沫细胞的形成(见图11B)。这种药理学特性是可以从实施例1中总结出来的。化合物F促进了THP-1细胞(图12)和初级人类单核细胞(图13)形成巨噬细胞泡沫细胞。实施例3：PPARδ活性抑制剂的筛选粘合物化验放射性配体筛选化验

如WO9728149文中和Berger等(1999，J.Biol.Chem.，274，6718-6725)中描述的，在K_d＝1nM的化合物L-783483存在时，将重组的hPPARδ与放射性配体[³H]₂L-783483混合。通过真空压将将倒入混合纤维素过滤器的混合物进行过滤。残留在过滤器中的放射活性将代表L-783483结合在了PPARδ上。放射性范围的减少将意味着一种PPARδ的竞争性化合物的存在。这种化验表明了试验化合物的结合特性。荧光脂肪酸转移

顺式或反式十八碳四烯酸的粘合物提供了一种对PPAR配体的荧光鉴定。“顺式十八碳四烯酸”是9，15-顺式，11，13反式十八碳四烯酸。“反式十八碳四烯酸”是9，11，13，15反式十八碳四烯酸。它们均可以从Molecuar Probes，Oregon获得。如果试验化合物的显著粘合发生，与脂肪酸/PPAR存在时相比，重组的PPARδ与这些脂肪酸和试验化合物混合后将产生少量的荧光，这个化验表明试验化合物是否与PPARδ发生了粘连。

这种化验可以在适宜荧光计的多孔中自动进行，提高了效率。共催化剂/受体/配体互作化验(CARLA)

PPARδ与共催化剂蛋白粘连象RIP140和SRC-1粘连，依赖于配体的存在。RIP140和SRC-1是可以粘合PPARδ(Krey等，1997，Nlol.Endocrinol.11，779-791)。在³⁵P标记的蛋氨酸存在时，共催化剂在体外与试验化合物存在时的纯化的重组hPPARδ混合，可以发生转变。HPPAR将免疫沉淀出，沉淀物可以通过SDS/PAGE和放射能照相方法进行分析，相对于共受体的一种放射性信号的存在表明了PPARδ配体的存在。这种化验可以用于鉴别有可能为反作用剂的共催化剂粘合物；这些可以通过出现在每个化验中的兴奋剂完成(见上文)。功能的化验短暂的转染受体结构化验

用一个PPARδ地表达结构和一个依赖于PPAR增强子调控的荧光素酶受体结构转染Cos-1或CV-1细胞。依赖于PPARδ的增强子包括来源于acyl-CoA氧化酶和细胞色素P4504A6基因的增强子。这可以在各种标准的多孔培养物中进行，转染的细胞用一种已知的PPARδ兴奋剂和试验化合物进行处理。细胞在体外融解，用一个照度计化验荧光素酶的活性。照度计适合用于高效率地筛选。。上述化验检测了试验化合物阻断一种PPARδ兴奋剂活性的能力。稳定细胞系受体结构分析

用除了编码抗生素抗性标记得上述那些相近结构转染细胞。这样可以选择能稳定表达PPARδ和包含整合进基因组受体结构的细胞系。细胞系生长并用于剔除PPARδ活性化合物，而不需要重复和昂贵的转染。实施例4：泡沫细胞分析

泡沫细胞分析用于鉴别潜在的抗动脉粥样化化合物。为了诱导巨噬细胞分化，在96-孔板培养的THP-1细胞用0.1到10ng/mlPMA处理。THP-1细胞可以根据ECACC序列号88081201获得。

提供的一个脂肪酸的来源是血清(来自Sigma的CPRS-3血清替代品)或是20-100μM的亚油酸。

在分化的巨噬细胞中脂肪酸的积累可以通过Nile Red染色3至7天后试验化合物的有无来衡量。

相对于不存在化合物时，能减少脂肪酸积累的试验化合物可以被选作抗动脉粥样化剂或作为引导物质。

实施例5：前列腺癌症细胞检测

我们发现PPARδ兴奋剂，化合物F，可以刺激前列腺上皮生长。最低限度转化的细胞PNT1A和非转化前列腺癌症细胞(LNCaP)被低于40％的低浓度化合物F刺激生长。RXR配体LG100268也能产生这种效果。而且，低浓度化合物F和LG100268并不显著地提高细胞的生长，当同时加入培养介质中后可以刺激细胞的生长。这些细胞系中的高度转化的前列腺癌症细胞系PC3生长得最快，同时不受化合物F的刺激。

我们用PPARδ反义RNA的表达结构转染PC3细胞，这些细胞均不生长。相反，建立了表达PPARγ反义RNA的细胞系，该细胞系发生了改变，但能支持生长。在所有试验中，包含空表达载体的细胞系同时产生，没有表型。这些试验支持了这种主张，即PPARδ是具有前增殖性的，PPARδ的兴奋剂可以用于治疗癌症。

将细胞系铺在在24孔板上，每孔2500个细胞，培养在含有5％右旋糖苷包被的木炭处理的FCS的RPMI中。化合物F和LG100268增加的浓度包含在培养介质中，培养物保持7天，其中每48小时更换药物和介质。最后每个样孔中细胞的数量可以用比色化验法确定(Landegreen U.J.，1984，mmunol.Meth.67，379-388)，其相对生长可以表示为在样孔中细胞数量的百分数。

参考文献：

1.Issemann，I.& Green，S.(1990)＂用过氧化物酶体增生因子激活类固醇激素受体家族一员＂Nature 347，645-50.

2.Dreyer，C.et al(1992)＂用一种新的核激素受体调控过氧化物酶体的β-氧化途径＂Cell 68，879-87.

3.Palmer，C.N.A.et al(1998)＂α-受体激活的过氧化物酶体增殖因子在人类肝脏中的表达＂Molecular Pharmacology53，14-22.

4.Lee，S.S-T.et al(1995)＂小鼠中过氧化物酶体增生激活受体α型基因靶性断裂导致过氧化物酶体多效性作用消失＂Mol.Cell.Biol.15，3012-3022.

5.Forman，B.M.et al(1995)＂15-脱氧-δ12，14-前列腺素J2是脂肪细胞决定因子PPARγ的一个配体＂Cell 83，803-812.

6.Lehmann，J.M.et al(1995)＂一种抗糖尿病的thiazolidinedione是对过氧化物酶体γ具有高度亲和力的配体＂J.Biol.Chem.270，12953-12956.

7.Barak，Y.et al(1998)＂由于假定的胎盘缺陷导致了缺PPARγ的早期小鼠的致死性＂Abstract No 303.Keystone Symposium onThe Nuclear

Receptor Gene Family.Incline Village，Nevada.

8.Schmidt，A.et al(1992)＂对能被过氧化物酶体增生因子和脂肪酸激活的类固醇激素受体超家族的新成员的鉴定＂MolecularEndocrinology 6，1634-1641.

9.Saxena，U.et al(1992)＂酯蛋白酯酶介导的极低密度酯蛋白的酯解增强了单核细胞对大动脉内皮细胞的粘附作用＂Biochemical & Biophysical Research Communications189，1653-1658.

10.Frostegard，J.et al(1990)＂氧化低密度酯蛋白诱导人类单核细胞和单核性细胞系U937的分化和粘附＂Proc.Nat.Acad.Sci.USA 87，904-908.

11.Terkeltaub，R.et al(1994)＂氧化LDL诱导单核细胞表达白细胞介素-8，一种具有T-淋巴细胞趋化活性趋化因子＂Arterioscler.Thromb.14，47-53.

12.Ross，R.(1993)＂动脉硬化症的发病机理；九十年代的一种观点＂Nature 362，801.

13.Ricote，M.et al(1998)＂过氧化物酶体增生因子γ是巨噬细胞活性的负调节因子＂Nature 391，79-82.

14.Jiang，C.et al(1998)＂PPARγ兴奋剂抑制单核细胞炎症因子＂Nature 391，82-86.

15.Marx，N.et al(1998)＂人类动脉粥样化的巨噬细胞包含PPARγ’Am.J.

Pathol.153，17-23.

16.Tontonoz，P.et al(1998)＂PPARγ促进了单核和巨噬细胞的分化和氧化LDL的吸收＂Cell 93，241-252.

17.Nagy，L.et al(1998)＂氧化LDL通过PPARγ配体的活化作用调节巨噬细胞基因表达’Cell 93，229-240.

Claims (49)

1.一种阻止或减少巨噬细胞或其它细胞形成泡沫细胞、或去除泡沫细胞的方法，该方法包括用有效量的一种PPARδ活性抑制剂与所述巨噬细胞、其它细胞或泡沫细胞接触。

2.一种阻止或减少患者体内巨噬细胞或其它细胞形成泡沫细胞、或去除泡沫细胞的方法，该方法包括给患者使用有效数量的一种PPARδ活性抑制剂。

3.一种如权利要求2所述的方法，其中巨噬细胞或其它细胞形成泡沫细胞与任一种粥样硬化症或与动脉硬化症、心脏病、中风、外周血管疾病、绞痛、再狭窄和动脉粥样化相关联的疾病相关联。

4.一种预防或治疗患者与斑块形成和/或血管血栓阻塞相关血管疾病的方法，该方法包括给患者使用有效数量的一种PPARδ活性抑制剂。

5.一种如权利要求4所述的方法，其中血管疾病是任一种粥样硬化症、心脏病、中风、外周血管疾病。

6.一种阻止或减少细胞增生的方法，该方法包括细胞与一种PPARδ活性抑制剂接触。

7.一种治疗或预防患者癌症的方法，该方法包括给患者使用有效数量的一种PPARδ活性抑制剂。

8.一种如权利要求6所述的方法，其中癌症是任一种皮肤癌、乳腺癌、结肠癌或前列腺癌。

9.一种治疗或预防患者老年痴呆症的方法，该方法包括给患者使用有效数量的一种PPARδ活性抑制剂。

10.一种如前所述任一项权利要求的方法，其中PPARδ活性抑制剂是一种抑制细胞内PPARδ表达的化合物。

11.一种如权利要求10所述的方法，其中化合物是基于核酸的分子。

12.一种如权利要求11所述的方法，其中细胞内抑制PPARδ活性地基于核酸的抑制剂是任一种PPARδ选择性反义分子或PPARδ选择性核酶。

13.一种如权利要求1-9所述的方法，其中化合物抑制了PPARδ蛋白的活性。

14.一种如前所述任一项权利要求的方法，其中PPARδ活性拮抗肌是一种能阻断PPARδ兴奋剂作用的化合物。

15.一种用于药物的PPARδ活性抑制剂。

16.一种药物组合物，该组合物包含一种PPARδ活性抑制剂和一种药理上可接受的载体。

17.PPARδ活性抑制剂在制备阻止或减少患者体内巨噬细胞形成泡沫细胞或去除泡沫细胞的药物中的应用。

18.PPARδ活性抑制剂在制备预防或治疗与斑块形成和/或血管血栓阻塞相关血管疾病药物中的应用。

19.PPARδ活性抑制剂在制备治疗或预防癌症药物中的应用。

20.PPARδ活性抑制剂在制备治疗或预防老年痴呆症药物中的应用。

21.一种鉴别可以或能够产生用于药物的化合物的引导化合物的方法，该方法包括选择一种抑制PPARδ活性的化合物。

22.一种鉴别可以或能够作为引导化合物来产生另一种化合物的的方法，该引导化合物产生的化合物可以，(1)阻止或减少巨噬细胞或其它细胞形成泡沫细胞，或去除泡沫细胞；或(2)预防或用于治疗与斑块形成和/或血管血栓阻塞相关的血管疾病；(3)预防或用于治疗癌症；或(4)预防或用于治疗老年痴呆症，该方法包括选择一种抑制PPARδ活性的化合物。

23.一种如权利要求22所述的方法，其中鉴别出的化合物被进一步筛选测试来检测其是否(1)阻止或减少巨噬细胞或其它细胞形成泡沫细胞，或去除泡沫细胞；或(2)预防或用于治疗与斑块形成和/或血管血栓阻塞相关的血管疾病；或(3)预防或用于治疗癌症；或(4)预防或用于治疗老年痴呆症。

24.一种如权利要求22所述的方法，其中鉴别出的作为引导化合物的化合物是被修饰的。

25.一种鉴别抑制PPARδ活性化合物的方法，该方法包括从所有能抑制PPARδ活性的化合物的一个试验化合物库中进行选择。

26.一种如权利要求22-24任一权利要求所述的方法，其中根据化合物抑制PPARδ蛋白功能或活性的能力来选择化合物。

27.一种如权利要求22-25任一权利要求所述的方法，其中根据化合物抑制细胞内PPARδ的产生来选择化合物。

28.一种鉴别可以或能够作为引导化合物来产生一种化合物的的方法，产生的化合物(1)阻止或减少巨噬细胞或其它细胞形成泡沫细胞，或去除泡沫细胞；或(2)预防或用于治疗与斑块形成和/或血管血栓阻塞相关的血管疾病，该方法包括以下的步骤选择：

(a)一个合适的初级细胞群和细胞系，

(b)供给细胞系一种炎症刺激物或能促进其分化成泡沫细胞前体的生长因子，

(c)供给泡沫细胞一个合适的脂肪酸浓度，和

(d)测定在化合物存在或不存在时细胞内脂肪酸的积累。

29.一种如权利要求28所述的方法，其中初级细胞群包括外周单核细胞和巨噬细胞，且细胞系是真核细胞系。

30.一种如权利要求29所述的方法，其中真核细胞系是单核细胞性或类巨噬细胞的细胞系。

31.一种如权利要求30所述的方法，其中细胞是THP-1或U937细胞。

32.一种如权利要求28-31任一项权利要求所述的方法，其中生长因子是一种佛波醇酯或GMCSF。

33.一种如权利要求32所述的方法，其中佛波醇酯是PMA。

34.一种如权利要求28-33任一项权利要求所述的方法，其中脂肪酸由血清提供或是用亚油酸。

35.一种如权利要求27-34任一项权利要求所述的方法，其中脂肪酸积累通过脂肪酸染色来测定。

36.一种用任一权利要求21-35所述方法可鉴别出的化合物。

37.一种如权利要求36所述的用于药物的化合物。

38.一种药物组合物，该组合物包含一种如权利要求36所述的化合物和一种适宜于药用的载体。

39.一种如权利要求1-12任一项权利要求所述的治疗方法，其中PPARδ活性抑制剂可以用权利要求21-36所述方法鉴别。

40.一种阻止或减少巨噬细胞或其它细胞形成泡沫细胞、或去除泡沫细胞、或预防或治疗与斑块形成和/或血管血栓阻塞相关的血管疾病的方法，该方法包括给患者使用有效数量的用权利要求27-33任一项所述方法鉴别出的化合物。

41.如权利要求16-19任一项的用途，其中PPARδ活性抑制剂可以用权利要求21-36所述方法鉴别。

42.用权利要求28-35任一项所述方法鉴别出的化合物在制备药物中的用途，该药物阻止或减少巨噬细胞或其它细胞形成泡沫细胞、或去除泡沫细胞、或预防或用于治疗与斑块形成和/或血管血栓阻塞相关的血管疾病。

43.任一在这公开的预防或治疗与斑块形成和/或血管血栓阻塞相关血管疾病的新的治疗方法。

44.任一在这公开的鉴别用于预防或治疗与斑块形成和/或血管血栓阻塞相关血管疾病的化合物的新方法。

45.一种预防或治疗炎症紊乱的方法，该方法包括给患者使用有效量的PPARδ活性抑制剂。

46.一种如权利要求1所述的方法，其中巨噬细胞或其它细胞涉及粥样硬化病理学过程。

47.一种如权利要求2所述的方法，其中巨噬细胞或其它细胞涉及粥样硬化病理学过程。

48.一种如权利要求17所述的应用，其中巨噬细胞涉及粥样硬化病理学过程。

49.一种如权利要求22所述的方法，其中巨噬细胞或其它细胞涉及于粥样硬化病理学过程。

Images