CN1355880A

CN1355880A - 生物传感器

Info

Publication number: CN1355880A
Application number: CN00809067.XA
Authority: CN
Inventors: 中南贵裕; 渡边基一; 池田信; 南海史朗
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Holdings Corp
Priority date: 1999-11-16
Filing date: 2000-11-16
Publication date: 2002-06-26
Anticipated expiration: 2020-11-16
Also published as: ATE331949T1; WO2001036955A1; US6740215B1; EP1235069A4; DE60029127D1; EP1235069B1; CN1162699C; DE60029127T2; EP1235069A1; ES2267583T3

Abstract

本发明涉及的生物传感器具备绝缘性基板,包含配置在前述基板上的工作电极和配极的电极系统,至少含有氧化还原酶、亲水性高分子及电子传递体的试剂系统。前述试剂系统中包含可使作为测定对象的底物和前述氧化还原酶直接反应而生成的有机生成物转变为其他化合物的物质。

Description

生物传感器

技术领域

本发明涉及能够以高精度迅速地对试样中包含的葡萄糖等底物进行定量测定的生物传感器。

背景技术

以实现一般的人体体液组分的简单定量为目的，近年开发了利用酶所具有的特异催化剂功能的各种类型的生物传感器。

以下，作为对试样溶液中的组分进行定量的法之一，对葡萄糖定量法进行说明。众所周知，电化学葡萄糖定量法一般是组合使用葡萄糖氧化酶(以下简称为GOD)和氧电极或过氧化氢电极的方法。

GOD以氧为电子传递体选择性地将作为底物的β-D-葡萄糖氧化为D-葡糖酸-δ-内酯。在氧存在下，GOD所进行的氧化反应过程中，氧被还原为过氧化氢。用氧电极对氧的减少量进行测定，或利用过氧化氢电极对过氧化氢的增加量进行测定。由于氧的减少量和过氧化氢的增加量与试样溶液中的葡萄糖含量成比例，所以由氧的减少量或过氧化氢的增加量可对葡萄糖进行定量。

此外，还开发了不用氧而是以铁氰化钾、二茂铁衍生物、醌衍生物等有机化合物或金属配合物为电子传递体的新型葡萄糖传感器。这种传感器通过酶反应生成的电子传递体的还原体在电极上的氧化，可由氧化电流量求得包含在试样溶液中的葡萄糖浓度。用以上有机化合物或金属配合物代替氧作为电子传递体使用时，这些电子传递体能够以精确的用量和稳定的状态与GOD一起负载于电极上，形成试剂层。此外，试剂层也可以接近干燥的状态和电极系统一体化。近年来以上述技术为基础开发的一次性葡萄糖传感器正倍受瞩目。其代表例如日本专利公报第2517153号所揭示的生物传感器。使用该一次性葡萄糖传感器时，只要将试样溶液导入与测定器以可脱卸状态连接的传感器中，就能够用测定器容易地测得葡萄糖浓度。

使用上述葡萄糖传感器的测定方法中，利用1～10μA/cm²级的感应电流，能够在30秒钟左右的时间内求得试样中的葡萄糖浓度。但是，近年从各方面的情况考虑，希望开发出能够以更高的灵敏度和精度以更快的速度对葡萄糖进行定量的方法。

此外，传统的电化学葡萄糖传感器中，通过在试剂层中添加羧甲基纤维素等亲水性高分子，可使测定结果不受来自外部并施加于测定器的振动的影响。该亲水性高分子还具有作为粘合剂的将酶慢慢固定在电极上的优点。但是，由于存在亲水性高分子，所以有时GOD催化剂活性或D-葡糖酸-δ-内酯水解为葡糖酸的反应热力学会发生变化，造成作为GOD反应生成物的D-葡糖酸-δ-内酯的蓄积。其结果是，出现逆反应，葡糖酸化反应的速度减慢，电子传递体的还原体在较短的反应时间内的生成量下降，传感器的对应于葡萄糖的感应电流(灵敏度)也下降。特别是对于高浓度的葡萄糖，要以高精度获得足够的灵敏度，必须大量生成电子传递体的还原体，这样就需要延长反应时间，可能使测定所需时间增加。

发明的揭示

本发明涉及生物传感器，该生物传感器具备绝缘性基板，包含配置在前述基板上的工作电极和配极的电极系统，至少含有氧化还原酶、亲水性高分子及电子传递体的试剂系统；前述试剂系统中包含可使作为测定对象的底物和前述氧化还原酶直接反应而生成的有机生成物转变为其他化合物的物质。

本发明提供了生物传感器，该生物传感器具备绝缘性基板，包含配置在前述基板上的工作电极和配极的电极系统，配置在前述基板上的覆盖部件、在该部件和前述基板间形成了向前述电极系统提供试样溶液的通道，设置在前述试样溶液供给通道的露出部分的试剂系统；前述试剂系统中至少包含氧化还原酶、亲水性高分子、电子传递体及可使作为测定对象的底物和前述氧化还原酶直接反应而生成的有机生成物转变为其他化合物的物质。

对附图的简单说明

图1为本发明的实施例之一的葡萄糖传感器的分解立体图(不包括试剂系统)。

图2为上述葡萄糖传感器的主要部分的纵剖面图。

实施发明的最佳方式

如前所述，本发明的生物传感器的特征是，具备包含配置在绝缘性基板上的工作电极及配极的电极系统及至少包含氧化还原酶、亲水性高分子及电子传递体的试剂系统；前述试剂系统中包含可使作为测定对象的底物和前述氧化还原酶直接反应而生成的有机生成物转变为其他化合物的物质。

前述可使有机生成物转变为其他化合物的物质可减少或除去酶反应系统中的有机生成物，使作为测定对象的底物和前述氧化还原酶的酶反应顺利进行，这样就能够以高精度对底物进行迅速测定。当然，前述可使有机生成物转变为其他化合物的物质不能够使有机生成物又转变为原来的底物或转变为对酶反应有不良影响的化合物。此外，该物质本身也不能够对酶反应产生不良影响。

本发明的较好实施方式中，由作为测定对象的底物和前述氧化还原酶的直接反应生成的有机生成物为底物通过氧化还原酶被氧化而获得的氧化生成物。根据伴随前述酶反应而被还原的电子传递体的氧化电流可求得底物浓度。

上述实施方式中，作为测定对象的底物为D-葡萄糖时，所用氧化还原酶为β-D-葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)，将作为有机氧化生成物的D-葡糖酸-δ-内酯转变为其他化合物的物质为葡糖酸-δ-内酯酶(EC 3.1.1.17，以下称为GLN)。前述氧化还原酶为吡咯并喹啉醌(以下用PQQ表示)依赖型葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.99.17)时，采用GLN作为可使氧化生成物D-葡糖酸-δ-内酯转变为其他化合物的物质。

前述氧化还原酶为辅酶I(以下用NAD表示)或辅酶II(以下用NADP表示)依赖型葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47)(EC 1.1.1.118)(EC 1.1.1.119)时，采用GLN作为可使有机氧化生成物D-葡糖酸-δ-内酯转变为其他化合物的物质。

氧化还原酶为乳酸氧化酶时，采用丙酮酸氧化酶作为可使氧化生成物丙酮酸转变为其他化合物乙酰磷酸和二氧化碳的物质。

以下实施例中，虽然采用作为酶的GLN作为可使生成物转变为其他化合物的物质，但并不一定要采用酶等生物体试剂。例如，作为测定对象的底物为一元醇，氧化还原酶为醇氧化酶或醇脱氢酶时，采用能够与作为氧化生成物的醛迅速结合的肼或具有氨基残基的有机化合物等作为前述可使氧化生成物转变为其他化合物的物质。

本发明的其他实施方式中，由作为测定对象的底物和前述氧化还原酶直接反应而生成的有机生成物为底物通过氧化还原酶被还原成的还原生成物，根据伴随前述酶反应而被氧化的电子传递体的还原电流可求得底物浓度。该实施方式中，作为测定对象的底物为谷胱甘肽二硫化物，氧化还原酶为谷胱甘肽还原酶(EC 1.6.4.2)时，作为使有机生成物谷胱甘肽转变为其他化合物的物质，可采用能够选择性地与硫醇反应的物质，例如马来酰胺化合物。

本发明所用的氧化还原酶可根据试样溶液中包含的底物进行适当选择。可使用的氧化还原酶除了以上所例举的酶之外，还包括醇脱氢酶、乳酸氧化酶、胆甾醇氧化酶、黄嘌呤氧化酶、氨基酸氧化酶、天冬氨酸氧化酶、酰基CoA氧化酶、尿酸酶、谷氨酸脱氢酶、果糖脱氢酶等。

为了使由底物和氧化还原酶反应而生成的有机生成物有效地转变为其他化合物，最好在试剂系统中添加pH缓冲剂。使用pH缓冲剂时必须考虑到氧化还原酶的最适pH范围。pH缓冲剂除了后述的实施例中与磷酸盐并用的缓冲剂之外还可使用含有选自磷酸盐、乙酸盐、硼酸盐、柠檬酸盐、邻苯二甲酸盐及甘氨酸的1种或数种的缓冲剂。也可采用上述盐的1种或数种氢盐的缓冲剂。此外，还可使用所谓的“标准缓冲液”。这些pH缓冲剂包含在传感器中的形态可根据传感器的结构变化，例如，可以是固体也可以是溶液。缓冲剂所能够体现的对pH缓冲性能，基本上以能够提高使底物和氧化还原酶反应而生成的有机生成物转变为其他化合物的物质的转化能力为主，但选择pH缓冲剂也要考虑到其对其他传感器反应所产生的影响的平衡。

电子传递体包括铁氰化钾、锇-三(二吡啶鎓)和二茂铁衍生物等金属配合物，对苯并醌等醌衍生物，吩嗪硫酸盐等吩嗪鎓衍生物、亚甲蓝等吩噻嗪鎓衍生物、辅酶I和辅酶II等。这些电子传递体可以与聚合物结构结合，也可以本身的一部分或全部形成高分子链。此外，氧作为电子传递体时也能够获得电流感应。电子传递体可使用其中的1种或2种以上。

亲水性高分子包括水溶性纤维素衍生物，除了乙基纤维素、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素之外，还包括聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、明胶、聚丙烯酸及其盐、淀粉及其衍生物、马来酸酐的聚合物及其盐、聚丙烯酰胺、甲基丙烯酸酯树脂、聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯等。

以下，参考图1和图2对本发明的传感器的结构进行说明，但本发明并不仅限于此。

图1为本发明的葡萄糖传感器的分解立体图(不包括试剂系统)。在聚对苯二甲酸亚乙酯形成的电绝缘性基板1上通过筛网印刷涂布银糊，形成导线2及3和后述的电极基底。然后，将含有树脂粘合剂的导电性碳糊涂布在基板1上形成工作电极4，使该工作电极4与导线2接触。接着，在基板1上涂布绝缘性糊状物形成绝缘层6。该绝缘层6覆盖工作电极4的外周部分，它可确保工作电极4的露出部分面积。然后，在基板1上涂布含有树脂粘合剂的导电性碳糊使其与导线3接触，形成环状配极5。

在上述绝缘性基板1上形成后述的试剂系统后，使具有切口10的隔板8及具备气孔11的覆盖部件9在图1的点划线所示位置上粘合，制得生物传感器。隔板8的切口10部分形成了试样溶液供给通道。传感器端部的切口10的开放端部为试样溶液供给通道的试样溶液供给口。

图2为本发明的生物传感器的纵剖面图。在形成了电极系统的基板1上形成了含有酶及电子传递体的试剂系统7。试剂系统7和电极系统中的工作电极4或配极5相连。这样实质上用于电极的电化学反应的电子传递体的量就更多了，能够获得更大的感应。在图示例子中，试剂系统7由亲水性高分子层7a和形成于其上的含有GOD、GLN及作为电子传递体的铁氰化钾的层7b构成。

使图2所示结构的传感器中成为试样溶液供给通道的切口10开放端部和试样溶液接触，通过毛细管现象将试样溶液导入试样溶液供给通道内，溶解试剂系统7进行酶反应。在设置了电极系统的基板1上由隔板8及覆盖部件9一起形成试样溶液供给通道，就能够将含有作为测定对象的底物的试样溶液定量地导入传感器，提高测定精度。

以上形成了试样溶液供给通道的传感器中，为使试剂系统溶于导入的试样溶液中，试剂系统可设置在电极系统上的试样溶液供给通道的露出部分。例如，相对设置隔板8和覆盖部件9，在与它们相反的切口10的凹部滴加可形成试剂系统的溶液，干燥后形成试剂系统。此外还可将试剂系统分为数个部分，一半在基板上，另一半在覆盖部分侧。被分开的各层中不一定要包含所有试剂，例如，氧化还原酶和电子传递体或pH缓冲剂可包含在不同层中。

如上所述，也可不形成试样溶液供给通道，仅由基板1构成传感器。这种情况下，试剂系统可设置在电极系统上或其附近。

任何结构的传感器的电极系统上最好都设置亲水性高分子层，这样能够防止蛋白质吸附在电极系统上等。

实施例1

在基板1的电极系统上滴加羧甲基纤维素钠盐(以下用CMC表示)的水溶液，干燥后形成CMC层7a。在该CMC层7a上滴加溶解了GOD、GLN及铁氰化钾的水溶液，干燥后形成层7b。以GOD的量为1个单位，以上形成的试剂系统7中包含的GOD和GLN的活性单位数比GOD∶GLN＝1∶2。

在以上基板上组合隔板8和覆盖部件9制得图2所示的传感器。

由该传感器的试样溶液供给通道的开口部分，即隔板的切口10的开放端部供给含有一定量的D-葡萄糖的水溶液。经过一定反应时间后，以配极5为基准对工作电极4施加500mV的电压，测定此时的电流值。通过GOD的作用使D-葡萄糖氧化为D-葡糖酸-δ-内酯，铁氰化物离子还原为亚铁氰化物离子。上述亚铁氰化物离子的生成浓度和葡萄糖浓度成比例。因此，由其氧化电流值可测得葡萄糖浓度。以上生成的D-葡糖酸-δ-内酯通过GLN的作用被分解。

用反应时间为5秒时获得的感应电流和所用溶液中的D-葡萄糖浓度作图，发现两者间显现出良好的线形关系。葡萄糖浓度为602mg/dL及200mg/dL时获得的感应电流分别约为500mV和190mV。作为对照，制得层7b中不含GLN的传感器，与前述同样测定感应电流，葡萄糖浓度为602mg/dL及200mg/dL时获得的感应电流分别约为425mV和165mV。试剂系统中含有GLN的传感器的感应电流大于不含GLN的传感器的感应电流。感应值的增加率达到非常高的18％和15％。这就说明在试剂系统中添加GLN可使作为GOD反应生成物的D-葡糖酸-δ-内酯分解，使其不在溶液中蓄积，加速了GOD和葡萄糖的反应。

此外，特别需要说明的是，添加了GLN的传感器的感应变化系数(CV)在不含有GLN的传感器的75％以下。可见添加GLN可提高测定精度。

如上所述，本发明可提高测定灵敏度。此外，在5秒钟这样极短的反应时间内能够以较高的精度对作为测定对象的底物进行定量测定。

使试剂系统和传感器表面接触，当对应于1平方毫米传感器的表面积、试剂系统中包含的GOD量达到0.05～0.5活性单位时，能够获得特别理想的测定结果。

实施例2

与实施例1同样，在基板1的电极系统上形成CMC层7a及含有GOD、GLN和铁氰化钾的层7b。该例子中未采用隔板8和覆盖部件9。

在传感器的试剂系统7上滴加含有一定量的D-葡萄糖的水溶液，D-葡萄糖水溶液的滴加量是一定的。经过一定时间后，以配极5为基准对工作电极4施加500mV的电压，测定此时的电流值。所得感应电流和D-葡萄糖浓度间显现出良好的线形关系。此外，所得感应电流大于试剂系统7中不含GLN的传感器的感应电流。即使传感器中无覆盖部件，由于前述GLN的作用也能够使测定灵敏度上升。

实施例1和2中，电极系统上形成了试剂系统7且两者相连。但在基板1上的试样溶液供给口附近无电极系统连接、且形成的试剂系统7露出在试样溶液供给通道时，添加GLN也能够实现测定灵敏度的上升。此外，试剂系统7露出在试样溶液供给通道、且形成于覆盖部件侧时也能够获得同样效果。

上述实施例中，为了有效分解D-葡糖酸-δ-内酯，可使GOD附近、即试剂系统7中包含GLN，但在传感器的试样溶液供给通道内的GLN的存在位置可与试剂系统7不同。只要所处位置能够与测定试样接触，通过添加GLN都可使测定灵敏度有所提高。

实施例3

本实施例中，除了在层7b中添加磷酸氢二钾(K₂HPO₄)和磷酸二氢钾(KH₂PO₄)组合而成的pH缓冲剂，导入水后显现的pH值为7之外，其他都和实施例1同样，制得传感器。

向试样溶液供给通道的开口部分导入含有一定量的D-葡萄糖的水溶液，经过一定时间后，以配极5为基准对工作电极4施加500mV的电压，测定此时的电流值。该电流值高于试剂系统7中不含pH缓冲剂的实施例1的传感器测得的电流值。能够获得该结果是因为添加了pH缓冲剂，使试样溶液的pH能够确保GLN有效分解D-葡糖酸-δ-内酯。通过添加pH缓冲剂，能够预想到GOD活性及GLN活性双方的变化。但是，由于GOD及GLN的最适pH分别在5及7附近，本实施例中在pH为7时GLN的效果更理想。

实施例4

本实施例中，除了用PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶(以下用PQQ-GDH表示)代替GOD酶之外，其他都和实施例1相同，制得传感器。GLN和PQQ-GDH的活性单位数比GLN∶PQQ-GDH＝2∶1，所用PQQ-GDH的量为2个单位。

向试样溶液供给通道的开口部分导入含有一定量的D-葡萄糖的水溶液，经过一定时间后，以配极5为基准对工作电极4施加500mV的电压，测定此时的电流值。所得感应电流和D-葡萄糖浓度显现出良好的线形关系。此外，作为对照，制得试剂系统7中不含GLN的传感器，与前述相同测定感应值。在各葡萄糖浓度下，试剂系统中含有GLN的传感器的感应值大于不含GLN的传感器的感应值。即使采用PQQ依赖型葡萄糖脱氢酶，通过在试剂系统中添加GLN也能够获得感应值增大的效果。

此外，和实施例3同样，在试剂系统中添加pH缓冲剂，感应值进一步增大。

使前述PQQ-GDH和传感器表面接触，当对应于1平方毫米传感器的表面积、PQQ-GDH达到0.1～1.5活性单位时，能够获得特别理想的测定结果。

实施例5

本实施例中，用辅酶I或辅酶II依赖型葡萄糖脱氢酶(以下分别称为NAD-GDH及NADP-GDH)代替PQQ-GDH，用硫堇代替铁氰化钾之外，其他都和实施例4同样，制得传感器。NAD-GDH或NADP-GDH和GLN的活性单位数比为NAD(NADP)-GDH∶GLN＝1∶2。

在与实施例4同样的条件下，测定D-葡萄糖浓度所对应的感应电流值，获得与D-葡萄糖浓度大致成比例的感应电流值。各GDH和D-葡萄糖反应而生成的NAD及NADP的还原体向硫堇提供电子，被转换的硫堇向电极传递电子获得电流。这里需要注意的是，NAD及NADP的还原体不是底物的生成物(底物和酶反应的生成物)。所得感应值大于试剂系统7中不含GLN的同样的传感器的感应值。因此，在采用NAD及NADP依赖型葡萄糖脱氢酶的情况下，由于在试剂系统中添加了GLN，所以同样能够获得感应值增大的效果。

实施例1～4中，对GOD、PPQ-GDH及NAD(NADP)-GDH、GLN的活性单位数之比为2的情况进行了说明。事实上，分别对应于氧化还原酶，上述比例为0.5～10时，GLN也能够使电流增大。此外，上述比为1～3时，效果特别明显，能够获得更理想的结果。

此外，与实施例3同样，通过使用pH缓冲剂，可使感应值进一步增大。使氧化还原酶的反应生成的底物的有机生成物转变为其他化合物的物质为GLN时，感应值增大的pH范围为4～9。在上述pH范围内，GLN的活性较高。

实施例中，对电极系统施加了500mV的电压，但并不仅限于此，施加的电压只要可使被还原的电子传递体在工作电极再被氧化即可。还原被氧化的电子传递体时施加适合于还原的电压。此外，作为测定方法使用了电流测定法，但只要是伴随电化学反应进行而出现的变化实质上都能够成为检测对象。例如，一定时间内的通电量。由于通电量是对应于时间的电流的积分值，所以和作为测定对象的底物的浓度有关。

对反应时间无特别限定。在较短的反应时间内，本发明的提高感应值的效果明显。实质上，在所有反应时间内感应值都会提高。

试剂系统或包含在试剂系统中的1种或多种试剂固定在工作电极上，它们不溶解酶、电子传递体或亲水性高分子或使它们非溶化。固定化的情况下，最好采用共价键法、交联固定法、吸附法或利用了配位结合和特异结合性的互相作用的固定法。此外，也可混合在电极材料中。

实施例中对作为电极材料的碳进行了说明，但并不仅限于此。工作电极除了碳之外，还可使用铂、金、钯等在氧化或还原电子传递体时其本身不会被氧化或还原的导电性材料。并且，配极材料除了碳之外，也可使用金、银、铂等常用导电性材料。上述实施例中，工作电极及配极通过筛网印刷法制得，但对制作方法无特别限定。例如，可采用作为其他电极制作法的照相平版印刷法、蒸镀法、化学蒸镀法或溅射法。除了工作电极及配极之外，还可在传感器内配置具有稳定电位的电极作为参考电极使用。这种情况下，在参考电极和工作电极间施加电压。

这些电极系统的形状、配置和个数等并不仅限于上述实施例。导线和端子形状、配置和个数等也并不仅限于上述实施例所述。

产业上利用的可能性

如上所述，本发明提供了能够以高精度迅速地对底物进行测定的生物传感器。

Claims

1.生物传感器，具备绝缘性基板，包含配置在前述基板上的工作电极和配极的电极系统，至少含有氧化还原酶、亲水性高分子及电子传递体的试剂系统；其特征在于，前述试剂系统中包含可使作为测定对象的底物和前述氧化还原酶直接反应而生成的有机生成物转变为其他化合物的物质。

2.如权利要求1所述的生物传感器，其中，前述试剂系统设置在前述电极系统上或其附近。

3.生物传感器，具备绝缘性基板，包含配置在前述基板上的工作电极和配极的电极系统，配置在前述基板上的覆盖部件、在该部件和前述基板间形成了向前述电极系统提供试样溶液的通道，设置在前述试样溶液供给通道的露出部分的试剂系统；其特征在于，前述试剂系统中至少包含氧化还原酶、亲水性高分子、电子传递体及可使作为测定对象的底物和前述氧化还原酶直接反应而生成的有机生成物转变为其他化合物的物质。

4.如权利要求3所述的生物传感器，其中，前述试剂系统和前述电极系统相连。

5.如权利要求1或3所述的生物传感器，其中，前述试剂系统中包含pH缓冲剂。

6.如权利要求1或3所述的生物传感器，其中，前述氧化还原酶为β-D-葡萄糖氧化酶(EC 1.1.3.4)，将作为前述有机生成物的D-葡糖酸-δ-内酯转变为其他化合物的物质为葡糖酸-δ-内酯酶(EC 3.1.1.17)。

7.如权利要求6所述的生物传感器，其中，对应于前述葡萄糖氧化酶的活性单位数的前述葡糖酸-δ-内酯酶的活性单位数之比为0.5～10。

8.如权利要求6所述的生物传感器，其中，对应于前述葡萄糖氧化酶的活性单位数的前述葡糖酸-δ-内酯酶的活性单位数之比为1～3。

9.如权利要求1或3所述的生物传感器，其中，前述氧化还原酶为吡咯并喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.99.17)，将作为前述有机生成物的D-葡糖酸-δ-内酯转变为其他化合物的物质为葡糖酸-δ-内酯酶(EC3.1.1.17)。

10.如权利要求9所述的生物传感器，其中，对应于前述吡咯并喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶的活性单位数的前述葡糖酸-δ-内酯酶的活性单位数之比为0.5～10。

11.如权利要求9所述的生物传感器，其中，对应于前述吡咯并喹啉醌依赖型葡萄糖脱氢酶的活性单位数的前述葡糖酸-δ-内酯酶的活性单位数之比为1～3。

12.如权利要求1或3所述的生物传感器，其中，前述氧化还原酶为辅酶I或辅酶II依赖型葡萄糖脱氢酶(EC 1.1.1.47)(EC 1.1.1.118)(EC1.1.1.119)，将作为前述有机氧化生成物的D-葡糖酸-δ-内酯转变为其他化合物的物质为葡糖酸-δ-内酯酶(EC 3.1.1.17)。

13.如权利要求12所述的生物传感器，其中，对应于辅酶I或辅酶II依赖型葡萄糖脱氢酶的活性单位数的前述葡糖酸-δ-内酯酶的活性单位数之比为0.5～10。

14.如权利要求12所述的生物传感器，其中，对应于辅酶I或辅酶II依赖型葡萄糖脱氢酶的活性单位数的前述葡糖酸-δ-内酯酶的活性单位数之比为1～3。

15.如权利要求5所述的生物传感器，其中，前述pH缓冲剂将pH值调整为4～9。