CN1347400A - 用于制备普伐他汀的微生物方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新的微生物方法,通过在好气发酵下通过深层培养一种能够将式(II)化合物6β－羟化的霉菌菌株,并且通过分离和纯化在所述生物转化过程中生成的式(I)的所述产物,从通式(II)的化合物(其中R代表一种碱金属或铵离子)制备化合物式(I)。所述方法包括在含有可同化碳源和氮源和无机盐的营养培养基上,培养一种能够将通式(II)的化合物6β－羟化的Mortierella maculata丝状霉菌菌种的菌株,并且从所述发酵肉汤中分离生成的所述产物,然后分离并纯化式(I)的所述化合物。本发明还公开了Mortierella maculata的多种新菌株。

Description

用于制备普伐他汀的微生物方法

                      发明领域

本发明涉及一种用于制备普伐他汀的方法，具体地说，涉及以工业规模生产普伐他汀的微生物方法。

                      发明背景

动脉粥样硬化、尤其是冠状血管闭塞最危险的因素是血浆的高胆固醇水平。最近二十年，对作为胆固醇生物合成限速关键酶的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(EC.1.1.1.34)进行了深入地研究。普伐他汀，一种式I的化合物，以及其它相关化合物(密实菌素、美维诺林(mevinolin)、辛伐他汀)是HMG-CoA还原酶的竞争性抑制剂[A.Endo等，J.Antibiot.29，1346-1348(1976)；A.Endo等，FEBS Lett.72，323-326(1976)；C.H.Kuo等，J.Org.Chem.48，1991(1983)]。

普伐他汀最先由M.Tanaka等(未公开的结果)在研究密实菌素代谢期间从狗尿中分离出来(Arai，M.等，Sankyo Kenkyusyo Nenpo，40，1-38，1988)。目前，普伐他汀是一种降胆固醇药，其在治疗中具有最有利的作用机制。它最重要的特征是组织选择性，即在胆固醇生成(cholesterogenesis)的两个主要部位例如在肝脏和在小肠中它抑制胆固醇的合成，而在其它器官很难检测到限制作用的胞内酶。然而，美维诺林和辛伐他汀的胆固醇生物合成限制作用在大多数器官中却是显著的(T.Koga等，Biochim.Biophys.Acta，1045，115-120，1990)。

普伐他汀在化学结构方面本质上不同于更具亲脂特征的美维诺林和辛伐他汀。在后二种化合物的情况下，与六氢化萘骨架的C-1碳原子连接的取代基的末端位于六元内酯环中，而在普伐他汀的情况下，不存在所述内酯环，而是存在生物活性的开链二羟酸的钠盐形式。另一重要的结构差别是美维诺林和辛伐他汀在六氢化萘环的C-6-位置是甲基，而在普伐他汀中可以见到一个羟基，这导致在其亲水特征方面进一步增强。

作为上述结构差异的结果，普伐他汀只能够极低程度地穿透外周细胞的亲脂膜(A.T.M.，Serajuddin等，J.Pharm.Sci.80，830-834，1991)。

可以通过两个发酵过程达到工业化生产普伐他汀。在第一个发酵过程中，制备微生物阶段的密实菌素，然后在第二个发酵过程中，在6β-位置上，通过微生物羟化作用，使作为底物的密实菌素酸的钠盐转化为普伐他汀。

按照公开的专利，用属于不同属的霉菌菌种、和用属于诺卡氏菌属(Nocardia)的丝状细菌、用马杜拉放线菌属(Actinomadura)和链霉菌属(Streptomyces)，可以在不同程度上完成密实菌素的微生物羟化作用(比利时专利说明书第895090号、日本专利说明书第5,810,572号、美国专利第4,537,859和4,346,227号和公开的欧洲专利申请号0605230)。公开了使用丝状霉菌例如冻土毛霉(Mucor hiemalis)、Syncephalastrum nigricans、刺孢小克银汉霉(Cunninghamella echinulata)以500μg/ml浓度和用属于原核生物的诺卡氏菌属、马杜拉放线菌属和链霉菌属的菌株以2000-4000μg/ml进行密实菌素底物的生物转化。

在用丝状霉菌生产普伐他汀的情况下经历的一个常见问题是由于密实菌素的抗真菌作用，引起微生物不能耐受添加到培养物中甚至低浓度的密实菌素底物(Serizawa等，J.Antibiotics，36，887-891，1983)。日本研究人员用Streptomyces carbophilus深入研究羟化作用时，也观察到该底物的细胞毒性(M.Hosobuchi等，Biotechnology andBioengineering，42，815-820，1993)。

日本作者已设法用重组DNA技术改进Streptomyces carbophilus菌株的羟化能力。密实菌素的羟化作用需要细胞色素P-450单加氧酶系统(Matsuoka等，Eur.J.Biochem.184，707-713，1989)。然而，根据所述作者的研究，在细菌的细胞色素P-450单加氧酶系统中，不是一种而是数种蛋白在电子传递中起作用，这使得所述DNA技术的应用更加困难。开发出用于生产普伐他汀的成本有效的微生物羟化法是极其艰难而复杂的工作。

本发明的目的是详细描述一种用于工业规模从密实菌素生产普伐他汀的新的微生物方法，所述方法会比先前已知的那些方法在更为有利的条件下生产普伐他汀。在我们的研究工作期间，我们尝试了以上所有研究，以发现含有可能适合于使密实菌素微生物转化为高浓度的普伐他汀的羟化酶的微生物菌株。

                 发明概述

本发明涉及一种用于从式(II)的底物化合物

其中R代表一种碱金属或铵离子，

制备式(I)化合物的微生物方法，所述方法包括以下步骤：(a)在含有可同化的碳源和氮源和无机盐的营养培养基上，培养能够将式(II)化合物6β-羟化的Mortierella maculata丝状霉菌菌种的菌株；(b)将待转化的底物添加到所形成的Mortierellamaculata培养物中；(c)让所述底物发酵直至生物转化结束为止；(d)从所述培养物肉汤中分离式(I)的化合物；和(e)分离纯化所述式(I)的化合物。

本发明还涉及保藏于匈牙利布达佩斯国立农业和工业微生物保藏中心、保藏号为NCAIM(P)F 001266的Mortierella maculata n.sp.E-97菌株的生物学上纯的培养物；以及所述菌株的突变株Mortierellamaculata n.sp.E-97/15/13菌株的生物学上纯的培养物，该突变株保藏于匈牙利布达佩斯国立农业和工业微生物保藏中心，保藏号为NCAIM(P)F 001267。

                        附图简述

图1说明Mortierella maculata n.sp.E-97的物理特征。

                        发明详述

在我们筛选程序的过程中，覆盖了大约5500种原核和真核菌株，选定了23种微生物，所述23种微生物反过来能够羟化密实菌素的。在这些菌株中，一种丝状霉菌证明是更适合于生产普伐他汀，因为与来自公开专利的已知菌株比较，它对密实菌素的抗性较高。按照分类学研究，该菌株证明是一种属于被孢霉属(Mortierella)的新的代表性菌种(Mortierella maculata n.sp.)。从所选定的霉菌中，一方面，通过应用突变-选择方法，另一方面，通过诱导所述菌株的羟化酶，分离到一种新菌株，所述新菌株能够比迄今为止公开的菌株以更高浓度使密实菌素底物羟化成普伐他汀。作为诱变剂，可使用物理和化学诱变剂(UV照射、甲磺酸甲酯、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)。诱变处理之后，为了制备单倍体细胞，将孢子悬液涂布在含benomyl的琼脂平板上，然后为了诱导羟化酶，将形成的菌落接种在100μg/ml含8-脱-(2-甲基-丁酰)-密实菌素或含密实菌素的琼脂平板上。通过这些方法的应用，从能够在显著高于亲代菌株的程度上使密实菌素转化为普伐他汀的新菌株中制备突变菌株。

在优化实验的过程中，我们确定了用于密实菌素羟化作用的最有益的接种物和最有利的生物转化培养基以及以高浓度重复添加密实菌素的最佳方法。

因此，本发明基于对名为Mortierella maculata的分离的霉菌的命名为E-97和E-97/15/13菌株的鉴别，所述菌株保藏于国立农业和工业微生物保藏中心(Department of Microbiology and Biotechnology.University of Horticulture and the Food Industry Budapest)，其保藏号分别为NCAIM(P)F 001266和NCAIM(P)F 001267，，它们在合适的发酵条件下，能够高水平地生产普伐他汀，而在生物转化期间，仅得到少量或微量不需要的相关化合物，例如酸形式的6α-羟基-密实菌素、2α-羟基-密实菌素、8-脱-(2-甲基-丁酰)-密实菌素、3α，5β-二羟基-5，6-二氢-异密实菌素、8a，β-羟基-密实菌素和位于密实菌素的2-甲基-丁酰侧链的位置2和3上的羟基化衍生物。因此，这些菌株特别适合于工业规模生产普伐他汀。

考虑到所述有效成分的工业规模经济生产随密实菌素底物浓度而变化的，因此重要的是具有能够耐受高密实菌素和普伐他汀浓度的菌株。因此，本发明的再一重要部分是认识到：通过应用突变-选择和酶诱导方法可以改进原始霉菌分离物的羟化能力，而且通过开发合适的底物添加方法，可以在单一步骤中实现将大量密实菌素羟化成普伐他汀。总之，命名为Mortierella maculata n.sp.E-97/15/13的新突变菌株特别适合于生产普伐他汀。

下文概述了所述分离的新霉菌菌种与已知的被孢霉菌种的最重要的鉴别属性比较的分类学特征。主模式菌株Mortierella maculata nov.spec.E-97的分类学描述

在淀粉-酪蛋白-麦芽汁-琼脂培养基上，很好地形成气生菌丝体(基内菌丝体上有超过10μm厚的覆盖层)。开始时，它表现为菌丝紧密编织的白色网，后来，出现稀疏的具有几毫米直经的浅黄色孢子形成斑点(新名称“maculatus”是指上述的斑点)。这种浅黄颜色有时可以占据气生网的较大连续表面。在Czapek琼脂培养基、血-Czapek琼脂培养基、酪氨酸琼脂培养基、淀粉-酪蛋白琼脂培养基、麦芽汁琼脂培养基等上基内菌丝体的颜色大多数是无色或浅黄色。在酵母提取物-葡萄糖-蛋白胨培养基上基内菌丝网的颜色是淡红色。实际上在以上所列的培养基上没有产生可扩散和可溶性色素，或者很少在这些培养基上产生很浅的浅黄色。菌株E-97的菌落，由于其产生挥发油，并且与许多被孢霉属的其它菌种(深黄被孢霉组(section Isabellina)的菌种除外)相似，可以散发一种非常特征性的强香气。

由图1中的参考编号1-7命名的孢囊柄，通常在气生菌丝上(而较少在基内菌丝上)以大量互相之间非常不同的距离局部形成。它们不分枝，但是多数是直的或弯曲。它们的长度一般为60-80μm。在绝大多数情况下的起始点是一个大体上短但强烈膨大的气生网的菌丝区域，它们由胞壁分隔。孢囊柄自身也可以膨大(有时是强烈地)，如参考编号6所示，但在孢子囊的方向上，它们由5.0-9.0μm逐渐缩窄到1.0-2.0μm。重要的分类学特征是在所述孢囊柄之下，它们从不加宽(参见参考编号8)。

孢子囊为球形；在某些情况下为略微变平的球体。它们的直经约为6.0-17.0μm，比其它被孢霉菌种的测量值小。孢子囊内可以有许多孢子，但仅有一个孢子的孢子囊内也存在。孢子9为圆柱形或不太椭圆。它们的大小为3.0-5.0×1.5-2.0μm。在单个孢子中，可以存在1个或2个小的暗色球形油滴10。由于孢子囊的壁非常容易分解，因此在潮湿环境中，孢子会很快地散布。在孢子囊解体后，有时在孢囊孢子的末端，可以观察到细小音叉样“囊领”和一种非常短的退化的(但不是典型的)囊轴。球形或圆柱形的芽孢15-28可以在大多数不同的鉴别培养基上形成。通常的大小为10-25μm。在所述培养基中，也可以见到球形芽孢13的链、芽生细胞、间生芽孢15-23、一个菌丝围绕另一菌丝的特定螺旋生长的菌丝群丛11、菌丝融合样结构和巨细胞等。在气生菌丝体中还可以观察到大的(直经50-250pm)非常致密的菌丝网14，但没有可检测的接合子存在。

菌株E-97的培养物能够使硝酸盐还原成亚硝酸盐，不水解淀粉、七叶苷、精氨酸或明胶，但水解吐温polysorbates，不分解石蜡烃类。菌株E-97的培养物具有脲酶活性，在pH7.0-9.0之间显示良好生长，耐受最大2％NaCl。黄嘌呤、次黄嘌呤、卵磷脂、酪氨酸和腺嘌呤的效应为负效应。从葡萄糖、果糖、甘油和半乳糖中已检测到培养物产生的强酸，但从木糖、阿拉伯糖、棉子糖、山梨糖醇、肌醇、菊粉等不产生或产生很少的强酸。在丙酮酸盐和乙酸盐上检测到弱生长，但是发现含有苯甲酸盐、水杨酸盐、柠檬酸盐、乳酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐和丙二酸盐时不能生长。观察到用葡萄糖和果糖作为培养基的唯一碳源时生长良好。木糖、阿拉伯糖、鼠李糖、蔗糖、棉子糖、甘露醇和肌醇的利用试验证明为阴性的。所述培养物不分解纤维素。

系统分类学位置：菌株E-97属于被孢霉科，而且它是被孢霉属的一个典型成员：孢子囊内一般有许多孢子，囊轴极其退化，常常存在芽孢，没有检测到接合子的存在，菌落散发一种非常特征性的强烈香气。在被孢霉属内，菌株E-97是“高山被孢霉组(Section Alpina)”的典型代表。后者的特征为孢囊柄极短，不分枝(最大长度为200μm)，并且孢子囊微小(Zycha，H.und Siepmann，R，Mucorales.EineBeschreibung aller Gattungen und Arion dieser Pilzgruppe.D-3301 Lehre，Verl.von J.Cramer.1969)。在高山被孢霉组的成员中，菌株E-97与菌种萨克被孢霉(M.thaxteri Bjrling 1936)和肾孢被孢霉(M.renisporaDixon-Stewart 1932)显示最高的相似性。然而，表I的数据清楚地表明菌株E-97与这两个种的鉴别特性方面的差别。因此，作为一个新种，由此我们将所述菌株命名为Mortierella maculata nov.spec.E-97。

                         表1

根据关键性鉴别特性，对Mortierella maculata n.sp.的主模式

菌株E-97与菌种肾孢被孢霉和萨克被孢霉进行比较

	肾孢被孢霉	被孢霉菌株E-97	萨克被孢霉
				孢囊柄的起源	普通，然而菌丝比正常菌丝宽大，侧性从扩大膨胀的菌丝	从(膨大或正常)气生菌丝或基内菌丝的非离生区域侧生。	从气生菌丝的膨大离生节段或基内菌丝为非离生节段侧生
孢囊柄的形状和大小	向顶端方向逐渐由10μm缩细至3μm。长度约为200μm。	多数为直的或弯曲的，不分枝。宽度向顶端逐渐由5-9μm缩细至1.5-2.5μm。长度约为60-80μm。在顶端不加粗。	长度约60-90μm。起始点的宽度约为5-7μm，在顶端缩细至1.5-2μm。在孢子囊处立即加粗。
				孢子囊的形状和大小	无色，直经为25μm。	多数为球形(直经6-17μm)，而极少为不太扁平。一般含有许多孢子，极少含有一个孢子。	球形(直经12-20μm)。它们含有许多孢子，但在某些培养基上也有只含一个孢子的孢子囊。
孢子囊的壁(膜)	扩展膜。解体后仍保留囊领样结构。	解体。保留音叉样囊领。	解体，保留微小反向弯曲的囊领。

孢子的形状和大小	大致肾形。透明结构，大小为2×4μm。	圆柱形。长度(3-5μm)可以超过宽度(1.5-2μm)的两倍。	椭圆透明孢子，大小为3.5-4×1.5-2μm。
				芽孢	在大多数不同的培养基上生成。	常常存在于非常不同的培养基上，多数存在于气生菌丝体内。球形或细长(10-25μm)。	基内菌丝体中间生的椭圆形芽孢(10-14μm)。
接合子	常常存在于所有鉴别培养基上。加上覆盖菌丝的直经约为500μm，没有它们时约为30μm。	没有检测到。	没有观察到。
				菌丝网的致密灶(foci)		常常为大而致密编织的菌丝灶(50-250μm)，而无接合子。	在老培养物中，为大的(直经100-125μm)浅灰黄色致密菌丝网，无接合子。
气生菌丝体的颜色和习性	松散而总是白色的菌丝网	白色和浅黄色斑点。	开始为蜘蛛网样，后来更致密。

在按照本发明制备普伐他汀的方法中，最好使用命名为Mortierella maculata n.sp.E-97或其命名为E-97/15/13突变株的霉菌菌株培养物。所选定的菌株由于它快速生长所以是高度优选的菌株。作为碳源，它容易利用葡萄糖、甘油、果糖或半乳糖。作为氮源，可以利用酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白、肉膏、大豆粉、玉米浆、硝酸钠或硫酸铵。

在用于生产普伐他汀的培养基中，除以上的碳源和氮源外，还可以含有无机盐(例如磷酸二氢钾、氯化镁、硫酸镁)、微量元素(亚铁盐、镁盐)、氨基酸和消泡剂。

按照本发明的一个优选的实施方案，将已由命名为E-97菌株或其命名为E-97/15/13的突变株[NCAIM(P)F 001267]的Mortierellamaculata n.sp.琼脂斜面培养物制备的孢子悬液接种于种子培养基中；然后，将在大约25-30℃、优选在大约24-28℃、最优选在大约28℃下培养3天的10％种子培养物转种到生物转化培养基中。然后将其在大约25-28℃、最好在大约28℃培养4天，然后将葡萄糖和密实菌素酸的钠盐添加到所述培养物中。根据所添加的密实菌素底物的浓度，将培养在需氧条件下继续再进行2-12天，同时使pH保持在5.5-7.5之间，最好在7.0。在搅拌和通气条件下，此时空气流速为0.2vvm，搅拌器的转速为400/分钟，进行生物转化。

在发酵过程中，在密实菌素底物的生物转化后再进行高压液相层析法(HPLC)。按照该方法，用甲醇将所述肉汤样品稀释2倍，然后离心，将上清液在以下参数下用于HPLC分析：Waters分析型HPLC仪；柱子：Nucleosil C₁₈ 10μm；检测波长：238nm；注射体积：20μl，流速：1ml/分钟；采用梯度洗脱，洗脱液：A＝0.05％磷酸水溶液，B＝乙腈。洗脱梯度：

时间(分钟)	洗脱液A(％)	洗脱液B(％)
			0	70	30
20	0	100
			25	0	100
25.1	70	30
			35	70	30

近似保留时间：普伐他汀8.6-9.0分钟；密实菌素酸11.6-12.0分钟；普伐他汀内酯15.0-15.5分钟，密实菌素16.5-17.0分钟。

为了生产普伐他汀，在培养的第96小时加入密实菌素酸的钠盐水溶液。对于该方法，如下以固体形式制备所述底物。于40℃、在0.2M氢氧化钠溶液中将密实菌素内酯水解2小时，然后用盐酸将反应混合物的pH调至7.5，将所述中和的溶液铺在Diaion HP-20吸附柱上；通过用水洗涤柱子除去中和反应期间生成的氯化钠，然后用50％丙酮水溶液从柱子中洗脱密实菌素酸的钠盐。此后，真空蒸馏洗出物并将含水残余物冻干。中和反应后，也可以将密实菌素的碱性水解产物的水溶液直接用作底物。在这种情况下，通过HPLC测量水解产物中密实菌素酸的钠盐含量，并且在使用之前一直将所述溶液保藏于20℃。

到发酵的第4天肉汤的pH越高，对密实菌素底物的羟化越有利。当肉汤的pH超过6.3时，允许开始添加密实菌素底物。在发酵的第4天，按需加入除菌过滤的密实菌素酸的钠盐水溶液至达到浓度为500μg/ml。如下也将在121℃灭菌25分钟的50％葡萄糖溶液添加至所述培养物中：如果肉汤的pH值高于6.7，则对应于所述肉汤体积加入1％葡萄糖，而如果pH在6.3-6.7的范围内，则添加的葡萄糖的量为0.5％。24小时后从肉汤中消耗密实菌素酸的钠盐，通过HPLC测定分析其转化。在这种情况下，每毫升肉汤另外加入500μg密实菌素。除密实菌素底物之外，还如上所述添加葡萄糖。120小时培养物的形态学特征为小球体(pellet)生长(球体直经为0.5-3.0mm)。24小时后，从肉汤中再消耗第二剂量的底物，因此，在全肉汤中加入产生浓度为500μg/ml的另一份密实菌素酸的钠盐，并且根据肉汤的pH值平行添加葡萄糖。从发酵的第4天开始，如上所述以每日的频率重复添加所述底物和葡萄糖，直到发酵的第17-18天为止。

为了从肉汤中回收所述产物，最好是考虑在生物转化期间以其酸的形式生成普伐他汀的事实，因此通过它在阴离子交换树脂柱上的吸附，可以将它从肉汤的滤液中分离出来。为了分离所述产物，最好是利用强碱性阴离子交换树脂，它为带有季铵活性基的聚苯乙烯-二乙烯基苯聚合物。通过将羟基形式的阴离子交换树脂混合到肉汤的滤液中，可以使所述产物直接从所述滤液中吸附出来。用乙酸或含氯化钠的丙酮-水混合物，最好是用含1％氯化钠的丙酮-水(1∶1)混合物，可以从所述柱子中将在阴离子交换树脂上被吸附的产物洗脱出来。合并含普伐他汀的流分，真空蒸馏出洗出物中的丙酮。用15％硫酸将浓缩物的pH调至3.5-4.0的范围，水溶液用乙酸乙酯萃取。用水洗涤乙酸乙酯萃取物，并用无水硫酸钠干燥。然后用普伐他汀制备内酯衍生物。在连续搅拌下，通过用以催化量存在的三氟乙酸诱导内酯生成，于室温下在干燥的乙酸乙酯溶液中进行内酯环的闭合。通过薄层层析分析(TLC)检查转化过程。完成内酯生成后，乙酸乙酯溶液首先用5％碳酸氢钠水溶液洗涤，然后用水洗涤，再用无水硫酸钠干燥，并真空蒸发。蒸发后的残余物在丙酮溶液中用活性炭处理，然后再蒸发，并且从含1-4个碳原子的脂族醇、最好是从乙醇中再结晶。用使用乙酸乙酯含量逐渐增加的乙酸乙酯-正己烷混合物作为洗脱液，用硅胶柱层析法，将再结晶母液的蒸发残余物纯化。

通过在室温下丙酮中用等量的氢氧化钠水解，用再结晶后和层析纯化获得的普伐他汀内酯制备普伐他汀。当完成普伐他汀钠盐的生成后，反应混合物用水稀释并中和，真空蒸馏丙酮内容物。在含DiaionHP-20树脂的柱上从所得到的含水残余物中吸附普伐他汀，用去离子水洗涤，再用丙酮-去离子水混合物从所述柱子上洗脱。然后将含普伐他汀的流分合并，蒸馏出丙酮内容物，在将含水残余物冻干后可以得到高纯度普伐他汀，可以将其从乙酸乙酯-乙醇混合物中再结晶。

在所述方法的过程中，可以吸附全部量的普伐他汀。在普伐他汀内酯闭合期间，还可能生成3α-羟基-异-密实菌素和其它副产物。虽然这些后面的反应减少所述分离的得率，但是那些化合物可以通过上述纯化方法分离，因此可以以这种方式生产药学上可接受质量的普伐他汀。

完成生物转化后，或者从发酵肉汤中或者从分离丝状霉菌细胞后获得的滤液中可以萃取普伐他汀。或者通过过滤或者通过离心可以去除丝状霉菌细胞；然而，尤其在工业规模中，最好是制备全肉汤萃取物。萃取之前，用无机酸、最好是用稀硫酸，将或者发酵肉汤或者肉汤的滤液的pH调至3.5-3.7。用乙酸的酯和含24个碳原子的脂族醇、最好是用乙酸乙酯或乙酸异丁酯，进行所述萃取。萃取步骤应进行得非常快，以避免在酸性pH下由普伐他汀生成所述内酯衍生物。

可以使普伐他汀的酸形式作为钠盐从有机溶剂萃取物转移到水相中。例如，可以用1/10和1/20体积比的5％碳酸氢钠或弱碱性水(pH7.5-8.0)从乙酸乙酯萃取物中萃取普伐他汀。发现通过应用非离子吸附树脂的柱层析，从以上得到的碱性含水萃取物中可以回收到纯形式的普伐他汀。一种优选方法是首先通过真空蒸馏从碱性含水萃取物中去除溶于水相的溶剂，然后将含水萃取物加样到Diaion HP-20柱。

正在所述柱子上吸附的普伐他汀钠盐通过逐渐增加水溶液的丙酮含量进行洗脱而被纯化，然后将含普伐他汀的主要流分合并并且真空浓缩。含水浓缩物进一步通过在另一Diaion HP-20柱上层析而纯化，获得含纯的普伐他汀的洗出物，将其用活性碳澄清并冻干后，可以得到药学上可接受质量的普伐他汀。

该分离方法比先前的方法包括更少的步骤，因为在所述方法中不涉及普伐他汀的内酯生成及其水解。在所述分离期间，使普伐他汀在酸性条件下只暴露有限时间，因为在酸性条件下它的稳定性比在中性或碱性溶液中的稳定性低，因此，在该分离方法中实际上不生成矫作物(artefacts)。

此外，发现最好是用Sephadex LH-20葡聚糖凝胶(羟基丙基化衍生物)上的层析法纯化普伐他汀。通过应用该方法，可以产生纯度超过99.5％(通过HPLC测定)的普伐他汀。

在我们的实验过程中，已经认识到用所述丝状霉菌或丝状细菌菌株尤其是能够将通式(II)的化合物6β-羟化的Mortierella maculata n.sp.菌株的肉汤或肉汤硝酸盐的有机溶剂萃取物、最好是用乙酸乙酯或乙酸异丁酯萃取物，可以用仲胺将普伐他汀作为结晶盐沉淀出来。还发现对于盐的生成，数种含有烷基取代基、环烷基取代基、芳烷基取代基或芳基取代基的仲胺是合适的。在它们中选择方便无毒的仲胺，例如二辛胺、二环己胺、二苄胺。通过加入相对于萃取物的普伐他汀含量为1.5相当量的二苄胺，进行所述有机仲胺盐中间体例如二苄胺盐的分离，然后通过真空蒸馏使萃取物浓缩至其原始体积的5％，最后再以0.2相当量比率将另一个量的二苄胺加入到所述浓缩物中。晶体二苄胺盐从所述浓缩物中沉淀出来。过滤晶体粗制产物并真空干燥。然后用活性炭将其澄清并在丙酮中再结晶。

在其中包括碱性pH下有机溶剂萃取和反萃取的先前的所述方法中，基于仲胺盐形成的分离方法还可以用来代替柱层析的纯化。在这种情况下，最好从在碱性含水萃取物酸化后得到的乙酸异丁酯萃取物中沉淀普伐他汀二苄胺盐。

用氢氧化钠或醇钠、最好是乙醇钠，可以使普伐他汀有机仲胺盐转化成普伐他汀。

所述转化在普伐他汀二苄胺盐的情况下详细描述。将再结晶的二苄胺盐悬浮于乙酸异丁酯-水混合物中，然后通过在搅拌下保持pH的范围为8.0-8.5，以水溶液将等量的氢氧化钠加入至所述悬浮液中。在所述悬浮液溶解后，分离各相，含普伐他汀的水溶液用乙酸异丁酯洗涤两次。水溶液用活性炭澄清并冻干，得到药学上可接受质量的普伐他汀。

用于将普伐他汀二苄胺盐转化为普伐他汀的一种优选方法是将再结晶的二苄胺盐悬浮于乙醇中，然后在搅拌下将等量或稍稍过量的乙醇钠加入至该悬浮液中，然后真空浓缩反应混合物，并通过加入丙酮，使普伐他汀以结晶形式从浓缩物中沉淀出来。

用于将普伐他汀二苄胺盐转化为普伐他汀的另一优选方法是将再结晶的二苄胺盐溶于乙酸乙酯-乙醇混合物中，然后将等量或稍稍过量的氢氧化钠的乙醇溶液加入至所述溶液中，使普伐他汀沉淀。

通过仲胺盐中间体分离普伐他汀，比任何先前已知的分离方法都简单。在该分离方法中不生成后生物(artifacts)，并且不需要用任何层析方法，就可以解决从生物转化副产物和从由羟化微生物生物合成的各种代谢产物中分离普伐他汀。

普伐他汀、普伐他汀内酯和普伐他汀的分离的仲胺盐的结构已经通过UV、IR、¹H-NMR、¹³C-NMR和质谱法证实。

                        实施例

将参照以下实施例更全面地描述和理解本发明，所述实施例作为说明提供而不是用来以任何方式限制本发明的范围。

                        实施例1

用5ml 0.9％氯化钠溶液制备孢子悬液，该溶液得自能够将密实菌素6β-羟化的Mortierella maculata nov.spec.E-97[NCAIM(P)F 001266]菌株的7-10日龄麦芽汁-酵母提取物琼脂斜面培养物，用所述悬液接种500ml锥形瓶中灭菌的100ml种子培养基PI。培养基PI的组成：

葡萄糖            50g

大豆粉            20g

溶于1000ml自来水中。

灭菌之前将培养基的pH调至7.0，然后121℃灭菌25分钟。于28℃将培养物在旋转式摇瓶机(250rpm，2.5cm振幅)上振摇3天，然后将10ml所获得的培养物转种到在500ml锥形瓶中121℃灭菌25分钟的100-100ml生物转化培养基MU/4中。培养基MU/4的组成：

葡萄糖           40g

大豆粉           20g

酪蛋白-蛋白胨    1g

天冬酰胺         2g

磷酸二氢钾       0.5g

溶于1000ml自来水中。

灭菌之前将培养基的pH调至7.0，然后121℃灭菌25分钟。

于25℃将锥形瓶在旋转式摇瓶机(250rpm，2.5cm振幅)上振摇4天，然后以除菌过滤的水溶液形式将50-50mg密实菌素底物(密实菌素酸的钠盐)加入至培养物中，然后继续进行培养。同样，在第5天，将另外50-50mg密实菌素酸的钠盐加入至该霉菌培养物中，并且使发酵再继续进行24小时。通过HPLC测定肉汤中普伐他汀含量。发酵继续进行168小时。在生物转化结束时，发酵肉汤中普伐他汀平均浓度为620μg/ml。

                     实施例2

在实验室规模5升工作体积的发酵罐中，制备MU/S生物转化培养基，加入对应于5升体积的培养基组分，但仅仅至多加样4.5升，然后121℃灭菌45分钟，用按照实施例1制备的500ml种子培养物接种。培养基MU/8的组成：

葡萄糖           20g

甘油             20g

大豆粉           20g

蛋白胨           5g

磷酸二氢钾       0.5g

聚丙二醇2000     1g

溶于1000ml自来水中。灭菌之前将培养基的pH调至7.0值。

于28℃、搅拌速率为400rpm并且从底部方向的通气速率为60升/小时下，将所述发酵进行4天。转种后的第2天，培养物开始严重起泡，该泡沫可以通过再加入聚丙二醇2000而减少。在发酵的初期(16-20小时)，pH从6.5的初始值减少至5.0-5.5，然后从第3天开始增加并且在第4天达到6.3-7.5。如果肉汤的pH大于6.3，则允许开始添加密实菌素底物。在发酵的第4天，以除菌过滤水溶液加入2.5g密实菌素底物。计算肉汤的体积，平行于所添加的底物，根据pH，以121℃灭菌25分钟的50％溶液形式，将0.5-1.0％葡萄糖加入到培养物中。24小时后，从培养物中消耗密实菌素底物，这可从取自发酵罐中的样品通过HPLC检测到。在这种情况下，如上所述加入2.5g密实菌素底物和葡萄糖，并且当所述底物被转化为普伐他汀时，使该生物转化再进行24小时。

完成所述发酵后，含630μg/ml普伐他汀的5.1升肉汤用过滤布过滤。将2升水加入到分离的菌丝体中，然后将菌丝体悬液搅拌1小时，然后过滤。将这两种滤液混合，并且以流速500ml/小时在含138g(250ml)Dowex A1 400(OH)树脂的柱子(柱子直经3.4cm，树脂床高度28cm)上通过，然后树脂床用300ml去离子水洗涤。随后，用1升含10g氯化钠的丙酮-水(1∶1)混合物对树脂进行洗脱。流分的体积为每个流分100ml。通过以下薄层层析(TLC)方法分析洗出物：吸附剂：Kieselgel 60F ₂₅₄ DC(Merck)铝箔；展开剂：丙酮-苯-乙酸(50∶50∶3)混合物；检出：用磷钼酸试剂。普伐他汀的R_f值为0.5。合并含所述产物的流分，真空蒸馏出丙酮。用15％硫酸将400ml浓缩物的pH调至3.5-4.0，然后用150ml乙酸乙酯萃取3次。将乙酸乙酯萃取物合并，用无水硫酸钠干燥。随后，于室温、连续搅拌下，通过以催化量加入三氟乙酸从普伐他汀酸制备普伐他汀内酯。普伐他汀内酯的生成由TLC控制(上述TLC系统中的普伐他汀内酯的R_f值为0.7)。内酯生成完成后，所述乙酸乙酯用2×50ml 5％碳酸氢钠水溶液洗涤，然后用50ml水洗涤，用无水硫酸钠干燥并且真空蒸发。将得到的3g量的蒸发残余物溶于100ml丙酮中并且用0.3g活性炭澄清。然后过滤去除活性炭，真空蒸发丙酮。得到的粗制产物从20ml乙醇中结晶。将沉淀的晶体普伐他汀内酯过滤出来，用30ml正己烷在过滤器上洗涤，于室温下真空干燥。这样得到1.5g层析纯的普伐他汀内酯。熔点140-142℃，[α]_D＝+194°(c＝0.5，甲醇)。真空蒸发结晶母液，得到1.2g蒸发残余物，该残余物在含24g Kieselgel 60吸附剂的柱子(柱子直经：1.6cm，床的高度：20cm)上层析。将溶于5ml苯的粗制产物铺在该柱子上。使用乙酸乙酯-正己烷混合物进行洗脱，其中逐渐增加乙酸乙酯的含量。用60％乙酸乙酯-40％正己烷混合物可以将普伐他汀内酯从该柱子上洗脱出来。采用乙酸乙酯-正己烷(9∶1)的混合物作为展开剂，通过TLC控制流分。合并含普伐他汀内酯的流分，真空蒸发。按照该方法，得到0.3g纯的产物，其质量与通过结晶得到的普伐他汀内酯的质量相同。

将两批普伐他汀内酯混合，然后按照以下方法制备钠盐：将1.8g普伐他汀内酯溶于20ml丙酮中，搅拌下加入4.5ml 1M氢氧化钠水溶液，然在室温下将该溶液搅拌0.5小时。当完成盐的生成后，将20ml水加入到混合物中，使溶液中和，然后真空蒸发丙酮。将含水浓缩物在用150ml Diaion HP20树脂填充的柱子(柱子直经：2.6cm，床的高度：30cm)上层析。作为洗脱剂，使用丙酮-去离子水的混合物，其中丙酮的浓度以5％分步增加。用含15％丙酮的丙酮-去离子水混合物，可以使普伐他汀从柱子上洗出。通过TLC分析流分。合并含所述产物的流分，真空蒸发丙酮。通过冻干含水残余物，得到1.3g普伐他汀。从乙醇和乙酸乙酯的混合物中结晶出层析纯的产物。熔点：170-173℃(分解)[α]^D ₂₀＝+156°，(c＝0.5，水中)。紫外吸收光谱(20μg/ml，甲醇中)：λ_max＝231，237，245nm(logε-4.263；4.311；4.136)红外吸收光谱(KBr)：υOH 3415，υCH 2965，υC＝O 1730，υCOO^-1575cm^-1。¹H-NMR波谱(D₂O，δ，ppm)：0.86，d，3H(2-CH₃)；5.92，dd，J＝10.0和5.4Hz，1H(3-H)；5.99，d，J＝10.0Hz，1H(4-H)；5.52，br 1H(5-H)；4.24，m 1H(6-H)；5.34，br，1H(8-H)；4.06，m，1H(β-H)，3.65，m，1H(δ-H)；1.05，d，3H(2’-CH₃)；0.82，t，3H(4’-H₃)。¹³C-NMR波谱(D₂O，δ，ppm)：15.3，q(2-CH₃)；139.5，d(C-3)；129.5，d，(C-4)；138.1，s(C-4a)，127.7，d(C-5)；66.6，d(C-6)；70.1，d(C-8)；182.6s(COO^-)；72.6.d(C-β)；73.0，d(C-δ)；182.0，s(C-1’)18.8；q(2’-CH₃)；13.7，q(C-4’)。正离子FAB质谱(特征离子)：[M+Na]^-469；[M+H]⁺447负离子FAB质谱(特征离子)：[M-H]^-445，[M-Na]^-423，m/z 101[2-甲基-丁酸-H]^-。

                    实施例3

在实验室规模5升工作体积发酵罐中，如实施例1中所述制备生物转化培养基MU/4，虽然它至多加样4.5升，但是培养基的组合物计按5升计算。121℃灭菌45分钟后，用按照实施例1制备的500ml种子培养物接种。通过使用搅拌速率为300 rpm，通气速率为50升/小时，使发酵于25℃进行4天。将5g密实菌素底物添加至培养物中后，按照实施例2进行生物转化。

完成该生成转化后，将4.9升含有660μg/ml普伐他汀的肉汤过滤，通过在2×1升去离子水中悬浮，洗涤分离的菌丝体。用20％硫酸将混合的5.6升肉汤滤液的pH调至3.5-3.7，然后该酸性滤液和2750ml乙酸乙酯搅拌30分钟。随后，分离各相。水相再用2×1375ml乙酸乙酯萃取。将470ml去离子水加入到混合的4740ml乙酸乙酯萃取物中，然后用1M氢氧化钠将乙酸乙酯混合物水溶液的pH调至7.5-8.0。搅拌20分钟后，分离各相，然后如上所述用2×235ml去离子水萃取乙酸乙酯萃取物。然后将混合的弱碱性1080ml体积的水溶液真空浓缩至280ml体积。将该浓缩的水溶液铺在用280ml Diaion HP-20(Mitsubishi Co.，日本)非离子树脂填充的层析柱(高度∶直经的比率＝6.5)上。用流速250-300ml/小时在该柱子上进行吸附，然后用840ml去离子水洗涤柱子。随后，按以下顺序用800ml5％，1000ml 10％，500ml15％和500ml 20％含丙酮的水洗脱柱子。在洗脱的过程中，收集50ml的流分，所述流分根据实施例2中提供的TLC方法进行分析。将含普伐他汀为主要成分的流分合并，所得到的溶液真空浓缩至260ml体积。浓缩的水溶液在含Diaion HP-20树脂的260ml体积的柱子上层析。吸附普伐他汀后，柱子用790ml去离子水洗涤，然后以260-260ml的部分用如下逐渐增加丙酮含量的丙酮水溶液洗脱：2.5％，5.0％，7.5％，10.0％，12.5％，15.0％和20.0％。在柱层析的过程中，收集25ml的流分，如上所述分析流分中的普伐他汀含量。通过TLC鉴定的把含普伐他汀作为单一组分的流分合并，并真空蒸发。随后，将0.3g活性炭加入到浓缩的水溶液(约30ml)中，室温下使普伐他汀澄清30分钟。然后通过过滤法从溶液中去除活性炭，将滤液冻干。这样得到1.62g冻干形式的普伐他汀。

                     实施例4

用培养10-12天的Mortierella maculata n.sp.E-97[NCAIM(P)F001266]菌株的斜面培养物，和5ml无菌0.9％氯化钠溶液制备孢子悬液，用该悬液接种将在3000ml锥形瓶中灭菌的500ml VHIG种子培养基。培养基VHIG的组成：

葡萄糖                                   30g

肉膏                                     8g

酵母提取物                               1g

吐温-80(聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐单油酸酯)  0.5g

溶于1000ml自来水中。

灭菌之前将培养基的pH调至7.0，121℃灭菌25分钟。在旋转式摇瓶机(250rpm，2.5cm振幅)上将培养物培养3天，然后用获得的种子培养物接种实验室规模5升工作体积中含生物转化培养基PK的发酵罐。培养基PK的组成：

葡萄糖                  40g

蛋白胨                  5g

大豆粉                  20g

K₂HPO₄               2g

KH₂PO₄               1g

NaNO₃                 2g

KCl                    0.5g

溶于1000ml自来水中。

灭菌之前将培养基的pH调至7.0。按照实施例2进行接种、培养、添加底物和生物转化后，再从该肉汤中分离普伐他汀，其中发酵结束时普伐他汀的浓度为650μg/ml。

完成发酵，在连续搅拌下用2M氢氧化钠将4.9升含650μg/ml普伐他汀的肉汤的pH调至9.5-10.0，搅拌1小时后，用20％硫酸将pH调至3.5-3.7。随后，用2.45升乙酸乙酯萃取该酸性溶液。分离各相，用离心法从该乳化的有机相制备澄清的萃取物。根据上述方法，肉汤再用2×1.22升乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯萃取物合并，加入0.4升去离子水，然后用1M氢氧化钠将混合物的pH调至8.0-8.5。分离各相，如上所述，用pH 8.0-8.52×0.2升去离子水萃取乙酸乙酯相。搅拌下用20％硫酸将混合的含普伐他汀的弱碱性水溶液的pH调至3.5-3.7。所获得的酸性溶液用4×0.2升乙酸乙酯萃取。混合的乙酸乙酯萃取物用2×0.2升去离子水洗涤，然后将150％(摩尔)二苄胺(根据通过HPLC测量的普伐他汀含量—计算的)加入到乙酸乙酯溶液中。将乙酸乙酯溶液真空浓缩至0.2升体积。再将20％(摩尔)二苄胺加入到获得的浓缩物中，沉淀的溶液于0-5℃放置过夜。过滤沉淀的普伐他汀二苄胺盐，然后将沉淀在过滤器上先用冷乙酸乙酯洗涤1次，然后用正己烷洗涤2次，最后于40-50℃真空干燥。室温下，将得到的粗制产物(3.9g)溶于100ml甲醇，然后用0.45g活性炭使该溶液澄清。此后真空浓缩甲醇滤液。在外部温度62-66℃时，将蒸发的残余物溶于120ml丙酮中，然后将溶液冷却至室温。随后，于0-5℃下继续进行再结晶过夜。过滤沉淀的晶体，在过滤器上将晶体先用冷丙酮洗涤2次，然后用正己烷洗涤2次。将再结晶的普伐他汀二苄胺盐悬浮于160ml乙酸异丁酯和80ml去离子水的混合物中。随后，在搅拌下以等量将氢氧化钠加入到悬浮液中。悬浮液消失后，分离各相，含普伐他汀的水溶液用2×30ml乙酸异丁酯洗涤。获得的水溶液用活性炭澄清。然后将含水滤液浓缩至约20ml体积。获得的水溶液加样到用0.4升SephadexLH-20凝胶(供应商：Pharmacia，瑞典)填充的层析柱(高度∶直经＝22)上。在层析过程中，去离子水用作洗脱液，收集20ml的流分。通过TLC对流分进行分析，然后采用上述方法通过HPLC还对含普伐他汀的那些流分进行分析。合并含纯的普伐他汀的流分并冻干。这样得到1.75g普伐他汀，通过HPLC测定它的纯度高于99.5％。

                       实施例5

用培养10-12天的Mortierella maculata n.sp.E-97[NCAIM(P)F001266]菌株的斜面培养物和5ml无菌0.9％氯化钠溶液制备孢子悬液，然后如实施例4所述用该悬液接种500ml种子培养基。在实验室规模5升工作体积发酵罐中，将生物转化培养基PC/4在121℃灭菌45分钟，然后用种子培养物接种。培养基PC/4的组成：

麦芽汁    5.0％

大豆粉    1.0％

蛋白胨    1.0％

玉米浆    1.0％

MgSO₄×7H₂O    0.1％

溶于1000ml自来水中。

灭菌之前将培养基的pH调至7.0。按照实施例2进行接种、培养和添加底物后，得到5.1升含有浓度为610μg/ml的普伐他汀的肉汤。

根据实施例4中所提供的方法，从该肉汤中生产3.7g普伐他汀二苄胺盐粗制产物，将其再结晶后，从中得到2.9g普伐他汀二苄胺盐。将该再结晶的普伐他汀二苄胺盐悬浮于45ml乙醇中，然后在搅拌下通过添加1M氢氧化钠的乙醇溶液而加入110％(摩尔)氢氧化钠。继续搅拌溶液0.5小时，然后将0.3g活性炭加入到溶液中并再搅拌0.5小时。过滤溶液，将滤液浓缩至15ml。然后在56-60℃下将60ml丙酮加入到浓缩物中。将所获得的溶液冷却至室温，然后于+5℃放置过夜。随后，将沉淀过滤，然后用2×20ml丙酮、2×20ml乙酸乙酯和2×20ml正己烷洗涤，最后真空干燥。将得到的1.7g粗制普伐他汀溶于乙醇中，然后用活性炭澄清，从乙醇-乙酸乙酯混合物中结晶。这样得到1.54g普伐他汀，它与实施例2的产物相同。

                      实施例6

如实施例4所述，用培养7-10天的Mortierella maculata n.sp.E-97[NCAIM(P)F 001266]菌株的斜面培养物，接种3000ml锥形瓶中灭菌的500ml种子培养基MI，然后于28℃在旋转式摇瓶机上培养3天。培养基MI的组成：

葡萄糖          40g

酪蛋白          5g

KCl             0.5g

NaNO₃         3g

KH₂PO₄       2g

MgSO₄×7H₂O  0.5g

FeSO₄×7H₂O  0.01g

溶于1000ml自来水中。

灭菌之前将培养基的pH调至6.0，121℃灭菌35分钟。将获得的种子培养物接种到发酵罐中灭菌的5升生物转化培养基P12中。培养基P12的组成：

葡萄糖          10g

麦芽汁          50g

酵母提取物      5g

玉米浆          5g

MgSO₄×7H₂O  1g

吐温-80         0.5g

溶于1000ml自来水中。

灭菌之前将培养基的pH调至7.0，然后121℃灭菌45分钟。按照实施例2进行发酵、添加底物和生物转化。完成生物转化后，如下分离生成的浓度为620μg/ml的普伐他汀：

用2M氢氧化钠将5.15升含有620μg/ml普伐他汀的肉汤的pH调至9.5值，然后室温下搅拌1小时。过滤肉汤，菌丝体先通过在1×2升水中悬浮，然后在1×0.5水中悬浮进行洗涤。合并滤液，用20％硫酸将水溶液的pH值调至3.7，先用2.5升然后用1.5升乙酸乙酯萃取。将乙酸乙酯萃取物合并，用2×0.5升水洗涤后加入1.95g二环己胺。在40℃减压下将乙酸乙酯萃取物浓缩至200ml，再次将0.195g二环己胺加入到浓缩物中，然后将其于15℃下搅拌6小时。将沉淀的晶体物质过滤，先用20ml然后用15ml乙酸乙酯洗涤，在40℃下干燥。这样得到3.51g粗制产物。该粗制产物在丙酮-乙醇混合物中再结晶后，得到3.05g普伐他汀二环己胺盐(熔点：162-168℃)，按照实施例5将其转化为普伐他汀。

                     实施例7

如实施例2所述，用Mortierella maculata n.sp.E-97[NCAIM(P)F001266]菌株进行发酵、添加底物和生物转化。如下从肉汤中分离通过生物转化获得的普伐他汀。

含有浓度为650μg/ml普伐他汀的5升培养肉汤在过滤布上过滤。在2升0.1M氢氧化钠溶液中将霉菌菌丝体搅拌1小时，然后过滤。混合两种滤液，用15％硫酸将pH调至3.5-4.0。随后，该溶液用2×1.8升乙酸乙酯萃取。混合的乙酸乙酯相用800ml水洗涤。然后加入400ml去离子水，用1M氢氧化钠将混合物的pH值调至8.0-8.5。将混合物搅拌15分钟，然后分离各相。将300ml水加入到乙酸乙酯相中，并且将pH调至8.0-8.5。搅拌15分钟后，分离各相。再次将300ml水加入到乙酸乙酯相中，并且将pH调至8.0-9.5。然后将混合物搅拌15分钟。再次分离两相。混合所有的水相，并用15％硫酸将pH调至3.5-4.0，然后用3×300ml乙酸乙酯萃取。混合的乙酸乙酯相用150ml水洗涤，用无水硫酸钠干燥，并且过滤。然后将150％(摩尔)二辛胺(根据普伐他汀含量—计算的)加入到乙酸乙酯萃取物中。将乙酸乙酯蒸发至约1/10体积，加入丙酮直到出现沉淀为止。混合物于+5℃放置过夜。在G-4过滤器上过滤沉淀，先用20ml丙酮洗涤，然后用20ml正己烷洗涤，并于室温下真空干燥。从20ml丙酮中再结晶所获得的3.3g粗制普伐他汀二辛胺盐，得到2.7g纯的普伐他汀二辛胺盐。熔点：143-146℃。用实施例5中提供的方法，将普伐他汀二辛胺盐转化为普伐他汀。

                    实施例8

通过对分离自天然栖息地、能够将密实菌素6β-羟化的Mortierellamaculata n.sp.E-97菌株羟化能力的开发，在下文详细讨论的突变选择和酶诱导实验中，得到Mortierella maculata n.sp.E-97/15/13[NCAIM(P)F 001267]突变株。

将由我们分离的Mortierella maculata n.sp.E-97[NCAIM(P)F001266]菌株于28℃在MS琼脂斜面培养基上培养7天。琼脂培养基MS的组成：

葡萄糖            4g

麦芽汁            10g

酵母提取物        4g

琼脂              20g

在1000ml蒸馏水中。

用5ml 0.9％氯化钠溶液从斜面培养物中把孢子洗出，然后在将孢子悬液转移到无菌培养皿后，用紫外灯对其照射1分钟。随后，将终浓度为2000μg/ml的N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍加入到孢子悬液中。然后将该悬液转移到100ml锥形瓶中，并于28℃下用150rpm的速率将其振摇20分钟。随后，通过以400rpm的速率离心10分钟，使孢子沉淀，然后悬浮于0.9％氯化钠无菌溶液中。将该悬液涂布在含10μg/ml benomyl和1％去纤维蛋白血的琼脂平板MU-VB上。琼脂培养基MU-VB的组成：

葡萄糖                 40g

天冬酰胺               2g

蛋白胨                 2.5g

磷酸二氢钾             0.5g

琼脂                   20g溶于990ml蒸馏水中；灭菌后，为该培养基补充10ml牛血和10mgbenomyl。

琼脂平板于28℃培养7天后，将生长的菌落通过随机选择转种到装有琼脂培养基PS的试管中。琼脂培养基PS的组成：

葡萄糖                 40g

真菌蛋白胨             10g

琼脂                   15g

溶于1000ml蒸馏水中。

灭菌之前将培养基的pH值调至5.6-5.7。121℃灭菌20分钟。

斜面培养物于28℃培养12天，如实施例1所述，在摇瓶实验中测试培养物的普伐他汀生产力。通过该方法选择Mortierella maculata n.sp.E-97/15/13突变株，该突变株用应用的1000μg/ml浓度的密实菌素酸的钠盐产生超过60％转化率的普伐他汀。

通过在含100μg/ml 8-脱-(2-甲基-丁酰)密实菌素和/或密实菌素的MU-VB琼脂培养基上培养，诱导Mortierella maculata n.sp.E-97/15/13菌株的羟化酶。随机选择生长的菌落后，将它们转种到含诱导物的MU-VB斜面。根据实施例1中所述的方法检测斜面生长培养物的普伐他汀生产力，但有以下不同：从发酵的第4天起以500μg/ml的量添加密实菌素底物，连续添加11天，逐渐加入密实菌素钠底物，密实菌素钠底物在12天内完全转化为普伐他汀。在用30g密实菌素钠底物在50个摇瓶培养物中进行生物转化结束时，通过HPLC测定生成了18.5g普伐他汀。按照以下方法，从混合的发酵肉汤中进行普伐他汀的回收。

完成发酵后，用20％硫酸溶液将含有3360μg/ml浓度普伐他汀的5.5升肉汤的pH调至3.5-3.7。随后，该酸性溶液用2.75升乙酸乙酯萃取。分离各相，通过离心从乳化的有机相制备澄清萃取物。如先前所描述，用1.37升乙酸乙酯再萃取肉汤2次。混合的乙酸乙酯萃取物用2×1.15升去离子水洗涤，然后将150％(摩尔)二苄胺(根据通过HPLC测量的普伐他汀含量—计算的)加入到乙酸乙酯溶液中。将乙酸乙酯溶液真空浓缩至约0.23升体积。再次将20％(摩尔)二苄胺加入到浓缩物中，将沉淀溶液于0-5℃放置过夜。过滤沉淀的普伐他汀酸的二苄胺盐，然后将沉淀物通过将其悬浮在冷却的乙酸乙酯中而洗涤，然后悬浮在在正己烷中洗涤2次，最后于40-50℃真空干燥。于62-65℃温度将得到的粗制产物(22.4g)溶于0.67升丙酮中，用2.2g活性炭使溶液澄清。澄清后，将丙酮滤液真空浓缩至0.56升体积。在上述温度下将从该浓缩物中沉淀的晶体再次溶解，然后将该溶液冷却至室温。随后，在0-5℃继续再结晶过夜。过滤沉淀的晶体，通过在冷却的丙酮中悬浮2次而洗涤，然后悬浮在正己烷中洗涤2次。在40-50℃真空干燥再结晶的普伐他汀酸的二苄胺盐。在40-44℃将得到的普伐他汀酸的二苄胺盐(14.8g)溶于740ml乙酸乙酯-乙醇(9∶1)混合物中，然后将110％(摩尔)氢氧化钠加入到1M乙醇溶液形式的该溶液中。室温下继续搅拌获得的沉淀溶液0.5小时，然后通过应用或冰冷却1-1.5小时达到完全沉淀。随后，过滤沉淀，用2×150ml冷却的乙酸乙酯和2×150ml正己烷洗涤，最后于40-50℃真空干燥。将得到的普伐他汀溶于乙醇中，用1.0g活性炭澄清，然后从乙醇-乙酸乙酯混合物中结晶出来。这样得到9.4g普伐他汀，其物理常数对应于实施例2中给出的数据。

虽然本文已经描述了本发明的某些目前优选的实施方案，但是对于本领域技术人员显而易见的是，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以对本发明描述的实施方案进行多种变化和修改。因此，本发明仅限于所附权利要求书和法律可应用的规则所需的程度。

Claims (33)

1.一种用于从式(II)的底物化合物

其中R代表一种碱金属或铵离子，制备式(I)化合物的微生物方法，

所述方法包括以下的步骤：

a)在含有可同化的碳源和氮源和无机盐的营养培养基上，培养

  能够将式(II)化合物6β-羟化的Mortierella maculata丝状霉菌

  菌种的菌株，

b)将待转化的底物添加到所形成的Mortierella maculata培养物中，

c)让所述底物发酵直至生物转化结束，

d)从所述培养物肉汤中分离所述式(I)的化合物，和

e)分离纯化所述式(I)的化合物。

2.权利要求1的方法，其中所述培养基为一种营养肉汤。

3.权利要求2的方法，其中通过在一种阴离子交换树脂上吸附，进行从所述培养物肉汤中分离所述式(I)的化合物的所述步骤。

4.权利要求2的方法，其中通过用一种水不混溶的有机溶剂萃取，进行从所述培养物肉汤中分离所述式(I)的化合物的所述步骤，然后制备它的内酯衍生物或它的仲胺盐作为一种中间体。

5.权利要求2的方法，其中通过在非离子吸附树脂上层析而将所述发酵肉汤的有机溶剂萃取物中获得的碱性含水萃取物纯化，进行从所述培养物肉汤中分离所述式(I)的化合物的所述步骤。

6.权利要求1的方法，其中所述Mortierella maculata菌株是保藏于匈牙利布达佩斯国立农业和工业微生物保藏中心、保藏号为NCAIM(P)F 001266的Mortierella maculata n. sp. E-97菌株。

7.权利要求1的方法，其中所述Mortierella maculata菌株是保藏于匈牙利布达佩斯国立农业和工业微生物保藏中心、保藏号为NCAIM(P)F 001267的Mortierella maculata n.sp.E-97/15/13菌株。

8.权利要求1的方法，其中所述用于转化的菌株的羟化酶被8-脱(2-甲基-丁酰)密实菌素或密实菌素诱导。

9.权利要求2的方法，其中将作为底物的式(II)的化合物加入到平行于所述添加步骤的培养物中，并且其中所述添加步骤取决于所述培养物的pH，而它的量是相应于所述肉汤体积的0.5-1.0％。

10.权利要求1的方法，其中在含有一种选自葡萄糖、果糖和甘油的碳源的培养基上进行所述发酵步骤。

11.权利要求1的方法，其中在含有一种选自大豆粉、蛋白胨、酪蛋白、酵母提取物和肉膏的氮源的培养基上进行所述发酵步骤。

12.权利要求2的方法，其中通过以下步骤从所述培养物肉汤中分离在所述生物转化期间生成的式(I)的化合物：在一种阴离子交换树脂上通过从所述肉汤的滤液和从所述菌丝体的洗涤水中吸附所述式(I)化合物，从所述树脂中洗脱所述式(I)的化合物，将所述式(I)的化合物完全转化成它的内酯形式，分离所述内酯衍生物，用氢氧化钠水解所述内酯衍生物，以及在一种非离子吸附树脂上使所述式(I)的化合物脱盐。

13.权利要求12的方法，其中所述阴离子交换树脂具有季铵活性基并携有聚苯乙烯-二乙烯基苯骨架，被用来从所述肉汤的滤液中分离所述式(I)的化合物。

14.权利要求4的方法，其中在所述生物转化期间生成的式(I)化合物用水不混溶的有机溶剂从所述肉汤或从所述肉汤的滤液中以酸的形式萃取，所述肉汤已被酸化为pH3.5-3.7。

15.权利要求14的方法，其中所述水不混溶的有机溶剂是乙酸乙酯。

16.权利要求14的方法，其中所述水不混溶的有机溶剂是乙酸异丁酯。

17.权利要求5的方法，其中所述式(I)的化合物以钠盐形式用氢氧化钠水溶液从所述有机溶剂中萃取，并且在一种非离子吸附树脂上纯化。

18.权利要求14的方法，其中用一种含有烷基取代基、环烷基取代基、芳烷基取代基或芳基取代基的仲胺将所述式(I)的化合物以晶体形式从所述萃取物中沉淀出来。

19.权利要求18的方法，其中将所述晶体仲胺盐悬浮于乙酸的含有1-4个碳原子的烷基酯和水的混合物中；将等量的氢氧化钠以水溶液加入到所述悬浮液中，以形成有机相和水相；分离所述有机相和水相；所述水相用乙酸异丁酯洗涤，然后用活性炭澄清；并且将所述水溶液冻干。

20.权利要求19的方法，其中所述烷基酯是异丁酯。

21.权利要求18的方法，其中将所述晶体仲胺盐悬浮于含有1-4个碳原子的醇中；通过加入氢氧化钠的乙醇溶液，从所述悬浮液制备所述式(I)化合物的溶液；并且用丙酮使所述式(I)的化合物从所述溶液中沉淀出来。

22.权利要求21的方法，其中所述含有1-4个碳原子的醇是乙醇。

23.权利要求18的方法，其中将所述晶体仲胺盐溶于含有1-4个碳原子的链烷羧酸的含有1-4个碳原子的烷基酯和含有1-4个碳原子的醇的混合物中；并且通过加入氢氧化钠，使式(I)的化合物从所述溶液中以晶体形式沉淀出来。

24.权利要求23的方法，其中所述混合物是乙酸乙酯-乙醇混合物。

25.权利要求19的方法，其中通过所述式(I)化合物酸形式的二苄胺盐，从所述发酵肉汤中分离纯化普伐他汀。

26.权利要求19的方法，其中所述式(I)化合物的酸性衍生物通过其二环己胺盐纯化。

27.权利要求19的方法，其中所述式(I)化合物的酸性衍生物通过其二辛胺盐纯化。

28.权利要求19的方法，其中采用凝胶层析，将所述式(I)的化合物纯化至经HPLC测定至少为99.5％。

29.权利要求1的方法，其中在约25℃至约30℃下培养所述Mortierella maculata的菌株。

30.一种保藏于匈牙利布达佩斯国立农业和工业微生物保藏中心、保藏号为NCAIM(P)F 001266的Mortierella maculata n.sp.E-97菌株的生物学纯的培养物。

31.一种保藏于匈牙利布达佩斯国立农业和工业微生物保藏中心、保藏号为NCAIM(P)F 001267的Mortierella maculata n.sp.E-97/15/13菌株的生物学纯的培养物。

32.一种能够将式(II)化合物6β-羟化的被孢霉属培养物，

其中R代表一种碱金属或铵离子，所述培养物主要由一种新菌株Mortierella maculata n.sp.E-97组成，所述菌株保藏于匈牙利布达佩斯国立农业和工业微生物保藏中心，保藏号为NCAIM(P)F 001266。

33.一种能够将式(II)化合物6β-羟化的被孢霉属培养物，其中R代表一种碱金属或铵离子，所述培养物主要由一种新菌株Mortierella maculata n.sp.E-97/15/13组成，所述菌株保藏于匈牙利布达佩斯国立农业和工业微生物保藏中心，保藏号为NCAIM(P)F001267。

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