CN1346401A

CN1346401A - L－山梨糖的制备方法

Info

Publication number: CN1346401A
Application number: CN00803945A
Authority: CN
Inventors: A·M·雅各布森; K·H·尼尔森
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1999-02-19
Filing date: 2000-02-18
Publication date: 2002-04-24
Also published as: DE19907115A1; WO2000049133A1; NO20013995L; IL144651A0; EP1153120A1; NO20013995D0; CA2362926A1; JP2003521232A; KR20010102256A; AU2912400A

Abstract

本发明涉及高度耐受D－山梨醇的氧化葡糖杆菌菌种;其生产方法;以及一种由D－山梨醇半连续发酵生产L－山梨糖的方法。

Description

L-山梨糖的制备方法

发明领域

本发明涉及一种制备L-山梨糖的改进方法，该方法使该物质的工业生产特别方便，本发明还涉及能够特别有利地应用于该制备方法中的特异性非重组微生物。

L-山梨糖为制备2-酮-L-古洛糖酸的起始产物，由此以工业规模合成L-抗坏血酸。通过发酵以微生物方法制备抗坏血酸或其前体，例如L-山梨糖，具有以对映异构纯形式制备所需产物的优点。

然而，至今用于制备L-山梨糖的发酵方法伴随有许多缺陷。至今已知的方法中最严重的缺陷之一是起始产物，D-山梨醇，它仅能以相对低的浓度使用，即约1-15％(重量)的范围。发酵结束后的L-山梨糖浓度相应较低，甚至在完全反应的情况下也如此。第二个严重缺陷是要求反应必需间歇地进行。这意味着对每个生产批次而言必需首先在许多步骤中制备新的接种物。这样劳动特别密集并且费时，而且是工业生产L-山梨糖的严重缺陷。这些缺陷的主要原因在于发酵所需的微生物，特别是氧化葡糖杆菌种的细菌，它在工业规模发酵的条件下仅具有极有限的生存期，这些工业规模的发酵条件例如有高D-山梨醇浓度、廉价的非复合营养培养基、约3-7的pH波动、0.1-1.5升O₂/升培养基/小时的氧供应波动。此外，由于反应条件与理想参数的偏差才缩短了细菌培养物的生存期，特别在大的发酵罐中。经常在发酵结束时所用的大量细菌不再能生存或者能繁殖。为了为下一个反应批次创造理想的起始条件，即能够制备高细胞密度的接种物，因此现有技术需要新接种物的培养物。

EP-A-0758679描述了一种L-山梨糖-生产的氧化葡糖杆菌菌株G624(保藏号FERM-BP 4415)，它可以在20％浓度山梨醇培养基中培养。培养4天之后，该菌株以高产率将D-山梨醇转化成L-山梨糖。而且该菌株还用载有编码L-山梨糖脱氢酶和L-山梨酮脱氢酶的DNA的表达构建体转化。将所得转化体用于由D-山梨醇生产2-酮-L-古洛糖酸。然而，该发酵所用的培养基仅有5％的D-山梨醇浓度。必需培养5天才能使反应完成。因此整体上说，必须说明EP-A-0758679所公开的细菌在D-山梨醇耐受性方面和L-山梨糖合成性能方面都没有令人满意的性能。同样没有提出将那里所述的微生物应用于D-山梨醇的半连续或连续转化。

因此本发明的目的是创造更有效地发酵制备L-山梨糖的前提条件。

我们已发现，尤其是通过使用氧化葡糖杆菌种的微生物提供一种由D-山梨醇制备L-山梨糖的半连续发酵方法实现了该目的。而且，通过提供最佳化氧化葡糖杆菌菌种实现了该目的。

因此本发明首先涉及，通过在浓度逐渐增加的D-山梨醇中培养氧化葡糖杆菌菌株，使该菌株逐渐适应培养基中增加的D-山梨醇浓度，使低耐性的氧化葡糖杆菌菌株得到调理，从而获得对D-山梨醇具有高度耐受性的氧化葡糖杆菌菌种。

如果氧化葡糖杆菌能够在范围为约20-40％(重量)，例如约25-38％(重量)或者28-35％(重量)的初始D-山梨醇浓度的培养基中培养的话，那么存在本发明的“高耐受性”氧化葡糖杆菌菌株，即适应高D-山梨醇浓度的。显然同样可以在低于20％(重量)的D-山梨醇浓度下生长。优选这类菌株还应在生长过程中以高产率如70-100％将培养基中存在的D-山梨醇发酵成L-山梨糖。

例如，在调理过程中通过逐步将D-山梨醇浓度从最初的约5-10％(重量)增加到约20-40％(重量)，如约25-38％(重量)或者28-35％(重量)的最终浓度，可以获得本发明的高耐受性菌株。例如可以进行如下调理：

制备适合氧化葡糖杆菌生长且本身已知的无菌液体培养基，调整最初D-山梨醇含量，以便接种之后D-山梨醇含量例如为约5-15％(重量)，例如约10％(重量)。培养基的适宜配方描述在例如“IndustrielleMikrobiologie”[Industrial Microbiology]，Hans-Jürgen Rehm，Springer Verlag Berlin，Heidelberg，New York，2nd Edition，p.500。例如，可以使用10％浓度山梨醇培养基(pH5)，其中加入了含或不含0.1％(重量)葡萄糖的0.5％(重量)的酵母提取物。该培养基用新制备的未经调理的氧化葡糖杆菌菌株接种物接种。经过接种的培养基在有氧条件下在约30-37℃下培养，并且例如轻轻摇动或搅拌。连续发酵，直到不再能观察到明显的L-山梨糖形成。从发酵肉汤中取出等分试样并用于接种在这期间制备的第二次培养阶段的另一无菌培养基，其中(再接种之后)D-山梨醇含量高于前面培养阶段的培养基中的含量。接种物与待接种的培养物的比例应大致为1∶5-1∶20，例如1∶5-1∶10。重复上面步骤，逐渐增加山梨醇浓度，直到获得在具有所需高初始D-山梨醇浓度的培养基中生长的细菌培养物。可以根据开始菌株对浓度增加的反应的函数选择逐渐增加的D-山梨醇浓度。此外，可以相同或不同大小的梯度进行增加。例如，可以0.5％-3％的相同梯度，例如1％或者2％梯度逐渐增加D-山梨醇浓度。

按照另一实施方案制备氧化葡糖杆菌菌种，该菌种除了增加了D-山梨醇耐受性之外，还具有基本上恒定，即稳定的高L-山梨糖合成性能。如上所述，通过在高山梨醇浓度，例如约25-35％(重量)浓度的D-山梨醇培养基中重复地培养高山梨醇耐性菌，直到L-山梨糖的形成结束，可以获得具有这类性能的细菌。

当约90-100mol％、例如约93-98mol％的所用山梨醇在不超过约48小时之后，特别在不超过约36小时之后，例如在约15-25小时或者18-22小时之后反应时能获得本发明令人满意的“高”L-山梨糖合成性能。由于该合成性能能够受培养条件影响，上面标准尤其可用于以下标准条件：初始D-山梨醇含量：28-30％(重量)；培养基的pH：4.5-5.0；通风0.5-1.5升空气/升培养基/小时；接种物与填充培养基的体积比约为1∶5-1∶6；标准培养基：每kg培养基含有

玉米浆，50％干基 4.354g

硫酸铵 0.495g

磷酸氢二铵 0.124g

硫酸镁七水合物 0.082g

碳酸钙 0.472g

消泡剂 0.150g

如果能够通过将培养肉汤等分试样在新配制的培养基中连续接种，优选以接种物与填充培养基的体积比为约1∶5-1∶6，更准确地说所用生产菌种的L-山梨糖合成性能没有明显降低的情况下重复培养的话，就能得到本发明令人满意的“恒定”或“稳定”的L-山梨糖合成性能。该合成性能可以在上面定义的转化速率和反应时间的范围内波动。再接种1-5次或更多次，例如10-50次或更多次之后应仍然可以观察到恒定的合成性能。

本发明的调理方法原则上可以对所有未调理过的氧化葡糖杆菌菌株进行。然而，优选使用氧化葡糖杆菌NRRL-B72进行调理。该菌株可以从保藏地点(Northern Regional Research Laboratory，USA)免费获得。

本发明尤其涉及以上面方式调理过的氧化葡糖杆菌，它能够在有氧条件下将D-山梨醇转化成L-山梨糖，其中该细菌还以单个、成对或短链非运动、革兰氏阴性杆状形式存在，在半固体山梨醇-葡萄糖-酵母提取物-琼脂培养基和液体山梨醇-玉米浆培养基中在pH约3.5-6，温度约25-40℃和D-山梨醇浓度最高约40％(重量)，例如20-40％(重量)，特别是约25-35％(重量)下生长良好。

以NRRL-B72为原料按照上述调理方法获得并记录为内部名字“2B3”的特别优选的氧化葡糖杆菌菌株具有以下性能：

1.2B₃的形态性能：

-革兰氏菌株：阴性

-细胞形状：杆状

-细胞大小：1-2μm

-细胞的存在：单个、成对或短链

-运动性：阴性

-孢子形成：阴性

-菌落：

a)在肉膏-蛋白胨琼脂(pH7.0)上：接种2天之后偶然出现薄的肉眼很难看见的不清楚的菌落；

b)在山梨醇-葡萄糖-酵母提取物琼脂(pH5)上培养2天之后，出现针头形状和大小的圆顶、球形菌落。菌落为白黄色并有光泽。

2.生理性能：

-生长温度：T＝25-40℃，最佳为32℃

-pH范围：在pH为3.5-6，最佳pH4.5-5.0下生长

-需氧

-过氧化氢酶：阳性

-氧化酶：阴性

-硝酸盐还原性：阴性

-明胶液化作用：阴性

-H₂S形成：阴性

-吲哚产生：阴性

-乙醇氧化为乙酸：阳性

-淀粉：不能水解

-甘油、D-甘露糖醇、山梨醇：能利用

-乳酸盐氧化：阴性

-乙酸盐氧化为CO₂和H₂O的：阴性

由此生产的菌株具有按照Bergey’s Manual of SystematicBacteriology(9th Edition)，p.275ff中的信息的氧化葡糖杆菌的主要特征。关于其它非限制性特征，可以参考该标准工作鉴定。

除了上面特定描述的氧化葡糖杆菌菌种之外，本发明还涉及基本上具有相同性质并适合实施制备L-山梨糖的本发明方法的突变体及其变体，该方法在下文中有详细的说明。

制备特定所述的本发明微生物的突变体和变体的适宜方法的例子包括(但不限于此)：通过紫外光或X射线照射诱变；用化学诱变剂如亚硝基胍(N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍)、甲磺酸甲酯、氮芥等处理；基因整合法和使用噬菌体的转导。这些方法在现有技术中为已知并描述在例如：J.H.Miller，Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1972)；J.H.Miller，A Short Course in Bacterial Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NewYork(1991)；M.Singer and P.Berg，Genes&Genomes，UniversityScience Books，Mill Valley，California(1991)；J.Sambrook，E.F.Fritsch and T.Maniatis，Molecular Cloning；A LaboratoryManual，2nd Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，New York(1989)；P.B.Kaufman et al.，Handbookof Molecular and Cellular Methods in Biology and Medicine，CRC Press，Boca.Raton，Florida(1995)；Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology，B.R.Glick and J.E.Thompson，Eds.，CRC Press，Boca Raton，Florida(1993)和P.F.Smith-Keary，Molecular Genetics of Escherichia coli，TheGuilford Press，New York，NY(1989)。

本发明还涉及一种半连续发酵制备L-山梨糖的方法，该方法包括：

a)将氧化葡糖杆菌菌种接种到含有D-山梨醇的第一个培养基中并培养它，直到该D-山梨醇的转化基本上结束；

b)转化结束之后，将形成的L-山梨糖从大部分所得培养肉汤中分离出来；

c)将剩余量的培养肉汤以重量比1∶4-1∶8接种到第二个含D-山梨醇的培养基中并培养它，直到该D-山梨醇转化基本上结束；和

d)转化结束之后，将形成的L-山梨糖从培养肉汤中分离出来；

每种情况下培养基接种之后的初始D-山梨醇浓度最高约40％(重量)。接种物中的细胞密度相应地例如为1-10g生物量(干基)/升接种物。

按照本发明方法的一个优选实施方案，通常根据需要重复包括步骤a)-c)的发酵循环，直到形成足够量的L-山梨糖。为了本发明的目的，发酵循环“所需”的重复数例如为1-5次或更多次如10-50次，或者50-200次重复数的发酵循环。

由此可以看出，与现有技术相比，本发明方法的突出优点在于不需要新的接种物接种生产培养基。而且，所需的接种物可以直接从上一个发酵循环的培养肉汤中分出去，优选在D-山梨醇转化结束之后。按照本发明还令人吃惊地发现，尽管初始D-山梨醇浓度异常地高，例如25-35％(重量)，但是大量发酵循环可以完成。此外，令人吃惊的是每个发酵循环，在每次循环的反应时间为约15-25小时，特别是约20小时内以相当高的产率即约95-98mol％得到L-山梨糖。按照本发明所选的接种物与培养基之比保证生产批次事实上没有超过延滞期，而是含有高活力的细菌培养物。

发酵温度优选为约25-40℃，特别是约32-36℃。特别优选的发酵温度为约35℃，该温度处于该菌最佳生长温度(32℃)和将D-山梨醇酶催化部分氧化为L-山梨糖的最佳温度(36℃)之间。温度低于25℃和高于40℃，都将观察不到明显的细菌大量繁殖。而且如果温度低于25℃，接着进行加热，生长和生产能力增加到正常值，温度增加到40℃以上将导致细菌生长和生产能力的永久破坏。

此外，按照本发明，优选在每升培养基每分钟供应约0.5-1.5升空气进行发酵。以本身为已知的方式通过使空气富含氧，例如最高约20％(体积)，可以进一步提高细菌生长和D-山梨醇的发酵转化。还可以本身为已知的方式通过改变压力控制氧转移。在搅拌发酵罐中，氧转移尤其受到所用搅拌器的搅拌功率的影响。优选搅拌功率为约0.5-4kW/m³培养基。常用的搅拌器类型的例子为桨式搅拌器。

如上所述，按照本发明优选的细菌的最佳生长pH为4.5-5.0。当pH大于6至约7.5时，生长和生产能力被可逆地抑制，而发酵过程中的pH也可以短时间上呈现为值3.5或以下，例如至约3.0，对运行批次中的山梨醇氧化或下一个发酵循环中的生长和生产能力没有不利的影响。

此外，优选必需小心确保山梨醇底物没有过量的D-葡萄糖杂质，这是由于在发酵过程中因D-葡萄糖氧化为葡萄糖酸使得pH异常降低。

按照本发明优选用于发酵的微生物的培育时间随培养基中山梨醇浓度增加而增加。因此，在其它发酵参数相同的条件下，在27％浓度的培养基中的培育时间例如比在10％浓度的培养基中的培育时间长3倍。超出山梨醇的浓度范围约30-32％(重量)，该培育时间急剧增加。浓度为约40％(重量)时生长停止。在27％浓度山梨醇的培养基中以比例1∶5.6(接种物：培养基)接种后约12-18小时内细菌达到最佳细菌密度。直到培养物达到一定的细胞密度如约30-50％最终密度之后D-山梨醇向L-山梨糖的氧化才开始。

如果L-山梨糖被以结晶形式分离的话，优选所用D-山梨醇底物应没有D-甘露糖醇杂质。这是因为D-甘露糖醇将被酶促转化为D-果糖。少量的后者使该结晶过程受到抑制。

本发明的其它优点在于本发明制备方法可以使用相对简单、廉价的营养培养基或培养基进行。优选每kg液体培养基包括

a)约100-300g D-山梨醇

b)约4-5g玉米浆(50％干基)

c)约0.4-0.6g(NH₄)₂SO₄

d)约0.1-0.15g(NH₄)₂HPO₄

e)约0.06-0.1gMgSO₄.7H₂O

f)约0.5-0.9gCaCO₃(有或没有)

g)有效量的消泡剂

接种之前将培养基以本身为已知的方式杀菌。为此，杀菌之前例如使用约70-80％浓度醋酸将培养基的pH调整至5.5。发酵过程中仅通过添加碳酸钙来控制其pH。不需要其它控制，例如通过向运行的发酵过程中加入氢氧化钠溶液。在最初的生长期时，培养物的pH为约5.5-6，生长的对数期(细菌的对数繁殖)时pH降低至约4.0-4.5。

在补充本身完全足够发酵用的上述主要组分时，如果需要的话可以向按照本发明所用的营养培养基中加入其它组分。

因此，例如可以存在一种或多种其它烃源，例如淀粉水解物、纤维素水解物或糖蜜；和醇类，例如甘油。

而且，另外可以存在一种或多种氮源，例如氨水、无机或有机酸的铵盐，例如氯化铵、硝酸铵、磷酸铵、硫酸铵和醋酸铵；尿素；硝酸盐和亚硝酸盐和其它含氮物质如氨基酸、肉膏，蛋白胨，鱼粉，鱼水解物，酪蛋白水解物，大豆水解物，酵母提取物，干酵母，乙醇酵母馏出物，大豆粉，棉籽粉等。

而且，另外可以存在无机盐，例如钾盐、钙盐、钠盐、镁盐、锰盐、铁盐、钴盐、锌盐、铜盐和其它痕量元素的盐，也有磷酸。

同样可以单独或联合地加入适宜的痕量元素和生长因子，例如辅酶A、泛酸、生物素、硫胺、核黄素、黄素、单核苷酸、黄素腺嘌呤二核甙酸和其它维生素，氨基酸如半胱氨酸、硫代硫酸钠、对氨基苯甲酸、烟酰胺等。它们可以纯形式或含有这些物质的天然物质形式使用。

每种情况下使用的优选发酵技术主要取决于批次大小。而对较小批次而言，有氧摇动培养原则上适合的，为了工业规模实施本发明的方法，优选浸没的有氧条件下的发酵。

以常规方式进行D-山梨醇的转化，例如通过HPLC分析抽出的样品。为了检测L-山梨糖含量，适宜的方法为例如来自Merck的OA KC型HPLC柱7.8×300mm，流动相0.05N硫酸，0.4ml/min流速。

使用常规方法将形成的L-山梨糖连续或间歇地分离。如果适宜的话例如通过过滤或离心除去细胞群之后，以常规方式首先将所得培养肉汤浓缩。例如通过高温如50-80℃和减压如0.01-0.1bar下蒸发。沉淀出的晶体经过滤，如果需要的话进行重结晶。如果需要的话可以单独或联合地使用其它提纯步骤，例如溶剂萃取、色谱法、沉淀或盐析。

在以下试验部分中描述了本发明方法的特别优选的实施方案。

实施例1：各种营养培养基的制备：

a)玉米浆-盐混合物

玉米浆，50％干基 240g(约200ml)

硫酸铵 22.2g

磷酸氢二铵 6.6g

硫酸镁七水合物 3.6g

碳酸钙 48.6g

为了制备该培养基，将除碳酸钙之外的所有成分混合在一起，使用25％浓度的氢氧化钠溶液将其pH调整至约6。然后加入碳酸钙。再次测定其pH，如果需要的话将其调整至6.5。

b)山梨醇-玉米浆-盐琼脂

将实验室培养的氧化葡糖杆菌保持在琼脂斜面管中的该固体培养基上。就在接种前即刻在Roux烧瓶中在该固体培养基上生产发酵罐第一次接种用的接种培养物。山梨醇糖浆，70％(重量)干基 75.0g(约5％山梨醇)玉米浆-盐混合物 7.5g琼脂粉末 25.0g软化水 1000ml

将山梨醇糖浆、玉米浆-盐混合物和水混合在一起，加热至60℃并过滤。然后向沸腾滤液中慢慢加入琼脂粉末。然后将该热培养基分装到各培养容器中(9ml/30ml琼脂斜面管和100ml/650ml Roux烧瓶)。然后将这些容器密封并在121℃下高压杀菌20分钟。

c)山梨醇-葡萄糖-酵母提取物琼脂(pH5)

使用该培养基研究发酵过程中培养物的纯度。该培养基适合氧化葡糖杆菌生长，并且不适合大多数经常存在的污染微生物。在32℃下培养1-2天之后氧化葡糖杆菌在该培养基上形成特征为圆顶球形白黄色有光泽培养物。山梨醇糖浆，70％(重量)干基 75.0g(约5％山梨醇)葡萄糖 1.0g酵母提取物 5.0g琼脂粉末 15.0g软化水 1000ml

将山梨醇糖浆、酵母提取物和葡萄糖混合在一起，然后加入水。用12％(重量)浓度的醋酸将pH调整至5.3-5.4。向该沸腾混合物中慢慢加入琼脂粉末。然后在培养基仍然热的情况下将其分装到螺纹顶玻璃瓶中并在121℃下高压杀菌20分钟。冷却到约50℃之后，将该培养基倒入无菌塑料陪替氏培养皿上。

d)肉提取物-蛋白胨琼脂(pH7)

使用该培养基研究发酵过程中培养物的纯度。它是大多数经常存在的污染微生物的营养培养基。它不适合氧化葡糖杆菌生长。在32℃下培养2天之后氧化葡糖杆菌至多在该培养基上形成几乎看不见的模糊菌落。经常观察不到生长。

肉提取物 3.0g

蛋白胨 5.0g

琼脂粉末 15.0g

软化水 1000ml

与上面培养基c)相似地制备该培养基，只是将pH调整至7。

e)生产培养基

1000kg的28％浓度山梨醇培养基(密度1097kg/m³)的配方：

玉米浆，50％干基 4.354kg

硫酸铵 0.495kg

磷酸氢二铵 0.124kg

硫酸镁七水合物 0.082kg

碳酸钙 0.472kg

消泡剂 0.150kg

用自来水将山梨醇糖浆(70％干基；相当于400山梨醇)稀释并加入玉米浆。然后加入预溶解或悬浮于自来水中的无机盐。然后使用70-80％浓度的醋酸将其pH调整至5.5。最后加入消泡剂。以本身为已知的方式在141℃下将该培养基杀菌2分钟。

实施例2：氧化葡糖杆菌接种培养物的生产

在5℃下以琼脂培养物(培养基b)的形式将氧化葡糖杆菌保持预培养。使用无菌接种循环，由一个琼脂培养物通过32℃下培养2天生产5个新琼脂培养物。使用8个该琼脂培养物的细菌接种Roux烧瓶中的相同培养基。为此将琼脂培养物中的细菌悬浮于2×5ml的无菌0.9％浓度的氯化钠溶液中。将该悬液转移到一Roux烧瓶中。将总共8个接种烧瓶在32℃下培养2天，如果需要的话保持在5℃。将2个Roux烧瓶中生长的细菌悬浮于2×50ml无菌0.9％浓度的氯化钠溶液中并将其转移到一无菌玻璃容器中。该培养物用作一50m³发酵罐中山梨醇发酵用的接种物。接种物中的细胞密度约为10⁹个细菌/ml。

实施例3：D-山梨醇的发酵

a)第一步发酵

在50m³发酵罐中添加15,000kg生产培养基(比较实施例1培养基e))，其中山梨醇浓度仅为15％(重量)，玉米浆和无机盐的含量为2倍。培养基调整至35℃。在无菌条件下将按照实施例2生产的200ml接种物转移到该发酵罐中。发酵罐以1600-1800m³无菌空气/小时充气。发酵罐中的压力为约1.3个大气压。最初pH为约5.5-6.0。该第一步的发酵时间为约30-40小时。发酵结束时pH降低至约4.0-4.5。所得培养肉汤或者经过处理分离出形成的L-山梨糖或者用作第二个发酵阶段的接种物。

b)第二步发酵

将第二个50m³发酵罐添加33,000kg无菌生产培养基(28％(重量)的山梨醇)并接种6400升的接种物(相当于7000kg来自第一步发酵的培养物)。接种物与生产培养基的比例为1∶4.7。然后将发酵进行约18-22小时，直到山梨醇浓度降至低于0.1％(重量)。L-山梨糖的产率为约8.3kg/m³发酵罐体积/小时。将另外6400升的接种物从所得的发酵肉汤中分出去用于下一个发酵循环。将剩余量的发酵肉汤经处理分离出L-山梨糖。

实施例4：L-山梨糖的分离

按照实施例3的方法之后呈现的发酵肉汤含有约25-26％(重量)的L-山梨糖，低于约0.1％(重量)的D-山梨醇、剩余的生长培养基(溶解或悬浮)和1-2g菌群/升。将该发酵肉汤保持在约50℃，防止细菌进一步生长和山梨糖损失。

首先在60-80℃和0.02bar的压力下在第一个浓缩步骤中在常规降膜蒸发器中将该发酵肉汤浓缩至山梨糖含量为约42％(重量)。在第二步中，在57℃和0.02bar的压力下在常规长管蒸发器中将其进一步浓缩。通过该第二步蒸发，使得浓缩的L-山梨糖溶液达到过饱和。结晶含量为约30-50％(体积)。然后将用这种方式获得的粗结晶混悬液转移到常规沉降容器中。在其底部区域，一段时间之后形成基本上没有菌群的非常浓的结晶混悬液。将该结晶悬液与上清液分离，离心，用水洗涤并在约90℃下干燥至残余水分含量低于0.1％(重量)。

然后如上所述，进一步处理所得母液、洗涤液和沉降容器中的上清液，如果适宜的话在与来自另一批次的发酵肉汤合并处理。

以所用D-山梨醇为基础的总收率在结束处理之后通常为约89-92mol％。以这种方式制备的产物用作制备L-抗坏血酸的起始产物。

实施例5：氧化葡糖杆菌的调理

a)以与上面培养基c)相似的方式(比较实施例1)，制备D-山梨醇含量为约10％(重量)的无菌不含琼脂的液体培养基(850ml总体积于2升培养容器中)。该培养基接种150ml新制备的未调理的氧化葡糖杆菌菌株接种培养物。

在剧烈摇动(80rpm)的有氧条件(大气)下将接种的培养基(pH5)在32℃下培养。连续发酵，直到不再能观察到明显的L-山梨糖形成。从发酵肉汤中取出150ml体积并用于接种在这期间制备并具有11％(重量)D-山梨醇含量的另一无菌培养基。重复上面步骤，同时逐渐(1％梯度)增加山梨醇浓度，直到获得在约30％重量浓度D-山梨醇的培养基中生长的细菌培养物。

b)为了进一步优化L-山梨糖合成性能，因此将得到的适于高山梨醇浓度的氧化葡糖杆菌培养物连续地接种到30％重量浓度D-山梨醇的培养基(150ml接种物/850ml培养基)中。当培养约24小时之后约90-98mol％的所用山梨醇转化时达到最佳合成性能。

Claims

1.一种高度耐受D-山梨醇的氧化葡糖杆菌菌种的细菌，它是通过在逐步增加的初始D-山梨醇浓度中培养低耐性氧化葡糖杆菌菌株，使该菌株逐渐适应培养基中较高的D-山梨醇浓度，使该低耐性的氧化葡糖杆菌菌株得到调理获得的。

2.权利要求1的细菌，其中D-山梨醇浓度逐步从初始的约5-10％(重量)增加至最终浓度约25-38％(重量)。

3.前面权利要求任一项的细菌，其特征还在于它具有基本上稳定的L-山梨糖合成性能。

4.权利要求3的细菌，它是通过在较高山梨醇浓度下重复培养耐山梨醇的细菌，直到L-山梨糖形成结束获得的。

5.权利要求1-4任一项的细菌，其中使用氧化葡糖杆菌NRRL-B72进行调理。

6.前面权利要求任一项的细菌，其中它

a)在有氧条件下将D-山梨醇转化成L-山梨糖；

b)以单个、成对或短链非运动、革兰氏阴性、不形成孢子的杆状形式存在；和

c)在山梨醇-葡萄糖-酵母提取物-琼脂培养基和山梨醇-玉米浆培养基中在pH3.5-6，温度为25-40℃和D-山梨醇浓度到约38％(重量)下生长良好。

7.一种半连续发酵生产L-山梨糖的方法，该方法包含

a)将氧化葡糖杆菌菌种的细菌接种到含有D-山梨醇的第一个培养基中并培养它，直到该D-山梨醇转化基本上结束；

c)将剩余量的培养肉汤以重量比1∶4-1∶8接种到第二个含D-山梨醇的培养基中并培养它，直到D-山梨醇转化基本上结束；和

d)转化结束之后，将形成的L-山梨糖从培养肉汤中分离出来；

每种情况下培养基接种之后的初始D-山梨醇浓度最高约38％(重量)。

8.权利要求7的方法，其中根据需要重复包括步骤a)-c)的发酵循环。

9.权利要求7和8任一项的方法，其中发酵温度为约25-40℃。

10.权利要求7-9任一项的方法，其中将新接种的培养基的pH调整至约pH5-6，并且在发酵过程中降至不低于约pH3.5。

11.权利要求7-10任一项的方法，其中在供应约0.5-1.5升大气/升培养基/分钟的情况下进行发酵。

12.权利要求7-11任一项的方法，其中接种之后，将该培养基培养约15-30小时。

13.权利要求7-12任一项的方法，其中在使用的培养基中每kg培养基包含：

a)约100-300g D-山梨醇

b)约4-5g玉米浆(50％干基)

c)约0.4-0.6g(NH₄)₂SO₄

d)约0.1-0.15g(NH₄)₂HPO₄

e)约0.06-0.1gMgSO₄.7H₂O

f)约0.5-0.9gCaCO₃

g)有效量的消泡剂。

14.权利要求7-13任一项的方法，其中使用权利要求1-6任一项所定义的细菌。

15.一种制备2-酮-L-古洛糖酸的方法，该方法包含

a)使用权利要求7-14任一项的方法通过发酵将D-山梨醇转化成L-山梨糖，和

b)就地或中间分离之后将以这种方式制备的L-山梨糖以常规方式转化成2-酮-L-古洛糖酸。

16.权利要求1-6任一项的细菌用于由D-山梨醇制备L-抗坏血酸的用途。

17.一种生产高度耐受D-山梨醇的细菌的方法，该方法包含将权利要求1-5任一项的氧化葡糖杆菌菌种的细菌进行调理。