CN1238380C - 用于红细胞代用品的高纯度无热原无基质血红蛋白的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及的是用于红细胞代用品的高纯度无热原无基质血红蛋白的制备方法。在0℃-4℃条件下，在由天然血细胞经溶血处理得到的粗制溶血液中加入抗氧剂并调节溶液pH5.40-6.00后，充分脱除存在于血红蛋白中的氧后，在按与脱氧血红蛋白溶液重量/体积比为1-2%的量加入多羟基化合物作为保护剂的条件下，于50℃-60℃加热1-3小时，然后作常规过滤和超滤膜过滤处理并调整pH7.0-7.4。

Description

用于红细胞代用品的高纯度无热原无基质 血红蛋白的制备方法

技术领域

本发明涉及的是一种作为红细胞代用品使用的高纯度无热原无基质血红蛋白的制备方法。

背景技术

由于人类血型十分复杂，除各种抗原可能导致的输血免疫反应难以克服外，肝炎、艾滋病等多种可经血液途径传播的传染病对血液临床直接使用构成的威胁也越来越大，因而在各种临床医疗和急救中，对输血的质和量的要求越来越高。此外，人血的体外保存和运输问题也是影响将采集血液直接使用的重要制约因素。因此，研发和使用血液代用品已普遍受到重视。现在已明确，人类的血型反应来源于红细胞膜上的抗原种类的不同，去除了红细胞膜及其上所携带的各种血型抗原后的无基质血红蛋白(Hb)类红细胞代用品即可完全不存在配血型之忧，并且在制备过程中通过对病毒的灭活还可以消除各种随血液传播疾病的可能性。试验表明，此种无基质血红蛋白类红细胞代用品在一般室温条件下的贮存时间可长达一年以上，特别是其在性能上不仅具有与天然血相似的良好的携、释氧功能，且其粘度低，粒度小，对微循环周围组织的供氧能力还超过了天然红细胞，因而在心脑血管等缺氧性疾病的治疗以及紧急救治方面显示出了良好的发展前景。

虽然为解决以人体的血红蛋白为原料制备红细胞代用品中所存在的人血红蛋白的来源受限问题，有报导以大肠杆菌表达的基因重组人血红蛋白已经研究成功；也有报导从人血干细胞体外培养诱发出的人红细胞已在实验室初步完成，但这些技术在投入工业化生产都尚存在有工艺复杂和成本过高等方面的问题。因此，目前直接以动物血液或人体血液为原料制备血红蛋白类红细胞代用品仍是主要采取的途径和方式。在这些方面，目前资料已有报导的一种方法，是主要通过超滤和用丙烯葡聚糖凝胶柱S-100处理，然后经高压液相柱层析，最后通过亲合层析纯化血红蛋白的方法，可得到高纯度的血红蛋白溶液。但其方法操作工序较繁琐，导致成本过高，且回收率也较低。还有资料报导采用标准阴离子交换法和阳离子交换法，可使所制备的牛血红蛋白的纯度达到99％。这些方法普遍还存在血红蛋白的回收率低以及尚不适合于大规模工业化生产的问题。

已有文献报导，使血红蛋白处于脱氧状态能提高其对加热温度的耐受性。为此，曾有报导采用过饱和置换层析后，使血红蛋白与一氧化碳结合，以取代血红蛋白中所结合的氧，然后经巴氏消毒灭活病毒以及阴离子交换柱层析和阳离子柱层析处理，可得到高纯化的血红蛋白制品。由于血红蛋白与一氧化碳的结合力比氧约大150倍，因此用一氧化碳驱除和替换血红蛋白中结合的氧虽较为容易，但处理后使已结合的一氧化碳再与血红蛋白解离则显然更为困难。另有资料报导，对经溶血处理得到的粗制溶血液，用通入氮气、氩气等无氧惰性气体或真空的方式，使血红蛋白中所结合的氧充分施放后，再在加入还原性的谷胱甘肽、二硫苏糖醇(DTT)或次硫酸类化合物、连二亚硫酸类化合物、亚硫酸氢类化合物、硫氢类化合物等具有还原性的含硫化合物，并在保持脱氧状态下加热数小时至数天，以除去其中的非血红蛋白类的其它蛋白质成分并对病毒进行灭活的制备无基质血红蛋白的方法。该文献虽对有关脱氧、加热及病毒灭活等条件的研究作了说明，但未明确其对所得血红蛋白的纯度及其对制品的有关性能有无影响和/或改变。

发明内容

针对上述情况，本发明将提供一种操作方法和所需设备都大为简化，且能使制备时间周期缩短，成本降低的用于红细胞代用品的高纯度无热原无基质血红蛋白制备方法。该方法制备所得的血红蛋白制品不仅可达到同样的高纯度与无热原要求，而且可以有较高的回收率。

本发明的用于红细胞代用品的高纯度无热原无基质血红蛋白的制备方法，是在0℃-4℃条件下，在由天然血细胞经溶血处理得到的粗制溶血液中加入抗氧剂并调节溶液pH5.40-6.00后，充分脱除存在于血红蛋白中的结合氧和溶解氧后，在按与脱氧血红蛋白溶液重量/体积比为1-2％的量加入多羟基化合物作为保护剂的条件下，于50℃-60℃加热1-3小时，然后作常规过滤和超滤膜过滤处理并调整pH7.0-7.4。

文献报导和本发明人的试验结果证实，血红蛋白中是否结合有氧，在对加热温度高低和/或加热时间长短的耐受性上可表现有较明显的差异。因此使血红蛋白处于脱氧状态，对提高其对加热温度和/或加热时间的耐受性，减少过程中的损失和提高制品收率显然是有利的。在本发明上述制备方法中，使离心除去沉淀物后溶血液血红蛋白中所结合的氧充分脱除。例如，可以采用通入不含氧的氮气、氩气等惰性气体，或者是如二氧化碳等与血红蛋白无亲和力的其它气体，也可以采用真空条件下的释放方式，使以结合氧、溶解氧等各种形式存在于血红蛋白中的氧能充分的释放并被移走，直至其氧分压降至为0毫米汞柱止。

为提高血红蛋白对加热处理的耐受性，减少因加热变性造成的损失，如已有文献报导，在血红蛋白处理过程中加入具有还原作用的抗氧剂并维持其脱氧状态是有益的。为此，除已有报导的方式外，本发明方法特别提出采用以维生素C作为处理过程中的抗氧剂。例如，一种可供选择的方式是按重量/体积比为0.2-0.4％的量加入维生素C，一般情况下，此时还可以使调节pH5.40-6.00的操作同时一步实现。此外，与文献中已有报导使用的各种抗氧剂相比，使用维生素C除在经济上所具有的优越性外，其所具有的另一无可比拟的显著优越性还在于其在制品中使用的安全性，并简化从制品中除去抗氧剂的后续工作要求和质量控制及检验工作的难度。

试验表明，在本发明上述制备方法中，对滤除沉淀物的粗制脱氧状态血红蛋白溶液在加入多羟基化合物作为保护剂的条件下再进行加热处理，对于减少血红蛋白在加热处理过程中的损失，提高回收率，是有显著意义和重要作用的。能作为本发明方法中所说的保护剂使用的多羟基化合物可以有多种选择，其中以采用常用的5-6个碳原子的多羟基化合物最为方便。例如，采用甘露醇等多羟基醇类化合物，或是采用蔗糖、麦芽糖、乳糖或葡萄糖等多种含有5-6个碳原子的糖类化合物中的一种等，都是可供选择的具体方式之一。试验结果显示，使用了上述的保护剂后，以同样的方式进行加热处理后，血红蛋白浓度的降低一般均小于10％，高铁血红蛋白含量可低于2％。而不使用保护剂的对比试验结果显示，其血红蛋白的损失可超过30％，高铁血红蛋白的含量高于10％。

在制备过程中通过加热处理，使粗制溶血液中的非血红蛋白类蛋白质变性沉淀而被除去，是目前此类制备方法中必要的措施。试验表明，在采用加入多羟基化合物作为保护剂的本发明上述方法，于50℃-60℃的温度范围内加热——一般可在53℃-57℃的温度下加热，可有满意的效果。

在上述方法的基础上，为进一步提高处理的效率和方便操作，对于所说的经加热处理并冷却后准备常规过滤的处理液中，还可以在加入医用吸附剂并使其充分混合后，再按常规方式进行过滤处理。所说的医用吸附剂可以在一般医疗中最为常用的如医用级活性炭、壳聚糖、白陶土等材料中选用。所说吸附剂的加入量一般无需有严格的限制，可按一般的常规方式操作，例如，按重量/体积比为0.1-1％范围的量使用，就是一般可供选择的一种方式。采取此措施后，一方面有利于进一步提高对存在于制品中的热原及非血红蛋白类杂质的脱除效果，另一方面其还可以具有助滤作用，能显著提高过滤效率，对减少制品在此步操作中的损失也是有益的。

制备上述红细胞代用品的血红蛋白制品所采用的原料，目前报导为直接采集的动物血液或为各种形式的人体血液。如前述，此类原料，特别是以人体血液为原料时，受来源制约是应面对和积极解决的首要问题。由于人类的胎盘娩出后其中尚存贮有相当量的血液，而存在于人类胎盘中的这些宝贵血液资源目前尚未能得到充分的利用。本发明人曾在以前的有关专利中提出过可用于采集胎盘血的装置，并可以使对胎盘血的采集利用率成倍提高，有利于对人胎盘血充分开发和利用。因此，本发明上述制备方法所用的天然血细胞原料首先并特别可以为采集的胎盘血。与人体外周血的采集相比，由于胎盘在娩出过程中易受到各种因素的污染，因此，在采用胎盘血为原料时，一般可以在经溶血得到的粗制溶血液中按10万-100万单位/1000毫升的量加入常规抑菌药物后，再进行其后的处理程序。所说的抑菌药物可以在广谱类抗菌和/或抑菌药物中选用，例如，最为常用的青霉素、链霉素等就是可供选择的方式之一。此外，也可以采用过期的库存人血等为制备原料，使仍能发挥一定使用价值的废弃物得到充分的利用。当然，在采用其它来源的天然血细胞原料时，如认为有必要，也可以按此同样方式进行处理。

由此不难理解，本发明的上述制备无热原无基质血红蛋白的方法，可以使操作过程及其技术条件的难度和要求大为简化，所需设备也相对简单，与目前已有方法相比，仅设备方面所需的费用即可降低50％以上；整个制备过程所需的时间周期也可由目前常规的2-3天缩短为约1天，效率提高一倍以上。由于本发明上述方法制备过程所需的时间周期大大缩短，并采取了有利于进一步减少损失和提高收率的相应措施，使得到的无热原无基质血红蛋白的总收率约可提高10个百分点，制品的纯度同样可以达到99％以上的要求。

以下将通过具体实施方式的形式再对本发明的上述内容作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅局限于以下的具体实施方式。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1为对血红蛋白制品纯度检测的HPLC图谱。

具体实施方式

将采集的胎盘血(或成人外周血)，在0℃-4℃的低温条件下，按常规方法用无热原的生理盐水反复洗涤、离心后，得到压积红细胞，再以常用的低渗盐水溶液(如渗透压为15毫渗摩尔及pH7.4的磷酸盐缓冲液)或超声波等常规方式进行溶血处理，得到粗制的溶血液。在粗制溶血液中按10万-100万单位/1000毫升的量加入青霉素和/或链霉素等常规的抑菌药物并充分混合均匀后，再按重量/体积比为0.2-0.4％的量加入维生素C作为抗氧剂，并同时可使溶液pH调节为5.40-6.00。用通入不含氧的氮气等惰性气体或与血红蛋白无亲和力的二氧化碳气体的方式对处理液中的血红蛋白进行脱氧处理，使存在于血红蛋白中的结合氧和溶解氧充分的释放脱除并被移走，至其氧分压为0毫米汞柱止。在脱氧处理后的血红蛋白处理液中按重量/体积比1-2％的量加入蔗糖、麦芽糖、乳糖、葡萄糖等常用含有5-6个碳原子的糖类化合物中的一种，或加入甘露醇等含有5-6个碳原子多元醇等多羟基化合物作为保护剂并充分混合均匀后，于50℃-60℃的温度范围——例如可在53℃-57℃温度下保温1-3小时——例如一般可为2小时，使非血红蛋白类的蛋白质等成分变性沉淀。冷却至0℃-4℃并保持在此温度范围下，按重量/体积比为0.1-1％的量加入活性炭或白陶土等医用吸附剂，充分混合后保持0.5-1小时，然后按常规方式以5000转/分作离心沉淀后，再以常规方式过滤，最大限度除尽处理液中的热原及残余的非血红蛋白类杂质成分。用碳酸氢钠或磷酸二氢钠等弱碱将上清液调整至pH7.0-7.4后，以截留分子量为10KD的超滤膜按常规方式进行30分钟超滤处理，再经除菌过滤，即得到高纯度(≥99％)的无热原无基质血红蛋白制品。由UV320型紫外检测仪检测其纯度的HPLC图谱如图1所示。该制备周期所需时间约为1天。对由上述方法制备的红细胞代用品进行的主要指标检测结果如表1所示。

表1  对制备的红细胞代用品主要指标检测结果

检测项目	本发明方法所得制品	现有文献报导水平
			血红蛋白(Hb)含量	7-14％	7-14％
MetHb含量	＜5％	＜3-10％
			血红蛋白(Hb)纯度	99％	99％
分子量	120-600KD	120-700KD
			未聚合Hb	＜1％	＜1％
PH值	7.0-7.4	7.0-7.4
			P50	20-28mmHg	20-30mmHg
渗透压(COP)	20-25mmHg	23-28mmHg
			内毒素	合格	合格
细菌	合格	合格
			热源	阴性	阴性
Ma+	130-140Eg/L	130-135Eg/L
			K+	3.5-4.0Eg/L	3.5-2.8Eg/L
Cl-	95-106Eg/L	100-105Eg/L

Claims (8)

1.用于红细胞代用品的高纯度无热原无基质血红蛋白的制备方法，其特征在于在0℃-4℃条件下，在由天然血细胞经溶血处理得到的粗制溶血液中加入抗氧剂并调节溶液pH5.40-6.00后，充分脱除存在于血红蛋白中的氧后，在按与脱氧血红蛋白溶液重量/体积比为1-2％的量加入多羟基醇类化合物或含有5-6个碳原子的糖类化合物作为保护剂的条件下，于50℃-60℃加热1-3小时，然后作常规过滤和超滤膜过滤处理并调整pH7.0-7.4。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所说的多羟基醇类化合物保护剂为甘露醇。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所说的多羟基化合物保护剂中含有5-6个碳原子的糖类化合物保护剂为蔗糖、麦芽糖、乳糖或葡萄糖中的一种。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所说的在粗制溶血液中加入抗氧剂并调节pH5.40-6.00采用按重量/体积比为0.2-0.4％的量加入维生素C的方式一步完成。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于加入所说的多羟基化合物保护剂后的加热处理温度为53℃-57℃。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于在所说的加热后的处理液中按重量/体积比为0.1-1％的量加入医用吸附剂并充分混合后，再作常规过滤和超滤膜过滤处理。

7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于制备所用原料的天然血细胞为采集的胎盘血或过期的库存人血。

8.如权利要求1至8之一所述的制备方法，其特征在于在所说的粗制溶血液中按10万-100万单位/1000毫升的量加入常规抑菌药物后再作其后的处理。