CN1231762C

CN1231762C - 对候选化合物进行直接鉴定的方法

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Publication number: CN1231762C
Application number: CNB998122653A
Authority: CN
Inventors: 多米尼克·P·比汉; 德里克·T·查默斯; 廖王蓁; 林伊玲; 凯文·洛斯; 陈若平
Original assignee: Arena Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Arena Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1998-07-31
Filing date: 1999-07-30
Publication date: 2005-12-14
Anticipated expiration: 2019-07-30
Also published as: NO20010509D0; WO2000006597A2; WO2000006597A3; IL140858A0; WO2000006597A9; DE69940923D1; AU5545999A; CN1323396A; NO20010509L; NZ509429A; DK1095275T3; AU751080B2; ATE432472T1; CA2338543A1; JP2002521681A; EP1095275A2; EP1095275B1; CA2338543C; MXPA01001176A

Abstract

本发明公开了直接鉴定候选化合物的技术，该化合物作为对内源组成激活的G蛋白偶联孤独受体的激动剂、部分激动剂和/或最适合的逆向激动剂。这种直接鉴定的化合物最适合应用于药物中。

Description

对候选化合物进行直接鉴定的方法

特此请求共同享有的权益，包括：(1)1998年7月31申请的序列号为60/094879的临时专利申请；(2)1998年10月30申请的序列号为60/106300的临时专利申请；(3)1998年12月4申请的序列号为60/110906的临时专利申请(4)1999年2月26申请的序列号为60/121851的临时专利申请。本专利文本涉及1998年4月14日申请的US序列号09/060188专利申请。在此，参考结合前述专利申请的全部公开内容。

发明领域

本专利文件公开的发明涉及跨膜受体，尤其涉及内源配体未知的内源组成激活的G蛋白偶联受体以及使用这种受体对作为这种受体的激动剂、部分激动剂和/或最适合的逆向激动剂的候选化合物进行直接鉴定筛选的方法。

背景技术

A.G蛋白偶联受体

G蛋白偶联受体具有普通结构图型。这类受体具有7个α螺旋型疏水氨基酸序列7个，每个序列由22至24个疏水氨基酸构成，每个螺旋都横跨细胞膜。由氨基酸链把这种横跨膜螺旋连接起来，这种氨基酸链在膜的胞外侧且在第4和第5跨膜螺旋之间有一较大的环。另一较大的环基本由亲水氨基酸组成，在膜的细胞内侧连接第5和第6横跨膜螺旋。该受体的羰基末端位于细胞内而氨基末端在细胞外空间中。目前认为连接着第5和第6螺旋的大环及羰基末端与G蛋白相互配合。现已鉴定Gq、Gs、Gi、Go是G蛋白。G蛋白偶联受体的通式如图1所示。

在生理条件下，细胞膜中G蛋白偶联受体处于“非活性”和“活性”两种不同状态或形态的平衡中。如图2所示，非激活态受体是不能连接到胞内传导通道上来产生生物反应的。受体形态变为激活态才能连接到胞内传导通道并产生生物反应。

用内源配体或外源激动剂配体可以把受体稳定在激活态。最近发现用受体而不用配体也能稳定激活态，包括修饰受体的氨基酸序列，但并不局限于此。这类方法是通过对配体结合受体产生的效应进行刺激来有效地稳定受体的活性状态的。把这种利用孤立配体的方法产生的稳态活性称为“组成受体活性”。把内源配体未知或未鉴定的受体都称为“孤独受体”。

B.传统化合物筛选

一般来说，使用孤独受体来筛选鉴定对联与这类受体相关生物反应进行调节的化合物是已不可能的。这是因为传统“教条”认为筛选中被选择的化合物是在受体的配体已知情况下与受体竟争性结合的化合物，即化合物干涉或阻碍自然配体与受体的结合。根据定义，这种方式不适用于孤独受体。这种现有技术以及坚持这种教条方式指导的治疗学研究主要认为除非且必须发现受体的自然配体才能使用孤独受体。而孤独受体的内源配体研究会花费几年且成本达几百万美元。

进一步来说，在人类基因组中估计有2000个G蛋白偶联受体，其中大部分是孤独受体，这种传统教条极力反对对这些受体进行治疗学研究的创新方式。

C.孤独受体实例：GPR3，GPR4，GPR6，GPR12，GPR21，GHSR，OGR1和ALO22171

GPR3是内源配体未知的具有330个氨基酸的G蛋白偶联受体(Marchese，A等(1994)Genomics 23：609；另见Iismaa，T.P.等(1994)Genomics 24：391；参见图1描述的核酸和氨基酸序列)。GPR3是内源型组成激活的(Eggerick，D等(1995)Biochem.J.389：837)。GPR12是GPR3的一种同源物，具有334个氨基酸，其内源配体是未知的(Song，Z.-H.，(1995)Genomics 28：347；参见图1描述的氨基酸序列)。GPR6是GPR3的一种同源物，具有362个氨基酸，其内源配体是未知的(Song，Z.-H.，(1995)见上述图1描述的氨基酸序列)。GPR6转录主要在人类脑壳中，在前额皮层、海马及下丘脑中很少(Heiber，M等，DNA and CELL Biology(1995)14(1)：25，参见图1描述的GPR6的核酸和氨基酸序列)。GPR4也已被证实为一种孤独GPCR(Heiber，M等，DNA and CELL Biology 25(1995))。OGR1是一种孤独GPCR，报道为GPR4的高度同系物(Xu，Y.和Casey，G.，35 Genomics397(1996)。GPR21是一种内源配体未知的具有349个氨基酸的G蛋白偶联受体(参见基因文库附加号为#U66580的核酸推导出的氨基酸序列)。GPR21被报道是位于染色体9q33上的(O，Dowd B等，187 Gene75(1997)。ALO22171是一种位于染色体1q24上的来自克隆384F21的人类DNA序列。ALO22171已被证实具有一个编码361个氨基酸蛋白(参见基因文库附加号ALO22171)的开读框架1086bp。ALO22171中68％与GPR21相同(参见图5B)。GHSK也被证实为一种孤独GPCR(Howard，A.D.等，273 Science 974(1996))。

技术方案

在此公开的方法是对内源组成激活的G蛋白偶联孤独受体(GPCRc)相对应的候选化合物进行筛选的方法，用于对作为这种受体的激动剂、逆向激动剂或部分激动剂的候选化合物进行直接鉴定。为了达到这种筛选目的，提出使用内源组成激活的孤独GPCR：G蛋白-融合蛋白。

附图说明

图1表示一种G蛋白偶联受体的大体结构，编号指跨膜螺旋、胞内环和胞外环。

图2图示活性和非活性两种状态，为典型的G蛋白偶联受体和与第二信息传导通道的激活态连接；

图3用计算机显示的“点斑”表示通过一种人体组织的孤独受体GPR4的分布(参见附录A坐标编码)；

图4是表示由带有孤独受体GPR3的受感染细胞293T制备的膜比仅用对照载体转染的膜加强了[³⁵S]GTPγS结合，膜蛋白为75μg/孔，[³⁵S]GTPγS的放射同位素标记浓度稳定保持为1.2nM，GDP浓度稳定保持为1μm，在Wallac闪烁记录仪中的96孔格式上进行评价；

图5A表示孤独受体GPR3、GPR6和GPR12的氨基酸链，图5B表示孤独受体GPR21和ALO22171的氨基酸链(共同序列#1表示配合的残基)；

图6A是利用在VIP细胞中从CRE受驱动报告系统诱导β-半乳糖酶表达的加强能力，表示证实了孤独受体GPR3、GPR6和GPR12为组成激活的示意图，图6B和图6C是分别利用在293和293T细胞中从CRE受驱动报告系统诱导荧光素酶基因表达的加强能力，表示证实了孤独受体GPR21和ALO22171为组成激活的示意图；

图7A、图7B和图7表示采用RT-PCR确认的几种正常人类组织剖面中孤独受体GPR3(A)、GPR6(B)和GPR12(C)表达的相对分布，缩写：Ocx＝枕骨皮层；Hypoth＝下丘脑；Tex＝颞部皮层；Fex＝额部皮层。

图8A和图8B表示采用RT-PCR确认的在正常人(A)和癫痫患者(B)脑组织中表达的GPR3受体；

图9A是使用GPR6探针进行原位杂交(正常鼠)结果的自动射线照片；图9B是鼠脑相应区域的参考图；

图10A是自动射线照相证实GPR6探针定位杂交(Zucker鼠-C型)结果的复印图；图10B是使用GPR6探针进行定位杂交(Zucker鼠-肥胖型)结果的自动射线照片；图10C是鼠脑相应区域的参考图；

图11A-F是相使用GPR12探针定位杂交(正常鼠)结果的自动射线照片；

图12是使用GPR6探针(12A)和食欲素受体探针(12B)进行原位杂交(正常鼠)结果及证实两个受体(12C和12D)同位的重叠部自动射线照片；

图13是使用GPR6探针(13A)和黑皮质素-3受体探针(13B)进行原位杂交(正常鼠)结果及证实两个受体(13C和13D)同位的重叠部自动射线照片；

图14提供了同位实验结果，证明了GPR6和AGRP在弓体内的共同位置上，箭头表示注意弓体内特异性细胞以及环绕该细胞的环，“点”是放射性同位素标记的GPR6，其下部较黑的阴影是AGRP。

图15提供了动物(n＝5)接受了GPR6的反义寡义核苷酸后(第5天星符表示给动物注射了右旋d-硫酸苯异丙胺，参见图16)随天数的体重变化图示结果；

图16提供了图15所述动物的标准运动活性及苯异丙胺诱导的运动行为的柱状图；

图17提供了用GPR3融合蛋白标记物(图17A)和GPR6融合蛋白标记物(图17B)对被筛选的候选化合物进行直接鉴定的柱状图；

图18A-L是最佳期载体pCMV的序列图，包括限制本酶位点。

详细说明

涉及受体的科学文献使用了许多术语对影响各种受体的配体进行解释。为了明确区别起见，在本专利文件中使用下述定义，这些定义与其它定义有冲突时，以下述定义为准：

激动剂：指与受体结合激活细胞内反应或加强GTP结合到膜上的物质(如配体、候选化合物)。

氨基酸缩写：这里使用的氨基酸缩写列于表1中。

表1

丙氨酸	ALA	A
丙氨酸	ALA	A	精氨酸	ARG	R
天门冬酰胺	ASN	N	精氨酸	ARG	R

天门冬氨酸	ASP	D
天门冬氨酸	ASP	D	半胱氨酸	CYS	C
谷氨酸	GLU	E	半胱氨酸	CYS	C
谷氨酸	GLU	E	谷氨酰胺	GLN	Q
甘氨酸	GLY	G	谷氨酰胺	GLN	Q
甘氨酸	GLY	G	组氨酸	HIS	H
异亮氨酸	ILE	I	组氨酸	HIS	H
异亮氨酸	ILE	I	亮氨酸	LEU	L
赖氨酸	LYS	K	亮氨酸	LEU	L
赖氨酸	LYS	K	蛋氨酸	MET	M
苯丙氨酸	PHE	F	蛋氨酸	MET	M
苯丙氨酸	PHE	F	脯氨酸	PRO	P
丝氨酸	SER	S	脯氨酸	PRO	P
丝氨酸	SER	S	苏氨酸	THR	T
色氨酸	TRP	W	苏氨酸	THR	T
色氨酸	TRP	W	酪氨酸	TYR	Y
缬氨酸	VAL	V	酪氨酸	TYR	Y

部分激动剂：指与受体结合激活细胞内反应的级别/程度或加强GTP结合到膜上的级别/程度弱于使用激动剂的级别/程度的物质(如配体、候选化合物)。

拮抗剂：指象激动剂一样以相同位点竟争结合到受体上但不激活由受体激活态所启动的胞内反应、并能抑制由激动剂或部分激动剂引起的胞内反应的物质。在没有激动剂或部分激动剂的情况下拮抗剂并不减弱胞内基准反应。

候选化合物：指能改进筛选技术的分子(如化学化合物，并不限定于此)。“候选化合物”不包括以前利用间接鉴定方法从受体的逆向激动剂、激动剂和拮抗剂中选择的公知化合物(“间接鉴定化合物”)，更不包括以前鉴定的至少对一种哺乳动物具有治疗作用的间接鉴定化合物；尤其不包括以前鉴定的对人有治疗用途的间接鉴定化合物。

混合物：至少包含有一种成分，“药物”是混合物的一个例子。

化合物功效：指一种化合物抑制或刺激受体功能的能力量度，当受体结合同簇物时功效相反。测定化合物功效的最佳方法是测定GTP(利用[³⁵S]GTPγS)或cAMP，在本专利文件的实施例中进一步公开。

组成激活的受体(组成激活受体)：指受到组成受体激活的一种受体。一种组成激活的受体可以是内源的或非内源的。

组成受体激活：指通过除受体与其内源配体或一种化学等同物的结合之外的手段而使激活态受体稳定。

接触或接触着：指至少把两部分放在一起，不论是在体外系统还是在活体系统。

直接鉴定或直接鉴定的：与“候选化合物”有关，指与一个组成激活的受体相配的候选化合物的筛选以及对这种化合物进行化合物功效评价，组成激活的受体可以是一个组成激活的孤独受体，最好是细胞表面的一个组成激活的G蛋白偶联孤独受体。无论在什么条件下，这个词组均被解释或理解为反义或相反含义的“间接鉴定”或“间接鉴定的”。

内源的：指哺乳动物自然产生的物质。如以“受体”为例，但并不限定于此，内源的是指由一种哺乳动物(如人类，只作为例子并不限定于此)或一种病毒自然产生的。与此相反，在这个意义上的非内源的是指由一种哺乳动物(如人类，只作为例子并不限定于此)或一种病毒非自然产生的。例如内源形态不是组成激活的受体受控变为组成激活，在此最好称为“非内源的组成激活的受体”，但并不限定于此。这两个的术语都被用于描述“活体”和“体外”体系。例如在筛选方法中，内源的或非内源的受体都可以以体外筛选体系为参照，但并不限定于此。又如控制哺乳动物基因组包括非内源组成激活受体，用活体对候选化合物的筛选是明显的，但并不限定于此。

G蛋白偶联受体融合蛋白和GPCR融合蛋白：本发明在此公开内容中，每个这种蛋白都是指一个包括非内源组成激活的孤独GPCR融合在至少一个G蛋白上的非内源蛋白质，最好是这种G蛋白的阿尔法(α)亚单位(结合GTP的亚单位)，这种G蛋白可以是与动物内源GPCR天然偶联的G蛋白一样类型的。例如，内源态G蛋白“Gsα”是主要与GPR6偶联的G蛋白，但并不限定于此，根据GPR6得到的GPCR融合蛋白可能是一种包含有融合了Gsα的GPR6的非内源蛋白。该G蛋白可以被直接融合到内源组成激活的孤独GPCR的C末端，或者，可以在两者之间具隔离物。

间接鉴定或间接鉴定的：是指传统方法，该方法在药物研究方式中涉及对内源受体的特异性内源配体的鉴定，对与受体相配的、用于确定干扰和/或竟争配体-受体相互作用的候选化合物进行鉴定，以及对影响与激活的受体相关的至少一个第二信息通道的化合物功效进行评价。

抑制剂或抑制：与“反应”相关，是指当有这种化合物存在时反应降低或受阻，而当缺少这种化合物时结果相反。

逆向激动剂：指即可以与受体的内源形态结合也可以与受体组成激活形态结合的物质(如配体、候选化合物)，在缺少激动剂或部分激动剂所观察到的正常活性基本水平以下，它抑制由受体的激活态所启动的胞内基准反应，或者降低GTP与膜结合。与缺少这种逆向激动剂的状况相比，有逆向激动剂的状况下这种胞内基准反应至少可以受到30％的抑制，受抑制至少50％的效果较好，受抑制至少75％的效果最好。

配体：是指针对天然产生的内源受体而天然产生的内源特异性分子。

孤独受体：是指一种内源性受体，对该受体的特异性内源配体未被鉴定或是未知的。

药物：指至少含有一种活性组分的混合物，从而使这种混合物经得起哺乳动物体(如人体，但不限定于此)内特定有效结果的研究检验。本领域的普通技术人员将会理解和意识到这种适当技术用于确定是否一种具有理想效果的活性组分是人工制作的必要基础。

非孤独受体：指对内源天然产生配体特异性的内源天然产生的分子，其特征在于配体与受体结合激活胞内信息通道。

刺激或刺激着：与“反应”有关，在具有某种化合时反应增强而缺少这种化合物时结果相反。

下列各部分的次序只起描述性说明，并不用作对下列公开内容或权利要求限定的预定格式，也不应当限定为这种结构。

A.引言

对受体的传统研究总是先假设(基于以前研究的)只有在发现前先确认了内源配体才可能进一步寻找到拮抗剂和可能影响该受体的其它分子。即使在一种拮抗剂可能是先已知的情况下，研究也要立即延伸到寻找内源配体。这种思维方式认为即使在组成激活的受体发现后也要坚持受体研究。以前没有意识到受体的激活态对发现受体的激动剂、剂、部分激动剂和逆向激动剂最有价值。对于由整个活性受体引起的疾病来说，理想的治疗药物是具有削弱受体激活态作用的化合物，这种药物不必是内源配体的拮抗剂。这是因为降低活性受体态活性的化合物(药)不必象内源配体那样在相同点结合。因此，按照本发明方法的指导，治疗用化合物的任何研究都应当从筛选抵抗非独立配体激活态的化合物开始。所以，这种研究是对激活态受体的逆向激动剂研究。

以内源组成激活的孤独受体为参照对候选化合物进行筛选可以对作用于细胞膜表面受体的候选化合物进行直接鉴定，不需要先了解这种受体的内源配体知识或不需要使用这种受体的内源配体，这种受体例如此处记载的内源组成激活的GPRs，GPR3、GPR4、GPR6、GPR12、GPR21、GHSR、RE2和ALO22171，但并不限定于此。通过确定这类受体在体内表达或/和过度表达的区域，就可能确定与这些受体的表达和/或过度表达有关的疾病/紊乱状态，这种措施在本专利文件中公开。

B.疾病/紊乱鉴定和/或选择

正如下面较详细的说明，采用本发明方法可以鉴定内源组成激活孤独受体的最佳逆向激动剂，这类内源组成激活的受体例如这里所述的受体(GPR3、GPR4、GPR6、GPR12、GPR21、GHSR、RE2和ALO22171)。在治疗与这些受体有关疾病的药物新发现程序中，这类逆向激动剂作为导引化合物是理想的候选物。的确，甚至在没有配体-受体结合的情况下如果激活受体，这类受体(即使配体是已知的)的拮抗剂也可能是无效的。由于这些受体具有直接鉴定逆向激动剂的能力，能够研究与这些受体有关疾病和紊乱，从而可以进行药物开发。例如，现在对出现这些孤独受体的病变组织和正常组织样品进行扫描而不用进行学究式试验，或者可能不用遵循鉴定内源配体的途径。组织扫描可以在健康组织和病变组织大范围内进行。对与疾病和/或紊乱有关特异性受体进行的这种组织扫描最好是第一步。

可以把内源组成激活的GPCR的DNA序列用来制作探针，用于对组织样品中受体的表达进行RT-PCR鉴定。用病变组织中出现的受体或病变组织中出现受体的测定浓度与正常组织的进行比较，就能用来分析与疾病的相关性。利用这种技术同样能对受体在器管中的区域进行定位。根据具有定位受体特异性组织的已知功能，能推导出受体的公认功用。

C、同源鉴定

有效进行孤独受体与疾病和/或紊乱相关分析及鉴定是对具有与该孤独受体同源的附加受体进行鉴定。根据GPR6和GPR12与GPR3的同源序列，用这种方法对GPR6和GPR12进行了鉴定，并且，根据ALO22171与GPR21的同源序列，用这种方法对ALO22171进行了鉴定。GPR3以前已被鉴定为是一种组成激活的孤独受体(见Eggerick，supra)。在本发明以前，并不知道GPR6、GPR12、GPR21和ALO22171在它们的内源状态中也是组成激活的。使用已知的计算机数据库(如dbEST)鉴定了GPR6、GPR12、GPR21和ALO22171。

在此公开的本发明独特之处的重点在于：因教条认为药剂筛选依赖于受体的内源配体鉴定和了解，现有技术没有动机来探索是否GPR3同源物在其内源形式中是组成激活的(最多是出于研究好奇)。但是，本发明研究的动力在于对这类受体的逆向激动剂进行直接鉴定并能对这类受体在组织样品中的分布进行确定，本发明明显地不是出于这种无用的好奇，并且提供了减缓影响人体正常状况的疾病和紊乱的方法。

D、候选化合物的筛选

1、一般的GPCR筛选试验技术

当一种G蛋白受体变得有组成激活时，它结合到一个G蛋白(如Gq、Gs、Gi、Go)并促进GTP与该G蛋白的结合。然后，这种G蛋白作为一种GTP酶并缓慢的把GTP水解为GDP，从而，在正常条件下受体失活。不过，组成激活的受体不断把GDP变换成GTP。一种不能水解的GTP同类物[³⁵S]GTPγS能被用于监测增强了的与膜结合，该膜表达组成激活的受体。据报道，[³⁵S]GTPγS能被用于监测G蛋白偶联到有或无配体的膜上。在现有技术中这种监测的实例是众所周知的并且是很有效的，其中的一个例子是1995年Traynor和Nahorski报道的。这个试验体系的最佳使用是对候选化合物的初期筛选，因为这种体系一般能用于所有G蛋白偶联受体，除了与受体的胞内区域相互作用的特殊G蛋白以外。在GTP试验体系中最好利用GPCR融合蛋白。

B.2.特异性GPCR筛选试验体系

在对候选化合物使用“一般的”G蛋白隅联受体试验进行鉴定后(即一种选择作为激动剂、部分激动剂和逆向激动剂化合物的试验)，提仪进一步筛选确认已在受体位点起作用的化合物。例如，一种用“一般的”试验鉴定的化合物可以不与受体结合，但仅可以替换从胞内区域伸出的G蛋白。在具有GPR3、GPR4、GPR6、GPR12、GPR21、GHSR、RE2和ALO22171的情况下，已证实这些受体偶联G蛋白Gs。Gs刺激腺苷酸环化酶(另一方面，Gi抑制这种酶)。腺苷酸环化酶催化ATP向cAMP转化；因此，由于这些受体在其内源形式中被激活，cAMP的增加水平与此相关(另一方面，偶联Gi蛋白的内源受激受体与cAMP的减少水平有关)。(见Sinauer Associates，Inc.(1992)Nichols，J.G.等编著的From Neuron To Brain(第三版)，请主要参见“Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission”，Chpt.8)。因此，检测cAMP的试验就能被用于确定一种候选化合物是否是该受体的逆向激动剂(即，这类化合物与该受体接触与不接触这种受体相比会降低cAMP的水平)。现有技术中已知的各种检测cAMP的方法都可以利用，最好的方法是使用反义cAMP抗体。可以使用的另一种试验方法是整个细胞第二信息报告体系试验。基因上的启动子驱动特异基因编码的蛋白质表达。循环AMP通过启动cAMP-反应的DNA结合蛋白质的结合或转录因子(CREB)的结合驱动基因表达，该转录因子随后在被称作cAMP元件的特异性位点结合到启动子上，并且驱动基因的表达。报告体系可以构建为具有一个启动子，该启动子在报告基因前具有多个cAMP反应元件，如β-半乳糖苷酶或萤光素酶。所以，类似GPR3的一种激活的Gs受体引起cAMP积累，随后，cAMP激活基因并使报告蛋白表达。然后，使用标准生物化学试验就能检测到类似β-半乳糖苷酶或萤光素酶报告蛋白(例如，参见Chen等，1995)。最好是使用cAMP试验。

当然，也可以不采用一般试验方法而采用特异性试验方法直接对候选化合物进行鉴定。这类选择基本上是技巧性选择。对于GPR6来说，修饰后使用，商业上使用的cAMP试验主要是用于对逆向激动剂的直接鉴定。

C.3.GPCR融合蛋白

在对逆向激动剂、激动剂和部分激动剂进行直接鉴定使用候选化合物筛选中利用内源组成激活的孤独GPCR是一种特殊性的挑战，根据定义，内源受体甚至在缺少内源配体结合的情况下也具有活性。因此，要区别受体结合与不结合之间的差别，例如对有候选化合物的内源受体和没有候选化合物的内源受体进行区别鉴定，这种区别的目的在于了解这种候选化合物是否是一种逆向激动剂、激动剂、部分激动剂，或者是否对这类受体有作用，使用这种方法的好处在于可以加强这种区别。是好的方式是使用GPCR融合蛋白。

一般来说，一旦确定了一种内源孤独GPCR具有组成激活，使用上述的试验技术(或其它方法)，有可能确定偶联内源GPCR的主要G蛋白，G蛋白对GPCR的偶联提供可评价的信息通道。由于希望体系中具有内源G蛋白，所以，使用哺乳动物表达体系进行筛选是最好的。根据定义，在这种体系中内源组成激活的孤独GPCR会有连续信号。根据这种认识，以受体的逆向激动剂为例，其益处在于当逆向激动剂存在的情况下会加强这种信号，尤其是在筛选中，更有可能使受体与逆向激动剂接触与否之间的区别更明显。

GPCR融合蛋白会加强G蛋白偶联内源GPCR的效率。用内源组成激活的GPCR进行筛选出现GPCR融合蛋白是重要的，因为这种方式增加了这类筛选技术中最主要使用的信号。如在此所公开的，加强一种有用的“信号/噪音”比率对候选化合物的筛选是重要的。

用于表达GPCR融合蛋白的构建是本领域普通技术人员所掌握的。商业使用的表达载体和体系的各种方式都适合研究者的特殊需要。一个主要的标准是这种GPCR融合蛋白结构为内源GCPR序列和G蛋白序列均是符合读框的(可以为：内源GPCR序列是G蛋白序列的上游)，并且GPCR的“终止”密码子在GPCR表达中必须能被检测或取代，G蛋白也能被表达。GPCR可以直接与G蛋白联结，或者两者之间有隔离残基(但不超过12，这个数是本领域的普通技术人员已确认的)。我们用测定的GPCR活性对两种方式进行了评价，结果基本上是相同的，但建议(为方便起见)使用有隔离物的方式，把对表达不起作用的某些限定性位点变成隔离物。最好是在创建GPCR融合蛋白结构之前鉴定偶联该内源GPCR的G蛋白。因为已被鉴定的G蛋白仅有几个，最好是把具有G蛋白序列(即整体的G蛋白结构)的结构有效地插入内源GPCR序列中，所以，这种方式对具有不同序列的各种不同内源GPCRs的大规模筛选是很有效的。

E.药物化学

一般来说，候选化合的直接鉴定是与利用结合化学技术产生的相关化合物来推导的，但并不总是如此，所以，用于这种分析的随机制备的化合物是成千上万的。总的来说，这种筛选的结果是化合物具有独特的核结构，这些化合物围绕一个主核结构可以进行化学修饰进一步加强其药性。在这种方式中，直接鉴定的逆向激动剂、激动剂和/或部分激动剂能对以前开发的具有这种化合物的药物进行改良。一般认为，进一步改进成药物所选择的直接鉴定的化合物的结合亲和力为与受体的结合亲和力低于100nM，但这一般要根据技师的特珠需要参照选择。这种技术是本领域普通技术人员已知的，在本专利文件中将不再描述。

F.药物组合物

进一步开发选择的候选化合物可以使用本领域已知技术制成药物。适合的药用载体是本领域常使用的，例如，1980年Mack PublishingCo.出版的Remington′s Pharmaceutical Sciences(Oslo等编著)第16版中记载的内容。

实施例

下述实施例用于解释本发明，并不是对本发明的限定。在此公开了特异性核酸和氨基酸的序列，相信本领域的普通技术人员有能力对这些序列进行微小的修饰就能获得与上述报告相同或实质上相似的结果。其目的在于本发明从属权利要求请求保护的范围包括与GPR3、GPR4、GPR6、GPR12、GPR21、GHSR、RE2和ALO2217具有85％同源性的同等内源组成激活的人类孤独受体序列，同源性达90％效果较好，最好是同源性在95％以上。

实施例1

原位探针的制备

GPR3、GPR6和GPR12的原位探针是已有的。下列所用的PCR流程制备了这三种探针：所用反应条件是：1×rTth DNA聚合酶II、1.5mMMg(OAc)₂、4种核苷酸均为0.2mM、0.228μg小鼠基因组DNA、各引物为0.25μM(参见下述)，并在50μl反应液中具有1个单位的rTthDNA聚合酶(Perkin Elmer)。用Perkin Elmer Cetus2400热循环仪进行了30个循环，循环条件是：94℃1分、55℃1分、72℃45秒。

1.小鼠GPR3原位探针

由于数据库中没有小鼠GPR3的整体长度cDNA序列，这种原位探针的DNA片段是采用PCR获得的，使用的3′简并寡核苷酸是由已被公开的跨膜结构区域3中间的人和鼠GPR3序列得到的，使用的5′简并寡核苷酸是接近5′胞外区域始端的。使用的寡核苷酸序列如下：

5′-GGAGGATCCATGGCCTGGTTCTCAGC-3′(SEQ.ID.NO.：1；5′寡核苷酸)

5′-CACAAGCTTAGRCCGRTCCMGRCARTTCCA-3′(SEQ.ID.NO.：2；3′寡核苷酸)其中R＝A或G，M＝A或C。

具有穿过跨膜3中部的核苷酸24的A 537bp PCR片段是用BamHI和Hind III消化得到的，并被亚克隆进pBluescript的Bam HI-Hind III位点。

2.小鼠GPR6原位探针

小鼠GPR6的原位探针DNA片段是根据已公开的小鼠GPR6cDNA序列采用PCR获得的。使用的这种寡核苷酸序列如下：

5′-GGAGAAGCTTCTGGCGGCGATGAACGCTAG-3′(SEQ.ID.NO.：3；5′寡核苷酸)

5′-ACAGGATCCAGGTGGCTGCTAGCAAGAG-3′(SEQ.ID.NO.：4；3′寡核苷酸)

具有穿过跨膜区域4中部的核苷酸-10的A608bpPCR片段是用Bam HI和Hind III消化得到的，并被亚克隆进pBluescript的Bam HI-Hind III位点。

3.小鼠GPR12原位探针

小鼠GPR12的原位探针DNA片段是根据已公开的小鼠GPR12cDNA序列采用PCR获得的。使用的这种寡核苷酸序列如下：

5′-CTTAAGCTTAAAATGAAGGAAGACCCGAAG-3′(SEQ.ID.NO.：5；5′寡核苷酸)

5′-GGAGGATCCCCAGAGCATCACTAGCAT-3′(SEQ.ID.NO.：6；3′寡核苷酸)

具有穿过跨膜区域4中部的核苷酸-5的A516bpPCR片段是用BamHI和Hind III消化得到的，并被亚克隆进pBluescript的Bam HI-Hind III位点。

产生的原位探针序列如下：

GPR3原位探针

GGAGGATCCATGGCCTGGTTCTCAGCCGGCTCAGGCAGTGTGAATGTGAGCATAGACCCAGCAGAGGAACCTACAGGCCCAGCTACACTGCTGCCCTCTCCCAGGGCCTGGGATGTGGTGCTGTGCATCTCAGGCACCCTGGTGTCCTGCGAGAATGCTCTGGTGATGGCCATCATTGTGGGCACGCCTGCCTTCCGCGCCCCCATGTTCCTGCTGGTGGGCAGCTTGGCCGTAGCAGACCTGCTGGCAGGCCTGGGCCTGGTCCTGCACTTCGCTGCTGACTTCTGTATTGGCTCACCAGAGATGAGCTTGGTGCTGGTTGGCGTGCTAGCAACGGCCTTTACTGCCAGCATCGGCAGCCTGCTGGCCATCACCGTTGACCGCTACCTTTCCCTGTACAACGCCCTCACCTACTACTCAGAGACAACAGTAACTCGAACCTACGTGATGCTGGCCTTGGTGTGGGTGGGTGCCCTGGGCCTGGGGCTGGTTCCCGTGCTGGCCTGGAACTGCCGGGACGGTCTAAGCTT(SEQ.ID.NO.：7)

GPR6原位探针：

AAGCTTCTGGCGGCGATGAACGCTAGCGCCGCCGCGCTCAACGAGTCCCAGGTGGTGGCAGTAGCGGCCGAGGGAGCGGCAGCTGCGGCTACAGCAGCAGGGACACCGGACACCAGCGAATGGGGACCTCCGGCAGCATCCGCGGCGCTGGGAGGCGGCGGAGGACCTAACGGGTCACTGGAGCTGTCTTCGCAGCTGCCCGCAGGACCCTCAGGACTTCTGCTTTCGGCAGTGAATCCCTGGGATGTGCTGCTGTGCGTGTCGGGGACTGTGATCGCAGGCGAAAATGCGCTGGTGGTGGCGCTCATCGCATCCACTCCCGCGCTGCGCACGCCCATGTTTGTGCTCGTGGGTAGTCTGGCCACTGCTGACCTGCTGGCGGGCTGTGGCCTCATCCTACACTTCGTGTTCCAGTACGTGGTGCCCTCGGAGACTGTGAGCCTGCTCATGGTGGGCTTCCTGGTGGCGTCTCACCTACTACTCGCGCCGGACCCTGTTGGGCGTGCACCTCTTGCTAGCAGCCACCTGGATCC(SEQ.ID.NO.：8)

GPR12原位探针：

AAGCTTA从ATGAACGAAGACCCGAAGGTCAATTTAAGCGGGCTGCCTCGGGACTGTATAGAAGCTGGTACTCCGGAGAACATCTCAGCCGCTGTCCCCTCCCAGGGCTCTGTTGTGGAGTCAGAACCCGAGCTCGTTGTCAACCCCTGGGACATTGTCTTGTGCAGCTCAGGAACCCTCATCTGCTGTGAAAATGCCGTCGTGGTCCTTATCATCTTCCACAGCCCCAGCCTGCGAGCACCCATGTTCCTGCTGATAGGCAGCCTGGCTCTTGCAGACCTGCTGGCTGGTCTGGGACTCATCATCAATTTTGTTTTTGCCTACCTGCTTCAGTCAGAAGCCACCAAGCTGGTCACAATTGGACTCATTGTCGCCTCTTTCTCTGCCTCTGTCTGCAGTTTGCTGGCTATCACTGTGGACCGCTACCTCTCGCTGTATTACGCCCTGACGTACCACTCCGAGAGGACCGTCACCTTTACCTATGTCATGCTAGTGATGCTCTGGGGATCC(SEQ.ID.NO.：9)

实施例2

1.cDNA和载体

对于GPR3和GPR6来说，含有cDNA的表达载体是由BrianO′Dowd(University of Toronto)捐赠的。GPR3 cDNA的载体是pcDNA3，GPR6的载体是pRcCMV(把GPR6的编码区在Hind III-Xbal位点亚克隆进pCMV)。使用下列方式制备GPR12 cDNA：人类GPR12 cDNA是使用人类基因组DNA和用来自带有Hind III-Xbal限制位点的5′未翻译区域的5′引物及来自带有Bam HI位点的3′未翻译区域的3′引物，采用PCR获得的。引物具有以下序列：

5′-CTTAAGCTTGTGGCATTTGGTACT-3′(SEQ.ID.NO.：10；5′寡核苷酸)

5′-TCTGGATCCTTGGCCAGGCAGTGGAAGT-3′(SEQ.ID.NO.：11；3′寡核苷酸)

进行PCR的条件是：在生产者提供的缓冲液体系中使用rTth DNA聚合酶(Perkin Elmer)，各引物为0.25μM，4种核苷酸均为0.2mM，以0.2μg的基因组DNA作模板。循环条件是：94℃1分钟、57℃1分钟、72℃1.5分钟共进行30个循环。把1.2kbPCR片段用Hind III和BamHI消化，并亚克隆进pCMV表达载体的Hind III-Bam HI位点。产生的cDNA克隆是完全按公开的序列构成序列的。

对于GPR21来说，进行PCR的条件是：在生产者提供的缓冲液体系中使用rTth DNA聚合酶(Perkin Elmer)和作为模板的基因组DNA，各引物为0.25mM，4种核苷酸均为0.2mM。循环条件是：94℃1分分钟、62℃1分分钟、72℃1分20秒，共进行30个循环。把具有序列5′-GAGAATTCACTCCTGAGCCACTTCAGAT-3′(SEQ.ID.NO.：12)的5′PCR引物激酶化，并使3′引物具有序列5′-CGGGATCCCCGTAACTGAGCCACCTTCAGAT-3′(SEQ.ID.NO.：13)和Bam HI位点。产生的1.1kbPCR片段用Bam HI消化，并克隆进pCMV表达载体的EcoRV-Bam HI位点。随后确定了人类GPR21的核酸序列(SEQ.ID.NO.：14)和氨基酸序列(SEQ.ID.NO.：15)。

对于ALO22171来说，进行PCR的条件是：在生产者提供的缓冲液体系中使用rTthDNA聚合酶(Perkin Elmer)和作为模板的基因组DNA，各引物为0.25μM，4种核苷酸均为0.2mM。循环条件是：94℃1分分钟、54℃1分分钟、72℃1分20秒，共进行30个循环。5′引物具有Hind III位点和下列序列：

5′-AGGAAGCTTTAAATTTCCAAGCCATGAATG-3′(SEQ.ID.NO.：16)，3′引物含有EcoRI位点及下列序列：

5′-ACCGAATTCAGATTACATTTGATTTACTATG-3′(SEQ.ID.NO.：17)。产生的1.15kbPCR片段用Hind III和EcoRI消化，并克隆进pCMV表达载体的Hind III-EcoRI位点。随后确定并修饰了人类ALO22171的核酸序列(SEQ.ID.NO.：18)和氨基酸序列(SEQ.ID.NO.：19)。

对于GPR4(基因文库附加号L36148)来说，含有cDNA的表达载体是由Brian O′Dowd(University of Toronto)捐赠的。GPR4 cDNA的载体是pcDNA3，并在Hind III-Xbal位点(在Hind III位点和Apal位点之间5′未翻译的区域是利用传导消化/自身连接反应来调整的)。

对于RE2(基因文库附加号AF091890)来说，进行PCR的条件是：在生产者提供的缓冲液体系中使用rTth DNA聚合酶(PerkinElmer)和作为模板的人脑cDNA，各引物为0.25μM，4种核苷酸均为0.2mM。循环条件是：94℃1分分钟、62℃1分分钟、72℃1分30秒，共进行30个循环。5′PCR引物具有EcoRI位点和序列5′-AGCGAATTCTGCCCACCCCACGCCGAGGTGCT-3′(SEQ.ID.NO.：20)，并且，3′引物含有BamHI位点及序列5′-TGCGGATCCGCCAGCTCTTGAGCCTGCACA-3′(SEQ.ID.NO.：21)。然后，把两片PCR产生的1.36kbPCR片段用BamHI和EcoRI消化，并克隆进pCMV表达载体的EcoRI-BamHI位点。随后确定了核酸序列(SEQ.ID.NO.：22)和氨基酸序列(SEQ.ID.NO.：23)。

对于OGR1(基因文库附加号U48405)来说，进行PCR的条件是：在生产者提供的缓冲液体系中使用rTth DNA聚合酶(PerkinElmer)和作为模板的人类基因组DNA，各引物为0.25μM，4种核苷酸均为0.2mM。循环条件是：94℃1分分钟、62℃1分分钟、72℃1分20秒，共进行30个循环。5′引物具有Hind III位点和序列5′-GGAAGCTTCAGGCCCAAAGATGGGGAACAT-3′(SEQ.ID.NO.：24)，3′引物含有BamHI位点及序列5′-GTGGATCCACCCGCGGAGGACCCAGGCTAG-3′(SEQ.ID.NO.：25)。产生的1.14kbPCR片段用Hind III和BamHI消化，并克隆进pCMV表达载体的Hind III-BamHI位点。随后确定了核酸序列(SEQ.ID.NO.：26)和氨基酸序列(SEQ.ID.NO.：27)。

对于GHSR来说，进行PCR的条件是：在生产者提供的缓冲液体系中使用TaqPlus精密聚合酶(Stratagene)和作为模板的脑海马区cDNA，各引物为0.25uM，4种核苷酸均为0.2mM。循环条件是：94℃1分min、68℃1分min、72℃1分10秒，共进行30个循环。对于第一片PCR来说，5′PCR引物序列为：5′-ATGTGGAACGCGACGCCCAGCG-3′(SEQ.ID.NO.：40)并且，3′引物序列为：5′-TCATGTATTAATACTAGATTCT-3′(SEQ.ID.NO.：41)。用两微升第一片PCR作为模板产生第二片PCR，其中，激酶化用的5′引物序列为：5′-TACCATGTGGAACGCGACGCCCAGCGAAGAGCCGGGGT-3′(SEQ.ID.NO.：42)，3′引物具有序列：5′-CGGAATTCATGTATTAATACTAGATTCTGTCCAGGCCCG-3′(SEQ.ID.NO.：43)。1.1kbPCR片段用EcoRI消化，并克隆进pCMV表达载体的平头状-EcoRI位点。随后确定了人类GHSR的核酸序列(SEQ.ID.NO.：44)和氨基酸序列(SEQ.ID.NO.：45)。

2.转染程序

第一天制好平板，使每150mm平板具有293细胞或293T细胞1×10⁷。第二天准备两支反应试管(各试管的比例与每个平板相应)：制备的试管A中有混合了8-20μg DNA(如pCMV载体、带有受体cDNA的pCMV载体、带有GPCR融合蛋白的pCMV，在上部)的无DMEM(Irvine Scientific Irvine，CA)血清1-2ml，试管B中有混合了50-120μl的脂(质)转染试剂(lipofectamine)(Gibco BRL生产)的无DMEM血清1-2ml，把试管A和试管B倒位(几次)混合，随后在室温下温育30-45分钟。把该混合物用作“转染混合物”。用1×PBS冲洗平板温育的细胞，随后加入无DMEM血清10-12ml，然后给细胞加上2.4ml的转染混合物，接着在37℃15％CO₂中温育4小时。然后吸走转染混合物，加上25mlDMEM/10％牛胎血清(Fetal Bovine Serum)，在37℃15％CO₂条件下温育细胞。

对于GPCR融合蛋白来说，在上部的用量如下：12μgDNA、2ml无DMEM血清、60μl脂(质)转染试剂(lipofectamine)、293细胞9个，以及附加12ml无DMEM血清。

实施例3

GPCR的组织分布

以人为例，对于某些孤独受体来说，区别于现有技术之处在于了解人类中这类受体或与疾病状态有关的这类受体的分布。但许多孤独受体的这类信息是未知的或将不可能知道的。因此，对这类受体的理解可以为受体分布，这样就能有机会对与特定组织相关疾病状态或紊乱状态有关的特定受体进行预测，这种特定组织最好是这类受体可以表达的组织。利用商业上使用的mRNA点斑格式，对各种组织类型中内源组成激活的GPCRs的分布进行了评价。

根据生产者的指导，使用Prime-It IITM Random Primer LabelingKit(Stratagene，#300385)，把受体的整个编码区用于产生放射性同位素标记探针。以GPR4为例，使用这种方式。

根据生产者的指导，把人类RNA Marster Blot^TMkit(Clontech，#7770-1)与本探针杂交，并在严格的条件下冲洗。在-80℃下过夜把印迹暴露到生物用放射性自显影照相柯达胶片上(KodakBioMax^TM Autoradiography film)结果表示在图3中。在这些结果的基础上，注意GPR4是通过各种类型的胎儿组织(row G)和非胎儿心脏(C1)及非胎儿肺(F1)表达出来的。这种方式很容易用于其它受体。

实施例4

GTP膜结合闪烁亲近测定法

当一个G蛋白偶联受体处于激活态时，既可以是配体结合的结果也可以是组成激活的结果，受体结合到G蛋白上(在具有GPR3、GPR4、GPR6、GPR12、GPR21、GHSR、OGR1、RE2和ALO222171的情况下)并促进GTP与该G蛋白的结合。这种三聚G蛋白受体复合物起GTP酶的作用，并且缓慢地把GTP水解为GDP，在GDP点位处受体一般是失活的。组成激活的受体不断地把GTP交换成GDP。不能水解的GTP同系物[³⁵S]GTPγS用于来证实[³⁵S]GTPγS与具有表达组成激活受体膜增加的结合。用[³⁵S]GTPγS结合来测定组成激活的优势在于：(a)普遍适用于所有G蛋白受体；(b)接近膜表面不可能封闭影响胞内级联反应的分子。

该测定法使用了G蛋白偶联受体促进[³⁵S]GTPγS结合到表达相关受体膜上的能力。因此，这种测定法能被用于对已知孤独受体及组成激活的G蛋白偶联受体的候选化合物进行筛选的直接鉴定方法中。该测定法是通用的，在所有G蛋白偶联受体方面的药物开发都能使用。

测定的[³⁵S]GTPγS在20mMHEPES、pH7.4的结合缓冲液中用12nM[³⁵S]GTPγS和75μg膜蛋白(如293T细胞表达GPR3)及1μMGDP温育1小时制得的。然后，加入麦胚凝集素玻珠(25μl，Amersham)，并把该混合物在室温下再温育30分钟。接着再把试管在室温下用1500Xg离心5分钟，然后在闪烁计数器中计数。

参照图4，与对照相比，GPR4被确定增加了活性，这种增加的活性并不是自分泌刺激的结果，因为这种数据是从制备的膜中获得，而制备的整个细胞则没有增加活性。

实施例5

受体同源性确定

在证实GPR3是一种组成激活的受体后，使用商用程序DNAStar对数据库(基因文库)中有用的偶联G蛋白进行同源性研究，证实了GPR6和GPR12是两个高度同源受体(参见图5A)，这两个受体均为孤独受体。虽然这些受体的序列是已前“已知的”(即它们在数据库中能找到)，但并不知道这两个受体的内源形式是组成激活的(参见实施例6，图7)。因此，在配体未知或还没有被鉴定的情况下，不会有理由来研究把这类受体在药物开发方案中使用，正因为如此，开发药物的传统方式可能至多是毫无意义地或更可能无关地找出GPR3、GPR6和GPR12的同源性。

实施例6

组成激活同源受体的分析

虽然在现有技术中使用表达蛋白质的各种细胞，但最好是使用哺乳动物细胞。主要原因是基于实践，即利用，以表达GPCR的酵母细胞为例，虽然可以引入这种拟定的非哺育乳动细胞，这种细胞可能不包含(的确，在酵母中是没有的)偶联受体的一般机制和用哺育乳动物体系推导的信使通道，因此，从非哺乳动物细胞获得的结果，虽然有潜在的使用价值，但不如从哺乳动物细胞获得的结果可靠。尤其是使用哺乳动物细胞COS-7、293和293T细胞，尽管使用的这种特异性哺乳动物细胞可能是根据制作者的特殊需要制作的。

1.GPR3、GPR6和GPR12的分析

为了产生具有多个Gal4位点的β-半乳糖苷酶，从启动子中含有质粒1.4(5×Gal)CAT(Leonard，J.等(1992)PNAS USA 89：6247-625)的促生长素抑制剂中取出BgIII/HindIII片段，并克隆进pβgal-Basic(Promega)。BglII/HindIII片段含有最小促生长素抑制启动子(从-71bp至+50bp相关转录开始点)，其中用酵母转录因子Gal4识别序列的5个拷贝取代了cAMP反应元件(Response Element)的核4bp。当这种报告因子与编码Gal4-CRFB融合蛋白的表达质粒共同被转录时，高度适应于增加cAMP信息通道的介质。

细胞系VIP2.0Zc是用报告基因β-半乳糖苷酶在cAMP适应VIP启动子(Konig，等，Mol.Cell.Neuro.1991，2，331-337)的控制下稳定转染的。这里使用该细胞系间接测定胞内cAMP的积累。在转染前当天，在6cm平板中平板培养出约2百万细胞。每个受体DNA(5μg)混合有2.5ml含200μg/mlDEAE葡聚糖和100μM氯喹无血清的DMEM，并加到漂洗过的单层细胞中。在CO₂温育箱中温育90分钟后，除掉转染基质。用无血清的基质冲洗细胞。转染后24小时，把细胞再放进96孔平板中平板培养，每孔密度50-100K，并且在转染后48-72小时内测定β-半乳糖苷酶活性。

在测定缓冲液中含有1000mM磷酸钠、2mM、MgSO4、0.1mMMnCl2，pH8.0。用PBS冲洗细胞，并加入由0.1×测定缓冲液构成的25μl/孔的低渗裂解缓冲液。10分钟后，每孔中加入含有0.5％TritonX-100和40mMβ-巯基乙醇的测定缓浊液100μl，并在室温下温育持续10分钟。加入底物溶液25μl/孔，在测定缓冲液中的该底物溶液是含有5mg/ml氯酚红-β-D-吡喃半乳糖苷(CPRG)，把平板在37℃下温育30分钟后，用平板阅读仪测定595nm下的吸光度。

使用前述体系对GPR3、GPR6和GPR12进行测定，并确定了GPR6和GPR12均是组成激活的。参见图6A。

2.对GPR21和ALO22171的分析

把293细胞和293T细胞在96孔平板上制成密度为每孔2×10⁴个细胞的平板，并进行转染，使用脂转染剂Regent(BRL)，持续天数按生产者的指示进行。用于每6孔转染的DNA/类脂混合物的制备为：把具有260ng质粒DNA的100μl DMEM与具有2μl类脂的100μlDMEM均匀混合(260ng质粒DNA是由200ng8×CRE-Lue报告质粒、50ng pCMV和10ng表达质粒GPRS(在pcDNA中的GPRS(Invitrogen))构成，pCMV包括内源受体、非内源受体或独立的pCMV。8×CRE-Lue报告质粒的制备为：通过克隆pβgal-Basic载体(Ckontech)中BglV-HindIII位点的鼠促生长素抑制剂启动子(-71/+51)获得载体SRIF-β-gal，通过PCR从腺病毒模板AdpCF126CCRE8(参见7Human GeneTherapy 1883(1996))获得8个拷贝的cMAP反应元件，并在Kpn-BgalV位点克隆进SRIF-β-gal载体，产生8×CRE-β-gal报告载体。用从pGL3-basic载体(Promega)HindIII-BamHI位点获得的荧光素酶基因取代8×CRE-β-gal报告载体中的β-半乳糖苷酶基因，产生8×CRE-β-Lue报告质粒。随后，在室温下温育30分钟，用400μl DMEM稀释该DNA/脂类混合物，并在每孔中加入稀释过的混合物。在细胞培养温育器中温育4小时后在每孔中加入100μl带有10％FCS的DMEM。把经过一天转染的细胞转变为用200μl/孔带有10％FCS的DMEM处理。8小时后，用PBS冲洗，各孔再转变为用100μl/孔带有10％FCS无酚红的DMEM处理。第二天，使用LucLite^TM报告基因测定试剂盒(Packard)，按照生产者的指示，测定荧光素酶活性，在1450MicroBeta^TM闪烁发光计数器(Wallac)上读取数据。结果总结在图6B和6C中。

使用前述体系对GPR21和ALO22171进行测定，并根据结果确定了GPR21和ALO22171在其内源形态中均是组成激活的，参见图6B和6C。

3.对GPR4、RE2、OGR1和GHSR的分析

在此使用规定的方案，分析确定了GPR4、RE2、OGR1和GHSR均为内源型组成激活的类型(未示出数据)。

实施例7

GPR3、GPR6和GPR12的组织分布

使用下列引物，采用比较RT-PCR对用于表达这些孤独受体的组织样品进行检测：

GPR3：

5′-CTGGTCCTGCACTTTGCTGC-3′(SEQ.ID.NO.：28)

5′-AGCATCACATAGGTCCGTGTCA-3′(SEQ.ID.NO.：29)

这些引物的扩增片段为194bp。

GPR6：

5′-ACCAGAAAGGGTGTGGGTACACTG-3′(SEQ.ID.NO.：30)

5′-GGAACGAAAGGGCACTTTGG-3′(SEQ.ID.NO.：31)

这些引物的扩增片段为249bp。

GPR12：

5′-GCTGCCTCGGGATTATTTAG-3′(SEQ.ID.NO.：32)

5′-GCCTATTAGCAGGAACATGGGTG-3′(SEQ.ID.NO.：33)

这些引物的扩增片段为220bp。

这些扩增子被设计为有相同的Tm′s而没有重叠，即它们之间没有相同的序列，以便每个引物对都能在相同的最适退火温度下扩增其各自的靶标。这减少了一个引物对的扩增子在多重复合反应中扮演其它引物退火靶标的机会，因此，减少了其它引物对干扰的机会。

使用TRIzol^TM Reagent(Gibco/BRL)，按照生产者的指示，从组织样品(人类)中提取总RNA。使用2mg总RNA和一个First-strand^TMcDNA合成试剂盒(Pharmacia)制得cDNA。然后把该cDNA样品按1∶3用H2O稀释，比较PCR在[³²P]dCTP存在的情况下按已说明过的方式(Jensen，J.等人(1996)J.Biol.Chem.271：187490)制备。所有反应都包括有SPI-特异性引物，该引物扩增一个300bp的片段，用于内部控制。总之，使用引物，在限定的PCR条件下(1个循环：95℃5分钟；23个循环：95℃30秒，58℃30秒，75℃1分钟；1个循环：72℃10分钟)得到组成可靠质量精确的结果。进一步证实了在多重复合时被选择的引物对彼此并不干扰。用变性凝胶电脉(7M脲，5％聚丙烯酰胺(LongRanger^TM Solution，AT Biochemical，0.6XTBE)对PCR产品进行显色，随后进行放射性自显影照相。

图7A、7B和7C表示人类组织中GPR3、GPR6和GPR12的分布。这种信息可以用于评价与这类组织有关的疾病状况，并且确定在主要表达组织中的特异性区域，因此，可以确定这种受体表达与特殊疾病状态的关系。然后，依次可以直接鉴定冲击这类受体的化合物，而不需要认识和了解这类受体的内源配体。根据RT-PCR分析(图8)证明，与对照相比，进一步的筛选表明了GPR3更高水平地表达在人类癫痫组织样品中(组织来源：颞皮层)。

实施例8A

功能分析-GPR6(原位分析)

在海马中GPR6的分布说明可能会涉及进食行为。因此，进行这种受体的功能分析。进行的原位分析如下：

1.探针设计

从被克隆进pBluescriptSK+中HindIII-Smal位点的GPR6受体的450bp HindIII-Smal片段制得GPR6探针。核糖探针是使用T7转录体系在标准标记反应中制得的，标记反应的构成为：1μg线型质粒、2μl 5×转录缓冲液、125μCi³⁵S-UTP、150μM的GTP、CTP及ATP，12.5mM的dithiothreitol、20U的核糖核酸酶抑制剂和6U的适当聚酯酶。反应在37℃下进行90分钟，被标记的探针从无核苷酸的交联葡聚糖(Sephadex)G-50自旋柱分离出来。

2.组织制备

把未切割的组织在异戊烷中冷冻到-42℃，随后在恒温器上保持-20℃进行切片前，在-80℃贮藏。然后把放在载玻片上的组织切片在-80℃贮存。

3.原位杂交方案

把组织切片从-80℃的冷冻机中取出，用1μg/ml的蛋白酶-K溶液温育透化组织和钝化内源核糖核酸酶。这种处理后，把切片在水中(1分钟)、0.1M三乙胺中(pH8.0，1分钟)和在具有0.25％的醋酸酐的0.1M三乙胺中(10分钟)连续温育。然后，把组织在2×SSC(0.3mMNaCl，0.03nM的柠檬酸钠，pH7.2；5分钟)冲洗，并通过梯度浓度乙醇脱水。然后，在含有75％甲酰胺、10％葡聚糖硫酸酯、3×SSC、50mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)、1×Denhart溶液、0.1mg/ml酵母tRNA和0.1mg/ml剪切的鲑精DNA的杂交缓冲液20μl中把切片与1.5×10⁶dpm[³⁵S]UTP-标记的cRNA探针杂交。用盖玻片盖上组织切片，该盖玻片是用橡胶粘结剂密封的。在50℃使载玻片温育过夜。在第二天去掉橡胶粘结剂，把盖玻片用2×SSC浸泡，用鲜2×SSC溶液把组织切片冲洗10分钟。通过在37℃核糖核苷酸酶200μg/ml溶液中温育切片30分钟，除去未杂交的带有内源mRNAs单个链结的探针。然后，把组织用严格增加的SSC溶液(2×、1×和0.5×SSC，各10分钟)冲洗，随后在60℃用0.5×SSC冲洗1小时。在本次最终冲洗后，用梯度浓度乙醇使组织切片脱水，用空气干燥后，备好在Kodak XAR-5胶片上用X射线自显影照相进行测定。

4.分析

在正常雄鼠(sprague-Dawley，Charles River)上使用上述方案，确定了GPR6是在脑部下列区域表达的：下丘脑、海马、伏隔核、尾状核和脑皮层。参见图9A表示的组织切片(GPR6受体处在暗区，图9B提供了鼠脑的参照图)。

假定GPR6是在与进食有关脑区高水平表达的，用上述的方案在型和胖型雄性Zucker鼠(Charles River)进行了原位杂交分析。正如现有技术所鉴别的，Zucker动物一般进食表现为型和胖型。图10A提供了GPR6在型Zucker动物中表达的典型组织切片，图10B提供了GPR6在胖型Zucker动物中表达的典型组织切片，图10C是鼠脑切片的参照图。这些结果证实内源组成激活的孤独受GPR6在胖型中是相对过度表达的。

实施例8B

功能分析-GPR12(原位分析)

对GPR12进行的原位分析如下：

1.探针设计

从被克隆进pBluescriptSK+中HindIII-BamHI位点的鼠GPR12受体的515bp HindIII-BamHI片段制得GPR12探针。核糖探针是使用T3/T7转录体系在标准标记反应中制得的，标记反应的构成为：1μg线型质粒、2μl 5×转录缓冲液、125μCi³⁵S-UTP、150μM的GTP、CTP及ATP，12.5mM的dithiothreitol、20U的核糖核酸酶抑制剂和6U的适当聚酯酶。反应在37℃下进行90分钟，被标记的探针从无核苷酸的交联葡聚糖(Sephadex)G-50自旋柱分离出来。

2.组织制备

把未切割的组织在异戊烷中冷冻到-42℃，随后在恒温器上保持-20℃进行切片前，在-80℃贮藏。把放在载玻片上的组织切片在-80℃贮存。

3.原位杂交方案

把组织切片从-80℃的冷冻机中取出，用1μg/ml的蛋白酶-K溶液温育透化组织和钝化内源核糖核酸酶。这种处理后，把切片在水中(1分钟)、0.1M三乙胺中(pH8.0，1分钟)和在具有0.25％的醋酸酐的0.1M三乙胺中(10分钟)连续温育。然后，把组织在2×SSC(0.3mMNaCl，0.03nM的柠檬酸钠，pH7.2；5分钟)冲洗，并通过梯度浓度乙醇脱水。然后，在含有75％甲酰胺、10％葡聚糖硫酸酯、3×SSC、50mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)、1×Denhart溶液、0.1mg/ml酵母tRNA和0.1mg/ml剪切的鲑精DNA的杂交缓冲液20μl中把切片与1.5×106dpm[³⁵S]UTP-标记的cRNA探针杂交。用盖玻片盖上组织切片，该盖玻片是用橡胶粘结剂密封的。在50℃使载玻片温育过夜。在第二天去掉橡胶粘结剂，把盖玻片用2×SSC浸泡，用鲜2×SSC溶液把组织切片冲洗10分钟。通过在37℃核糖核苷酸酶200μg/ml溶液中温育切片30分钟，除去未杂交的带有内源mRNAs单个链结的探针。然后，把组织用严格增加的SSC溶液(2×、1×和0.5×SSC，各10分钟)冲洗，随后在60℃用0.5×SSC冲洗1小时。在本次最终冲洗后，用梯度浓度乙醇使组织切片脱水，用空气干燥后，备好在KodakXAR-5胶片上用X射线自显影照相进行测定。

4.分析

在正常雄性鼠(Sprague-Dawley，Charles River)上使用上述方案，确定了GPR12是在脑部下列区域表达的：海马(特别是在CA3区、CA4区和齿状脑回区；脑皮层的外层；以及杏仁状核区-现有技术中已知的与学习和记忆有关重要区域的所用区域)和丘脑中继核，包括外侧膝状核、内侧膝状核和外侧乳状核(与外部中继功能如视觉和听觉有关的区域)。参见图11A-F表示的组织切片(GPR12受体处在暗区)。

实施例8C

功能分析-GPR6与进食-行为受体共位(原位分析)

人类食欲素受体OX1R，主要是孤独受体GPCR(a.k.a.，“HFGAN72”)，已证实是在脑中外侧下丘脑区，并且推测是与进食行为的调节有关。Sakurai，T.等92(4)Cell 573(1998)。正如Sakurai中引用的，“对食欲素受体的直接药物干涉最引人注目的是对与能量体内平衡有关疾病新治疗的研究，这类疾病如肥胖症和糖尿病”，Id at582。已被鉴定的黑皮质素-3受体(MC-3)Gantz，I.等，268(11)J.Biol.Chem.8246(1993)，是与能量体内平衡有关的类似物。

了解与能量体内平衡的调节与失调有关的神经通道的重要性在于区别主要的细微差异是合理药物计设的关键。仅仅影响一个受体，尤其是与受体通道更相关的“下游”受体，会导致时间和资源的浪费，最终结果是药用化合物的开发可能性极小，即使是对一种特定疾病状态有实质性冲击。例如，菜普亭，虽然明显地与能量体内平衡的某些状态有关，但至今，仍不能证明在肥胖症药用产品的开发上有使用机会。OX1和MC-3受体(以及其它黑皮质素受体)也是以某种方式与能量体内平衡有关，例如，如果这些受体在能量体内平衡通道中，在其内源形态上不是组成激活的就没有效果，而如果有一个受体在内源状态中是组成激活的则效果很大，但按照传统的受体“拮抗剂”方式进行的药物开发可能会证明是无效的而不是多效的。根据定义，内源组成激活受体能连续地传送信号，而内源非组成激活受体需要结合配体来传送信号。因此，GPR6不但在内源形态中是组成激活的，而且在肥胖型动物模型中表现为显著上调。即使利用受体拮抗剂使这些受体达到完全阻断，GPR6的作用基本上超过了其它与能量体内平衡相关受体，GPR6可以连续传递信号。因此，确定这些受体(以及在能量体内平衡通道中的其它受体)是否在分离的神经区内共位对于提供用于药物开发更精确的受体目标是很有用的。

上述说明了对GPR6、OX1R和MC-3受体的原位杂交研究。对于GPR6来说，如实例例7A所述，使用了原位探针，对于OX1R和MC-3来说，探针是根据已出版的鼠序列制作的，并且分别大约为950bp和441bp。组织制备(正常鼠)和原位杂交基本与实施例8A相同。

结果表示在图12(GPR6和OX₁R)和图13(GPR6和MC-3)中，GPR6杂交的使用了红膜，而OX1R(图12B)和MC-3(图13B)杂交使用了绿膜。图12C和12D(图12A放大的版本)是由图12A和12B的重叠产生的；桔色区(来自红绿结合)是共位区。因此，在图12C中，可以看到GPR6和OX₁R在外侧弓状核和在腹内侧丘脑核的细胞亚区是共位的，外侧弓状核和在腹内侧丘脑核与能量体内平衡通道有关。对图13A(GPR6)和13B(MC-3)进行类似重叠证明了这些受体在外侧弓状核中基本是共位的。

现有技术认为信息是连续传送到与进食行为有关神经通道的。该通道的一个重要组件是神经肽，这是与灰质有关肽(AGRP)，有时称为与灰质有关转录(ART)。AGRP的表达大大限制了弓状核(见Flier，J.S.和Marators-Flier，E.以及其中的图1)。产生AGPR的细胞也产生神经肽Y(NPY)。动物研究已经证明摄入AGPR和神经肽(NPY)都会引起进食行为和肥胖症增加。已表明AGPR是黑皮质素4(MC-4)受体的一种拮抗剂，并且已知这种MC-4受体拮抗剂会增加进食行为和肥胖症。因此，AGPR的出现涉及到至少两条与进食行为有关的通道。如下所述，已经发现GPR6受体在产生AGPR的细胞内是共位的，根据下述实施例8中的结果，结合GPR6是一种内源组成激活的GPCR的事实，很明显，GPR6在某种方式上是系统的一种潜在“调节剂”-当通过反义扩增子(实施例9)减少GPR6受体的表达时，试验动物的体重会极快速地下降，说明GPR6调节着AGPR的表达。

不象上述“重叠”方式，使用Marks，D.L.等，3Mol.&Cell.Neuro.359(1992)中所述的方案对共位进行评价。AGRP(把382bp的AGRPcDNA克隆进Bluescript SK载体合成AGRPcRNA)与用放射性标记的GPR6联合进行分析，发现两者在弓状核中均是共位的(见图4)。假定AGPR在体内平衡中起作用，进一步假定GPR6在其内源状态是组成激活的，那么从下面的实施例9得到的结果可能与这种几乎直觉的资料是一致，可以用GPR6影响AGRP的程度来理解体重的显著下降。

实施例9

功能分析-GPR6(活体分析：GPR6反义)

根据实施例7得出的结果，并且不用任何特珠的理论推测，只假定GPR6受体的表达会使inter alia、进食行为、代谢、体重等减少，所以，使用反义寡核苷酸减少这种受体的表达，假定这类动物在功能性进食行为和/或与进食有关代谢方面是变化的。一般认为这种假定的检测类同于给受体使用逆向激动剂，逆向激动剂可能会降低这类受体的组成激活，类同于减少受体本身的表达。注意这种方式结果是“获得”受体，而不是“击落”受体。即一般来说，反义方式可减少约30％目标蛋白的表达。

本研究中使用了16只成年雄性Sprague-Dawley鼠(Harlan，SanDiego)。在使用前使动物在试验动物园中适应至少一周。把动物放在屋中(两组)挂着的塑料笼内，其中装有可随意取得的食物和水。在手术前(确立基本体重)至少一天及整个研究过程中(评价处理效果)对动物称重和进行管理。笼中成对动物的取食根据每天早晨再填满食物前后称得进食重量来测定。组类包括反义(n＝5)处理、错义(n＝4)处理和无菌水(n＝5)处理。

在戊巴比妥钠阿奈西辛(60mg/kg)处理下进行手术，必要是使用氟烷。用单插管(脑输注试剂盒，Alza Pharmaceuticals)以外腹侧(前囟，AP-1.0，Lat-1.5，自脑表面DV-3.8)为目标对动物进行脑功能区植入。通过软管把插管进口连接到渗透微泵(2001型，AlzaPharmaceuticals)的出口，根据生产者提供的说明，皮下植入在肩片之间。

泵中有反义寡核苷酸5′-GsCAGCGTTCATCGCCGsC-3′(SEQ.ID.NO.：34反义)(这里的小“s”表示硫代磷酸键)或错义寡核苷酸5′-CsTGGACTGTATCGCCCCsG-3′(SEQ.ID.NO.：35错义)或无菌水载体。利用GenSet Corp合成的寡核苷酸，并用无菌水稀释为2μg/μl。由于所用泵释放1μg/小时，动物接受量为反义寡核苷酸48μg/天或错义寡核苷酸24μl/天或无菌水24μl/天。在植入前在37℃无菌盐水中温育至少4小时，然后，再用泵植入。

手术后5天，用d-苯异丙胺硫酸盐处理动物，手术后6天，检测基准运动行为和苯异丙胺刺激的运动行为；手术后7天，把动物无痛苦致死并迅速取下脑部冷冻，用于组织学分析。

把动物从试验动物园带到实验室，放进开放式围场(见下述)，对基准活性测定30分钟。30分钟末，暂时把动物移出围场，注射d-苯异丙胺硫酸盐(1.0mg/kgs.c.，用无菌盐水稀释；National Institute onDrug Abuse Drug Supply Program)，再立即放回围场150分钟。每间隔10分钟测定运动行为，以便得出基准活性苯异丙胺刺激活性随时间变化。

对基准运动行为和苯异丙胺刺激的运动行为测定是在San DiegoInstruments Flex Field System中进行的，该体系由16″×16″×15″清洁有机玻璃开放式围场构成的。围绕开放式的光电池列界面与采集数据的个人电脑相连。一列光电池在围场地板上部2″处测定运动行为，第二列光电池在上部5″处测定后腿站立行为。计算机提供运动行为的各种测量，包括光电池总光片减弱、活动时间、休息时间、运动距离、后腿站立总数、后腿站立花费时间(未示出数据)。在试验过程中，试验室用过头顶的白炽灯泡产生的微弱光，用微弱噪声模仿外界声音。

结果列在图15、16中。注意，在图15中，接受反义寡核苷酸的动物(“获得”GPR6的动物)体重下降明显大于用错义寡核苷酸处理的动物或对照处理的动物。对于运动活性来说，图16的位置结果表明三组中基线和苯异丙胺刺激处理运动活性基本是相同的。

实施例10

GPCR融合蛋白制备

制备内源组成激活的GPCR-G蛋白的方案如下：鼠G蛋白Gsα(长型，Itoh，H.等，83 PNAS 3776(1986))的5′端和3′端均构建为其上包括HindIII(5′-AAGCTT-3′)序列。下面证实正确序列(包括侧位HindIII序列)，通过亚克隆利用载体的HindIII限制性位点把整个序列封密进pcDNA3.1(-)(Invitrogen，cat.no.V795-20).在亚克隆进pcDNA3.1(-)后测定Gsα序列的正确顺序。然后，对修饰过的在HindIII序列中含有鼠Gsα基因的pcDNA3.1(-)进行变化，本受体现在可用作“universal”Gsa载体。pcDNA3.1(-)载体在HindIII位点上游具有许多众所周知的限制性位点，所以，其好处在于提供了在Gsα蛋白上游插入编码内源组成激活GPRS序列的能力。利用这种相同的方法也能创建其它“universal”G蛋白载体，当然，利用其它商用载体或已知的特异性载体进行反义的重要标准是GPCR序列在上游且G蛋白的序列符合读框。

GPR3-Gsα融合蛋白结构和GPR6-Gsα融合蛋白结构的制作如下：

5′-gatcTCTAGAATGATGTGGGGTGCAGGCAGCC-3′(SEQ.ID.NO.：36正义)

5′-ctagGGTACCCGGACATCACTGGGGGAGCGGGATC-3′(SEQ.ID.NO.：37反义)

正义和反义引物分别含有限制性位点Xbal和Kpnl。对于GPR6来说，引物如下：

5′-gatcTCTAGAATGCAGGGTGCAAATCCGGCC-3′(SEQ.ID.NO.：38正义)

5′-ctagGGTACCCGGACCTCGCTGGGAGACCTGGAAC-3′(SEQ.ID.NO.：39反义)

正义和反义引物也分别含有限制性位点Xbal和Kpnl。在pcDNA3.1(-)载体中这些限制性位点在HindIII位点的上游。

利用PCR以保证上述公开Gsα通用载体中融合的各个受体序列，方案如下：把GPR3和GPR6的100ng cDNAlk 2μl分别加入单个试管，试管中分别具有2μl(正义和反义)、3μl 10mMdNTPs、10μL10×TaqPlus^TM精度缓冲液、1μLTaqPlus^TM精度聚酯酶(Stratagene：#600211)和80μL水。GPR3的反应温度和循环次数为：初期变性步骤是94℃5分钟，每个循环为94℃30秒、55℃30秒、72℃2分钟(对GPR3来说，重复30次)。最后的延伸时间为72℃下10分钟。对于GPR6来说，初期变性步骤是96℃7分钟，每个循环为96℃30秒、55℃30秒、72℃2分钟，重复30次。GPR6最后的延伸时间为72℃下10分钟。把GPR3和GPR6的PCR产品在1％琼脂糖胶上电脉，然后纯化(未示出数据)。把每个纯化的产品用Xbal和Kpnl(New England Biolabs)消化，并分离出想要插入的片段，纯化，在各自的限制性位点结合进Gs通用载体。转化和用限制性酶消化后分离出正克隆，并按后述方案使用293细胞完成表达。对GPR3：Gs-融合蛋白和GPR6：Gs-融合蛋白的每个正克隆测序，并用于对候选化合物的直接鉴定。

如上所述分析GPCR融合蛋白，并证实为组成激活的(未示出数据)。

实施例11

方案：用[³⁵S]GTPγS对逆向激动剂和激动剂直接鉴定

以作为逆向激动剂为例，尽管我们利用内源组成激活GPRs对候选化合物直接鉴定，但由于不了解其结合形态，内部试验差异会更大。所以，使用了上述公开的GPCR融合蛋白。我们已证实使用这类蛋白内部试验差异基本稳定，从而获得有效的信号/噪音比率。其好处是可以更好地对候选化合物进行鉴定。

注意，重要的是使用孤独受体得出的结果，正如使用此处公开的技术得出的资料所示，可以直接鉴定候选化合物，这类化合物是作为直接初选的逆向激动剂、激动剂和部分激动剂调节该孤独受体的，因此，此处公开的方法明显地足以可以在相同试验平板上对逆向激动剂调节剂和激动剂调节剂进行直接鉴定。

1.制备细胞膜

膜最内侧(参见实施例2和10)具有内源组成激活孤独受体GPCR融合蛋白，这种膜用于对作为逆向激动剂、激动剂和部分激动剂的候选化合物进行直接鉴定，其制备如下：

(a)材料

刮膜缓冲液(Membrane Scrape Buffer)的构成为20mMHEPES、10mMEDTA，pH7.4；洗膜缓冲液(Membrane Wash Buffer)构成为20mM HEPES、0.1mMEDTA，pH7.4；结合缓冲液(BindingBuffer)的构成为20mM HEPES、100mM NaCl和10mMMgCl₂，pH7.4。

(b)制备过程

在整个制备过程中把所有材料置于冰上。首先，从一个成片的单层细胞抽出基质，用10ml冷PBS漂洗后，再进行抽取。随后，加上5ml刮膜缓冲液刮细胞，接着把细胞提取物转移进50ml离心管中(4℃，20,000rpm，离心17分)。随后，取出上清液，给沉淀物加30ml洗膜缓冲液使沉淀再悬浮，随后在4℃、20,000rpm条件下离心17分。然后，取出上清液，把沉淀物用结合缓冲液再悬浮。使用Brinkmanpolytron^TM均浆器均浆(15-20秒爆发至所有材料均为悬浮状)。该操作参见“Membrane Protein”。

2.Bradford蛋白质测定法

均浆后用Bradford蛋白质测定法(蛋白质可以稀释为1.5mg/ml，等分，冷冻(-80℃)备用，冷冻后，操作如下：在测定当天，把冷冻的膜蛋白在室温下缓慢解冻，旋涡后，用polytron在12×1000rpm约5-20秒进行均浆。注意，多次制备应当把均浆器在不同制备均浆间完全清洁)。

(a)材料

根据生产者的指导说明(Biorad，cat.no.500-0006)，使用结合缓冲液(见上所述)、Bradford Dye Reagent(重染剂)、Bradford ProteinStandard(蛋白质标定)。

(b)操作程序

准备双份试管，一试管具有膜，另一试管作为对照“空白”。每个试管中装有800μl结合缓冲液。之后，在每个试管中加入10μlBradford Protein Standard(1mg/ml)，再在试管中加入10μl膜(空白中不加)。然后，每个试管中加入200μl Bradford Dye Reagent，再把每个试管涡旋。5分钟后，对试管再涡旋，把材料转移到样品槽中。然后，用CECIL3041分光光度计在波长595下对各槽读数。

3.直接鉴定测定法

(a)材料

GDP缓冲液由37.5ml结合缓冲液和2mgGDP(Sigma，cat.no.G-7127)组成，用结合缓冲液进行系列稀释得到0.2μM GDP(每孔中GDP的最终浓度为0.1μM GDP)，每孔中有一种候选化合物，最终的200μl是由100μlGDP缓冲液(最终浓度为0.1μM GDP)、50μl含有膜蛋白的结合缓冲液和50μl含有[³⁵S]GTPγS(0.6μM)的结合缓冲液(每10ml结合缓冲液有2.5μl[³⁵S]GTPγS)。

(b)操作程序

把候选化合物(Tripos，Inc.ST.Louis，MO)放入96孔平板(可以在-80℃冷冻过)。基本把膜蛋白(或除去了融合蛋白的带有表达载体的膜，如对照)均浆至为悬浮状。然后，用Bradford蛋白质测定法如上所述测定蛋白质浓度。再把膜蛋白(和对照)用结合缓冲液(最后测定浓度为12.5μg/孔)稀释至0.25mg/ml。随后，给Wallac Scintistrip^TM(Wallac)的每个孔中加入100μlGDP缓冲液。然后用5μl注射器把5μl候选化合物转移进孔中(即5μl在200μl总测定量中的比例为1∶40，这样候选化合物最终筛选浓度为10μM)。再次强调，为了避免污染，在每步转移后都要把注射器用三种冲洗液冲洗，这三种冲洗液为：水(1×)、乙醇(1×)和水(1×)至更多次，每次冲洗后用试验纸或Kimsipes纸巾擦干。然后，再给每孔加5μl膜蛋白(也可以使用没有GPCR融合蛋白的膜作为对照)，在室温下预温5-10分钟(用箔片衬托盖住平板，其中从Trrpos获得的候选化合物是光敏型的)。随后，每孔中加入50ul含有[³⁵S]GTPγS(0.6μM)的结合缓冲液，接着在室温下振荡器上摇合温育60分钟(再次强调，在这个实施例中是用箔片衬托盖住平板)。然后，在22℃、4000RPM下自旋15分钟停止测定。随后用8道多头管抽吸平板并用平板盖密封平板。随后，在Wallac1450上用“Prot.#37”读取平板的数据。

实验结果列于图17A(GPR3：Gs融合蛋白)和图17B(GPR6：Gs融合蛋白)中，其中，每个标号表示含有一种不同候选化合物的孔，标准差用反应百分率表示，是根据每板在虚线和垂直线的平均结果得出的。图17A孔标号C4的注解为：本化合物是直接鉴定作为GPR3受体的逆向激动剂的。图17B孔标号G7和H9的注解为：这些化合物是分别直接鉴定作为GPR6受体的逆向激动剂和激动剂的。这两种情况下，受体均为孤独受体。

按照这种直接鉴定，可以确定IC50(逆向激动剂)和EC50(激动剂)的数据，本领域的普通技术人员已经认识到可以选择利用IC50和EC50测定方案。

实施例12

方案：确认试验

如上所述在使用一种独立的测定方法得到直接鉴定的候选化合物后，最好使用定性测定法。在这种情况下，建议确认试验用环化酶基试验法。

按照下列方案，使用已有模式化的Flash PlateTM Adenylyl Cyclase试剂盒(New England Nuclear，Cat.No.SMP004A)，对直接鉴定作内源组成激活受体GPCRs的逆向激动剂和激动剂的候选化合物进行确认。

在转染后大约三天取出受转染的细胞。在缓冲液中把悬浮细胞均浆制备膜，该缓冲液pH7.4并具有20mM HEPES和10μM MgCl₂。使用Brinkman Polyreon^TM在冰上进行均浆约10秒。把产生的上清液在4℃、49,000×g下离心15分钟。把沉淀物用pH7.4并具有20mM HEPES和0.1μM MgCl₂的缓冲液再悬浮，接着，在4℃、49,000×g下离心15分钟。在使用前可以把产生的沉淀物贮存在-80℃中。在直接鉴定筛选的当天，把膜沉淀物在室温下缓慢解冻，用pH7.4并具有20mM HEPES和10μM MgCl₂的缓冲液再悬浮，最终蛋白质浓度为0.60mg/ml(在使用前把再悬浮的膜放在冰上)。

根据生产者的指导说明制备和保存cAMP标定物和测定缓冲液(包括把2μCi示踪剂[¹²⁵I]cAMP100μl加到11ml测定缓冲液中)。新制备筛选用试验缓冲液，其pH7.4并具有20mM HEPES、10μM MgCl₂、20μM磷酸肌酸(Sigma)、0.1单位/ml肌酸磷酸激酶(Sigma)、50μMGTP(Sigma)和0.2μM ATP(Sigma)，使用前可以把试验缓冲液存放在冰上。

具有把如上所述的被鉴定的候选化合物(如果是冷冻的要在室温下缓慢解冻)加在平板孔中(3μl/孔)，同时加入40μl膜蛋白(30μg/孔)和50μl试验缓冲液。然后把该混合液在室温下均匀摇荡温育30分钟。

之后，每孔加入100μl测定缓冲液，温育2-24小时。然后，把平板放进Wallac MicroBeta^TM平板读数器，采用“Prot.：#31”(按生产者的指导说明)读数。

虽然各种表达载体是现有技术中使用的，但最好使用载体pCMV。按照国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约的规定，把这种载体于1998年10月13日保存在美国典型培养物收集中心(American Type Culture Collection)(ATCC)(10801 UniversityBlvd.，Manassas，VA20110-2209 USA)。该载体经ATCC试验是具有活性的。ATCC给定的保存号为pCMV：ATCC#203351。图18给出了pCMV(包括限制性位点)的图谱。

特此指出，本发明是参考本专利文件中提到的各项专利、申请和打印出版物全部内容得出的。对于本领域的普通技术人员来说，不脱离本发明的精神可以对本发明的最佳实施例进行区别、各种变化及修饰。所有这类变化都在本发明请求保护的范围内。

序列表

(1)一般信息：

(i)申请人：比汉，多米尼克P.(Behan，Dominic P.)

查默斯，德里克T.(Chalmers，Derek T.)

廖王蓁(Liaw，chen)

林伊玲(Lin，I-Lin)

洛斯，凯文P.(Lowitz，Kevin P.)

陈若平(Chen，Ruoping)

(ii)发明名称：内源组成激活G蛋白偶联孤独受体

(iii)序列数：45

(iv)联系地址：

(A)联系人：

(B)街道：

(C)城市：

(D)州：

(E)国家：

(F)邮政编码：

(v)计算机可读形式：

(A)媒介类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.30

(vi)当前申请数据：

(A)申请号：US

(B)申请日：

(C)分类号：

(Viii)律师/代理人信息：

(A)姓名：米歇尔P.斯特拉尔(Michael P.Straher)

(B)注册号：38,325

(ix)电信信息：

(A)电话：

(B)传真：

(2)SEQ ID NO：1信息：

(i)序列特征：

(A)长度：26个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

GGAGGATCCATGGCCTGGTTCTCAGC

(3)SEQ ID NO：2信息：

(i)序列特征：

(A)长度：29个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

CACAAGCTTAGRCCRTCCMGRCARTTCCA

(4)SEQ ID NO：3信息：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

GGAGAAGCTTCTGGCGGCGATGAACGCTAG

(5)SEQ ID NO：4信息：

(i)序列特征：

(A)长度：28个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

ACAGGATCCAGGTGGCTGCTAGCAAGAG

(6)SEQ ID NO：5信息：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

CTTAAGCTTAAAATGAACGAAGACCCGAAG

(7)SEQ ID NO：6信息：

(i)序列特征：

(A)长度：27个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

GGAGGATCCCCAGAGCATCACTAGCAT

(8)SEQ ID NO：7信息：

(i)序列特征：

(A)长度：530个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

GGAGGATCCA TGGCCTGGTT CTCAGCCGGC TCAGGCAGTG TGAATGTGAG CATAGACCCA 60

GCAGAGGAAC CTACAGGCCC AGCTACACTG CTGCCCTCTC CCAGGGCCTG GGATGTGGTG 120

CTGTGCATCT CAGGCACCCT GGTGTCCTGC GAGAATGCTC TGGTGATGGC CATCATTGTG 180

GGCACGCCTG CCTTCCGCGC CCCCATGTTC CTGCTGGTGG GCAGCTTGGC CGTAGCAGAC 240

CTGCTGGCAG GCCTGGGCCT GGTCCTGCAC TTCGCTGCTG ACTTCTGTAT TGGCTCACCA 300

GAGATGAGCT TGGTGCTGGT TGGCGTGCTA GCAACGGCCT TTACTGCCAG CATCGGCAGC 360

CTGCTGGCCA TCACCGTTGA CCGCTACCTT TCCCTGTACA ACGCCCTCAC CTACTACTCA 420

GAGACAACAG TAACTCGAAC CTACGTGATG CTGGCCTTGG TGTGGGTGGG TGCCCTGGGC 480

CTGGGGCTGG TTCCCGTGCT GGCCTGGAAC TGCCGGGACG GTCTAAGCTT 530

(9)SEQ ID NO：8信息：

(i)序列特征：

(A)长度：601个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

AAGCTTCTGG CGGCGATGAA CGCTAGCGCC GCCGCGCTCA ACGAGTCCCA GGTGGTGGCA 60

GTAGCGGCCG AGGGAGCGGC AGCTGCGGCT ACAGCAGCAG GGACACCGGA CACCAGCGAA 120

TGGGGACCTC CGGCAGCATC CGCGGCGCTG GGAGGCGGCG GAGGACCTAA CGGGTCACTG 180

GAGCTGTCTT CGCAGCTGCC CGCAGGACCC TCAGGACTTC TGCTTTCGGC AGTGAATCCC 240

TGGGATGTGC TGCTGTGCGT GTCGGGGACT GTGATCGCAG GCGAAAATGC GCTGGTGGTG 300

GCGCTCATCG CATCCACTCC CGCGCTGCGC ACGCCCATGT TTGTGCTCGT GGGTAGTCTG 360

GCCACTGCTG ACCTGCTGGC GGGCTGTGGC CTCATCCTAC ACTTCGTGTT CCAGTACGTG 420

GTGCCCTCGG AGACTGTGAG CCTGCTCATG GTGGGCTTCC TGGTGGCGTC CTTCGCCGCC 480

TCAGTCAGCA GCCTGCTCGC TATCACAGTG GACCGTTACC TGTCCCTTTA CAACGCGCTC 540

ACCTACTACT CGCGCCGGAC CCTGTTGGGC GTGCACCTCT TGCTAGCAGC CACCTGGATC 600

C 601

(10)SEQ ID NO：9信息：

(i)序列特征：

(A)长度：510个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：

AAGCTTAAAA TGAACGAAGA CCCGAAGGTC AATTTAAGCG GGCTGCCTCG GGACTGTATA 60

GAAGCTGGTA CTCCGGAGAA CATCTCAGCC GCTGTCCCCT CCCAGGGCTC TGTTGTGGAG 120

TCAGAACCCG AGCTCGTTGT CAACCCCTGG GACATTGTCT TGTGCAGCTC AGGAACCCTC 180

ATCTGCTGTG AAAATGCCGT CGTGGTCCTT ATCATCTTCC ACAGCCCCAG CCTGCGAGCA 240

CCCATGTTCC TGCTGATAGG CAGCCTGGCT CTTGCAGACC TGCTGGCTGG TCTGGGACTC 300

ATCATCAATT TTGTTTTTGC CTACCTGCTT CAGTCAGAAG CCACCAAGCT GGTACAATT 360

GGACTCATTG TCGCCTCTTT CTCTGCCTCT GTCTGCAGTT TGCTGGCTAT CACTGTGGAC 420

CGCTACCTCT CGCTGTATTA CGCCCTGACG TACCACTCCG AGAGGACCGT CACCTTTACC 480

(11)SEQ ID NO：10信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：

CTTAAGCTTGTGGCATTTGGTACT

(12)SEQ ID NO：11信息：

(i)序列特征：

(A)长度：28个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：

TCTGGATCCTTGGCCAGGCAGTGGAAGT

(13)SEQ ID NO：12信息：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：

GAGAATTCAC TCCTGAGCTC AAGATGAACT

(14)SEQ ID NO：13信息：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：

CGGGATCCCC GTAACTGAGC CACTTCAGAT

(15)SEQ ID NO：14信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1050个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：

ATGAACTCCA CCTTGGATGG TAATCAGAGC AGCCACCCTT TTTGCCTCTT GGCATTTGGC 60

TATTTGGAAA CTGTCAATTT TTGCCTTTTG GAAGTATTGA TTATTGTCTT TCTAACTGTA 120

TTGATTATTT CTGGCAACAT CATTGTGATT TTTGTATTTC ACTGTGCACC TTTGTTGAAC 180

CATCACACTA CAAGTTATTT TATCCAGACT ATGGCATATG CTGACCTTTT TGTTGGGGTG 240

AGCTGCGTGG TCCCTTCTTT ATCACTCCTC CATCACCCCC TTCCAGTAGA GGAGTCCTTG 300

ACTTGCCAGA TATTTGGTTT TGTAGTATCA GTTCTGAAGA GCGTCTCCAT GGCTTCTCTG 360

GCCTGTATCA GCATTGATAG ATACATTGCC ATTACTAAAC CTTTAACCTA TAATACTCTG 420

GTTACACCCT GGAGACTACG CCTGTGTATT TTCCTGATTT GGCTATACTC GACCCTGGTC 480

TTCCTGCCTT CCTTTTTCCA CTGGGGCAAA CCTGGATATC ATGGAGATGT GTTTCAGTGG 540

TGTGCGGAGT CCTGGCACAC CGACTCCTAC TTCACCCTGT TCATCGTGAT GATGTTATAT 600

GCCCCAGCAG CCCTTATTGT CTGCTTCACC TATTTCAACA TCTTCCGCAT CTGCCAACAG 660

CACACAAAGG ATATCAGCGA AAGGCAAGCC CGCTTCAGCA GCCAGAGTGG GGAGACTGGG 720

GAAGTGCAGG CCTGTCCTGA TAAGCGCTAT GCCATGGTCC TGTTTCGAAT CACTAGTGTA 780

TTTTACATCC TCTGGTTGCC ATATATCATC TACTTCTTGT TGGAAAGCTC CACTGGCCAC 840

AGCAACCGCT TCGCATCCTT CTTGACCACC TGGCTTGCTA TTAGTAACAG TTTCTGCAAC 900

TGTGTAATTT ATAGTCTCTC CAACAGTGTA TTCCAAAGAG GACTAAAGCG CCTCTCAGGG 960

GCTATGTGTA CTTCTTGTGC AAGTCAGACT ACAGCCAACG ACCCTTACAC AGTTAGAAGC 1020

AAAGGCCCTC TTAATGGATG TCATATCTGA 1050

(16)SEQ ID NO：15信息：

(i)序列特征：

(A)长度：349个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：无关

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：

Met Asn Ser Thr Leu Asp Gly Asn Gln Ser Ser His Pro Phe Cys Leu

1 5 10 15

Leu Ala Phe Gly Tyr Leu Glu Thr Val Asn Phe Cys Leu Leu Glu Val

20 25 30

Leu Ile Ile Val Phe Leu Thr Val Leu Ile Ile Ser Gly Asn Ile Ile

35 40 45

Val Ile Phe Val Phe His Cys Ala Pro Leu Leu Asn His His Thr Thr

50 55 60

Ser Tyr Phe Ile Gln Thr Met Ala Tyr Ala Asp Leu Phe Val Gly Val

65 70 75 80

Ser Cys Val Val Pro Ser Leu ser Leu Leu His His Pro Leu Pro Val

85 90 95

Glu Glu Ser Leu Thr Cys Gln Ile Phe Gly phe Val Val Ser Val Leu

100 105 110

Lys Ser Val Ser Met Ala Ser Leu Ala Cys Ile Ser Ile Asp Arg Tyr

115 120 125

Ile Ala Ile Thr Lys Pro Leu Thr Tyr Asn Thr Leu Val Thr Pro Trp

130 135 140

Arg Leu Arg Leu Cys Ile Phe Leu Ile Trp Leu Tyr Ser Thr Leu Val

145 150 155 160

Phe Leu Pro Ser Phe Phe His Trp Gly Lys Pro Gly Tyr His Gly Asp

165 170 175

Val Phe Gln Trp Cys Ala Glu Ser Trp His Thr Asp Ser Tyr Phe Thr

180 185 190

Leu Phe Ile Val Met Met Leu Tyr Ala Pro Ala Ala Leu Ile Val Cys

195 200 205

Phe Thr Tyr Phe Asn Ile Phe Arg Ile Cys Gln Gln His Thr Lys Asp

210 215 220

Ile Ser Glu Arg Gln Ala Arg Phe Ser Ser Gln Ser Gly Glu Thr Gly

225 230 235 240

Glu Val Gln Ala Cys Pro Asp Lys Arg Tyr Ala Met Val Leu Phe Arg

245 250 255

Ile Thr Ser Val Phe Tyr Ile Leu Trp Leu Pro Tyr Ile Ile Tyr Phe

260 265 270

Leu Leu Glu Ser Ser Thr Gly His Ser Asn Arg Phe Ala Ser Phe Leu

275 280 285

Thr Thr Trp Leu Ala Ile Ser Asn Ser Phe Cys Asn Cys Val Ile Tyr

290 295 300

Ser Leu Ser Asn Ser Val Phe Gln Arg Gly Leu Lys Arg Leu Ser Gly

305 310 315 320

Ala Met Cys Thr Ser Cys Ala Ser Gln Thr Thr Ala Asn Asp Pro Tyr

Thr Val Arg Ser Lys Gly Pro Leu Asn Gly Cys His Ile

340 345

(17)SEQ ID NO：16信息：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：

AGGAAGCTTT AAATTTCCAA GCCATGAATG

(18)SEQ ID NO：17信息：

(i)序列特征：

(A)长度：31个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：

ACCGAATTCA GATTACATTT GATTTACTAT G

(19)SEQ ID NO：18信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1086个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：

ATGAATGAAT CCAGGTGGAC TGAATGGAGG ATCCTGAACA TGAGCAGTGG CATTGTGAAT 60

GTGTCCGAGC GTCACTCCTG CCCACTTGGA TTTGGCCACT ACAGTGTGGT GGATGTCTGC 120

ATCTTCGAGA CAGTGGTTAT TGTGTTGCTG ACATTTCTGA TCATTGCTGG GAATCTAACA 180

GTTATCTTTG TCTTTCATTG TGCTCCACTG TTACATCATT ATACTACCAG CTATTTCATT 240

CAGACGATGG CATATGCTGA TCTTTTCGTT GGAGTTAGCT GCTTGGTTCC TACTCTGTCA 300

CTTCTCCACT ACTCCACAGG TGTCCACGAG TCATTGACTT GCCAGGTTTT TGGATATATC 360

ATCTCAGTTC TAAAAAGTGT TTCTATGGCA TGTCTTGCTT GCATCAGTGT GGATCGTTAT 420

CTTGCAATAA CCAAGCCTCT TTCCTACAAT CAACTGGTCA CCCCTTGTCG CTTGAGAATT 480

TGCATTATTT TGATCTGGAT CTACTCCTGC CTAATTTTCT TGCCTTCCTT TTTTGGCTGG 540

GGGAAACCTG GTTACCATGG TGACATTTTT GAATGGTGTG CCACGTCTTG GCTCACCAGT 600

GCCTATTTTA CTGGCTTTAT TGTTTGTTTA CTTTATGCTC CTGCTGCCTT TGTTGTCTGC 660

TTCACTTACT TCCACATTTT CAAAATTTGC CGTCAGCACA CCAAAGAGAT AAATGACCGA 720

AGAGCCCGAT TCCCTAGTCA TGAGGTAGAT TCTTCCAGAG AGACTGGACA CAGCCCTGAC 790

CGTCGCTACG CCATGGTTTT GTTTAGGATA ACCAGTGTAT TTTATATGCT GTGGCTCCCC 840

TATATAATTT ACTTTCTTCT AGAAAGCTCC CGGGTCTTGG ACAATCCAAC TCTGTCCTTC 900

TTAACAACCT GGCTTGCAAT AAGTAATAGT TTTTGTAACT GTGTAATATA CAGCCTCTCC 960

AACAGCGTTT TCCGGCTAGG CCTCCGAAGA CTGTCTGAGA CAATGTGCAC ATCCTGTATG 1020

TGTGTGAAGG ATCAGGAAGC ACAAGAACCC AAACCTAGGA AACGGGCTAA TTCTTGCTCC 1080

ATTTGA 1086

(20)SEQ ID NO：19信息：

(i)序列特征：

(A)长度：361个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：无关

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：19：

Met Asn Glu Ser Arg Trp Thr Glu Trp Arg Ile Leu Asn Met Ser Ser

1 5 10 15

Gly Ile Val Asn Val Ser Glu Arg His Ser Cys Pro Leu Gly Phe Gly

20 25 30

His Tyr Ser Val Val Asp Val Cys Ile Phe Glu Thr Val Val Ile Val

35 40 45

Leu Leu Thr Phe Leu Ile Ile Ala Gly Asn Leu Thr Val Ile Phe Val

50 55 60

Phe His Cys Ala Pro Leu Leu His His Tyr Thr Thr Ser Tyr Phe Ile

65 70 75 80

Gln Thr Met Ala Tyr Ala Asp Leu Phe Val Gly Val Ser Cys Leu Val

85 90 95

Pro Thr Leu Ser Leu Leu His Tyr Ser Thr Gly Val His Glu Ser Leu

100 105 110

Thr Cys Gln Val Phe Gly Tyr Ile Ile Ser Val Leu Lys Ser Val Ser

115 120 125

Met Ala Cys Leu Ala Cys Ile Ser Val Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Thr

130 135 140

Lys Pro Leu Ser Tyr Asn Gln Leu Val Thr Pro Cys Arg Leu Arg Ile

145 150 155 160

Cys Ile Ile Leu Ile Trp Ile Tyr Ser Cys Leu Ile Phe Leu Pro Ser

165 170 175

Phe Phe Gly Trp Gly Lys Pro Gly Tyr His Gly Asp Ile Phe Glu Trp

180 185 190

Cys Ala Thr Ser Trp Leu Thr Ser Ala Tyr Phe Thr Gly Phe Ile Val

195 200 205

Cys Leu Leu Tyr Ala Pro Ala Ala Phe Val Val Cys Phe Thr Tyr Phe

210 215 220

His Ile Phe Lys Ile Cys Arg Gln His Thr Lys Glu Ile Asn Asp Arg

225 230 235 240

Arg Ala Arg Phe Pro Ser His Glu Val Asp Ser Ser Arg Glu Thr Gly

245 250 255

His Ser Pro Asp Arg Arg Tyr Ala Met Val Leu Phe Arg Ile Thr Ser

260 265 270

Val Phe Tyr Met Leu Trp Leu Pro Tyr Ile Ile Tyr Phe Leu Leu Glu

275 280 285

Ser Ser Arg Val Leu Asp Asn Pro Thr Leu Ser Phe Leu Thr Thr Trp

290 295 300

Leu Ala Ile Ser Asn Ser Phe Cys Asn Cys Val Ile Tyr Ser Leu Ser

305 310 315 320

Asn Ser Val Phe Arg Leu Gly Leu Arg Arg Leu Ser Glu Thr Met Cys

325 330 335

Thr Ser Cys Met Cys Val Lys Asp Gln Glu Ala Gln Glu Pro Lys Pro

340 345 350

Arg Lys Arg Ala Asn Ser Cys Ser Ile

355 360

(21)SEQ ID NO：20信息：

(i)序列特征：

(A)长度：32个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：20：

AGCGAATTCT GCCCACCCCA CGCCGAGGTG CT

(22)SEQ ID NO：21信息：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：21:

TGCGGATCCG CCAGCTCTTG AGCCTGCACA

(23)SEQ ID NO：22信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1381个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：22：

GGCCTTATCT TTCCAGTCGT CCAGCATGCT CTGCCCACCC CACGCCGAGG TGCACTGACC 60

ATGAGCCTCA ACTCCTCCCT CAGCTGCAGG AAGGAGCTGA GTAATCTCAC TGAGGAGGAG 120

GGTGGCGAAG GGGGCGTCAT CATCACCCAG TTCATCGCCA TCATTGTCAT CACCATTTTT 180

GTCTGCCTGG GAAACCTGGT CATCGTGGTC ACCTTGTACA AGAAGTCCTA CCTCCTCACC 240

CTCAGCAACA AGTTCGTCTT CAGCCTGACT CTGTCCAACT TCCTGCTGTC CGTGTTGGTG 300

CTGCCTTTTG TGGTGACGAG CTCCATCCGC AGGGAATGGA TCTTTGGTGT AGTGTGGTGC 360

AACTTCTCTG CCCTCCTCTA CCTGCTGATC AGCTCTGCCA GCATGCTAAC CCTCGGGGTC 420

ATTGCCATCG ACCGCTACTA TGCTGTCCTG TACCCCATGG TGTACCCCAT GAAGATCACA 480

GGGAACCGGG CTGTGATGGC ACTTGTCTAC ATCTGGCTTC ACTCGCTCAT CGGCTGCCTG 540

CCACCCCTGT TTGGTTGGTC ATCCGTGGAG TTTGACGAGT TCAAATGGAT GTGTGTGGCT 600

GCTTGGCACC GGGAGCCTGG CTACACGGCC TTCTGGCAGA TCTGGTGTGC CCTCTTCCCC 660

TTTCTGGTCA TGCTGGTGTG CTATGGCTTC ATCTTCCGCG TGGCCAGGGT CAAGGCACGC 720

AAGGTGCACT GTGGCACAGT CGTCATCGTG GAGGAGGATG CTCAGAGGAC CGGGAGGAAG 780

AACTCCAGCA CCTCCACCTC CTCTTCAGGC AGCAGGAGGA ATGCCTTTCA GGGTGTGGTC 840

TACTCGGCCA ACCAGTGCAA AGCCCTCATC ACCATCCTGG TGGTCCTCGG TGCCTTCATG 900

GTCACCTGGG GCCCCTACAT GGTTGTCATC GCCTCTGAGG CCCTCTGGGG GAAAAGCTCC 960

GTCTCCCCGA GCCTGGAGAC TTGGGCCACA TGGCTGTCCT TTGCCAGCGC TGTCTGCCAC 1020

CCCCTGATCT ATGGACTCTG GAACAAGACA GTTCGCAAAG AACTACTGGG CATGTGCTTT 1080

GGGGACCGGT ATTATCGGGA ACCATTTGTG CAACGACAGA GGACTTCCAG GCTCTTCAGC 1140

ATTTCCAACA GGATCACAGA CCTGGGCCTG TCCCCACACC TCACTGCGCT CATGGCAGGT 1200

GGACAGCCCC TGGGGCACAG CAGCAGCACG GGGGACACTG GCTTCAGCTG CTCCCAGGAC 1260

TCAGGTAACC TGCGTGCTTT ATAAGCCTCT CACCTGTCGC GTTTTCCCTG TGTTGCGTTT 1320

CCCCCGTGTC GCGTTTCCCC TGTGCAGGCT CAAGAGCTGG CGGAGGGGCA TTTCCCACGG 1380

TG 1382

(24)SEQ ID NO：23信息：

(i)序列特征：

(A)长度：407个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：无关

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：23：

MSLNSSLSCR KELSNLTEEE GGEGGVIITQ FIAIIVITIF VCLGNLVIVV

TLYKKSYLLT LSNKFVFSLT LSNFLLSVLV LPFVVTSSIR REWIFGVVWC

NFSALLYLLI SSASMLTLGV IAIDRYYAVL YPMVYPMKIT GNRAVMALVY

IWLHSLIGCL PPLFGWSSVE FDEFKWMCVA AWHREPGYTA FWQIWCALFP

FLVMLVCYGF IFRVARVKAR KVHCGTVVIV EEDAQRTGRK NSSTSTSSSG

SRRNAFQGVV YSANQCKALI TILVVLGAFM VTWGPYMVVI ASEALWGKSS

VSPSLETWAT WLSFASAVCH PLIYGLWNKT VRKELLGMCF GDRYYREPFV

QRQRTSRLFS ISNRITDLGL SPHLTALMAG GQPLGHSSST GDTGFSCSQD

SGNLRAL

(25)SEQ ID NO：24信息：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：24：

GGAAGCTTCA GGCCCAAAGA TGGGGAACAT

(26)SEQ ID NO：25信息：

(i)序列特征：

(A)长度：30个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：25：

GTGGATCCAC CCGCGGAGGA CCCAGGCTAG

(27)SEQ ID NO：26信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1697个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：26：

ACTCCCAAAG TGCTGGGCTT ACAGGTGTAA GCCATCATGT CCAGCCGTTC AGATATTCTA 60

GTTGAATTGG AGTTGGTGGG CTAGTACACC TTCTAAATTA AATGAGTAAA GGATTTAGAA 120

TGGTGCCTGA CACACAGTAG GTGCTACATT CATGTTAGCT ACTATTATAA ACCTTTCCTG 180

CCTCTGACTT TCAGGGTCTT GCCCACCACC AGCGATGCCC AGCCCTTGGT AGAGCTTGAA 240

CCACCTTCTA TAAACAGGAT GGCGGTGGAG AGACAGGCCC AGTCCCTGAG CCCATGAGGA 300

GTGTGGCCCC TTCAGGCCCA AAGATGGGGA ACATCACTGC AGACAACTCC TCGATGAGCT 360

GTACCATCGA CCATACCATC CACCAGACGC TGGCCCCGGT GGTCTATGTT ACCGTGCTGG 420

TGGTGGGCTT CCCGGCCAAC TGCCTGTCCC TCTACTTCGG CTACCTGCAG ATCAAGGCCC 480

GGAACGAGCT GGGCGTGTAC CTGTGCAACC TGACGGTGGC CGACCTCTTC TACATCTGCT 540

CGCTGCCCTT CTGGCTGCAG TACGTGCTGC AGCACGACAA CTGGTCTCAC GGCGACCTGT 600

CCTGCCAGGT GTGCGGCATC CTCCTGTACG AGAACATCTA CATCAGCGTG GGCTTCCTCT 660

GCTGCATCTC CGTGGACCGC TACCTGGCTG TGGCCCATCC CTTCCGCTTC CACCAGTTCC 720

GGACCCTGAA GGCGGCCGTC GGCGTCAGCG TGGTCATCTG GGCCAAGGAG CTGCTGACCA 780

GCATCTACTT CCTGATGCAC GAGGAGGTCA TCGAGGACGA GAACCAGCAC CGCGTGTGCT 840

TTGAGCACTA CCCCATCCAG GCATGGCAGC GCGCCATCAA CTACTACCGC TTCCTGGTGG 900

GCTTCCTCTT CCCCATCTGC CTGCTGCTGG CGTCCTACCA GGGCATCCTG CGCGCCGTGC 960

GCCGGAGCCA CGGCACCCAG AAGAGCCGCA AGGACCAGAT CCAGCGGCTG GTGCTCAGCA 1020

CCGTGGTCAT CTTCCTGGCC TGCTTCCTGC CCTACCACGT GTTGCTGCTG GTGCGCAGCG 1080

TCTGGGAGGC CAGCTGCGAC TTCGCCAAGG GCGTTTTCAA CGCCTACCAC TTCTCCCTCC 1140

TGCTCACCAG CTTCAACTGC GTCGCCGACC CCGTGCTCTA CTGCTTCGTC AGCGAGACCA 1200

CCCACCGGGA CCTGGCCCGC CTCCGCGGGG CCTGCCTGGC CTTCCTCACC TGCTCCAGGA 1260

CCGGCCGGGC CAGGGAGGCC TACCCGCTGG GTGCCCCCGA GGCCTCCGGG AAAAGCGGGG 1320

CCCAGGGTGA GGAGCCCGAG CTGTTGACCA AGCTCCACCC GGCCTTCCAG ACCCCTAACT 1380

CGCCAGGGTC GGGCGGGTTC CCCACGGGCA GGTTGGCCTA GCCTGGGTCC TCCGCGGGTG 1440

GCTCCACGTG AGGCCTGAGC CTTCAGCCCA CGGGCCTCAG GGCCTGCCGC CTCCTGCTTC 1500

CCTCGCTGCG GAGGCAGGGA AGCCCCTGTA ACTCCGGAAG CCTGCTCTCG CTTGCTGAGC 1560

CCGCTGGGAC CGCCGAGGGT GGGAATAAGC CCCGGTTGGC TCGTGGGAAT AAGCCGTGTC 1620

CTCTGCCGCG GCTGCGATGT GGCCACGCTG GGGCTGCTGG TCGGGGGAAA ACAGTGAACT 1680

GCGTCCCCTG GCCTGCT 1697

(28)SEQ ID NO：27信息：

(i)序列特征：

(A)长度：365个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：无关

(ii)分子类型：蛋白质(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：27：

MGNITADNSS MSCTIDHTIH QTLAPVVYVT VLVVGFPANC LSLYFGYLQI

KARNELGVYL CNLTVADLFY ICSLPFWLQY VLQHDNWSHG DLSCQVCGIL

LYENIYISVG FLCCISVDRY LAVAHPFRFH QFRTLKAAVG VSVVIWAKEL

LTSIYFLMHE EVIEDENQHR VCFEHYPIQA WQRAINYYRF LVGFLFPICL

LLASYQGILR AVRRSHGTQK SRKDQIQRLV LSTVVIFLAC FLPYHVLLLV

RSVWEASCDF AKGVFNAYHF SLLLTSFNCV ADPVLYCFVS ETTHRDLARL

RGACLAFLTC SRTGRAREAY PLGAPEASGK SGAQGEEPEL LTKLHPAFQT

PNSPGSGGFP TGRLA

(29)SEQ ID NO：28信息：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：

CTGGTCCTGC ACTTTGCTGC

(30)SEQ ID NO：29信息：

(i)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：29：

AGCATCACAT AGGTCCGTGT CAC

(31)SEQ ID NO：30信息：

(i)序列特征：

(A)长度：24个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：

ACCAGAAAGG GTGTGGGTAC ACTG

(32)SEQ ID NO：31信息：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：31：

GGAACGAAAG GGCACTTTGG

(33)SEQ ID NO：32信息：

(i)序列特征：

(A)长度：20个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：

GCTGCCTCGG GATTATTTAG

(34)SEQ ID NO：33信息：

(i)序列特征：

(A)长度：23个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：

GCCTATTAGC AGGAACATGGGTG

(35)SEQ ID NO：34信息：

(i)序列特征：

(A)长度：18个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：34：

GCTAGCGTTC ATCGCCGC

(36)SEQ ID NO：35信息：

(i)序列特征：

(A)长度：18个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：35：

CTGGACTGTA TCGCCCCG

(37)SEQ ID NO：36信息：

(i)序列特征：

(A)长度：32个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：36：

GATCTCTAGA ATGATGTGGG GTGCAGGCAG CC

(38)SEQ ID NO：37信息：

(i)序列特征：

(A)长度：35个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：37：

CTAGGGTACC CGGACATCAC TGGGGGAGCG GGATC

(39)SEQ ID NO：38信息：

(i)序列特征：

(A)长度：31个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：38：

GATCTCTAGA ATGCAGGGTG CAAATCCGGC C

(40)SEQ ID NO：39信息：

(i)序列特征：

(A)长度：35个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：39：

CTAGGGTACC CGGACCTCGC TGGGAGACCT GGAAC

(41)SEQ ID NO：40信息：

(i)序列特征：

(A)长度：22个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：40：

ATGTGGAACG CGACGCCCAG CG

(42)SEQ ID NO：41信息：

(i)序列特征：

(A)长度：42个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：41：

TCATGTATTA ATACTAGATT CT

(43)SEQ ID NO：42信息：

(i)序列特征：

(A)长度：38个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：42：

TACCATGTGG AACGCGACGC CCAGCGAAGA GCCGGGGT

(44)SEQ ID NO：43信息：

(i)序列特征：

(A)长度：39个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：43：

CGGAATTCAT GTATTAATAC TAGATTCTGT CCAGGCCCG

(45)SEQ ID NO：44信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1101个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：DNA(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：44：

ATGTGGAACG CGACGCCCAG CGAAGAGCCG GGGTTCAACC TCACACTGGC CGACCTGGAC 60

TGGGATGCTT CCCCCGGCAA CGACTCGCTG GGCGACGAGC TGCTGCAGCT CTTCCCCGCG 120

CCGCTGCTGG CGGGCGTCAC AGCCACCTGC GTGGCACTCT TCGTGGTGGG TATCGCTGGC 180

AACCTGCTCA CCATGCTGGT GGTGTCGCGC TTCCGCGAGC TGCGCACCAC CACCAACCTC 240

TACCTGTCCA GCATGGCCTT CTCCGATCTG CTCATCTTCC TCTGCATGCC CCTGGACCTC 300

GTTCGCCTCT GGCAGTACCG GCCCTGGAAC TTCGGCGACC TCCTCTGCAA ACTCTTCCAA 360

TTCGTCAGTG AGAGCTGCAC CTACGCCACG GTGCTCACCA TCACAGCGCT GAGCGTCGAG 420

CGCTACTTCG CCATCTGCTT CCCACTCCGG GCCAAGGTGG TGGTCACCAA GGGGCGGGTG 480

AAGCTGGTCA TCTTCGTCAT CTGGGCCGTG GCCTTCTGCA GCGCCGGGCC CATCTTCGTG 540

CTAGTCGGGG TGGAGCACGA GAACGGCACC GACCCTTGGG ACACCAACGA GTGCCGCCCC 600

ACCGAGTTTG CGGTGCGCTC TGGACTGCTC ACGGTCATGG TGTGGGTGTC CAGCATCTTC 660

TTCTTCCTTC CTGTCTTCTG TCTCACGGTC CTCTACAGTC TCATCGGCAG GAAGCTGTGG 720

CGGAGGAGGC GCGGCGATGC TGTCGTGGGT GCCTCGCTCA GGGACCAGAA CCACAAGCAA 780

ACCGTGAAAA TGCTGGCTGT AGTGGTGTTT GCCTTCATCC TCTGCTGGCT CCCCTTCCAC 840

GTAGGGCGAT ATTTATTTTC CAAATCCTTT GAGCCTGGCT CCTTGGAGAT TGCTCAGATC 900

AGCCAGTACT GCAACCTCGT GTCCTTTGTC CTCTTCTACC TCAGTGCTGC CATCAACCCC 960

ATTCTGTACA ACATCATGTC CAAGAAGTAC CGGGTGGCAG TGTTCAGACT TCTGGGATTC 1020

GAACCCTTCT CCCAGAGAAA GCTCTCCACT CTGAAAGATG AAAGTTCTCG GGCCTGGACA 1080

GAATCTAGTA TTAATACATG A 1101

(46)SEQ ID NO：45信息：

(i)序列特征：

(A)长度：366个氨基酸

(B)类型：氨基酸酸

(C)链型：

(D)拓扑结构：无关

(ii)分子类型：蛋白质(基因组的)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：45：

MWNATPSEEP GFNLTLADLD WDASPGNDSL GDELLQLFPA PLLAGVTATC VALFVVGIAG

NLLTMLVVSR FRELRTTTNL YLSSMAFSDL LIFLCMPLDL VRLWQYRPWN FGDLLCKLFQ

FVSESCTYAT VLTITALSVE RYFAICFPLR AKVVVTKGRV KLVIFVIWAV AFCSAGPIFV

LVGVEHENGT DPWDTNECRP TEFAVRSGLL TVMVWVSSIF FFLPVFCLTV LYSLIGRKLW

RRRRGDAVVG ASLRDQNHKQ TVKMLAVVVF AFILCWLPFH VGRYLFSKSF EPGSLEIAQI

SQYCNLVSFV LFYLSAAINP ILYNIMSKKY RVAVFRLLGF EPFSQRKLST LKDESSRAWT

ESSINT

附录A

A2-杏仁状核；A3-尾状核；A4-小脑；A5-脑皮层；A6-前额皮层；A7-海马；A8-延髓

B1-枕骨皮层；B2-壳核；B3-黑质；B4-颞皮层；B5-丘脑；B6-亚丘脑核；B7-脊髓

C1-心脏；C2-主动脉；C3-骨骼肌肉；C4-结肠；C5-膀胱，囊；C6-子宫；C7-前列腺；C8-胃，中肠

D1-睾丸；D2-卵巢；D3-胰；D4-脑垂体，垂体脉；D5-肾上腺；D6-甲状脉；D7-唾液脉；D8-乳脉

E1-肾；E2-肝；E3-小肠；E4-脾；E5-胸脉；E6-周围白细胞，周围白血球；E8-淋巴节；E9-骨髓

F1-扁桃体；F2-肺；F3-气管；F4-胎盘

G1-胎脑；G2-胎心；G3-胎肾；G4-胎肝；G5-胎脾；G6-胎胸腺；G7-胎肺

Claims

1.一种对候选化合物进行直接鉴定的方法，该化合物是作为内源组成激活G蛋白偶联孤独受体的逆向激动剂、部分激动剂和激动剂被选择的，包括步骤：

(a)把候选化合物与GPCR融合蛋白接触，所述的GPCR融合蛋白由内源组成激活G蛋白偶联孤独受体和G蛋白构成；

(b)通过测定该化合物对所述被接触受体的作用来确定是否所述的化合物是所述受体的逆向激动剂、部分激动剂或激动剂。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于作为所述孤独受体的逆向激动剂的该化合物是直接被鉴定的。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于作为所述孤独受体的激动剂的该化合物是直接被鉴定的。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于作为所述孤独受体的部分激动剂的该化合物是直接被鉴定的。

5.一种混合物具有一种由权利要求2所述方法鉴定的化合物。

6.一种混合物具有一种由权利要求3所述方法鉴定的化合物。

7.一种混合物具有一种由权利要求4所述方法鉴定的化合物。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的孤独受体选自：GPR3、GPR4、GPR6、GPR12、GPR21、OGR1、GHSR、RE2和ALO22171。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的孤独受体是

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述G蛋白选自Gs、Gi、Gq和Go。

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述G蛋白是Gsα。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述的孤独受体是GPR6。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述化合物是直接被鉴定作为一种逆向激动剂和一种激动剂的被选化合物。

14.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述化合物是一种逆向激动剂。

15.一种混合物具有权利要求11所述的化合物。

16.一种用于模拟G蛋白偶联孤独受体的方法包括把所述受体与用权利要求1所述方法鉴定的一种化合物接触。

17.一种用于模拟G蛋白偶联孤独受体的方法包括把所述受体与用权利要求11所述方法鉴定的一种化合物接触。