[go: up one dir, main page]

CN1229391C - 涉及α6β4整联蛋白的人胃肠上皮肿瘤抗原的抗体 - Google Patents

涉及α6β4整联蛋白的人胃肠上皮肿瘤抗原的抗体 Download PDF

Info

Publication number
CN1229391C
CN1229391C CNB008148864A CN00814886A CN1229391C CN 1229391 C CN1229391 C CN 1229391C CN B008148864 A CNB008148864 A CN B008148864A CN 00814886 A CN00814886 A CN 00814886A CN 1229391 C CN1229391 C CN 1229391C
Authority
CN
China
Prior art keywords
antibody
leu
gly
ser
val
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB008148864A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1384840A (zh
Inventor
T·N·布罗丁
P·J·卡尔斯特罗姆
L·G·奥尔森
M·J·特德森
P·P·奇尔尼
B·H·K·尼尔森
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Active Biotech AB
Original Assignee
Active Biotech AB
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Active Biotech AB filed Critical Active Biotech AB
Publication of CN1384840A publication Critical patent/CN1384840A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1229391C publication Critical patent/CN1229391C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3046—Stomach, Intestines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2839—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the integrin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • G01N33/5753—
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/582—Recycling of unreacted starting or intermediate materials

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

描述了具有靶结构的结合结构的抗体、衍生物或其片段。抗体展示于人胃肠上皮肿瘤细胞中和细胞表面上以及正常人胃肠上皮细胞亚群中。所述结合结构含有轻链中SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第23-33(CDR1)、49-55(CDR2)、88-98(CDR3)位氨基酸的互补决定区(CDR)序列，和重链中基本地包含SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列第158-162(CDR1)、177-193(CDR2)和226-238(CDR3)位氨基酸的CDR序列，或者有相似独特结合特性的其它结合结构。本发明还描述了展示于肿瘤细胞中或表面上的靶结构、疫苗组合物、药物组合物以及与人恶性疾病相关的方法。

Description

涉及α6β4整联蛋白的人胃肠上皮肿瘤抗原的抗体
本发明涉及具有在人胃肠上皮肿瘤细胞中和细胞表面上以及正常人胃肠上皮细胞亚群中展示的靶结构的结合结构的抗体、或其衍生物或片段；并且涉及展示在肿瘤细胞中或表面上的靶结构、疫苗组合物、药物组合物以及与人恶性疾病相关的方法。
发明背景
外科手术是结肠癌的主要治疗方案，根据Dukes Stage A到C的肿瘤进程状态，导致五年存活率为90％到40％。包括放疗和化疗的传统的辅助治疗已经能够进一步降低死亡率大约30％(1)。尽管有这些进步，结肠癌和直肠癌仍是人类癌症死亡的主要原因之一。已经广泛尝试了免疫治疗。然而，结肠癌通常对免疫治疗有抗性并且被认为是低免疫原性的。结肠癌病人对白细胞介素-2治疗和过继转移体外培养的肿瘤浸润淋巴细胞没有反应，而这些对免疫原性恶性疾病如黑素瘤患者有效。然而，最振奋的是，Riethmuller等报道：Dukes Stage C结肠癌经原发癌切除后用针对肿瘤和正常上皮相关抗原(Ep-CAM)的裸鼠单克隆抗体(mAb)治疗，七年死亡率下降了32％(2)，表明其它免疫治疗模式也会有效。
辅助免疫治疗及更高阶段癌症的治疗的显著改进需要提供比裸mAb更有效力的效应机制。原则上，需要提高导向抗体的肿瘤选择性来提高效力。
使用从人肿瘤异种免疫得到的杂交瘤产生的鼠mAbs已经发现了目前所定义的有限数目的结肠癌相关抗原(3)。
使用大的噬菌体展示文库来鉴定新的肿瘤相关抗原预期能显著加快发现对肿瘤免疫治疗和诊断有用的靶分子的进程。可以通过在培养的肿瘤细胞和组织块上选择和筛选抗体噬菌体文库来这样鉴定靶分子以产生定义体内外表达抗原的特异试剂(4)。噬菌体展示技术已经成为产生针对各种纯化抗原的单克隆抗体试剂的有效工具，并且在几项研究中已经描述了从免疫的、原初的和合成的抗体噬菌体文库来的构建和成功的筛选结果(5)。
考虑到其普遍应用，非免疫文库是有利的，使得针对每一个单一靶标的独特文库是不必要的。在另一方面，足够大的和高质量的非免疫文库难于构建，并且，使用这些文库发现靶子的过程在基于复合抗原时需要有效的消减筛选法。
现在已经用复合人抗原免疫的近人灵长类构建了更适度容量的噬菌体文库。这代表了利用体内预选择库的方案。对异种抗原反应背景降低时应该富集对肿瘤特异性表位有特异性的该种文库(6)。进一步，与鼠相比，与人抗体有接近的序列同源性的灵长类抗体在人中应无免疫原性(7)。
现在已经鉴定了噬菌体文库来的限定选择性表达的结肠癌相关抗原的新的灵长类抗体。治疗潜力(由T细胞介导的对包被了两种与工程化超抗原融合的该抗体的培养结肠癌细胞的杀伤所证明)和与结肠癌相关抗原例如EP-CAM特异的鼠Fab片段融合的超抗原是相当的，该超抗原先前在实验系统中确定了其治疗能力。
本发明还提供了噬菌体抗体的有效的正向和消减细胞筛选法，其应能够促进将来用从大噬菌体文库来的抗体鉴定包括肿瘤相关抗原在内的新的表型特异性抗原。
发明概述
本发明第一方面涉及具有在人胃肠上皮肿瘤细胞中和人胃肠上皮肿瘤细胞细胞表面上及正常人胃肠上皮细胞亚群中展示的靶结构的结合结构的抗体、或其衍生物或片段，所述结合结构含有轻链中基本地包含SEQID NO：2所示氨基酸序列的第23-33(CDR1)、49-55(CDR2)、88-98(CDR3)位氨基酸的互补决定区(CDR)序列，和重链中基本地包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的第158-162(CDR1)、177-193(CDR2)和226-238(CDR3)位氨基酸的CDR序列，或者所述结合结构可以是有相似独特结合特性的其它结合结构。
在一个实施方案中，抗体是噬菌体选择的。在另一个实施方案中，所述序列起源于Macaca fascicularis。本发明的另一个实施方案是所述抗体的衍生物，该衍生物起源于人。优选地，该序列与人来源的相应序列有至少84％的同一性。优选地，抗体在人中是低免疫原性的或无免疫原性。
在另一个实施方案中，通过在基因上连接到其它多肽、和/或通过化学偶联到有机或无机化学分子和/或通过二聚化、寡聚化或多聚化来衍生该抗体。
在另一个实施方案中，所述抗体在基因上连接或化学偶联到细胞毒性多肽或细胞毒性有机或无机化学分子。
在另一个实施方案中，所述抗体在基因上连接或化学偶联到生物学活性分子。
在另一个实施方案中，所述抗体在基因上连接或化学偶联到免疫活化分子。
在另一个实施方案中，已改变所述抗体以提高或降低其抗体亲抗原性(avidity)和/或其亲和力(affinity)。
在另一个实施方案中，已改变所述抗体以提高其产率。
在另一个实施方案中，已改变所述抗体以影响其药代动力学特性。
在另一个实施方案中，已改变所述抗体以赋予其新的药代动力学特性。
在另一个实施方案中，所述抗体被标记，并且其结合被未标记形式的所述抗体抑制而不被其它结合结构抑制，而且不抑制有其它特异性的其它结合结构的结合。
另一个实施方案是抗体，其结合结构识别非还原形式的α6β4整联蛋白。
在另一方面，本发明涉及展示于肿瘤细胞中或表面上的靶结构，所述靶结构
a)能被权利要求1-14之中任意一项所限定的抗体的结合结构、和有相似结合特异性的其它结合结构特异地阻断并能特异地阻断它们，
b)展示于人胃肠上皮细胞中和表面上，
c)与α6和/或β4整联蛋白链或其变异体基本同源，代表共有的或独特的表位，
d)在肿瘤细胞表面上高表达，并且
e)是细胞毒性效应机制的靶子。
上文中“基本同源”意为与靶结构中与抗体结合有关的那些部分的同源性。
在所述靶结构的一个实施方案中，结合结构被标记并且其结合被所述结合结构的未标记形式抑制而不被其它结合结构所抑制，并且不抑制有其它结合特异性的其它结合结构的结合。
在所述靶结构的另一个实施方案中，所述结合结构含有基本地包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第23-33、49-55、88-98、158-162、177-193和226-238位氨基酸的一个或更多个互补决定区(CDR)序列，或是有相似独特结合特性的其它结合结构。
在所述靶结构另一实施方案中所述结合结构是抗体，该抗体在另一实施方案中含有基本地包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第1-109位氨基酸的轻链可变区，和基本地包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第128-249位氨基酸的重链可变区。
在另一实施方案中，所述靶结构在人结肠上皮细胞中均一地表达，在胰腺管和胆管细胞中表达较低。
在另一实施方案中，所述靶结构的表达与胃肠上皮分化相关联。
在另一实施方案中，所述靶结构包含α6β4整联蛋白的氨基酸序列，其中α6部分如SEQ ID NO：3所示并且β4部分如SEQ ID NO：4所示。靶结构的另一个实施方案包含所述α6β4整联蛋白和/或其所述一个或更多片段和/或变异体和/或亚单位的同型的或异型的单体或同型或异型的多聚体。优选地，所述靶结构非还原形式的表观分子量为90-140kDa，最优选80-160kDa。
在另一实施方案中，靶结构含有基本地包含SEQ ID Nos：5-51所示氨基酸序列之任意一个的肽或多肽，或者含有与所述多肽复合的分子。
对包含来自α6β4整联蛋白的氨基酸序列的靶结构，所述靶结构在另一实施方案中可在其非还原形式下被上述抗体包含的结合结构唯一或不唯一地识别。
在另一方面本发明涉及结合以上定义的靶结构的物质，该物质是有机化学分子或肽。在一个实施方案中，所述物质是所述靶结构的抗独特型。所述抗独特型可被对所述靶结构有相似结合特异性的结合结构特异地阻断并特异地阻断之。
在另一方面本发明涉及阻断以上定义靶结构的功能的物质，该物质是有机分子或肽。
在另一方面，本发明涉及识别以上定义靶结构、并有有机化学特性的结合结构。
在另一方面，本发明涉及包含以上定义的抗体、以上定义的靶结构或以上定义的物质作为有效成份的药物组合物。
在另一方面，本发明涉及包含以上定义的抗体、以上定义的靶结构或以上定义的物质作为有效成份的疫苗组合物。
在另一方面，本发明涉及基于抗血管扩张机制(anti-angiotenicmechanism)治疗疾病的治疗方法，其中将以上定义抗体、或以上定义靶结构或以上定义物质施用给人实施对象。
在另一方面，本发明涉及治疗人转移性疾病的方法，其中将以上定义抗体施用给实施对象人。
在另一方面，本发明涉及人恶性疾病体外组织病理诊断和预后的方法，其中将样品与以上定义的抗体和指示剂接触。
所述方法的实施方案包含肿瘤分型、肿瘤筛选、肿瘤诊断和预后以及监测恶化前疾病。
在另一方面，本发明涉及人恶性疾病体外诊断和预后的方法，其中测定体液中包含以上定义的靶结构的抗原、或以上定义的所述靶结构的抗独特型的浓度。
在另一方面，本发明涉及人恶性疾病体外诊断和预后的方法，其中测定体液中以上定义抗体的浓度。
在另一方面，本发明涉及人恶性疾病体外诊断和预后的方法，其中测定体液中a)包含以上定义的靶结构的抗原或以上定义的所述靶结构的抗独特型，和b)以上定义的抗体的复合物的浓度。
在另一方面，本发明涉及人恶性疾病体内诊断和预后的方法，其中确定实施对象人中以上定义的抗体在肿瘤沉积物(tumour deposits)的定位。优选地所述抗体在确定前施用给该实施对象。在一个实施方案中，所述抗体在肿瘤沉积物中积累。在另一实施方案中，所述方法是定量性的。
在另一方面，本发明涉及人恶性疾病的治疗方法，其中将以上定义抗体施用给实施对象人。在该方法的一个实施方案中，已通过在基因上连接到赋予联合分子改变的药代动力学特性的分子改变了所述抗体。在另一实施方案中，已通过衍生改变了所述抗体。
发明详述
鉴定新的肿瘤相关抗原(TAAs)对肿瘤免疫治疗和诊断领域的进步很关键。基于流式细胞术评估和使用由连接了不同抗生素抗性标记物的特异抗体克隆组成的微小文库，在本发明中首创了利用完整细胞作为抗原来源的噬菌体抗体的正向和消减筛选(positive and substractiveselection)法。从用混合的人结肠癌免疫的灵长类动物(Macacafascicularis)构建了scFv噬菌体文库(2.7×107)。通过结合到Colo205结肠腺癌细胞、蛋白质水解洗脱和随后的噬菌体扩增进行三轮文库筛选。
用免疫组化鉴定了与结肠癌有反应的并且只与少数几种正常上皮组织有有限反应的几个抗体。一个克隆，A3scFv，识别在所研究的11/11结肠癌和4/4胰腺癌中均一表达的表位，并且正常组织的表达局限于胃肠道上皮亚型。A3scFv的总表观亲和力比A3Fab高约100倍，表明scFv同型二聚体的结合。基于Fab结合计算的A3表位的细胞表面密度特别地高，接近每个细胞3,000,000个。
还证明了：T细胞介导的对包被有融合了A3scFv的低II类MHC结合超抗原突变体SEA(D227A)的结肠癌细胞的有效杀伤。因此所鉴定的A3分子是一种TAA，其特性预示了其在结肠癌和胰腺癌免疫治疗中的用途。
讨论
在本发明中开发了用于从大噬菌体文库中鉴定细胞表型特异性抗体片段的有效的噬菌体筛选方案。作为范例应用的靶特异性是针对结肠癌相关抗原的。
首先使用此处提供的用于噬菌体增殖的噬菌粒构建体分析了在噬菌体群中pIII-scFv融合蛋白表面展示的频率。与以前的报道相比，获得了更高水平的C215scFv展示。这有利于消减筛选效率，但是也提高了从文库中亲和力筛选低亲和性抗体的可能性。
清楚地证明了C215 scFv噬菌体结合到Colo205结肠腺癌细胞的特异性。使用能特异性切割噬菌体蛋白III和scFv抗体之间的靶序列的蛋白酶Genenase能够有效地洗脱结合的噬菌体并使洗脱后细胞完整。无论其结合亲和力如何，这种非化学性洗脱方法应该同样有效地洗脱噬菌体抗体，和仅通过scFv相互作用结合的噬菌体，增加了该过程的特异性。
使用该筛选方案在Colo205细胞(500 000×)上三轮筛选后获得的富集与其它研究人员报道的对复合抗原的筛选相似。
证实了各种方法步骤的效果后，将此联合技术应用于使用Colo205细胞的文库筛选。
用人肿瘤免疫的近人物种构建文库。在对广泛分布的正常人组织抗原的有限异种反应性背景下，该方式产生的抗体库可能包括针对肿瘤特异性抗原的亲和力成熟抗体(6)。所鉴定的抗体识别在正常组织中有限分布的肿瘤和组织分化抗原。在初级筛选中筛选出的鉴定为结肠癌组织反应性的所有抗体在流式细胞仪上也与活的Colo205细胞反应。这种对细胞表面特异性的限制反映了筛选过程而不是文库的组成，因为用于免疫的是肿瘤组织成分混合物悬液。
在以往相似的研究中，在相同方式产生并用组织块作为抗原来源筛选出的抗黑素瘤文库中鉴定了细胞外和细胞内的特异性(4)。与流式细胞术筛选相比，在初级筛选中使用术后人结直肠肿瘤和正常结肠(在相同孔中封固)的组织切片用免疫组化法确保选出的特异性的临床相关性、提高效率和获得更高质量的信息。
根据其对不同器官上皮的反应性模式来区分，筛选出的抗体可分为四个抗体特异性组(见实施例1，表1)。在这些特异组中，A3scFv识别了大多数的肿瘤选择性抗原。在原发的和转移的结肠癌和胰腺癌样品中该A3TAA的表达高、均一和频繁。而且，用A3Fab融合蛋白(3百万表位/细胞)确定其细胞表面表达水平特别地高，并且允许细胞表面介导的细胞毒性效应。
所定义的频繁表达的人肿瘤抗原很少(如果有的话)是肿瘤特异性的，但是通常涉及组织分化，例如A3和Ep-CAM。然而，这些抗原在肿瘤中上调的表达提供了治疗有效剂量窗口的基础。由于有限的毛细管通透性和体内表达位点(例如暴露给循环抗体的肠上皮细胞顶面非常有限)，正常组织区室表达抗原的有效循环也许更局限。
全上皮Ep-CAM反应性17-1A mAb的临床经验支持鉴定有效无毒抗体剂量的可行性。该工作中筛选出的所有scFv克隆在上皮中的限制性表达，表明原则上能认为这些克隆是与17-1A(例如全长mAbs)相似的用于免疫治疗的侯选者。然而与Ep-CAM相比，A3 TAA的特别优势是在大多数正常上皮例如肺和肾上皮中缺乏表达，尽管在结肠中的表达是相似的。
在源于胃肠道的肿瘤亚型中的选择性表达支持正常上皮亚型的组织分布(见实施例2，表2)。
与A3表位相比，以前熟知的几个结肠癌相关抗原(CEA，CA50，CA19-9，CA242，Tag-72)(3)在正常组织中表达相同或更局限。然而，与A3和C215 Ep-CAM相反，它们在肿瘤中的表达更不均一。
使用Ep-CAM抗体已经证明了好的临床结果，包括在辅助背景下结肠癌患者的存活优势(2)。为了在甚至更高阶段的患者中诱导肿瘤应答，引入与该抗体连接的有效的效应分子将有望克服在用裸17-1A mAb治疗时所见的“正常组织抗性”。临床使用前，这能够用毒素偶联的鼠源该抗原的特异抗体或人结肠癌相关抗原的转基因动物在模式系统中进行研究。
以往，应用抗体免疫毒素成功地治疗了带有表达异源(人)肿瘤抗原(其在鼠组织中不表达)的转移性生长的肿瘤的小鼠模型(10)。然而，所用TAAs是真正肿瘤特异性，并且该模型不反映对正常组织靶向毒性的潜力。
在以前的研究中我们报道了作为免疫刺激毒素的超抗原在肿瘤免疫治疗中的潜力(8)。抗体介导的超抗原的靶向吸引大量细胞毒性的和产生细胞因子的T细胞到肿瘤部位。突变为MHC II类低结合亲和力的超抗原SEA(D227A)，被遗传连接到肿瘤靶向性抗体。该“肿瘤选择”剂用于征集肿瘤中不依赖于MHC表达的T细胞，因此解决了代表其它主动免疫治疗方法重大障碍的MHC下调和多态性的问题。
所建立的“肿瘤选择性”1F scFv噬菌体、“广泛反应的”C215噬菌体和非特异性D1.3噬菌体抗体克隆的微小文库(mini-library)是研发有效的消减细胞筛选法重要的工具。由于不展示噬菌体颗粒的频率高，该筛选原则需要在噬菌体拯救和扩增前先负选择再正选择。或者，通过选择性蛋白水解(G.Winter，pers.comm.)，可以使不展示的噬菌体成为无感染性的。该技术可允许产生“无作用文库”，例如广泛地负向预选择的文库(例如针对静息状态细胞或可转染的亲代细胞)。
总之，对每一轮筛选，能从噬菌体群中选择性地减去约100位的“不需要的”模型噬菌体特异性。将来的消减筛选法联合使用该研发方案和非免疫的大噬菌体文库以鉴定细胞表面差异表达抗原将证明该方法是否优于本研究中我们使用的策略，即使用体内预选择免疫库的正向筛选法，包括限制性和偏向性如免疫优势(4)。与A3scFv融合蛋白相比，A3Fab结合肿瘤细胞的低亲和力和高的表位密度，表明形成了与在细胞表面聚集的表位相互作用的scFv多聚体。应该研发更高亲和力的A3Fab单价变体或者是稳定二价构建体例如与推断的A3的低免疫原性相容的全长的A3Fv嫁接mAbs。该构建体将适于将适宜的效应分子靶向高度表达的该胃肠肿瘤相关抗原。
本发明在本说明书以下非限制性实验部分中进一步阐述。
实验部分
材料与方法
动物
瑞典斯德哥尔摩传染病控制研究所(Swedish Institute forInfectious Desease Control(SIIDC)，Stockholm)饲养并免疫猕猴Macaque(Macaca fascicularis)。总能自由地得到食物和水。用2ml在含10％正常猕猴血清的PBS中的结肠癌组织粗悬液皮下接种四只猴子。第21、35和49天时给予加强免疫剂量。在两只接种了与明矾佐剂混合的抗原的猴子中证实了抗体反应。按照瑞典立法饲养动物并且当地道德委员会认可实验。
组织和细胞
从Lund University Hospital和Malm General Hospital，Sweden得到人肿瘤和正常组织样品。人结肠细胞系Colo205、人B细胞淋巴瘤细胞系Raji和鼠B16黑素瘤细胞系获自美国典型培养物保藏中心(ATCC，Rockville，MD)。以前描述了用含有Ep-CAM-1基因(C215)的表达载体pKGE839转染的鼠黑素瘤B16-C215+细胞。
人细胞培养于补充了10％热灭活胎牛血清(Gibco)和0.1mg/ml硫酸庆大霉素(Biological Industries，Kibbutz Beit Haemek，以色列)的RPMI 1640(Gibco，Middlesex，UK)培养基中。鼠细胞培养于额外补加了1mM谷氨酰按(Hyclone，Cramlington，UK)、5×10-5Mβ-巯基乙醇(ICN，Costa Mesa，CA)、0.2％NaHCO3(Seromed Biochrome，Berlin，德国)、1×10-2M HEPES(HyClone，UT)和1×10-3M丙酮酸钠(Hyclone)的培养基中。用Gene-Probe Mycoplasma T.C.test(San Diego，CA)反复测试细胞的支原体污染。
噬菌粒载体和噬菌体文库构建
从一只对应的猴子用Promega的RNA分离试剂盒(Mannheim，Germany)抽提脾脏总RNA。用PE Biosystems(Stockholm，Sweden)RNA PCR试剂盒扩增cDNA。以前报道了用于λ轻链和重链基因的cDNA合成和组装这些基因到scFv基因的引物(4)。scFv cDNA连接进噬菌粒载体(4)与M13基因III的249-406位残基融合。scFv gIII基因由phoA启动子表达并且所导致的蛋白由大肠杆菌热稳定毒素II的信号肽引导。
用有scFv基因插入的7ug文库载体重复电穿孔在最小化琼脂平板上得到2.7×107个原始转化的大肠杆菌TG-1菌落。从平板上刮下菌落并在2×YT中在以150rpm 37℃生长1小时。培养物用50倍过量M13K07辅助噬菌体(promega)超感染。加入终浓度为100mg/l氨苄青霉素、让培养物再生长1小时。加入终浓度为70mg/l的卡那霉素，培养物以250rpm在30℃生长15小时。用PEG/NaCl重复沉淀二次以从培养上清中收获噬菌体颗粒。沉淀的噬菌体溶解于含1％BSA的PBS中。
Western印迹分析
scFv-C215噬菌体颗粒的两倍比稀释系列(来自PEG沉淀/浓缩的噬菌体的未稀释原种)在含1％SDS和2％β巯基乙醇的12％还原性聚丙烯酰胺凝胶上分离。蛋白质通过电泳转移到硝酸纤维素膜(Bio-Rad，Hercules，CA)上。用5％低脂牛奶(Semper AB，Stockholm，Sweden)封闭膜。再用偶联到匙孔血蓝蛋白上针对蛋白III衍生肽序列(AEGDDPAKAAFNSLQASATEC)的兔抗血清孵育。用偶联了辣根过氧化物酶(HRP)的二级羊抗兔抗体(Bio-Rad)孵育30分钟。所有步骤间在PBS/0.5％Tween 20中洗膜，洗3次，每次5分钟。膜在底物(AmershamPharmacia Biotech，Little Chalfon Buckingham-shire，UK)中孵育1分钟。光敏感胶片(ECL hyperfilm，Amersham)爆光到膜上并显色0.5-5分钟。
相似地，为分析纯化Fab(A3，包括猕猴CH1和Clambda区域)、scFv-和Fab(包括鼠CH1和Ckappa)-SEA(D227A)融合蛋白(按照以前描述(9)生产)的完整性，进行12％ SDS-PAGEs。用纯化的多克隆兔抗-SEA抗体孵育含转移蛋白的膜，随后是以上描述的试剂步骤。
模型和噬菌体文库在细胞上的筛选
1012个在100μl PBS/1％BSA中的λ轻链文库(或者是模型噬菌体)噬菌体悬液，用3,000,000个Colo205细胞在冰上孵育1小时。细胞用2ml PBS/1％BSA洗3遍，每次洗时孵育10分钟。向细胞沉淀加入50μl的33μg/ml的Genenase洗脱噬菌体，并且孵育15分钟。Genenase，枯草芽孢杆菌素BPN-突变体，S24C/H64A/E156S/G169A/Y217L，由Dr.PoulCarter(San Francisco，CA)慷慨提供。离心后，上清转移到新管，加入250μl含1％BSA的PBS。为拯救和扩增选出的文库(和多代实验中的模型噬菌体颗粒)，使洗脱的噬菌体颗粒感染1ml大肠杆菌DH5αF(OD600nm＝1.0)。感染的细菌培养物用补充了适当抗生素的2×YT稀释100倍，并且培养直到OD＞1.0(直到2天)。
最终，为产生可溶性scFv，大肠杆菌的琥珀抑制株HB2151用从第二轮和第三轮筛选出的文库感染。在含有氨苄青霉素的琼脂平板上生长后，在30℃在96微孔板上补充了氨苄青霉素的2×YT培养基中培养单菌落17小时。离心后，去掉上清，加入等体积的PBS/1％BSA，分析单个scFvs对人肿瘤和正常组织切片的免疫反应性。简而言之，用兔抗血清、随后用生物素标记的羊抗兔抗体(DAKO A/S，Copenhagen，Denmark)和StreptABComplex HRP(DAKO A/S)检测C-末端标签ATPAKSE(见“免疫组织化学”)。
免疫组织化学
冰冻切片(8μm)在载玻片上空气干燥，-20℃丙酮固定10分钟并在含20％胎牛血清的PBS(FBS)中重新水化。内源性生物素用亲和素(1/6稀释)封闭15分钟再用生物素(1/6稀释)孵育15分钟(VectorLaboratories，Burlingame，CA)。5μg/ml亲和纯化和生物素标记的兔抗-SEA抗体孵育30分钟，随后用1/110稀释于50mM Tris pH 7.6中的StreptABComplex HRP(DAKO A/S，Copenhagen，Denmark)孵育30分钟。所有步骤间，切片在TBS中洗3次。在0.5mg/ml 3，3’二氨基联苯胺四盐酸盐(Sigma)(溶解于含0.01％H2O2的Tris pH7.6)中进行染色反应8分钟。在0.5％甲基绿中复染10分钟，载玻片在自来水下冲洗10分钟，在70-99％乙醇和二甲苯中逐渐脱水，再在DPX介质(Sigma)中封固。
流式细胞术
用0.02％ w/v EDTA解离并用PBS洗Colo205结肠癌细胞。为跟踪猴子的抗体反应进程，用稀释血清、生物素标记的兔抗人IgG抗体(SouthernBiotechnology Ass.Inc.，Al，USA)、最终用抗生物素蛋白-PE(BectonDickinson，Mountain View，CA)连续4℃分别孵育细胞1小时、30分钟和30分钟。
用兔-抗-M13抗体(用M13颗粒免疫兔子产生)和FITC偶联的驴抗兔抗体(Amersham Pharmacia Biotech)分析模型噬菌体和细胞的结合。用生物素标记的兔抗SEA抗体和亲和素-PE检测融合到SEA(D227A)的抗体的结合。所有试剂稀释于PBS/1％BSA。噬菌体颗粒结合后，用试剂孵育三次，每次10分钟，再用PBS/1％BSA洗两次细胞。
用FACSort流式细胞仪(Becton Dickinson)进行流式细胞分析。
在培养细胞上确定亲和性
按照Bolton Hunter描述用碘标记A3 scFv-SEA(D227A)、A3Fab-SEA(D227A)和1F scFv SEA(D227A)融合蛋白，每种蛋白80μg，比活性为10-15μCi/μg。Colo205细胞和Raji细胞，30,000个/样品，与两倍比系列稀释于1％BSA中的碘标记融合蛋白(100μl/管)孵育1小时。再在PBS中洗3次，然后测定结合活性。加入的和结合的融合蛋白的浓度用于斯卡查得分析(Scatchard analysis)。减去与Raji细胞的背景结合以计算与Colo205细胞的特异结合。
细胞毒性实验
用51Cr-标记的Colo205细胞作为靶细胞，人T细胞作为效应细胞在标准的4小时铬释放试验中测定超抗原融合蛋白的T细胞依赖的细胞毒性(超抗原抗体依赖的细胞的细胞毒性，SADCC)(9)。特异性裂解的百分比计算为：
实施例1
结合肿瘤的猕猴单克隆抗体的产生
每隔一周用人结肠癌悬液免疫猕猴，Macaca fascicularis(4只)，重复四次。猴子中抗体反应的逐渐形成通过使用系列稀释的免疫前和免疫血清，流式细胞染色培养的结肠细胞Colo205来跟踪。仅仅当使用明矾沉淀的肿瘤组织悬液时引发IgG抗体反应(2个个体)。
用免疫前血清抗体有最高免疫结合水平的猴子用于构建大的大约2.7×107(由原始转化体数目估计)的联合scFv噬菌体文库。用Colo205细胞筛选灵长类噬菌体文库。经三轮连续筛选，总噬菌体产量(洗脱的/加入的噬菌体数目，计算为集落形成单位，CFU)由1.9×10-7、1.4×10-6到1.2×10-3逐渐增加。流式细胞术证明：三轮筛选后从噬菌体文库产生的5％(12/246)单克隆可溶性scFv：s结合人结肠癌组织块和完整的Colo205细胞。根据用1％琼脂糖凝胶电泳分析的Hinf I限制性图谱，证明所有选择的抗体分别有独特核酸序列。
用5μl细菌培养物和互补于噬菌粒载体中scFv基因的5’和3’区域的引物(在phoA启动子和M13基因III中的区域)用聚合酶链式反应扩增抗体基因。
选出的scFv逐个证明了与正常组织上皮的独特反应性
根据其与正常组织的免疫组化反应模式，将结肠癌反应性scFv’s分为特异性组(表1)。详尽研究的抗体是A3 scFv(和A3scFv-SEA(D227A))、A10 scFv、3D scFv和1D scFv。通过其对不同器官上皮的精细特异性和其与白细胞的结合能相互区分代表性抗体。1DscFv与肠上皮强烈反应，并且是与有多形核粒细胞形态细胞反应的唯一抗体。通过对肾小管和收集管的管腔表面染色，1D scFv能够与其它抗体区分，然而A10 scFv与这些上皮细胞均一地(非极性)反应，并且3D scFv和A3 scFv为阴性反应。1D、A10和3D，而非A3 scFv，也与肺中巨嗜细胞样细胞反应。
第五组抗体未广泛评估，因而不包括在表1中，其与结肠上皮和白细胞及肝中枯否细胞反应。A3 scFv突出地显示与所用的正常组织组最大限制性地反应。A3最显著的正常组织反应性是正常结肠上皮的染色。在胰腺小管和肝胆管及小肠上皮的亚结构中也检测到弱染色。两个胃样品的其中一个的表面上皮被A3抗体强烈染色。
用融合蛋白A3 scFv-SEA(D227A)证实了A3 scFv的反应模式。该模式允许使用多克隆兔抗-SEA抗体以便免疫组化检测，其与使用针对scFvsC-末端肽标签ATPAKSE的二级抗体比较，是更为敏感的检测系统，显示低的反应背景和组织交叉反应性。
表1对来自选出的结直肠癌噬菌体文库的可溶性scFv片段对正常人组织的免疫组织化学反应性
  组织/亚结构   n*   ScFv克隆名称
  A3**    A10          3D          1D
  食管   1   0       ND           ND          ND
  /上度组织
  /非上皮组织   0       ND           ND          ND
  结肠   5   ++      +            +           ++
  /上皮
  /非上皮组织   0       0            0           粒细胞      ++
  小肠   2   (+)      不均一地 +  +           不均一地      (+)
  /绒毛上皮
  /基底腺   +       +            +           ++
  /非上皮组织   0       0            0           0
  Ventricle   2   0，++   0            0，+        ++
  /表面上皮
  /腺上皮   0       +，++        0           ++
  /非上皮组织   0       0            0           0
  胰腺   1   0       (+)          +           ++
  /腺泡
  /小管   (+)     (+)          +           ++
  /大管   0       (+)          +           ++
  /非上皮组织   0       0            0           0
  /内分泌   0       0            0           0
  肝   2   0       ND           ND          ND
  /肝细胞
  /枯否氏细胞   0       ND           ND          ND
  /胆管   (+)     ND           ND          ND
  肾   1   0       +            0           腔表面    ++
  /近端小管
  /远端小管   0       +            0           腔表面    ++
  /收集管   0       +            0           腔表面    ++
  /肾小球   0       0            0           0
  /非上皮组织   0       0            0           0
  膀胱   1   0       ND           ND          ND
  /上皮组织
  /非上皮组织   0       ND           ND          ND
  前列腺   1   0       ++           +           和分泌物质++
  /上皮组织
  /非上皮组织   0       0            0           0
  肺   1   0       (+)          (+)         0
  /支气管上皮
  /肺泡上皮   0       (+)          (+)         0
  /非上皮组织   0       巨嗜细胞  +  巨嗜细胞    粒细胞     +++           巨嗜细胞  +
  CNS   1   0       ND           ND          ND
  /灰质
  /白质   0       ND           ND          ND
  骨骼肌   1   0       ND           ND          ND
表1注解：
0＝阴性，(+)＝弱，+＝中等，++＝强，ND＝未测
*检查的组织样品数目
**已用A3 scFv(D227A)融合蛋白确证A3 scFv的反应性。
实施例2
A3肿瘤相关抗原在结直肠癌和胰腺癌中均一地和频繁地表达
A3scFv-SEA(D227A)融合蛋白用于上皮来源的各种肿瘤的免疫组织化学染色(表2和图1)。该融合蛋白均一地和强烈地染色原发结肠癌组织的11/11样品和取自卵巢、淋巴结和肝中的4/4转移结肠癌样品。胰腺癌的4/4样品均呈强烈阳性。与之相反，胃的、前列腺的、乳腺的和非小细胞性肺癌的组织样品呈阴性。
                                     表2.A3 scFv SEA(D227A)的肿瘤组织反应性
  肿瘤组织   n   反应性
  结肠癌，原发肿瘤结肠癌在淋巴结、肝和卵巢中的转移癌胰腺癌心室癌前列腺癌乳腺癌肺癌(非小细胞)恶性黑素瘤   1144222222   所有肿瘤细胞被强烈和均一地染色同上同上阴性阴性阴性阴性阴性
实施例3
A3 TAA在结肠癌细胞表面上表达很高。
来自几个确定亲和性的斯卡查德图(Scatchard plot)的结果，根据融合蛋白A3 scFV-SEA(D227A)，A3 Fab和1F scFv-SEA(D227A)(1F分类为A3特异群)对Colo250细胞的结合，总结于表3。从对Colo250细胞的结合减去对不表达A3和A3 TAAs的细胞系B细胞杂交瘤Raji细胞的非特异性结合，计算出特异性结合。用线性回归计算Scatchard图中外推直线的斜率和截距。与A3 Fab(每个细胞约300万个结合位点)融合蛋白相比，A3 scFV-SEA(D227A)融合蛋白在每个细胞的饱和结合位点约少10倍，显示对scFV涉及二价(多价)结合。与A3 Fab(580-780nM)相比A3 scFV融合蛋白的总亲和力(3.6-5.5nM)高100倍支持这个观点。
用1F scFv-SEA(D227A)融合蛋白进行的单一实验，证明了与A3scFv-SEA(D227A)融合蛋白相似的结合亲和力和结合位点的饱和。
表3结合到Colo205细胞的碘标记的融合蛋白的斯卡查德分析
  融合蛋白   n*   Kd(nM)   百万位点/细胞
A3 Fab-SEA(D227A)A3 ScFv-SEA(D227A)1F ScFv-SEA(D227A)   231   580-7803.6-5.54.2   3.0-3.90.11-0.390.18
*进行的实验次数
实施例4
A3和1F scFv-SEA(D227A)介导对Colo250细胞的T细胞裂解
检查和比较了两种融合蛋白A3和1F scFv-SEA(D227A)与阳性对照C215 Fab-SEA(D227A)和阴性对照D1.3 scFv-SEA(D227A)融合蛋白介导对Colo250细胞的超抗原抗体依赖性细胞毒(SADCC)的能力。A3scFv-SEA(D227A)融合蛋白滴度在这个4小时实验中达到与C215 Fab-SEA(D227A)融合蛋白相似的最大裂解平台，约50％，虽然以高10倍的浓度(图2)。与A3 scFv-SEA(D227A)相比，1F scFv-SEA(D227A)以稍高的浓度介导相似水平的细胞毒性。
阴性对照D1.3 scFv-SEA(D227A)融合蛋白不介导任何细胞毒性。
实施例5
纯化结肠癌反应性抗体A3所识别的肿瘤相关抗原
从异种移植肿瘤细胞系Colo250中制备肿瘤抽提物。将抽提物加样到用C215 Fab-SEAm9偶联的前置柱和用A3scFv-SEA m9偶联的柱上。在加样时将柱子串联，但在碱性条件洗脱前将柱子分离。
洗脱时通过紫外分光光度计检测到一个单峰(图3)。收集、中和并浓缩后一个A3柱来的该洗脱组分，然后在非还原条件下SDS-PAGE分析(图4)。通过银染可看到两条表观分子量大约为90-140kDa的条带(图4中标记的I和II)，将其切下并用标准的肽作图法检查。这两条带对应于Western印迹中被A3检测的条带，见实施例8。从条带I得到47条分离的胰化肽质量(序列和对应的质量见SEQ ID NO：3、表4、和图5)，其完全匹配人α6整联蛋白或β4整联蛋白的MALDI-TOF(分别见SEQ ID NOs：5-51和3-4，和分别见图3A和B，在图3A中下划线部分对应于图3B/SEQ ID Nos：5-51所示的肽)确定的不同胰化肽质量。从条带II得到22条分离的胰化肽质量，其完全匹配β4整联蛋白不同的胰化肽质量(数据未出示)。数据显示可用A3-亲和柱特异性分离α6β4整联蛋白异型二聚体。
表4 源于人α6β4整联蛋白的肽/多肽和其质量
  序列号   序列   测量的质量   计算的质量
  5   LLLVGAPR   838.568   838.551
  6   ANRTGGLYSCDITARGPCTR   2226.131   2226.050
  7   VVTCAHRYEK   1262.637   1262.631
  8   RQHVNTK   882.524   882.490
  9   CYVLSQNLR   1152.618   1152.583
  10   FGSCQQGVAATFTK   1501.706   1501.710
  11   DFHYIVFGAPGTYNWK   1914.881   1914.917
  12   DEITFVSGAPR   1191.625   1191.600
  13   ANHSGAVVLLK   1108.600   1108.647
  14   DGWQDIVIGAPQYFDR   1879.865   1879.897
  15   DGEVGGAVYVYMNQQGR   1842.811   1842.844
  16   WNNVKPIR   1026.608   1026.584
  17   NIGDINQDGYPDIAVGAPYDDLGK   2520.213   2520.189
  18   GISPYFGYSIAGNMDLDR   1975.913   1975.922
  19   NSYPDVAVGSLSDSVTIFR   2026.992   2027.008
  20   SRPVINIQK   1054.644   1054.637
  21   LRPIPITASVEIQEPSSR   1993.066   1993.108
  22   VNSLPEVLPILNSDEPK   1863.920   1864.006
  23   TAHIDVHFLK   1180.665   1180.647
  24   FSYLPIQK   995.601   995.556
  25   DIALEITVTNSPSNPR   1726.866   1726.897
  26   SEDEVGSLIEYEFR   1672.764   1672.770
  27   VESKGLEKVTCEPQK   1731.866   1731.895
  28   REIEKQIDDNRK   1644.792   1644.866
  29   FSLFAER   869.476   869.452
  30   YQTLNCSVNVNCVNIR   1954.003   1953.927
  31   LNYLDILMR   1150.644   1150.629
  32   AFIDVTAAAENIR   1390.739   1390.733
  33   LPNAGTQVR   955.523   955.532
  34   VSVPQTDMRPEK   1386.727   1386.705
  35   EPWPNSDPPFSFK   1547.730   1547.717
  36   NVISLTEDVDEFR   1536.744   1536.754
  37   TQDYPSVPTLVR   1375.718   1375.722
  38   RGEVGIYQVQLR   1417.801   1417.791
  39   ALEHVDGTHVCQLPEDQK   2075.965   2075.981
  40   GNIHLKPSFSDGLK   1512.749   1512.817
  41   MDAGIICDVCTCELQK   1928.901   1928.822
  42   YEGQFCEYDNFQCPR   2012.795   2012.790
  43   SCVQCQAWGTGEKKGR   1879.865   1879.890
  44   DEDDDCTYSYTMEGDGAPGPNSTVLVHK   3103.229   3103.278
  45   QEVEENLNEVYR   1521.779   1521.718
  46   VAPGYYTLTADQDAR   1640.779   1640.791
  47   VPLFIRPEDDDEK   1572.778   1572.790
  48   DVVSFEQPEFSVSR   1625.758   1625.781
  49   LLELQEVDSLLR   1427.760   1427.810
  50   VCAYGAQGEGPYSSLVSCR   2060.883   2060.916
  51   VLVDNPKNR   1054.644   1054.600
材料与方法
肿瘤组织的溶解
由瑞典医院提供表达A3抗原的人结肠癌组织，并且在ABR组织银行将其冻存于-70℃。冰冻的结肠癌组织用解剖刀切并转移到含有冷的等渗的蔗糖缓冲液(0.2M蔗糖，10mM KCl，1.5M MgCl2，50mM Tris-HClpH7.4在25℃)并补充了1％(v/v)Nonidet P-40(NP-40)和蛋白酶抑制剂(CompletetTM蛋白酶抑制剂鸡尾酒片，Boehringer Mannheim)的管子中。用Ultra-Turrax匀浆器匀浆组织并置于0℃溶解。溶解的制备物在11,000rpm(Hettich centrifuge Universal 30RF转子)离心，去除细胞碎片。上清进一步在108,000g 4℃离心(Beckman Ultracentrifuge Ti-60转子)，并且最终通过0.2μm Minisart plus滤膜(Sartoriuis AGGottingen Germany)过滤。
组织抗原的亲和纯化
按照生产者建议偶联A3scFv-SEAm9到NHS活化的HiTrap柱(Pharmacia Biotech Uppsala Sweden)。用C215Fab-SEAm9偶联对照和前置柱，并且对照、前置柱和柱子串联安装。用预洗缓冲液(20mM Tris HClpH7.5，4℃，0.2％NP40)洗所有柱子。抽提物以0.1ml/min加载到柱子上，流穿物再循环。柱子再用起始缓冲液洗涤。结合的抗原在二乙胺的pH从7.5到11.0的pH梯度中洗脱。收集2.5ml的洗脱物并浓缩为75μl。用AKTA FPLC(Amersham Pharmacia Biotech Uppsala Sweden)系统在4℃进行纯化。洗脱的蛋白用SDS PAGE和银染分析。切下各个带，用胰蛋白酶消化并且采用Protana A/S(Odense，Denmark)的MALDI-TOF仪器确定肽质量。在SWISSPROT数据库为每一个蛋白通过计算机搜索比较所有胰化肽质量，Protana A/S(Odense Denmark)提供这种服务。
实施例6
A3scFv-SEAm9检测新的α6β4整联蛋白表位
人α6整联蛋白和β4整联蛋白商业化抗体与A3在正常和恶性结肠切片上比较。反应性，如图6所示，证明了A3限制于结肠上皮(图6[i])，和肿瘤中恶性细胞(图6[ii])。对α6整联蛋白的商业化抗体NKI-GoH3也对正常结肠(图6[iii])和结肠癌(图6[iv])反应。反应见于结肠的上皮细胞和恶性细胞(箭头)，也见于血管(BV)，某些基底成分和粘膜肌层(mm)。用商业化ASC-3抗-β4整联蛋白抗体观察到的反应在正常结肠(v)和结肠癌(vi)中与用抗-α6抗体观察到的相似但是较弱。
材料与方法
抗体
A3 scFv选自M fascicularis文库。来源于此的VH和VL基因用限制性内切酶消化释放并融合到葡萄球菌内毒素AE嵌合突变体(D227A)以产生A3scFv-SEAm9。这证明了非常低水平的非特异性结合并使得可用二级抗体敏感地检测。ASC-3抗人β4整联蛋白抗体和NKI-GoH3抗人α6整联蛋白抗体来自Becton Dickinson(Copenhagen，Denmark)。
免疫组化
肿瘤和正常组织样品获自Lund Hospital外科。这些样品在异戊烷中冻存，其已在液氮中预冷。样品在切片前储存于-70℃。冰冻切片后，切片空气干燥过夜，在冷丙酮中固定并用亲和素/生物素(VectorBurlingame CA)封闭。加入一级抗体到切片1小时。
二级抗体孵育30分钟，随后用链霉亲和素-生物素/HRP(DakopattsCopenhagen Denmark)再孵育30分钟。在所有步骤间用50mM Tris pH 7.6，0.15M NaCl充分洗涤。二氨基联苯胺(DAB)用作色原，并且切片在0.5％甲基绿中复染。对照包括非组织反应性Fab和SEA-D227A或无一级抗体。所有抗体使用的终浓度为5μg/ml。结果表述为阴性、弱的、中等的或强的染色。
实施例7
A3肿瘤相关抗原与α6和β4整联蛋白抗体在捕获ELISA中反应
粗肿瘤抽提物或用A3亲和层析(见实施例5)纯化的A3抗原用捕获ELISA分析。对β4整联蛋白特异性的商业化抗体ASC-3用作捕获抗体，施加不同稀释度的粗肿瘤抽提物。这再用A3scFv-SEAm9示踪。结合的A3scFv-SEAm9再用抗SEA-HRP检测(图7A)。在图7B中商业化的抗α6整联蛋白抗体NKI-GoH3用于捕获不同稀释度的浓缩A3亲和纯化洗脱物。以图7A相似的方式捕获的抗体用A3scFv-SEAm9示踪，并用抗-SEA-HRP检测。在两个实验中，检测到浓度依赖的信号。结果证实了A3对α6β4整联蛋白异二聚体的特异性，其也显示在实施例5中从A3亲和柱特异性分离。
材料与方法
商业化的抗体NKI-GoH3或ASC-3(Becton Dickinson CopenhagenDenmark)100μl用于在0.05M NaHCO3 PH9.6中包被E.I.A./R.I.A.平板(Costar)的孔。允许反应4℃过夜，随后平板在DPBS+0.05％ Tween 20中洗4次。孔再用200μl在DPBS+0.05％Tween 20中的3％脱脂奶粉在室温(RT)中摇晃封闭1-2小时。按以上定义的再次冲洗孔并施加100μl稀释于含3％脱脂奶的DPBS+0.05％Tween 20中的抗原提取物，室温摇动2小时。再次洗涤各孔(4×DPBS+0.05％Tween 20)，之后加入100μl稀释于含3％脱脂奶粉的DPBS+0.5％Tween 20中的一级抗体，室温摇动孵育2小时。再按以上定义的洗孔，并将100μl稀释于含3％脱脂奶的DPBS+0.05％Tween 20中的二级抗体加到每孔中，室温摇动1小时。再次按以上定义的洗孔，加入100μl过氧化物酶底物(Sigma Fast OPDPeroxidase Substrate Tablet Set P-9187)显色。使反应在室温黑暗中继续30分钟，并摇动，然后加入50μl 3M H2SO4终止反应。在490nm读吸光度值。
实施例8
A3肿瘤抗原的Western印迹分析
A3亲和纯化的肿瘤抗原抽提物用SDS-PAGE分离并转移到膜上做Western印迹分析。抽提物直接用或加热到100℃5分钟或在巯基乙醇(BME)存在下加热到100℃5分钟(图8)。膜再用A3scFv-SEAm9和抗SEA-HRP或抗人α6整联蛋白或抗人β4整联蛋白抗体探测。抗β4整联蛋白抗体不与膜上的任何蛋白反应(图8[ii])。抗人α6整联蛋白与在A3亲和纯化的肿瘤抗原抽提物中表观分子量在90-140kDa的主要种类反应(图8[iii])。同样的种类也用A3scFv-SEAm9检测到，其也在加热后检测到，但在还原条件下弱得多(有BME在)(图8[i])。在90-140kDa区间检测到的主要带对应于在实施例5中的带，用肽作图分析并发现包含α6整联蛋白和β4整联蛋白。
材料与方法
ASC-3抗人β4整联蛋白抗体和NKI-GoH3抗人α6整联蛋白抗体来自Becton Dickinson(Copenhagen，Denmark)。样品用SDS-PAGE在0.25Mtris-甘氨酸pH8.9和0.1％SDS在100V经过上层胶，再170V经过分离胶进行分离。所有胶上都有分子量标准(Biorad宽范围，Biorad)。分离的样品在转移缓冲液(10mM Tris碱，2M甘氨酸，4％(v/v)甲醇)中在100V1小时转移到硝酸纤维素膜(Biorad)上。膜用5％(w/v)BSA/TBS在4℃封闭至少2小时，再与稀释于5％BSA/TBS/0.2％叠氮化物的适当抗体孵育。让反应在室温持续至少2小时，随后用TBST-T充分洗膜。结合的抗体通过与稀释于含有5％奶粉的TBS-T中的HRP偶联的抗体孵育1小时来检测。膜再用增强化学发光(ECL)检测试剂(Renaissance NEN Life ScienceProducts，Boston MA)孵育1分钟并曝光到胶片上至1小时。
参考文献
1.DeCosse JJ，Tsioulias GJ，Jacobson JS.结肠癌：检测、治疗和康复(Colorectal cancer：detection，treatment，andrehabilitation).CA Cancer J Clin 1994；44：27-42
2.Riethmuller G，et al.手术后Dukes’C结直肠癌的单克隆抗体治疗：多中心随机实验的七年结果(Monoclonal antibody therapy forresected Duke’s C colorectal  cancer：seven-year outcome of amulticenter randomized trial).J clin Oncol 1998；16：1788-1794
3.Kuhn JA，Thomas G.单克隆抗体和结直肠癌：诊断应用的临床综述(Monoclonal antibodies and colorectal carcinoma：a clinicalreview of diagnostic applications).Cancer Invest1994；12：314-323.
4.Tordsson J，等，通过吸附到组织块中的原位表达抗原对scFv抗体噬菌体的有效筛选(Efficient selection of scFv antibody phage byadsorption to in situ expressed antigens in tissue sections).JImmunol Methods 1997；210：11-23.
5.Aujame L，Geoffroy F，Sodoyer R.通过噬菌体展示的高亲和力人抗体(High affinity human antibodies by phage display).HumAntibodies 1997；8：155-168
6.Clark RK，Trainer DL，Bailey DS，Greig RG人结肠癌免疫恒河猴的抗血清的免疫组化分析(Immunohistochemical analysis ofantiserum from rhesus monkeys immunized with human coloncareinoma).Cancer Res 1989；49：3656-3661
7.Lewis Ap，et al.猕猴免疫球蛋白κ链和γ链的cDNAs的克隆和序列分析(Cloning and sequence analysis of kappa and gammacynomolgus monkey immunoglobulin cDNAs).Dev Comp Immunol1993；17：549-560
8.Brodin TN，et al.人造超抗原：用于基于T-细胞治疗的肿瘤选择剂(Man-made superantigens：Tumor-selective reagents forT-cell-based therapy).Adv Drug Deliv Rev 1998；31；131-142.
9.Dohlsten M，et al.单克隆抗体超抗原融合蛋白：用于基于T-细胞肿瘤治疗的肿瘤特异性试剂(Monoclonal antibody-superantigenfusion proteins：tumor-specific agents for T-cell-based tumortherapy).Proc Natl Acad Sci USA 1994；91：8945-8949.
10.Liu C，et al.通过定向传输美登木素生物碱根除大结肠癌异源移植物(Eradication of large colon tumor xenografts by targeteddelivery of maytansinoids).Proc Natl Acad Sci USA 1996；93：8618-8623。
附图说明
图1A3肿瘤-相关抗原在原发肿瘤和转移肿瘤中的均一表达
使用70nM A3 scFv-SEA(D227A)和C215 Fab-SEA(D227A)对冷冻和丙酮固定的人肿瘤组织切片的免疫组化染色。A3scFv融合蛋白与从肿瘤患者切除的原发结肠癌和胰腺癌都能强烈地均一地反应。原发结肠癌对C215 Fab-SEA(D227A)的代表性染色示于(A)中，对A3 scFv-SEA(D227A)的代表性染色示于(B)中。A3 scFv-SEA(D227A)染色的结肠癌肝转移瘤和原发胰腺癌分别示于(C)和(D)中。
图2T细胞能有效地杀死A3 scFv-SEA(D227A)包被的Colo250肿瘤细胞
A3 scFv-SEA(D227A)介导的对Colo250细胞的超抗原抗体依赖的细胞毒(SADCC)与抗-Ep-CAM融合蛋白C215 Fab-SEA(D227A)一样达到相同的最大细胞毒，但所用浓度高10倍。D1.3 scFv-SEA(D227A)介导的细胞毒缺乏证明在融合蛋白中需要肿瘤导向的抗体部分。
图3
A3scFv-SEA m9偶联柱上肿瘤抽提物的免疫亲和层析。彻底地洗脱A3偶联柱上的结合蛋白，然后按实施例5“材料和方法”中的描述洗脱。洗脱组分用紫外分光光度计(箭头)检测并检测到一单峰。如X所示，用pH梯度洗脱样品。
图4
在非还原SDS-PAGE上分离并银染A3抗原制备品。以前Western分析确定了据信A3抗原所处的分子量范围。切下该区域(标记的I和II)中的明显条带用于肽作图分析。
图5A和5B
上皮整联蛋白α6β4：α6完整的一级结构和β4的变体形式(前体)(Tamura等，J.Cell Biol.111：1593-1604(1990))。在发表的人α6(图5A)整联蛋白和β4(前体)(图5B)整联蛋白序列中对SEQ IDNos：5-51所示的对应肽加有下划线。
图6
使用A3scFv和商业化的抗人α6和β4整联蛋白单克隆抗体所进行的正常和恶性化结肠的免疫组化。
图7A和7B
捕获ELISA。图7A中β4整联蛋白特异的单克隆抗体ASC-3用作捕获抗体，向其施加不同稀释度的肿瘤抽提物。图7B中抗-α6整联蛋白单克隆抗体NKI-GoH3用于捕获不同稀释度的浓缩A3-亲和纯化洗脱液。然后用A3scFv-SEA m9都成功地检测到图7A和7B中的捕获的整联蛋白抗原。
图8A和8B
Western印迹分析A3-亲和层析洗脱物。使用的一级抗体是(i)和(ii)A3scFv-SEA m9，(iii)ASC-3抗-人-β4整联蛋白抗体和(iv)NKI-GoH3抗-人-α6整联蛋白抗体。道A-洗脱液直接应用，道B-洗脱液100℃加热5分钟，和道C-洗脱液在巯基乙醇存在下100℃加热5分钟。显示了分子量标准的位置。
序列表
<110>Active Biotech AB
<120>
<130>2002163
<150>SE 9903895-2
<151>1999-10-28
<160>51
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>747
<212>DNA
<213>Macaca fascicularis
<221>CDS
<222>(1)..(747)
<223>编码序列    VL(1-109)-修饰的Huston
     接头   (110-127)-VH(128-249)
<400>1
tct tct gag ctg act cag ggc cct gca ttg tct gtg gcc ttg gga cat   48
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Gly Pro Ala Leu Ser Val Ala Leu Gly His
  1               5                  10                  15
aca gtc agg atg acc tgc caa gga gac agc ctc aaa acc tat tat gca   96
Thr Val Arg Met Thr Gys Gln Gly Asp Ser Leu Lys Thr Thr Thr Ala
             20                  25                  30
agc tgg tac cag cag aag cca ggc cag gtc cct gtg ctg gtc atc tat  144
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Val Pro Val Leu Val Ile Tyr
         35                  40                  45
ggt aac aac tac cgg ccc tca ggg atc cca ggc cga ttc tct ggc tcc  192
Gly Asn Asn Tyr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Gly Arg Phe Ser Gly Srr
     50                  55                  60
tgg tca gga aac aca gct tcc ttg acc atc act gcg gct cag gtg gaa  240
Trp Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Ala Ala Gln Val Glu
 65                  70                  75                  80
gat gag gct gac tat tac tgt aac tcc tgg gac agc agc ggt acc cat  288
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Trp Asp Ser Ser Gly Thr His
                 85                  90                  95
ccg gta ttc ggc gga ggg acc cgg gtg acc gtc cta ggt caa gcc aac  336
Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val Thr Val Leu Gly Gln Ala Asn
            100                 105                 110
ggt gaa ggc ggc tct ggt ggc ggg gga tcc gga ggc ggc ggt tct gag  384
Gly Glu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
        115                 120                 125
gtg cag ttg gtg gag tct ggg gga ggc ttg gta aag cct ggg ggg tcc  432
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser
    130                 135                 140
ctg aga ctc tct tgt gta gcc tct ggg tcc atc ttc agt agc tct gtt  480
Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Ser Val
145                 150                 155                 160
atg cac tgg gtc cgc cag gct cca gga aag ggt ctg gag tgg gtc tca  528
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
                165                 170                 175
gtt att agt gaa aat ggg cgt acc att aac tac gca gac tct gtg aag  576
Val Ile Ser Glu Asn Gly Arg Thr Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
            180                 185                 190
ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tca ctg ttt ctg  624
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe Leu
        195                 200                 205
cag atg aac agc ctg aca ggc gag gac acg gcc gtc tat tac tgt agt  672
Gln Met Asn Ser Leu Thr Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser
    210                 215                 220
aga gag ggg gga cct gga aca acg tcc aac cgg ctc gat gcc tgg ggc  720
Arg Glu Gly Gly Pro Gly Thr Thr Ser Asn Arg Leu Asp Ala Trp Gly
225                 230                 235                 240
ccg gga gtc ctg gtc acc gtt tcc tca                              747
Pro Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser
                245
<210>2
<211>249
<212>PRT
<213>Macaca fascicularis
<223>编码序列         VL(1-109)-修饰的Huston
     接头   (110-127)-VH(128-249)
<400>2
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Gly Pro Ala Leu Ser Val Ala Leu Gly His
  1               5                  10                  15
Thr Val Arg Met Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Lys Thr Tyr Tyr Ala
             20                  25                  30
Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Val Pro Val Leu Val Ile Tyr
         35                  40                  45
Gly Asn Asn Tyr Arg Pro Ser Gly Ile Pro Gly Arg Phe Ser Gly Ser
     50                  55                  60
Trp Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Ala Ala Gln Val Glu
 65                  70                  75                  80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Trp Asp Ser Ser Gly Thr His
                 85                  90                  95
Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val Thr Val Leu Gly Gln Ala Asn
            100                 105                 110
Gly Glu Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu
        115                 120                 125
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly Ser
    130                 135                 140
Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Ser Ile Phe Ser Ser Ser Val
145                 150                 155                 160
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser
                165                 170                 175
Val Ile Ser Glu Asn Gly Arg Thr Ile Asn Tyr Ala Asp Ser Val Lys
            180                 185                 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Phe Leu
        195                 200                 205
Gln Met Asn Ser Leu Thr Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser
    210                 215                 220
Arg Glu Gly Gly Pro Gly Thr Thr Ser Asn Arg Leu Asp Ala Trp Gly
225                 230                 235                 240
Pro Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser
                245
<210>3
<211>1073
<212>PRT
<213>人
<223>TA6-人整联蛋白α-6A
<400>3
Met Ala Ala Ala Gly Gln Leu Cys Leu Leu Tyr Leu Ser Ala Gly Leu
  1               5                  10                  15
Leu Ser Arg Leu Gly Ala Ala Phe Asn Leu Asp Thr Arg Glu Asp Asn
             20                  25                  30
Val Ile Arg Lys Tyr Gly Asp Pro Gly Ser Leu Phe Gly Phe Ser Leu
         35                  40                  45
Ala Met His Trp Gln Leu Gln Pro Glu Asp Lys Arg Leu Leu Leu Val
     50                  55                  60
Gly Ala Pro Arg Gly Glu Ala Leu Pro Leu Gln Arg Ala Ash Arg Thr
 65                  70                  75                  80
Gly Gly Leu Tyr Ser Cys Asp Ile Thr Ala Arg Gly Pro Cys Thr Arg
                 85                  90                  95
Ile Glu Phe Asp Asn Asp Ala Asp Pro Thr Ser Glu Ser Lys Glu Asp
            100                 105                 110
Gln Trp Met Gly Val Thr Val Gln Ser Gln Gly Pro Gly Gly Lys Val
        115                 120                 125
Val Thr Cys Ala His Arg Tyr Glu Lys Arg Gln His Val Asn Thr Lys
    130                 135                 140
Gln Glu Ser Arg Asp Ile Phe Gly Arg Cys Tyr Val Leu Ser Gln Asn
145                 150                 155                 160
Leu Arg Ile Glu Asp Asp Met Asp Gly Gly Asp Trp Ser Phe Cys Asp
                165                 170                 175
Gly Arg Leu Arg Gly His Glu Lys Phe Gly Ser Cys Gln Gln Gly Val
            180                 185                 190
Ala Ala Thr Phe Thr Lys Asp Phe His Tyr Ile Val Phe Gly Ala Pro
        195                 200                 205
Gly Thr Tyr Asn Trp Lys Gly Ile Val Arg Val Glu Gln Lys Asn Asn
    210                 215                 220
Thr Phe Phe Asp Met Asn Ile Phe Glu Asp Gly Pro Tyr Glu Val Gly
225                 230                 235                 240
Gly Glu Thr Glu His Asp Glu Ser Leu Val Pro Val Pro Ala Asn Ser
                245                 250                 255
Tyr Leu Gly Phe Ser Leu Asp Ser Gly Lys Gly Ile Val Ser Lys Asp
            260                 265                 270
Glu Ile Thr Phe Val Ser Gly Ala Pro Arg Ala Asn His Ser Gly Ala
        275                 280                 285
Val Val Leu Leu Lys Arg Asp Met Lys Ser Ala His Leu Leu Pro Glu
    290                 295                 300
His Ile Phe Asp Gly Glu Gly Leu Ala Ser Ser Phe Gly Tyr Asp Val
305                 310                 315                 320
Ala Val Val Asp Leu Asn Lys Asp Gly Trp Gln Asp Ile Val Ile Gly
                325                 330                 335
Ala Pro Gln Tyr Phe Asp Arg Asp Gly Glu Val Gly Gly Ala Val Tyr
            340                 345                 350
Val Tyr Met Asn Gln Gln Gly Arg Trp Asn Asn Val Lys Pro Ile Arg
        355                 360                 365
Leu Asn Gly Thr Lys Asp Ser Met Phe Gly Ile Ala Val Lys Asn Ile
    370                 375                 380
Gly Asp Ile Asn Gln Asp Gly Tyr Pro Asp Ile Ala Val Gly Ala Pro
385                 390                 395                 400
Tyr Asp Asp Leu Gly Lys Val Phe Ile Tyr His Gly Ser Ala Asn Gly
                405                 410                 415
Ile Asn Thr Lys Pro Thr Gln Val Leu Lys Gly Ile Ser Pro Tyr Phe
            420                 425                 430
Gly Tyr Ser Ile Ala Gly Asn Met Asp Leu Asp Arg Asn Ser Tyr Pro
        435                 440                 445
Asp Val Ala Val Gly Ser Leu Ser Asp Ser Val Thr Ile Phe Arg Ser
    450                 455                 460
Arg Pro Val Ile Asn Ile Gln Lys Thr Ile Thr Val Thr Pro Asn Arg
465                 470                 475                 480
Ile Asp Leu Arg Gln Lys Thr Ala Cys Gly Ala Pro Ser Gly Ile Cys
                485                 490                 495
Leu Gln Val Lys Ser Cys Phe Glu Tyr Thr Ala Asn Pro Ala Gly Tyr
            500                 505                 510
Asn Pro Ser Ile Ser Ile Val Gly Thr Leu Glu Ala Glu Lys Glu Arg
        515                 520                 525
Arg Lys Ser Gly Leu Ser Ser Arg Val Gln Phe Arg Asn Gln Gly Ser
    530                 535                 540
Glu Pro Lys Tyr Thr Gln Glu Leu Thr Leu Lys Arg Gln Lys Gln Lys
545                 550                 555                 560
Val Cys Met Glu Glu Thr Leu Trp Leu Gln Asp Asn Ile Arg Asp Lys
                565                 570                 575
Leu Arg Pro Ile Pro Ile Thr Ala Ser Val Glu Ile Gln Glu Pro Ser
            580                 585                 590
Ser Arg Arg Arg Val Asn Ser Leu Pro Glu Val Leu Pro Ile Leu Asn
        595                 600                 605
Ser Asp Glu Pro Lys Thr Ala His Ile Asp Val His Phe Leu Lys Glu
    610                 615                 620
Gly Cys Gly Asp Asp Asn Val Cys Asn Ser Asn Leu Lys Leu Glu Tyr
625                 630                 635                 640
Lys Phe Cys Thr Arg Glu Gly Asn Gln Asp Lys Phe Ser Tyr Leu Pro
                645                 650                 655
Ile Gln Lys Gly Val Pro Glu Leu Val Leu Lys Asp Gln Lys Asp Ile
            660                 665                 670
Ala Leu Glu Ile Thr Val Thr Asn Ser Pro Ser Asn Pro Arg Asn Pro
        675                 680                 685
Thr Lys Asp Gly Asp Asp Ala His Glu Ala Lys Leu Ile Ala Thr Phe
    690                 695                 700
Pro Asp Thr Leu Thr Tyr Ser Ala Tyr Arg Glu Leu Arg Ala Phe Pro
705                 710                 715                 720
Glu Lys Gln Leu Ser Cys Val Ala Asn Gln Asn Gly Ser Gln Ala Asp
                725                 730                 735
Cys Glu Leu Gly Asn Pro Phe Lys Arg Asn Ser Asn Val Thr Phe Tyr
            740                 745                 750
Leu Val Leu Ser Thr Thr Glu Val Thr Phe Asp Thr Pro Asp Leu Asp
        755                 760                 765
Ile Asn Leu Lys Leu Glu Thr Thr Ser Asn Gln Asp Asn Leu Ala Pro
    770                 775                 780
Ile Thr Ala Lys Ala Lys Val Val Ile Glu Leu Leu Leu Ser Val Ser
785                 790                 795                 800
Gly Val Ala Lys Pro Ser Gln Val Tyr Phe Gly Gly Thr Val Val Gly
                805                 810                 815
Glu Gln Ala Met Lys Ser Glu Asp Glu Val Gly Ser Leu Ile Glu Tyr
            820                 825                 830
Glu Phe Arg Val Ile Asn Leu Gly Lys Pro Leu Thr Asn Leu Gly Thr
        835                 840                 845
Ala Thr Leu Aan Ile Gln Trp Pro Lys Glu Ile Ser Asn Gly Lys Trp
    850                 855                 860
Leu Leu Tyr Leu Val Lys Val Glu Ser Lys Gly Leu Glu Lys Val Thr
865                 870                 875                 880
Cys Glu Pro Gln Lys Glu Ile Asn Ser Leu Asn Leu Thr Glu Ser His
                885                 890                 895
Asn Ser Arg Lys Lys Arg Glu Ile Thr Glu Lys Gln Ile Asp Asp Asn
            900                 905                 910
Arg Lys Phe Ser Leu Phe Ala Glu Arg Lys Tyr Gln Thr Leu Asn Cys
        915                 920                 925
Ser Val Asn Val Asn Cys Val Asn Ile Arg Cys Pro Leu Arg Gly Leu
    930                 935                 940
Asp Ser Lys Ala Ser Leu Ile Leu Arg Ser Arg Leu Trp Asn Ser Thr
945                 950                 955                 960
Phe Leu Glu Glu Tyr Ser Lya Leu Asn Tyr Leu Asp Ile Leu Met Arg
                965                 970                 975
Ala Phe Ile Asp Val Thr Ala Ala Ala Glu Asn Ile Arg Leu Pro Asn
            980                 985                 990
Ala Gly Thr Gln Val Arg Val Thr Val Phe Pro Ser Lys Thr Val Ala
        995                1000                1005
Gln Tyr Ser Gly Val Pro Trp Trp Ile Ile Leu Val Ala Ile Leu Ala
   1010                1015                1020
Gly Ile Leu Met Leu Ala Leu Leu Val Phe Ile Leu Trp Lys Cys Gly
1025               1030                1035                1040
Phe Phe Lys Arg Asn Lys Lys Asp His Tyr Asp Ala Thr Tyr His Lys
               1045                1050                1055
Ala Glu Ile His Ala Gln Pro Ser Asp Lys Glu Arg Leu Thr Ser Asp
           1060                1065                1070
Ala
<210>4
<211>1875
<212>PRT
<213>人
<223>整联蛋白β-4(前体)
<400>4
Met Ala Gly Pro Arg Pro Ser Pro Trp Ala Arg Leu Leu Leu Ala Ala
  1               5                  10                  15
Leu Ile Ser Val Ser Leu Ser Gly Thr Leu Ala Asn Arg Cys Lys Lys
             20                  25                  30
Ala Pro Val Lys Ser Cys Thr Glu Cys Val Arg Val Asp Lys Asp Cys
         35                  40                  45
Ala Tyr Cys Thr Asp Glu Met Phe Arg Asp Arg Arg Cys Asn Thr Gln
     50                  55                  60
Ala Glu Leu Leu Ala Ala Gly Cys Gln Arg Glu Ser Ile Val Val Met
 65                  70                  75                  80
Glu Ser Ser Phe Gln Ile Thr Glu Glu Thr Gln Ile Asp Thr Thr Leu
                 85                  90                  95
Arg Arg Ser Gln Met Ser Pro Gln Gly Leu Arg Val Arg Leu Arg Pro
            100                 105                 110
Gly Glu Glu Arg His Phe Glu Leu Glu Val Phe Glu Pro Leu Glu Ser
        115                 120                 125
Pro Val Asp Leu Tyr Ile Leu Met Asp Phe Ser Asn Ser Met Ser Asp
    130                 135                 140
Asp Leu Asp Asn Leu Lys Lys Met Gly Gln Asn Leu Ala Arg Val Leu
145                 150                 155                 160
Ser Gln Leu Thr Ser Asp Tyr Thr Ile Gly Phe Gly Lys Phe Val Asp
                165                 170                 175
Lys Val Ser Val Pro Gln Thr Asp Met Arg Pro Glu Lys Leu Lys Glu
            180                 185                 190
Pro Trp Pro Asn Ser Asp Pro Pro Phe Ser Phe Lys Asn Val Ile Ser
        195                 200                 205
Leu Thr Glu Asp Val Asp Glu Phe Arg Asn Lys Leu Gln Gly Glu Arg
    210                 215                 220
Ile Ser Gly Asn Leu Asp Ala Pro Glu Gly Gly Phe Asp Ala Ile Leu
225                 230                 235                 240
Gln Thr Ala Val Cys Thr Arg Asp Ile Gly Trp Arg Pro Asp Ser Thr
                245                 250                 255
His Leu Leu Val Phe Ser Thr Glu Ser Ala Phe His Tyr Glu Ala Asp
            260                 265                 270
Gly Ala Asn Val Leu Ala Gly Ile Met Ser Arg Asn Asp Glu Arg Cys
        275                 280                 285
His Leu Asp Thr Thr Gly Thr Tyr Thr Gln Tyr Arg Thr Gln Asp Tyr
    290                 295                 300
Pro Ser Val Pro Thr Leu Val Arg Leu Leu Ala Lys His Asn Ile Ile
305                 310                 315                 320
Pro Ile Phe Ala Val Thr Asn Tyr Ser Tyr Ser Tyr Tyr Glu Lys Leu
                325                 330                 335
His Thr Tyr Phe Pro Val Ser Ser Leu Gly Val Leu Gln Glu Asp Ser
            340                 345                 350
Ser Asn Ile Val Glu Leu Leu Glu Glu Ala Phe Asn Arg Ile Arg Ser
        355                 360                 365
Asn Leu Asp Ile Arg Ala Leu Asp Ser Pro Arg Gly Leu Arg Thr Glu
    370                 375                 380
Val Thr Ser Lys Met Phe Gln Lys Thr Arg Thr Gly Ser Phe His Ile
385                 390                 395                 400
Arg Arg Gly Glu Val Gly Ile Tyr Gln Val Gln Leu Arg Ala Leu Glu
                405                 410                 415
His Val Asp Gly Thr His Val Cys Gln Leu Pro Glu Asp Gln Lys Gly
            420                 425                 430
Asn Ile His Leu Lys Pro Ser Phe Ser Asp Gly Leu Lys Met Asp Ala
        435                 440                 445
Gly Ile Ile Cys Asp Val Cys Thr Cys Glu Leu Gln Lys Glu Val Arg
    450                 455                 460
Ser Ala Arg Cys Ser Phe Asn Gly Asp Phe Val Cys Gly Gln Cys Val
465                 470                 475                 480
Cys Ser Glu Gly Trp Ser Gly Gln Thr Cys Asn Cys Ser Thr Gly Ser
                485                 490                 495
Leu Ser Asp Ile Gln Pro Cys Leu Arg Glu Gly Glu Asp Lys Pro Cys
            500                 505                 510
Ser Gly Arg Gly Glu Cys Gln Cys Gly His Cys Val Cys Tyr Gly Glu
        515                 520                 525
Gly Arg Tyr Glu Gly Gln Phe Cys Glu Tyr Asp Asn Phe Gln Cys Pro
    530                 535                 540
Arg Thr Ser Gly Phe Leu Cys Asn Asp Arg Gly Arg Cys Ser Met Gly
545                 550                 555                 560
Gln Cys Val Cys Glu Pro Gly Trp Thr Gly Pro Ser Cys Asp Cys Pro
                565                 570                 575
Leu Ser Asn Ala Thr Cys Ile Asp Ser Asn Gly Gly Ile Cys Asn Gly
            580                 585                 590
Arg Gly His Cys Glu Cys Gly Arg Cys His Cys His Gln Gln Ser Leu
        595                 600                 605
Tyr Thr Asp Thr Ile Cys Glu Ile Asn Tyr Ser Ala Ile His Pro Gly
    610                 615                 620
Leu Cys Glu Asp Leu Arg Ser Cys Val Gln Cys Gln Ala Trp Gly Thr
625                 630                 635                 640
Gly Glu Lys Lys Gly Arg Thr Cys Glu Glu Cys Asn Phe Lys Val Lys
                645                 650                 655
Met Val Asp Glu Leu Lys Arg Ala Glu Glu Val Val Val Arg Cys Ser
            660                 665                 670
Phe Arg Asp Glu Asp Asp Asp Cys Thr Tyr Ser Tyr Thr Met Glu Gly
        675                 680                 685
Asp Gly Ala Pro Gly Pro Asn Ser Thr Val Leu Val His Lys Lys Lys
    690                 695                 700
Asp Cys Pro Pro Gly Ser Phe Trp Trp Leu Ile Pro Leu Leu Leu Leu
705                 710                 715                 720
Leu Leu Pro Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Cys Trp Lys Tyr Cys
                725                 730                 735
Ala Cys Cys Lys Ala Cys Leu Ala Leu Leu Pro Cys Cys Asn Arg Gly
            740                 745                 750
His Met Val Gly Phe Lys Glu Asp His Tyr Met Leu Arg Glu Asn Leu
        755                 760                 765
Met Ala Ser Asp His Leu Asp Thr Pro Met Leu Arg Ser Gly Asn Leu
    770                 775                 780
Lys Gly Arg Asp Val Val Arg Trp Lys Val Thr Asn Asn Met Gln Arg
785                 790                 795                 800
Pro Gly Phe Ala Thr His Ala Ala Ser Ile Asn Pro Thr Glu Leu Val
                805                 810                 815
Pro Tyr Gly Leu Ser Leu Arg Leu Ala Arg Leu Cys Thr Glu Asn Leu
            820                 825                 830
Leu Lys Pro Asp Thr Arg Glu Cys Ala Gln Leu Arg Gln Glu Val Glu
        835                 840                 845
Glu Asn Leu Asn Glu Val Tyr Arg Gln Ile Ser Gly Val His Lys Leu
    850                 855                 860
Gln Gln Thr Lys Phe Arg Gln Gln Pro Asn Ala Gly Lys Lys Gln Asp
865                 870                 875                 880
His Thr Ile Val Asp Thr Val Leu Met Ala Pro Arg Ser Ala Lys Pro
                885                 890                 895
Ala Leu Leu Lys Leu Thr Glu Lys Gln Val Glu Gln Arg Ala Phe His
            900                 905                 910
Asp Leu Lys Val Ala Pro Gly Tyr Tyr Thr Leu Thr Ala Asp Gln Asp
        915                 920                 925
Ala Arg Gly Met Val Glu Phe Gln Glu Gly Val Glu Leu Val Asp Val
    930                 935                 940
Arg Val Pro Leu Phe Ile Arg Pro Glu Asp Asp Asp Glu Lys Gln Leu
945                 950                 955                 960
Leu Val Glu Ala Ile Asp Val Pro Ala Gly Thr Ala Thr Leu Gly Arg
                965                 970                 975
Arg Leu Val Asn Ile Thr Ile Ile Lys Glu Gln Ala Arg Asp Val Val
            980                 985                 990
Ser Phe Glu Gln Pro Glu Phe Ser Val Ser Arg Gly Asp Gln Val Ala
        995                1000                1005
Arg Ile Pro Val Ile Arg Arg Val Leu Asp Gly Gly Lys Ser Gln Val
   1010                1015                1020
Ser Tyr Arg Thr Gln Asp Gly Thr Ala Gln Gly Asn Arg Asp Tyr Ile
1025               1030                1035                1040
Pro Val Glu Gly Glu Leu Leu Phe Gln Pro Gly Glu Ala Trp Lys Glu
               1045                1050                1055
Leu Gln Val Lys Leu Leu Glu Leu Gln Glu Val Asp Ser Leu Leu Arg
           1060                1065                1070
Gly Arg Gln Val Arg Arg Phe His Val Gln Leu Ser Asn Pro Lys Phe
       1075                1080                1085
Gly Ala His Leu Gly Gln Pro His Ser Thr Thr Ile Ile Ile Arg Asp
   1090                1095                1100
Pro Asp Glu Leu Asp Arg Ser Phe Thr Ser Gln Met Leu Ser Ser Gln
1105               1110                1115                1120
Pro Pro Pro His Gly Asp Leu Gly Ala Pro Gln Asn Pro Asn Ala Lys
               1125                1130                1135
Ala Ala Gly Ser Arg Lys Ile His Phe Asn Trp Leu Pro Pro Ser Gly
           1140                1145                1150
Lys Pro Met Gly Tyr Arg Val Lys Tyr Trp Ile Gln Gly Asp Ser Glu
       1155                1160                1165
Ser Glu Ala His Leu Leu Asp Ser Lys Val Pro Ser Val Glu Leu Thr
   1170                1175                1180
Asn Leu Tyr Pro Tyr Cys Asp Tyr Glu Met Lys Val Cys Ala Tyr Gly
1185               1190                1195                1200
Ala Gln Gly Glu Gly Pro Tyr Ser Ser Leu Val Ser Cys Arg Thr His
               1205                1210                1215
Gln Glu Val Pro Ser Glu Pro Gly Arg Leu Ala Phe Asn Val Val Ser
           1220                1225                1230
Ser Thr Val Thr Gln Leu Ser Trp Ala Glu Pro Ala Glu Thr Asn Gly
       1235                1240                1245
Glu Ile Thr Ala Tyr Glu Val Cys Tyr Gly Leu Val Asn Asp Asp Asn
   1250                1255                1260
Arg Pro Ile Gly Pro Met Lys Lys Val Leu Val Asp Asn Pro Lys Asn
1265               1270                1275                1280
Arg Met Leu Leu Ile Glu Asn Leu Arg Glu Ser Gln Pro Tyr Arg Tyr
               1285                1290                1295
Thr Val Lys Ala Arg Asn Gly Ala Gly Trp Gly Pro Glu Arg Glu Ala
           1300                1305                1310
Ile Ile Asn Leu Ala Thr Gln Pro Lys Arg Pro Met Ser Ile Pro Ile
       1315                1320                1325
Ile Pro Asp Ile Pro Ile Val Asp Ala Gln Ser Gly Glu Asp Tyr Asp
   1330                1335                1340
Ser Phe Leu Met Tyr Ser Asp Asp Val Leu Arg Ser Pro Ser Gly Ser
1345               1350                1355                1360
Gln Arg Pro Ser Val Ser Asp Asp Thr Gly Cys Gly Trp Lys Phe Glu
               1365                1370                1375
Pro Leu Leu Gly Glu Glu Leu Asp Leu Arg Arg Val Thr Trp Arg Leu
           1380                1385                1390
Pro Pro Glu Leu Ile Pro Arg Leu Ser Ala Ser Ser Gly Arg Ser Ser
       1395                1400                1405
Asp Ala Glu Ala Pro Thr Ala Pro Arg Thr Thr Ala Ala Arg Ala Gly
   1410                1415                1420
Arg Ala Ala Ala Val Pro Arg Ser Ala Thr Pro Gly Pro Pro Gly Glu
1425               1430                1435                1440
His Leu Val Asn Gly Arg Met Asp Phe Ala Phe Pro Gly Ser Thr Asn
               1445                1450                1455
Ser Leu His Arg Met Thr Thr Thr Ser Ala Ala Ala Tyr Gly Thr His
           1460                1465                1470
Leu Ser Pro His Val Pro His Arg Val Leu Ser Thr Ser Ser Thr Leu
       1475                1480                1485
Thr Arg Asp Tyr Asn Ser Leu Thr Arg Ser Glu His Ser His Ser Thr
   1490                1495                1500
Thr Leu Pro Arg Asp Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Val Ser Ser His Gly
1505               1510                1515                1520
Leu Pro Pro Ile Trp Glu His Gly Arg Ser Arg Leu Pro Leu Ser Trp
               1525                1530                1535
Ala Leu Gly Ser Arg Ser Arg Ala Gln Met Lys Gly Phe Pro Pro Ser
           1540                1545                1550
Arg Gly Pro Arg Asp Ser Ile Ile Leu Ala Gly Arg Pro Ala Ala Pro
       1555                1560                1565
Ser Trp Gly Pro Asp Ser Arg Leu Thr Ala Gly Val Pro Asp Thr Pro
   1570                1575                1580
Thr Arg Leu Val Phe Ser Ala Leu Gly Pro Thr Ser Leu Arg Val Ser
1585               1590                1595                1600
Trp Gln Glu Pro Arg Cys Glu Arg Pro Leu Gln Gly Tyr Ser Val Glu
               1605                1610                1615
Tyr Gln Leu Leu Asn Gly Gly Glu Leu His Arg Leu Asn Ile Pro Asn
           1620                1625                1630
Pro Ala Gln Thr Ser Val Val Val Glu Asp Leu Leu Pro Asn His Ser
       1635                1640                1645
Tyr Val Phe Arg Val Arg Ala Gln Ser Gln Glu Gly Trp Gly Arg Glu
   1650                1655                1660
Arg Glu Gly Val Ile Thr Ile Glu Ser Gln Val His Pro Gln Ser Pro
1665               1670                1675                1680
Leu Cys Pro Leu Pro Gly Ser Ala Phe Thr Leu Ser Thr Pro Ser Ala
               1685                1690                1695
Pro Gly Pro Leu Val Phe Thr Ala Leu Ser Pro Asp Ser Leu Gln Leu
           1700                1705                1710
Ser Trp Glu Arg Pro Arg Arg Pro Asn Gly Asp Ile Val Gly Tyr Leu
       1715                1720                1725
Val Thr Cys Glu Met Ala Gln Gly Gly Gly Pro Ala Thr Ala Phe Arg
   1730                1735                1740
Val Asp Gly Asp Ser Pro Glu Ser Arg Leu Thr Val Pro Gly Leu Ser
1745               1750                1755                1760
Glu Asn Val Pro Tyr Lys Phe Lys Val Gln Ala Arg Thr Thr Glu Gly
               1765                1770                1775
Phe Gly Pro Glu Arg Glu Gly Ile Ile Thr Ile Glu Ser Gln Asp Gly
           1780                1785                1790
Gly Pro Phe Pro Gln Leu Gly Ser Arg Ala Gly Leu Phe Gln His Pro
       1795                1800                1805
Leu Gln Ser Glu Tyr Ser Ser Ile Thr Thr Thr His Thr Ser Ala Thr
   1810                1815                1820
Glu Pro Phe Leu Val Asp Gly Pro Thr Leu Gly Ala Gln His Leu Glu
1825               1830                1835                1840
Ala Gly Gly Ser Leu Thr Arg His Val Thr Gln Glu Phe Val Ser Arg
               1845                1850                1855
Thr Leu Thr Thr Ser Gly Thr Leu Ser Thr His Met Asp Gln Gln Phe
           1860                1865                1870
Phe Gln Thr
       1875
<210>5
<211>8
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第61-68位氨基酸
<400>5
Leu Leu Leu Val Gly Ala Pro Arg
                  5
<210>6
<211>20
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第77-96位氨基酸
<400>6
Ala Asn Arg Thr Gly Gly Leu Tyr Ser Cys Asp Ile Thr Ala Arg Gly
  1               5                  10                  15
Pro Cys Thr Arg
             20
<210>7
<211>10
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第128-137位氨基酸
<400>7
Val Val Thr Cys Ala His Arg Tyr Glu Lys
  1               5                  10
<210>8
<211>7
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第138-144位氨基酸
<400>8
Arg Gln His Val Asn Thr Lys
  1               5
<210>9
<211>9
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第154-162位氨基酸
<400>9
Cys Tyr Val Leu Ser Gln Asn Leu Arg
  1               5
<210>10
<211>14
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第185-198位氨基酸
<400>10
Phe Gly Ser Cys Gln Gln Gly Val Ala Ala Thr Phe Thr Lys
  1               5                  10
<210>11
<211>16
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第199-214位氨基酸
<400>11
Asp Phe His Tyr Ile Val Phe Gly Ala Pro Gly Thr Tyr Asn Trp Lys
  1               5                  10                  15
<210>12
<211>11
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第272-282位氨基酸
<400>12
Asp Glu Ile Thr Phe Val Ser Gly Ala Pro Arg
  1               5                  10
<210>13
<211>11
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第283-293位氨基酸
<400>13
Ala Asn His Ser Gly Ala Val Val Leu Leu Lys
  1               5                  10
<210>14
<211>16
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第328-343位氨基酸
<400>14
Asp Gly Trp Gln Asp Ile Val Ile Gly Ala Pro Gln Tyr Phe Asp Arg
  1               5                  10                  15
<210>15
<211>17
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第344-360位氨基酸
<400>15
Asp Gly Glu Val Gly Gly Ala Val Tyr Val Tyr Met Asn Gln Gln Gly
  1               5                  10                  15
Arg
<210>16
<211>8
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第361-368位氨基酸
<400>16
Trp Asn Asn Val Lys Pro Ile Arg
  1               5
<210>17
<211>24
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第383-406位氨基酸
<400>17
Asn Ile Gly Asp Ile Asn Gln Asp Gly Tyr Pro Asp Ile Ala Val Gly
  1               5                  10                  15
Ala Pro Tyr Asp Asp Leu Gly Lys
             20
<210>18
<211>18
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第427-444位氨基酸
<400>18
Gly Ile Ser Pro Tyr Phe Gly Tyr Ser Ile Ala Gly Asn Met Asp Leu
  1               5                  10                  15
Asp Arg
<210>19
<211>19
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第445-463位氨基酸
<400>19
Asn Ser Tyr Pro Asp Val Ala Val Gly Ser Leu Ser Asp Ser Val Thr
  1               5                  10                  15
Ile Phe Arg
<210>20
<211>9
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第464-472位氨基酸
<400>20
Ser Arg Pro Val Ile Asn Ile Gln Lys
  1               5
<210>21
<211>18
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第577-594位氨基酸
<400>21
Leu Arg Pro Ile Pro Ile Thr Ala Ser Val Glu Ile Gln Glu Pro Ser
  1               5                  10                  15
Ser Arg
<210>22
<211>17
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第597-613位氨基酸
<400>22
Val Asn Ser Leu Pro Glu Val Leu Pro Ile Leu Asn Ser Asp Glu Pro
  1               5                  10                  15
Lys
<210>23
<211>10
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第614-623位氨基酸
<400>23
Thr Ala His Ile Asp Val His Phe Leu Lys
  1               5                  10
<210>24
<211>8
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第652-659位氨基酸
<400>24
Phe Ser Tyr Leu Pro Ile Gln Lys
  1               5
<210>25
<211>16
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第671-686位氨基酸
<400>25
Asp Ile Ala Leu Glu Ile Thr Val Thr Asn Ser Pro Ser Asn Pro Arg
  1               5                  10                  15
<210>26
<211>14
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第822-835位氨基酸
<400>26
Ser Glu Asp Glu Val Gly Ser Leu Ile Glu Tyr Glu Phe Arg
  1               5                  10
<210>27
<211>15
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第871-885位氨基酸
<400>27
Val Glu Ser Lys Gly Leu Glu Lys Val Thr Cys Glu Pro Gln Lys
  1               5                  10                  15
<210>28
<211>13
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第902-914位氨基酸
<400>28
Arg Glu Ile Thr Glu Lys Gln Ile Asp Asp Asn Arg Lys
  1               5                  10
<210>29
<211>7
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第915-921位氨基酸
<400>29
Phe Ser Leu Phe Ala Glu Arg
  1               5
<210>30
<211>16
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第923-938位氨基酸
<400>30
Tyr Gln Thr Leu Asn Cys Ser Val Asn Val Asn Cys Val Asn Ile Arg
  1               5                  10                  15
<210>31
<211>9
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第968-976位氨基酸
<400>31
Leu Asn Tyr Leu Asp Ile Leu Met Arg
  1               5
<210>32
<211>13
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第977-989位氨基酸
<400>32
Ala Phe Ile Asp Val Thr Ala Ala Ala Glu Asn Ile Arg
  1               5                  10
<210>33
<211>9
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：3第990-998位氨基酸
<400>33
Leu Pro Asn Ala Gly Thr Gln Val Arg
  1               5
<210>34
<211>12
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：4第178-189位氨基酸
<400>34
Val Ser Val Pro Gln Thr Asp Met Arg Pro Glu Lys
  1               5                  10
<210>35
<211>13
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：4第192-204位氨基酸
<400>35
Glu Pro Trp Pro Asn Ser Asp Pro Pro Phe Ser Phe Lys
  1               5                  10
<210>36
<211>13
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：4第205-217位氨基酸
<400>36
Asn Val Ile Ser Leu Thr Glu Asp Val Asp Glu Phe Arg
  1               5                  10
<210>37
<211>12
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：4第301-312位氨基酸
<400>37
Thr Gln Asp Tyr Pro Ser Val Pro Thr Leu Val Arg
  1               5                  10
<210>38
<211>12
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：4第402-413位氨基酸
<400>38
Arg Gly Glu Val Gly Ile Tyr Gln Val Gln Leu Arg
  1               5                  10
<210>39
<211>18
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：4第414-431位氨基酸
<400>39
Ala Leu Glu His Val Asp Gly Thr His Val Cys Gln Leu Pro Glu Asp
  1               5                  10                  15
Gln Lys
<210>40
<211>14
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：4第432-445位氨基酸
<400>40
Gly Asn Ile His Leu Lys Pro Ser Phe Ser Asp Gly Leu Lys
  1               5                  10
<210>41
<211>16
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：4第446-461位氨基酸
<400>41
Met Asp Ala Gly Ile Ile Cys Asp Val Cys Thr Cys Glu Leu Gln Lys
  1               5                  10                  15
<210>42
<211>15
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：4第531-545位氨基酸
<400>42
Tyr Glu Gly Gln Phe Cys Glu Tyr Asp Asn Phe Gln Cys Pro Arg
  1               5                  10                  15
<210>43
<211>16
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：4第631-646位氨基酸
<400>43
Ser Cys Val Gln Cys Gln Ala Trp Gly Thr Gly Glu Lys Lys Gly Arg
  1               5                  10                  15
<210>44
<211>28
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：4第675-702位氨基酸
<400>44
Asp Glu Asp Asp Asp Cys Thr Tyr Ser Tyr Thr Met Glu Gly Asp Gly
  1               5                  10                  15
Ala Pro Gly Pro Asn Ser Thr Val Leu Val His Lys
             20                  25
<210>45
<211>12
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：4第845-856位氨基酸
<400>45
Gln Glu Val Glu Glu Asn Leu Asn Glu Val Tyr Arg
  1               5                  10
<210>46
<211>15
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：4第916-930位氨基酸
<400>46
Val Ala Pro Gly Tyr Tyr Thr Leu Thr Ala Asp Gln Asp Ala Arg
  1               5                  10                  15
<210>47
<211>13
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：4第946-958位氨基酸
<400>47
Val Pro Leu Phe Ile Arg Pro Glu Asp Asp Asp Glu Lys
  1               5                  10
<210>48
<211>14
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：4第990-1003位氨基酸
<400>48
Asp Val Val Ser Phe Glu Gln Pro Glu Phe Ser Val Ser Arg
  1               5                  10
<210>49
<211>12
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：4第1061-1072位氨基酸
<400>49
Leu Leu Glu Leu Gln Glu Val Asp Ser Leu Leu Arg
  1               5                  10
<210>50
<211>19
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：4第1196-1214位氨基酸
<400>50
Val Cys Ala Tyr Gly Ala Gln Gly Glu Gly Pro Tyr Ser Ser Leu Val
  1               5                  10                  15
Ser Cys Arg
<210>51
<211>9
<212>PRT
<213>人
<223>SEQ ID NO：4第1273-1281位氨基酸
<400>51
Val Leu Val Asp Asn Pro Lys Asn Arg
  1               5

Claims (45)

1.抗体、衍生物或其片段，具有展示于人胃肠上皮肿瘤细胞中和人胃肠上皮肿瘤细胞细胞表面上及正常人胃肠上皮细胞亚群中的靶结构的结合结构，所述结合结构含有轻链中包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第23-33(CDR1)、49-55(CDR2)、88-98(CDR3)位氨基酸的互补决定区(CDR)序列，和重链中包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第158-162(CDR1)、177-193(CDR2)和226-238(CDR3)位氨基酸的CDR序列。
2.根据权利要求1的抗体，其是噬菌体选择的。
3.根据权利要求1的抗体，其中所述序列是Macaca fascicularis来源的。
4.根据权利要求1的抗体的衍生物，其是人来源的。
5.根据权利要求1的抗体，其中所述序列与相应的人来源的序列有至少84％的同一性。
6.根据权利要求1的抗体，其在人中有低免疫原性或无免疫原性。
7.根据权利要求1的抗体，其已通过基因上连接到其它多肽，和/或通过化学偶联到有机或无机化学分子，和/或通过二聚化、寡聚化或多聚化被衍生化。
8.根据权利要求1的抗体，其在基因上连接到或化学偶联到细胞毒性多肽或细胞毒性有机或无机化学分子上。
9.根据权利要求1的抗体，其在基因上连接到或化学偶联到生物学活性分子上。
10.根据权利要求1的抗体，其在基因上连接到或化学偶联到免疫活化分子上。
11.根据权利要求1的抗体，其已被改变以提高或降低其抗体亲抗原性和/或亲和力。
12.根据权利要求1的抗体，其已被改变以提高其产率。
13.根据权利要求1的抗体，其已被改变以影响其药代动力学特性。
14.根据权利要求1的抗体，其已被改变以赋予其新的药代动力学特性。
15.根据权利要求1的抗体，其被标记，并且其结合被非标记形式的所述抗体抑制而不被其它结合结构抑制，并且不抑制有其它结合特异性的其它结合结构的结合。
16.根据权利要求1的抗体，其中所述结合结构识别非还原形式的α6β4整联蛋白。
17.展示于肿瘤细胞中或表面上的靶结构，所述靶结构
a)能被权利要求1-14之任意一项限定的抗体的结合结构特异地阻断，并能特异地阻断之，
b)展示于人胃肠上皮细胞中和表面上，
c)与α6和/或β4整联蛋白链或其变异体基本同源，代表共有的或独特的表位，
d)在肿瘤细胞表面上高表达，并且
e)是细胞毒性效应机制的靶子。
18.根据权利要求17的靶结构，其中该结合结构被标记并且其结合被非标记形式的所述结合结构抑制而不被其它结合结构抑制，并且不抑制有其它结合特异性的其它结合结构的结合。
19.根据权利要求17的靶结构，其中所述结合结构含有包含SEQ IDNO：2所示氨基酸序列第23-33、49-55、88-98、158-162、177-193和226-238位氨基酸的一个或更多个互补决定区(CDR)序列。
20.根据权利要求17的靶结构，其中所述结合结构是抗体。
21.根据权利要求20的靶结构，其中所述抗体含有包含SEQ IDNO：2所示氨基酸序列第1-109位氨基酸的轻链可变区，和包含SEQ IDNO：2所示氨基酸序列第128-249位氨基酸的重链可变区。
22.根据权利要求17-21之任意一项的靶结构，其在人结肠上皮细胞中均一地表达，在胰腺管和胆管细胞中表达较低。
23.根据权利要求17-22之任意一项的靶结构，其表达与胃肠上皮分化相关联。
24.根据权利要求17-23之任意一项的靶结构，其包含SEQ ID NO：3所示α6整联蛋白和/或SEQ ID NO：4所示β4整联蛋白的氨基酸序列，和/或其一个或更多个片段，和/或拼接变体，和/或亚单位。
25.根据权利要求24的靶结构，其包含所述α6β4整联蛋白和/或其所述的一个或更多个片段和/或变体和/或亚单位的同型或异型单体或同型或异型多聚体。
26.根据权利要求24的靶结构，其在非还原形式下的表观分子量为90-140kDa。
27.权利要求26的靶结构，其在非还原形式下的表观分子量为80-160kDa。
28.根据权利要求24的靶结构，其含有包含SEQ ID Nos：5-51所示氨基酸序列之任一个的肽或多肽，或含有与所述多肽复合的分子。
29.根据权利要求24-28之任意一项的靶结构，其在还原形式被权利要求1-16之任意一项所定义的抗体包含的结合结构唯一或不唯一地识别。
30.一种药物组合物，其包含权利要求1-16之任意一项中所定义的抗体作为有效成分。
31.一种药物组合物，其包含权利要求17-29之任意一项中所定义的靶结构作为有效成分。
32.一种疫苗组合物，其包含权利要求1-16之任意一项中所定义的抗体或权利要求17-29之任意一项所定义的靶结构作为有效成分。
33.权利要求1-16之任意一项中所定义的抗体或权利要求17-29之任意一项中所定义的靶结构在制备用于施用给实施对象人以基于抗血管扩张机制治疗疾病的药物中的用途。
34.权利要求1-16之任意一项中所定义的抗体在制备用于治疗人转移性疾病的药物中的用途。
35.一种人恶性疾病体外组织病理诊断和预后的方法，其中将样品与权利要求1-17之任意一项中所定义的抗体和指示剂接触。
36.根据权利要求35的方法，该方法包括肿瘤分型。
37.根据权利要求35的方法，该方法包括肿瘤筛选。
38.根据权利要求35的方法，该方法包括肿瘤诊断和预后。
39.根据权利要求35的方法，该方法包括监测恶化前疾病。
40.一种人恶性疾病体外诊断和预后的方法，其中测定体液中包含权利要求17-29之任意一项所定义的靶结构的抗原的浓度。
41.一种人恶性疾病体外诊断和预后的方法，其中测定体液中权利要求1-16之任意一项所定义的抗体的浓度。
42.一种人恶性疾病体外诊断和预后的方法，其中测定体液中a)包含权利要求17-29之任意一项所定义的靶结构的抗原，和b)权利要求1-16之任意一项所定义的抗体的复合物的浓度。
43.权利要求1-16之任意一项所定义的抗体在制备用于治疗人恶性疾病的药物中的用途。
44.根据权利要求43的用途，其中所述抗体通过在基因上连接到这样的分子上而被改变，该分子赋予联合分子改变的药代动力学性质。
45.根据权利要求43的用途，其中所述抗体通过衍生而被改变。
CNB008148864A 1999-10-28 2000-10-26 涉及α6β4整联蛋白的人胃肠上皮肿瘤抗原的抗体 Expired - Fee Related CN1229391C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE9903895A SE9903895D0 (sv) 1999-10-28 1999-10-28 Novel compounds
SE99038952 1999-10-28

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1384840A CN1384840A (zh) 2002-12-11
CN1229391C true CN1229391C (zh) 2005-11-30

Family

ID=20417520

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB008148864A Expired - Fee Related CN1229391C (zh) 1999-10-28 2000-10-26 涉及α6β4整联蛋白的人胃肠上皮肿瘤抗原的抗体

Country Status (18)

Country Link
US (2) US7189816B1 (zh)
EP (1) EP1232186A2 (zh)
JP (1) JP2003513024A (zh)
KR (1) KR20020047288A (zh)
CN (1) CN1229391C (zh)
AU (1) AU773568B2 (zh)
BR (1) BR0015103A (zh)
CA (1) CA2386926A1 (zh)
EE (1) EE200200224A (zh)
HU (1) HUP0203297A2 (zh)
IL (1) IL149245A0 (zh)
NO (1) NO20021436L (zh)
NZ (1) NZ518300A (zh)
PL (1) PL354508A1 (zh)
RU (1) RU2266298C2 (zh)
SE (1) SE9903895D0 (zh)
WO (1) WO2001030854A2 (zh)
ZA (1) ZA200202221B (zh)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SE0102327D0 (sv) 2001-06-28 2001-06-28 Active Biotech Ab A novel engineered superantigen for human therapy
TWI671403B (zh) 2005-03-31 2019-09-11 中外製藥股份有限公司 控制組裝之多肽的製造方法
WO2007008943A2 (en) 2005-07-08 2007-01-18 Xencor, Inc. Optimized anti-ep-cam antibodies
US7956162B2 (en) * 2005-12-21 2011-06-07 Viventia Biotechnologies Inc. Cancer-associated antigen
DK2009101T3 (en) 2006-03-31 2018-01-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antibody modification method for purification of a bispecific antibody
DK3056568T3 (da) 2006-03-31 2021-11-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fremgangsmåder til kontrollering af antistoffers blodfarmakokinetik
SI2472264T1 (sl) * 2007-02-27 2016-06-30 SentoClone International AB Karolinska Institute Science Park Multipleksna detekcija tumorskih celic z uporabo plošč vezavnih sredstev na zunajcelične markerje
EP3689912A1 (en) 2007-09-26 2020-08-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr
KR102467302B1 (ko) 2007-09-26 2022-11-14 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항체 정상영역 개변체
GB0719231D0 (en) 2007-10-03 2007-11-14 Oxford Genome Sciences Uk Ltd Protein
KR101840994B1 (ko) 2007-12-05 2018-03-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항ｎｒ１０ 항체 및 그의 이용
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
EP3674317B1 (en) 2009-03-19 2024-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
US9228017B2 (en) 2009-03-19 2016-01-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variant
TW201041595A (en) 2009-05-15 2010-12-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-axl antibody
US10150808B2 (en) 2009-09-24 2018-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
JP5889181B2 (ja) 2010-03-04 2016-03-22 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
CA2817964C (en) 2010-11-17 2018-06-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Multi-specific antigen-binding molecule having alternative function to function of blood coagulation factor viii
SG192945A1 (en) 2011-02-25 2013-09-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fcgriib-specific fc antibody
TW201817744A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
JP6322411B2 (ja) 2011-09-30 2018-05-09 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
EP3050896B1 (en) 2013-09-27 2021-07-07 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide heteromultimer
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
BR112017011235A2 (pt) 2014-12-19 2018-02-06 Chugai Pharmaceutical Co Ltd anticorpos anti-c5 e métodos de uso
EP4600372A3 (en) 2014-12-19 2025-11-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies, polypeptides containing variant fc regions, and methods of use
CN114773469B (zh) 2015-02-05 2025-12-19 中外制药株式会社 包含离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗体，fc区变体，il-8-结合抗体及其应用
TWI805046B (zh) 2015-02-27 2023-06-11 日商中外製藥股份有限公司 Il-6受體抗體用於製備醫藥組成物的用途
EP3279216A4 (en) 2015-04-01 2019-06-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha PROCESS FOR PREPARING POLYPEPTIDE HETERO OLIGOMER
MA44334A (fr) 2015-10-29 2018-09-05 Novartis Ag Conjugués d'anticorps comprenant un agoniste du récepteur de type toll
WO2017110981A1 (en) 2015-12-25 2017-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
BR112018009312A8 (pt) 2015-12-28 2019-02-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd método para promover eficiência de purificação de polipeptídeo contendo região de fc
BR112018068363A2 (pt) 2016-03-14 2019-01-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha fármaco terapêutico indutor de dano celular para uso em terapia de câncer
MX2018012648A (es) 2016-04-28 2019-01-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Preparaciones que contienen anticuerpos.
KR102102734B1 (ko) 2016-08-05 2020-04-22 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Il-8 관련 질환의 치료용 또는 예방용 조성물
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
MX2020003472A (es) 2017-11-01 2020-08-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Variante e isoforma de anticuerpos con actividad biologica reducida.

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5320942A (en) * 1987-02-19 1994-06-14 Vito Quaranta Method of diagnosing the presence of abnormal epithelial tissue using monoclonal antibodies to the A6 B4 cell surface protein
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
WO1994004679A1 (en) * 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
CA2078817A1 (en) 1991-10-18 1993-04-19 Beat A. Imhof Anti-.alpha.6-integrin-antibodies
US6113898A (en) * 1995-06-07 2000-09-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Human B7.1-specific primatized antibodies and transfectomas expressing said antibodies
GB9601081D0 (en) * 1995-10-06 1996-03-20 Cambridge Antibody Tech Specific binding members for human transforming growth factor beta;materials and methods
WO1999006834A2 (en) * 1997-08-04 1999-02-11 Ixsys, Incorporated Methods for identifying ligand specific binding molecules

Also Published As

Publication number Publication date
WO2001030854A3 (en) 2001-12-06
AU1424801A (en) 2001-05-08
US20070112179A1 (en) 2007-05-17
CN1384840A (zh) 2002-12-11
US7189816B1 (en) 2007-03-13
EP1232186A2 (en) 2002-08-21
BR0015103A (pt) 2002-07-16
RU2266298C2 (ru) 2005-12-20
IL149245A0 (en) 2002-12-01
SE9903895D0 (sv) 1999-10-28
CA2386926A1 (en) 2001-05-03
AU773568B2 (en) 2004-05-27
JP2003513024A (ja) 2003-04-08
HUP0203297A2 (hu) 2003-01-28
ZA200202221B (en) 2003-05-28
KR20020047288A (ko) 2002-06-21
NO20021436D0 (no) 2002-03-22
NO20021436L (no) 2002-06-19
WO2001030854A2 (en) 2001-05-03
NZ518300A (en) 2004-03-26
PL354508A1 (en) 2004-01-26
EE200200224A (et) 2003-06-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1229391C (zh) 涉及α6β4整联蛋白的人胃肠上皮肿瘤抗原的抗体
CN1165764C (zh) 抗psma抗体或其抗原结合部分，以及它们的用途
CN1201005C (zh) 特异性检测癌细胞的抗原结合片段、编码所述片段的dna、以及它们在预防和检测癌症上的用途
CN1878790A (zh) 可中和的hgf表位和与其结合的中和抗体
CN1606453A (zh) Cripto阻断抗体及其用途
CN1191855C (zh) 淋巴细胞系肿瘤的治疗剂
CN1756768A (zh) 诱导持久t细胞应答的三聚体多肽构建体
CN1950399A (zh) 免疫原性较弱的结合分子
CN1606569A (zh) 具有mn结合和细胞粘附中和活性的人类抗体
CN1823163A (zh) 针对胰岛素样生长因子ⅰ受体的抗体及其应用
CN1922199A (zh) Ca6抗原特异性细胞毒性偶联物及其应用方法
CN1323217A (zh) 治疗性接种的新方法
CN101044242A (zh) 肿瘤特异性抗体
CN101035809A (zh) 抗tag－72的人源化单克隆抗体
CN1596313A (zh) 人源化的胶原抗体及相关方法
CN1551783A (zh) 治疗多发性骨髓瘤的方法
CN1849137A (zh) 基于vefg,her－2,psa蛋白质异构体的用于诊断和治疗的疾病的特效试剂
CN1551886A (zh) 用于选择性癌症治疗的特异性人抗体
CN1642983A (zh) 抗C5aR抗体及其应用
CN101076542A (zh) 特异性针对肝细胞癌和其他癌的抗体及其用途
CN1151184A (zh) 对细胞周期非依赖的神经胶质瘤表面抗原特异的人单克隆抗体
CN1151377C (zh) 诊断及治疗鳞状细胞癌的方法
CN1649901A (zh) 人癌胚抗原(cea)的特异性抗体片段
CN1812999A (zh) 包含EpCAM特异构建体的药物组合物
CN1230446C (zh) 识别抗原ior c2的抗体和fv片段

Legal Events

Date Code Title Description
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20051130

Termination date: 20091126