CN1218928C - 多塞瑞龙化合物与制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
涉及一种利用真菌发酵液提取的化合物与制法及在制备抗肿瘤药物中的应用。多塞瑞龙化合物是从红树植物内生真菌-小穴壳菌HTF3的发酵液中提取分离，其制备方法为：内生真菌的种子培养，内生真菌的发酵培养，将上述培养好的发酵培养液纱布过滤除去菌体，将过滤后的发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，收集、浓缩得化合物产物。提供了一类来源于红树林内生真菌、实验中对人口腔上皮癌和淋巴瘤等有抑制作用的新结构化合物，它们可用于制备抗口腔上皮癌和淋巴瘤等的药物。化合物的制备方法简单，适于产业化生产。
Description
(1)技术领域
本发明涉及一种利用真菌发酵液提取的化合物与制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
(2)背景技术
红树林是热带和亚热带海岸潮间带特有的植物类群，是海岸重要的湿地生态系统，除分布着大量的海洋动植物和微生物外，还存在丰富的内生真菌资源。据报道(1、Strol，G.A.Endophytes as sources of bioactive products.Microbes and Infection.20035：535-544；2、Schmidt，K.，Gunther，W.，Stoyanova，S.，et al.a neurotrophicpyridone alkaloid from Paecilomvces militaris.Org Lett.2002，24；4(2)：197-199；3、Bandaranayake，W.M.Bioactivities，bioactive compounds and chemical constituentsof mangrove plants.Wetland Ecology and Management 2002，10：421-452.)世界上50％的真菌都能从红树植物中分离到，但目前对红树林内生真菌进行的系统报道相对很少，而且主要集中在生态学领域。红树植物特殊的生长环境，决定了其内生真菌有特殊的代谢途径，能产生特异结构的代谢产物。在对其次级代谢产物化学成分进行的不多的研究中，人们已发现了具有很高生理活性和全新结构的物质，例如具有选择性细胞毒性的新结构环肽类化合物等。总之对红树植物内生真菌的研究才刚刚起步，它具有较高的理论价值和实际应用价值。
(3)发明内容
本发明的目的在于提供一类新的来源于红树植物内生真菌的具有潜在药用价值的化合物及其提取分离方法，以及它们在制备抗肿瘤药物方面的应用。
本发明所说的多塞瑞龙化合物是从红树植物内生真菌一小穴壳菌HTF3(Dothiorella sp.HTF3，简称HTF3)的发酵液中提取分离到四种结构类似的化合物，结构分别为多塞瑞龙A，[3，5-二羟基-2-(7-羟基-辛酰)]-苯乙酸乙酯(记为化合物A)、多塞瑞龙B，[3，5-二羟基-2-(6-羟基-辛酰)]-苯乙酸乙酯(记为化合物B)、多瑞塞龙C，[3，5-二羟基-2-(8-羟基-辛酰)]-苯乙酸乙酯(记为化合物C)和多塞瑞龙D，6，8-二羟基-1(R)-(5-羟基-己基)-异苯并二氢吡喃-3-酮(记为化合物D)。
本发明所用的红树植物内生真菌HTF3已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉大学校内)，保藏号为CCTCC NO：M203067，保藏日期为2003年8月29日，其分类命名为小穴壳菌属(Dothiorella SP.)。
化合物A、化合物B、化合物C和化合物D的结构式分别为：
本发明所说的多塞瑞龙化合物的制备方法为：
1)内生真菌的种子培养：
培养基以克为单位：马铃薯去皮、切碎20，水煮，纱布过滤，滤液中加葡萄糖1～3，琼脂1.5-2.0，海水定容至100ml，灭菌，制成试管斜面。挑取菌种接入斜面，室温下培养5-8天；
2)内生真菌的发酵培养：
发酵培养基以克为单位：马铃薯去皮、切碎20，水煮，纱布过滤，滤液中加葡萄糖1～3，海水定容至100ml，灭菌，将斜面上培养好的菌株挑入发酵培养基，室温培养5-8天；
3)将上述培养好的发酵培养液纱布过滤除去菌体；
4)将过滤后的发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚/乙酸乙酯＝1/(0.1～4)为洗脱剂梯度洗脱；
5)收集、浓缩得化合物产物：
1、收集石油醚/乙酸乙酯为9/1的组分，浓缩后用氯仿/甲醇＝95/5为洗脱剂，高效液相色谱层析(层析柱：WAT 025821，流量：3ml/min)，收集5-6分钟和6.5-7.5分钟时的流出液，浓缩后分别得到无色的组分化合物B和化合物A。
2、石油醚/乙酸乙酯为7/1的组分，浓缩后用氯仿/甲醇＝98/2为洗脱剂，高效液相色谱层析(层析柱：WAT 025821，流量：3ml/min)，收集18-19分钟的流出液，浓缩后得到无色的油状物，为组分化合物C；
3、石油醚/乙酸乙酯为1/1的组分，浓缩后用乙酸乙酯/环己烷＝1/1为洗脱剂，高效液相色谱层析(层析柱：WAT 025821，流量：3ml/min)，收集14-15分钟的流出液，浓缩后得浅黄色的油状物，为组分化合物D。
化合物A的实验数据：
EMS：m/z(rel.int.)：339.1[M+1]+(60.9)，356.3[M+NH4]+(43.6)，361.2[M+Na]+(100)，694.2[2M+NH4]+(4.3)，698.5[2M+Na]+(58)：1H NMR and 13C NMR(400MHz，DMSO-d6)见表1和表2；
化合物B的实验数据：
EMS：m/z(rel.int.)：339.0[M+H]+(24.1)，356.3[M+NH4]+(21.8)，361.1[M+Na](21.3)，698.4[2M+Na]+(9.8)；1H NMR and 13C NMR(400MHz，CDCl3)见表1和表2；
化合物C的实验数据：Colourless oil；EMS：m/z(rel.int.)：339.3[M+H](100)；1H NMR and 13C NMR(400MHz，CDCl3)见表1和表2；
化合物D的实验数据：EMS：m/z(rel.int.)：281.0[M+H]+(90)；1H NMR and 13C NMR(400MHz，DMSO-d6)见表1和表2。
表1化合物A、B、C和D的1H-NMR数据
| Position | Aa | Bb | Cb | Da |
| 2 | 3.47(s) | 3.77(s) | 3.81(s) | 3.43(m)3.85(d，10) |
| 4 | 6.11(d，2.2) | 6.25(s) | 6.30(d，2.5) | 6.07(s) |
| 6 | 6.25(d，2.2) | 6.26(s) | 6.27(d，2.5) | 6.19(s) |
| 9 | 5.39(q，5.13，8.8) | |||
| 10 | 2.77(t，6) | 2.85(t，7.2) | 2.83(t，7) | 1.77(m，8.8，9.16)1,62(m，5.13，9.16) |
| 11 | 1.47 | 1.45 | 1.34 | 1.26 |
| 12 | 1.20 | 1.25 | 1.27 | 1.28 |
| 13 | 1.24 | 1.42 | 1.26 | 1.39 |
| 14 | 1.24 | 3.55 | 1.34 | 3.50(m) |
| 15 | 3.55(m) | 1.25(m，7.2) | 1.36 | 0.93(d) |
| 16 | 1.01(d，5.3) | 0.93(t，7.4) | 3.64(t，6.5) | |
| 17 | 3.99(q，7) | 4.18(q，7.2) | 4.18(q，7.2)) | |
| 18 | 1.14((t，7) | 1.25(t.7.2) | 1.26(t，7.2) | |
| OH-5 | 9.74 | 9.35 | ||
| OH-7 | 9.96 | 12.06(s) | 9.63 |
表2化合物A、B、C和D的13C-NMR数据
| Position | Aa | Bb | Cb | Da |
| 1 | 170.9 | 171.2 | 171.2 | 170.6 |
| 2 | 38.0 | 41.6 | 41.7 | 34.5 |
| 3 | 135.2 | 136.5 | 136.7 | 132.1 |
| 4 | 110.3 | 112.6 | 112.6 | 100.7 |
| 5 | 159.5 | 163.6 | 164.5 | 153.9 |
| 6 | 101.6 | 103.1 | 103.1 | 104.7 |
| 7 | 157.5 | 160.4 | 160.3 | 157.9 |
| 8 | 120.0 | 116.9 | 116.5 | 112.0 |
| 9 | 205.7 | 206.6 | 206.0 | 77.4 |
| 10 | 43.6 | 43.2 | 43.2 | 35.2 |
| 11 | 24.0 | 25.1 | 25.4 | 39.7 |
| 12 | 29.0 | 30.1 | 29.7 | 25.4 |
| 13 | 25.4 | 36.4 | 24.8 | 28.8 |
| 14 | 38.9 | 73.2 | 29.0 | 65.8 |
| 15 | 65.8 | 29.7 | 32.6 | 23.7 |
| 16 | 23.7 | 9.9 | 62.9 | |
| 17 | 60.0 | 61.5 | 61.5 | |
| 18 | 14.1 | 29.7 | 14.1 |
本发明所说的多塞瑞龙化合物可用于制备抗肿瘤药物。以下给出抗肿瘤活性检测实验结果。
1)肿瘤细胞株：
人B淋巴瘤Raji细胞、人口腔皮样癌KB细胞等。
2)材料
a MTT(噻唑蓝)：
用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解MTT(Thiazoyl blue)到终浓度5mg/ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃避光保存；
b SDS裂解液：
100g十二烷基磺酸钠(SDS)，1N HCl 10ml，加热溶解，蒸馏水定容至1000ml。
c 细胞培养基(全培)：
一袋10g干粉RMPI 1640(Gibco Co.Ltd.)细胞培养基溶于1L双蒸水中；加入2g NaHCO3搅匀溶解后封口，置于4℃过夜，以自然沉淀除去杂质；次日加入10-15％已灭活(56℃，30min)的小牛血清及1％多抗母液；混匀后用0.22μm孔径的滤膜过滤除菌。
3)化合物A、B、C和D的配置
分别取一定量的化合物A、B、C和D，用甲醇溶解并调整浓度为5mg/ml，0.22μm孔径的滤膜过滤除菌，4℃保存备用。
4)肿瘤细胞的培养
a 细胞活化：
取一干净烧杯，装入干净温水，水温调至37-40℃；将冻存管从液氮中取出迅速投入温水解冻，并将冻存细胞接入预装有细胞培养基的培养瓶内，在37℃、5％CO2、100％湿度的条件下培养，观察细胞生长情况，及时更换培养液、分瓶。
b 细胞计数：
选对数生成期细胞，胰酶消化，移入离心管中，加全培至10ml，取一滴滴入计数板一侧凹槽中，倒置显微镜下计数。调整细胞数至1×106/ml。
c 活性检测：
①96孔板在超净工作台内紫外光下照射1小时；
②在各孔中加入细胞悬液80μl，37℃、5％CO2、100％湿度的条件下培养24小时；
③加入20μl用全培梯度稀释成一系列浓度的A、B、C和D溶液，继续培养48小时；
④每孔加入MTT溶液10μl，轻轻震摇使颗粒溶解，37℃放置3小时；
⑤取出培养板，每孔加入10％SDS溶液100μl，37℃溶解过夜；
⑥用酶联反应仪570nm测定各孔吸光值(参比波长为655nm)，按下列公式计算抑制率：
抑制率＝(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100％
⑦以抑制率为纵坐标，受试样品浓度的对数为横坐标作图，求出抑制率为50％时的浓度即为IC50。
d 试验结果：
化合物A、B、C和D对人口腔上皮癌KB细胞的IC50分别是16μg/ml、18μg/ml、20μg/ml和20μg/ml；对人淋巴瘤Raji细胞的IC50分别是12μg/ml、9μg/ml、10μg/ml和8μg/ml。
综上所述，本发明的优点是提供了一类来源于红树林内生真菌、实验中对人口腔上皮癌和淋巴瘤等有抑制作用的新结构化合物，它们可用于制备抗口腔上皮癌和淋巴瘤等的药物。另外，这些化合物的制备方法简单，适于产业化生产。
(4)具体实施方式
实施例1
内生真菌的种子培养；将马铃薯20g去皮、切碎，水煮30min，纱布过滤，滤液中加葡萄糖1g，琼脂1.6g，50％海水定容至100ml，灭菌，制成试管斜面。挑取菌种接入斜面，25℃下培养6天。
内生真菌的发酵培养：将马铃薯20g去皮、切碎，水煮30min，纱布过滤，滤液中加葡萄糖1.5g，50％海水定容至100ml，灭菌，将斜面上培养好的菌株挑入发酵培养基，26℃培养6天。将上述培养好的发酵培养液纱布过滤除去菌体，将过滤后的发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚/乙酸乙酯＝1/1为洗脱剂梯度洗脱。
收集、浓缩得化合物产物：
1、收集石油醚/乙酸乙酯为9/1的组分，浓缩后用氯仿/甲醇＝95/5为洗脱剂，高效液相色谱层析(层析柱：WAT 025821，流量：3ml/min)，收集330s和400s时的流出液，浓缩后分别得到无色的组分化合物B和化合物A。
2、石油醚/乙酸乙酯为7/1的组分，浓缩后用氯仿/甲醇＝98/2为洗脱剂，高效液相色谱层析(层析柱：WAT 025821，流量：3ml/min)，收集1100s的流出液，浓缩后得到无色的油状物，为组分化合物C；
3、石油醚/乙酸乙酯为1/1的组分，浓缩后用乙酸乙酯/环己烷＝1/1为洗脱剂，高效液相色谱层析(层析柱：WAT 025821，流量：3ml/min)，收集880s的流出液，浓缩后得浅黄色的油状物，为组分化合物D。
实施例2
将马铃薯20g去皮、切碎，水煮30min，纱布过滤，滤液中加葡萄糖1.5g，琼脂1.8g，50％海水定容至100ml，灭菌，制成试管斜面。挑取菌种接入斜面，30℃下培养8天；再将马铃薯20g去皮、切碎，水煮30min，纱布过滤，滤液中加葡萄糖2.5g，50％海水定容至100ml，灭菌，将斜面上培养好的菌株挑入发酵培养基，20℃培养8天。将上述培养好的发酵培养液纱布过滤除去菌体。过滤后的发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚/乙酸乙酯＝1/0.1为洗脱剂梯度洗脱。
收集、浓缩得化合物产物：
1、收集石油醚/乙酸乙酯为9/1的组分，浓缩后用氯仿/甲醇＝95/5为洗脱剂，高效液相色谱层析，收集310s和420s时的流出液，浓缩后分别得到无色的组分化合物B和化合物A。
2、石油醚/乙酸乙酯为7/1的组分，浓缩后用氯仿/甲醇＝98/2为洗脱剂，高效液相色谱层析，收集1140s的流出液，浓缩后得到无色的油状物，为组分化合物C；
3、石油醚/乙酸乙酯为1/1的组分，浓缩后用乙酸乙酯/环己烷＝1/1为洗脱剂，高效液相色谱层析，收集840s的流出液，浓缩后得浅黄色的油状物，为组分化合物D。
实施例3
将马铃薯20g去皮、切碎，水煮30min，纱布过滤，滤液中加葡萄糖2g，琼脂1.5g，50％海水定容至100ml，灭菌，制成试管斜面。挑取菌种接入斜面，28℃下培养5天。再将马铃薯20g去皮、切碎，水煮30min，纱布过滤，滤液中加葡萄糖2g，50％海水定容至100ml，灭菌，将斜面上培养好的菌株挑入发酵培养基，25℃培养6天。将上述培养好的发酵培养液纱布过滤除去菌体。过滤后的发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚/乙酸乙酯＝1/2为洗脱剂梯度洗脱。
收集、浓缩得化合物产物：
1、收集石油醚/乙酸乙酯为9/1的组分，浓缩后用氯仿/甲醇＝95/5为洗脱剂，高效液相色谱层析，收集360s和390s时的流出液，浓缩后分别得到无色的组分化合物B和化合物A。
2、石油醚/乙酸乙酯为7/1的组分，浓缩后用氯仿/甲醇＝98/2为洗脱剂，高效液相色谱层析，收集1080s的流出液，浓缩后得到无色的油状物，为组分化合物C；
3、石油醚/乙酸乙酯为1/1的组分，浓缩后用乙酸乙酯/环己烷＝1/1为洗脱剂，高效液相色谱层析，收集860s的流出液，浓缩后得浅黄色的油状物，为组分化合物D。
实施例4
将马铃薯20g去皮、切碎，水煮30min，纱布过滤，滤液中加葡萄糖2.5g，琼脂2.0g，50％海水定容至100ml，灭菌，制成试管斜面。挑取菌种接入斜面，20℃下培养7天。再将马铃薯20g去皮、切碎，水煮30min，纱布过滤，滤液中加葡萄糖1g，50％海水定容至100ml，灭菌，将斜面上培养好的菌株挑入发酵培养基，30℃培养5天。将上述培养好的发酵培养液纱布过滤除去菌体。过滤后的发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚/乙酸乙酯＝1/1.5为洗脱剂梯度洗脱。
收集、浓缩得化合物产物：
1、收集石油醚/乙酸乙酯为9/1的组分，浓缩后用氯仿/甲醇＝95/5为洗脱剂，高效液相色谱层析，收集300s和450s时的流出液，浓缩后分别得到无色的组分化合物B和化合物A。
2、石油醚/乙酸乙酯为7/1的组分，浓缩后用氯仿/甲醇＝98/2为洗脱剂，高效液相色谱层析，收集1120s的流出液，浓缩后得到无色的油状物，为组分化合物C；
3、石油醚/乙酸乙酯为1/1的组分，浓缩后用乙酸乙酯/环己烷＝1/1为洗脱剂，高效液相色谱层析，收集900s的流出液，浓缩后得浅黄色的油状物，为组分化合物D。
实施例5
将马铃薯20g去皮、切碎，水煮30min，纱布过滤，滤液中加葡萄糖3g，琼脂1.7g，50％海水定容至100ml，灭菌，制成试管斜面。挑取菌种接入斜面，23℃下培养6天。再将马铃薯20g去皮、切碎，水煮30min，纱布过滤，滤液中加葡萄糖3g，50％海水定容至100ml，灭菌，将斜面上培养好的菌株挑入发酵培养基，28℃培养7天。将上述培养好的发酵培养液纱布过滤除去菌体。过滤后的发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚/乙酸乙酯＝1/4为洗脱剂梯度洗脱。
收集、浓缩得化合物产物：
1、收集石油醚/乙酸乙酯为9/1的组分，浓缩后用氯仿/甲醇＝95/5为洗脱剂，高效液相色谱层析，收集340s和420s时的流出液，浓缩后分别得到无色的组分化合物B和化合物A。
2、石油醚/乙酸乙酯为7/1的组分，浓缩后用氯仿/甲醇＝98/2为洗脱剂，高效液相色谱层析，收集1100s的流出液，浓缩后得到无色的油状物，为组分化合物C；
3、石油醚/乙酸乙酯为1/1的组分，浓缩后用乙酸乙酯/环己烷＝1/1为洗脱剂，高效液相色谱层析，收集850s的流出液，浓缩后得浅黄色的油状物，为组分化合物D。
Claims (3)
1、多塞瑞龙化合物，所说的多塞瑞龙化合物是从红树植物内生真菌—小穴壳菌HTF3的发酵液中提取分离的化合物，所说的小穴壳菌HTF3的保藏号为CCTCC NO：M203067，其特征在于其结构分别为化合物A：多塞瑞龙A，[3，5-二羟基-2-(7-羟基-辛酰)]-苯乙酸乙酯、化合物B：多塞瑞龙B，[3，5-二羟基-2-(6-羟基-辛酰)]-苯乙酸乙酯、化合物C：多瑞塞龙C，[3，5-二羟基-2-(8-羟基-辛酰)]-苯乙酸乙酯和化合物D：多塞瑞龙D，6，8-二羟基-1(R)-(5-羟基-己基)-异苯并二氢吡喃-3-酮；
化合物A、化合物B、化合物C和化合物D的结构式分别为：
2、权利要求1的多塞瑞龙化合物的制备方法，其特征在于其步骤为：
1)内生真菌的种子培养：
培养基以克为单位：马铃薯去皮、切碎20，水煮，纱布过滤，滤液中加葡萄糖1～3，琼脂1.5-2.0，海水定容至100ml，灭菌，制成试管斜面，挑取菌种接入斜面，室温下培养5-8天；
2)内生真菌的发酵培养：
发酵培养基以克为单位：马铃薯去皮、切碎20，水煮，纱布过滤，滤液中加葡萄糖1～3，海水定容至100ml，灭菌，将斜面上培养好的菌株挑入发酵培养基，室温培养5-8天；
3)将上述培养好的发酵培养液纱布过滤除去菌体；
4)将过滤后的发酵液用等体积的乙酸乙酯萃取多次，浓缩乙酸乙酯，在硅胶柱中进行色谱分离，以石油醚/乙酸乙酯＝1/(0.1～4)为洗脱剂梯度洗脱；
5)收集、浓缩得化合物产物：
(1)、收集石油醚/乙酸乙酯为9/1的组分，浓缩后用氯仿/甲醇＝95/5为洗脱剂，高效液相色谱层析，收集5-6分钟和6.5-7.5分钟时的流出液，浓缩后分别得到无色的组分化合物B和化合物A；
(2)、石油醚/乙酸乙酯为7/1的组分，浓缩后用氯仿/甲醇＝98/2为洗脱剂，高效液相色谱层析，收集18-19分钟的流出液，浓缩后得到无色的油状物，为组分化合物C；
(3)、石油醚/乙酸乙酯为1/1的组分，浓缩后用乙酸乙酯/环己烷＝1/1为洗脱剂，高效液相色谱层析，收集14-15分钟的流出液，浓缩后得浅黄色的油状物，为组分化合物D。
3、权利要求1的多塞瑞龙化合物在制备用于治疗抗肿瘤药物中的用途。
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