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CN1214734A - Scf类似物组合物和方法 - Google Patents

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CN1214734A
CN1214734A CN97193342A CN97193342A CN1214734A CN 1214734 A CN1214734 A CN 1214734A CN 97193342 A CN97193342 A CN 97193342A CN 97193342 A CN97193342 A CN 97193342A CN 1214734 A CN1214734 A CN 1214734A
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卢
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Abstract

本发明涉及干细胞因子(“SCF”)类似物多肽组合物,以及用于生产本发明SCF类似物的重组DNA的载体,宿主细胞和方法。

Description

SCF类似物组合物和方法
发明领域
本发明涉及干细胞因子(“SCF”)类似物多肽组合物，以及同于产生本发明SCF类似物的重组DNA产物的载体、宿主细胞和方法。另一方面，本发明也提供了药剂组合物和使用方法。
背景：
干细胞因子(SCF，见PCT Pub.No.WO91/05795；也叫做kit-配基，见PCT Pub.No.WO92/03459，肥大细胞生长因子，见PCT Pub.No.WO92/00376,Steel因子(“SF”或“SLF”)，见White发表于1990年Cell 63卷5-6页的文章))是作用于造血祖细胞的造血因子。编码SCF的基因已被克隆和表达，例如，可见Martin等发表于1990年Cell 63卷203-211页的文章，以及PCT Pub.No.WO91/05795----它的全文以参考文献的形式引入本发明。
SCF活性的标志是原始祖细胞在骨髓和外周血中的扩展。临床上已证明，SCF在骨髓抑制引起恶病质和死亡的的疾病情况下有用。这些情况包括将SCF用于：骨髓减少化疗(myeloabative chemo-therapy)后移植时祖细胞的迁移，在自身骨髓移植时骨髓在收获以前的接触抗原，以及标准剂量的化疗或骨髓减少化疗/全身性照射后加速造血系统重建。
SCF有很多种活性形式，包括一种结合形式和一种可溶性形式。见PCT Pub.No.WO91/05795。C末端删除的类似物也有活性。例如，SCF 1-137(“1”指成熟蛋白的第一个氨基酸)有生物学活性，SCFl-141有几乎全部生物学活性。见Langley等发表于1994年Arch.Biochem.Biophys.311卷55-61页的文章。对于天然序列里10位的天冬酰胺替换成天冬氨酸(引用为“N10D”)的SCF 1-165也有研究，发现这种变化对二聚体的形成的速率无明显影响，见Lu等发表于1995年Biochem.J.305卷563-568页的文章。PCT Pub.No.WO95/26199中报告了某种共价交联的SCF二聚体。据报告，分子间的共价交联可以增加稳定性。
因为低剂量就可以达到同样的生物学效果，消费者渴望得到更高活性和稳定性的SCF类似物----例如此处提供的这些。因为高活性的产品可以使每批产品卖掉更多的单位数，生产者也渴望得到这些类似物。稳定性的增加，尤其是保质期的增加，对消费者和生产者同样特别有用。本发明具有这些优点，满足消费者和生产者的需要。
发明概述：
本发明涉及的用天冬氨酸替换10位和11位(根据图一中的编号，此处的蛋氨酸在-1位)天冬酰胺的SCF类似物。奇怪的是，也重要的是，这些替代使SCF类似物与未修饰的SCF相比活性更强，稳定性也更高。
这些类似物的发现，部分得自体外老化实验的观察结果。在此研究中发现，野生型SCF在特定的制剂缓冲液中，高度不稳定。据推测，这些野生型SCF的保质期较短。目前已发现，野生型SCF的不稳定性是由于10位(根据图一中的成熟蛋白)的天冬氨酰基(天冬酰胺，ASN,”N”)的脱酰胺反应。脱酰胺也使脱酰胺的天冬氨酰基靠α/β肽键位移而同聚化。同聚化的一类SCF没有生物学活性。由于分子结构的微细变化，它们还具有存在抗原性的危险。如下所示，这里所提供的类似物比野生型更稳定，生物学活性更强，也避免了脱酰胺引起的危险。
本发明的其它方面包括编码本发明SCF类似物的核酸，和用于生产本发明SCF类似物的重组DNA的载体，宿主细胞和方法。另一方面，本发明也提供了药物组合物和使用方法。
附图简述：
图一所示是膜结合型的人重组SCF的氨基酸1-248的序列
图二的曲线图说明了完整蛋白/类似物在快速稳定性分析中的相对量(见下)。样品在37℃孵育1-5天，然后分析降解产物，检测的样品是(a)“rhSCF，野生型”，重组的人类met-1 SCF 1-165,(b)“N10D,N11D变异体”，10和11位为天冬氨酸残基的重组人类met-1SCF 1-165；(c)“N10D变异体”，除了仅10位为天冬氨酸外和(b)相同；(d)“N10E变异体”，除了10位为谷氨酸外和N10D相同。
发明详述：
本发明涉及比天然SCF活性更高的特殊SCF类似物。如上所示，现已发现10位和11位有一到两个天冬酰胺被替换后得到的分子与天然SCF相比生物学活性明显增加。这里的SCF类似物称为N10D(10位天冬酰胺被替换成天冬氨酸)和N10D,N11D(11位还有一个另外的替代)。优选地使用N10D,N11D，因为两个位置上的替换与仅10位上替换相比，生物学活性更强(在巨核细胞增殖实验中)。
为了方便，词“N10D”和“N10D,N11D”泛指本发明的SCF类似物，不论它们是全长的1-248 SCF蛋白还是下面所述的其它形式。讨论一个具体的类似物时，针对的是相应的具体的未修饰的氨基酸序列。例如，下面所述的是SCF类似物N10D SCF met 1-165(一种含有图一中165个氨基酸的SCF类似物，N末端为甲硫氨酰残基，10位的天冬酰胺被替换为天冬氨酸)。
SCF类似物可能是相比于全长人SCF分子类似物(例如图一所示)，也可能是修饰过的SCF类似物，例如是含有图一中氨基酸1-165或1-164的SCF类似物。(目前所举例子中显示，修饰的SCF 1-165在-1位有一个甲硫氨酰残基)。还有一种SCF由于删除了一个外显子(膜结合型SCF)，含有220个氨基酸。见PCT WO91/05795，题目是“干细胞因子”，发表于1991年5月2日，它全文以参考文献引入本发明。以上的干细胞因子PCT文献在图44中图示了SCF 1-220。SCF的修饰还包括删除C末端一个或更多氨基酸，一直到氨基酸1-138或更优选的 1-141(见图一)，或者是删除N末端1位一直到4位的氨基酸(也见图一)。
修饰的SCF可以包括有其它添加、删除或替代，只要它们有天然产生人SCF的至少一种造血功能即可。刺激早期造血祖细胞生长是优选的一个造血生物学活性。这在SCF PCT Pub.WO91/05795中到处可见。这种用天冬氨酸代替“起始”SCF分子中相应位置的天冬酰胺的修饰方法，预期可以增加起始分子的活性。(术语“起始”采用引号是因为编码这些蛋白的核酸，而不是蛋白本身做为生产本发明类似物的起始材料。)
特殊修饰的SCF可以做为“起始”材料，来实施本发明，(因为N10D和N10D,N11D中相应的改变可以增加生物学活性)，它们包括(参考图一)：
(a)任何SCF 1-138，优选 1-141(至少含有图一中在此位的C末端半胱氨酸)，一直到1-248，因为这些C末端删除在UT-7生物学分析(描述见后)中不明显影响生物学活性；
(b)SCF1-127, 1-130和1-137，活性有下降；和
(c)任何以上所述的SCF在N末端1、2、3、4个位置
上有删除(4位的半胱氨酸仍然存在)形成的SCF。
另外，在WO95/26199中报导的共价二聚体，比如用氨基酸连结子将一个单体的N端和另一个单体的C端相连而形成的二聚体中，也可能有一个或更多的单体是本发明的一种类似物。
优选的起始SCF是SCF1-248,SCF1-165,SCF1-164，因为这些被认为活性最强，而且已经鉴定过。
这些类似物可能在-1位有一个甲硫氨酰残基(细菌表达的典型结果)。
本发明的SCF类似物可能以单体或二聚体形式包含于试剂中，优选同源二聚体来维持最高的生物学活性。一分子N10D和一分子N10D,N11D组成的异源二聚体的活性也有升高。也可以配制N10D,N11D和天然SCF(例如未修饰的SCF1-164或SCF 1-165)的异源二聚体。SCF制剂可以是异源二聚体和同源二聚体的混合物，也可以是这类二聚体和单体的混合物。
本发明的新核酸序列包括确保在原核或真核宿主细胞中表达本发明SCF类似物N10D和N10D,N11D的有用序列。这些核酸可以分离纯化，以便用需要的编码序列产生这些多肽。
更具体地，本发明的DNA序列包括：
(a)在序列ID No.3及4、6、7给出的序列；
(b)(a)中的亚序列修饰而成的序列，它们编码具有自然产生
的SCF的至少一种造血生物学活性的其他形式。SCF优选的生物
学特性是结合一种SCF受体(c-kit受体)，但它还有一种生物
学特性是刺激早期造血祖细胞增殖。另外一种生物学特性是刺激
黑色素细胞产生黑色素。至于其它生物学活性，专业人士是很清
楚的。
更具体地，这些核酸编码的是以下起始SCF的N10D或N10D,N11D类似物(参考图一)：
(a)任何一种SCF 1-138，优选1-141(至少具有图一中在此位的C端的半胱氨酸)，一直到1-248；
(b)SCF1-127,1-130,1-137；和
(c)任何一种以上所述的SCF，在N端删除1、2、3或4个氨基酸(仍保留4位的半胱氨酸)的产物。
DNA分子可能掺入有利于在微生物宿主中转录和翻译信使RNA的密码子。制造的这些序列可根据Alton等人在PCT发表应用专利83/04053中提供的方法来很容易地构建。这些DNA可能选择性地编码N-末端的甲硫氨酰残基。
本发明提供的DNA序列可用来产生新的有用的病毒和质粒DNA载体，新的有用的转化的和转染的原核和真核宿主细胞(包括细菌和酵母细胞，培养的哺乳细胞)，以及培养本发明的可以表达这些SCF类似物的宿主细胞的新的有用的方法。这里提供的编码具有生物学活性的SCF类似物的DNA序列(或者相应的RNA)可用来做基因治疗，用于那些SCF水平低下的状况可以得到改善的病例。
本发明也提供了生产本发明的SCF类似物的生产过程。提供的是从含有编码SCF类似物N10D和/或N10D,N11D的核酸的宿主细胞中，生产这类SCF类似物的生产过程，包括：
(a)在有利于这类基因表达的培养条件下，培养含有这些类似物核酸的宿主细胞；以及
(b)获得这种SCF类似物。
也可以选用生产过程中获得的其它成份来分离纯化该种类似物。
宿主细胞可以是原核或真核细胞，包括细菌，哺乳细胞(例如中国仓鼠卵巢细胞，猴细胞，幼龄仓鼠肾细胞或其它细胞)，酵母细胞和昆虫细胞。在商业生产中最容易利用的是细菌宿主细胞。
本发明还包括含有本发明的类似物药物的药物组合物，它包括有效剂量的本发明的多肽产品以及药剂学上可以接受的对SCF治疗有用的稀释剂，保藏剂，增溶剂，乳化剂，佐剂和/或载体。这些成份包括不同缓冲能力(如tris-HCl，乙酸盐，磷酸盐)、PH和离子强度的稀释剂、添加剂，如去污剂、助溶剂(如，Tween 80,polysorbate 80)、抗氧化剂(如抗坏血酸，sodinm metabisulfite)、防腐剂(如，硫柳汞，苯甲醇)和增加体积的物质(如，乳糖，甘露醇)；将这些材料掺入到多聚化合物，如聚乳酸，聚羟基乙酸等的特殊制剂中，或者配以脂质体得到目的制剂。这些成份将影响这些SCF类似物的物理状态，稳定性，体内释放速度和体内清除速度。例如，可见Remington'sPharmceutical Sciences第18版(1990年Mark出版公司，Easton,PA 18042)第1435-1712页。这部分做为参考文献引入本发明。
目前这些类似物的衍生物也包括在本发明里。这些衍生物包括被一个或多个水溶性多聚分子，如聚乙二醇修饰，或者添加多聚氨基酸得到的分子。这些衍生可能以单个形式发生在N端或C端，也可能发生在多个位置。用赖氨酸替换一个或多个氨基酸可以提供更多的位置用于衍生。
这些类似物或其衍生物可以做成制剂，通过注射，口服，鼻腔，肺，皮肤或其它的专业人员清楚的方式用药。制剂可以是水剂，固体_例如可做成冻干粉以便以后重溶后使用。
总之，本发明类似物或其衍生物可以和现用的SCF一样地使用，不同的是这些类似物的活性更强(如下所示，大约为200％)。其用途包括一系列与造血，神经以及生殖相关的疾病。见WO91/05795----这已做为参考文献并入本发明；也可见U.S.S.N 07/982,255------这也已做为参考文献并入本发明。这样，这些成份和生产药物的方法可以用来治疗这类疾病。这类疾病包括但并不局限于以下这些：白细胞减少症、血小板减少症、贫血，增强移植时骨髓的植入，增强放疗、化学品或化疗引起的骨髓萎缩或髓系抑制的骨髓恢复，获得性免疫缺陷综合症，以及增加细胞对化疗的敏感性。另外，本发明的SCF类似物组合物可以促使外周血祖细胞的迁移。这样的用途和成份也包括治疗神经损伤和不育或有肠道疾患的哺乳动物。另外，本发明的SCF类似物组合物也可以用来治疗色素病，比如白斑。
本发明的SCF类似物(或衍生物)组合物也可以用在体外。比如，在基因治疗方案中，可能需要将外源DNA转染进造血细胞，并利用本发明的SCF类似物成份来培养所说的细胞。这样，本发明在另一个方面来说包括一种体外培养造血细胞的方法，它包括：
(ⅰ)将所说的细胞置于合适的培养液中，所说的合适培养液
含有一种根据本发明的SCF类似物成份，而且
(ⅱ)提供一种合适的环境，使所说的造血细胞生长。
更具体的是，本发明提供了一种利用外源DNA转染造血细胞的方法，它包括：
(ⅰ)用含根据本发明的SCF类似物的培养液培养这种造血细胞，以及
(ⅱ)用外源DNA转染这种培养细胞。例如造血细胞可以是骨髓细胞或外周血祖细胞。
另一方面，本发明提供了一种试剂盒，它包含培养骨髓细胞或外周祖细胞所需成份，包括：
(ⅰ)本发明的一种SCF类似物组合物；以及
(ⅱ)制备骨髓细胞或外周血祖细胞的合适培养液所需的成份。
这里的用途或产品涉及施用或包埋从以下因子中所选的至少一种额外的因子：EPO、G-CSF、M-GDF、GM-CSF、M-CSF、CSF-1、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IGF-1、LIF、干扰素(如α,β,γ或consensus)、神经营养因子(如，BDNF,NT-3,CTNF或noggin)、其它多能生长因子(如，目前被证明是这类多能生长因子的flt-3/flt-2配基、干细胞增生因子、以及全能干细胞因子)、成纤维细胞生长因子(如FGF)，以及类似物、融合分子或以上所罗列因子的其它衍生物。例如，SCF和G-CSF结合使用，可以增强外周血祖细胞在体内的迁移。在体外发现，SCF和G-CSF、IL-3以及IL-6结合使用，有利于外周血细胞的扩增。本发明的类似物可用于同样用途。
一般情况下，本发明类似物的有效剂量由年龄、体重、受治者疾病的状况和严重程度决定。见，Remingtons Pharmaceutical Sciences,上册697-773页，该部分以参考文献并入本发明。典型地，可用剂量为0.001μg/kg体重/天到1000μg/kg体重/天，但一个熟练的医师会发现，使用剂量可以比之更多或更少。可以一日一次或多次用药，也可以减少次数，也可以和此处提供的其它组合物结合使用。应该指出，本发明的范围不局限于此处引用的剂量。
下面提供的实施例用来对本发明有一个更充分的阐述，但本发明的范围并不局限于此。这个实施例讲述的是本发明SCF met 1-165 N10D和N10D,N11D的制备，以及为了避免10位和/或11位的天冬酰胺可能的脱酰胺同时避免重组人SCF降解副产物而做的测定。此处也描述了体外测试这些SCF类似物的方法。
                       实施例
1．测定10位和/或11位的天冬酰胺对重组人类SCF的生物学活性和化学稳定性的影响。
在体外老化实验中，通过HPLC分析和可溶性氨的释放来检测重组人干细胞生长因子(rhSCF-165)。在低PH或低温度的缓冲液中，脱酰胺速率较低，但在碱性缓冲液，如碳酸氢钠中，或者加上高一些的温度时，脱酰胺的速率明显升高。用HPLC分离各种脱酰胺形式，然后进行肽谱分析，结果发现，蛋白10位的天冬酰胺涉及脱酰胺反应。其后的肽谱分析，可鉴定到含大量天冬氨酰和异天冬氨酰的多肽，这表明10位的天冬酰胺转化成了天冬氨酰和异天冬氨酰残基。作为SCF二聚体自发结合-解离的结果(见Lu等发表于1995年Biochem.J.305卷563-568页的文章)，可分离到共五种脱酰胺形式，包括两种同二聚体和三种异二聚体。细胞增殖分析表明，得自异天冬氨酰SCFrhSCF和其它SCFrhSCF单体的二聚化的两种SCF异二聚体，保留大约一半生物学活性。异天冬氨酰代替10位的天冬酰胺得到的同二聚体，活性只有1/50。而天冬氨酰同二聚体，不论是脱酰胺实验中分离到的，还是按上面所述方法定向突变得到的重组产品，其活性都比标准分子高。作为对照，合成的N10A(10位有一个丙氨酸)或N10E(10位有一个谷氨酸)，虽然失去了脱酰胺位点，活性都明显地降低。所有这些类似物都比含有天冬氨酰基的分子相对更为稳定。这些结果表明重组人SCF的生物活性和化学稳定性都受10位氨基酸残基的性质的影响。
2．SCF met 1-165 N10D和N10D,N11D的制备
以上研究显示10位的脱酰胺引起活性的降低和rhSCF制品的不稳定性，根据此观点，制备了这些N10D和N10D,N11D类似物，并检测了它们的生物学活性和稳定性。
本发明的SCF类似物是对SCF met 1-165 SCF进行定向突变而得到的。SCF met 1-165在E.Coli中的表达以前已有报导。见Langley等发表于1992年Arch.Biochem.Biophys.295卷21-28页的文章。编码重组人SCF的DNA具有一个起始的蛋氨酸密码子，紧接者是人SCF的密码子。纯化的重组人SCF保留了起始蛋氨酸(蛋氨酸位置为-1位)。目前的N10D和N10D,N11D类似物，都是根据Langley等发表于1994年Arch.Biochem.Biophys.311卷55-61页的文章中所述，通过定向突变得到的。其它测试的类似物N10A和N10E，也是按此制备的。
SCF met 1-165 N10D的氨基酸和核苷酸序列是(Seq.ID No.1(DNA)和2(氨基酸))：
ATGGAAGGTA TCTGCCGTAA CCGTGTTACT AACAACGTTA AAGACGTTAC
 M  E  G   I  C  R  N   R  V  T   N  N  V   K  D  V  T
TAAACTGGTT GCTAACCTGC CGAAAGACTA CATGATCACC CTGAAATACG
 K  L  V   A  N  L  P   K  D  Y   M  I  T   L  K  Y
TTCCGGGTAT GGACGTTCTG CCGTCTCACT GCTGGATCTC TGAAATGGTT
V  P  G  M   D  V  L   P  S  H   C  W  I  S   E  M  V
GTTCAGCTGT CTGACTCTCT GACTGACCTG CTGGACAAAT TCTCTAACAT
 V  Q   L  S  D  S  L   T  D  L   L  D  K   F  S  N  I
CTCTGAAGGT CTGTCTAACT ACTCTATCAT CGACAAACTG GTTAACATCG
  S  E  G   L  S  N   Y  S  I  I   D  K  L   V  N  I
TTGACGACCT GGTTGAATGC GTTAAAGAAA ACTCTTCTAA AGACCTGAAA
 V D  D  L   V  E  C   V  K  E   N  S  S  K   D  L  K
AAATCTTTCA AATCTCCGGA ACCGCGTCTG TTCACTCCGG AAGAATTCTT
 K  S  F   K  S  P  E   P  R  L   F  T  P   E  E  F  F
CCGTATCTTC AACCGTTCCA TCGACGCTTT CAAAGACTTC GTTGTTGCTT
  R  I  F   N  R  S   I  D  A  F   K  D  F   V  V  A
CCGAAACCTC CGACTGCGTT GTTTCCTCCA CCCTGTCTCC GGAAAAAGAC
S  E  T  S   D  C   V  V  S  S   T  L  S  P   E  K  D
TCCCGTGTTT CGGTTACCAA ACCGTTCATG CTGCCGCCGG TTGCTGCTTAA
 S  R  V   S  V  T  K   P  F  M   L  P  P   V  A  A  *
SCFmet 1-165 N10D的氨基酸和核苷酸序列是(Seq.ID No.3和4(DNA)以及5(氨基酸))：
  CATATGGAAGGTATCTGCAGGAATCGTGTGACTGACAATGTAAAAGACGTCACTAAATTG1  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60
  GTATACCTTCCATAGACGTCCTTAGCACACTGACTGTTACATTTTCTGCAGTGATTTAAC
      M  E  G  I  C  R  N  R  V  T  D  N  V  K  D  V  T  K  L  -
 GTGGCAAATCTTCCAAAAGACTACATGATAACCCTCAAATATGTCCCCGGGATGGATGTT61   ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120
  CACCGTTTAGAAGGTTTTCTGATGTACTATTGGGAGTTTATACAGGGGCCCTACCTACAA
   V  A  N  L  P  K  D  Y  M  I  T  L  K  Y  V  P  G  M  D  V   -
  TTGCCAAGTCATTGTTGGATAAGCGAGATGGTAGTACAATTGTCAGACAGCTTGACTGAT121   ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180
  AACGGTTCAGTAACAACCTATTCGCTCTACCATCATGTTAACAGTCTGTCGAACTGACTA
   L  P  S  H  C  W  I  S  E  M  V  V  Q  L  S  D  S  L  T  D   -
   CTTCTGGACAAGTTTTCAAATATTTCTGAAGGCTTGAGTAATTATTCCATCATAGACAAA181    ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240
   GAAGACCTGTTCAAAAGTTTATAAAGACTTCCGAACTCATTAATAAGGTAGTATCTGTTT
    L  L  D  K  F  S  N  I  S  E  G  L  S  N  Y  S  I  I  D  K  -
   CTTGTGAATATAGTGGATGACCTTGTGGAGTGCGTGAAAGAAAACTCATCTAAGGATCTA241    ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300
   GAACACTTATATCACCTACTGGAACACCTCACGCACTTTCTTTTGAGTAGATTCCTAGAT
    L  V  N  I  V  D  D  L  V  E  C  V  K  E  N  S  S  K  D  L  -
   AAAAAATCATTCAAGAGCCCAGAACCCAGGCTCTTTACTCCTGAAGAATTCTTCCGTATC301    ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360
   TTTTTTAGTAAGTTCTCGGGTCTTGGGTCCGAGAAATGAGGACTTCTTAAGAAGGCATAG
    K  K  S  F  K  S  P  E  P  R  L  F  T  P  E  E  F  F  R  I  -
   TTCAACCGTTCCATCGACGCTTTCAAAGACTTCGTTGTTGCTTCCGAAACCTCCGACTGC361    ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420
   AAGTTGGCAAGGTAGCTGCGAAAGTTTCTGAAGCAACAACGAAGGCTTTGGAGGCTGACG
    F  N  R  S  I  D  A  F  K  D  F  V  V  A  S  E  T  S  D  C  -
   GTTGTTTCCTCCACCCTGTCTCCGGAAAAAGACTCCCGTGTTTCGGTTACCAAACCGTTC421    ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480
   CAACAAAGGAGGTGGGACAGAGGCCTTTTTCTGAGGGCACAAAGCCAATGGTTTGGCAAG
     V  V  S  S  T  L  S  P  E  K  D  S  R  V  S  V  T  K  P  F -
   ATGCTGCCGCCGGTTGCTGCTTAATAGGATCC481    ---------+---------+---------+-- 512
   TACGACGGCGGCCAACGACGAATTATCCTAGG
    M  L  P  P  V  A  A  *  *
SCF met 1-165 N10D,N11D的氨基酸和核苷酸序列是(Seq.ID No.6和7(DNA)以及8(氨基酸))：
 CATATGGAAGGTATCTGCAGGAATCGTGTGACTGACGATGTAAAAGACGTCACTAAATTG1 ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 60
 GTATACCTTCCATAGACGTCCTTAGCACACTGACTGCTACATTTTCTGCAGTGATTTAAC
    M  E  G  I  C  R  N  R  V  T  D  D  V  K  D  V  T  K  L   -
 GTGGCAAATCTTCCAAAAGACTACATGATAACCCTCAAATATGTCCCCGGGATGGATGTT61  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 120
 CACCGTTTAGAAGGTTTTCTGATGTACTATTGGGAGTTTATACAGGGGCCCTACCTACAA
  V  A  N  L  P  K  D  Y  M  I  T  L  K  Y  V  P  G  M   D V
 TTGCCAAGTCATTGTTGGATAAGCGAGATGGTAGTACAATTGTCAGACAGCTTGACTGAT121  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 180
 AACGGTTCAGTAACAACCTATTCGCTCTACCATCATGTTAACAGTCTGTCGAACTGACTA
  L  P  S  H  C  W  I  S  E  M  V  V  Q  L  S  D  S  L  T  D   -
 CTTCTGGACAAGTTTTCAAATATTTCTGAAGGCTTGAGTAATTATTCCATCATAGACAAA181  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 240
 GAAGACCTGTTCAAAAGTTTATAAAGACTTCCGAACTCATTAATAAGGTAGTATCTGTTT
  L  L  D  K  F  S  N  I  S  E  G  L  S  N  Y  S  I  I  D  K
 CTTGTGAATATAGTGGATGACCTTGTGGAGTGCGTGAAAGAAAACTCATCTAAGGATCTA241  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 300
 GAACACTTATATCACCTACTGGAACACCTCACGCACTTTCTTTTGAGTAGATTCCTAGAT
  L  V  N  I  V  D  D  L  V  E  C  V  K  E  N  S  S  K  D  L  -
 AAAAAATCATTCAAGAGCCCAGAACCCAGGCTCTTTACTCCTGAAGAATTCTTCCGTATC301  ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 360
 TTTTTTAGTAAGTTCTCGGGTCTTGGGTCCGAGAAATGAGGACTTCTTAAGAAGGCATAG
  K  K  S  F  K  S  P  E  P  R  L  F  T  P  E  E  F  F  R  I  -
   TTCAACCGTTCCATCGACGCTTTCAAAGACTTCGTTGTTGCTTCCGAAACCTCCGACTGC361    ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 420
   AAGTTGGCAAGGTAGCTGCGAAAGTTTCTGAAGCAACAACGAAGGCTTTGGAGGCTGACG
    F  N  R  S  I  D  A  F  K  D  F  V  V  A  S  E  T  S  D  C  -
   GTTGTTTCCTCCACCCTGTCTCCGGAAAAAGACTCCCGTGTTTCGGTTACCAAACCGTTC421    ---------+---------+---------+---------+---------+---------+ 480
   CAACAAAGGAGGTGGGACAGAGGCCTTTTTCTGAGGGCACAAAGCCAATGGTTTGGCAAG
    V  V  S  S  T  L  S  P  E  K  D  S  R  V  S  V  T  K  P  F  -
   ATGCTGCCGCCGGTTGCTGCTTAATAGGATCC481    ---------+---------+---------+-- 512
   TACGACGGCGGCCAACGACGAATTATCCTAGG
    M  L  P  P  V  A  A  *  *
鉴定：
SCF met 1-165 N10D和N10D,N11D，是通过测定完整蛋白N端序列来确认的。SCF N10D的氨基酸次序的测定结果为Met-Glu-Gly-Ile-[Cys]-Arg-Asn-Arg-Val-Thr-Asp-Asn-Val-Lys----，而SCFN10D,N11D的氨基酸次序的测定结果为Met-Glu-Gly-Ile-[Cys]-Arg-Asn-Arg-Val-Thr-Asp-Asp-Val-Lys----。这样，测定的次序和从相应的DNA序列SEQ ID No.3和4以及Seq.ID No.6和7推测出的序列是相符的。
3．升高的生物学活性
下面提供数据证明这些重组的人SCF类似物N10D和N10D,N11D比未修饰的SCF 1-165活性升高大约50％。
生物学活性分析
采用体外UT-3生物测定法，它通过测定SCF对巨核细胞培养物的刺激作用来实现。经过样品刺激后，培养物对3H-胸腺核苷的摄入量，是SCF生物功能的指标。所用方法依据Smith等发表于CurrentProtocol in Immunology(Coligan等主编，纽约John Willey & Sons公司出版)6.17.1页到6.17.11页的文章。
这些类似物和未修饰的SCF 1-165比较结果如下：
    样品 半数最高刺激浓度(ng/ml)     ％活性
 SCF met 1-165     5.4     100
 SCF met 1-165 N10D     3.5     154
 SCF met 1-165N10D,N11D     3.2     160
注：计算方法是：重组人SCF标准品的半数最高刺激浓度，被变异体的值来除，再乘以100。
4．增加的稳定性
下面提供数据证明，在快速稳定性分析中，这些重组的人SCF类似物N10D和N10D,N11D比未修饰的SCF 1-165更稳定。
稳定性分析
将样品在100mM的碳酸氢钠，PH8.4,37℃孵育1-5天，来比较其快速稳定性。利用SP-5PW TSK凝胶柱进行磺丙基阴离子交换HPLC，来定量在如上所述的缓冲液中保存时，剩余的未降解形式和脱酰胺产物。如图2所示，SCF N10D和SCF N10D,N11D同样稳定，而比SCF标准品稳定。
虽然本发明是以优选方案来描述的，对专业人士而言，变化或改良都是可能的。因此，所有这样的同等的变化的附加权利要求也包括在本发明权利要求范围之内。
                        序列表：
(1)总信息：
(ⅰ)申请者：AmgenInc.
(ⅱ)发明题目：SCF类似物成份和方法
(ⅲ)序列数目：9
(ⅳ)通讯地址：
(A)收件人：Amgen Inc.
(B)街道：1840 DeHavilland Drive
(C)城市：Thousand Oaks
(D)州：CA
(E)国家：USA
(F)邮政编码：91320-1789
(ⅴ)计算机可读类型：
(A)介质类型：软盘
(B)计算机：IBM PC兼容机
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release#1.0,Version#1.30
(ⅵ)本申请数据：
(A)申请号：US 08/628,428
(B)填表日期：05-APR-1996
(C)分类：
(ⅷ)代理人/委托人信息：
(A)姓名：Knight,Matthew W
(B)登记号：36,846
(C)参考文献/文件摘要号：A-400
(2)SEQ ID NO:1信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：501碱基对
(B)类型：核酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑型：线性
(ⅱ)分子类型：cDNA
(ⅹⅰ)序列的详细情况：SEQ ID NO:1:ATGGAAGGTA TCTGCCGTAA CCGTGTTACT AACAACGTTA AAGACGTTAC TAAACTGGTT       60GCTAACCTGC CGAAAGACTA CATGATCACC CTGAAATACG TTCCGGGTAT GGACGTTCTG       120CCGTCTCACT GCTGGATCTC TGAAATGGTT GTTCAGCTGT CTGACTCTCT GACTGACCTG       180CTGGACAAAT TCTCTAACAT CTCTGAAGGT CTGTCTAACT ACTCTATCAT CGACAAACTG       240GTTAACATCG TTGACGACCT GGTTGAATGC GTTAAAGAAA ACTCTTCTAA AGACCTGAAA       300AAATCTTTCA AATCTCCGGA ACCGCGTCTG TTCACTCCGG AAGAATTCTT CCGTATCTTC       360AACCGTTCCA TCGACGCTTT CAAAGACTTC GTTGTTGCTT CCGAAACCTC CGACTGCGTT       420GTTTCCTCCA CCCTGTCTCC GGAAAAAGAC TCCCGTGTTT CGGTTACCAA ACCGTTCATG       480CTGCCGCCGG TTGCTGCTTA A                                                 501
(2)SEQ ID NO:2信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：166氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白
(ⅹⅰ)特征：
(A)名字/关键：蛋白
(B)位置：1..166
(C)其它信息：/注意=“序列2中蛋氨酸在-1位起始”
(ⅹⅰ)序列的详细情况：SEQ ID NO:2:Met Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val1               5                   10                  15Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met Ile Thr Leu Lys
        20                  25                  30 Tyr Val Pro Gly Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu
     35                  40                  45Met Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe
 50                  55                  60Ser Asn Ile Ser Glu Gly Leu Sar Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu65                  70                  75                  80Val Asn Ile Val Asp Asp Leu Val Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser
            85                  90                  95Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr
        100                 105                 110Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys
    115                120                  125Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr
130                 135                 140Leu Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg Val Ser Val Thr Lys Pro Phe Met145                 150                 155                 160Leu Pro Pro Val Ala Ala
            165
(2)SEQ ID NO:3信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：512碱基对
(B)类型：核酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：cDNA
(ⅹⅰ)序列的详细情况：SEQ ID NO:3:CATATGGAAG GTATCTGCAG GAATCGTGTG ACTGACAATG TAAAAGACGT CACTAAATTG       60GTGGCAAATC TTCCAAAAGA CTACATGATA ACCCTCAAAT ATGTCCCCGG GATGGATGTT       120TTGCCAAGTC ATTGTTGGAT AAGCGAGATG GTAGTACAAT TGTCAGACAG CTTGACTGAT       180CTTCTGGACA AGTTTTCAAA TATTTCTGAA GGCTTGAGTA ATTATTCCAT CATAGACAAA       240CTTGTGAATA TAGTGGATGA CCTTGTGGAG TGCGTGAAAG AAAACTCATC TAAGGATCTA       300AAAAAATCAT TCAAGAGCCC AGAACCCAGG CTCTTTACTC CTGAAGAATT CTTCCGTATC       360TTCAACCGTT CCATCGACGC TTTCAAAGAC TTCGTTGTTG CTTCCGAAAC CTCCGACTGC       420GTTGTTTCCT CCACCCTGTC TCCGGAAAAA GACTCCCGTG TTTCGGTTAC CAAACCGTTC       480ATGCTGCCGC CGGTTGCTGC TTAATAGGAT CC                                     512
(2)SEQ ID NO:4信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：512碱基对
(B)类型：核酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：cDNA
(ⅹⅰ)序列的详细情况：SEQ ID NO:4:GTATACCTTC CATAGACGTC CTTAGCACAC TGACTGTTAC ATTTTCTGCA GTGATTTAAC       60CACCGTTTAG AAGGTTTTCT GATGTACTAT TGGGAGTTTA TACAGGGGCC CTACCTACAA       120AACGGTTCAG TAACAACCTA TTCGCTCTAC CATCATGTTA ACAGTCTGTC GAACTGACTA       180GAAGACCTGT TCAAAAGTTT ATAAAGACTT CCGAACTCAT TAATAAGGTA GTATCTGTTT       240GAACACTTAT ATCACCTACT GGAACACCTC ACGCACTTTC TTTTGAGTAG ATTCCTAGAT       300TTTTTTAGTA AGTTCTCGGG TCTTGGGTCC GAGAAATGAG GACTTCTTAA GAAGGCATAG       360AAGTTGGCAA GGTAGCTGCG AAAGTTTCTG AAGCAACAAC GAAGGCTTTG GAGGCTGACG       420CAACAAAGGA GGTGGGACAG AGGCCTTTTT CTGAGGGCAC AAAGCCAATG GTTTGGCAAG       480TACGACGGCG GCCAACGACG AATTATCCTA GG                                     512
(2)SEQ ID NO:5信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：166氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白
(ⅹⅰ)特征：
(A)名字/关键：蛋白
(B)位置：1..166
(C)其它信息：/注意=“序列2中蛋氨酸在-1位起始”
(ⅹⅰ)序列的详细情况：SEQ ID NO:5:Met Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg Val Thr Asp Asn Val Lys Asp Val1               5                   10                  15Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met Ile Thr Leu Lys
         20                  25                  30Tyr Val Pro Gly Met Asp Val Leu Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu
    35                  40                  45Met Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe
50                  55                  60Ser Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu65                  70                  75                  80Val Asn Ile Val Asp Asp Leu Val Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser
            85                  90                  95Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr
        100                 105                 110Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys
    115                 120                 125Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr
130                 135                 140Leu Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg Val Ser Val Thr Lys Pro Phe Met145                 150                155                  160Leu Pro Pro Val Ala Ala
            165
(2)SEQ ID NO：6信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：512碱基对
(B)类型：核酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：cDNA
(ⅹⅰ)序列的详细情况：SEQID NO:6:CATATGGAAG   GTATCTGCAG   GAATCGTGTG   ACTGACGATG   TAAAAGACGT   CACTAAATTG               60GTGGCAAATC   TTCCAAAAGA   CTACATGATA   ACCCTCAAAT   ATGTCCCCGG   GATGGATGTT               120TTGCCAAGTC   ATTGTTGGAT   AAGCGAGATG   GTAGTACAAT   TGTCAGACAG   CTTGACTGAT               180CTTCTGGACA   AGTTTTCAAA   TATTTCTGAA   GGCTTGAGTA   ATTATTCCAT   CATAGACAAA               240CTTGTGAATA   TAGTGGATGA   CCTTGTGGAG   TGCGTGAAAG   AAAACTCATC   TAAGGATCTA               300AAAAAATCAT   TCAAGAGCCC   AGAACCCAGG   CTCTTTACTC   CTGAAGAATT   CTTCCGTATC               360TTCAACCGTT   CCATCGACGC   TTTCAAAGAC   TTCGTTGTTG   CTTCCGAAAC   CTCCGACTGC               420GTTGTTTCCT   CCACCCTGTC   TCCGGAAAAA   GACTCCCGTG   TTTCGGTTAC   CAAACCGTTC               480ATGCTGCCGC   CGGTTGCTGC   TTAATAGGAT   CC                                                 512
(2)SEQID NO：7信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：512碱基对
(B)类型：核酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：cDNA
(ⅹⅰ)序列的详细情况：SEQ ID NO:7:GTATACCTTC CATAGACGTC CTTAGCACAC TGACTGCTAC ATTTTCTGCA GTGATTTAAC       60CACCGTTTAG AAGGTTTTCT GATGTACTAT TGGGAGTTTA TACAGGGGCC CTACCTACAA       120AACGGTTCAG TAACAACCTA TTCGCTCTAC CATCATGTTA ACAGTCTGTC GAACTGACTA       180GAAGACCTGT TCAAAAGTTT ATAAAGACTT CCGAACTCAT TAATAAGGTA GTATCTGTTT       240GAACACTTAT ATCACCTACT GGAACACCTC ACGCACTTTC TTTTGAGTAG ATTCCTAGAT       300TTTTTTAGTA AGTTCTCGGG TCTTGGGTCC GAGAAATGAG GACTTCTTAA GAAGGCATAG       360AAGTTGGCAA GGTAGCTGCG AAAGTTTCTG AAGCAACAAC GAAGGCTTTG GAGGCTGACG       420CAACAAAGGA GGTGGGACAG AGGCCTTTTT CTGAGGGCAC AAAGCCAATG GTTTGGCAAG       480TACGACGGCG GCCAACGACG AATTATCCTA GG                                     512
(2)SEQ ID NO:8信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：166氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白
(ⅸ)特征：
(A)名字/关键：蛋白
(B)位置：1..166
(C)其它信息：/注意=“序列2中蛋氨酸在-1位起始”
(ⅹⅰ)序列的详细情况：SEQID NO:8:Met Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg Val Thr Asp Asp Val Lys Asp Val1               5                   10                  15Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro Lys Asp Tyr Met Ile Thr Leu Lys
        20                  25                  30Tyr Val Pro Gly Met Asp Val Leu Pro Ser Mis Cys Trp Ile Ser Glu
    35                  40                  45Met Val Val Gln Leu Ser Asp Ser Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe
50                  55                  60Sar Asn Ila Ser Glu Gly Leu Ser Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu65                  70                  75                  80Val Asn Ile Val Asp Asp Leu Val Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser
            85                  90                  95Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys Ser Pro Glu Pro Arg Leu Phe Thr
        100                 105                 110Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys
    115                 120                 125Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr
130                 135                 140Leu Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg Val Ser Val Thr Lys Pro Phe Met145                 150                 155                 160Leu Pro Pro Val Ala Ala
            165
(2)SEQ ID NO:9信息：
(ⅰ)序列特征：
(A)长度：273氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链类型：单链
(D)拓扑学：线性
(ⅱ)分子类型：蛋白
(ⅸ)特征：
(A)名字/关键：蛋白
(B)位置：1..273
(C)其它信息：/注意=“成熟全长1-248 SCF蛋白
开始于26位的氨基酸；氨基酸1-25包括蛋氨酸和人重组
SCF膜结合形式的引导序列”(ⅹⅰ)序列的详细情况：SEQ ID NO:9:Met Lys Lys Thr Gln Thr Trp Ile Leu Thr Cys Ile Tyr Leu Gln Leu1               5                   10                  15Leu Leu Phe Asn Pro Leu Val Lys Thr Glu Gly Ile Cys Arg Asn Arg
         20                  25                  30Val Thr Asn Asn Val Lys Asp Val Thr Lys Leu Val Ala Asn Leu Pro
     35                  40                  45Lys Asp Tyr Met Ile Thr Leu Lys Tyr Val Pro Gly Met Asp Val Leu
 50                  55                  60Pro Ser His Cys Trp Ile Ser Glu Met Val Val Gln Leu Ser Asp Ser65                  70                  75                  80Leu Thr Asp Leu Leu Asp Lys Phe Ser Asn Ile Ser Glu Gly Leu Ser
             85                  90                  95Asn Tyr Ser Ile Ile Asp Lys Leu Val Asn Ile Val Asp Asp Leu Val
         100                 105                 110Glu Cys Val Lys Glu Asn Ser Ser Lys Asp Leu Lys Lys Ser Phe Lys
     115                 120                 125Ser Pro Glu Pro Arg Lau Phe Thr Pro Glu Glu Phe Phe Arg Ile Phe
 130                 135                 140Asn Arg Ser Ile Asp Ala Phe Lys Asp Phe Val Val Ala Ser Glu Thr145                 150                 155                 160Ser Asp Cys Val Val Ser Ser Thr Leu Ser Pro Glu Lys Asp Ser Arg
             165                 170                 175Val Ser Val Thr Lys Pro Phe Met Leu Pro Pro Val Ala Ala Ser Ser
         180                 185                 190Leu Arg Asn Asp Ser Ser Ser Ser Asn Arg Lys Ala Lys Asn Pro Pro
     195                 200                 205Gly Asp Ser Ser Leu His Trp Ala Ala Met Ala Leu Pro Ala Leu Phe
 210                 215                 220Ser Leu Ile Ile Gly Phe Ala Phe Gly Ala Leu Tyr Trp Lys Lys Arg225                 230                 235                 240Gln Pro Ser Leu Thr Arg Ala Val Glu Asn Ile Gln Ile Asn Glu Glu
             245                 250                 255Asp Asn Glu Ile Ser Met Leu Gln Glu Lys Glu Arg Glu Phe Gln Glu
         260                 265                 270Val                             21

Claims (17)

1．选自N10D和N10D,N11D的一种置于可药用的稀释剂，佐剂或载体中的一种SCF类似物。
2．权利要求1的N10D或所说的N10D,N11D，是一种选自从下所述物质组中的重组人SCF的类似物(参见图1)：
(a)任何SCF 1-138一直到1-248；
(b)SCF 1-127,1-130和1-137；
(c)任何(a)或(b)亚序列(subpart)的SCF，在N末端1、2、3、4个位置上有删除(4位的半胱氨酸仍然存在)；以及
(d)在N末端有甲硫氨酰残基的任何(a)、(b)或(c)亚序列的SCF。
3．含有以下特征的DNA分子：
(a)描述于Seq.ID No.3或Seq.ID No.6(和其互补链)的DNA序列；
(b)10位和/或11位编码天冬氨酸的(a)亚序列的DNA序列，经过修饰后编码具有天然产生人SCF至少一种造血功能的另一种SCF。
4．编码N10D或N10D,N11D的DNA分子，此处所说的N10D或N10D,N11D是以下物质的类似物(参考图一)：
(a)任何SCF 1-138一直到1-248；
(b)SCF 1-127,1-130和1-137；和
(c)任何(a)或(b)亚序列的SCF，在N末端1、2、3、4个位置上有删除(4位的半胱氨酸仍然存在)；以及
(d)在N末端有甲硫氨酰残基的任何(a)、(b)或(c)亚序列的SCF。
5．从含编码以下SCF类似物核酸的宿主细胞中生产SCF类似物N10D和/或N10D,N11D的方法：
(a)在利于这类DNA分子表达的条件下，培养含有权利要求3或4相应DNA分子的宿主细胞；以及
(b)获得这样的SCF类似物。
6．含有权利要求3或4的DNA分子的DNA病毒或质粒载体。
7．含有权利要求3或4的DNA分子的宿主细胞。
8．权利要求权利要求7的宿主细胞，这里所说的宿主细胞选自细菌、哺乳细胞、酵母细胞和昆虫细胞。
9．包含对需要此种治疗的病人施用有效剂量的权利要求1或权利要求2的组合物，来治疗造血疾病的方法。
10．权利要求9的治疗方法，所说的疾病选自：白细胞减少症、血小板减少症、贫血，增强移植时骨髓的植入，增强放疗、化学品或化疗引起的骨髓萎缩或髓系抑制的骨髓恢复，获得性免疫缺陷综合症。
11．包含对需要此种治疗的病人施用有效剂量的权利要求1或权利要求2的组合物，来增强细胞对化疗敏感性的治疗方法。
12．包含对需要此种治疗的病人施用有效剂量的权利要求1或权利要求2的组合物，来治疗神经损伤和不育或肠道疾患的治疗方法。
13．体外培养造血细胞的方法，包括：
(ⅰ)将这些细胞置于合适的培养液中，所说的合适培养液含有一种SCF N10D或N10D,N11D类似物，此处的类似物选自以下重组人SCF的修饰形式(参考图一)：
(a)任何SCF 1-138一直到 1-248；
(b)SCF 1-127,1-130和1-137
(c)任何(a)或(b)亚序列的SCF在N末端1、2、3、4个位置上有删除(4位的半胱氨酸仍然存在)；以及
(d)在N末端有甲硫氨酰残基的任何(a)、(b)或(c)亚序列的SCF；以及，
(ⅱ)提供这些造血细胞生长的合适条件。
14．用外源DNA转染造血细胞的方法，包括：
(ⅰ)在含有一种SCF N10D或N10D,N11D类似物的培养液中培养这些造血细胞，此处的类似物选自以下重组人SCF的修饰形式(参考图一)：
(a)任何SCF 1-138一直到 1-248；
(b)SCF 1-127,1-130和1-137
(c)任何(a)或(b)亚序列的SCF在N末端1、2、3、4个位置上有删除(4位的半胱氨酸仍然存在)；以及
(d)在N末端有甲硫氨酰残基的任何(a)、(b)或(c)亚序列的SCF；以及，
(ⅱ)用外源DNA转染这些培养细胞
15．权利要求14的方法，其中造血细胞是骨髓细胞或外周血祖细胞。
16．权利要求9-15的之任一的方法，所说的治疗或培养包括使用选自以下物质组的以下附加因子：EP0,G-CSF,M-GDF,GM-CSF,M-CSF,CSF-1,IL-1,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8,IL-9,IL-10,IL-11,IL-12,IGF-1,LIF,干扰素，神经营养因子，flt-3/flt-2配基，成纤维细胞生长因子。
17．含有用于培养造血细胞的成份的试剂盒，包括：
(ⅰ)一种SCF N10D或N10D,N11D类似物，此处的类似物选自以下重组人SCF的修饰形式(参考图一)：
(a)任何SCF 1-138一直到1-248；
(b)SCF 1-127,1-130和1-137
(c)任何(a)或(b)亚序列的SCF在N末端1、2、3、4个位置上有删除(4位的半胱氨酸仍然存在)；以及
(d)在N末端有蛋氨酸残基的任何(a)、(b)或(c)亚序列的SCF；
(ⅱ)适合制备骨髓细胞或外周血祖细胞培养基的成份；以及，
(ⅲ)可选的，至少一种选自下列物质组的附加的因子：EPO,G-CSF,M-GDF,GM-CSF,M-CSF,CSF-1,IL-1,IL-2,IL-3,IL-4,IL-5,IL-6,IL-7,IL-8,IL-9,IL-10,IL-11,IL-12,IGF-1,LIF,干扰素，神经营养因子，flt-3/flt-2配基，成纤维细胞生长因子。
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