CN121428077A - 检测socs3表达水平的试剂在制备评估间充质干细胞对肺动脉高压治疗效果的产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及检测SOCS3表达水平的试剂在制备评估间充质干细胞对肺动脉高压治疗效果的产品中的应用。本发明通过整合转录组学和功能实验，揭示了MSC通过旁分泌作用激活SOCS3表达，进而抑制STAT3的过度磷酸化，从而阻断PAAF活化及ECM异常沉积的分子机制。SOCS3的表达水平可以作为判断间充质干细胞抑制肺动脉外膜成纤维细胞活化的标志物，也可以作为判断间充质干细胞对肺动脉高压治疗效果的标志物。通过上调SOCS3表达，可以抑制STAT3的过度磷酸化，抑制肺动脉外膜成纤维细胞活化及Col1和Col3表达，但不影响其增殖活性，进而治疗PAH。

Description

检测SOCS3表达水平的试剂在制备评估间充质干细胞对肺动 脉高压治疗效果的产品中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及检测SOCS3表达水平的试剂在制备评估间充质干细胞对肺动脉高压治疗效果的产品中的应用。

背景技术

肺高压（Pulmonary hypertension，PH）是一种以肺血管阻力进行性升高为特征的严重临床综合征，最终导致右心衰竭和死亡。PH被系统性地分为五大临床类型：1）肺动脉高压（Pulmonary Arterial Hypertension，PAH）；2）左心疾病相关的PH；3）肺部疾病和/或低氧相关的PH；4）慢性血栓栓塞性PH（Chronic thromboembolic pulmonary hypertension，CTEPH）；5）其他机制不明的PH。其中，PAH发病机制复杂且涉及多环节病理改变。肺动脉内皮细胞（Pulmonary artery endothelial cell，PAEC）功能障碍是PAH的始动环节，表现为血管舒张因子（如一氧化氮和前列环素）减少，同时伴随血管收缩因子（如内皮素-1）增加，从而引发肺动脉平滑肌细胞（Pulmonary arterial smooth muscle cell，PASMC）的异常增殖，导致血管壁增厚及管腔狭窄。近年研究发现，慢性炎症微环境在PAH进展中也发挥关键作用，活化的巨噬细胞、T淋巴细胞等炎症细胞及其分泌的IL-6、TNF-α等促炎因子通过复杂的细胞间相互作用影响肺血管的病理改变[3-6]。此外，肺动脉外膜成纤维细胞（Pulmonaryartery adventitial fibroblast，PAAF）对PAH血管重构也发挥着不可忽视的作用。在TGF-β/Smad、Wnt/β-catenin等信号通路调控下，PAAF转化为肌成纤维细胞，导致血管细胞外基质（Extracellular matrix, ECM）过度沉积，加剧血管壁纤维化及僵硬。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）在免疫调节和组织修复中的有益作用，其已在多项临床试验中用于治疗多种炎症性疾病，如移植物抗宿主病、糖尿病、肺纤维化、心力衰竭和克罗恩病等。然而对于间充质干细胞治疗后PAH机体代谢模式发生怎样的改变以及如何改变这些代谢途径目前仍不十分清楚。因此，从代谢组学角度找出相关的有效性的生物标志物和治疗靶点，有效评估MSC对PAH血管ECM重构的具体调控作用十分必要。

细胞因子信号传导抑制分子3（SOCS3）作为SOCS家族中的一员，是SOCS家族中负性调控细胞因子的JAK/STAT信号转导通路作用最强的抑制蛋白之一，其基因启动子上含有JAK2/STAT3信号途径的结合位点。SOCS3作为JAK/STAT信号传导途径的特异性内源性抑制物，能够通过直接与JAK2位点和STAT3磷酸化络氨酸残基结合以及募集链接泛素化酶等途径抑制细胞因子的过度激活。目前，SOCS3在PAH血管重构和肺动脉外膜成纤维细胞活化中的作用并未有相关研究。

发明内容

本发明的目的在于提供检测SOCS3表达水平的试剂在制备评估间充质干细胞对肺动脉高压治疗效果的产品中的应用，阐明MSC治疗PAH的作用机制，为PAH的治疗提供了新的潜在靶点。

本发明提供了检测SOCS3表达水平的试剂在制备用于评估间充质干细胞对肺动脉高压治疗效果的产品中的应用。

优选的，所述评估间充质干细胞对肺动脉高压治疗效果包括评估间充质干细胞对肺动脉高压血管细胞外基质重构的治疗效果。

优选的，所述肺动脉高压血管细胞外基质重构包括野百合碱诱导的肺动脉高压血管细胞外基质重构。

优选的，所述肺动脉高压血管细胞外基质重构包括肺动脉高压血管胶原蛋白异常沉积；所述胶原蛋白包括Collagen 1和Collagen 3。

本发明提供了检测SOCS3表达水平的试剂在制备用于评估间充质干细胞抑制肺动脉外膜成纤维细胞活化的效果的产品中的应用。

优选的，所述肺动脉外膜成纤维细胞活化包括TGF-β1诱导的肺动脉外膜成纤维细胞活化。

优选的，所述产品包括试剂盒；

所述检测SOCS3表达水平的试剂包括抗SOCS3抗体。

本发明提供了SOCS3和/或上调SOCS3表达的试剂在制备治疗肺动脉高压和/或抑制肺动脉外膜成纤维细胞活化的药物中的应用。

优选的，所述上调SOCS3表达的试剂的试剂包括间充质干细胞。

优选的，所述SOCS3和/或上调SOCS3表达的试剂通过下调STAT3磷酸化水平，治疗肺动脉高压和/或抑制肺动脉外膜成纤维细胞活化。

有益效果：

本发明通过整合转录组学和功能实验，揭示了MSC通过旁分泌作用激活SOCS3表达，进而抑制STAT3的过度磷酸化，从而阻断PAAF活化及ECM异常沉积的分子机制。SOCS3的表达水平可以作为判断间充质干细胞抑制肺动脉外膜成纤维细胞活化的标志物，也可以作为判断间充质干细胞对肺动脉高压治疗效果的标志物。通过上调SOCS3表达，可以抑制STAT3的过度磷酸化，抑制肺动脉外膜成纤维细胞活化及Col1和Col3表达，但不影响其增殖活性，进而治疗PAH。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为MSC对MCT诱导的PAH肺血管ECM重构的治疗作用；其中，A为各组远端肺动脉α-SMA（绿色）和Col1（紫色）免疫荧光共定位显微图像，细胞核用DAPI蓝色复染，标尺：10 μm；B为远端肺动脉Col1荧光强度定量分析；C为RT-qPCR检测各组远端肺组织Col1 mRNA相对表达水平；D为各组远端肺动脉α-SMA（绿色）和Col3（红色）免疫荧光共定位显微图像，细胞核用DAPI蓝色复染，标尺：10 μm；E为远端肺动脉Col3荧光强度定量分析；F为qRT-PCR检测各组远端肺组织Col1 mRNA相对表达水平；实验数据以均值±标准差表示（每组n=7-8）；

图2为MSC抑制MCT诱导的PAH中PAAF活化；其中，A为各组远端肺动脉α-SMA（绿色）和vimentin（红色）共定位代表性共聚焦图像，细胞核用DAPI蓝色复染，标尺：10 μm；B为远端肺动脉外膜vimentin+/α-SMA-单阳性细胞数量的定量分析；C为远端肺动脉外膜vimentin+/α-SMA+双阳性细胞数量的定量分析；实验数据以均值±标准差表示（每组n=7-8）；

图3为原代PAAF的鉴定和TGF-β1诱导PAAF活化模型的建立；其中，A为原代PAAF的细胞形态学图像；B为原代PAAF免疫表型鉴定，标尺：200 μm；C为不同浓度TGF-β1处理PAAF48 h后α-SMA蛋白表达的Western blot结果；D为不同浓度TGF-β1处理PAAF 48 h后α-SMA（绿色）的免疫荧光结果，细胞核用DAPI染色（蓝色），标尺：200 μm；E为10 ng/mL TGF-β1不同作用时间后PAAF中α-SMA蛋白表达的Western blot结果；F）为10 ng/mL TGF-β1不同作用时间PAAF中α-SMA（绿色）的免疫荧光结果，细胞核用DAPI染色（蓝色），标尺：200 μm；

图4为MSC对TGF-β1诱导的PAAF活化及ECM沉积的抑制作用；其中，A为MSC与PAAF的transwell非接触共培养体系示意图；B为各组PAAF中α-SMA、Col1和Col3蛋白表达的Western blot图像；C为各组PAAF中α-SMA（绿色）、Col1（绿色）和Col3（红色）表达的免疫荧光染色图像，细胞核用DAPI蓝色复染，标尺：200 μm；D为α-SMA、Col1和Col3蛋白表达的定量分析；E为α-SMA、Col1和Col3荧光强度的定量分析；F为各组PAAF增殖的EdU染色图像，细胞核用DAPI蓝色复染，标尺：400 μm；G为EdU阳性细胞数量的定量分析；H为CCK-8法检测各组PAAF增殖活性结果。实验数据以均值±标准差表示（n=3）；

图5为MSC通过SOCS3/STAT3信号通路抑制PAAF活化；其中，A为MSC治疗组和MCT诱导的PAH组肺动脉的KEGG通路富集分析（MCT+MSC vs. MCT+PBS，n=3）；B为MSC共培养治疗组和TGF-β1刺激PAAF组的KEGG通路富集分析（TGF-β1+MSC vs. TGF-β1+Veh，n=3）；C为各组PAAF中SOCS3、p-STAT3和STAT3蛋白表达的Western blot图像（n=3）；D为SOCS3、p-STAT3/STAT3蛋白表达水平的灰度值定量分析（n=3）；E为RT-qPCR检测各组PAAF中SOCS3 mRNA相对表达量（n=3）；F为各组远端肺动脉p-STAT3表达的免疫组化代表性图像（n=6-8，标尺：10 μm）；G为各组远端肺动脉SOCS3表达的免疫荧光共聚焦显微图像（n=6-8，标尺：10 μm）；H为远端肺动脉外膜p-STAT阳性细胞定量分析（n=6-8）；I为远端肺动脉外膜SOCS3阳性细定量分析（n=6-8）。实验数据以均值±标准差表示；

图1~5中显著性标注：****P<0.0001；***P<0.001；**P<0.01；*P<0.05；ns，表示无显著性差异。

具体实施方式

本发明提供了检测SOCS3表达水平的试剂在制备用于评估间充质干细胞对肺动脉高压治疗效果的产品中的应用。

作为一种实施方式，本发明所述评估间充质干细胞对肺动脉高压治疗效果包括评估间充质干细胞对肺动脉高压血管细胞外基质重构的治疗效果。作为一种实施方式，本发明所述肺动脉高压血管细胞外基质重构包括肺动脉高压血管胶原蛋白异常沉积。作为一种实施方式，本发明所述胶原蛋白包括Collagen 1和Collagen 3。SOCS3在NCBI的登录号为O14543。

作为一种实施方式，本发明所述肺动脉高压血管细胞外基质重构包括野百合碱诱导的肺动脉高压血管细胞外基质重构。

本发明提供了检测SOCS3表达水平的试剂在制备用于评估间充质干细胞抑制肺动脉外膜成纤维细胞活化的效果的产品中的应用。

作为一种实施方式，本发明所述肺动脉外膜成纤维细胞活化包括TGF-β1诱导的肺动脉外膜成纤维细胞活化。

作为一种实施方式，本发明所述产品包括试剂盒。

作为一种实施方式，本发明所述检测SOCS3表达水平的试剂包括抗SOCS3抗体。

本发明通过肺动脉组织和原代PAAF的转录组测序分析，发现MSC治疗显著上调细胞因子-细胞因子受体相互作用通路，通路中SOCS3表达显著上调。SOCS3的上调可抑制JAK2激酶活性并降低STAT3磷酸化表达。本发明体内外实验证实MSC干预后PAAF中SOCS3表达上调，p-STAT3表达下降，揭示了MSC可能通过STAT3通路抑制PAAF活化及胶原沉积，为MSC调控血管ECM重构作用的机制提供了理论依据。SOCS3的表达水平可以作为判断间充质干细胞抑制肺动脉外膜成纤维细胞活化的标志物，也可以作为判断间充质干细胞对肺动脉高压治疗效果的标志物。

本发明提供了SOCS3和/或上调SOCS3表达的试剂在制备治疗肺动脉高压和/或抑制肺动脉外膜成纤维细胞活化的药物中的应用。

作为一种实施方式，本发明所述上调SOCS3表达的试剂的试剂包括间充质干细胞。作为一种实施方式，本发明所述间充质干细胞为原代间充质干细胞；作为另一种实施方式，本发明所述间充质干细胞包括P0~P3代中任意一代或者多代的原代间充质干细胞。作为一种实施方式，本发明所述SOCS3和/或上调SOCS3表达的试剂通过下调STAT3磷酸化水平，治疗肺动脉高压和/或抑制肺动脉外膜成纤维细胞活化。

Col1和Col3的异常沉积是PAH血管重构最主要的胶原成分，本发明通过免疫荧光共定位结果发现，PAH模型组肺血管中Col1和Col3表达显著升高，而MSC治疗可显著抑制这种病理性的血管ECM沉积，使两种胶原蛋白表达水平明显降低。本发明通过免疫荧光共定位结果发现，Col1和Col3主要富集于α-SMA阳性区域的外周，提示PAAF可能是其主要来源。本发明创新性地结合免疫荧光双标技术及血管空间定位方法，证实MSC选择性抑制活化态PAAF数量，而对静息态PAAF数量无显著影响。通过transwell间接共培养系统，在细胞水平上进一步验证了MSC可通过旁分泌作用显著抑制TGF-β1诱导的PAAF活化及Col1和Col3表达，但不影响其增殖活性，MSC干预显著改善这些胶原的表达。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的检测SOCS3表达水平的试剂在制备评估间充质干细胞对肺动脉高压治疗效果的产品中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

本发明实施例使用的试剂和耗材：Recombinant Mouse/Rat TGF-β1（苏州近岸）、一抗α-SMA（英国Abcam）、一抗Col1（英国Abcam）、一抗Col3（武汉赛维尔）、一抗vWF（英国Abcam）、一抗Vimentin（武汉塞维尔）、一抗SOCS3（美国Proteintech）、一抗p-STAT3（美国CST）、一抗STAT3（美国CST）、山羊抗小鼠IgG H&L (Alexa Fluor® 488)（英国Abcam）、山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor® 594)（英国Abcam）、HRP偶联的山羊抗小鼠二抗（武汉赛维尔）、HRP偶联的山羊抗兔二抗（武汉赛维尔）、TBS（武汉赛维尔）、Tween 20（烟台清骏）、环保脱蜡剂（武汉同声）、PBS（美国Gibco）、无水乙醇（北京国药集团）、75%酒精消毒液（北京国药集团）、1×Tris-EDTA（pH 9.0）抗原修复液（武汉赛维尔）、内源性过氧化物酶封闭液（上海碧云天）、DAB显色试剂盒（武汉博士德）、免疫组化笔（武汉塞维尔）、自发荧光淬灭剂（武汉赛维尔）、BSA（广州顺豪）、DAPI（武汉赛维尔）、抗荧光淬灭封片剂（武汉赛维尔）、显微镜载玻片（江苏世泰）、显微镜盖玻片（江苏世泰）、TransZol Up高性能RNA提取试剂盒（北京全式金，ET111-01-V2）、cDNA逆转录试剂盒（上海翌圣）、RT-qPCR试剂盒（上海翌圣）、0.2 mL透明PCR管（美国康宁）、DEPC处理水（0.1%）（北京雷根）、各种规格transwell小室（美国康宁）、各种规格移液管（江苏耐思）、EdU-594细胞增殖检测试剂盒（上海碧云天）、CCK8试剂盒（美国MCE）、甲醇（上海麦克林）、蛋白酶和磷酸酶抑制剂（上海碧云天）、RIPA Lysis Buffer（美国ThermoFisher）、微量 BCA 蛋白定量试剂盒（美国ThermoFisher）、ECL发光液（上海天能）、PVDF膜（德国Merck）、5×蛋白上样缓冲液（杭州弗德）、蛋白Marker（美国ThermoFisher）、10% SDS-PAGE（上海雅酶）、SDS-PAGE电泳液（上海碧云天）、Western转膜液（上海碧云天）、Western一抗稀释液（上海碧云天）、QuickBlock^TMWestern封闭液（上海碧云天）。

本发明实施例使用的主要仪器：蛋白电泳仪（美国Bio-Rad）、组织裂解仪（广州露卡测序仪器）、化学发光仪（上海天能）、分光光度计微孔板阅读器（美国Themo）、酶标仪（美国Themo）。

实施例1

MSC对野百合碱（MCT）诱导的PAH肺血管ECM重构的治疗作用

1.参照现有技术（鲍长磊. 青蒿素和ROC-325在肺动脉高压实验动物模型中的治疗作用与机制研究[D]. 西北农林科技大学, 2022. DOI:10.27409/d.cnki.gxbnu.2022.002256.），对180-220 g的SPF级雄性SD大鼠单次腹腔注射MCT（50 mg/kg），构建MCT诱导的PAH动物模型。

2.肺组织免疫荧光染色

（1）将肺组织切片置于70℃烤箱中烤片2 h；（2）切片在TO透明剂溶液Ⅰ和TO透明剂溶液Ⅱ中各浸泡5 min，进行脱蜡；（3）将切片依次放于梯度酒精（100%Ⅰ→100%Ⅱ→95%→80%→70%→蒸馏水）中进行水化，各5 min；（4）EDTA抗原修复液提前加热至沸腾（100℃），放入切片后，微波炉加热维持温度稳定在95℃以上，高温10-20 min，随后冷却至室温，含吐温20的Tris缓冲盐溶液（Tris-buffered saline with Tween 20，TBST）洗3次，每次5 min；（5）免疫组化笔画圈标记组织，5% BSA封闭液室温封闭1.5 h；（6）滴加适量一抗稀释液，4℃湿盒中孵育过夜。所用抗体为：α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA，ab7817，1:1000）、Collagen 1（Col1，ab270993，1:500）、Collagen 3（Col3，GB111629，1:300）、波形蛋白（Vimentin，ab92547，1:300）、SOCS3（2923S，1:100）；（7）第二天湿盒室温复温30 min，TBST洗3次，每次5min；（8）滴加对应二抗，室温避光孵育1.5 h，TBST洗3次，每次5 min；（9）DAPI 染液避光染色10 min，TBST 洗3 次，每次5 min；（10）滴加抗荧光淬灭封片剂封片。切片晾干后用全景组织细胞定量TG扫描系统扫描，SlideViewer软件进行观察。

3.RT-qPCR检测肺组织中mRNA的表达

3.1利用TransZol Up高性能RNA提取试剂盒提取肺组织RNA。

3.2利用cDNA逆转录试剂盒将步骤3.1得到的肺组织RNA逆转录为cDNA，具体步骤如下：

（1）残留基因组DNA去除：在RNase free离心管中配制混合液（5×gDNA digesterMix 3 μL、Total RNA 10 pg~5 μg，RNase-free H₂O补足至15μL），用移液枪轻轻吹打混匀，42℃孵育2 min，得到第1步反应液。（2）将第1步反应液和5 μL 4×Hifair^®Ⅲ SuperMixplus混合，按照25℃ 5 min、55℃ 15 min、85℃ 5 min的程序逆转录，逆转录产物可立即用于qRT-PCR反应，也可-20℃短期保存。若长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。

3.3 RT-qPCR检测

（1）委托华大基因公司合成检测引物，具体如表1所示。

表1 RT-qPCR检测引物

（2）RT-qPCR检测反应体系的配置：Hieff UNICON® qPCR SYBR Green MasterMix（抗体法，High Rox） 10 μL、上游引物（10 μM） 0.4 μL、下游引物（10 μM） 0.4 μL、模版DNA 2 μL，无菌超纯水补足至20 μL，操作都在冰上进行；

RT-qPCR检测反应程序：95℃预变性30 sec；95℃变性10 sec，55-60℃退火20sec，72℃延伸20 sec，40个循环；溶解曲线阶段仪器默认设置1个循环。

4.统计学分析

采用GraphPad Prism软件（版本9.5）进行统计分析。两组间比较采用Student’s t检验，多组比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）。所有图像数据使用ImageJ软件进行定量分析。P<0.05被认为差异有统计学意义，所有定量数据均以均值±标准差（Mean ±SD）表示。

5.实验结果

与正常对照组（Nor组）相比，MCT模型组肺血管中Col1（图1中A和B）和Col3（图1中D和E）表达显著升高（P＜0.001），而MSC治疗可显著抑制这种病理性的血管ECM沉积，使两种胶原蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。该结果在mRNA水平得到验证，RT-qPCR结果显示MSC组远端肺组织中Col1和Col3 mRNA水平较MCT模型组显著下降（P＜0.05，图1中C和F）。通过空间分布分析发现，Col1和Col3主要富集于α-SMA阳性区域（即PASMC层）的外周部分（图1中A和D）。这种特征性的分布模式提示，血管外膜PAAF可能是病理性ECM沉积的主要细胞来源。

3.基于步骤2的结论，进一步探讨了MSC对肺动脉外膜成纤维细胞（PAAF）活化的调控作用。由于血管成纤维细胞缺乏单一特异性标志物，波形蛋白（Vimentin）可同时表达于血管成纤维细胞和内皮细胞，而α-SMA除表达于PASMC外，亦表达于活化态成纤维细胞，本步骤通过整合双标免疫荧光共染技术（Vimentin/α-SMA）与血管解剖定位，对PAAF进行鉴别和解析。将活化态PAAF定义为位于α-SMA阳性PASMC层外周区域中的vimentin+α-SMA+双阳性细胞，而静息态PAAF则为相同区域内vimentin+α-SMA-单阳性细胞。定量分析显示：与Nor组相比，MCT模型组血管外膜中活化态和静息态PAAF数量均显著增加（P＜0.0001，图2中A-C）；MSC治疗后，活化态PAAF数量显著减少（P＜0.0001，图2中A和C），但静息态PAAF数量无显著影响（P＞0.05，图2中A和B）。这些结果表明，MSC主要通过抑制PAAF由静息态向活化态的转化，而非影响静息态细胞数量，来改善血管ECM的病理性沉积。该发现为阐明MSC治疗PAH过程中对血管ECM重构的特异性调控靶点提供了重要的实验依据。

实施例2

1. PAAF的提取，具体步骤如下：

（1）取6-8周龄、体重约200 g左右的正常雄性SD大鼠，异氟烷深度麻醉后固定于操作台上。75%酒精对大鼠胸腹部进行充分消毒后，用高压灭菌的大剪刀沿正中线剪开胸腹部皮肤，更换另一把高压灭菌的大剪刀剪开横膈膜及肋骨，充分暴露胸腔内的肺组织，此时再次更换高压灭菌的小剪刀，仔细分离并完整剪下肺组织；

（2）将分离的肺组织放入预冷的含2%青链霉素的无菌磷酸盐缓冲液（Phosphate-buffered saline，PBS）中，充分清洗以去除血液和杂质。在体式显微镜下分离各叶肺动脉，分离过程中尽量确保血管完整。将分离后的肺动脉用预冷的含2%青链霉素的无菌PBS溶液清洗3遍。将肺动脉转移至生物安全柜内，再用预冷的含2%青链霉素的无菌PBS溶液清洗数遍。将肺动脉转移至6孔板中，使用高压灭菌的显微剪将其剪成约1 mm×1 mm×1 mm的小块。随后将组织块均匀铺展于孔板底部，置于37℃、5% CO₂培养箱中静置约10 min，促进组织块贴附

（3）组织贴附后向6孔板中各孔缓慢加入2 mL高糖DMEM完全培养基（含20% 胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）及1%青链霉素），加液时枪头沿孔壁缓慢注入，避免直接冲击组织块。随后将培养板置于37℃、5% CO₂培养箱中继续培养；

（4）原代培养5-7 d后，在光学显微镜下可见大量梭形细胞从组织块边缘爬出。在生物安全柜内，使用无菌枪头轻柔吸走组织块，避免损伤贴壁细胞。吸弃培养上清，用无菌PBS溶液轻柔洗涤2遍，每次1 mL；

（5）每孔加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液，37℃孵育2-3 min，待细胞变圆后加入2 mL的完全培养基终止消化，吹打制成单细胞悬液并转移至15 ml离心管。若消化不完全，可补加1 mL消化液进行二次消化，合并两次消化所得细胞悬液；

（6）细胞悬液经500 g离心5 min后，弃去上清，加入1mL完全培养基重悬细胞。将细胞悬液转移至T25培养瓶，采用“十字法”轻柔摇匀后置于37℃、5% CO₂培养箱中进行差速贴壁培养。60 min后，小心吸弃含未贴壁细胞培养基，用无菌PBS轻柔清洗2次。高糖DMEM完全培养基（含10% FBS及1%青链霉素）继续培养，每2-3 d更换新鲜培养基。待细胞融合度达80-90%左右时进行传代。后续所有实验均使用3代以内的原代PAAF。

2. PAAF的鉴定

细胞荧光波形蛋白（Vimentin）作为中胚层来源间充质细胞的标志性中间纤维蛋白，在成纤维细胞、内皮细胞、中性粒细胞及巨噬细胞中均有表达，是鉴定成纤维细胞的重要分子标记物。α-SMA主要表达于平滑肌细胞和活化的成纤维细胞，而在静息态成纤维细胞中呈阴性表达。血管性血友病因子（Von willebrand factor，vWF）作为内皮细胞特异性标记物，可有效排除内皮细胞污染。因此，通过检测vimentin+/α-SMA-/vWF-的免疫表型特征可准确鉴定为成纤维细胞。细胞免疫荧光染色具体步骤如下：

（1）取P1代PAAF，以5×10⁴个cells/孔的密度接种于24孔板中，每孔加入500 μL高糖DMEM完全培养基（含10% FBS及1%青链霉素），置于37℃、5% CO₂培养箱中培养24 h至细胞完全贴壁；

（2）细胞贴壁后，小心吸弃培养上清，每孔加入1mL PBS，沿孔壁缓慢加入，轻柔摇晃5 min后弃去，清洗3次，操作过程中保持枪头始终不接触孔底，避免机械力损伤贴壁细胞；

（3）每孔加入1 mL 4%多聚甲醛溶液，室温固定30 min，吸弃固定液，1mL PBS清洗3遍，每次5 min；

（4）每孔加入1 mL 0.1% Triton X-100溶液，室温透化30 min，吸弃透化液，1mLPBS清洗3遍，每次5 min；

（5）每孔加入1 mL 5% BSA溶液，室温封闭30 min，吸弃封闭液，无需清洗；

（6）每孔加入300 μL的一抗工作液 [Vimentin（GB11192，1：300）、vWF（ab6994，1：200）、α-SMA（ab7817，1:500）]，将24孔板置于4℃孵育过夜（16-18 h）。次日，吸弃一抗，1mLPBS清洗3遍，每次5 min；

（7）每孔加入300 μL荧光标记的二抗工作液（山羊抗小鼠IgG H&L (Alexa Fluor® 488)和山羊抗兔IgG H&L (Alexa Fluor® 594)），室温避光孵育1.5 h，吸弃二抗，1mLPBS清洗3遍，每次5 min；

（8）每孔加入300 μL DAPI，室温避光孵育10 min，吸弃DAPI染液，1mL PBS清洗3遍，每次5 min；

（9）为保持样本湿润，每孔加入500 μL PBS。立即使用Leica DMi8正置荧光显微镜进行图像采集，或短期保存时将24孔板密封后置于4℃避光保存（建议议7 d内完成图像采集）。结果表明，PAAF细胞呈现典型的成纤维细胞形态学特征，表现为梭形细胞体伴随细长突起，呈放射状或漩涡状生长，细胞汇合时形成特异性的的“铺路石”样排列（图3中A）。通过免疫荧光鉴定证实，分离细胞vimentin阳性率>95%，而平滑肌细胞标志物α-SMA和内皮细胞标志物vWF表达均低于5%，表明所获得的PAAF纯度高，满足后续实验要求（图3中B）。

3.鉴于TGF-β1是促纤维化反应的关键调控因子，系统设置浓度梯度（0、5、10 ng/mL）和时间进程（0、24、48 h）实验，证实10 ng/mL TGF-β1刺激48 h可显著上调PAAF的α-SMA表达（图3中C-F）。这一标准化PAAF活化条件的建立，为后续研究MSC调控PAAF活化的分子机制提供了可靠的实验模型。

实施例3

PAAF/MSC transwell共培养体系的建立（间接共培养）

1. MSC复苏与培养

将已完成成骨、成脂及成软骨三系分化鉴定的人骨髓来源的MSC P2代细胞传代至P4代冻存于液氮罐。提前打开水浴锅并调节温度至37℃恒定，从液氮罐中取出冻存细胞，快速转移至37℃水浴锅中，轻柔晃动冻存管使细胞悬液迅速解冻。随后，加入2 mL MSC培养基（XR MSC Pro间充质干细胞完全培养基）稀释细胞冻存悬液，500 g离心5 min后弃去上清。加入1 mL MSC培养基重悬细胞沉淀，将细胞悬液接种至适宜规格的培养瓶中，置于37℃、5%CO₂培养箱中进行培养。每2~3天更换一次培养基，待细胞长至80%时，用0.25%胰酶进行消化传代。连续传代大量扩增细胞后，将细胞消化、离心、弃上清液后，用无菌0.9%生理盐水重悬细胞，采用台盼蓝染色液1：1混匀后进行细胞计数，当细胞活率＞90%方可使用，用无菌0.9%生理盐水将细胞悬液浓度调整至3.0×10⁶cells/mL，置于4℃保存，6 h内使用。所有实验均使用8代内的MSC。

2.在0.4μm孔径的transwell上室接种4×10⁵个MSC，同时在另一个6孔板底部接种2×10⁵个PAAF，两组细胞先分别用各自完全培养基培养24 h以确保细胞充分贴壁。然后移除6孔板中培养基，对PAAF进行8 h无血清高糖DMEM培养基饥饿处理。处理完成后，更换为2mL含10 ng/mL TGF-β1的无血清高糖DMEM刺激培养基，同时将接种MSC的transwell小室置于培养体系上层，同时在上层小室中加入1.5 mL无血清高糖DMEM培养基（图4中A）。共培养系统在37℃、5% CO₂条件下培养48 h后，收集下层PAAF用于后续功能学检测和分析。

3.蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB）检测

3.1细胞总蛋白的提取

（1）取150 μL RIPA裂解液，加3 μL蛋白酶抑制剂和3 μL磷酸酶抑制剂，涡旋混匀后置于冰上备用；

（2）细胞清洗与裂解：吸弃细胞培养液，用预冷的PBS清洗3遍，彻底去除残留培养基；每孔加150 μL预冷的RIPA裂解液，冰上孵育10 min，使细胞充分裂解；用细胞刮刀挂下细胞，并反复吹打裂解液，确保细胞完全破碎，收集裂解液至离心管；

（3）离心与上清收集：4℃、15000 rpm离心20 min，小心吸取上清液，避免吸入沉淀；

（4）蛋白浓度测定（BCA法）：按照BCA蛋白定量试剂盒说明书配制标准品，检测样品吸光度，计算每个样品的蛋白浓度；

（5）蛋白样品制备与保存：将蛋白样品与5×上样缓冲液按4：1比例混合，100℃煮沸10 min使蛋白变性；分装后短期保存于-20℃，长期保存于-80℃。

3.2 BCA法测定蛋白浓度

（1）BCA工作液配制：临用前按试剂A：试剂B=50：1比例混合，避光保存，2 h内使用；

（2）蛋白标准品梯度制备：取2 μg/μL蛋白标准品用PBS进行梯度稀释（2 μg/μL→1μg/μL→0.5 μg/μL→0.25 μg/μL→0.125 μg/μL→0.0625 μg/μL），每个浓度准备100 μL；

（3）加样方案：稀释后的蛋白标准品按浓度依次加到96孔板中，每孔20 μL，每个浓度设3个复孔。待测样品的孔内先各加19 μL的PBS，然后每孔内再加1 μL的待测蛋白样品，每个样品设3个复孔；设置空白对照孔（20 μL PBS）；

（4）反应体系：各孔加200 μL BCA工作液，轻轻混匀，37℃避光孵育30 min；

（5）检测与分析：酶标仪检测562 nm吸光度（OD 值）。标准曲线制作：扣除空白孔背景值；以浓度为横坐标，平均OD值为纵坐标，采用二次线性回归拟合标准曲线（R²≥0.99）。样品浓度计算：实测浓度×稀释倍数（20×）。

3.3 Western Blot实验步骤

（1）配下层胶：根据实验目的分子的大小选择10% SDS-PAGE分离胶（配制方法参照雅酶说明书）。配好后混匀即刻加入两层玻璃板之间（1.5 mm厚的玻璃板常规加7-8 mL下层胶），然后小心在下层胶上加1 mL异丙醇压平下层胶，室温静置待其凝固；

（2）配上层胶：待下层胶凝固后，直接倒掉异丙醇，用双蒸水洗涤凝胶以去除未聚合的丙烯酰胺，用滤纸吸净残留水分。上层胶配制方法参照雅酶说明书，配好后混匀即刻加入两层玻璃板之间（1.5 mm厚的玻璃板常规加2 mL上层胶），随后立即插入干净无水的Teflon梳子，避免气泡产生，室温静置待其凝固。待上层胶凝固后小心拔出梳子，将配制的凝胶固定于电泳槽上，内外槽中加满Tris-甘氨酸电泳缓冲液；

（3）上样：取出-20℃保存的蛋白样品，每孔上样20 μL（每孔总蛋白量为40 μg），预染蛋白marker作为参照；

（4）跑胶：80 V恒压电泳至样品进入分离胶，随后调整为120 V恒压电泳至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部；

（5）转膜：采用湿转法将蛋白转移至0.22 μm PVDF膜上。跑胶结束后，取出凝胶，根据凝胶大小裁剪相近的PVDF膜，将PVDF膜置于甲醇中激活10 s。然后，将两层滤纸、凝胶、PVDF膜、两层滤纸按“黑胶白膜”顺序置于塑料夹之间，凝胶与PVDF膜之间避免气泡存在。将塑料夹小心放置到电泳槽中，加转膜液（转膜液按雅酶说明书配制）至没过凝胶上沿。转膜条件：400 mA 恒流转膜90-120分钟。转膜完成后，用TBST缓冲液洗膜2次，每次5min；

（6）封闭：转膜完成后用TBST缓冲液清洗2遍PVDF膜，然后用5%脱脂牛奶室温封闭2h，TBST缓冲液洗膜2次，每次5min；

（7）孵一抗：加入一抗稀释液，4℃摇床上孵育过夜。一抗浓度为：α-SMA（ab7817，1:1000）、Col1（ab34710，1:1000）、Col3（GB111629，1:1000）STAT3（9139S，1:1000）、p-STAT3（9145S，1:1000）、SOCS3（2923S，1:500）。次日，TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min；

（8）孵二抗：加入HRP标记的二抗（1:5000, 赛维尔），室温孵育1 h，TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min；

（9）加入ECL化学发光试剂显影液，通过Tanon-5200多功能成像系统采集蛋白条带图像。采用ImageJ软件对分析条带灰度值进行定量分析。

4. CCK8实验检测细胞增殖

在PAAF/MSC transwell共培养体系终止前2 h，吸掉孔板中原有培养基，然后每孔加入预先配制好的含CCK8试剂的新鲜培养基（培养基：CCK8=10：1），加样时避免气泡产生。需设置仅含培养基加CCK8试剂的空白对照组。将培养板置于37℃、5%CO₂培养箱中孵育1-4h，孵育时间可根据细胞状态适当调整。孵育结束后，使用酶标仪450 nm波长下测定各孔的吸光度（OD值）。细胞增殖率计算公式为：（实验组OD值-空白组OD值）/（对照组OD值-空白组OD值）×100%。

5 EdU实验检测细胞增殖

在PAAF/MSC Transwell共培养体系结束前2 h，向培养基中加入EdU工作液至终浓度为10μM，置于37℃培养箱中继续孵育2 h，使EdU充分整合进入处于S期细胞的DNA合成链中。孵育结束后，弃除培养基，采用4%多聚甲醛溶液室温固定细胞30 min，随后使用0.3%Triton X-100进行细胞膜通透处理10 min。按照试剂盒说明书配制Click反应混合液，将反应液加入孔板后于室温条件下避光孵育30 min。孵育结束后，使用PBS缓冲液充分洗涤去除未结合染料，加入DAPI进行细胞核复染10min。最后，在荧光显微镜下观察并采集图像。随机选取5个不重叠视野，采用ImageJ软件进行图像分析。实验过程中注意避光操作。

Western blot结果显示，经10 ng/mL TGF-β1刺激48 h后，PAAF中肌成纤维细胞标志物α-SMA以及ECM成分Col1和Col3的表达水平均显著升高（P＜0.05，图4中B和D）。与MSC共培养后，这些指标的表达均显著降低（P＜0.05，图4中B和D）。免疫荧光染色结果进一步证验证了这一发现：TGF-β1刺激组可见明显的α-SMA表达和胶原沉积（Col1和Col3），而MSC共培养组这些病理改变显著减轻（P＜0.05，图4中C和E）。通过EdU增殖实验和CCK8检测发现，虽然TGF-β1刺激使PAAF增殖率明显增加，但MSC共培养后，两组增殖活性未见统计学差异（图4中F-H）。这些结果表明，MSC通过旁分泌机制显著抑制TGF-β1诱导的PAAF活化及ECM沉积，但并不影响PAAF的增殖活性。

实施例4

组织和细胞转录组测序与生物信息学分析

用于测序的RNA使用Nanodrop测定RNA浓度和纯度，确保A260/A280>1.8，并通过Agilent 2100 Bioanalyzer检测RNA完整性，要求RIN值>8.0。使用mRNA Library Prep Kit进行文库构建，包括mRNA纯化、片段化、cDNA合成、末端修复、加A尾、接头连接和PCR扩增等步骤。构建完成的文库进行双端150 bp测序。测序数据分析质控后，使用DESeq2进行差异表达分析，筛选标准为|log2FC|>1且FDR<0.05的基因。对差异表达基因进行GO功能注释和KEGG通路富集分析，以揭示其生物学功能和参与的代谢通路。

通过对肺动脉组织（图5中A）和原代PAAF（图5中B）的转录组测序分析，发现MSC治疗显著上调了“细胞因子-细胞因子受体相互作用（Cytokine-cytokine receptorinteraction）”通路。值得注意的是，该通路中的关键负调控因子-细胞因子信号转导抑制因子3（Suppressor of cytokine signaling 3，SOCS3）表达显著上调。在细胞水平上，发现MSC共培养显著上调SOCS3表达并下调STAT3磷酸化水平（P＜0.05，图5中C-E）。动物实验进一步验证了这一机制：与MCT模型组相比，MSC治疗后，肺动脉外膜表达SOCS3细胞数显著升高（P＜0.05，图5中G和I），且表达p-STAT3细胞数显著降低（P＜0.001，图5中F和H）。这些结果揭示了MSC通过旁分泌作用激活SOCS3表达，进而抑制STAT3的过度磷酸化，从而阻断PAAF活化及ECM异常沉积的分子机制。该发现不仅进一步阐明了MSC治疗PAH的作用机制，而且为PAH的治疗提供了新的潜在靶点。

根据上述内容可以看出，SOCS3可以作为评估MSC抑制PAAF活化以及治疗PAH的标志物，为PAH的治疗提供了新的潜在靶点；通过激活SOCS3表达，可以抑制STAT3的过度磷酸化，从而阻断PAAF活化及ECM异常沉积。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.检测SOCS3表达水平的试剂在制备用于评估间充质干细胞对肺动脉高压治疗效果的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述评估间充质干细胞对肺动脉高压治疗效果包括评估间充质干细胞对肺动脉高压血管细胞外基质重构的治疗效果。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肺动脉高压血管细胞外基质重构包括野百合碱诱导的肺动脉高压血管细胞外基质重构。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述肺动脉高压血管细胞外基质重构包括肺动脉高压血管胶原蛋白异常沉积；所述胶原蛋白包括Collagen 1和Collagen 3。

5.检测SOCS3表达水平的试剂在制备用于评估间充质干细胞抑制肺动脉外膜成纤维细胞活化的效果的产品中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述肺动脉外膜成纤维细胞活化包括TGF-β1诱导的肺动脉外膜成纤维细胞活化。

7.根据权利要求1~6任一项所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒；

所述检测SOCS3表达水平的试剂包括抗SOCS3抗体。

8. SOCS3和/或上调SOCS3表达的试剂在制备治疗肺动脉高压和/或抑制肺动脉外膜成纤维细胞活化的药物中的应用。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述上调SOCS3表达的试剂的试剂包括间充质干细胞。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述SOCS3和/或上调SOCS3表达的试剂通过下调STAT3磷酸化水平，治疗肺动脉高压和/或抑制肺动脉外膜成纤维细胞活化。