CN121427917A - 一种苜蓿种子特异性启动子及其在智能保持系培育中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种苜蓿种子特异性启动子及其在智能保持系培育中的应用。本发明属于生物技术领域，具体涉及一种苜蓿种子特异性启动子及其在智能保持系培育中的应用。本发明提供了如下a）、b）或c）DNA分子：a）核苷酸序列是SEQ ID No:1的第25‑2210位的DNA分子；b）与a）限定的核苷酸序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上或者80%以上同一性，且来源于相同功能的DNA片段；c）在严格条件下与a）或b）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。本发明提供的苜蓿种子特异性启动子OLEpro能够用于提高基因在种子特异性的表达，应用于植物种子特异性标记或种子性状改良育种。

Description

一种苜蓿种子特异性启动子及其在智能保持系培育中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种苜蓿种子特异性启动子及其在智能保持系培育中的应用。

背景技术

紫花苜蓿是多年生豆科牧草，享有“牧草之王”美誉，具有蛋白质含量高、适口性佳等优良特性，是畜牧业发展的重要物质基础之一。目前，苜蓿育种工作以轮回选择为主，育种周期长、育成品种数量少、稳定性和一致性较差。为进一步推动苜蓿遗传改良，建立以雄性不育系为基础的杂种优势利用系统是苜蓿育种的关键技术突破。

此前研究在苜蓿中鉴定到一个细胞核雄性育性调控基因MtNP1/MsNP1，单基因纯合突变造成雄性不育表型。因此，利用基因编辑技术可以在紫花苜蓿中高效创制隐性细胞核雄性不育系；同时，该方法获得的杂合突变体能够产生可育花粉，从而作为保持系利用，与不育系杂交产生后代，在后代中苗期通过鉴定MsNP1的编辑位点基因型来区分不育系和保持系。然而，这种隐性核不育系的保持方法仍然耗时耗力，难以推广至大田生产。因此，建立一种与育性恢复基因连锁、基于种子阶段的无损分选鉴定方法非常必要。

在生物技术育种领域，由于紫花苜蓿多为同源四倍体，杂合度较高，其基因功能解析面临较大挑战，蒺藜苜蓿作为豆科模式物种，具有较小的二倍体基因组、自花授粉、生育期短和易于遗传转化等优势，为苜蓿基因功能研究提供了便利。基于苜蓿基因组，开发种子特异性表达启动子，驱动荧光标记基因，能有效筛选转基因种子。因此，种子特异性表达启动子是植物种子基因工程改良的重要工具。

综上所述，开发一种苜蓿种子特异性表达的启动子，对于苜蓿的基础研究和生物育种应用具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的主要问题是如何使苜蓿种子特异性表达，并便于苜蓿育种。

为了解决上述问题，本发明提供了如下a）、b）或c）的DNA分子：

a）核苷酸序列是SEQ ID No:1的第25-2210位的DNA分子；

b）与a）限定的核苷酸序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上或者80%以上同一性，且来源于苜蓿并具有启动子功能的DNA片段；

c）在严格条件下与a）或b）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。

上述75%或75%以上一致性，可为80%、85%、90%、95%以上的一致性。

本发明还提供了含有前文所述DNA分子的表达盒或重组载体。

所述含有OLE _pro启动子的表达盒，是指能够在宿主细胞中表达目的基因的DNA，该DNA不但包括启动所述目的基因的OLE _pro启动子，还可包括终止所述目的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。所述转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子（NOS终止子）、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子（参见，例如：Odell 等人（I985) Nature 313:810；Rosenberg等人（1987) Gene, 56:125；Guerineau等人(1991) Mol. Gen. Genet，262:141；Proudfoot (1991) Cell, 64:671;Sanfacon等人Genes Dev.，5:141；Mogen等人(1990) Plant Cell, 2:1261； Munroe等人（1990) Gene, 91:151；Ballad等人(1989)Nucleic Acids Res. 17:7891；Joshi等人(1987) Nucleic Acid Res., 15:9627)。

其中，所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

在一个具体的实施例中，所述重组载体可为pEarleyGate100-OLE _pro :RFP 载体。

所述pEarleyGate100-OLE _pro :RFP 载体的结构描述如下：是在出发载体pEarleyGate100的5’-GCAGCAGCTGACGCGTAC-3’和5’-TCTAGAGAGTTAATTAAG-3’两个片段之间插入序列为SEQ ID No:1第19-2897位的DNA片段，保持载体pEarleyGate100其他序列不变得到的重组载体。pEarleyGate100-OLE _pro :RFP 载体可表达RFP荧光蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No:2。

在一个具体的实施例中，所述重组载体可为pCAMBIA1381-MF::S载体。所述pCAMBIA1381-MF::S载体的结构描述如下：是在出发载体pCAMBIA1381的5’-TTGGGCCCGGCGCGCC-3’和5’-GGGAATTAAACTATCAGT-3’两个片段之间插入序列为SEQ ID No:3第17-7930位的DNA片段，保持载体pCAMBIA1381其他序列不变得到的重组载体。pCAMBIA1381-MF::S载体可表达MtNP1基因和RFP荧光蛋白，MtNP1氨基酸序列为SEQ ID No:4的第1-580位，RFP荧光蛋白氨基酸序列为SEQ ID No:2。

本发明还提供了含有前文所述DNA分子的重组微生物。

所述重组微生物具体可为细菌，酵母，藻和真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属（Escherichia ）、欧文氏菌(Erwinia )、根癌农杆菌属（Agrobacterium ）、黄杆菌属（Flavobacterium ）、产碱菌属（Alcaligenes ）、假单胞菌属（Pseudomonas ）、芽胞杆菌属（Bacillus ）等。所述的转基因细胞系不包括植物的繁殖材料。

本发明还提供了含有前文所述DNA分子的转基因细胞系。

本发明还提供了前文所述的DNA分子作为启动子的应用。

本发明还提供了前文所述DNA分子在植物中启动目的基因表达中的应用。

进一步地，所述启动目的基因表达为启动目的基因在植物种子中特异表达。

本发明还提供了前文所述DNA分子或重组载体或表达盒、重组微生物或转基因细胞系在培育转基因植物或植物育种中的应用。

所述转基因植物理解为不仅包含将目的基因转化目的植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

前文所述DNA分子在构建苜蓿智能保持系中的应用也属于本发明要求保护的范围。

所述苜蓿智能保持系可为在苜蓿不育系背景下转入携带包括SEQ ID No:3第17-7930位的DNA片段形成的转基因株系，具体可表现为：在msnp1 -L1敲除突变体苜蓿受体背景下转入pCAMBIA1381-MF::S载体生成的苜蓿转基因株系，其产生可育花粉，并与不育系杂交后产生不具有荧光的不育系种子和具有荧光的保持系种子。

进一步地，所述植物可为如下：

N1)双子叶植物；

N2)豆目植物；

N3)豆科植物；

N4)苜蓿属植物；

N5)蒺藜苜蓿或紫花苜蓿。

本发明提供了一种苜蓿种子特异性启动子OLEpro及其应用方法。该启动子能够用于提高基因在种子特异性的表达，应用于植物种子特异性标记或种子性状改良，例如，该启动子驱动荧光标记蛋白形成的分子模块，能够实现转基因种子高效、无损可视化分选。将该种子表型标记模块与花粉育性恢复基因模块连锁，能够在隐性核不育系遗传背景下创制智能保持系，其与不育系杂交，后代可以通过荧光分选获得无外源转基因的不育系种子，实现隐性核不育系制种。本发明提供的方法有利于快速、无损鉴定转基因种子，对于生物育种具有重要意义。

附图说明

图1为载体pEarleyGate100-OLE _pro :RFP 的结构示意图。

图2为根癌农杆菌介导的蒺藜苜蓿R108受体背景下遗传转化获得OLE _pro :RFP 转基因再生植株的过程。

图3为蒺藜苜蓿遗传转化再生植株OLE _pro :RFP -1、OLE _pro :RFP -2、OLE _pro :RFP -3的转基因鉴定结果。图中Marker为DNA标准分子量，“-”表示阴性对照，以野生型R108 DNA为模板，“+”表示阳性对照，以pEarleyGate100-OLE _pro :RFP 质粒DNA为模板。

图4为转基因植株OLE _pro :RFP -1、OLE _pro :RFP -2、OLE _pro :RFP -3的bar试纸检测情况。OLE _pro :RFP -1为1个重复，OLE _pro :RFP -2为3个重复，OLE _pro :RFP -3为3个重复，R108为阴性对照。

图5为转基因植株OLE _pro :RFP -1、OLE _pro :RFP -2、OLE _pro :RFP -3的种子不同发育阶段荧光检测表型。I-IV为种子发育的4个时期，I为生长期，II为营养物质贮存积累期，III为成熟期，IV为完熟期。标尺为1 mm。

图6为载体pCAMBIA1381-MF::S的结构示意图。

图7为紫花苜蓿msnp1 -L1受体背景下通过根癌农杆菌介导的遗传转化获得MF::S转基因植株的过程。

图8为紫花苜蓿msnp1 -L1背景下遗传转化再生植株MF::S-1、MF::S-2、MF::S-3、MF::S-4的转基因鉴定结果。图中Marker为DNA标准分子量；“-”表示阴性对照，以msnp1 -L1DNA为模板；“+”表示阳性对照，以pCAMBIA1381-MF::S质粒DNA为模板。

图9为转基因株系MF::S-2和MF::S-4作为花粉供体分别与msnp1 -L1材料杂交收获的种子荧光检测表型。

图10为转基因株系MF::S-4作为花粉供体与msnp1 -L1材料杂交获得种子的荧光及基因型鉴定。图中M为DNA标准分子量；“-”表示阴性对照，以msnp1 -L1 DNA为模板；“+”表示阳性对照，以MF::S-4 DNA为模板。

图11为智能保持系统构建及应用方法示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的野生型蒺藜苜蓿种子为R108生态型；紫花苜蓿细胞核雄性不育系msnp1 -L1株系来自于Ye, Q.Y., Meng, X.Z., Chen, H., Wu, J.L., Zheng, L.H.,Shen, C., Guo, D., Zhao, Y.F., Liu, J.L., Xue, Q.X., Dong, J.L., and Wang, T.(2022). Construction of genic male sterility system by CRISPR/Cas9 editingfrom model legume to alfalfa.Plant Biotechnology Journal 20, 613-615. 公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的pE3025-cRFP已记载于:Guo, D., Liu, P., Liu, Q.W., Zheng,L.H., Liu, S.K., Shen, C., Liu, L., Fan, S.S., Li, N., Dong, J.L., and Wang,T. (2023). Legume-specific SnRK1 promotes malate supply to bacteroids forsymbiotic nitrogen fixation.Molecular Plant 16, 1396-1412。公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的pCAMBIA1381和MtNP1 _pro :GUS 已记载于:Ye, Q.Y., Meng,X.Z., Chen, H., Wu, J.L., Zheng, L.H., Shen, C., Guo, D., Zhao, Y.F., Liu,J.L., Xue, Q.X., Dong, J.L., and Wang, T. (2022). Construction of genic malesterility system by CRISPR/Cas9 editing from model legume to alfalfa.Plant Biotechnology Journal 20, 613-615.。公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的实验所用，不可作为其它用途使用。

培养基质：蛭石:珍珠岩（体积比）为5:2。

下述实施例中涉及的培养基的配方如下：

YEP培养基（1 L）：酵母提取物10 g、氯化钠5 g、蛋白胨10 g, 固体培养基中加入15 g琼脂。

10×N6大量母液（1 L）：MgSO₄·7H₂O 1.85 g，KNO₃28.3 g，（NH₄）₂SO₄4.63 g，CaCl₂·2H₂O 1.66 g，KH₂PO₄4 g。

1000×SH微量母液（100 mL）：MnSO₄·H₂O 1 g，H₃BO₃500 mg，ZnSO₄·7H₂O 100 mg，KI 100 mg，Na₂MoO₄·2H₂O 10 mg，CuSO₄·5H₂O 20 mg，CoCl₂·6H₂O 10 mg。

1000×SH有机母液（100 mL）：烟酸 500 mg，盐酸吡哆醇 500 mg，盐酸硫胺素 500mg。

50×EDFS铁盐母液（500 mL）：NaFe·EDTA 3.487 g。

SH3a培养基（1 L）的配方为：10×N6大量母液100 mL，1000×SH微量母液1 mL，1000×SH有机母液1 mL，50×EDFS铁盐母液20 mL，2，4-D储存液（10 mg/mL）0.4 mL，6-BAP储存液（1 mg/mL）0.5 mL，肌醇100 mg，蔗糖30 g，pH调整至5.85。固体培养基中加入3.2 g植物凝胶。

SH9培养基（1 L）的配方为：10×N6大量母液100 mL，1000×SH微量母液1 mL，1000×SH有机母液1 mL，50×EDFS铁盐母液20 mL，肌醇100 mg，蔗糖20 g，pH调整至5.85。固体培养基中加入8 g琼脂。

1/2MS液体培养基（1L）的配方为：MURASHIGE&SKOOG (MS) BASAL MEDIUM（M519）（Phyto Technology Laboratories^TM）2.22g，蔗糖12g，pH调整至5.85。固体培养基中加入8g琼脂。

SM4培养基（1 L）的配方为：MURASHIGE&SKOOG (MS) BASAL MEDIUM（M519）（PhytoTechnology Laboratories^TM）4.43 g，2，4-D储存液（10 mg/mL）0.4 mL，6-BAP储存液（1 mg/mL）0.2 mL，蔗糖30 g，pH调整至5.85。固体培养基中加入3.2 g植物凝胶。

MSBK培养基（1 L）的配方为：MURASHIGE&SKOOG (MS) BASAL MEDIUM（M519）（PhytoTechnology Laboratories^TM）4.43 g，激动素（1 mg/mL） 1 mL，6-BAP储存液（1 mg/mL）0.5mL，蔗糖30 g，pH调整至5.85。固体培养基中加入3.2 g植物凝胶。

实施例1、培育OLE _pro :RFP 转基因植株及其表型鉴定

一、载体pEarleyGate100-OLE _pro :RFP 构建

由北京六合华大基因科技有限公司合成引物：

表1、pEarleyGate100-OLEpro:RFP载体构建引物

注：下划线表示酶切位点。

首先利用引物ProOLE-F和ProOLE-R以蒺藜苜蓿R108 DNA为模板进行扩增反应。扩增反应产物经DNA凝胶回收后，利用Eco RI和Bam HI进行双酶切。同时对载体pE3025-cRFP利用Eco RI和Bam HI进行双酶切。随后回收上述酶切片段，利用T4连接酶进行连接反应，获得pE3025-OLE _pro :RFP 载体。

pE3025-OLE _pro :RFP 载体的结构描述如下：是在出发载体pE3025-cRFP的Eco RI和Bam HI两个酶切位点之间插入序列为SEQ ID No:1第25-2210位的DNA片段，保持载体pE3025-cRFP其他序列不变得到的重组载体。pE3025-OLE _pro :RFP 载体可表达RFP荧光蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No:2。

以pE3025-OLE _pro :RFP 质粒DNA为模板，利用引物ProOLE:RFP-F和ProOLE:RFP-R进行扩增反应，并回收反应产物；同时对载体pEarleyGate100用Bst BI和Xba I进行双酶切，并回收酶切产物；将上述扩增产物和酶切产物进行重组反应，获得pEarleyGate100-OLE _pro :RFP 载体（图1）。

pEarleyGate100-OLE _pro :RFP 载体的结构描述如下：是在出发载体pEarleyGate100的5’-GCAGCAGCTGACGCGTAC-3’和5’-TCTAGAGAGTTAATTAAG-3’两个片段之间插入序列为SEQ ID No:1第19-2897位的DNA片段，保持载体pEarleyGate100其他序列不变得到的重组载体。pEarleyGate100-OLE _pro :RFP 载体可表达RFP荧光蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No:2。

二、转基因苜蓿OLE _pro :RFP 植株的获得

利用根癌农杆菌介导的叶盘转化法，将pEarleyGate100-OLE _pro :RFP 载体转化至蒺藜苜蓿R108受体背景，获得了OLE _pro :RFP 转基因材料，其中涉及到的材料共培养、脱分化、再分化及出苗阶段如图2。具体步骤如下：

1、电转化根癌农杆菌

将植物转化载体pEarleyGate100-OLE _pro :RFP 50 ng质粒转入农杆菌EHA105菌株（购于北京酷来搏科技有限公司，货号：EC403-10×50μL）感受态细胞中，冰浴5 min后将混合物加入预冷的电击杯，2100 V高压电击，随后向电击杯中加入500 μL不加抗生素的YEP液体培养基，吹打混匀后将菌液转移至2 ml离心管中，在28℃ 200 rpm条件下震荡培养1h，取30 μL菌液涂在含Rifampicin（75 mg/L）和Kanamycin（50 mg/L）的YEP固体培养基上，28℃黑暗倒置筛选培养24-48 h，挑取克隆于含有Rifampicin（75 mg/L）和Kanamycin（50 mg/L）的700 μL YEP液体培养基中，28℃ 200 rpm条件下震荡培养24-48 h，提取质粒进行PCR鉴定，鉴定引物ProOLE:RFP-JP-F（5’- ACCGATCAAAAACAGGTT -3’）和ProOLE:RFP-JP-R（5’-ACTCGTGGCCGTTCACGG -3’）进行扩增，阳性克隆大小为2274 bp的特异条带，选取阳性克隆进行下一步侵染。

2、外植体制备

首先，准备蒺藜苜蓿野生型R108无菌苗。将蒺藜苜蓿R108种子每50颗分装到一个2mL离心管中，先用1 mL 98% H₂SO₄处理8 min，用预冷的去离子水冲洗5遍；然后加入1 mL30% 立白消毒水消毒12 min，在超净台中用无菌水冲洗5遍；将种子平铺在0.8%水琼脂板上，4℃黑暗倒置培养3天。随后室温避光倒置12 h，在超净台中将萌发的种子种在1/2 MS培养基上。22℃ 16 h光照8 h黑暗生长3-4周后可用于遗传转化。

在超净台中收集R108无菌苗的完全展开叶，用无菌小刀将每片单叶切成2-4块作为外植体备用。

3、农杆菌侵染液制备

将转入pEarleyGate100-OLE _pro :RFP 的EHA105农杆菌阳性菌落转接至200 mL含Rifampicin（75 mg/L）和Kanamycin（50 mg/L）的YEP液体培养基中，28℃ 230 rpm震荡培养至OD₆₀₀为0.6-0.8。将菌液转移至无菌离心瓶中，室温5000 rpm离心10 min，超净台中去上清，用等体积含0.1 mM乙酰丁香酮的SH3a液体培养基重悬菌液，制备成pEarleyGate100-OLE _pro :RFP 转化材料的侵染液。

4、农杆菌介导的遗传转化和共培养

将准备好的外植体在无菌环境下投入上述制备好的侵染液中，抽真空至-0.09MPa维持30 min，然后缓慢放气；在50 rpm水平摇床上，避光震荡培养1.5 h。随后在超净台中去除侵染液，将外植体表面多余的液体用灭菌滤纸吸干后平铺在覆有单层滤纸的SH3a固体培养基（含乙酰丁香酮0.1 mM）上，22℃避光共培养3天。

5、愈伤诱导和分化

将外植体转移至含有草铵膦（10 mg/L）的SH3a固体培养基（同时含有特美汀200mg/L）上诱导抗性愈伤，22℃避光培养，每2周继代一次，共继代三次，持续6周；随后将愈伤转移至含有草铵膦（5 mg/L）的SH9固体培养基（同时含有特美汀200 mg/L）上诱导芽分化，在22℃、16 h光照、8 h黑暗条件下培养，每3周继代一次，直至产生再生苗；将再生苗转移至不含抗生素的1/2 MS固体培养基上生根，22℃、16 h光照、8 h黑暗培养，每3-4周继代一次；生根后移至营养土中，温室环境下用保鲜膜覆盖保湿培养，5天后揭膜，温室环境为22℃、16h光照、8 h黑暗、湿度70%-80%，得到OLE _pro :RFP 转基因植株。

三、转基因苜蓿OLE _pro :RFP 植株的基因型鉴定

1、DNA水平检测OLE _pro :RFP 转基因阳性植株

提取OLE _pro :RFP 转基因植株基因组DNA，以其作为模板，ProOLE:RFP-TF和ProOLE:RFP-TR为引物进行扩增反应。野生型R108基因组DNA为阴性对照，pEarleyGate100-OLE _pro :RFP 质粒作为阳性对照。反应体系总体积20 μL，其中2× Taq mix 10 μL，引物F 1μL，引物R 1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 7 μL。

ProOLE:RFP-TF：5’-CTTGCCAAGTAATCTGTCACCG-3’；

ProOLE:RFP-TR：5’-TAGTCCCGGGTCTTAATTAACTC-3’。

扩增反应程序为：第一轮：95℃变性5 min；第二轮：94 ℃变性30 sec，55 ℃退火30 sec，72 ℃延伸1min，33个循环；第三轮：72 ℃延伸10 min。程序结束后，通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果。

OLE _pro :RFP 阳性转基因植株可扩增出大小为867 bp的片段，结果表明，OLE _pro : RFP -1、OLE _pro :RFP -2、OLE _pro :RFP -3均为转基因阳性植株（图3）。

2、蛋白水平检测OLE _pro :RFP 转基因阳性植株。

利用上海佑隆生物科技有限公司的转基因PAT/bar速测试剂盒（货号:AA1032-LS）对OLE _pro :RFP PCR阳性植株材料进行检测。将植物叶片组织置于一次性组织提取管的盖子与管身之间，迅速盖住盖子，重复2次，得到2片圆形叶片组织。将杵插入管中，旋转杵碾搅碎叶片，持续按压20-30秒。加入0.2 mL（约8滴）提取缓冲液EB004。重复碾碎步骤使样品与缓冲液充分接触混合。拿掉杵棒。速测试纸和待检样本溶液恢复至常温后，将速测试纸从试纸桶中取出，直接插入样品槽中，计时8-10分钟，读取结果。阳性材料在Bar速测试纸上具有C线和T线两条条带，阴性对照只具有C线条带，均无条带视为操作不当或试纸失效。

结果表明，OLE _pro :RFP- 1、OLE _pro :RFP- 2、OLE _pro :RFP- 3中Bar检测均为阳性（图4）。

四、OLE _pro :RFP 转基因阳性植株的表型鉴定

对野生型R108和转基因阳性植株OLE _pro :RFP -1的种子进行荧光观察：在OLYMPUSSZX7体式显微镜下，利用OLYMPUS SZX7体式显微镜光源和LUYOR仪器有限公司的LUYOR-3415双波长荧光蛋白激发光源的RFP激发光光源，对R108、OLE _pro :RFP -1种子发育不同时期（I-IV）进行观察，I为生长期，II为营养物质贮存积累期，III为成熟期，IV为完熟期。

结果表明：OLE _pro :RFP -1主要在成熟期（III）出现明显荧光，完熟期（IV）荧光强度最高，野生型R108在种子发育各个时期均无荧光（图5）。因此，OLE _pro :RFP 种子特异性表达启动子驱动荧光标记基因，能够进行转基因种子的有效筛选。

实施例2、培育携带转基因种子标记的紫花苜蓿智能保持系及其应用

一、紫花苜蓿智能保持系载体pCAMBIA1381-MF::S设计与构建

智能保持系载体pCAMBIA1381-MF::S具有连锁的育性恢复表达盒（MF）和种子荧光分选表达盒（S），其中，种子荧光分选表达盒（S）为OLE _pro :RFP ，育性恢复表达盒（MF）为MtNP1pro:MtNP1 。

由北京六合华大基因科技有限公司合成引物MtNP1-F，MtNP1-R，以蒺藜苜蓿R108长度小于1mm的花蕾cDNA为模板扩增获得MtNP1编码及3’UTR调控序列（SEQ ID No:3第2019-3967位）；用Sal I和Pml I双酶切使载体MtNP1 _pro :GUS 线性化，将上述扩增片段通过重组反应连入线性化载体，构成MtNP1pro:MtNP1 。合成引物MF-F，MF-R以MtNP1pro:MtNP1 质粒为模版扩增MF表达盒，合成引物S-F，S-R以实施例1中OLE _pro :RFP 质粒为模版扩增S表达盒，再利用MF-F，S-R进行搭桥PCR，获得MF::S串联的片段（核苷酸序列为SEQ ID No:3第1-7950位）。

利用引物1381-F和1381-R，以pCAMBIA1381质粒DNA为模板进行扩增反应，获得线性化的pCAMBIA381载体片段。将MF::S片段及pCAMBIA1381线性化载体片段进行重组反应，获得pCAMBIA1381-MF::S转化载体（图6）。

pCAMBIA1381-MF::S载体的结构描述如下：是在出发载体pCAMBIA1381的5’-GGGAATTAAACTATCAGTGT-3’和5’-TGTTGGGCCCGGCGCGCC-3’两个片段之间插入序列为SEQ IDNo:3第17-7930位的DNA片段，保持载体pCAMBIA1381其他序列不变得到的重组载体。pCAMBIA1381-MF::S载体可表达MtNP1基因和RFP荧光蛋白，MtNP1氨基酸序列为SEQ ID No:4的第1-580位，RFP荧光蛋白氨基酸序列为SEQ ID No:2。

表2、pCAMBIA1381-MF::S载体构建引物

二、紫花苜蓿智能保持系MF::S的获得

利用根癌农杆菌介导的叶盘转化法，将pCAMBIA1381-MF::S载体转化至紫花苜蓿无外源转基因组分的雄性不育系msnp1 -L1受体材料中，获得了MF::S转基因材料，其中涉及到的材料共培养、脱分化、再分化及生根阶段如图7。

1、电转化根癌农杆菌

将植物转化载体pCAMBIA1381-MF::S50 ng质粒转入农杆菌EHA105感受态细胞中，冰浴5 min后将混合物加入预冷的电击杯，2100 V高压电击，随后向电击杯中加入500 μL不加抗生素的YEP液体培养基，吹打混匀后将菌液转移至2 ml离心管中，在28℃ 200 rpm条件下震荡培养1h，取30 μL菌液涂在含Rifampicin（75 mg/L）和Kanamycin（50 mg/L）的YEP固体培养基上，28℃黑暗倒置筛选培养24-48 h，挑取克隆于含有Rifampicin（75 mg/L）和Kanamycin（50 mg/L）的700 μL YEP液体培养基中，28℃ 200 rpm条件下震荡培养24-48 h，提取质粒进行PCR鉴定，鉴定引物为pCAMBIA-MF::S-TF（5’- GCTATGGAGGTTAATTCTTCT -3’）和S-R进行扩增，阳性克隆大小为5921 bp的特异条带，选取阳性克隆进行下一步侵染。

2、农杆菌侵染液制备

将农杆菌阳性菌落转接至200 mL含Rifampicin（75 mg/L）和Kanamycin（50 mg/L）的YEP液体培养基中，28℃ 230 rpm震荡培养至OD₆₀₀为0.4。将菌液转移至无菌离心瓶中，室温5000 rpm离心10 min，超净台中去上清，用等体积含0.1 mM乙酰丁香酮的SM4液体培养基重悬菌液，制备成MF::S转化材料的侵染液。

3、农杆菌介导的遗传转化和共培养

提前一天采集msnp1 -L1材料叶片，保存在4℃湿润且避光环境，侵染时将叶片浸泡于0.1% Triton X-100溶液中，5 min后转移至无菌空玻璃瓶，在超净台中用去离子水冲洗3次，转移至250 mL蓝盖瓶中，加入30%立白漂白水，处理8 min，去离子水漂洗5次。

将消毒后的叶片转移至无菌空玻璃瓶中，加入侵染液。抽真空至-0 .09 MPa维持5min，超声处理3 min，随后再抽真空5 min。在超净台中去除侵染液，并用滤纸除去叶片多余的液体，叶片吹干后，用刀片切成小块，将叶片平铺于SM4固体培养基，室温黑暗培养3 d。

4、愈伤诱导和分化

转移至SM4固体培养基（含200 mg/L头孢和10 mg/L潮霉素），24℃光照培养，每2周转移到新的SM4培养基上，长出愈伤后，将愈伤组织转移至MSBK再生培养基（含200 mg/L特美汀和10 mg/L潮霉素）上生长2-3周后，转移至SH9培养基（含200 mg/L头孢和5 mg/L潮霉素），22℃、16h光照、8h黑暗培养，每3周继代一次，直至产生再生苗。再生苗转移至不含抗生素的1/2 MS固体培养基上，生根后转移至温室培养，鉴定阳性苗。

三、MF::S转基因植株的基因型鉴定

DNA水平检测MF::S转基因阳性植株。提取遗传转化获得的再生材料基因组DNA，以其作为模板，MF::S-TF（5’- GTCGAACTTTTCGATCAGAA -3’）和MF::S-TR（5’-ACTCAACAAGGGAACCATAC -3’）为引物进行扩增反应。msnp1 -L1受体材料DNA为阴性对照扩增模板，pCAMBIA1381-MF::S质粒DNA作为阳性对照扩增模板。反应体系总体积20 μL，其中2× Taq mix 10 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 7 μL。

扩增反应程序为：第一轮：95℃变性5 min；第二轮：94℃变性30 sec，55℃退火30sec，72℃延伸1 min，33个循环；第三轮：72℃延伸10 min。程序结束后，通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果。

阳性转基因植株可扩增出大小为1320 bp的片段，结果表明，MF::S-1、MF::S-2、MF::S-3、MF::S-4均为转基因阳性材料（图8）。

四、MF::S转基因植株与msnp1 -L1杂交种子表型鉴定

以MF::S-2、MF::S-4株系分别作为父本，msnp1 -L1雄性不育系材料作为母本，进行杂交并收获种子。对收获的杂交种子进行荧光观察：使用LUYOR仪器有限公司的LUYOR-3415双波长荧光蛋白激发光源的RFP激发光光源进行照射，对MF::S-2（父本）×msnp1 -L1（母本）、MF::S-4（父本）×msnp1 -L1（母本）杂交种子进行荧光观察。

结果如图9所示：杂交种子中能够明显区分携带荧光和不携带荧光的种子。说明种子荧光分选表达盒（S），即OLE _pro :RFP 能够在紫花苜蓿中实现高效种子分选。

进一步随机挑选MF::S-4（父本）×msnp1 -L1（母本）杂交种子中携带荧光的15颗和不携带荧光的15颗种子播种后进行DNA水平鉴定；其中，携带荧光的种子萌发并存活14棵，不携带荧光的种子萌发并存活12棵。

以MF::S-TF和MF::S-TR为引物，播种后14天的幼苗提取基因组DNA为模板，亲本MF::S-4为阳性对照，msnp1 -L1为阴性对照，进行PCR扩增。反应体系总体积20 μL，其中2×Taq mix 10 μL，引物F 1 μL，引物R 1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 7 μL。

扩增反应程序为：第一轮：95℃变性5 min；第二轮：94℃变性30 sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，33个循环；第三轮：72℃延伸10 min。程序结束后，通过1.0%琼脂糖凝胶电泳检测结果。

转基因阳性材料扩增条带大小为1320 bp，结果显示，所有携带荧光的种子其幼苗均为转基因阳性，所有不携带荧光的种子其幼苗均无转基因组分（图10）。因此，OLE _pro :RFP 能够在紫花苜蓿中实现有效的转基因种子分选。

综上所述，本发明提供了一种利用种子特异性启动子驱动荧光标记蛋白，形成转基因种子表型标记，从而构建苜蓿智能保持系的方法。该方法构建了连锁的育性恢复表达盒MtNP1pro:MtNP1 （MF）和转基因种子荧光分选表达盒OLE _pro :RFP （S），即MF::S。将该构件通过根癌农杆菌介导的遗传转化转入无外源转基因组分的msnp1 -L1雄性不育系受体背景，产生的转基因阳性再生植株为智能保持系，其携带MF::S，产生可育花粉，作为父本与雄性不育系msnp1 -L1杂交产生后代种子。其中，携带MF::S的转基因种子能够通过激发光照射下携带荧光而被分选出来，不携带MF::S的种子则在激发光照射下不发光，为雄性不育系种子，从而实现隐性核不育系的制种（图11）。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。

Claims (10)

1.如下a）、b）或c）的DNA分子：

a）核苷酸序列是SEQ ID No:1的第25-2210位的DNA分子；

b）与a）限定的核苷酸序列具有99%以上、95%以上、90%以上、85%以上或者80%以上同一性，且来源于苜蓿并具有启动子功能的DNA片段；

c）在严格条件下与a）或b）限定的核苷酸序列杂交，且具有启动子功能的DNA片段。

2.含有权利要求1所述DNA分子的表达盒或重组载体。

3.含有权利要求1所述DNA分子的重组微生物。

4.含有权利要求1所述DNA分子的转基因细胞系。

5.权利要求1所述的DNA分子作为启动子的应用。

6.权利要求1所述DNA分子在植物中启动目的基因表达中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述启动目的基因表达为启动目的基因在植物种子中特异表达。

8.权利要求1所述DNA分子在构建苜蓿智能保持系中的应用。

9.权利要求1所述DNA分子或权利要求2所述重组载体或表达盒、权利要求3所述的重组微生物或权利要求4所述的转基因细胞系在植物育种中的应用。

10.根据权利要求9中的应用，其特征在于，所述植物为如下：

N1)双子叶植物；

N2)豆目植物；

N3)豆科植物；

N4)苜蓿属植物；

N5)蒺藜苜蓿或紫花苜蓿。