CN1214052A - 分离的二聚体成纤维细胞激活蛋白α及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及已知为成纤维细胞激活蛋白α,或“FAPα”的蛋白质的二聚体形式,及其用途。

Description

分离的二聚体成纤维细胞激活蛋白α及其用途

相关申请

本申请是1994年4月20日提交的未决流水号08/230,491(列入本文参考文献供参考)的部分持续申请。

发明领域

本发明涉及与癌症组织和反应性肿瘤基质细胞相关的某种分子。本发明更具体地涉及成纤维细胞激活蛋白α(下文称之为“FAPα”)分子。先前已通过免疫化学方法鉴定出此分子的单体形式，但仍未分离或克隆出编码该分子的核酸分子，也未鉴定出其二聚体形式，而这些正是本发明的特征。通过煮沸样品的SDS-PAGE测定出单体蛋白质的分子量约为88-95KDa，通过未煮沸样品的SDS-PAGE测定出二聚体的分子量约为170KDa。FAPα的特征在于：它与特征性膜结合酶共享很多特征和特性，这很强烈地暗示它也是膜结合酶。为本发明主要部分的核酸分子既可用于表达FAPα之细胞的探针，也可作为重组生产该蛋白质的起始物质。FAPα蛋白则可用于生产特异于该蛋白质的单克隆抗体，因此是其自身有用的诊断试剂。它们也有另外的用途，包括如本文所述的与酶功能相关的用途。

背景和现有技术

上皮癌症的侵染性生长与支持基质中特征性的细胞和分子变化相关。例如，上皮癌症诱导肿瘤血管的形成，反应性肿瘤基质成纤维细胞的征集，淋巴和吞噬细胞的浸润，肽介体和蛋白酶解酶的释放，和经改变的细胞外基质(ECM)的产生。例见Folkman,Adv.Cancer Res,43:175-203(1985)；Basset等，自然，348:699-704(1990)；Denekamp等，Cancer Metastasis Rev,9:267-282(1990)；Cullen等，癌症研究，51:4978-4985(1991)；Dvorak等，癌症细胞，3:77-85(1991)；Liotta等，癌症研究，51:5054s-5059s(1991)；Garin-Chesa等，组织化学及细胞化学杂志，37:1767-1776(1989)。在几种普通组织学类型的上皮癌症中，基质高度一致的分子特征可诱导成纤维细胞激活蛋白(FAPα)，该蛋白是细胞表面的糖蛋白，最初通过单克隆抗体mAb F19发现该蛋白M_r观测值为95,000，所述单充隆抗体是抗增殖培养的成纤维细胞产生的。例见Rettig等，癌症研究，46:6406-6412(1986)；Rettig等，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),85:3110-3114(1988)；Garin-Chesa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:7235-7239(1990)；Rettig等，癌症研究，53:3327-3335(1993)。这四篇文献的全文列入本文作为参考。

上述文献提到的那些免疫组化研究已表明在某些正常的胎儿间充质组织中瞬时表达了FAPα，但正常的成人组织一般是FAPα^-。类似地，恶性的上皮，神经和造血细胞一般是FAPα^-。然而，大多数普通类型的上皮癌症，包括＞90％的乳腺，肺，皮肤，胰腺和结肠癌含有丰富的FAPα⁺反应性基质成纤维细胞。Garin-Chesa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:7235-7239(1990)。FAPα⁺肿瘤基质成纤维细胞几乎恒定地与肿瘤血管相伴随，形成在肿瘤毛细血管内皮和恶性上皮细胞簇的基本方位之间插入的不同的细胞分隔间。尽管在原发性和转移性癌症中都发现了FAPα⁺基质成纤维细胞，但良性的和前恶性的上皮损害，如乳腺和结肠腺瘤的纤维腺瘤几乎不含FAPα⁺基质细胞。与FAPα在上皮肿瘤的基质特异性定位形成对照的是：大部分骨和软组织肉瘤的恶性细胞中表达了FAPα(Rettig等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:3110-3114(1988))。最终，在愈合伤口的肉芽组织中已检测到FAPα+成纤维细胞(Garin-Chesa等，文献同上)。基于FAPα在正常组织中的限制性分布模式及其在多种上皮癌症之支持基质中的一致表达，已在转移性结肠癌患者体内开始用¹³¹I-标记的mAb F19进行临床试验(Welt等，Proc.Am.AssocCancer Res,33:319(1992)；Welt等，J.Clin.Oncol,12:1561-1571(1994))以研究用于上皮癌症之免疫检测和免疫治疗的“肿瘤基质靶向”概念。

列入本文参考文献的Rettig等，Int.J.Cancer,58:385-392(1994)中讨论了FAPα分子及其特征。Rettig等假定在大于400KDa的高分子量络合物中发现了FAPα，但未讨论二聚体分子的可能性，此文献中也未详细地说明此分子特异性的酶特性。

在胎儿发育，组织修复和致癌的过程中，在组织再建的时间和位点对FAPα⁺成纤维细胞的诱导与此分子在正常成纤维细胞生理学中的基本作用一致。因此，分离和克隆编码此分子的核酸分子是有意义和有价值的。这是本发明的一方面，在下文的公开内容中将结合本发明的其它特征详细地描述此方面。本发明另外的方面包括二聚体的FAPα分子，和这些分子之特性的利用，下文中也会详细地说明这些特征。

图的简述

图1比较了推定的FAPα氨基酸序列和已知的CD26序列，序列的排列已最优化。

图2A-2H(含2A和2H)显示了在多种组织中对FAPα和CD26的免疫组化检测。在图2A和2B中，研究了乳腺癌中的FAPα(图2A)和CD26(图2B)。在图2C和2D中，研究了恶性纤维组织细胞瘤中的FAPα(图2C)和CD26(图2D)。在图2E(FAPα)和2F(CD26)中检测了皮肤瘢痕组织。在图2G(FAPα)和2H(CD26)中研究了肾细胞癌。

图3提供了显示FAPα具有细胞外基质(ECM)蛋白质降解活性之实验中产生的一些资料。当进行293-FAP明胶降解提取物的酶谱检测时，使用未煮沸的样品以保留酶活性，通过SDS-PAGE发现活性物质的分子量约为170KD。

优选实施方案的详细描述

实施例1

以前已观察到成纤维细胞系WI-38可与mAb F19反应(Rettig等，癌症研究，46:6406-6412(1986)；Rettig等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:3110-3114(1988)；Garin-Chesa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:7235-7239(1990)；Rettig等，癌症研究，53:3327-3335(1993))。在以下的实验中利用了此特性。

使用熟知的技术和可商购的材料，由WI-38制备cDNA文库。具体地说，使用Fast Track mRNA分离试剂盒和Librarian cDNA噬粒系统，在表达载体pCDNAI中构建文库。一旦制备好文库，将载体电穿孔至细胞系大肠杆菌MC1061/P3中。pCDNAI表达载体含有抗生素抗性基因，因此通过抗生素抗性可选择该大肠杆菌。然后将抗性菌落用于进一步的实验中。根据Sambrook等，分子克隆：实验室手册(冷泉港实验室，冷泉港，纽约，第2版，1989)的描述，通过碱性裂解和在CsCl₂上纯化可得到菌落中的质粒DNA。此技术

一旦分离出质粒DNA，将所述DNA用于转染COS-1细胞，然后将所述细胞培养48小时，再用抗体包被的平皿检测这些细胞。所用mAb包括Rettig等(1986，文献同上，全文列入本文参考文献)所述的F19。由于COS-1细胞正常情况下是FAPα^-，任何阳性的结果都表明编码序列的存在。免疫选择方案取自列入本文参考文献的Aruffo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84:3365-3369(1987)。

根据Hirt，分子生物学杂志，26:365-369(1967)的教导回收阳性克隆的质粒DNA，重新导入大肠杆菌MC1061/P3中，并在COS-1细胞中重新选择。

将本文所提供的方案再进行4轮，然后，使用Qiagen质粒试剂盒纯化50个分离的细菌菌落的质粒DNA。通过EcoRⅠ限制性酶图谱分析测定发现：在所有菌落中，有27个克隆含有相同的2.8kb的插入片断。通过在COS-1细胞中瞬时表达和用mAbF19直接免疫荧光染色检测发现：其中几个克隆含有FAPα特异性的cDNA。选择这些克隆中的一个，即“pFAP.38”供进一步的研究，此研究将在下文中详细描述。

实施例2

一旦已鉴定出pFAP.38，将它与编码已知细胞表面标记物CD26的载体(“pCD26”)以及对照载体pCDNAⅠ一起检测。

在这些实验中，用pFAP.38,pCD26或pCDNAⅠ中的一个转染COS-1细胞。48小时后，使用熟知的用于细胞表面抗原表达的MHA花结试验检测转染子。在这些实验中，使用了FAPα特异性的mAb F19以及CD26特异性的mAb EF-1。也使用了4个其它的FAPα特异性的mAb，即FB23,FB52,FB58和C48。还检测了已知能与mAb F19(SW872脂肪肉瘤)或EF-1(SK-OV6卵巢癌)反应的2个癌症细胞系，结果列于下列表1。

 表1．在人细胞和COS-1细胞转染子中多种FAPα表位和CD26的细胞表面表达

                                细胞表面抗原表达靶细胞            F19      FB23      FB52      FB58     C48     EF-1人细胞SW872脂肪肉瘤    ＞95％    ＞95％    ＞95％    ＞95％   ＞95％   -SK-OV6卵巢癌     -         -         -         -        -        ＞95％COS-1转染子COS.pCDNAI对照   -         -         -         -        -        -COS.pFA P38      40％      30％      40％      20％    20％      -COS.pCD26        -         -         -         -       -         40％

实施例3

然后进行免疫沉淀研究以鉴定出通过抗体靶向的抗原。

用Trans ³⁵S-标记(ICN)代谢标记细胞，用裂解缓冲液(0.01MTris-HCl/0.15M NaCl/0.01M MgCl₂/0.5％Nonidet P-40/抑蛋白酶肽(20ug/ml)/2mM苯甲基磺酰氟)提取，然后进行免疫沉淀。所用方案都是熟知的，可参见Rettig等，癌症研究，53:3327-3325(1993)；和Fellinger等，癌症研究，51:336-340(1991)，所述文献的全文已列入本文参考文献。沉淀的mAb是阴性的对照小鼠Ig,mAbF19或EF-1。用模拟转染的COS-1细胞进行对照试验。免疫沉淀之后，在提取缓冲液中煮沸免疫沉淀物，并在还原条件下，通过NaDOdSO₄/PAGE分离免疫沉淀物。在一些实验中，进行另外的试验以测定免疫沉淀的物质是否是糖基化的。在这些实验中，在免疫沉淀之前用ConA-SEPHAROSE分级分离细胞提取物。在免疫沉淀之后，但在NaDOdSO₄/PAGE上分级分离之前，用N-聚糖酶消化这些沉淀物。

结果表明在COS-1细胞中，pFAP.38指导了88kd蛋白质类(通过SDS-PAGE测定)的表达，它比SW872，或培养的成纤维细胞产生的95kd FAPα类略小。用N-聚糖酶消化产生了大小相当的肽(即74kd对75kd)，这表明COS-1细胞中FAPα蛋白质的糖基化与人细胞系中有所不同。

实施例4

然后使用得自FAPα⁺成纤维细胞系WI-38和GM05389和FAPα^-卵巢癌细胞系SK-OV6的mRNA进行典型的Northern印迹分析。使用Sambrook等，文献同上的方法，检测得自每种细胞系的5ug mRNA。所用探针是32P标记的探针，并制备自pFAP.38的2.3kb ECOI片断，CD26的2.4kb HindⅢ片断和γ-肌动蛋白cDNA的1.8kb BamHⅠ片断。已从1％琼脂糖凝胶中纯化出这些片断。

FAPα⁺成纤维细胞株的提取物显示出2.8kb的FAP mRNA类，但SK-OV6的提取物没有显示出所述mRNA。在所有种类中都观察到γ-肌动蛋白的mRNA类。

实施例5

对鉴定为编码FAPα的cDNA进行从测序开始的更加详细的分析。使用Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463-5467(1977)中所述的典型的Sanger方法学测定cDNA两条链的序列。一旦操作完毕，由此推导出氨基酸序列，此资料示于SEQ ID NO:1。然后将此序列与已知的CD26氨基酸序列(Morimoto等，免疫学杂志，143:3430-3437(1989))相比较。图1提供了使用最优化序列排列的比较结果。星号表示比较中的任何缺口，而在CD26序列中用破折号表示相同的氨基酸。双划线表示疏水的推定的跨膜序列，而单划线表示潜在的N-糖基化位点。

序列分析显示出2812碱基对的插入片断，其中2277个碱基对构成了开放阅读框。此ORF从核苷酸209位的起始密码子ATG延伸至2486位的终止密码子TAA。

推导的多肽长为760个氨基酸，分子量为87,832。与之形成对照的是：据报道经N-聚糖酶消化的，免疫纯化的FAPα在NaDOdSO₄/PAGE上的M_r估计值为75,000(Rettig等，癌症研究，53:3327-3335(1993))。进行GenBank数据库检索，所发现的最密切相关的基因是那些编码二肽基肽酶Ⅳ同系物(DPPIV；EC3.4.14.5)的基因，所述同系物与人的DPPIV(也已知为T-细胞激活抗原CD26)显示出61％的核苷酸序列同一性，和48％的氨基酸序列同一性。

第二套相关基因是DPPX的人，大鼠和牛同系物的基因，所述基因是在脑和其它正常组织中广泛表达的未知功能的基因。推定的人的DPPX基因产物显示出与FAPα和CD26有30％的氨基酸序列同一性。FAPα分子显示出Ⅱ型膜内在蛋白的典型结构特征，包括大的COOH-末端胞外域，疏水的跨膜区段，和短的胞质尾。推定的胞外域含有5个潜在的N-糖基化位点，11个半胱氨酸残基(其中8个在FAPα和CD26之间是保守的)，和对应于丝氨酸蛋白酶，如DPPIV特征性的高度保守的催化域的3个区段。这些保守的序列示于下列表2。通过Morimoto等，文献同上；Wada等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:197-201(1992)；Yokotani等，人类分子遗传学，2:1037-1039(1993)的描述与DPPIV和DPPX进行比较。

实施例6

进行另一套实验以测定非人类中是否存在FAPα相关序列。为此，使用限制性酶消化人，小鼠和中国仓鼠的基因组DNA，并使用前述的经³²P标记的2.3kb片段，经Southern印迹检测所述DNA。使用严紧的洗涤条件(0.1×SSC,0.1％NaDOdSO₄,68℃)进行杂交，用小鼠和仓鼠DNA都易于观察到交叉杂交，这表明高度保守的FAPα同系物的存在。在使用前述的CD26cDNA片段的对照实验中，未观察到交叉杂交的迹象。

实施例7

CD26分子与先前所述的FAPβ共享很多生化和血清学特性，FAPβ是FAPα相关分子，其分子量为105kd，是在培养的成纤维细胞和黑素细胞上发现的(Rettig等，癌症研究，53:3327-3335(1993))。进行共转染实验以测定FAPβ是否是CD26基因产物。为此，使用与前述的用pFAP.38或pCD26转染所用方法相同的方法，但使用了两个载体。上述文献中提供的结果表明对每个载体而言，共转染的效率约为40％，因此约有10-20％的细胞应能被共转染。

共转染之后，如前述用Trans ³⁵S标记COS-1细胞，然后也如前述进行裂解。

在Con A SEPHAROSE上分离所得的细胞提取物，回收与Con A结合之组分中的抗原(FAPα和/或CD26)。用0.25M α-D-甘露吡喃糖苷(mannopyranoside)洗脱被结合的组分。然后如前述进行免疫沉淀，也如上述文献中所讨论的在NaDOdSO₄/PAGE上分离沉淀物。

那些仅用pFAP.38转染的细胞产生了FAPα，而不是FAPβ(由mAb F19的免疫沉淀物测定)，它们也未产生CD26抗原(用EF-1检测)。那些仅用pCD26转染的细胞产生了CD26而不是FAPα。共转染子产生了CD26和FAPα/FAPβ异聚体，这在mAbF19的沉淀物中可检测到，此结果提供了FAPβ是CD26基因产物的直接证据。

实施例8

以前已观察到一些培养的人细胞类型共表达了FAPα和CD26，并显示出FAPα/CD26异聚体的形成。然而，由以前的免疫组化研究测定出FAPα和CD26的体内分布模式似乎是非重叠的(见Rettig等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:3110-3114(1988)；Garin-Chesa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:7235-7239(1990)；Rettig等，癌症研究，53:3327-3335(1993)；Stein等，于Knapp等人编辑的“白细胞定型Ⅳ-白细胞分化抗原”，p412-415；Mobious等，实验免疫学杂志，74:431-437(1988))。鉴于FAPα/CD26共结合的潜在意义，通过同时免疫组化染色已知含有FAPα⁺成纤维细胞或FAPα⁺恶性细胞的正常组织和损害组织以重新检查组织的分布。

为了检测样品，将样品包埋于OCT化合物中，在预冷于液氮的异戊烷中冷冻，并储存于-70℃下待用。切下5微米厚的切片，封固于经聚-L-赖氨酸包被的玻片上，风干，并在冷丙酮中固定(4℃,10分钟)。然后使用如Garin-Chesa等，组织化学及细胞化学杂志，37:1767-1776(1989)；Garin-Chesa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:7235-7239(1990)；Rettig等，癌症研究，53:3327-3335(1993)；Garin-Chesa等，Am.J.Pathol,142:557-567中所述的熟知的亲和素-生物素免疫-过氧化物酶法，用mAb(10-20ug/ml)检测切片。

结果示于图2，乳腺，结肠，胰腺和肺癌显示出FAPα的强表达，而未发现CD26(见图2A和2B)。检测了5个FAPα⁺肉瘤，包括恶性纤维组织细胞瘤(图2C和2D)，未发现CD26的表达。愈合中的真皮伤口的反应性成纤维细胞的检查(图2E和2F)显示出FAPα和CD26都有充分的表达。被检测的3个肾癌(图2G和2H)显示出恶性上皮中CD26的表达。恶性上皮细胞中缺乏FAPα,FAPα在这些癌症的基质中显示出低表达。

实施例9

制备被编码FAPα之cDNA转染的哺乳动物细胞系。

人胚胎肾细胞系293是众所周知的，并可广泛地得自例如美国典型培养物保藏中心。

于37℃,95％空气，5％CO₂的氛围中，在温箱中维持293样品。在Dulbecco氏修饰的极限必需培养基与Ham氏F12培养基的50∶50混合物中培养细胞，所述混合物中添加了10％胎牛血清，青霉素和链霉素。按照Ustar等，欧洲分子生物学杂志，1991，和/或Park等，生物化学杂志，169:25646-25654(1994)(皆列入本文参考文献)所述的方法，将FAPα之cDNA(即SEQ ID NO:1)转染至293细胞。上述文献中提供了cDNA载体的细节(pFAP.38)。选择对抗生素(200ug/ml遗传霉素)具有抗性的转染子，然后在含有遗传霉素的选择性培养基中维持转染子。

挑选抗性细胞的各个集落，在6孔组织培养板中培养至铺满，并在免疫荧光测定(IFA)中检测各个集落的FAPα表达，所述IFA使用前述的FAPα特异性的单克隆抗体F19。

扩展表达FAPα的那些集落，并通过前述的间接IFA和细胞荧光测定分析监测所述集落。

对于下文中被称为细胞系293-FAP的转染子而言，IFA呈阳性，但对于亲代细胞系293而言，IFA呈阴性。

实施例10

为了进一步地证实实际上正在产生的重组FAPα，进行了一系列的免疫沉淀实验。这些实验都遵照Park等，文献同上和Rettig等，癌症研究，53:3327-3335(1993)(都已列入本文参考文献)中所述的方法。实质上，以上述文献中所述的方式将³⁵[S]甲硫氨酸标记的细胞提取物与单克隆抗体F19相连，然后在提取缓冲液中煮沸沉淀物，使用小鼠IgG1作为阴性对照在SDS-PAGE凝胶上电泳。检测了细胞系293-FAP和未转染的细胞系293。结果清楚地表明重组的FAPα是由被转染的细胞系293-FAP产生的，这是通过免疫沉淀分析测定的，所述分析使用了FAPα特异性单克隆抗体F19。

实施例11

产生重组FAPα的能力使得可进一步地研究分子的特性。具体地说，假使在前述实施例中已列出了结构特征，可设计实验以测定FAPα是否具有酶活性，设计实验以检测FAPα是否具有降解胞外基质(ECM)蛋白的活性。

使用提取缓冲液(0.15M NaCl,0.05M Tris-HCl,pH7.4,10mMMgCl₂,1％Triton X-114)制备293-FAP的提取物，通过离心(4,000×g,10分钟，4℃)澄清提取物，在37℃下进行相分配达10-20分钟，然后再次离心(4000×g,20分钟，20-25℃)。用缓冲液(0.15M NaCl,0.05MTris-HCl,pH7.4,5mM CaCl₂,5mM MgCl₂,0.75％ Empigen BB)稀释去污剂相，按照Rettig等，文献同上的教导，在伴刀豆球蛋白A-Sepharose上分离此相。在洗脱缓冲液中(0.15M NaCl,0.05M Tris-HCl,pH7.4,5mMCaCl₂,5mM MgCl₂,0.1％ Triton X-100)，用0.25M甲基-α-D-甘露吡喃糖苷洗脱任何被伴刀豆球蛋白A结合的组分，将此组分与酶谱样品缓冲液(0.25M Tris-HCl,pH6.8,8％SDS,40％甘油，0.01％溴酚蓝)以3∶1的比率混合，并用于进一步的分析。

将样品的等分试样上样于含有0.1％的明胶或酪蛋白的聚丙烯酰胺凝胶中，然后在Biorad Mini-Protein Ⅱ系统中，以20mA的恒定电流进行电泳1.5-2小时，直至样品正前方的溴酚蓝到达凝胶的末端。取出凝胶，于20-25℃，在旋转振荡器上，2.5％的Triton X-100水溶液中保温1小时，倾析TritonX-100溶液，并用酶缓冲液(0.05M Tris-HCl,pH7.5,0.2M NaCl,5mMCaCl₂,5mM MgCl₂,0.02％Brij35)代替之。然后在37℃或41℃下保温凝胶，接着在室温下染色或脱染色。在30％甲醇和10％乙酸的水溶液中，用0.5％的考马斯亮蓝G-250分别染色凝胶15,30和60分钟。随后，在30％CH₃OH和5％甘油的水溶液中将凝胶保温15分钟，再在玻璃纸层中干燥。

根据Kleiner等，Anal.Biochem,218:325-329(1994)(全文列入本文参考文献)的教导评价明胶酶的活性，这是用于测定是否存在能消化明胶的蛋白酶的常规试验，在用于分子量测定的逐渐还原的条件下，在相同凝胶中电泳经标记的分子量标准。

使用熟知的膜覆盖试验检测确定氨基酸序列基元的蛋白酶解活性，见Smith等，组织化学杂志，24(9):637-647(1992)(列入本文参考文献)。底物是Ala-Pro-7-氨基-4-三氟甲基香豆素，Gly-Pro-7-氨基-4-三氟甲基香豆素和Lys-Pro-7-氨基-4-三氟甲基香豆素。

这些实验的部分结果示于图3，此图显示出细胞提取物中明胶降解活性的酶谱检测，见Kleiner等，文献同上。观察到经SDS-PAGE检测大约为170KDa的蛋白质类具有明胶降解活性。因此将在293-FAP细胞系，而不是在未转染的293细胞中发现的此类蛋白质鉴定为FAPα，分子量与二聚体，即二聚体的FAPα分子的一致。

当酪蛋白为底物时，未观察到本文所述的底物为明胶的蛋白酶解活性。

实施例12

进行另外的研究以进一步鉴定170KD的FAPα二聚体。具体地说，重复实施例11中所述的实验，不同之处在于进行SDS-PAGE之前，在提取物中加入5％2-巯基乙醇或5um碘乙酰胺，或在用于明胶酶谱分析的保温缓冲液中加入乙二胺N,N,N’,N’-四乙酸(10mM)，这些处理都不能消除酶活性。与之形成对照的是：在SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳之前在100℃中加热5分钟会消除明胶降解活性。

使用如Smith等，组织化学杂志，24(9):637-647(1992)(列入本文参考文献)中所述的膜覆盖试验进行进一步的研究，揭示了FAPα二聚体可裂解所有被检测的Ala-Pro,Gly-Pro和Lys-Pro二肽。

在另外的实验中，产生了融合蛋白，该蛋白含有FAPα和鼠CD8蛋白的胞外域。此嵌合蛋白是在昆虫细胞的杆状病毒系统中产生的。使用上述文献中讨论的模式，嵌合蛋白表现出与FAPα相同的酶解活性。

实施例13

使用Ala-Pro-7-氨基-4-三氟甲基香豆素(Ala-Pro-AFC)作为底物进行两个定量测定FAPα酶活性的试验。在第一个试验形式中，将表达FAPα之细胞的膜提取物与5-10倍体积的反应缓冲液(100mM NaCl,100mM Tris,pH7.8)混合，并将混合物加入等体积的含0.5mM Ala-Pro-AFC的反应缓冲液中，然后在37℃下保温1小时。在使用395nm激发/530nm发射滤光片套的荧光计中测量游离AFC的释放。在此试验形式中分析的膜提取物得自293-FAPα细胞(被上述文献中所述载体FAP.38稳定转染的293细胞)或HT1080-FAPα细胞(被载体FAP.38稳定转染的HT1080细胞)。用制备自各个亲代293或HT1080细胞系的膜提取物进行评价FAPα特异性活性的阴性对照实验。在第二个试验中，通过特异于FAPα的抗体从293-FAPα或HT1080-FAPα的膜提取物中分离FAPα。在4℃下，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的1ug/ml F19单克隆抗体将96孔ELISA培养板包被过夜。在下文讨论的CD8-FAPα的情况下，在4℃下用上述的F19抗体或1ug/ml大鼠抗-小鼠CD8将培养板包被过夜，然后用洗涤缓冲液(PBS,0.1％吐温20)洗涤孔，在室温下用封闭缓冲液(PBS中的5％牛血清白蛋白)将多余的结合位点封闭1小时，除去封闭缓冲液；加入293-FAPα表达细胞或对照细胞的膜提取物，并在室温下保温1小时。除去未结合的物质，用洗涤缓冲液洗涤孔，在37℃下，使用100ulAla-Pro-AFC(于反应缓冲液中的0.5mM Ala-Pro-AFC)检测FAPα活性1小时，如上所述检测游离AFC的释放，mAb F19与FAPα的结合未可测地影响其酶解活性。

实施例14

使用上述文献中所述的用于FAPα酶活性的试验，已鉴定出FAPα酶活性的抑制剂。此抑制剂是(S)-缬氨酰吡咯烷-2(R)-硼酸(Snow等，J.Am.ChemSoc.(1994),116:10860-10869)，本文称之为ValboroPro。ValboroPro抑制FAPα对Ala-Pro-AFC的裂解，其IC₅₀为0.11uM。ValboroPro也抑制浓度为100uM的FAPα的明胶裂解活性。在试验中用不相关的丝氨酸蛋白酶，即胰蛋白酶阐明了ValboroPro对FAPα的特异性。当用苄酯基-L-valinyl-glycinyl-L-arginyl-4-苯基重氮酸乙酸盐(carbobenzoxyl-L-valinyl-glycinyl-L-arginyl-4-nitranilide acetate)作为底物检测时，未观察到ValboroPro(达100uM)对牛胰蛋白酶的抑制。

实施例15

FAPα酶活性的特异性结构需求的鉴定促进了可结合和/或抑制FAPα的分子的发展。为了检测FAPα多肽推测的氨基酸序列第624位的丝氨酸残基对于其酶功能是否是至关重要的，可使用标准的聚合酶链反应方法进行根据Zoller等，DNA,3:479-488(1984)的定点诱变。用GCG取代FAPαcDNA中编码第624位丝氨酸的TCC密码子，在此位置产生了丙氨酸。如前文所述，将改变的DNA重新导入FAP.38载体中，并转染至293细胞中。选择遗传霉素抗性集落，并通过间接IFA检测FAPα的表达，所述IFA使用mAb F19以及上述文献所列的Rettig等，癌症杂志，58:385-392(1994)中所述的其它FAPα特异性抗体。与野生型FAPα转染细胞相比，未观察到抗FAPα抗体与突变体FAPα表达细胞之结合中的差异。通过用几个克隆的转染细胞进行基因组DNA的扩增和限制性酶消化进一步证实突变的存在。为了评价突变体FAPα的酶活性，进行了下列的试验。由3个独立的阳性克隆制备膜提取物，在明胶裂解和Ala-Pro-AFC捕获试验中检测等量的FAPα蛋白(在使用两个抗FAPα抗体的双测定ELISA试验中测定，所述抗体可识别不同的FAPα表位)。与野生型FAPα相比，分离的突变体FAPα的明胶裂解活性和捕获试验中的活性降低至不可检测的水平，这进一步证实了催化三联体中规范丝氨酸对两种观察到的酶解活性的作用。

实施例16

产生融合蛋白以得到分泌的，水溶性的FAPα酶。在此融合蛋白中，使用标准的聚合酶链反应方法，将由鼠CD8前189个氨基酸组成的CD8胞外域与Lane等，实验医学杂志，177:1209(1993)中所述的FAPα胞外域(氨基酸27-760)相连，并插入可商购的pVL1393载体中。用此载体转染Sf9细胞并扩增所得的重组杆状病毒皆按上文所述进行(杆状病毒表达载体，OReilly,Miller和Luckow，牛津大学出版社，1994)。在两步纯化法中，从被CD8-FAPα杆状病毒感染4天的High Five^TM细胞的用尽培养基中分离CD8-FAP融合蛋白。通过超速离心除去细胞和病毒，使上清液穿过含有肝素-Sepharose(Pharmacia)的柱中，并用10mM磷酸盐，pH7中的0.6,1.0和2.0M NaCl逐步洗脱。收集1.0和2.0M洗脱液中的活性组分，并使用YM-10滤器和26/60 Superdex-200凝胶过滤柱浓缩之。在高分子量的峰中观察到活性，当进行N-末端气相测序时，进一步证实了该活性为CD8-FAPα。在明胶裂解试验中，当检测纯化的CD8-FAPα时，检测到大于200KD的活性，这与融合蛋白较高的推测分子量一致。

实施例17

在非人类中存在结构和功能同系物已被证实，例如，已克隆和鉴定了小鼠FAPα的cDNA。同源小鼠FAPα cDNA序列(EMBL登记号Y10007)的推测氨基酸序列的检查揭示了FAPα交叉种类的高度保守性。两种蛋白质89％相同，人FAPα和小鼠FAPα之间的催化三联体是保守的。高度保守性和相似的组织表达表明非人源的FAPα可能是人FAPα的功能等同物。此结论被下列发现进一步证实，即在设计上与CD8-人FAPα类似的CD8-鼠FAPα融合蛋白也阐明了使用Ala-Pro-AFC作为底物的预期二肽基肽酶酶解活性。

上述实施例描述了编码成纤维细胞激活蛋白α(“FAPα”)的分离的核酸分子，以及此分子的二聚体形式，及其用途。此序列在COS-1细胞中的表达产物是蛋白质，该蛋白质在煮沸样品的SDS-PAGE上显示出分子量约为88kd。SEQ ID NO:1提供的一种形式分子的推定氨基酸序列产生了约88kd的分子量。

应注意分子量有明显的差异，因为COS-1分离物是糖基化的，而由推定氨基酸序列得到的分子量不能说明糖基化。然而，已知膜蛋白在凝胶系统中表现出异常的迁移，这可以解释本文观察到的差异。

本发明的另一部分是嵌合和融合蛋白，所述蛋白含有FAPα部分，该部分含有分子的催化域，所述蛋白另外还含有非FAPα组分。FAPα催化域本身也是本发明的一部分。

应理解如上所述，FAPα可以是糖基化的，根据表达此分子的细胞类型，糖基化的类型和量有所改变，本文所述的实验显示出这一点。经未煮沸样品的SDS-PAGE测定出本文首次描述的二聚体形式的分子具有的分子量约为170KDa，这也是正确的。

本发明也包含用于产生FAPα分子的表达载体的生产。在这些载体最宽的范围内，它们含有与启动子有效相连的完整的FAPα编码序列或其部分。另外的元件可以是表达载体的一部分，如与FAPα蛋白或蛋白质部分融合的蛋白质域(“融合蛋白”)的基因，所述基因可赋予抗生素抗性，以及可扩增的基因等等。

编码序列和载体也可用于制备细胞系，其中使用编码序列或表达载体转染或转化受体宿主，所用细胞的类型可以是原核生物，如大肠杆菌，或真核生物，如酵母，CHO,COS或其它细胞类型。

如SEQ ID NO:1所示核酸分子的鉴定也使得技术人员可鉴定和分离那些在严紧条件下能与之杂交的核酸分子。本文所用的“严紧条件”指的是上文所述的那些参数，籍此也鉴定出鼠和仓鼠的序列。熟练的技术人员可以认为这些条件提供了使用与前述不同的参数可得到的严紧度。这些不同之处包含在术语“严紧条件”中。

核酸分子与互补分子杂交的能力也使得技术人员可通过使用核酸杂交试验鉴定出表达FAPα的细胞。人们可使用本发明中所述的序列与互补序列杂交，从而鉴定它们。通过此方法，可靶向mRNA，如表达FAPα分子的任何细胞中存在的mRNA。

当然，应懂得本发明的核酸分子也可用于生产单体和二聚体形式的重组FAPα。实施例清楚地说明宿主细胞可装配二聚体形式。重组蛋白质可用作例如免疫原的来源以产生与已知的mAb F19类似，并具有相同用途的抗体。类似地，可将重组蛋白质，和/或表达其表面分子的细胞用于测定拮抗剂，激动剂或能与具有FAPα活性之分子相互作用的其它分子的试验中。这种物质可以是，但不必局限于底物，抑制分子，抗体等等。具有FAPα活性的分子可以是例如单体或二聚体形式的FAPα，含有催化域的衍生物等等。具有FAPα活性的分子可以是纯的，或者是细胞提取物的形式，如已接受了FAPα活性基因的被转化或转染之细胞的提取物。原核生物和真核生物都可以使用。根据所观察到的与膜结合酶的结构相似性应考虑到本发明的最后一个特征。此类分子的某些相关特性无需在此详细描述，这足以说明与FAPα相关的这些特性的抑制或加强是本发明的特征，例如，通过使用重组细胞或重组FAPα本身可鉴定FAPα分子的底物，可对底物进行修饰以改善其效果，减轻其效果，或用可测的信号简单地标记它们以使它们可用于例如鉴定表达FAPα的细胞。对底物和FAPα，以及FAPα和任何诸如此类的分子之间的相互作用的研究可被用于开发和/或鉴定FAPα分子的激动剂和拮抗剂。

本发明另外的特征是经SDS-PAGE测定出其分子量约为170KDa的分离的二聚体FAPα分子，其作为酶裂解剂的用途和本文所述的其它用途。FAPα的酶活性形式也可以作为重组的融合蛋白产生，如含有FAPα催化域和具有适当生化特性的其它蛋白质域的可溶性融合蛋白，所述蛋白质域包括分泌信号，蛋白酶裂解位点，纯化标记物和技术人员已知的其它元件，例子是上文所述的CD8肽序列。如本文所述，FAPα具有特殊特性这一事实使得可以在表达分子的细胞上鉴定分子。换句话说，由于FAPα分子与肿瘤和肿瘤基质细胞相关，通过施用足够的治疗剂以减轻癌症负荷，用治疗剂靶向FAPα可以用作治疗癌症或癌症前期疾病的方法。

显示FAPα蛋白酶解特性的实验成为本发明的另一方面。众所周知，降解胞外基质或“ECM”蛋白质的蛋白酶对于肿瘤生长的某些方面具有重要的作用，所述作用包括它们对肿瘤细胞侵害，肿瘤血管形成(即新血管生成)和肿瘤转移的作用。同蛋白酶的底物相比，胶原具有特殊的意义，因为胶原是ECM重要的一部分。FAPα消化ECM的事实暗示了分子抑制剂的治疗作用。本文所用的“抑制剂”是指干扰FAPα酶功能的分子，从这种抑制剂中特别排除的是单克隆抗体F19。已知此mAb可结合但不抑制FAPα的酶功能，因此它不是抑制剂。有关既结合也抑制酶的单克隆抗体领域的技术是很成熟的。这种抑制剂的另外的例子包括例如底物衍生物，如经修饰的胶原分子，该分子干扰FAPα分子的活性位点，其它适当的抑制剂对于本领域技术人员是显而易见的，本文无需罗列。另外，在酶筛选试验中可使用前述的重组FAPα蛋白和被FAPα转染的细胞系以从任何化合物库中鉴定抑制剂，所述试验中使用了前述的底物或其它适当的底物。因此，与FAPα活性分子相互作用之底物的鉴定使得可以治疗受试者表现出异常FAPα活性的疾病。具体地说，给受试者施用足以使FAPα活性正常化的适当量底物，所述底物可以是抑制剂(如胶原衍生物，S-缬氨酰-吡咯烷-2(R)-硼酸)，激动剂或拮抗剂。

本发明的其它方面对于本领域技术人员是显而易见的，本文无需罗列。

本文使用的术语和措辞是为了描述而不是限制的目的，在使用这种术语和措辞时并不排除所示和所述特征的任何等同物或其部分，应理解多种修饰也可以在本发明的范围之内。

                       序列表(1)一般资料：(ⅰ)申请人：Zimmermann,Rainer；Park,John E.；

        Rettig,Wolfgang；Old,Lloyd J.(ⅱ)发明题目：分离的二聚体成纤维细胞激活蛋白α及其用途(ⅲ)序列数：2(ⅳ)通讯地址：

(A)收件人：Felfe & Lynch

(B)街道：805 Third Avenue

(C)城市：纽约

(D)州：纽约

(E)国家：美国

(F)邮政编码：10022(ⅴ)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘，3.5英寸，2.0MB内存

(B)计算机：IBM PS/2

(C)操作系统：PC-DOS

(D)软件：Wordperfect(ⅵ)目前的申请资料：

(A)申请号：

(B)申请日：

(C)分类号：(ⅶ)在先申请资料：

(A)申请号：08/619,280

(B)申请日：1996年3月18日

(C)分类号：435(ⅶ)在先申请资料：

(A)申请号：08/230,491

(B)申请日：1994年4月20日(ⅷ)代理人/代理资料：

(A)姓名：Hanson,Norman D.

(B)登记号：30,946

(C)资料/文档号：LUD 5330.1-PCT(ⅸ)通讯资料：

(A)电话：(212)688-9200

(B)传真：(212)838-3884(2)SEQ ID NO:1的资料：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：2815个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)序列描述：SEQ ID NO:1:AAGAACGCCC CCAAAATCTG TTTCTAATTT TACAGAAATC TTTTGAAACT TGGCACGGTA   60TTCAAAAGTC CGTGGAAAGA AAAAAACCTT GTCCTGGCTT CAGCTTCCAA CTACAAAGAC  120AGACTTGGTC CTTTTCAACG GTTTTCACAG ATCCAGTGAC CCACGCTCTG AAGACAGAAT  180TAGCTAACTT TCAAAAACAT CTGGAAAAAT GAAGACTTGG GTAAAAATCG TATTTGGAGT  240TGCCACCTCT GCTGTGCTTG CCTTATTGGT GATGTGCATT GTCTTACGCC CTTCAAGAGT  300TCATAACTCT GAAGAAAATA CAATGAGAGC ACTCACACTG AAGGATATTT TAAATGGAAC  360ATTTTCTTAT AAAACATTTT TTCCAAACTG GATTTCAGGA CAAGAATATC TTCATCAATC  420TGCAGATAAC AATATAGTAC TTTATAATAT TGAAACAGGA CAATCATATA CCATTTTGAG  480TAATAGAACC ATGAAAAGTG TGAATGCTTC AAATTACGGC TTATCACCTG ATCGGCAATT  540TGTATATCTA GAAAGTGATT ATTCAAAGCT TTGGAGATAC TCTTACACAG CAACATATTA  600CATCTATGAC CTTAGCAATG GAGAATTTGT AAGAGGAAAT GAGCTTCCTC GTCCAATTCA  660GTATTTATGC TGGTCGCCTG TTGGGAGTAA ATTAGCATAT GTCTATCAAA ACAATATCTA  720TTTGAAACAA AGACCAGGAG ATCCACCTTT TCAAATAACA TTTAATGGAA GAGAAAATAA  780AATATTTAAT GGAATCCCAG ACTGGGTTTA TGAAGAGGAA ATGCTTCCTA CAAAATATGC  840TCTCTGGTGG TCTCCTAATG GAAAATTTTT GGCATATGCG GAATTTAATG ATAAGGATAT  900ACCAGTTATT GCCTATTCCT ATTATGGCGA TGAACAATAT CCTAGAACAA TAAATATTCC  960ATACCCAAAG GCTGGAGCTA AGAATCCCGT TGTTCGGATA TTTATTATCG ATACCACTTA 1020CCCTGCGTAT GTAGGTCCCC AGGAAGTGCC TGTTCCAGCA ATGATAGCCT CAAGTGATTA 1080TTATTTCAGT TGGCTCACGT GGGTTACTGA TGAACGAGTA TGTTTGCAGT GGCTAAAAAG 1140AGTCCAGAAT GTTTCGGTCC TGTCTATATG TGACTTCAGG GAAGACTGGC AGACATGGGA 1200TTGTCCAAAG ACCCAGGAGC ATATAGAAGA AAGCAGAACT GGATGGGCTG GTGGATTCTT 1260TGTTTCAAGA CCAGTTTTCA GCTATGATGC CATTTCGTAC TACAAAATAT TTAGTGACAA 1320GGATGGCTAC AAACATATTC ACTATATCAA AGACACTGTG GAAAATGCTA TTCAAATTAC 1380AAGTGGCAAG TGGGAGGCCA TAAATATATT CAGAGTAACA CAGGATTCAC TGTTTTATTC 1440TAGCAATGAA TTTGAAGAAT ACCCTGGAAG AAGAAACATC TACAGAATTA GCATTGGAAG 1500CTATCCTCCA AGCAAGAAGT GTGTTACTTG CCATCTAAGG AAAGAAAGGT GCCAATATTA 1560CACAGCAAGT TTCAGCGACT ACGCCAAGTA CTATGCACTT GTCTGCTACG GCCCAGGCAT 1620CCCCATTTCC ACCCTTCATG ATGGACGCAC TGATCAAGAA ATTAAAATCC TGGAAGAAAA 1680CAAGGAATTG GAAAATGCTT TGAAAAATAT CCAGCTGCCT AAAGAGGAAA TTAAGAAACT 1740TGAAGTAGAT GAAATTACTT TATGGTACAA GATGATTCTT CCTCCTCAAT TTGACAGATC 1800AAAGAAGTAT CCCTTGCTAA TTCAAGTGTA TGGTGGTCCC TGCAGTCAGA GTGTAAGGTC 1860TGTATTTGCT GTTAATTGGA TATCTTATCT TGCAAGTAAG GAAGGGATGG TCATTGCCTT 1920GGTGGATGGT CGAGGAACAG CTTTCCAAGG TGACAAACTC CTCTATGCAG TGTATCGAAA 1980GCTGGGTGTT TATGAAGTTG AAGACCAGAT TACAGCTGTC AGAAAATTCA TAGAAATGGG 2040TTTCATTGAT GAAAAAAGAA TAGCCATATG GGGCTGGTCC TATGGAGGAT ACGTTTCATC 2100ACTGGCCCTT GCATCTGGAA CTGGTCTTTT CAAATGTGGT ATAGCAGTGG CTCCAGTCTC 2160CAGCTGGGAA TATTACGCGT CTGTCTACAC AGAGAGATTC ATGGGTCTCC CAACAAAGGA 2220TGATAATCTT GAGCACTATA AGAATTCAAC TGTGATGGCA AGAGCAGAAT ATTTCAGAAA 2280TGTAGACTAT CTTCTCATCC ACGGAACAGC AGATGATAAT GTGCACTTTC AAAACTCAGC 2340ACAGATTGCT AAAGCTCTGG TTAATGCACA AGTGGATTTC CAGGCAATGT GGTACTCTGA 2400CCAGAACCAC GGCTTATCCG GCCTGTCCAC GAACCACTTA TACACCCACA TGACCCACTT 2460CCTAAAGCAG TGTTTCTCTT TGTCAGACTA AAAACGATGC AGATGCAAGC CTGTATCAGA 2520ATCTGAAAAC CTTATATAAA CCCCTCAGAC AGTTTGCTTA TTTTATTTTT TATGTTGTAA 2580AATGCTAGTA TAAACAAACA AATTAATGTT GTTCTAAAGG CTGTTAAAAA AAAGATGAGG 2640ACTCAGAAGT TCAAGCTAAA TATTGTTTAC ATTTTCTGGT ACTCTGTGAA AGAAGAGAAA 2700AGGGAGTCAT GCATTTTGCT TTGGACACAG TGTTTTATCA CCTGTTCATT TGAAGAAAAA 2760TAATAAAGTC AGAAGTTCAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAGCGGCCG CTCGA      2815(2)SEQ ID NO:2的资料：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：760个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(D)拓扑结构：线性(ⅹⅰ)序列描述:SEQ ID NO:2:Met Lys Thr Trp Val Lys Ile Val Phe Gly Val Ala Thr Ser Ala Val

             5                   10                  15Leu Ala Leu Leu Val Met Cys Ile Val Leu Arg Pro Ser Arg Val His

         20                  25                  30Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu

     35                  40                  45Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe Pro Asn Trp Ile Ser Gly

 50                  55                  60Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn Asn Ile Val Leu Tyr Asn65                  70                  75                  80Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile Leu Ser Asn Arg Thr Met Lys

             85                  90                  95Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val

        100                 105                 110Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala

    115                 120                 125Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Asn

130                 135                 140Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser145                 150                 155                 160Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro

            165                 170                 175Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe Asn Gly Arg Glu Asn Lys Ile

        180                 185                 190Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Pro Thr

    195                 200                 205Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Ala

210                 215                 220Glu Phe Asn Asp Lys Asp Ile Pro Val Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly225                 230                 235                 240Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly

            245                 250                 255Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Ile Phe Ile Ile Asp Thr Thr Tyr Pro

        260                 265                 270Ala Tyr Val Gly Pro Gln Glu Val Pro Val Pro Ala Met Ile Ala Ser

    275                 280                 285Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Thr Asp Glu Arg Val

290                 295                 300Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile305                 310                 315                 320Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gln Thr Trp Asp Cys Pro Lys Thr Gln

            325                 330                 335Glu His Ile Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val

        340                 345                 350Ser Arg Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala Ile Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe

    355                 360                 365Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val

370                 375                 380Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Asn Ile385                 390                 395                 400Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu

            405                 410                 415Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Ser Tyr

        420                 425                 430Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys

    435                 440                 445Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu

450                 455                 460Val Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg465                 470                 475                 480Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn

            485                 490                 495Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys Glu Glu Ile Lys Lys Leu Glu

        500                 505                 510Val Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe

    515                 520                 525Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro

530                 535                 540Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Ser Tyr545                 550                 555                 560Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly

            565                 570                 575Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr Ala Val Tyr Arg Lys Leu

        580                 585                 590Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile

    595                 600                 605Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile Ala Ile lrp Gly Trp Ser

610                 615                 620Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu625                 630                 635                 640Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr

            645                 650                 655Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp

        660                 665                 670Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr

    675                 680                 685Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn

690                 695                 700Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala705                 710                 715                 720Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Leu

            725                 730                 735Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe Leu

        740                 745                 750Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp

    755                 760

Claims (30)

1．分离的，二聚体FAPα分子，经SDS-PAGE测定出其分子量约为170千道尔顿，其中所述二聚体FAPα分子能降解胞外基质蛋白。

2．权利要求1的二聚体FAPα分子，其中所述二聚体FAPα分子的各个单体由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成。

3．权利要求1的二聚体FAPα分子，所述分子是重组产生的。

4．权利要求3的二聚体FAPα分子，所述分子是由真核细胞产生的。

5．分离的蛋白质，由(ⅰ)FAPα催化域，和(ⅱ)至少一部分非FAPα蛋白组成。

6．从分子中裂解式Xaa-Pro的末端二肽的方法，所述方法包括：将所述分子与第二分子接触，所述第二分子具有FAPα酶解活性。

7．权利要求6的方法，其中所述第二分子是分离的二聚体FAPα。

8．权利要求6的方法，其中所述第二分子含有FAPα催化域。

9．鉴定与具有FAPα活性之分子相互作用的物质的方法，所述方法包括将所述分子与需检测的样品混合，并将与所述分子的任何相互作用测定为与具有FAPα活性之分子相互作用的分子的指示。

10．权利要求9的方法，其中所述的FAPα分子是二聚体。

11．权利要求9的方法，其中所述分子含有FAPα催化域。

12．权利要求9的方法，其中所述物质是FAPα活性的拮抗剂。

13．权利要求9的方法，其中所述物质是FAPα活性的激动剂。

14．权利要求9的方法，其中所述物质是FAPα活性的抑制剂。

15．权利要求9的方法，包括将所述物质与具有FAPα活性之细胞提取物混合。

16．权利要求15的方法，其中所述的细胞提取物是已被编码具有FAPα活性之分子的核酸分子转化或转染的细胞的提取物。

17．权利要求16的方法，其中所述细胞是原核生物的细胞。

18．权利要求16的方法，其中所述细胞是真核生物的细胞。

19．治疗处于FAPα活性异常之病理状态的受试者的方法，所述方法包括给需要治疗的受试者施用其量足以使所述受试者体内的FAPα活性水平正常化的物质，所述物质可与具有FAPα活性之分子相互作用。

20．权利要求19的方法，包括施用FAPα活性的抑制剂。

21．权利要求20的方法，其中所述的抑制剂是胶原衍生物。

22．权利要求20的方法，其中所述抑制剂是(S)-缬氨酰吡咯烷-2(R)-硼酸。

23．权利要求19的方法，其中所述物质是FAPα活性的激动剂。

24．权利要求19的方法，其中所述物质是FAPα活性的拮抗剂。

25．鉴定物质是否与具有FAPα活性的分子相互作用的方法，所述方法包括将所述物质与所述分子和Ala-Pro-AFC混合，测定所述分子与Ala-Pro-AFC的相互作用，并将所述相互作用与缺乏所述物质时所述分子与Ala-Pro-AFC的相互作用相比较，其中它们之间的差异表示所述物质与所述分子相互作用。

26．含有足以维持FAPα活性的FAPα分子的一部分和非FAPα氨基酸序列的融合蛋白，其中所述融合蛋白是水溶性的。

27．权利要求26的融合蛋白，其中所述的非FAPα氨基酸序列是在CD8蛋白中发现的氨基酸序列。

28．权利要求27的融合蛋白，其中所述的CD8蛋白是鼠源蛋白质。

29．权利要求27的融合蛋白，其中所述的CD8蛋白是人源蛋白质。

30．权利要求27的融合蛋白，含有与FAPα的氨基酸27-760相连的鼠CD8氨基酸1-189。

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