[go: up one dir, main page]

CN121398856A - 包含微小rna去靶向传感器的多核苷酸及其用途 - Google Patents

包含微小rna去靶向传感器的多核苷酸及其用途

Info

Publication number
CN121398856A
CN121398856A CN202480042549.9A CN202480042549A CN121398856A CN 121398856 A CN121398856 A CN 121398856A CN 202480042549 A CN202480042549 A CN 202480042549A CN 121398856 A CN121398856 A CN 121398856A
Authority
CN
China
Prior art keywords
glycero
payload
aspects
spleen
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202480042549.9A
Other languages
English (en)
Inventor
T·基塔达
J·库拉纳
W·A·曾
P·南比亚
K·施
J·莱顿德雷
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Strand Biotechnology
Original Assignee
Strand Biotechnology
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Strand Biotechnology filed Critical Strand Biotechnology
Publication of CN121398856A publication Critical patent/CN121398856A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0041—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A61K48/0066—Manipulation of the nucleic acid to modify its expression pattern, e.g. enhance its duration of expression, achieved by the presence of particular introns in the delivered nucleic acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2820/00—Vectors comprising a special origin of replication system
    • C12N2820/60—Vectors comprising a special origin of replication system from viruses
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本公开涉及多核苷酸，其包含(a)编码有效载荷的第一区域和(b)包含免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器)的第二区域。在所述传感器识别标志物时，所编码的有效载荷的表达被减少或抑制。本文还提供了包含此类多核苷酸的复制子、纳米颗粒、合成回路、药物组合物。还提供了使用所述多核苷酸、复制子、合成回路、纳米颗粒和药物组合物的方法。

Description

包含微小RNA去靶向传感器的多核苷酸及其用途
相关申请的交叉引用
本PCT申请要求2023年7月25日提交的美国临时申请号63/515,514和2024年5月8日提交的美国临时申请号63/644,296的优先权权益，其各自的全部公开内容出于所有目的通过引用并入本文。
对经由EFS-WEB以电子方式递交的序列表的引用
以电子方式递交(名称：4597_031PC02_Seqlisting_ST26；大小：38,199字节；创建日期：2024年7月25日)并与本申请一起提交的序列表的内容通过引用以其整体并入本文。
背景技术
基于核酸的治疗(例如，mRNA疫苗)正在成为治疗各种疾病的越来越重要的方法。在施用时，可产生所编码的蛋白质，以诱导免疫应答(例如，肿瘤抗原，以诱导抗肿瘤免疫应答)或提供维持健康状态的重要功能。然而，以组织特异性和/或细胞特异性方式控制来自mRNA治疗剂的有效载荷蛋白的表达仍然是一个挑战。另外，用于递送核酸分子的当前递送平台是无效的或与不期望的副作用相关联，从而限制了基于核酸的疗法的全部潜力。
因此，仍然需要更有效且允许组织特异性和/或细胞特异性递送的改进的核酸(例如，mRNA)递送平台。
发明内容
本文提供了一种分离的多核苷酸，其包含(a)编码有效载荷的第一区域和(b)包含能够特异性识别由免疫细胞表达的标志物的传感器(免疫细胞去靶向传感器)的第二区域，其中与参考细胞(例如，非免疫细胞)相比，免疫细胞去靶向传感器对标志物的识别导致有效载荷的表达减少。
在一些方面，免疫细胞包括造血干细胞和/或其衍生物。
在一些方面，免疫细胞包括T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或它们的组合。
在一些方面，与非淋巴组织相比，免疫细胞在淋巴组织内以更大的量存在。
在一些方面，与非淋巴组织的对应值相比，淋巴组织内存在的免疫细胞的数量大于约1倍、大于约2倍、大于约3倍、大于约4倍、大于约5倍、大于约6倍、大于约7倍、大于约8倍、大于约9倍、大于约10倍或更多。
在一些方面，淋巴组织包括脾脏、淋巴结或两者。
在一些方面，第二区域包含多个免疫细胞去靶向传感器。
在一些方面，多个免疫细胞去靶向传感器中的每一个是相同的。
在一些方面，多个免疫细胞去靶向传感器中的一个或多个是不同的。
在一些方面，标志物包括微小RNA。
在一些方面，微小RNA包括miR-142。
在一些方面，有效载荷包括细胞因子、配体结合蛋白或两者。
在一些方面，细胞因子包括白介素(IL)-12蛋白。
在一些方面，分离的多核苷酸还包含：(1)内部核糖体进入位点(IRES)，(2)非翻译区(UTR)，(3)编码信号肽的序列，(4)翻译起始序列，(5)聚A序列，(6)编码RNA结合蛋白的序列，(7) 5'-帽，(8)编码2A核糖体跳跃肽的序列，(9)翻译增强子元件，或(10) (1)至(9)的任何组合。
本文还提供了一种分离的多核苷酸，其包含(a)编码有效载荷的第一区域和(b)包含能够特异性识别在脾脏内表达的标志物的传感器(脾脏去靶向传感器)的第二区域，并且其中脾脏去靶向传感器对标志物的识别减少有效载荷的表达。
在一些方面，标志物包括微小RNA。
在一些方面，微小RNA包括miR-142。
在一些方面，有效载荷包括细胞因子、配体结合蛋白或两者。
在一些方面，细胞因子包括白介素(IL)-12蛋白。
在一些方面，第二区域包含多个脾脏去靶向传感器。
在一些方面，多个脾脏去靶向传感器中的每一个是相同的。
在一些方面，多个脾脏去靶向传感器中的一个或多个是不同的。
在一些方面，分离的多核苷酸还包含：(1)内部核糖体进入位点(IRES)，(2)非翻译区(UTR)，(3)编码信号肽的序列，(4)翻译起始序列，(5)聚A序列，(6)编码RNA结合蛋白的序列，(7) 5'-帽，(8)编码2A核糖体跳跃肽的序列，(9)翻译增强子元件，或(10) (1)至(9)的任何组合。
本文还提供了一种合成回路，其包含本文所描述的任何分离的多核苷酸。
本文还提供了一种合成回路，其基本上由本文所描述的任何分离的多核苷酸组成。
本文还提供了一种合成回路，其由本文所描述的任何分离的多核苷酸组成。
本文还提供了一种复制子，其包含本文所描述的任何分离的多核苷酸或合成回路，其中复制子是自我复制的。
在一些方面，复制子衍生自甲病毒。
在一些方面，甲病毒包括委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒。
本文还提供了一种纳米颗粒，其包含(a)本文所描述的任何分离的多核苷酸、合成回路或复制子，和(b)脂质和/或脂质样材料。
在一些方面，脂质包括可电离脂质、阳离子脂质、类脂质、非阳离子辅助脂质、磷脂、甾醇或其他结构脂质或它们的组合。
在一些方面，可电离脂质包括((4-羟基丁基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)、8-((2-羟基乙基)(6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(SM-102)、8-((2-羟基乙基)(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(脂质5)、9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4-三(十二烷基)-1-哌嗪乙胺(KL10)、Nl-[2 (双十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三(十二烷基) 1,4-哌嗪二乙胺(KL22)、14,25-双十三烷基-15,18,21,24-四氮杂-三十八烷(KL25)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、1,2-二油氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)、2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2R))和(2S)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA (2S))或它们的组合。
在一些方面，阳离子脂质包括l,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、脂质体转染试剂(lipofectamine)、N-[l-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、l-[2-(油酰氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)氯化咪唑鎓(DOTEVI)、2,3-二油氧基-N-[2(精胺甲酰氨基)乙基]-N,N-二甲基-l-三氟乙酸丙铵(DOSPA)、N,N-二硬脂酰-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、N-(l,2-二油酰氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DORIE)、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、l,2-二月桂酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DLePC)、l,2-二硬脂酰-3-三甲基铵-丙烷(DSTAP)、l,2-二棕榈酰-3-三甲基铵-丙烷(DPTAP)、l,2-二亚油酰-3-三甲基铵-丙烷(DLTAP)、l,2-二肉豆蔻酰-3-三甲基铵-丙烷(DMTAP)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DSePC)、l,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DPePC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DMePC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOePC)、l,2-二-(9Z-十四碳烯酰基)-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(14: 1 EPC)、l-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(16:0-18: 1 EPC)或它们的任何组合。
在一些方面，类脂质包括1,1′-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇) (C12-200)、3,6-双(4-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丁基)哌嗪2,5-二酮(cKK-E12)、四(8-甲基壬基)3,3′,3″,3-(((甲基氮烷二基)双(丙烷-3,1-二基))双(氮烷三基))四丙酸酯(306Oi10)、G0-C14、5A2-SC8、3,6-双(4-(双((9Z,12Z)-2-羟基十八碳9,12-二烯-1-基)氨基)丁基)哌嗪-2,5-二酮(OF-02)、(((3,6-二氧代哌嗪-2,5-二基)双(丁烷-4,1-二基))双(氮烷三基))四(乙烷2,1-二基)(9Z,9′Z,9″Z,9Z,12Z,12′Z,12″Z,12Z)-四(十八碳-9,12-二烯酸酯)(OF-Deg-Lin)、(((3,6-二氧代哌嗪-2,5-二基)双(丁烷-4,1-二基))双(氮烷三基))四(丁烷-4,1-二基)(9Z,9′Z,9″Z,9Z,12Z,12′Z,12″Z,12Z)-四(十八碳-9,12-二烯酸酯)(OF-C4-Deg-Lin)、N1,N3,N5-三(3-(双十二烷基氨基)丙基)苯1,3,5-三甲酰胺(TT3)、六(辛-3-基) 9,9′,9″,9,9″″,9″-((((苯-1,3,5-三羰基)三(氮烷二基))三(丙烷-3,1-二基))三(氮烷三基))己基壬酸酯(FTT5)、PL-1、98N12-5、5,5-二((Z)-十七碳-8-烯-1-基)-1-(3-(吡咯烷-1-基)丙基)-2,5-二氢-1H-咪唑-2-甲酸乙酯(A2-Iso5-2DC18(A2))、A12-Iso5-2DC18 (A12)或它们的任何组合。
在一些方面，磷脂选自由以下各项组成的组：1,2-二亚油酰-sn-甘油-3磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰-sn甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-双十一烷酰-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC)、1-油酰-2-胆固醇基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 LysoPC)、1,2-二亚麻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0 PE)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(14:0-16:0 PC，MPPC)、1-肉豆蔻酰-2硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(14:0-18:0 PC，MSPC)、1-棕榈酰2-乙酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-02:0 PC)、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-14:0 PC，PMPC)、1-棕榈酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-18:0 PC，PSPC)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-18:1 PC，POPC)、1-棕榈酰-2-亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-18:2 PC，PLPC)、1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-20:4 PC)、1-棕榈酰-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(14:0-22:6 PC)、1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-14:0 PC，SMPC)、1-硬脂酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-16:0 PC，SPPC)、1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-18:1 PC，SOPC)、1-硬脂酰-2-亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-18:2 PC)、1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-20:4 PC)、1-硬脂酰-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-22:6 PC)、1-油酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-14:0 PC，OMPC)、1-油酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-16:0PC，OPPC)、1-油酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-18:0 PC，OSPC)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(16:0-18:1 PE，POPE)、1-棕榈酰-2-亚油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(16:0-18:2 PE)、1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(16:0-20:4 PE)、1-棕榈酰-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(16:0-22:6 PE)、1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:0-18:1 PE)、1-硬脂酰-2-亚油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:0-18:2 PE)、1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:0-20:4 PE)、1-硬脂酰-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:0-22:6 PE)、1-油酰-2-胆固醇基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)以及它们的任何组合。
在一些方面，甾醇包括胆固醇、粪甾醇、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、番茄碱(tomatidine)、番茄苷(tomatine)、熊果酸、α-生育酚以及它们的组合。
在一些方面，脂质和/或脂质样材料是聚乙二醇化的。
在一些方面，本文所描述的任何纳米颗粒还包含靶向配体。
本文还提供了一种药物组合物，其包含(a)本文所描述的任何分离的多核苷酸、合成回路、复制子或纳米颗粒，和(b)药学上可接受的载剂。
本公开的一些方面涉及减少有需要的受试者的免疫细胞内的有效载荷的表达(有效载荷表达)的方法，其包括向受试者施用本文所描述的任何(a)分离的多核苷酸，(b)合成回路，(c)复制子，(d)纳米颗粒，或(e)药物组合物，或(a)至(e)的任何组合。
在这些方法的一些方面，与参考受试者(例如，接受缺乏免疫细胞去靶向传感器的对应多核苷酸的受试者)相比，减少有效载荷表达包括(a)减少由免疫细胞表达的有效载荷的量，(b)减少免疫细胞的有效载荷表达的持续时间，或(c) (a)和(b)两者。
在这些方法的一些方面，在施用后，与参考受试者相比，由免疫细胞表达的有效载荷的量减少至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或约100%。
在这些方法的一些方面，在施用后，与参考受试者相比，免疫细胞的有效载荷表达的持续时间减少至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或约100%。
在这些方法的一些方面，免疫细胞包括T细胞、巨噬细胞或两者。
本公开的一些方面涉及在有需要的受试者的非免疫细胞中选择性表达有效载荷的方法，其包括向受试者施用本文所描述的任何(a)分离的多核苷酸，(b)合成回路，(c)复制子，(d)纳米颗粒，(e)药物组合物，或(a)至(e)的任何组合。
在这些方法的一些方面，在施用后，与受试者的免疫细胞中的对应的量和/或持续时间相比，(a)在非免疫细胞中表达的有效载荷的量，(b)非免疫细胞中的有效载荷的表达的持续时间，或(c) (a)和(b)两者均增加。
本公开的一些方面涉及减少有需要的受试者的淋巴组织内的有效载荷的表达(有效载荷表达)的方法，其包括向受试者施用本文所描述的任何(a)分离的多核苷酸，(b)合成回路，(c)复制子，(d)纳米颗粒，(e)药物组合物，或(a)至(e)的任何组合。
在这些方法的一些方面，淋巴组织包括脾脏、淋巴结或两者。
在这些方法的一些方面，与参考受试者(例如，接受缺乏免疫细胞去靶向传感器的对应多核苷酸的受试者)相比，减少有效载荷表达包括(a)减少在淋巴组织中表达的有效载荷的量，(b)减少淋巴组织中的有效载荷表达的持续时间，或(c) (a)和(b)两者。
在这些方法的一些方面，在施用后，与参考受试者相比，在淋巴组织中表达的有效载荷的量减少至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或约100%。
在这些方法的一些方面，在施用后，与参考受试者相比，淋巴组织中的有效载荷表达的持续时间减少至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或约100%。
本公开的一些方面涉及减少有需要的受试者的脾脏内的有效载荷的表达(有效载荷表达)的方法，其中该方法包括向受试者施用本文所描述的任何(a)分离的多核苷酸，(b)合成回路，(c)复制子，(d)纳米颗粒，或(e)药物组合物，或(a)至(e)的任何组合。
在这些方法的一些方面，与参考受试者(例如，接受缺乏脾脏去靶向传感器的对应多核苷酸的受试者)相比，减少有效载荷表达包括(a)减少在脾脏中表达的有效载荷的量，(b)减少脾脏中的有效载荷表达的持续时间，或(c) (a)和(b)两者。
在这些方法的一些方面，在施用后，与参考受试者相比，在脾脏中表达的有效载荷的量减少至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或约100%。
在这些方法的一些方面，在施用后，有效载荷不在脾脏中表达。
在这些方法的一些方面，在施用后，与参考受试者相比，脾脏中的有效载荷表达的持续时间减少至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或约100%。
本公开的一些方面涉及在有需要的受试者的非淋巴组织中选择性表达有效载荷的方法，其包括向受试者施用本文所描述的任何(a)分离的多核苷酸，(b)合成回路，(c)复制子，(d)纳米颗粒，(e)药物组合物，或(a)至(e)的任何组合。
在这些方法的一些方面，在施用后，与受试者的脾脏中的对应的量和/或持续时间相比，(a)在非淋巴组织中表达的有效载荷的量，(b)非脾脏组织中的有效载荷的表达的持续时间，或(c) (a)和(b)两者均增加。
本公开的一些方面涉及在有需要的受试者的非脾脏组织中选择性表达有效载荷的方法，其包括向受试者施用本文所描述的任何(a)分离的多核苷酸，(b)合成回路，(c)复制子，(d)纳米颗粒，或(e)药物组合物，或(a)至(e)的任何组合。
在这些方法的一些方面，在施用后，与受试者的脾脏中的对应的量和/或持续时间相比，(a)在非脾脏组织中表达的有效载荷的量，(b)非脾脏组织中的有效载荷的表达的持续时间，或(c) (a)和(b)两者均增加。
本公开的一些方面涉及治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，其包括向受试者施用本文所描述的任何(a)分离的多核苷酸，(b)合成回路，(c)复制子，(d)纳米颗粒，或(e)药物组合物，或(a)至(e)的任何组合。
在这些方法的一些方面，疾病或病症包括癌症、炎性病症、单基因病症、神经病症、精神病症或它们的组合。
在这些方法的一些方面，癌症包括黑色素瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝肿瘤、胃癌、头颈癌或它们的组合。
在这些方法的一些方面，本文所描述的任何分离的多核苷酸、合成回路、复制子、纳米颗粒和/或药物组合物经由静脉内、肿瘤内、鞘内、肌内、皮下、吸入、皮内、淋巴内、眼内、腹膜内、胸膜内、脊柱内、血管内、经鼻、经皮、舌下、粘膜下、透皮或经粘膜施用来施用于受试者。
在这些方法的一些方面，该方法包括向受试者施用另外的治疗剂。
附图说明
图1A和1B分别提供了在单次静脉内施用负载有(a)包含仅编码IL-12的mRNA (即，无免疫细胞去靶向传感器(例如，无脾脏去靶向传感器，例如，无miR-142传感器))的VEE复制子或(b)包含编码IL-12并且包含免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的mRNA的VEE复制子的脂质纳米颗粒后小鼠脾脏中的IL-12和IFN-γ水平的比较。LNP以两种剂量之一施用：0.1 mg/kg或0.3 mg/kg。对照动物用PBS处理。在施用后6小时和24小时测量IL-12和IFN-γ水平。
图2提供了在施用负载有(a)包含仅编码IL-12的mRNA (即，无免疫细胞去靶向传感器(例如，无脾脏去靶向传感器，例如，无miR-142传感器))的VEE复制子(正方形)或(b)包含编码IL-12并且包含免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的mRNA的VEE复制子(菱形)的脂质纳米颗粒后小鼠的体重百分比的比较。对照动物用PBS处理(圆形)。在施用后10天的过程中测量体重。
图3A和3B分别提供了在单次静脉内施用负载有以下之一的脂质纳米颗粒后非人灵长类动物的血浆中的IL-12和IFN-γ水平的比较：(a)仅编码IL-12的经修饰的mRNA (即，无免疫细胞去靶向传感器(例如，无脾脏去靶向传感器，例如，无miR-142传感器)) (“mod-IL-12”；圆形)；(b)编码IL-12并且包含免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)和肝脏去靶向传感器的经修饰的mRNA (“mod-IL-12-回路”；正方形)；(c)包含仅编码IL-12的mRNA (即，无免疫细胞去靶向传感器(例如，无脾脏去靶向传感器，例如，无miR-142传感器))的VEE复制子(“rep-IL-12”；三角形)；以及(d)包含编码IL-12并且包含免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的mRNA的VEE复制子(“rep-IL-12-回路”；倒三角形)。
图4提供了实施例1中所描述的RNA回路的示意图。
图5提供了不同细胞类型(两种不同的肿瘤、脾细胞和健康的非脾细胞)中的miRNA表达的比较，以及在用编码有效载荷和对miRNA具有特异性的传感器的RNA回路处理后不同细胞类型中的预测有效载荷表达的比较。
图6A和6B分别提供了在用以下之一全身治疗后来自小鼠的脾脏和非脾脏组织中的有效载荷表达的比较：(1)单独的PBS，(2)编码有效载荷而不具有免疫细胞去靶向传感器(例如，无脾脏去靶向传感器，例如，无miR-142传感器)的mRNA (即，非回路化的mRNA)，以及(3)编码有效载荷的具有免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的mRNA (即，回路化的mRNA)。
图7A-7F提供了用以下之一治疗的小鼠的体重、血清和脾脏IL-12水平以及血清和脾脏IFN-γ水平的比较：(1)单独的PBS，(2)编码IL-12而不具有免疫细胞去靶向传感器(例如，无脾脏去靶向传感器，例如，无miR-142传感器)的mRNA (即，非回路化的mRNA)，以及(3)编码IL-12的具有免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的mRNA (即，回路化的mRNA)。以两种不同的剂量向动物施用mRNA：0.1 mg/kg (图7A、7B和7C)和0.3 mg/kg (图7D、7E和7F)。
图8A-8C分别提供了用以下之一治疗的小鼠的肿瘤体积、肿瘤中的IL-12水平和脾脏中的IL-12水平的比较：(1)单独的PBS，(2)编码有效载荷而不具有免疫细胞去靶向传感器(例如，无脾脏去靶向传感器，例如，无miR-142传感器)的mRNA (即，非回路化的mRNA)，以及(3)编码有效载荷的具有免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的mRNA (即，回路化的mRNA)。
图9A和9B提供了用以下之一转染患者来源的乳腺癌类器官(图9A)和A549细胞(图9B)后上清液中的IL-12蛋白水平的比较：(1)编码有效载荷而不具有免疫细胞去靶向传感器(例如，无脾脏去靶向传感器，例如，无miR-142传感器)的mRNA (即，非回路化的mRNA)(左侧条柱)和(2)编码有效载荷的具有免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的mRNA (即，回路化的mRNA) (右侧条柱)。
图10提供了跨不同细胞类型(即，A549、BT-20、HeLa、HEK293T、HEK293、CD3+ T、CD4+ T、CD8+ T、CD14+单核细胞、CD19+ B、CD56+ NK和B16F10)的miR-142表达谱(每百万计数)的比较。
图11提供了用包含编码萤火虫萤光素酶(“Fluc”)而不具有免疫细胞去靶向传感器(例如，无脾脏去靶向传感器，例如，无miR-142传感器)的mRNA (即，非回路化的mRNA)的VEE复制子(“Rep-Fluc”)或包含编码Fluc的具有免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的mRNA (即，回路化的mRNA)的VEE复制子(“Rep-Fluc-miRNA传感器”)转染的人库普弗(Kupffer)细胞(肝脏巨噬细胞)中的萤光素酶表达的体外比较。
图12提供了静脉内递送负载有以下之一的脂质纳米颗粒后非人灵长类动物的脾脏、肠系膜淋巴结(LN)、气管支气管LN、下颌LN、腋窝LN和骨髓中的IL-12表达的比较：(a)仅编码IL-12的经修饰的mRNA (即，无免疫细胞去靶向传感器(例如，无脾脏去靶向传感器，例如，无miR-142传感器)) (“mod-IL-12”；圆形)；(b)编码IL-12并且包含免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)和肝脏去靶向传感器的经修饰的mRNA (“mod-IL-12-回路”；正方形)；(c)包含仅编码IL-12的mRNA (即，无免疫细胞去靶向传感器(例如，无脾脏去靶向传感器，例如，无miR-142传感器))的VEE复制子(“rep-IL-12”；三角形)；以及(d)包含编码IL-12并且包含免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的mRNA的VEE复制子(“rep-IL-12-回路”；倒三角形)。虚线表示定量下限(LLOQ)。
图13示出非人灵长类动物脾脏的白髓(含有淋巴细胞和巨噬细胞)内的miR-142-3p表达的染色。
图14提供了下组的有效载荷表达(即，报告基因)的比较：T细胞中的对照和miR-142-3p传感器。
图15A和15B提供了A549 (图15A)和B16.F10细胞(图15B)中的miR-142传感器活性。图15A提供了下组的有效载荷表达(即，发光)的比较：(1) hsa-miR-142-3p (回路化的；左侧条柱) (即，用包含编码有效载荷的mRNA和miR-142传感器的构建体处理的A549细胞)，(2)无miR (非回路化的；中间条柱) (即，用包含编码有效载荷的mRNA但无miR-142传感器的构建体处理的A549细胞)，以及(3)无报告基因(对照；右侧条柱)(即，未处理的A549细胞)。图15B提供了下组的有效载荷表达(即，mIL-12)的比较：(1)无传感器(非回路化的；左侧条柱) (即，用包含编码IL-12的mRNA但无miR-142传感器的构建体处理的B16.F10细胞)和(2) hsa-miR-142-3p传感器(回路化的；右侧条柱) (即，用包含编码IL-12的mRNA和miR-142传感器的构建体处理的B16.F10细胞)。
图16是贯穿实施例描述的编码VEE衍生的复制子的质粒的示意图。
图17提供了RAW264.7巨噬细胞中的miR-142传感器活性的比较。将表达萤火虫荧光素酶(Fluc)有效载荷蛋白并携带响应于miR-142-3p的传感器(具有传感器的Rep)或不具有这种传感器(不具有传感器的Rep)的VEE复制子(Rep)转染到RAW264.7巨噬细胞中。将一些样品用靶向miR-142-3p的miRNA抑制剂(抗miR-142-3p)或阴性对照miRNA抑制剂(抗cel-miR-67)共转染。
具体实施方式
本公开整体涉及允许选择性调控组织中的基因(例如，编码有效载荷)表达的分离的多核苷酸。更具体地，本文所描述的多核苷酸包含(a)编码有效载荷的第一区域和(b)包含已被编程为识别特定标志物(诸如在脾脏内表达的标志物)的传感器的第二区域。如本文进一步所描述，取决于特定标志物的存在或不存在，传感器可以调控所编码的有效载荷的表达。此类多核苷酸可以特别可用于减少和/或防止有效载荷在特定组织(例如，脾脏)内的表达。如本领域技术人员将显而易见的，诸如脾脏的组织包含大量免疫细胞(例如，T细胞)。在一些方面，传感器所识别的特定标志物由存在于此类组织内的免疫细胞表达。不受任何一种理论的束缚，在一些方面，基因(例如，编码有效载荷)在特定组织(例如，脾脏)内的表达与存在于该特定组织内的免疫细胞对该基因的表达直接相关。在一些方面，通过调控免疫细胞对基因(例如，编码有效载荷)的表达，还可以调控该基因在特定组织内的表达。本申请全篇提供了本公开的另外的方面。
在更详细地描述本公开之前，应当理解，本公开不限于所描述的特定组合物或方法步骤，因此此类组合物或方法步骤当然可变化。本领域技术人员在阅读本公开时将显而易见的是，本文所描述且说明的各个单独方面具有离散的组分和特征，这些组分和特征可容易地与任何另外的若干方面的特征分离或组合而不偏离本公开的范围或精神。任何叙述的方法均可以叙述的事件的顺序或以在逻辑上可能的任何其它顺序进行。
本文提供的标题并非是对本公开的各个方面的限制，这些各个方面可通过参考说明书整体来限定。还应理解，本文使用的术语仅出于描述特定方面的目的，并且并不意图是限制性的，因为本公开的范围将仅受所附权利要求限制。
I.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科技术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。在发生冲突的情况下，以本申请(包括定义)为准。除非上下文另有要求，否则单数术语应包括复数并且复数术语应包括单数。
在本公开全篇中，术语“一个”或“一种”实体是指一个(种)或多个(种)该实体；例如，“一种多核苷酸”应理解为表示一种或多种多核苷酸。因此，术语“一个”或(“一种”)、“一个(种)或多个(种)”和“至少一个(种)”在本文可互换使用。
此外，当在本文使用时，“和/或”应视为具有或不具有另一者的两种特定特征或组分的每一者的具体公开。因此，如本文短语诸如“A和/或B”中所用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如在短语诸如“A、B和/或C”中所用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A (单独)；B (单独)；以及C (单独)。
应了解，每当在本文中以措辞“包含”描述各个方面的情况下，还提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”描述的另外类似方面。
术语“约”在本文用于意指近似、大致、大约或在……左右。当该术语与数值范围结合使用时，其通过使边界延伸高于和低于阐述的数值来修饰那个范围。一般来说，除非另外指明，否则术语“约”在本文用于以高于和低于所陈述值10%上下(升高或降低)的变化来修饰数值。
如从上下文中清楚的，在数字或一系列数字之前的术语“至少”应理解为包括与术语“至少”相邻的数字，以及逻辑上可包括的所有后续数字或整数。例如，核酸分子中核苷酸的数目必须是整数。例如，“21个核苷酸的核酸分子的至少18个核苷酸”意味着18、19、20或21个核苷酸具有指定的性质。当至少出现在一系列数字或范围之前时，应理解，“至少”可以修饰该系列或范围中的每一个数字。“至少”也不限于整数(例如，“至少5%”包括5.0%、5.1%、5.18%，而不考虑有效数字的位数)。
如本文所用，术语“传感器”是指能够识别本文所描述的标志物的任何部分。如本文所用，“识别”标志物可包括标志物与传感器之间的物理相互作用(例如，标志物结合传感器内的特异性标志物识别位点)。如本文所描述，在一些方面，可用于本公开的传感器能够特异性识别由免疫细胞表达的标志物(即，免疫细胞标志物)。在识别标志物时，传感器“开启”并且从而减少或抑制免疫细胞对所编码的有效载荷的表达，例如，当施用于受试者时。此类传感器在本文也称为“免疫细胞去靶向传感器”。如本公开其他地方进一步描述的，此类免疫细胞存在于许多组织中，例如，淋巴组织，诸如脾脏。在一些方面，通过减少或抑制此类免疫细胞对所编码的有效载荷的表达，本文所描述的传感器还可用于减少或抑制所编码的多肽在某些组织(例如，淋巴组织)内的表达。在传感器导致所编码的有效载荷在脾脏内的表达被减少或抑制(例如，通过识别由脾脏内存在的免疫细胞表达的标志物)的情况下，此类传感器在本文也称为“脾脏去靶向传感器”。在传感器特异性识别miR-142-3p的情况下，此类传感器在本文也称为“miR-142传感器”
如本文所用，术语“标志物”是指由免疫细胞(例如，存在于组织(例如，脾脏)内)表达并且可被本文所描述的传感器识别的任何分子。此类标志物的非限制性示例在本公开的其他地方提供。
如本文所用，术语“免疫细胞”是指为免疫系统的一部分并且帮助身体对抗感染和其他疾病的那些细胞。可用于本公开的免疫细胞的非限制性示例包括为造血干细胞的衍生物的细胞。在一些方面，为造血干细胞的衍生物的细胞包括淋巴谱系细胞、骨髓谱系细胞或两者。在一些方面，淋巴谱系细胞包括淋巴细胞、浆细胞或两者。在一些方面，淋巴细胞包括T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞或它们的组合。在一些方面，骨髓谱系细胞包括巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或它们的组合。如将对本领域技术人员显而易见的，免疫细胞主要存在于淋巴组织内或循环中(例如，血液内)。如本文所用，“淋巴组织”是指受试者内富含免疫细胞的任何组织。淋巴组织的非限制性示例包括骨髓、胸腺、淋巴结、脾脏、扁桃体、阑尾、派尔斑(Peyer's patches)以及它们的组合。
如本文所用，术语“非免疫细胞”是指不源自造血干细胞的任何细胞。
如本文所用，术语“有效载荷”是指可由所描述的多核苷酸编码的任何剂。在本公开的其他地方提供了可用有效载荷的非限制性示例。
如本文所用，术语“源自”是指从特定分子或生物体中分离或使用特定分子或生物体制备的组分，或来自特定分子或生物体的信息(例如，氨基酸或核酸序列)。例如，源自第二核酸序列的核酸序列可包括与第二核酸序列的核苷酸序列同一或基本相似的核苷酸序列。在核苷酸或多肽的情况下，来源物种可通过例如天然存在的诱变、人工定向诱变或人工随机诱变获得。用于获得核苷酸或多肽的诱变可以是有意定向的或有意随机的，或两者的混合。核苷酸或多肽的诱变以产生源自第一核苷酸或多肽的不同核苷酸或多肽可以是随机事件(例如，由聚合酶失真引起)并且可通过适当的筛选方法(例如如本文所讨论)来鉴定来源核苷酸或多肽。在一些方面，源自第二核苷酸或氨基酸序列的核苷酸或氨基酸序列分别与第二核苷酸或氨基酸序列具有至少约50%、至少约51%、至少约52%、至少约53%、至少约54%、至少约55%、至少约56%、至少约57%、至少约58%、至少约59%、至少约60%、至少约61%、至少约62%、至少约63%、至少约64%、至少约65%、至少约66%、至少约67%、至少约68%、至少约69%、至少约70%、至少约71%、至少约72%、至少约73%、至少约74%、至少约75%、至少约76%、至少约77%、至少约78%、至少约79%、至少约80%、至少约81%、至少约82%、至少约83%、至少约84%、至少约85%、至少约86%、至少约87%、至少约88%、至少约89%、至少约90%、至少约91%、至少约92%、至少约93%、至少约94%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99%或约100%的序列同一性，其中第一核苷酸或氨基酸序列保留第二核苷酸或氨基酸序列的生物活性。
“核酸”、“核酸分子”、“核苷酸序列”、“核酸序列”、“多核苷酸”以及它们的语法变体可互换使用并且是指呈单链形式或双链螺旋的核糖核苷(腺苷、鸟苷、尿苷或胞苷；“RNA分子”)或脱氧核糖核苷(脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷或脱氧胞苷；“DNA分子”)的磷酸酯聚合形式或其任何磷酸酯类似物，诸如硫代磷酸酯和硫酯。单链核酸序列是指单链DNA(ssDNA)或单链RNA(ssRNA)。双链DNA-DNA、DNA-RNA和RNA-RNA螺旋是可能的。术语核酸分子，特别是DNA或RNA分子，仅指分子的一级和二级结构，并且不将其限制于任何特定的三级形式。因此，这一术语包括尤其见于线性或环状DNA分子(例如限制片段)、质粒、超螺旋DNA和染色体中的双链DNA。在讨论特定双链DNA分子的结构时，在本文中可根据仅沿非转录DNA链(即具有与mRNA同源的序列的链)以5’至3’方向给出序列的正常惯例来描述序列。“重组DNA分子”是经过分子生物学操作的DNA分子。DNA包括但不限于cDNA、基因组DNA、质粒DNA、合成DNA和半合成DNA。本公开的“核酸组合物”包含一种或多种如本文所描述的核酸。如本文所描述，本公开的多核苷酸包含DNA、RNA或两者。在一些方面，术语“多核苷酸”包括聚脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)；聚核糖核苷酸(含有D-核糖)，包括tRNA、rRNA、shRNA、siRNA、miRNA和mRNA，无论是剪接的还是未剪接的；为嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷的任何其他类型的多核苷酸；以及含有正核苷酸主链的其他聚合物，例如聚酰胺(例如，肽核酸“PNA”)和聚吗啉代聚合物；以及其他合成的序列特异性核酸聚合物，条件是这些聚合物含有呈允许碱基配对和碱基堆积，诸如在DNA和RNA中发现的构型的核碱基。
如本文所用，术语“复制子”是指包含允许多核苷酸在所关注的细胞中复制的复制起点的多核苷酸。如本文进一步所描述，在一些方面，复制子是自我复制mRNA (即，能够指导其自身在靶细胞内的扩增或复制) (在本文也称为“repRNA”或“RNA-VEE”)。为了指导其自身的扩增，RNA分子应编码催化RNA扩增所必需的酶(例如，甲病毒非结构蛋白nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)，并且还含有复制所需的顺式RNA序列，这些序列被所编码的酶识别和利用。甲病毒RNA载体复制子应包含以下有序元件：非结构蛋白介导的扩增所需的5'病毒或细胞序列(也可称为5'CSE，或5'顺式复制序列，或复制所需的顺式5'病毒序列，或能够启动甲病毒转录的5'序列)；当表达时编码生物活性甲病毒非结构蛋白(例如，nsP1、nsP2、nsP3、nsP4)的序列；以及非结构蛋白介导的扩增所需的3'病毒或细胞序列(也可称为3'CSE，或复制所需的顺式3'病毒序列，或甲病毒RNA聚合酶识别序列)。甲病毒RNA载体复制子可以含有表达一个或多个异源序列的手段，诸如例如IRES或病毒(例如，甲病毒)亚基因组启动子(例如，连接区启动子)，在某些方面，可对其进行修饰，以增加或减少亚基因组片段的病毒转录，或降低与有缺陷的辅助蛋白或结构蛋白表达盒的同源性，以及待表达的一个或多个异源序列。复制子还可以含有额外的序列，例如，编码一种或多种多肽(例如，蛋白质编码基因或3'近端基因)和/或聚腺苷酸束的一个或多个异源序列。复制子不应含有编码所有甲病毒结构蛋白(衣壳、E1、E2)的序列。可由复制子载体表达的异源序列的非限制性示例描述于例如美国专利号6,015,686 (通过引用以其整体并入本文)中，并且包括例如抗原、淋巴因子、细胞因子等。如从本公开显而易见的，本文提供的VEE复制子是repRNA。因此，“VEE复制子”、“RNA-VEE”和“repRNA”在本公开中可互换使用。
如本文所用，术语“modRNA”是指合成的经修饰的RNA，其可编码有效载荷(例如，本文所描述的)，并且当递送至细胞时，可诱导所编码的有效载荷的表达。除非另外指明，否则本文所描述的modRNA不是自我复制的。在一些方面，本文所描述的modRNA包含可帮助改善RNA的一种或多种特性(例如，增加的稳定性和/或转录)的修饰。此类修饰的非限制性示例是本领域已知的(例如，核碱基的化学修饰)。参见，例如，US 2020/0000881，其通过引用以其整体并入本文。在一些方面，本文所描述的多核苷酸(例如，包含编码有效载荷的第一区域和包含传感器(例如，免疫细胞去靶向传感器)的第二区域)不是modRNA。
术语“药学上可接受的载剂”、“药学上可接受的赋形剂”以及它们的语法变化形式涵盖美国联邦政府的监管机构批准的或美国药典中列出的用于包括人在内的动物的任何剂，以及不导致产生以至于禁止向受试者施用该组合物的程度的不期望的生理效应并且不消除所施用的化合物的生物活性和特性的任何载剂或稀释剂。包括可用于制备药物组合物并且通常是安全、无毒且合乎需要的赋形剂和载剂。
如本文所用，术语“药物组合物”是指本文所描述的一种或多种化合物，诸如例如与一种或多种其他化学组分(诸如药学上可接受的载剂和赋形剂)混合或掺混或悬浮在其中的本公开的多核苷酸。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文可互换使用以指例如由本文所描述的多核苷酸编码的任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可包含经修饰的氨基酸。这些术语还涵盖已经天然地或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如二硫键形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰，诸如与标记组分缀合。定义中还包括例如含有一种或多种氨基酸类似物(包括，例如非天然氨基酸，诸如高半胱氨酸、鸟氨酸、对乙酰基苯丙氨酸、D-氨基酸和肌酸)以及本领域已知的其他修饰的多肽。如本文所用，术语“多肽”是指具有任何大小、结构或功能的蛋白质、多肽和肽。
多肽包括基因产物、天然存在的多肽、合成多肽、同源物、直向同源物、横向同源物、前述的片段和其他等效物、变体和类似物。
多肽可以是单个多肽或者可以是多分子复合物，诸如二聚体、三聚体或四聚体。它们还可包含单链或多链多肽。最常见地，二硫键存在于多链多肽中。术语多肽还可应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物。在一些方面，“肽”可小于或等于约50个氨基酸长，例如约5、约10、约15、约20、约25、约30、约35、约40、约45或约50个氨基酸长。
术语“RNA”在本文用于意指包含至少一个核糖核苷酸残基的分子。“核糖核苷酸”涉及在β-D-呋喃核糖基的2'-位具有羟基的核苷酸。该术语包括双链RNA、单链RNA、分离的RNA诸如部分或完全纯化的RNA、基本上纯的RNA、合成RNA、重组生成的RNA (其通过添加、缺失、取代和/或改变一个或多个核苷酸而与天然存在的RNA不同)。在一些方面，RNA包括线性RNA、环状RNA、自我复制RNA、非复制RNA或它们的组合。在一些方面，本文所描述的多核苷酸(例如，包含编码有效载荷的第一区域和包含传感器(例如，免疫细胞去靶向传感器，例如，脾脏去靶向传感器)的第二区域)不是线性RNA。在一些方面，本文所描述的多核苷酸(例如，包含编码有效载荷的第一区域和包含传感器(例如，免疫细胞去靶向传感器，例如，脾脏去靶向传感器)的第二区域)不是环状RNA。在一些方面，本文所描述的多核苷酸(例如，包含编码有效载荷的第一区域和包含传感器(例如，免疫细胞去靶向传感器，例如，脾脏去靶向传感器)的第二区域)是自我复制RNA。在一些方面，本文所描述的多核苷酸(例如，包含编码有效载荷的第一区域和包含传感器(例如，免疫细胞去靶向传感器，例如，脾脏去靶向传感器)的第二区域)为非自我复制RNA。
术语“mRNA”意指“信使RNA”并且涉及通过使用DNA模板生成并编码肽或蛋白质(例如，本文所描述的有效载荷)的“转录物”。通常，mRNA包含5′-UTR、蛋白质编码区和3′-UTR。mRNA在细胞中和体外仅具有有限的半衰期。在本公开的上下文中，可通过从DNA模板体外转录生成mRNA。体外转录方法是技术人员已知的。例如，存在各种可商购获得的体外转录试剂盒。在本公开的一些方面，RNA，优选mRNA，用5'-帽结构修饰。
如本文所用，术语“同一性”(例如，序列同一性)是指聚合物分子之间，例如多核苷酸分子之间的总体单体保守性。没有任何另外限定符的术语“同一的”，例如多核苷酸A与多核苷酸B同一，意味着多核苷酸序列是100%同一的(100%序列同一性)。将两个序列描述为例如“70%同一”等同于将它们描述为具有例如“70%序列同一性”。
两个多肽或多核苷酸序列的同一性百分比的计算例如可通过出于最佳比较目的比对两个序列来进行(例如，为了最佳比对可将空位引入第一和第二多肽或多核苷酸序列之一或两者中并且出于比较目的可忽视不相同的序列)。在一些方面，出于比较目的比对的序列的长度是参考序列的长度的至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%或100%。然后比较对应氨基酸位置的氨基酸，或在多核苷酸的情况下比较碱基。
第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸或核苷酸占据时，则分子在该位置处是同一的。两个序列之间的同一性百分比随将为了两个序列的最优比对而需要引入的空位的数目和每个空位的长度考虑在内，由这些序列共有的相同位置的数目而变化。两个序列之间的序列的比较和同一性百分比的确定可使用数学算法来完成。
可用于比对各种序列(例如，多核苷酸序列)的合适软件程序可从各种来源获得。用于确定序列同一性百分比的一种合适的程序是bl2seq，其为可从美国政府国家生物技术信息中心BLAST网址(blast.ncbi.nlm.nih.gov)获得的BLAST程序套件的一部分。Bl2seq使用BLASTN或BLASTP算法进行两个序列之间的比较。BLASTN用于比较核酸序列，而BLASTP用于比较氨基酸序列。其他合适的程序是例如Needle、Stretcher、Water或Matcher，其为生物信息学程序的EMBOSS套件的一部分，并且也可从欧洲生物信息学研究所(EBI)在worldwideweb.ebi.ac.uk/Tools/psa获得。
序列比对可使用本领域中已知的方法如MAFFT、Clustal (ClustalW、Clustal X或Clustal Omega)、MUSCLE等来进行。
与多核苷酸或多肽参考序列比对的单个多核苷酸或多肽靶序列内的不同区域可各自具有其自己的序列同一性百分比。应注意，序列同一性百分比值四舍五入至最接近的十分位。例如，80.11、80.12、80.13和80.14向下舍入到80.1，而80.15、80.16、80.17、80.18和80.19向上舍入到80.2。还应注意，长度值将始终是整数。
在一些方面，第一氨基酸序列(或核酸序列)与第二氨基酸序列(或核酸序列)的同一性百分比(%ID)计算为%ID = 100 x (Y/Z)，其中Y是在第一序列和第二序列的比对(如通过目视检查或特定序列比对程序比对)中评分为相同匹配的氨基酸残基(或核碱基)的数目，并且Z是第二序列中残基的总数。如果第一序列的长度长于第二序列，则第一序列与第二序列的同一性百分比将高于第二序列与第一序列的同一性百分比。
本领域技术人员将理解，用于计算序列同一性百分比的序列比对的生成不限于仅由一级序列数据驱动的二进制序列-序列比较。还应理解，序列比对可通过将序列数据与来自异构源的数据如结构数据(例如，晶体学蛋白质结构)、功能数据(例如，突变的位置)或系统发育数据整合而产生。整合异构数据以生成多重序列比对的合适程序是可在www.tcoffee.org获得且可替代地可例如从EBI获得的T-Coffee。还应理解，用于计算序列同一性百分比的最终比对可自动地或人工地加以验证。
如本文所用，术语“分离的”、“纯化的”、“提取的”以及它们的语法变体可互换使用并且是指已进行一个或多个纯化过程的本公开的期望组合物，例如本公开的多核苷酸的制备状态。在一些方面，如本文所用，分离或纯化是从含有污染物的样品中去除、部分去除(例如，一部分)本公开的组合物的过程。
如本文所用，术语“表达”是指多核苷酸产生基因产物，例如RNA或多肽(例如治疗性蛋白，例如冠状病毒蛋白)的过程。它包括但不限于将多核苷酸转录成微小RNA结合位点、小发夹RNA (shRNA)、小干扰RNA (siRNA)或任何其他RNA产物。它包括但不限于将多核苷酸转录成信使RNA (mRNA)和将mRNA翻译成多肽。表达产生“基因产物”。如本文所用，基因产物可以是例如核酸，如通过基因的转录产生的RNA。如本文所用，基因产物可以是由基因的转录产生的核酸、RNA或miRNA，或从转录物翻译的多肽。本文所描述的基因产物还包括具有转录后修饰的核酸，这些修饰例如聚腺苷酸化或剪接；或具有翻译后修饰的多肽，这些修饰例如磷酸化、甲基化、糖基化、添加脂质、与其他蛋白质亚基缔合或蛋白水解切割。
II.多核苷酸
本文提供了一种多核苷酸(例如，分离的多核苷酸)，其包含(a)编码有效载荷的第一区域和(b)包含传感器的第二区域，其中传感器能够特异性识别由免疫细胞表达的标志物(即，免疫细胞去靶向传感器)。如从本公开显而易见的，在一些方面，组织(例如，淋巴组织)包含此类免疫细胞的群，使得所编码的有效载荷在该组织内的表达与免疫细胞对所编码的有效载荷的表达直接相关。如本文所描述，当传感器识别(例如，结合)标志物时，传感器“开启”(即，处于活性形式)并且从而抑制或减少所编码的有效载荷的表达。在不存在特定标志物的情况下，传感器“关闭”(即，处于非活性形式)并且所编码的有效载荷的表达没有抑制或减少。
II.A.传感器和标志物
可用于本公开的传感器可被编程为识别由免疫细胞(例如，存在于淋巴组织诸如脾脏内)表达的宽泛范围的标志物。在一些方面，标志物仅由免疫细胞(例如，存在于淋巴组织诸如脾脏内)表达。在一些方面，标志物由免疫细胞(例如，存在于淋巴组织诸如脾脏内)和一种或多种非免疫细胞表达。在标志物也由非免疫细胞表达的情况下，在一些方面，与非免疫细胞相比，标志物在免疫细胞中的表达增加。除非另外指明，否则标志物的表达增加可包括(a)所表达的标志物的总量的增加，(b)标志物表达的时间的增加，或(c) (a)和(b)两者。
在一些方面，与非免疫细胞的对应表达相比，免疫细胞(例如，存在于淋巴组织诸如脾脏中)对标志物的表达增加至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或至少约100%或更多。在一些方面，与非免疫细胞的对应表达相比，免疫细胞(例如，存在于淋巴组织诸如脾脏中)对标志物的表达增加至少约1.5倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约15倍、至少约20倍、至少约25倍、至少约30倍、至少约35倍、至少约40倍、至少约45倍或至少约50倍或更多。
在一些方面，标志物包括微小RNA。在一些方面，本文所描述的多核苷酸包含(a)编码有效载荷的第一区域和(b)包含免疫细胞去靶向传感器的第二区域，其中免疫细胞去靶向传感器能够识别在免疫细胞内表达的微小RNA。在一些方面，免疫细胞存在于淋巴组织诸如脾脏内。因此，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(a)编码有效载荷的第一区域和(b)包含脾脏去靶向传感器的第二区域，其中脾脏去靶向传感器能够识别在脾脏中表达的微小RNA (例如，在脾脏内的免疫细胞内表达的微小RNA)。在一些方面，微小RNA包括微小RNA-142 (miR-142)。因此，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(a)编码有效载荷的第一区域和(b)包含免疫细胞去靶向传感器的第二区域，其中免疫细胞去靶向传感器能够识别miR-142。在一些方面，免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)包含核苷酸序列TCCATAAAGTAGGAAACACTACA (SEQ ID NO: 6)。在一些方面，免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)基本上由核苷酸序列TCCATAAAGTAGGAAACACTACA (SEQ ID NO: 6)组成。在一些方面，免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)由核苷酸序列TCCATAAAGTAGGAAACACTACA(SEQ ID NO: 6)组成。
除非另外指明，否则可用于本公开的miR-142包括来自任何脊椎动物来源(例如，人)的任何miR-142。在一些方面，miR-142包括miR-142-3p、miR-142-5p或两者。miR-142-3p的示例性序列如SEQ ID NO: 1 (UGUAGUGUUUCCUACUUUAUGGA)所示。miR-142-5p的示例性序列如SEQ ID NO: 2 (CAUAAAGUAGAAAGCACUACU)所示。
在一些方面，本文提供的多核苷酸包含多个免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器)。例如，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(a)编码有效载荷的第一区域和(b)包含多个免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器)的第二区域，其中多个免疫细胞去靶向传感器对标志物的识别减少有效载荷的表达。在一些方面，多个免疫细胞去靶向传感器包括约两个免疫细胞去靶向传感器、约三个免疫细胞去靶向传感器、约四个免疫细胞去靶向传感器、约五个免疫细胞去靶向传感器、约六个免疫细胞去靶向传感器、约七个免疫细胞去靶向传感器、约八个免疫细胞去靶向传感器、约九个免疫细胞去靶向传感器、约10个免疫细胞去靶向传感器、约11个免疫细胞去靶向传感器、约12个免疫细胞去靶向传感器、约13个免疫细胞去靶向传感器、约14个免疫细胞去靶向传感器、约15个免疫细胞去靶向传感器、约16个免疫细胞去靶向传感器、约17个免疫细胞去靶向传感器、约18个免疫细胞去靶向传感器、约19个免疫细胞去靶向传感器，或约20个或更多个免疫细胞去靶向传感器。
在一些方面，多个免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器)中的每一个是相同的(例如，全部具有相同的序列并且识别由免疫细胞(例如，存在于脾脏内)表达的相同标志物)。在一些方面，免疫细胞去靶向传感器中的一个或多个是不同的。例如，在一些方面，多个免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器)中的一个或多个可识别由免疫细胞(例如，存在于脾脏内)表达的相同标志物，但在它们的序列上却有所不同。在一些方面，多个免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器)中的一个或多个在它们的序列上有所不同并且识别由免疫细胞(例如，存在于脾脏内)表达的不同标志物。
在一些方面，本文所描述的多核苷酸(例如，包含免疫细胞去靶向传感器)可包含识别由非免疫细胞表达的标志物的一个或多个另外的传感器。此类另外的传感器在本文也称为“非免疫细胞去靶向传感器”。例如，在一些方面，可用于本公开的多核苷酸包含(a)编码有效载荷的第一区域和(b)第二区域，该第二区域包含(i)免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器)和(ii)识别由非免疫细胞表达的标志物的另外的传感器。如从本公开显而易见的，在一些方面，此类多核苷酸可用于调控(例如，减少或抑制)有效载荷在多种细胞类型内的表达。
在多核苷酸包含免疫细胞去靶向传感器和非免疫细胞去靶向传感器两者的情况下，在一些方面，(a)免疫细胞去靶向传感器识别由免疫细胞(例如，存在于脾脏内)表达的微小RNA，(b)非免疫细胞去靶向传感器识别由非免疫细胞表达的微小RNA，或(c) (a)和(b)两者。在一些方面，由免疫细胞表达的微小RNA和由非免疫细胞表达的微小RNA是不同的。在一些示例中，非免疫细胞存在于非淋巴组织内。已知微小RNA在其中调控mRNA并从而调控蛋白质表达的非淋巴组织的示例包括但不限于肝脏(miR-122)、肌肉(miR-133、miR-206、miR-208)、内皮细胞(miR-17-92、miR-126)、髓系细胞(miR-16、miR-21、miR-223、miR-24、miR-27)、脂肪组织(let-7、miR-30c)、心脏(miR-1d、miR-149)、肾脏(miR-192、miR-194、miR-204)和肺上皮细胞(let-7、miR-133、miR-126)。
II.B.有效载荷
如本文所描述，本文提供的多核苷酸(例如，包含免疫细胞去靶向传感器，例如，脾脏去靶向传感器)包含编码有效载荷的第一区域。如本领域技术人员将显而易见的，本领域已知的任何合适的有效载荷可与本公开一起使用。此类有效载荷的非限制性示例包括治疗性蛋白、可检测蛋白(例如，报告蛋白或荧光蛋白)、免疫调节蛋白、配体结合蛋白或它们的组合。
在一些方面，有效载荷包含治疗性蛋白。此类治疗性蛋白的非限制性示例包括细胞因子。在一些方面，本文所描述的多核苷酸包含(a)编码细胞因子的第一区域和(b)包含免疫细胞去靶向传感器的第二区域，其中免疫细胞去靶向传感器对标志物的识别导致细胞因子在免疫细胞中的表达减少。在一些方面，免疫细胞存在于淋巴组织诸如脾脏内。因此，本公开的一些方面涉及一种分离的多核苷酸，其包含(a)编码细胞因子的第一区域和(b)包含脾脏去靶向传感器的第二区域，其中脾脏去靶向传感器对标志物的识别减少细胞因子在脾脏内的表达。
在一些方面，治疗性蛋白是细胞因子并且标志物包括微小RNA。在一些方面，本文所描述的多核苷酸包含(a)编码细胞因子的第一区域和(b)包含能够识别由免疫细胞表达的微小RNA的免疫细胞去靶向传感器的第二区域，其中传感器对微小RNA的识别导致细胞因子在免疫细胞中的表达减少。在一些方面，免疫细胞存在于淋巴组织诸如脾脏内。因此，在一些方面，本文提供的分离的多核苷酸包含(a)编码细胞因子的第一区域和(b)包含能够识别在脾脏中表达的微小RNA的脾脏去靶向传感器的第二区域，其中传感器对微小RNA的识别减少细胞因子在脾脏内的表达。
在一些方面，细胞因子包括白介素(IL)-12。在一些方面，本文所描述的多核苷酸包含(a)编码IL-12蛋白的第一区域和(b)包含免疫细胞去靶向传感器的第二区域，其中传感器对标志物的识别导致免疫细胞对IL-12蛋白的表达减少。在一些方面，免疫细胞存在于淋巴组织诸如脾脏内。在一些方面，本文提供了一种分离的多核苷酸，其包含(a)编码IL-12蛋白的第一区域和(b)包含脾脏去靶向传感器(例如，其能够识别在脾脏中表达的微小RNA)的第二区域，其中传感器对标志物的识别减少IL-12的表达。IL-12的示例性氨基酸和/或核酸序列在WO2022150712A1中提供，其通过引用以其整体并入本文。
在一些方面，细胞因子不是IL-12。在一些方面，细胞因子选自(i)细胞因子的共同γ链家族；(ii)细胞因子的IL-1家族；(iii)造血细胞因子；(iv)干扰素(例如，I型、II型或III型)；(v)细胞因子的TNF家族；(vi)细胞因子的IL-17家族；(vii)损伤相关分子模式(DAMP)；(viii)致耐受细胞因子；或(ix)它们的组合。在一些方面，细胞因子包括IL-2、IL-4、IL-7、IL-10、IL-15、IL-21、IFN-γ、IL-1α、IL-1β、IL-1ra、IL-18、IL-33、IL-36α、IL-36β、IL-36γ、IL-36ra、IL-37、IL-38、IL-3、IL-5、IL-6、IL-11、IL-13、IL-23、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子(SCF)、血小板生成素(TPO)、巨噬细胞-集落刺激因子(M-CSF)、促红细胞生成素(EPO)、Flt-3、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-19、IL-20、IL-22、IL-24、TNF-α、TNF-β、BAFF、APRIL、淋巴毒素β (TNF-γ)、IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E、IL-17F、IL-25、TSLP、IL-35、IL-27、TGF-β或它们的组合。
在一些方面，有效载荷包含配体结合蛋白。配体结合蛋白的非限制性示例包括嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、嵌合抗体-T细胞受体(caTCR)、嵌合信号传导受体(CSR)、T细胞受体模拟物(TCR模拟物)或它们的组合。
在一些方面，有效载荷包含抗体或其抗原结合片段(本文统称为“抗体”)。抗体可以源自天然来源，或部分或全部合成产生。在一些方面，抗体是单克隆抗体。在一些方面，单克隆抗体是IgG抗体。在一些方面，单克隆抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。在一些方面，抗体是多克隆抗体。在一些方面，抗体选自Fab、Fab'和F(ab')2、F(ab1)2、Fv、dAb和Fd片段。在一些方面，抗体是scFv或(scFv)2片段。在一些方面，抗体是NANOBODY®(单结构域抗体)。在一些方面，抗体是双特异性或多特异性抗体。
在一些方面，有效载荷包含可检测蛋白(例如，报告蛋白或荧光蛋白)。此类可检测蛋白的非限制性示例包括：荧光素酶、wt-GFP、绿色荧光蛋白(例如，EGFP、Emerald、Superfolder GFP、Azami Green、mWasabi、TagGFP、TurboGFP、AcGFP、ZsGreen、T-Sapphire等)、蓝色荧光蛋白(例如，EBFP、EBFP2、Azurite、mTagBFP等)、青色荧光蛋白(例如，ECFP、mECFP、Cerulean、mTurquoise、CyPet、AmCyan1、Midori-Ishi Cyan、TagCFP、mTFP1 (Teal)等)、黄色荧光蛋白(例如，EYFP、Topaz、Venus、mCitrine、YPet、TagYFP、PhiYFP、ZsYellow1、mBanana等)、橙色荧光蛋白(例如，Kusabira Orange、Kusabira Orange2、mOrange、mOrange2、dTomato、dTomato-Tandem、TagRFP、TagRFP-T、DsRed、DsRed2、DsRed-Express(T1)、DsRed-Monomer、mTangerine等)或红色荧光蛋白(例如，mRuby、mApple、mStrawberry、AsRed2、mRFP1、JRed、mCherry、HcRedl、mRaspberry、dKeima-Tandem、HcRed-Tandem、mPlum、AQ143等)。
II.C.另外的组分
在一些方面，本文提供的多核苷酸(例如，编码有效载荷并且包含免疫细胞去靶向传感器)还包含一种或多种另外的组分。在一些方面，此类另外的组分可有助于多核苷酸的功能和/或表达。因此，在一些方面，本公开的多核苷酸包含(a)编码有效载荷的第一区域，(b)包含免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器)的第二区域，以及(c)本文所描述的一种或多种另外的组分，其中传感器对标志物的识别减少有效载荷的表达。此类另外的组分的非限制性示例包括：(1)内部核糖体进入位点(IRES)，(2)非翻译区(UTR)，(3)编码信号肽的序列，(4)翻译起始序列，(5)聚A序列，(6)编码RNA结合蛋白的序列，(7) 5'-帽，(8)编码2A核糖体跳跃肽的序列，(9)翻译增强子元件，(10)间隔子序列，或(11) (1)至(10)的任何组合。下面提供了与此类另外的组分相关的另外的公开内容。
非翻译区(UTR)
在一些方面，本文所描述的多核苷酸还包含UTR。在一些方面，UTR是5'-UTR。在一些方面，UTR是3'-UTR。在一些方面，UTR包括5'-UTR和3'-UTR两者。
天然5'-UTR具有在翻译起始中起作用的特征。它们含有像Kozak序列这样的特征，Kozak序列被熟知参与了核糖体启动许多基因翻译的过程。Kozak序列具有一致的CCR(A/G)CCAUGG，其中R是起始密码子(AUG)上游三个碱基处的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，其后跟另一个“G”。还已知5′-UTR形成参与延伸因子结合的二级结构。
参与延伸因子结合的5'-UTR二级结构可以与5'UTR或3'UTR中的其他RNA结合分子相互作用，以调节基因表达。例如，延伸因子EIF4A2与5'-UTR中的二级结构元件的结合对于微RNA介导的抑制是必需的(Meijer H A等人, Science, 2013, 340, 82-85，其通过引用以其整体并入本文)。可将5'-UTR中的不同二级结构掺入侧翼区，以稳定特定组织或细胞中的mRNA或选择性地使其不稳定。
通过对通常在特定靶器官的丰富表达的基因中发现的特征进行工程化，可提高稳定性和蛋白质产量。例如，引入肝脏表达的mRNA (诸如白蛋白、血清淀粉样蛋白A、载脂蛋白A/B/E、转铁蛋白、甲胎蛋白、促红细胞生成素或因子VIII)的5'-UTR可用于增强核酸分子(诸如mRNA)在肝细胞系或肝脏中的表达。同样，使用来自其他组织特异性mRNA的5'-UTR来改善在该组织中的表达是可能的—对于肌肉(MyoD、肌球蛋白、肌红蛋白、肌细胞生成素、Herculin)、对于内皮细胞(Tie-1、CD36)、对于髓样细胞(C/EBP、AML1、G-CSF、GM-CSF、CD11b、MSR、Fr-1、i-NOS)、对于白细胞(CD45、CD18)、对于脂肪组织(CD36、GLUT4、ACRP30、脂联素)和对于肺上皮细胞(SP-A/B/C/D)。
其他非UTR序列也可掺入UTR (例如，5'-UTR和/或3'-UTR)中。例如，可将内含子或内含子序列的部分掺入本文所描述的多核苷酸的侧翼区中。
在一些方面，UTR (例如，5'-UTR和/或3'-UTR)内的一个或多个核苷酸可以发生突变、被替代和/或被去除。例如，可将起始密码子上游的一个或多个核苷酸替代为另一个核苷酸。待替代的一个或多个核苷酸可以在起始密码子上游1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60个或超过60个核苷酸处。作为另一个示例，可以从UTR中去除起始密码子上游的一个或多个核苷酸。
已知3'-UTR具有嵌入其中的腺苷和尿苷区段。这些富AU特征在具有高周转率的基因中特别普遍。基于它们的序列特征和功能特性，富AU元件(ARE)可以分为三类(Chen等人,1995)：I类ARE在富U区内含有AUUUA基序的若干个分散拷贝。C-Myc和MyoD含有I类ARE。II类ARE具有两个或更多个重叠的UUAUUUA(U/A)(U/A)九聚体。含有这类ARE的分子包括GM-CSF和TNF-a。III类ARE的定义不太明确。这些富U区不含AUUUA基序。c-Jun和肌细胞生成素是这一类中两个被充分研究的示例。已知与ARE结合的大多数蛋白质会使信使不稳定，而ELAV家族的成员，最著名的是HuR，已被证明增加mRNA的稳定性。HuR结合所有三个类别的ARE。将HuR特异性结合位点工程化至核酸分子的3′-UTR中可以导致HuR结合，从而稳定体内信息。
在一些方面，引入、去除或修饰3′-UTR富AU元件(ARE)可用于调节核酸序列的稳定性。在对特定多核苷酸进行工程化时，可引入ARE的一个或多个拷贝，以使核酸序列不太稳定并且从而限制翻译并减少所得蛋白质的产生。同样地，ARE可被鉴定并去除或突变以增加细胞内稳定性并从而增加所得蛋白质的翻译和产生。
翻译增强子元件(TEE)
在一些方面，本文提供的多核苷酸还包含翻译增强子元件(TEE)。如本文所用，术语“翻译增强子元件”是指增加由核苷酸序列编码的蛋白质的表达的顺式作用序列。可与本公开一起使用的TEE的非限制性示例是本领域已知的，参见例如，US20130177581A，其通过引用以其整体并入本文。
在一些方面，TEE位于序列的转录启动子与起始密码子之间。在一些方面，可用于本公开的TEE与以下专利中提供的任何TEE具有至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%序列同一性：美国公布号US20140147454、US20090226470、US20070048776、US20130177581、US20110124100、WO1999024595、WO2012009644、WO2009075886、WO2007025008、美国专利号6,310,197、美国专利号6,849,405、美国专利号7,456,273、美国专利号7,183,395，其每一个通过引用以其整体并入本文。
在一些方面，本文提供的多核苷酸包含多个TEE。例如，在一些方面，本公开的多核苷酸(例如，编码有效载荷并且包含脾脏去靶向传感器)包含至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个、至少约20个、至少约21个、至少约22个、至少约23个、至少约24个、至少约25个、至少约30个、至少约35个、至少约40个、至少约45个、至少约50个、至少约55个或多于约60个TEE序列。在一些方面，RNA (例如，经修饰的RNA)的5'UTR中的TEE序列是相同或不同的TEE序列。在一些方面，TEE序列处于重复一次、两次或超过三次的模式，如ABABAB或AABBAABBAABB或ABCABCABC或其变体。在这些模式中，每个字母A、B或C代表核苷酸水平上的不同TEE序列。
RNA结合蛋白(RBP)
在一些方面，本文提供的多核苷酸还包含编码RNA结合蛋白的序列。RNA结合蛋白(RBP)可调控共转录和转录后基因表达的许多方面，诸如但不限于RNA剪接、定位、翻译、周转、聚腺苷酸化、加帽、修饰、输出和定位。RNA结合结构域(RBD)，如但不限于RNA识别基序(RR)和hnRNP K-同源性(KH)结构域，通常调节RBP与其RNA靶标之间的序列关联(Ray等人,Nature2013. 499:172-177；通过引用以其整体并入本文)。在一些方面，典型RBD结合短RNA序列。在一些方面，典型RBD识别RNA结构。
RNA结合蛋白以及相关核酸和蛋白质序列的非限制性示例描述于US 2014/0147454中，其通过引用以其整体并入本文。
5'-加帽
在一些方面，本文所描述的多核苷酸还包含5'-帽结构。mRNA的5'帽结构参与核输出，从而增加mRNA稳定性并结合mRNA帽结合蛋白(CBP)，通过CBP与聚(A)结合蛋白缔合形成成熟的环状mRNA物类，该CBP负责细胞中的mRNA稳定性和翻译能力。帽还有助于在mRNA剪接期间去除5'近端内含子。
对本公开的RNA的修饰可以生成不可水解的帽结构，从而防止脱帽，并因此增加mRNA半衰期。由于帽结构水解需要切割5'-ppp-5'磷酸二酯连接，因此可以在加帽反应期间使用经修饰的核苷酸。例如，来自New England Biolabs(Ipswich, Mass.)的疫苗加帽酶可根据制造商的说明书与α-硫代-鸟苷核苷酸一起使用，以在5'-ppp-5'帽中产生硫代磷酸酯连接。另外的经修饰的鸟苷核苷酸，如α-甲基-膦酸和硒代-磷酸核苷酸。
另外的修饰包括但不限于在糖环的2'-羟基上对mRNA的5'-末端和/或5'-前末端核苷酸的核糖(如上所提及)进行2'-O-甲基化。可使用多个不同的5'-帽结构以生成核酸分子(诸如mRNA分子)的5'-帽。
帽类似物(在本文也称为合成帽类似物、化学帽、化学帽类似物或者结构或功能帽类似物)在其化学结构上不同于天然(即，内源性、野生型或生理) 5'-帽，同时保留帽功能。帽类似物可以化学(即，非酶促)或酶促合成和/或连接至核酸分子。
例如，抗反向帽类似物(ARCA)帽含有通过5'-5'-三磷酸基团连接的两个鸟嘌呤，其中一个鸟嘌呤含有N7甲基以及3'-O-甲基(即，N7,3'-O-二甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷(m7G-3'mppp-G；其可等同地命名为3'O-Me-m7G(5')ppp(5')G))。另一个未修饰的鸟嘌呤的3'-O原子连接至加帽的核酸分子(例如，mRNA或mmRNA)的5'-末端核苷酸。N7-和3'-O-甲基化鸟嘌呤提供加帽的核酸分子(例如，mRNA或mmRNA)的末端部分。
另一个示例性帽是mCAP，其类似于ARCA但在鸟苷上具有2'-β-甲基(即，N7,2'-O-二甲基-鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷，m7Gm-ppp-G)。
在一些方面，帽是二核苷酸帽类似物。在一些方面，将二核苷酸帽类似物在不同的磷酸位置用硼烷磷酸基团或硒代磷酸基团进行修饰，如美国专利号8,519,110中描述的二核苷酸帽类似物，该美国专利的内容通过引用以其整体并入本文。
在一些方面，帽是帽类似物，是本领域已知和/或本文所描述的帽类似物的N7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸形式。帽类似物的N7-(4-氯苯氧基乙基)取代的二核苷酸形式的非限制性示例包括N7-(4-氯苯氧基乙基)-G(5')ppp(5')G和N7-(4-氯苯氧基乙基)-m3'-OG(5')ppp(5')G帽类似物(参见例如，the various cap analogs and the methodsof synthesizing cap analogs，描述于Kor等人Bioorganic&Medicinal Chemistry 201321:4570-4574中；该参考文献的内容通过引用以其整体并入本文)。在一些方面，本公开的帽类似物是4-氯/溴苯氧基乙基类似物。
虽然帽类似物允许在体外转录反应中伴随的核酸分子加帽，但高达约20%的转录物保持未加帽。这，以及帽类似物，与由内源性细胞转录机制产生的核酸的内源性5'-帽结构的结构差异可导致翻译能力降低和细胞稳定性降低。
在一些方面，提供具有5'-帽或5'-帽类似物的RNA是通过在所述5'-帽或5'-帽类似物存在下体外转录DNA模板来实现的，其中所述5'-帽被共转录地掺入所产生的RNA链中。
在一些方面，RNA可以例如通过体外转录生成，并且可以使用加帽酶(例如，痘苗病毒的加帽酶)在转录后将5'-帽附接到RNA。在一些方面，使用酶对编码IL-12的核苷酸序列进行转录后加帽，以生成更真实的5'帽结构。如本文所用，短语“更真实的”是指在结构上或功能上紧密地反映或模拟内源性或野生型特征的特征。也就是说，与现有技术的合成特征或类似物等相比，“更真实的”特征更好地代表内源性、野生型、天然或生理细胞功能和/或结构，或者在一个或多个方面优于对应的内源性、野生型、天然或生理特征。本公开的更真实的5′帽结构的非限制性示例是如与本领域已知的合成5′帽结构(或野生型、天然或生理性5′帽结构)相比具有增强的帽结合蛋白的结合、增加的半衰期、降低的对5′核酸内切酶的敏感性和/或减少的5′脱帽的那些结构。例如，重组痘苗病毒加帽酶和重组2'-O-甲基转移酶可以在mRNA的5'-末端核苷酸和鸟嘌呤帽核苷酸之间产生典型的5'-5'-三磷酸连接，其中帽鸟嘌呤含有N7甲基化，并且mRNA的5'-末端核苷酸含有2'-O-甲基。如与例如本领域已知的其他5'帽类似物结构相比，这种帽导致更高的翻译能力和细胞稳定性以及减少的细胞促炎细胞因子的活化。帽结构包括7mG(5')ppp(5')N,pN2p、7mG(5')ppp(5')NlmpNp、7mG(5')-ppp(5')NlmpN2 mp和m(7)Gpppm(3)(6,6,2')Apm(2')Apm(2')Cpm(2)(3,2')Up。
在一些方面，5'末端帽包括内源性帽或帽类似物。在一些方面，5'末端帽包含鸟嘌呤类似物。有用的鸟嘌呤类似物包括肌苷、N1-甲基-鸟苷、2'氟-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、LNA-鸟苷和2-叠氮基-鸟苷。
在一些方面，5'帽包含5'至5'三磷酸连接。在一些方面，5'帽包含5'至5'三磷酸连接，包括硫代磷酸酯修饰。在一些方面，5'帽包含2'-O或3'-O-核糖甲基化核苷酸。在一些方面，5'帽包含经修饰的鸟苷核苷酸或经修饰的腺苷核苷酸。在一些方面，5'帽包含7-甲基鸟苷酸。示例性帽结构包括m7G(5')ppp(5')G、m7,2`O-mG(5')ppSp(5')G、m7G(5')ppp(5')2`O-mG和m7,3`O-mG(5')ppp(5')2`O-mA。
在一些方面，本文所描述的多核苷酸包含经修饰的5'帽。5'帽上的修饰可增加mRNA的稳定性，增加mRNA的半衰期，并且可增加mRNA翻译效率。在一些方面，经修饰的5'帽包含以下修饰中的一者或多者：在加帽的鸟苷三磷酸(GTP)的2'和/或3'位处的修饰、用亚甲基部分(CH2)替代糖环氧(其产生碳环)、在帽结构的三磷酸桥部分处的修饰或在核碱基(G)部分处的修饰。
可修饰的5'帽结构包括但不限于美国申请号2014/0147454和WO2018/160540中描述的帽，这些美国申请通过引用以其整体并入本文。
IRES序列
在一些方面，本文提供的多核苷酸包含内部核糖体进入位点(IRES)。最初被鉴定为特征小核糖核酸病毒RNA的IRES在不存在5'帽结构的情况下在启动蛋白质合成方面发挥着重要作用。IRES可以充当唯一的核糖体结合位点，或者可以充当mRNA的多个核糖体结合位点之一。含有多于一个功能性核糖体结合位点的核酸或mRNA可编码由核糖体独立翻译的若干个肽或多肽(“多顺反子核酸分子”)。当向核酸或mRNA提供IRES时，进一步任选地提供第二可翻译区。可根据本公开使用的IRES序列的示例包括但不限于来自小核糖核酸病毒(例如，FMDV)、害虫病毒(CFFV)、脊髓灰质炎病毒(PV)、脑心肌炎病毒(ECMV)、口蹄疫病毒(FMDV)、丙型肝炎病毒(HCV)、经典猪瘟病毒(CSFV)、鼠白血病病毒(MLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)或蟋蟀麻痹病毒(CrPV)的那些。
聚A尾
在一些方面，本文提供的多核苷酸包含聚A尾。
在一些方面，聚A尾的长度大于约30个核苷酸。在一些方面，聚A尾的长度大于约35个核苷酸。在一些方面，长度是至少约40个核苷酸。在一些方面，长度是至少约45个核苷酸。在一些方面，长度是至少约55个核苷酸。在一些方面，长度是至少约60个核苷酸。在一些方面，长度是至少70个核苷酸。在一些方面，长度是至少约80个核苷酸。在一些方面，长度是至少约90个核苷酸。在一些方面，长度是至少约100个核苷酸。在一些方面，长度是至少约120个核苷酸。在一些方面，长度是至少约140个核苷酸。在一些方面，长度是至少约160个核苷酸。在一些方面，长度是至少约180个核苷酸。在一些方面，长度是至少约200个核苷酸。在一些方面，长度是至少约250个核苷酸。在一些方面，长度是至少约300个核苷酸。在一些方面，长度是至少约350个核苷酸。在一些方面，长度是至少约400个核苷酸。在一些方面，长度是至少约450个核苷酸。在一些方面，长度是至少约500个核苷酸。在一些方面，长度是至少约600个核苷酸。在一些方面，长度是至少约700个核苷酸。在一些方面，长度是至少约800个核苷酸。在一些方面，长度是至少约900个核苷酸。在一些方面，长度是至少约1000个核苷酸。在一些方面，长度是至少约1100个核苷酸。在一些方面，长度是至少约1200个核苷酸。在一些方面，长度是至少约1300个核苷酸。在一些方面，长度是至少约1400个核苷酸。在一些方面，长度是至少约1500个核苷酸。在一些方面，长度是至少约1600个核苷酸。在一些方面，长度是至少约1700个核苷酸。在一些方面，长度是至少约1800个核苷酸。在一些方面，长度是至少约1900个核苷酸。在一些方面，长度是至少约2000个核苷酸。在一些方面，长度是至少约2500个核苷酸。在一些方面，长度是至少约3000个核苷酸。
在一些方面，聚A尾包含聚A-G四联体。G-四联体是四个鸟嘌呤核苷酸的环状氢键阵列，其可以由DNA和RNA中的富G序列形成。在一些方面，G-四联体掺入在聚A尾的末端。可在不同的时间点测定所得核酸或mRNA的稳定性、蛋白质产生和其他参数，包括半衰期。已经发现，聚A-G四联体导致的蛋白质产生相当于单独使用120个核苷酸的聚A尾所见的蛋白质产生的至少75%。
经修饰的核苷
在一些方面，本文提供的多核苷酸包含一个或多个经修饰的核苷。在一些方面，一个或多个经修饰的核苷包括6-氮杂-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假-异-胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、N1-甲基-假尿苷、5,6-二氢尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧-胸苷、假-尿苷、肌苷、α-硫代-鸟苷、8-氧代-鸟苷、O6-甲基-鸟苷、7-脱氮-鸟苷、N1-甲基腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、N6-甲基-2-氨基-嘌呤、6-氯-嘌呤、N6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-叠氮-腺苷、7-脱氮-腺苷、吡咯-胞苷、5-甲基-胞苷、N4-乙酰基-胞苷、5-甲基-尿苷、5-碘-胞苷以及它们的组合。
在一些方面，本文提供的多核苷酸包含一个或多个已被经修饰的核苷替代的尿苷。在一些方面，替代尿苷的经修饰的核苷是假尿苷()、N1-甲基-假尿苷(m1)或5-甲基-尿苷(m5U)。
在一些方面，本文提供的多核苷酸还包含间隔子序列。因此，在一些方面，本文提供的多核苷酸包含(a)编码有效载荷的第一区域，(b)包含免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的第二区域，以及(c)间隔子序列。在一些方面，间隔子序列包含核苷酸序列GCGGCCGCTAAA (SEQ ID NO: 7)。在一些方面，间隔子序列基本上由核苷酸序列GCGGCCGCTAAA (SEQ ID NO: 7)组成。在一些方面，间隔子序列由核苷酸序列GCGGCCGCTAAA (SEQ ID NO: 7)组成。在一些方面，间隔子序列位于包含免疫细胞去靶向传感器的第二区域的上游。在一些方面，间隔子序列位于编码有效载荷的第一区域与包含免疫细胞去靶向传感器的第二区域之间。
III.合成回路
本公开的一些方面涉及包含本文所描述的任何多核苷酸的基因回路。如本文所用，术语“基因回路”是指可控的基因表达系统。如本文所描述，可用于本公开的基因回路包括合成基因回路(“合成回路”)。如本文所用，术语“合成回路”是指工程化的、非天然的基因回路。如从本公开显而易见的，本文所描述的合成回路已被特别编程以减少或抑制有效载荷在受试者的脾脏内的表达。
在一些方面，本文提供了一种包含分离的多核苷酸的合成回路，该分离的多核苷酸包含(a)编码有效载荷的第一区域和(b)包含免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器)的第二区域，其中传感器对标志物的识别减少或抑制所编码的有效载荷的表达。在一些方面，合成回路基本上由分离的多核苷酸组成，该分离的多核苷酸包含(a)编码有效载荷的第一区域和(b)包含免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器)的第二区域，其中传感器对标志物的识别减少或抑制所编码的有效载荷的表达。在一些方面，合成回路由分离的多核苷酸组成，该分离的多核苷酸包含(a)编码有效载荷的第一区域和(b)包含免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器)的第二区域，其中传感器对标志物的识别减少或抑制所编码的有效载荷的表达。因此，在一些方面，可用于本公开的合成回路是单链的。
如本公开其他地方所提供的，在一些方面，由免疫细胞表达并由此被免疫细胞去靶向传感器特异性识别的标志物包括微小RNA。在一些方面，免疫细胞存在于淋巴组织诸如脾脏内。在一些方面，在脾脏中表达并由此被本文所描述的脾脏去靶向传感器特异性识别的标志物包括微小RNA。因此，在一些方面，本文所描述的合成回路包含分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含(a)编码有效载荷的第一区域和(b)包含能够特异性识别在免疫细胞中表达的微小RNA的免疫细胞去靶向传感器的第二区域。在一些方面，有效载荷是IL-12。在一些方面，本文提供了一种包含分离的多核苷酸的合成回路，该分离的多核苷酸包含(a)编码IL-12蛋白的第一区域和(b)包含能够特异性识别在免疫细胞中表达的微小RNA的免疫细胞去靶向传感器的第二区域。在一些方面，微小RNA包括miR-142。因此，在一些方面，本文所描述的合成回路包含分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含(a)编码IL-12蛋白的第一区域和(b)包含能够特异性识别miR-142的免疫细胞去靶向传感器的第二区域。如从本公开显而易见的，免疫细胞去靶向传感器对miR-142的识别可导致免疫细胞对IL-12蛋白的表达减少。
如从本公开显而易见的，在一些方面，免疫细胞存在于淋巴组织内。在一些方面，淋巴组织包括脾脏。因此，在一些方面，合成回路包含分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含(a)编码有效载荷的第一区域和(b)包含能够特异性识别在脾脏中表达的微小RNA的脾脏去靶向传感器的第二区域。在一些方面，有效载荷是IL-12。对于此类方面，本文所描述的合成回路可包含分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含(a)编码IL-12的第一区域和(b)包含能够特异性识别在脾脏中表达的微小RNA的脾脏去靶向传感器的第二区域。在一些方面，微小RNA包括miR-142。因此，在一些方面，合成回路包含分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含(a)编码IL-12的第一区域和(b)包含能够特异性识别miR-142的脾脏去靶向传感器的第二区域。在一些方面，合成回路包含分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含(a)编码IL-12的第一区域和(b)包含能够特异性识别miR-142的脾脏去靶向传感器的第二区域。
III.复制子
本公开的一些方面涉及一种包含本文所描述的任何多核苷酸的复制子。如本文所用，术语“复制子”是指能够指导自身拷贝生成的病毒核酸。除非另外指明，否则复制子包含RNA或DNA。因此，在一些方面，可用于本公开的复制子包含分离的多核苷酸，该分离的多核苷酸包含(a)编码有效载荷的第一区域和(b)包含免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器)的第二区域，其中传感器对标志物的识别减少有效载荷的表达。
在一些方面，可用于本公开的复制子衍生自甲病毒。甲病毒包括披膜病毒科的一组基因、结构和血清学相关的节肢动物传播的病毒。二十六种已知的病毒和病毒亚型已被归类在甲病毒属内，包括辛德毕斯病毒(Sindbis virus，SIN)、塞姆利基森林病毒(SemlikiForest virus，SFV)、罗斯河病毒(Ross River virus，RRV)和委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)。在一些方面，复制子衍生自VEE。因此，本公开的一些方面涉及一种包含本文所描述的任何多核苷酸的VEE复制子。例如，在一些方面，本文提供的VEE复制子包含多核苷酸，该多核苷酸包含(a)编码有效载荷的第一区域和(b)包含脾脏去靶向传感器的第二区域，其中传感器对标志物的识别减少有效载荷的表达。
VEE病毒是通常由蚊子携带的病毒病原体，其主要在马物种中引起VEE或脑脊髓炎。然而，人类也可能感染VEE，并且免疫系统较弱的人(如果感染VEE)尤其具有发生严重并发症的风险。VEE的病毒体是球形的，并且具有脂质膜，其中糖蛋白表面蛋白散布在外表面周围。VEE具有大约11.45 kb的基因组，不包括5'-末端帽和3'-末端聚(A)束，并且包含四种非结构蛋白(nsP)和五种结构蛋白。非结构蛋白包括nsP1、nsP2、nsP3和nsP4，而结构区编码蛋白C、E3、E2、6K和E1。在一些方面，自扩增复制子RNA是源自VEE的WT复制子RNA。表4中提供了示例性VEE复制子序列。
在一些方面，可用于本公开的VEE复制子包括本领域已知的任何VEE复制子。在一些方面，VEE复制子包含一个或多个突变。例如，在一些方面，VEE复制子包含具有非结构蛋白nsP2和nsP3的突变，其中这些突变促进人细胞中的亚基因组表达。在一些方面，与不具有突变的对应VEE复制子相比，VEE复制子包含允许所编码的有效载荷的更大表达的突变。在一些方面，VEE复制子包含在表4中提供的序列中的任一者的核酸位置3936和/或4758处的至少一个点突变。在一些方面，VEE复制子包含以下点突变中的至少一个：表4中提供的序列中的任一者的位置3936处的鸟嘌呤变为胞嘧啶(G3936C)和位置4758处的腺嘌呤变为鸟嘌呤(A4758G)。G3936C突变将导致氨基酸残基1309处的甘氨酸变为精氨酸(G1309R)。A4758G突变将导致氨基酸残基1583处的丝氨酸变为甘氨酸(S1583G)。关于此类VEE复制子的另外的公开内容在例如US20200281994A1中提供，其通过引用以其整体并入本文。
IV.纳米颗粒
在一些方面，本公开涉及递送本文所描述的多核苷酸(例如，编码有效载荷并且包含免疫细胞去靶向传感器)，使得有效载荷的表达在免疫细胞(例如，存在于脾脏内)中被减少或抑制。在一些方面，递送可以在体内(例如，通过向受试者施用本文所描述的多核苷酸)或离体(例如，通过将本文所描述的多核苷酸与细胞一起体外培养)发生。在一些方面，本文所描述的多核苷酸的递送可使用本领域已知的任何合适的递送系统进行。在某些方面，递送系统是载体。因此，在一些方面，本公开提供了一种包含本文所描述的任何多核苷酸的载体。可使用的合适载体是本领域已知的。参见例如，Sung等人,Biomater Res23(8)(2019)，其通过引用以其整体并入本文。
在一些方面，使用纳米颗粒(例如，脂质纳米颗粒或脂质样纳米颗粒)递送本文所描述的多核苷酸。因此，在一些方面，本公开涉及一种封装在纳米颗粒内的多核苷酸(例如，本文所描述的)、一种包含此类纳米颗粒的组合物以及此类纳米颗粒的用途。更具体地，在一些方面，本文提供了一种纳米颗粒，其包含(i)本文所描述的任何多核苷酸和(ii)一种或多种类型的纳米颗粒组分。
IV.A.纳米颗粒(NP)
如本文所用，“纳米颗粒”(NP)是指具有以纳米(nm)为单位测量的特征尺寸的颗粒，诸如囊泡。纳米颗粒可以用于将药物疗法递送至靶向位置的方法中。NP的非限制性示例包括脂质纳米颗粒(LNP)、脂质样纳米颗粒(LLN)、聚合物纳米颗粒(PNP)和无机纳米颗粒。
IV.B.脂质纳米颗粒(LNP)
如本文所用，“脂质纳米颗粒”(LNP)是指由脂质构成的纳米颗粒。脂质纳米颗粒可以用于将药物疗法递送至靶向位置的方法中。LNP的非限制性示例包括阳离子脂质纳米颗粒、可电离脂质纳米颗粒、脂质体、固体脂质纳米颗粒(SLN)、双头两亲分子(bolaamphihile)、纳米结构的脂质载剂(NLC)以及单层膜结构(例如，古菌体和胶束)。
如本文所用，“阳离子脂质纳米颗粒”是指包含阳离子脂质的纳米颗粒。如本文所用，“可电离脂质纳米颗粒”是指包含可电离脂质的纳米颗粒。在本公开的各个方面，LNP包含以下脂质中的一种或多种：“非阳离子辅助脂质”、“磷脂”、“甾醇或其他结构脂质”和“PEG/聚乙二醇化脂质”。
示例性的LNP包含以下组分中的一种或多种：
(i) 可电离/阳离子脂质；
(ii) 磷脂或非阳离子辅助脂质；
(iii) 甾醇或其他结构脂质；
(iv) PEG/PEG化脂质和
(v) 靶向递送分子(脂质成分/靶向配体)。
IV.C.脂质样纳米颗粒(LLN)
如本文所用，“脂质样纳米颗粒”(LLN)是指包含如本文所描述的脂质和脂质样材料或类脂质的纳米颗粒。在本公开的各个方面，LLN包含以下脂质中的一种或多种：“非阳离子辅助脂质”、“磷脂”、“甾醇或其他结构脂质”和“PEG/PEG化脂质”。脂质样纳米颗粒可以用于将药物疗法递送至靶向位置的方法中。
示例性的LLN包含以下组分中的一种或多种：
(i) 可电离/阳离子脂质样材料或类脂质；
(ii) 磷脂或非阳离子辅助脂质；
(iii) 甾醇或其他结构脂质；
(iv) PEG/PEG化脂质；和
(v) 靶向递送分子(脂质成分/靶向配体)。
IV.D.脂质或脂质样材料
可电离脂质
可电离脂质的非限制性示例包括：((4-羟基丁基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)、8-((2-羟基乙基)(6-氧代-6-(十一烷氧)己基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(SM-102)、8-((2-羟基乙基)(8-(壬氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(脂质5)、9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4三(十二烷)基-1-哌嗪乙胺(KL10)、Nl-[2(双十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三(十二烷)基1,4-哌嗪二乙胺(KL22)、14,25-双十三烷基-15,18,21,24-四氮杂-三十八烷(KL25)、1,2-二亚油酰氧基-N,N--二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油酰-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-二亚油酰-4-(2二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、1,2-二油酰氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)、2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2R))和(2S)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA(2S))或其任何组合。
阳离子脂质
阳离子脂质的非限制性示例包括：l,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、脂质体转染试剂、N-[l-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、l-[2-(油酰氧基)乙基]-2-油酰-3-(2-羟乙基)氯化咪唑鎓(DOTEVI)、2,3-二油酰氧基-N-[2(精胺甲酰氨基)乙基]-N,N-二甲基-l-三氟乙酸丙铵(DOSPA)、N,N-二硬脂酰-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、N-(l,2-二油酰氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DORIE)、N,N-二油酰-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、l,2-二月桂酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DLePC)、l,2-二硬脂酰-3-三甲基铵-丙烷(DSTAP)、l,2-二棕榈酰-3-三甲基铵-丙烷(DPTAP)、l,2-二亚油酰-3-三甲基铵-丙烷(DLTAP)、l,2-二肉豆蔻酰-3-三甲基铵-丙烷(DMTAP)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DSePC)、l,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DPePC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DMePC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOePC)、l,2-二-(9Z-十四碳烯酰基)-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(14: 1 EPC)、l-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(16:0-18: 1 EPC)或其任何组合。
在本公开的一些方面，LNP主要包含阳离子脂质以及其他脂质成分。这些通常包括属于但不限于磷脂酰胆碱(PC)类(例如，1,s-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC))和1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、甾醇(例如，胆固醇)和聚乙二醇(PEG)-脂质缀合物(例如，1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[叶酸(聚乙二醇)-2000(DSPE-PEG2000)和C14-PEG2000)的其他脂质分子。
DOTAP
在本公开的各个方面，阳离子脂质是DOTAP。DOTAP可以用于将包括酵母人工染色体(YAC)在内的DNA高效转染到真核细胞中以用于瞬时或稳定的基因表达，并且也适用于将其他带负电荷的分子(如RNA、寡核苷酸、核苷酸、核糖核蛋白(RNP)复合物和蛋白质)高效转移到哺乳动物细胞的研究样品中。
脂质体转染试剂
在本公开的各个方面，阳离子脂质是脂质体转染试剂。本文中使用的脂质体转染试剂是常见的转染试剂，由Invitrogen生产和销售，用于分子和细胞生物学。它用于通过脂质体转染提高RNA (包括mRNA和siRNA)或质粒DNA到体外细胞培养物中的转染效率。脂质体转染试剂含有脂质亚基，这些脂质亚基可在水性环境中形成脂质体或脂质纳米颗粒，这些脂质体或脂质纳米颗粒夹带转染有效载荷(例如，modRNA)。由于中性辅脂介导脂质体与细胞膜的融合，因此含RNA的脂质体(在其表面上带正电荷)可以与带负电荷的活细胞质膜融合，从而允许核酸货物分子穿过细胞质进行复制或表达。
脂质样材料或类脂质
除非另有指示，否则“脂质样材料”和“类脂质”可以互换使用。脂质类材料和/或类脂质的非限制性示例包括：1,1′-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇)(C12-200)、3,6-双(4-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丁基)哌嗪2,5-二酮(cKK-E12)、四(8-甲基壬基)3,3′,3″,3-(((甲基氮烷二基)双(丙烷-3,1-二基))双(氮烷三基))四丙酸酯(306Oi10)、G0-C14、5A2-SC8、3,6-双(4-(双((9Z,12Z)-2-羟基十八碳9,12-二烯-1-基)氨基)丁基)哌嗪-2,5-二酮(OF-02)、(((3,6-二氧代哌嗪-2,5-二基)双(丁烷-4,1-二基))双(氮烷三基))四(乙烷2,1-二基)(9Z,9′Z,9″Z,9Z,12Z,12′Z,12″Z,12Z)-四(十八碳-9,12-二烯酸酯)(OF-Deg-Lin)、(((3,6-二氧代哌嗪-2,5-二基)双(丁烷-4,1-二基))双(氮烷三基))四(丁烷-4,1-二基)(9Z,9′Z,9″Z,9Z,12Z,12′Z,12″Z,12Z)-四(十八碳-9,12-二烯酸酯)(OF-C4-Deg-Lin)、N1,N3,N5-三(3-(双十二烷基氨基)丙基)苯1,3,5-三甲酰胺(TT3)、六(辛-3-基)9,9′,9″,9,9″″,9″-((((苯-1,3,5-三羰基)三(氮烷二基))三(丙烷-3,1-二基))三(氮烷三基))己基壬酸酯(FTT5)、PL-1[公开于Nature Communications, 12-7264(2021)中，其特此通过引用并入]、98N12-5[公开于Molecular Therapy第17卷第5期，2009年5月5日，其特此通过引用并入]、5,5-二((Z)-十七碳-8-烯-1-基)-1-(3-(吡咯烷-1-基)丙基)-2,5-二氢-1H-咪唑-2-甲酸乙酯(A2-Iso5-2DC18(A2))、A12-Iso5-2DC18(A12)或其任何组合。
如本文所用，TT3能够形成纳米颗粒，以用于将各种生物活性剂递送到细胞中。此外，本公开还证明了未负载的TT3-LLN可以在体内和体外诱导癌细胞中的免疫原性细胞死亡(ICD)。如本文所描述，免疫原性细胞死亡是指可以通过活化树突细胞(DC)和随后活化特异性T细胞应答来诱导有效免疫应答的细胞死亡形式。在本公开的一些方面，经历免疫原性细胞死亡的细胞是肿瘤细胞。免疫原性肿瘤细胞死亡可以引发有效的抗肿瘤免疫应答。
在一些方面，类脂质是TT3。
磷脂或其他非阳离子辅助脂质
除非另外指明，否则“磷脂”和“其他非阳离子辅助脂质”可互换使用并且非限制性示例包括：1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰-sn甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-双十一烷酰-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC)、1-油酰-2-胆固醇基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0 PE)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂以及它们的任何组合。
在一些方面，磷脂选自由以下各项组成的组：1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(14:0-16:0 PC，MPPC)、1-肉豆蔻酰-2硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(14:0-18:0PC，MSPC)、1-棕榈酰2-乙酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-02:0 PC)、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-14:0 PC，PMPC)、1-棕榈酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-18:0 PC，PSPC)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-18: 1 PC，POPC)、1-棕榈酰-2-亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-18:2 PC，PLPC)、1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-20:4 PC)、1-棕榈酰-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(14:0-22:6 PC)、1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-14:0 PC，SMPC)、1-硬脂酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-16:0 PC，SPPC)、1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-18: 1 PC，SOPC)、1-硬脂酰-2-亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-18:2PC)、1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-20:4 PC)、1-硬脂酰-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-22:6 PC)、1-油酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18: 1-14:0 PC，OMPC)、1-油酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18: 1-16:0 PC，OPPC)、1-油酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18: 1-18:0 PC, OSPC)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(16:0- 18: 1 PE，POPE)、1-棕榈酰-2-亚油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(16:0-18:2 PE)、1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(16:0-20:4PE)、1-棕榈酰-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(16:0-22:6 PE)、1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:0-18: 1 PE)、1-硬脂酰-2-亚油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:0-18:2 PE)、1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:0-20:4 PE)、1-硬脂酰-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:0-22:6 PE)、1-油酰-2-胆固醇基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)以及它们的任何组合。
在一些方面，磷脂是DSPC。在一些方面，磷脂是DOPE。
甾醇或其他结构脂质
如本文所用，“甾醇或其他结构脂质”是指可用于填充脂质膜堆积缺陷并提供结构完整性的胆固醇或胆固醇类似物。
甾醇的非限制性示例包括：胆固醇、粪甾醇、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、番茄碱、番茄苷、熊果酸、α-生育酚以及它们的组合。在一些方面，甾醇是胆固醇。
PEG/聚乙二醇化脂质
如本文所用，“PEG脂质”和“聚乙二醇化脂质”可互换使用。
PEG脂质的非限制性示例包括：2-[(聚乙二醇)-2000]-N,N-双十四烷基乙酰胺(ALC-0159)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-二硬脂酰甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油酰、PEG-二油酰、PEG-二硬脂酰、PEG-二酰基甘油(diacylglycamide)(PEG-DAG)、PEG-二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-1,2-二肉豆蔻酰氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。在一些方面，PEG-脂质的脂质部分包括长度为约C14至约C22的那些。
在一些方面，PEG部分具有约1000、2000、5000、10,000、15,000或20,000道尔顿的大小。在某些方面，C14-PEG2000包括1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000(DMG-PEG2000)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000](DMPE-PEG2000)或二者。
在一些方面，可以在多核苷酸封装之前将PEG-脂质嵌入LNP中。在一些方面，可以在多核苷酸封装之后将PEG脂质(或本文公开的其他脂质成分)添加到LNP中。例如，在一些方面，将本文所描述的多核苷酸封装在LNP中，然后使用例如胶束将PEG脂质(本文公开的其他脂质成分)附接至LNP。
在一些方面，纳米颗粒不包含任何聚乙二醇化脂质。在一些方面，脂质纳米颗粒不包含任何聚乙二醇化脂质。
靶向递送分子(脂质组合物/靶向配体)
在本公开的方面，如本文所描述的纳米颗粒(例如，LNP和LLN)包含靶向递送分子(脂质组合物/靶向配体)。如本文所用，“靶向递送分子(脂质组合物/靶向配体)”和“靶向递送分子”可互换使用，并且在一些方面，靶向递送分子可以是另外的脂质或脂质样组分，如本文所描述。在一些方面，靶向递送分子可以改变纳米颗粒的总电荷。在一些方面，靶向递送分子可以是与纳米颗粒非共价或共价结合的配体。在一些方面，靶向递送配体可以是小分子或大分子。
靶向递送分子的非限制性示例公开于Pharmaceuticals (Basel). 7月20日;15(7):897.(2022), Nat Rev Drug Discov 20, 101-124(2021)和Advanced Drug DeliveryReviews,第188卷,(2022)，其特此通过引用并入。靶向递送分子的非限制性示例包括：l,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、N,N-二硬脂基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸盐(钠盐)(18:1 PA)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸盐(钠盐)(14:0PA)、双(单油酰甘油)磷酸盐(S,R异构体)(铵盐)(18BMP)、2-((2,3-双(油酰氧基)丙基)二甲基铵)乙基磷酸乙酯(DOCPe)、叶酸、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、抗CD3抗体。
摩尔比
在一些方面，本文所描述的纳米颗粒包含如本文所描述的脂质(例如，可电离脂质、阳离子脂质、非阳离子辅助脂质、磷脂、甾醇或其他结构脂质或PEG脂质)和/或类脂质，其在脂质和/或脂质样组合物中的摩尔比是约10%至约50%。在一些方面，本文提供的纳米颗粒包含如本文所描述的脂质和/或类脂质，其在脂质组合物中的摩尔比是约10%、约20%、约30%、约40%或约50%。
在一些方面，本文提供的纳米颗粒包含如本文所描述的脂质和/或类脂质，其在脂质和/或脂质样组合物中的摩尔比是约10%。在一些方面，本文提供的纳米颗粒包含如本文所描述的脂质和/或类脂质，其在脂质和/或脂质样组合物中的摩尔比是约20%。在一些方面，本文提供的纳米颗粒包含如本文所描述的脂质和/或类脂质，其在脂质和/或脂质样组合物中的摩尔比是约30%。在一些方面，本文提供的纳米颗粒包含如本文所描述的脂质和/或类脂质，其在脂质和/或脂质样组合物中的摩尔比是约40%。在一些方面，本文提供的纳米颗粒包含如本文所描述的脂质和/或类脂质，其在脂质和/或脂质样组合物中的摩尔比是约40%。
在一些方面，本文所描述的纳米颗粒包含聚乙二醇化脂质，其在脂质和/或脂质样组合物中的摩尔比是约0%至约10%。在一些方面，脂质纳米颗粒包含聚乙二醇化脂质，其在脂质和/或脂质样组合物中的摩尔比是约0%、约0.25%、约0.5%、约0.75%、约1%、约2%、约3%、约4%、约5%、约6%、约7%、约8%、约9%或约10%。
在一些方面，本文提供的纳米颗粒包含聚乙二醇化脂质，其在脂质和/或脂质样组合物中的摩尔比是约0.25%。在一些方面，本文提供的纳米颗粒包含聚乙二醇化脂质，其在脂质和/或脂质样组合物中的摩尔比是约0.5%。在一些方面，本文提供的纳米颗粒包含聚乙二醇化脂质，其在脂质和/或脂质样组合物中的摩尔比是约0.75%。在一些方面，本文提供的纳米颗粒包含聚乙二醇化脂质，其在脂质和/或脂质样组合物中的摩尔比是约1.0%。在一些方面，本文提供的纳米颗粒包含聚乙二醇化脂质，其在脂质和/或脂质样组合物中的摩尔比是约2.0%。在一些方面，本文提供的纳米颗粒包含聚乙二醇化脂质，其在脂质和/或脂质样组合物中的摩尔比是约3.0%。在一些方面，本文提供的纳米颗粒包含聚乙二醇化脂质，其在脂质和/或脂质样组合物中的摩尔比是约4.0%。在一些方面，本文提供的纳米颗粒包含聚乙二醇化脂质，其在脂质和/或脂质样组合物中的摩尔比是约5.0%。在一些方面，本文提供的纳米颗粒包含聚乙二醇化脂质，其在脂质和/或脂质样组合物中的摩尔比是约6.0%。在一些方面，本文提供的纳米颗粒包含聚乙二醇化脂质，其在脂质和/或脂质样组合物中的摩尔比是约7.0%。在一些方面，本文提供的纳米颗粒包含聚乙二醇化脂质，其在脂质和/或脂质样组合物中的摩尔比是约8.0%。在一些方面，本文提供的纳米颗粒包含聚乙二醇化脂质，其在脂质和/或脂质样组合物中的摩尔比是约9.0%。在一些方面，本文提供的纳米颗粒包含聚乙二醇化脂质，其在脂质和/或脂质样组合物中的摩尔比是约10.0%。
例如，在一些方面，聚乙二醇化脂质包括C14-PEG2000。在一些方面，C14-PEG2000存在于脂质纳米颗粒中，其在脂质和/或脂质样组合物中的摩尔比是约0.25%。在一些方面，C14-PEG2000在脂质和/或脂质样组合物中以约0.5%的摩尔比存在。在一些方面，C14-PEG2000在脂质和/或脂质样组合物中以约0.75%的摩尔比存在。在一些方面，C14-PEG2000在脂质和/或脂质样组合物中以约1%的摩尔比存在。在一些方面，C14-PEG2000在脂质和/或脂质样组合物中以约2%的摩尔比存在。在一些方面，C14-PEG2000在脂质和/或脂质样组合物中以约3%的摩尔比存在。在一些方面，C14-PEG2000在脂质和/或脂质样组合物中以约4%的摩尔比存在。在一些方面，C14-PEG2000在脂质和/或脂质样组合物中以约5%的摩尔比存在。在一些方面，C14-PEG2000在脂质和/或脂质样组合物中以约6%的摩尔比存在。在一些方面，C14-PEG2000在脂质和/或脂质样组合物中以约7%的摩尔比存在。在一些方面，C14-PEG2000在脂质和/或脂质样组合物中以约8%的摩尔比存在。在一些方面，C14-PEG2000在脂质和/或脂质样组合物中以约9%的摩尔比存在。在一些方面，C14-PEG2000在脂质和/或脂质样组合物中以约10%的摩尔比存在。
粒度
纳米颗粒的粒度可以影响药物释放速率、生物分布、粘膜粘附、细胞对水的摄取和纳米颗粒内部的缓冲液交换以及蛋白质扩散。在本公开的一些方面，NP的直径范围是从约30至约500 nm。在本公开的一些方面，NP的直径范围是从约30至约500 nm、约50至约400nm、约70至约300 nm、约100至约200 nm、约100至约175 nm或约100至约160 nm。在本公开的一些方面，NP的直径范围是100-160 nm。在本公开的一些方面，NP的直径可以是约30 nm、约40 nm、约50 nm、约60 nm、约70 nm、约80 nm、约90 nm、约100 nm、约101 nm、约102 nm、约103 nm、约104 nm、约105 nm、约106 nm、约107 nm、约108 nm、约109 nm、约110 nm、约111nm、约112 nm、约113 nm、约114 nm、约115 nm、约116 nm、约117 nm、约118 nm、约119 nm、约120 nm.、约130 nm、约140 nm、约150 nm或约160 nm。在某些方面，脂质纳米颗粒具有约140nm的直径。
ζ电位
如本文所用，“ζ电位”是脂质纳米颗粒表面上的有效电荷的量度。ζ电位的大小提供了关于颗粒稳定性的信息。在本公开的一些方面，纳米颗粒的ζ电位范围是从约-20至约20 mv。在本公开的一些方面，NP的ζ电位可以是约-6.0 mv、约-5.9 mv、约-5.8 mv、约-5.7mv、约-5.6 mv、约-5.5 mv、约-5.4 mv、约-5.3 mv、约-5.2 mv、约-5.1 mv、约-5.0 mv、约-4.9 mv、约-4.8 mv、约-4.7 mv、约-4.6 mv、约-4.5 mv、约-4.4 mv、约-4.3 mv、约-4.2 mv、约-4.1 mv、约-4.0 mv、约-3.9 mv、约-3.8 mv、约-3.7 mv、约-3.6 mv、约-3.5 mv、约-3.4mv、约-3.3 mv、约-3.2 mv、约-3.1 mv、约-3.0 mv、约-2.9 mv、约-2.8 mv、约-2.7 mv、约-2.6 mv、约-2.5 mv、约-2.4 mv、约-2.3 mv、约-2.2 mv、约-2.1 mv、约-2.0 mv、约-1.9 mv、约-1.8 mv、约-1.7 mv、约-1.6 mv、约-1.5 mv、约-1.4 mv、约-1.3 mv、约-1.2 mv、约-1.1mv、约-1.0 mv、约-0.9 mv、约-0.8 mv、约-0.7 mv、约-0.6 mv、约-0.5 mv、约-0.4 mv、约-0.3 mv、约-0.2 mv、约-0.1 mv、约0.0 mv、约0.1 mv、约0.2 mv、约0.3 mv、约0.4 mv、约0.5mv、约0.6 mv、约0.7 mv、约0.8 mv、约0.9 mv、约1.0 mv、约1.1 mv、约1.2 mv、约1.3 mv、约1.4 mv、约1.5 mv、约1.6 mv、约1.7 mv、约1.8 mv、约1.9 mv、约2.0 mv、约2.1 mv、约2.2mv、约2.3 mv、约2.4 mv、约2.5 mv、约2.6 mv、约2.7 mv、约2.8 mv、约2.9 mv、约3.0 mv、约3.1 mv、约3.2 mv、约3.3 mv、约3.4 mv、约3.5 mv、约3.6 mv、约3.7 mv、约3.8 mv、约3.9mv、约4.0 mv、约4.1 mv、约4.2 mv、约4.3 mv、约4.4 mv、约4.5 mv、约4.6 mv、约4.7 mv、约4.8 mv、约4.9 mv、约5.0 mv、约5.1 mv、约5.2 mv、约5.3 mv、约5.4 mv、约5.5 mv、约5.6mv、约5.7 mv、约5.8 mv、约5.9 mv或约6.0 mv。
质量比
在一些方面，LNP或LLN的脂质与多核苷酸之间的质量比在约1:2至约15:1的范围内。在一些方面，脂质与多核苷酸之间的质量比可为约1:2、约1:1.9、约1:1.8、约1:1.7、约1:1.6、约1:1.5、约1:1.4、约1:1.3、约1:1.2、约1:1.1、约1:1、约1.1:1、约1.2:1、约1.3:1、约1.4:1、约1.5:1、约1.6:1、约1.7:1、约1.8:1、约1.9:1、约2:1、约2.5:1、约3:1、约3.5:1、约4:1、约4.5:1、约5:1、约5.5:1、约6:1、约6.5:1、约7:1、约7.5:1、约8:1、约8.5:1、约9:1、约9.5:1、约10:1、约10.5:1、约11:1、约11.5:1、约12:1、约12.5:1、约13:1、约13.5:1、约14:1、约14.5:1或约15:1。在本公开的一些方面，脂质与多核苷酸之间的质量比为约10:1。
V.药物组合物
在一些方面，本公开涉及一种药物组合物，其包含本文所描述的任何多核苷酸、复制子和/或纳米颗粒。在一些方面，药物组合物还包含药学上可接受的载剂(赋形剂)。如本文所用，“可接受的”意指载剂必须与组合物的活性成分相容并且对待治疗的受试者无害。在一些方面，载剂能够稳定活性成分。药学上可接受的赋形剂(载剂)包括缓冲液，其是本领域所熟知的。参见例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy第20版(2000)Lippincott Williams and Wilkoins,编辑：K. E. Hoover。
待用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这很容易通过例如通过无菌过滤膜过滤来实现。纳米颗粒可以放置在具有无菌接入端口的容器(例如，具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)中。
在一些方面，药物组合物可以被配制用于肿瘤内、鞘内、肌内、静脉内、皮下、吸入、皮内、淋巴内、眼内、腹膜内、胸膜内、脊柱内、血管内、鼻内、经皮、舌下、粘膜下、透皮或透粘膜施用。在本公开的一些方面，药物组合物可以被配制用于肿瘤内注射。如本文所用，肿瘤内注射是指直接注射到肿瘤中。可以原位获得高浓度的组合物，同时使用少量药物。免疫疗法的局部递送允许多种组合疗法，同时防止显著的全身暴露和脱靶毒性。
在一些方面，药物组合物可以被配制用于肌内注射、静脉内注射或皮下注射。
在一些方面，药物组合物包含冻干制剂或水溶液形式的药学上可接受的载剂、缓冲剂、赋形剂、盐或稳定剂。参见例如，Remington: The Science and Practice ofPharmacy第20版(2000)Lippincott Williams and Wilkins,编辑：K. E. Hoover。可接受的载剂和赋形剂或稳定剂在采用的剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且包括缓冲液诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖以及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，诸如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，本文所描述的药物组合物可通过本领域已知的方法制备，诸如以下文献中所描述的方法：Epstein等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)；Hwang等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)；以及美国专利号4,485,045和4,544,545，这些文献特此通过引用以其整体并入。具有增强的循环时间的脂质体公开于美国专利号5,013,556中，该美国专利特此通过引用以其整体并入。在一些方面，可以用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物来通过反相蒸发法生成脂质体。通过具有限定孔径的过滤器将脂质体挤出以产生具有期望直径的脂质体。
在一些方面，药物组合物以持续释放形式配制。持续释放制剂的合适示例包括含有纳米颗粒的固体疏水性聚合物的半透性基质，这些基质呈成形制品的形式，例如，膜或微胶囊。持续释放基质的示例包括但不限于聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯(美国专利号3,773,919)、L-谷氨酸和7-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPROM DEPOT™ (由乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙瑞林构成的可注射微球)、乙酸异丁酸蔗糖和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
在一些方面，合适的表面活性剂包括但不限于非离子剂，如聚氧乙烯脱水山梨醇(例如，TWEEN™ 20、40、60、80或85)和其他脱水山梨醇(例如，SPAN™ 20、30、60、80或85)。在一些方面，具有表面活性剂的组合物包含在0.05%与5%之间的表面活性剂。在一些方面，组合物包含0.1%和2.5%。应当理解，如果需要，可以添加其他成分，例如甘露醇或其他药学上可接受的媒介物。
在一些方面，药物组合物呈单位剂型，诸如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、溶液剂或混悬剂或栓剂，以用于口服、肠胃外或直肠施用或者通过吸入或吹入施用。
为了制备固体组合物诸如片剂，可以将主要活性成分与药物载剂(例如，常规压片成分，诸如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶)和其他药物稀释剂(例如，水)混合，以形成含有本公开的化合物或其无毒的药学上可接受的盐的均匀混合物的固体预配制组合物。当将这些预配制组合物称为均匀的时，意指活性成分被均匀地分散于整个组合物以使得可容易地将组合物细分成同样有效的单位剂型诸如片剂、丸剂和胶囊剂。然后将这个固体预配制组合物细分为含有约0.1至约500 mg本公开的活性成分的上述类型的单位剂型。可以包覆或以其他方式配混新颖组合物的片剂或丸剂以提供给出延长作用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包含内剂量组分和外剂量组分，后者为在前者上的包膜形式。这两种组分可以通过肠溶层分开，该肠溶层用于抵抗胃中的崩解并且允许内组分完整地传递进入十二指肠或被延迟释放。多种材料可用于此类肠溶层或包衣，此类材料包括许多聚合酸以及聚合酸与虫胶、十六醇和乙酸纤维素等材料的混合物。
可使用可商购获得的脂肪乳剂(如INTRALIPID™、LIPOSYN™、INFONUTROL™、LIPOFUNDIN™和LIPIPHYSAN™)制备合适的乳剂。活性成分可以溶解在预混合的乳剂组合物中，或者可替代地，活性成分可以溶解在油(例如，大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)以及与磷脂(例如，卵磷脂、大豆磷脂或大豆卵磷脂)和水混合后形成的乳剂中。应当理解，可以添加其他成分，例如甘油或葡萄糖，以调节乳剂的张力。合适的乳剂通常将含有至多约20%(例如，在约5%与约20%之间)的油。脂肪乳剂可以包含具有合适尺寸的脂肪液滴，并且可以具有在约5.5至约8.0范围内的pH。
用于吸入或吹入的药物组合物包括药学上可接受的水性或有机溶剂、或其混合物中的溶液和混悬剂、以及粉末。液体或固体组合物可含有如上所述合适的药学上可接受的赋形剂。在一些方面，通过口服或鼻腔呼吸途径施用组合物，以产生局部或全身作用。
在药学上可接受的溶剂中的组合物可以通过使用气体进行雾化。可以直接从雾化装置中吸入雾化溶液，或者雾化装置可以附接到面罩塞条或间歇正压呼吸机。可从以适当方式递送制剂的装置施用溶液、悬浮液或粉末组合物。
VI.治疗性应用
VI.A.选择性表达
本公开的一些方面涉及诱导免疫细胞(例如，存在于淋巴组织内)对有效载荷的选择性表达的方法。如本文所描述，本文所描述的多核苷酸包含免疫细胞去靶向传感器，使得当向受试者施用该多核苷酸时，免疫细胞对所编码的有效载荷的表达被减少或抑制。
因此，本公开的一些方面涉及一种减少或避免有需要的受试者的免疫细胞内的有效载荷的表达的方法，其包括向受试者施用本文所描述的任何分离的多核苷酸、复制子(例如，VEE复制子)、纳米颗粒和/或药物组合物。如本文所描述，在一些方面，免疫细胞存在于淋巴组织诸如脾脏内。在一些方面，本文提供了一种减少或避免有需要的受试者的脾脏内的有效载荷的表达(有效载荷表达)的方法，其包括向受试者施用本文所描述的任何分离的多核苷酸、复制子(例如，VEE复制子)、纳米颗粒和/或药物组合物。
在一些方面，完全避免免疫细胞内的有效载荷的表达(即，在施用后，有效载荷在免疫细胞中不表达)。在一些方面，与受试者内的非免疫细胞相比，免疫细胞中的有效载荷的表达减少。例如，在一些方面，在施用后，与非免疫细胞中的对应表达相比，免疫细胞中的有效载荷的表达减少至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或约100%。
如本文所展示的，在一些方面，免疫细胞内有效载荷的表达减少可与受试者内有效载荷的总体表达降低相关。不受任何一种理论的束缚，在一些方面，通过减少存在于淋巴组织(例如，脾脏)内的免疫细胞内的有效载荷的表达，可减少非淋巴组织(例如，其他非脾脏组织)中的有效载荷的表达。例如，如本公开其他地方进一步描述的，在一些方面，有效载荷包含IL-12蛋白。IL-12是分泌蛋白，其在产生时(例如，由脾脏内的免疫细胞)分泌到外周(例如，血液中)。因此，对于本领域技术人员将显而易见的是，脾脏内IL-12表达的减少可与其他非脾脏组织(例如，血液)中IL-12表达的减少相关。
在一些方面，有效载荷的表达减少可与毒性降低相关。因此，在一些方面，多核苷酸、复制子(例如，VEE复制子)、纳米颗粒和/或药物组合物在施用于受试者时以降低的毒性允许更大的耐受性。毒性和/或耐受性可通过本领域已知的任何合适的方法评估。在一些方面，毒性和/或耐受性可通过在施用后监测受试者的体重来评估，其中降低的毒性和/或增加的耐受性与降低的体重减轻相关。
如本文所用，“减少表达”是指(i)由免疫细胞(例如，存在于组织(例如，脾脏)中)表达的有效载荷的总量降低；(ii)免疫细胞(例如，存在于组织(例如，脾脏)中)表达有效载荷的时间(即，持续时间)降低；或(iii) (i)和(ii)两者。
因此，在一些方面，在施用后，与非免疫细胞相比，由免疫细胞(例如，存在于脾脏中)表达的有效载荷的总量减少。在一些方面，与由非免疫细胞表达的对应量相比，由免疫细胞表达的有效载荷的总量减少至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或约100%。在一些方面，与由参考受试者的对应免疫细胞表达的有效载荷的总量相比，由免疫细胞表达的有效载荷的总量减少。在一些方面，在施用后，与由参考受试者的免疫细胞表达的对应量相比，由免疫细胞表达的有效载荷的总量减少至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或约100%。在一些方面，参考受试者是接受缺乏本文所描述的免疫细胞去靶向传感器的对应多核苷酸的受试者。
如本文所描述，在一些方面，在施用后，与非免疫细胞的对应表达相比和/或与参考受试者的免疫细胞的对应表达相比，有效载荷仅由免疫细胞(例如，存在于脾脏中)瞬时表达。因此，在一些方面，与非免疫细胞相比，向受试者施用任何多核苷酸、复制子、纳米颗粒和/或药物组合物导致免疫细胞的有效载荷表达的持续时间减少。在一些方面，与非免疫细胞的对应持续时间相比，免疫细胞的有效载荷表达的持续时间降低至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或约100%。在一些方面，在施用后，与参考受试者(例如，接受缺乏免疫细胞去靶向传感器的对应多核苷酸的受试者)的免疫细胞的有效载荷表达的持续时间相比，受试者的免疫细胞(例如，存在于脾脏中)的有效载荷表达的持续时间减少。在一些方面，与参考受试者的免疫细胞的对应持续时间相比，受试者的免疫细胞的有效载荷表达的持续时间减少至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或约100%。
在一些方面，在施用后，与非免疫细胞相比，免疫细胞中(i)所表达的有效载荷的总量和(ii)有效载荷表达的持续时间均减少。在一些方面，与非免疫细胞中的对应值相比，(i)所表达的有效载荷的总量和(ii)有效载荷表达的持续时间均减少至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或约100%。在一些方面，在施用后，与参考受试者(例如，接受缺乏免疫细胞去靶向传感器的对应多核苷酸的受试者)的免疫细胞的对应值相比，免疫细胞中(i)所表达的有效载荷的总量和(ii)有效载荷表达的持续时间均减少。在一些方面，与参考受试者的免疫细胞的对应值相比，(i)所表达的有效载荷的总量和(ii)有效载荷表达的持续时间均减少至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或约100%。
本公开的一些方面涉及在有需要的受试者的非免疫细胞中选择性表达有效载荷的方法。如本文所描述，免疫细胞主要存在于淋巴组织(例如，脾脏)中并且较少存在于非淋巴组织中。因此，本公开的一些方面涉及在有需要的受试者的非淋巴组织中选择性表达有效载荷的方法。在一些方面，此类方法包括向受试者施用本文所描述的任何多核苷酸、复制子(例如，VEE复制子)、纳米颗粒和/或药物组合物，其中在施用后，与非淋巴组织中的对应表达相比，淋巴组织(例如，脾脏)中的有效载荷表达减少。如本文所用，“选择性表达”或“优先表达”或其语法变体是指与第二组织(例如，淋巴组织，诸如脾脏)相比，第一组织(例如，非淋巴组织)中(例如，有效载荷)的表达增加。在一些方面，有效载荷选择性地或优先地在非淋巴组织中表达，其中与淋巴组织(例如，脾脏)中的对应表达相比，非淋巴组织中的表达(例如，有效载荷的总量和/或有效载荷表达的持续时间)增加。在一些方面，有效载荷在非淋巴组织中的表达与在受试者的其他非淋巴组织中的对应表达相同。在一些方面，与受试者的其他非淋巴组织中的对应表达相比，有效载荷在该非淋巴组织中的表达增加。在一些方面，有效载荷在该非淋巴组织中的表达与受试者的其他非淋巴组织相比降低，但与淋巴组织(例如，脾脏)中的对应表达相比增加。
VI.B.治疗方法
如从本公开显而易见的，本文所描述的多核苷酸、复制子(例如，VEE复制子)、纳米颗粒和/或药物组合物可用于治疗广泛多种疾病或病症。因此，在一些方面，本文提供了一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，其包括向受试者施用本文提供的任何多核苷酸、复制子(例如，VEE复制子)、纳米颗粒和/或药物组合物。如本文所描述，在施用后，有效载荷优先由受试者的非免疫细胞表达。
本文提供的多核苷酸、复制子(例如，VEE复制子)、纳米颗粒和/或药物组合物可用于治疗本领域中已知的任何合适的疾病或病症。可治疗的疾病和病症的非限制性示例包括癌症、炎性病症、单基因病症、神经病症、精神病症或它们的组合。
在一些方面，该疾病或病症包括癌症。癌症的非限制性示例包括：黑色素瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、大细胞癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝肿瘤、胃癌、头颈癌或它们的组合。在一些方面，乳腺癌是三阴性乳腺癌。
在一些方面，任何多核苷酸、复制子(例如，VEE复制子)、纳米颗粒和/或药物组合物可经由静脉内、肿瘤内、鞘内、肌内、皮下、吸入、皮内、淋巴内、眼内、腹膜内、胸膜内、脊柱内、血管内、经鼻、经皮、舌下、粘膜下、透皮或经粘膜施用来施用于受试者。
在一些方面，可将任何多核苷酸、复制子(例如，VEE复制子)、纳米颗粒和/或药物组合物与一种或多种另外的治疗剂组合施用于受试者。在一些方面，另外的治疗剂包括抗癌剂。抗癌剂的非限制性示例包括：化学疗法、放射疗法、手术疗法、免疫疗法或它们的组合。在一些方面，化疗剂是卡铂(carboplatin)、顺铂(cisplatin)、多西他赛(docetaxel)、吉西他滨(gemcitabine)、白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel)、培美曲塞(pemetrexed)、长春瑞滨(vinorelbine)或它们的组合。在一些方面，放射疗法是电离辐射、γ辐射、中子束放射疗法、电子束放射疗法、质子疗法、近距离放射疗法、全身放射性同位素、放射增敏剂或它们的组合。在一些方面，手术疗法是治愈性手术(例如，肿瘤去除手术)、预防性手术、腹腔镜手术、激光手术或它们的组合。在一些方面，免疫疗法是过继性细胞转移、治疗性癌症疫苗或它们的组合。
在一些方面，化疗剂是铂化剂，诸如卡铂、奥沙利铂(oxaliplatin)、顺铂、奈达铂(nedaplatin)、赛特铂(satraplatin)、洛铂(lobaplatin)、三铂(triplatin)、四硝酸酯(tetranitrate)、吡铂(picoplatin)、prolindac、阿罗铂(aroplatin)和其他衍生物；拓扑异构酶I抑制剂，诸如喜树碱、拓扑替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)/SN38、鲁比替康(rubitecan)、贝洛替康(belotecan)和其他衍生物；拓扑异构酶II抑制剂，诸如依托泊苷(VP-16)、柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)剂(例如，脂质体中的多柔比星、多柔比星HCl、多柔比星类似物或多柔比星及其盐或类似物)、米托蒽醌(mitoxantrone)、阿柔比星(aclarubicin)、表柔比星(epirubicin)、伊达比星(idarubicin)、氨柔比星(amrubicin)、安吖啶(amsacrine)、吡柔比星(pirarubicin)、戊柔比星(valrubicin)、佐柔比星(zorubicin)、替尼泊苷(teniposide)和其他衍生物；抗代谢药，诸如叶酸家族(甲氨蝶呤、培美曲塞、雷替曲塞(raltitrexed)、氨基蝶呤(aminopterin)和亲属(relatives))；嘌呤拮抗剂(硫鸟嘌呤、氟达拉滨(fludarabine)、克拉屈滨(cladribine)、6-巯基嘌呤、喷司他丁(pentostatin)、氯法拉滨(clofarabine)和亲属)和嘧啶拮抗剂(阿糖胞苷、氟尿苷、阿扎胞苷、替加氟(tegafur)、卡莫氟(carmofur)、卡培他滨(capacitabine)、吉西他滨、羟基脲、5-氟尿嘧啶(5fu)和亲属)；烷基化剂，诸如氮芥(例如，环磷酰胺、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、氮芥(mechlorethamine)、异环磷酰胺、曲磷胺(trofosfamide)、泼尼莫司汀(prednimustine)、苯达莫司汀(bendamustine)、乌莫司汀(uramustine)、雌莫司汀(estramustine)和亲属)；亚硝基脲类(例如，卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、福莫司汀(fotemustine)、尼莫司汀(nimustine)、雷莫司汀(ranimustine)、链脲佐菌素和亲属)；三氮烯类(例如，达卡巴嗪(dacarbazine)、阿曲他明(altretamine)、替莫唑胺(temozolomide)和亲属)；烷基磺酸盐(例如，白消安(busulfan)、甘露舒凡(mannosulfan)、曲奥舒凡(treosulfan)和亲属)；丙卡巴肼；二溴甘露醇和氮丙啶类(例如，卡波醌(carboquone)、三亚胺醌(triaziquone)、噻替派(thiotepa)、三亚乙基蜜胺(triethylenemalamine)和亲属)；抗生素，诸如羟基脲、蒽环类(例如，多柔比星剂、柔红霉素、表柔比星和其他衍生物)；蒽二酮类(例如，米托蒽醌和亲属)；链霉菌家族(例如，博来霉素(bleomycin)、丝裂霉素c、放线菌素(actinomycin)、普卡霉素(plicamycin))；紫外光；以及它们的组合。
在一些方面，另外的治疗剂是抗体。抗体(优选单克隆抗体)通过各种机制实现其针对癌细胞的治疗效果。它们可以在产生细胞凋亡或程序性细胞死亡方面具有直接作用。它们可以阻断信号转导途径的组分，诸如例如生长因子受体，从而有效地阻止肿瘤细胞的增殖。在表达单克隆抗体的细胞中，它们可以导致抗独特型抗体的形成。间接作用包括募集具有细胞毒性的细胞，诸如单核细胞和巨噬细胞。这种类型的抗体介导的细胞杀伤被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)。抗体还结合补体，从而导致直接细胞毒性，其被称为补体依赖性细胞毒性(CDC)。将手术方法与免疫治疗药物或方法组合是一种成功的方法，如例如Gadri等人2009: Synergistic effect of dendritic cell vaccination andanti-CD20 antibody treatment in the therapy of murine lymphoma. J Immunother.32(4): 333-40中所展示。以下列表提供了可与本公开组合使用的抗癌抗体和潜在抗体靶标(在括号中)的一些非限制性示例：阿巴伏单抗(Abagovomab) (CA-125)、阿昔单抗(Abciximab) (CD41)、阿德木单抗(Adecatumumab) (EpCAM)、阿托珠单抗(Afutuzumab)(CD20)、培戈-阿拉赛珠单抗(Alacizumab pegol) (VEGFR2)、阿妥莫单抗(Altumomabpentetate) (CEA)、阿麦妥单抗(Amatuximab) (MORAb-009)、马安那莫单抗(Anatumomabmafenatox) (TAG-72)、阿泊珠单抗(Apolizumab) (HLA-DR)、阿西莫单抗(Arcitumomab)(CEA)、巴维昔单抗(Bavituximab) (磷脂酰丝氨酸)、贝妥莫单抗(Bectumomab) (CD22)、贝利尤单抗(Belimumab) (BAFF)、贝伐珠单抗(Bevacizumab) (VEGF-A)、比伐珠单抗美登新(Bivatuzumab mertansine) (CD44 v6)、博纳吐单抗(Blinatumomab) (CD19)、维布妥昔单抗(Brentuximab vedotin) (CD30 TNFRSF8)、莫坎妥珠单抗(Cantuzumab mertansin) (粘蛋白CanAg)、雷坎妥组单抗(Cantuzumab ravtansine) (MUC1)、卡普罗单抗喷地肽(Capromab pendetide) (前列腺癌细胞)、卡芦单抗(Carlumab) (CNT0888)、卡妥索单抗(Catumaxomab) (EpCAM，CD3)、西妥昔单抗(Cetuximab) (EGFR)、泊西他组单抗(Citatuzumab bogatox) (EpCAM)、西妥木单抗(Cixutumumab) (IGF-1受体)、克劳昔单抗(Claudiximab) (Claudin)、泰坦-克利妥珠单抗(Clivatuzumab tetraxetan) (MUC1)、可那木单抗(Conatumumab) (TRAIL-R2)、达西组单抗(Dacetuzumab) (CD40)、达罗托组单抗(Dalotuzumab) (胰岛素样生长因子I受体)、地诺单抗(Denosumab) (RANKL)、地莫单抗(Detumomab) (B淋巴瘤细胞)、曲齐妥单抗(Drozitumab) (DR5)、依美昔单抗(Ecromeximab) (GD3神经节苷脂)、依决洛单抗(Edrecolomab) (EpCAM)、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab) (SLAMF7)、依那妥组单抗(Enavatuzumab) (PDL192)、恩妥昔单抗(Ensituximab) (NPC-1C)、依帕珠单抗(Epratuzumab) (CD22)、厄妥索单抗(Ertumaxomab)(HER2/neu，CD3)、埃达组单抗(Etaracizumab) (整合蛋白αvβ3)、法妥组单抗(Farletuzumab) (叶酸受体1)、FBTA05 (CD20)、非拉妥组单抗(Ficlatuzumab) (SCH900105)、芬妥木单抗(Figitumumab) (IGF-1受体)、法兰妥单抗(Flanvotumab) (糖蛋白75)、非苏木单抗(Fresolimumab) (TGF-β)、加利昔单抗(Galiximab) (CD80)、加尼妥单抗(Ganitumab) (IGF-I)、吉妥珠单抗奥唑米星(Gemtuzumab ozogamicin) (CD33)、吉伏组单抗(Gevokizumab) (IL-1β)、吉妥昔单抗(Girentuximab) (碳酸酐酶9 (CA-IX))、维汀-格巴妥木单抗(Glembatumumab vedotin) (GPNMB)、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)(CD20)、艾芦库单抗(Icrucumab) (VEGFR-1)、伊戈伏单抗(Igovoma) (CA-125)、雷英妥昔单抗(Indatuximab ravtansine) (SDC1)、英妥木单抗(Intetumumab) (CD51)、奥加伊妥珠单抗(Inotuzumab ozogamicin) (CD22)、伊匹单抗(Ipilimumab) (CD152)、伊妥木单抗(Iratumumab) (CD30)、拉贝珠单抗(Labetuzumab) (CEA)、来沙木单抗(Lexatumumab)(TRAIL-R2)、利韦单抗(Libivirumab) (乙型肝炎表面抗原)、林妥珠单抗(Lintuzumab)(CD33)、莫星-洛沃妥珠单抗(Lorvotuzumab mertansine) (CD56)、卢卡木单抗(Lucatumumab) (CD40)、鲁昔单抗(Lumiliximab) (CD23)、马帕木单抗(Mapatumumab)(TRAIL-R1)、马妥珠单抗(Matuzumab) (EGFR)、美泊利单抗(Mepolizumab) (IL-5)、米拉珠单抗(Milatuzumab) (CD74)、米妥莫单抗(Mitumomab) (GD3神经节苷脂)、莫格利珠单抗(Mogamulizumab) (CCR4)、莫赛妥莫单抗(Moxetumomab pasudotox) (CD22)、他那可单抗(Nacolomab tafenatox) (C242抗原)、他那莫单抗(Naptumomab estafenatox) (5T4)、那呐妥单抗(Narnatumab) (RON)、耐昔妥珠单抗(Necitumumab) (EGFR)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab) (EGFR)、纳武单抗(Nivolumab) (IgG4)、奥法木单抗(Ofatumumab)(CD20)、奥拉单抗(Olaratumab) (PDGF-R α)、奥那妥组单抗(Onartuzumab) (人散射因子受体激酶)、莫妥组单抗(Oportuzumab monatox) (EpCAM)、奥戈伏单抗(Oregovomab) (CA-125)、奥塞芦单抗(Oxelumab) (OX-40)、帕尼单抗(Panitumumab) (EGFR)、帕曲妥单抗(Patritumab) (HER3)、培妥莫单抗(Pemtumoma) (MUC1)、帕妥珠单抗(Pertuzuma) (HER2/neu)、平妥莫单抗(Pintumomab) (腺癌抗原)、普立木单抗(Pritumumab) (波形蛋白)、雷妥莫单抗(Racotumomab) (N-羟乙酰神经氨酸)、雷曲妥单抗(Radretumab) (纤连蛋白额外结构域-B)、雷韦单抗(Rafivirumab) (狂犬病毒糖蛋白)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)(VEGFR2)、利妥木单抗(Rilotumumab) (HGF)、利妥昔单抗(Rituximab) (CD20)、罗妥木单抗(Robatumumab) (IGF-1受体)、沙马组单抗(Samalizumab) (CD200)、西罗珠单抗(Sibrotuzumab) (FAP)、司妥昔单抗(Siltuximab) (IL-6)、他贝芦单抗(Tabalumab)(BAFF)、泰坦-替组单抗(Tacatuzumab tetraxetan) (甲胎蛋白)、帕他普莫单抗(Taplitumomab paptox) (CD19)、替妥莫单抗(Tenatumomab) (肌腱蛋白C)、替妥木单抗(Teprotumumab) (CD221)、曲美木单抗(Ticilimumab) (CTLA-4)、替加组单抗(Tigatuzumab) (TRAIL-R2)、TNX-650 (IL-13)、托西莫单抗(Tositumomab) (CD20)、曲妥珠单抗(Trastuzumab) (HER2/neu)、TRBS07 (GD2)、替西木单抗(Tremelimumab) (CTLA-4)、西莫白介素单抗(Tucotuzumab celmoleukin) (EpCAM)、乌妥昔单抗(Ublituximab)(MS4A1)、乌瑞芦单抗(Urelumab) (4-1BB)、伏洛昔单抗(Volociximab) (整联蛋白α5β1)、伏妥莫单抗(Votumumab) (肿瘤抗原CTAA16.88)、扎芦木单抗(Zalutumumab) (EGFR)、扎木单抗(Zanolimumab) (CD4)。
在一些方面，另外的治疗剂是细胞因子、趋化因子、共刺激分子、融合蛋白或它们的组合。趋化因子的示例包括但不限于CCR7及其配体CCL19和CCL21，此外还有CCL2、CCL3、CCL5和CCL16。其他示例是CXCR4、CXCR7和CXCL12。此外，共刺激或调节分子诸如例如B7配体(B7.1和B7.2)是有用的。其他细胞因子也是有用的，诸如例如白介素，尤其是(例如，IL-1至IL17)、干扰素(例如，IFNα1至IFNα8、IFNα10、IFNα13、IFNα14、IFNα16、IFNα17、IFNα21、IFNβ1、IFNW、IFNE1和IFNK)、造血因子、TGF (例如，TGF-α、TGF-β和TGF家族的其他成员)，最后是肿瘤坏死因子受体家族的成员及其配体以及其他刺激分子，包括但不限于41BB、41BB-L、CD137、CD137L、CTLA-4GITR、GITRL、Fas、Fas-L、TNFR1、TRAIL-R1、TRAIL-R2、p75NGF-R、DR6、LT.β.R、RANK、EDAR1、XEDAR、Fn114、Troy/Trade、TAJ、TNFRII、HVEM、CD27、CD30、CD40、4-1BB、OX40、GITR、GITRL、TACI、BAFF-R、BCMA、RELT和CD95 (Fas/APO-1)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白、TNF受体相关凋亡介导蛋白(TRAMP)和死亡受体-6 (DR6)。尤其地，CD40/CD40L和OX40/OX40L由于其对T细胞存活和增殖的直接影响而成为组合免疫疗法的重要靶标。
在一些方面，另外的治疗剂是激酶抑制剂。癌细胞的生长和存活与激酶活性的失调密切相关。为了恢复正常激酶活性并因此减少肿瘤生长，使用了广泛的抑制剂。靶向激酶组包括受体酪氨酸激酶，例如，BCR-ABL、B-Raf、EGFR、HER-2/ErbB2、IGF-IR、PDGFR-α、PDGFR-β、c-Kit、Flt-4、Flt3、FGFR1、FGFR3、FGFR4、CSF1R、c-Met、RON、c-Ret、ALK、细胞质酪氨酸激酶(例如，c-SRC、c-YES、ABL、JAK-2)、丝氨酸/苏氨酸激酶(例如，ATM、Aurora A&B、CDKs、mTOR、PKCi、PLKs、b-Raf、S6K、STK11/LKB1)和脂质激酶(例如，PI3K、SK1)。小分子激酶抑制剂是例如PHA-739358、尼洛替尼(Nilotinib)、达沙替尼(Dasatinib)和PD166326、NSC743411、拉帕替尼(Lapatinib) (GW-572016)、卡奈替尼(Canertinib) (CI-1033)、司马沙尼(Semaxinib) (SU5416)、瓦他拉尼(Vatalanib) (PTK787/ZK222584)、舒尼替尼(Sutent)(SU11248)、索拉非尼(Sorafenib) (BAY 43-9006)和来氟米特(Leflunomide) (SU101)。更多信息参见例如，Zhang等人2009: Targeting cancer with small molecule kinaseinhibitors. Nature Reviews Cancer 9, 28-39。
在一些方面，另外的治疗剂是toll样受体。Toll样受体(TLR)家族的成员是先天性免疫和适应性免疫之间的重要联系，许多佐剂的作用依赖于TLR的活化。大量已建立的抗癌疫苗掺入TLR配体以增强疫苗应答。除了TLR2之外，TLR3、TLR4，尤其是TLR7和TLR8已经被用于被动免疫疗法方法中的癌症疗法。密切相关的TLR7和TLR8通过影响免疫细胞、肿瘤细胞和肿瘤微环境而有助于抗肿瘤应答，并且可以被核苷类似物结构活化。所有TLR都已用作独立的免疫治疗剂或癌症疫苗佐剂，并且可以与本公开的制剂和方法协同地组合。
在一些方面，另外的治疗剂是血管生成抑制剂。血管生成抑制剂阻止肿瘤存活所需的血管的广泛生长(血管生成)。例如，可以通过靶向不同的分子来阻断肿瘤细胞为满足其日益增长的营养和氧气需求而促进的血管生成。可与本公开组合的血管生成介导分子或血管生成抑制剂的非限制性示例是可溶性VEGF (VEGF同种型VEGF121和VEGF165、受体VEGFR1、VEGFR2和共受体神经纤毛蛋白-1和神经纤毛蛋白-2) 1和NRP-1、血管生成素2、TSP-1和TSP-2、血管抑素和相关分子、内皮抑素、血管抑制因子(vasostatin)、钙网蛋白、血小板因子-4、TIMP和CDAI、Meth-1和Meth-2、IFN-α、-β和-γ、CXCL10、IL-4、-12和-18、凝血酶原(kringle结构域-2)、抗凝血酶III片段、催乳素、VEGI、SPARC、骨桥蛋白、乳腺丝抑蛋白(maspin)、血管能抑素(canstatin)、增殖蛋白相关蛋白、休眠蛋白(restin)和药物例如贝伐珠单抗(bevacizumab)、伊曲康唑(itraconazole)、羧酰胺三唑(carboxyamidotriazole)、TNP-470、CM101、IFN-α、血小板因子-4、舒拉明(suramin)、SU5416、凝血栓蛋白(thrombospondin)、VEGFR拮抗剂、血管静止类固醇+肝素、软骨源性血管生成抑制因子、基质金属蛋白酶抑制剂、2-甲氧基雌二醇、替考加兰(tecogalan)、四硫钼酸盐(tetrathiomolybdate)、沙利度胺(thalidomide)、凝血栓蛋白、催乳素Vβ3抑制剂、利诺安(linomide)、他喹莫德(tasquinimod)。
在一些方面，另外的治疗剂是基于病毒的疫苗。存在许多可用的或正在开发的基于病毒的癌症疫苗，其可以与本公开的制剂一起用于组合治疗方法中。使用此类病毒载体的一个优点是其固有的引发免疫应答的能力，其中由于病毒感染而发生炎性反应，从而产生免疫活化所需的危险信号。理想的病毒载体应该是安全的，并且不应该引入抗载体免疫应答以允许增强抗肿瘤特异性应答。重组病毒(诸如疫苗病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒和禽痘病毒)已被用于动物肿瘤模型，并且基于其令人鼓舞的结果，人类临床试验已经启动。特别重要的基于病毒的疫苗是病毒样颗粒(VLP)，即含有来自病毒外壳的某些蛋白质的小颗粒。病毒样颗粒不含有来自病毒的任何遗传物质，并且不可引起感染，但是它们可被构建成在其外壳上呈递肿瘤抗原。VLP可以源自各种病毒，诸如例如乙型肝炎病毒或其他病毒家族，包括细小病毒科(例如，腺相关病毒)、逆转录病毒科(例如，HIV)和黄病毒科(例如，丙型肝炎病毒)。
在一些方面，另外的治疗剂是基于肽的靶向疗法。肽可以结合至细胞表面受体或肿瘤周围受影响的细胞外基质。如果核素在细胞附近衰变，则附接到这些肽(例如，RGD)的放射性核素最终会杀死癌细胞。这些结合基序的寡聚体或多聚体尤其令人感兴趣，因为这可导致增强的肿瘤特异性和亲合力。
VII.用于疗法中的试剂盒
本公开还提供了用于针对疾病或病症(诸如癌症(例如，黑色素瘤、肺癌、结直肠癌或肾细胞癌))的免疫疗法和/或治疗或降低疾病或病症(例如，癌症)的风险的试剂盒。在一些方面，试剂盒包括一个或多个容器，该容器包含本文所描述的任何多核苷酸、复制子(例如，VEE复制子)、纳米颗粒和/或药物组合物。
在一些方面，试剂盒包含根据本文所描述的任何方法使用的说明书。例如，所包括的说明书可包括施用本文所描述的多核苷酸、复制子(例如，VEE复制子)、纳米颗粒和/或药物组合物以治疗目标疾病、延迟其发作或减轻目标疾病的描述。在一些方面，说明书包括向有目标疾病/病症(例如，癌症)风险的受试者施用本文所描述的多核苷酸、复制子(例如，VEE复制子)、纳米颗粒和/或药物组合物的描述。
在一些方面，说明书包括剂量信息、给药时间表和施用途径。在一些方面，容器是单位剂量、散装包装(例如多剂量包装)或亚单位剂量。在一些方面，说明书是标签或包装插页(例如，试剂盒中包含的纸片)上的书面说明书。在一些方面，说明书是机器可读说明书(例如，在磁性或光学存储盘上携带的说明书)。
在一些方面，标签或包装插页表明本文公开的组合物用于治疗、延迟发作和/或缓解与癌症相关的疾病或病症，例如本文所描述的那些。可以提供用于实践本文所描述的任何方法的说明书。
在一些方面，本文所描述的试剂盒采用合适的包装。在一些方面，合适的包装包括小瓶、瓶子、罐子、软包装(例如密封Mylar或塑料袋)或其组合。在一些方面，包装包括与特定装置例如吸入器、鼻施用装置(例如，雾化器)或输注装置例如微型泵组合使用的包装。在一些方面，试剂盒包含无菌进入端口(例如，容器可以是具有通过皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。在一些方面，容器还可以具有无菌进入端口(例如，容器可以是具有通过皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。在一些方面，至少一种活性剂是如本文所描述的组合物。
在一些方面，试剂盒还包含另外的组分，如缓冲液和解释信息。在一些方面，试剂盒包含容器和在该容器上或与该容器相关联的标签或包装插页。在一些方面，本公开提供了包含本文所描述的试剂盒的内容物的制品。
一般技术
除非另有说明，否则本公开的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，这些技术在本领域的技术范围内。MolecularCloning: A Laboratory Manual,第二版(Sambrook等人, 1989)Cold Spring HarborPress；Oligonucleotide Synthesis(M.J. Gait编辑, 1984)；Methods in MolecularBiology, Humana Press；Cell Biology: A Laboratory Notebook(J. E. Cellis编辑,1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R. I. Freshney编辑, 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P. Mather和P.E. Roberts, 1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures(A. Doyle, J.B.Giffiths和D.G. Newell编辑, 1993-8)J. Wiley and Sons；Method of Enzymology(Academic Press, Inc.)；Handbook of Experimental Immunology(D.M. Weir和C.C.Blackwell编辑)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M. Miller和M.P.Calos编辑, 1987)；Current Protocols in Molecular Biology(F.M. Ausubel等人编辑,1987): PCR: The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编辑, 1994)；CurrentProtocols in Immunology(J.E. Coligan等人编辑, 1991)；Short Protocols inMolecular Biology(Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology(C.A. Janeway和P.Travers, 1997)；Antibodies(P. Finch, 1997)；Antibodies: a practical approach(D.Catty编辑, IRL Press, 1988-1989)；Monoclonal antibodies: a practical approach(P. Shepherd和C. Dean编辑, Oxford University Press, 2000)；Using antibodies: alaboratory manual(E. Harlow和D. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999)；The Antibodies(M. Zanette和J.D. Capra,编辑, Harwood AcademicPublishers, 1995)。无需进一步阐述，据信，基于以上描述，本领域技术人员可以最大程度地利用本公开。本文引用的所有出版物(包括上文和本公开中别处列出的那些)通过引用以其整体并入。
实施例
实施例1：RNA回路构建和表达分析
为了评估本文所描述的多核苷酸减少组织特异性和/或免疫细胞特异性有效载荷表达的能力，在计算机中设计了自我复制RNA回路，其编码有效载荷与免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器)。RNA回路的示意图在图4中提供。如图5中所示，该自我复制RNA回路设计模拟了有效载荷在肿瘤细胞中的受控表达(即，低免疫细胞特异性标志物表达)与在脾细胞中的减少表达(即，较高的免疫细胞特异性标志物表达)。图5中提供的结果证实，基于组织内脾脏特异性和/或免疫细胞特异性标志物的水平，上述RNA回路模拟了有效载荷表达。为了证实这些计算机预测，将上述回路装载到脂质纳米颗粒(LNP)中并全身施用于小鼠。如图6A和6B中所示，有效载荷表达在脾脏(如本文所描述，其包含大量免疫细胞)中特异性地减少，但在其他非脾脏组织(即，肺，已知例如与脾脏相比，其包含较少的免疫细胞)中则并非如此。
为了进一步评估本文所描述的多核苷酸，向小鼠施用包含以下之一的脂质纳米颗粒(LNP)：(a)包含仅编码IL-12的mRNA (即，不具有免疫细胞去靶向传感器(例如，无脾脏去靶向传感器，例如，无miR-142传感器)的非回路化的mRNA)的VEE复制子和(b)包含编码IL-12并且包含免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的mRNA (即，回路化的mRNA)的VEE复制子。LNP以两种不同的剂量施用：0.1 mg/kg (低剂量)和0.3 mg/kg (高剂量)。对照动物接受单独的PBS。然后，在施用后6小时、24小时和264小时评估脾脏和血清中IL-12和IFN-γ的表达。预期脾脏内的IL-12表达减少将导致IL-12分泌降低和血清内的水平降低。
如图1A、7B和7C中所示，在施用后6小时，接受不具有免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的LNP (即，非回路化的mRNA)的小鼠在脾脏内以及血清中表现出显著的IL-12蛋白水平。相比之下，在接受具有免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的LNP (即，回路化的mRNA)的小鼠中，IL-12蛋白水平显著降低，并且与PBS对照动物的水平更加相当。在施用后24和264小时，IL-12蛋白表达在所有动物中均开始回到基础水平(在脾脏以及血清两者中) (与PBS处理的对照动物相当)。关于IFN-γ水平(IL-12的下游效应，例如，在IL-12暴露时，免疫细胞诸如树突状细胞产生IFN-γ)，一般趋势类似于上文针对IL-12所描述(例如，在施用后6小时，与接受非回路化的mRNA的动物相比，接受回路化的mRNA的动物的脾脏和血清中的IFN-γ水平降低)。图1B、7E和7F。在施用后24小时仍观察到IFN-γ水平的差异。在接受不具有免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的LNP的小鼠中，脾脏内仍然存在明显较高水平的IFN-γ。
然后，在不同的细胞类型上评估miR-142表达，包括免疫和非免疫细胞(即，A549、BT-20、HeLa、HEK293T、HEK293、CD3+ T、CD4+ T、CD8+ T、CD14+单核细胞、CD19+ B、CD56+ NK和B16F10)。如图10中所示，miR-142表达通常在癌细胞(例如，A549)中低，而在免疫细胞(例如，CD19+ B细胞)中高。
接下来，为了评估上述多核苷酸是否对其他免疫细胞有影响，将人库普弗细胞(即，肝脏巨噬细胞)用包含编码萤火虫萤光素酶而不具有免疫细胞去靶向传感器(例如，无脾脏去靶向传感器，例如，无miR-142传感器)的mRNA的VEE复制子(“Rep-Fluc”)或包含编码萤火虫萤光素酶的具有本文所描述的免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的mRNA的VEE复制子(“Rep-Fluc-miRNA传感器”)处理。然后，评估荧光素酶表达。与上述数据一致并且如图11中所示，与用Rep-Fluc处理的细胞中的有效载荷表达相比，用Rep-Fluc-miRNA传感器处理的人库普弗细胞中的有效载荷表达减少大约35倍。
图14类似地显示，与对照相比，miR-142传感器去靶向T细胞中的有效载荷(即，报告基因)表达。
这些结果表明，上述RNA回路可以去靶向免疫细胞(例如，肝脏巨噬细胞和T细胞)中的报告基因有效载荷表达。不受任何一种理论的束缚，以上结果表明，在脾脏中观察到的有效载荷表达减少不一定局限于脾脏，并且类似的影响可以发生在其他包含免疫细胞的组织(例如，其他淋巴组织，诸如本文所描述的那些)中。
实施例2：小鼠中的毒性分析
为了评估在实施例1中观察到的IL-12的表达减少是否对毒性有任何影响，将上述LNP再次施用于小鼠(如实施例1中所描述)，然后在约10天的过程中监测体重。
如图2、7A和7D中所示，在接受具有免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的LNP (即，回路化的mRNA)的小鼠中，与接受不具有免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的对应LNP (即，非回路化的mRNA)的小鼠相比，体重减轻大大降低。与较低剂量相比，体重差异在较高剂量下明显得多(参见，例如，图7A和7B)。这些结果证实在实施例1中观察到的IL-12表达减少与降低的总体毒性相关。
实施例3：抗肿瘤活性的分析
为了评估本文所描述的多核苷酸(例如，具有免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的RNA回路(即，回路化的mRNA))的特异性和效力，向小鼠皮下植入B16-F10黑色素瘤细胞。一旦肿瘤在动物体内发展，就静脉内施用上述LNP(参见实施例2)。然后定期测量肿瘤体积，持续30天。还在施用后6和24小时评估肿瘤和脾脏中的IL-12水平。
如图8A中所示，接受具有免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的LNP (即，回路化的mRNA)的小鼠与接受不具有免疫细胞去靶向传感器(例如，无脾脏去靶向传感器，例如，无miR-142传感器)的LNP (即，非回路化的mRNA)的小鼠相比具有相似的肿瘤控制，并且与PBS对照相比，两种LNP均赋予增强的肿瘤控制。关于IL-12蛋白水平，接受具有免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的LNP (即，回路化的mRNA)的小鼠与接受不具有免疫细胞去靶向传感器(例如，无脾脏去靶向传感器，例如，无miR-142传感器)的对应LNP (即，非回路化的mRNA)的小鼠相比在肿瘤中具有相似的IL-12水平。参见图8B。这与先前所描述的结果一致并且证实免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)在肿瘤内具有最小活性(其表达低至无miR-142-3p表达)。相反，如图8C中所示，相对于不具有免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的对应LNP (即，非回路化的mRNA)，接受具有免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的LNP (即，回路化的mRNA)的小鼠在脾脏中具有较低的IL-12蛋白水平。
上述结果证明了本文所描述的多核苷酸的特异性和抗肿瘤能力。
实施例4：非人灵长类动物中的表达分析
为了证实上文在实施例1-3中描述的在小鼠中观察到的结果，产生表1 (以下)中所示的四种构建体。构建体#1包括编码IL-12的经修饰的mRNA (即，非自我复制的)并且缺乏任何组织特异性传感器(即，无免疫细胞去靶向传感器(例如，无脾脏去靶向传感器，例如，无miR-142传感器))。构建体#2包括编码IL-12的经修饰的mRNA (即，非自我复制的)并且包括两种不同的组织特异性传感器：(i)识别在脾脏中表达的标志物的传感器(免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器))和(ii)识别在肝脏中表达的标志物的传感器(肝脏去靶向传感器)。如本公开中所描述，预期免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)和肝脏去靶向传感器将分别减少或抑制脾脏和肝脏内IL-12蛋白的表达。构建体#3包括包含编码IL-12的mRNA的VEE复制子(即，自我复制的)并且缺乏任何组织特异性传感器(即，无免疫细胞去靶向传感器(例如，无脾脏去靶向传感器，例如，无miR-142传感器))。构建体#4包括包含编码IL-12的mRNA的VEE复制子(即，自我复制的)并且包括免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)。
表1. LNP构建体
将以上构建体装载到单独的纳米颗粒中并静脉内施用于非人灵长类动物。然后，在血浆中观察IL-12和IFN-γ水平。
如图3A和表2中所示，在接受构建体#1 (即，编码IL-12而不具有任何免疫细胞去靶向传感器(例如，无脾脏去靶向传感器，例如，无miR-142传感器)的经修饰的mRNA)的动物中，在血浆中观察到高IL-12蛋白水平。有趣的是，与接受构建体#1的动物相比，在接受构建体#2 (即，编码IL-12的具有免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)和肝脏标志物传感器的经修饰的mRNA)的动物中，IL-12水平仅略有降低。事实上，与接受包括VEE复制子但无免疫细胞去靶向传感器(例如，无脾脏去靶向传感器，例如，无miR-142传感器)的构建体#3的动物相比，接受构建体#2的动物中的IL-12水平更高。在接受构建体#4 (即，编码IL-12并且包含免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的VEE复制子)的动物中观察到IL-12水平的最大降低。如在接受构建体#3或构建体#4的动物之间所比较的，在接受具有免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的LNP (即，构建体#4)的动物中，IL-12水平的Cmax降低155倍并且AUC降低200倍。
如在小鼠中观察到的，当在非人灵长类动物的血浆中评估IFN-γ水平时，一般趋势是相似的(参见图3B和表3)。同样，如在接受构建体#3或构建体#4的动物之间所比较的，在接受具有脾脏去靶向传感器的LNP (即，构建体#4)的动物中，IFN-γ水平的Cmax降低18倍并且AUC降低32倍。
表2. IL-12药效动力学特性
表3. IFN-γ药效动力学特性
图12提供了静脉内递送负载有以下之一的脂质纳米颗粒后非人灵长类动物的脾脏、肠系膜淋巴结(LN)、气管支气管LN、下颌LN、腋窝LN和骨髓IL-12表达的进一步比较：(a)mod-IL-12 (即，构建体#1)；(b) mod-IL-12-回路(即，构建体#2)；(c) rep-IL-12 (即，构建体#3)；和(d) rep-IL-12-回路(即，构建体#4)。所有所测试的组织的IL-12水平的结果与上述血清结果一致。同样，在接受构建体#4 (即，编码IL-12并且包含免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的VEE复制子)的动物中观察到IL-12的最大减少。这些结果证明了免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器) (尤其是与VEE的限制性复制组合)降低免疫细胞中的IL-12水平的能力。图13示出非人灵长类动物脾脏内的miR-142-3p表达；具体地，非人灵长类动物脾脏的白髓(含有淋巴细胞和巨噬细胞)内的miR-142-3p表达。
实施例5：癌细胞中的回路表达
为了确认实施例4中测试的构建体#3和构建体#4是否将转染人癌细胞，将含有构建体#3 (即，非回路化的mRNA)和构建体#4 (即，回路化的mRNA)的LNP施用于细胞培养物中的患者来源的乳腺癌类器官或A549细胞。
如图9A和图9B中所示，与构建体#3 (即，非回路化的mRNA)的LNP递送相比，含有构建体#4 (即，回路化的mRNA)的LNP导致患者来源的乳腺癌类器官和A549细胞(人非小细胞肺癌细胞系)中的hIL-12表达更高。该结果显示，在全身施用后在NHP中具有较低的循环hIL-12和IFN-γ表达的回路化的构建体(即，免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)) (参见实施例4)同样在癌症类器官或A549癌细胞中产生hIL-12的稳健表达。图15A和15B进一步证明有效载荷表达在缺乏miR-142表达的癌细胞(即，A549和B16.F10)中得以保留。具体地，在A549细胞中，与用包含编码有效载荷的mRNA但缺乏miR-142传感器的构建体(参见图15A中的无miR组)处理的对应细胞相比，用包含编码有效载荷的mRNA和miR-142传感器的构建体(参见图15A中的hsa-mir142-3p组)处理未减少有效载荷(即，发光)表达。类似地，在B16.F10细胞(鼠黑色素瘤细胞系)中，与用包含编码IL-12的mRNA但缺乏miR-142传感器的构建体(参见图15B中的无传感器组)处理的对应细胞相比，用包含编码IL-12的mRNA和miR-142传感器的构建体(参见图15B中的hsa-miR-142-3p传感器组)处理的细胞中的mIL-12表达没有减少。以上数据证明miR-142传感器能够下调免疫细胞(其表达miR-142)中的有效载荷表达，但不能下调癌细胞(其缺乏miR-142表达)中的有效载荷表达，突出了本文所描述的免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的特异性。
总之，以上结果证明本文所描述的多核苷酸(例如，其包含编码有效载荷的第一区域和包含脾脏去靶向传感器的第二区域)可以选择性地减少所编码的有效载荷在脾脏和其他免疫细胞内的表达。上述结果进一步证明，通过使用本文所描述的自我复制的复制子，例如，VEE复制子(参见，例如图16)，可以大大改善观察到的特异性。
表4.示例性VEE复制子序列
表5.另外的示例性序列
实施例6：巨噬细胞中的MIR-142活性加上使用MIR-抑制剂的特异性控制
为了进一步评估本文提供的免疫去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)的特异性，使用miRNA抑制剂来调控细胞中的miR-142-3p表达。简单地说，将包含编码萤火虫荧光素酶(Fluc)的mRNA和miR-142传感器(具有传感器的Rep)或不具有这种传感器(不具有传感器的Rep)的VEE复制子(Rep)转染到表达高水平miR-142-3p的RAW264.7巨噬细胞中。将一些细胞用靶向miR-142-3p的miRNA抑制剂(抗miR-142-3p)或阴性对照miRNA抑制剂(抗cel-miR-67)共转染。在不存在任一miRNA抑制剂(0 pmol/孔)的情况下，miR-142传感器阻遏Fluc有效载荷的表达(参见图17中的第二和第四黑色条柱)。然而，用三种剂量的抗miR-142-3p中的任一者共转染(参见图17中的0.125、1.25和12.5pmol/孔组中的每一个中的第二条柱)消除这种阻遏，而抗cel-miR-67则没有(参见图17中的0.125、1.25和12.5 pmol/孔组中的每一个中的第四条柱)。
这些结果进一步证明本文提供的免疫细胞去靶向传感器(例如，脾脏去靶向传感器，例如，miR-142传感器)对miR-142-3p活性的特异性响应
应当理解，意图使用具体实施方式部分而非发明内容以及摘要部分来对权利要求进行解释。发明内容和摘要部分可阐明如诸位发明人所构想的本公开的一个或多个但非所有的示例性方面，并且因此，并不意图通过任何方式对本公开和所附权利要求进行限制。
本公开已经在上文中借助于说明特定功能的实施及其关系的功能性结构单元进行了描述。为了方便描述，本文已对这些功能构建块的边界进行任意界定。也可限定替代边界，只要指定功能及其相互关系被适当地执行。
具体方面的前述描述将充分地揭示本公开的一般特性，以使得其它人通过应用本领域中的知识，在无过度实验且不背离本公开的一般概念的情况下，可容易地针对各种应用对此类具体方面进行修改和/或改变。因此，基于本文呈现的教义和指导，此类改变和修改意图在所公开方面的等效物的含义和范围内。应了解，本文的措辞或术语是出于描述而非限制的目的，以使得本说明书的术语或措辞应由熟练的技术人员根据教义和指导进行解释。
本公开的广度和范围不应受任何上述示例性方面的限制，而应仅根据以下权利要求及其等同物来限定。

Claims (65)

1.一种分离的多核苷酸，其包含(a)编码有效载荷的第一区域和(b)包含能够特异性识别由免疫细胞表达的标志物的传感器(免疫细胞去靶向传感器)的第二区域，其中与参考细胞(例如，非免疫细胞)相比，所述免疫细胞去靶向传感器对所述标志物的识别导致所述有效载荷的表达减少。
2.如权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中所述免疫细胞包括造血干细胞和/或其衍生物。
3.如权利要求1或2所述的分离的多核苷酸，其中所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞或它们的组合。
4.如权利要求1至3中任一项所述的分离的多核苷酸，其中与非淋巴组织相比，所述免疫细胞在淋巴组织内以更大的量存在。
5.如权利要求4所述的分离的多核苷酸，其中与所述非淋巴组织的对应值相比，所述淋巴组织内存在的所述免疫细胞的数量大于约1倍、大于约2倍、大于约3倍、大于约4倍、大于约5倍、大于约6倍、大于约7倍、大于约8倍、大于约9倍、大于约10倍或更多。
6.如权利要求4或5所述的分离的多核苷酸，其中所述淋巴组织包括脾脏、淋巴结或两者。
7.如权利要求1至6中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述第二区域包含多个免疫细胞去靶向传感器。
8.如权利要求7所述的分离的多核苷酸，其中所述多个免疫细胞去靶向传感器中的每一个是相同的。
9.如权利要求7所述的分离的多核苷酸，其中所述多个免疫细胞去靶向传感器中的一个或多个是不同的。
10.如权利要求1至9中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述标志物包括微小RNA。
11.如权利要求10所述的分离的多核苷酸，其中所述微小RNA包括miR-142。
12.如权利要求1至11中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述有效载荷包括细胞因子、配体结合蛋白或两者。
13.如权利要求12所述的分离的多核苷酸，其中所述细胞因子包括白介素(IL)-12蛋白。
14. 如权利要求1至13中任一项所述的分离的多核苷酸，其还包含：(1)内部核糖体进入位点(IRES)，(2)非翻译区(UTR)，(3)编码信号肽的序列，(4)翻译起始序列，(5)聚A序列，(6)编码RNA结合蛋白的序列，(7) 5'-帽，(8)编码2A核糖体跳跃肽的序列，(9)翻译增强子元件，或(10) (1)至(9)的任何组合。
15.一种分离的多核苷酸，其包含(a)编码有效载荷的第一区域和(b)包含能够特异性识别在脾脏内表达的标志物的传感器(脾脏去靶向传感器)的第二区域，并且其中所述脾脏去靶向传感器对所述标志物的识别减少所述有效载荷的表达。
16.如权利要求15所述的分离的多核苷酸，其中所述标志物包括微小RNA。
17.如权利要求16所述的分离的多核苷酸，其中所述微小RNA包括miR-142。
18.如权利要求15至17中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述有效载荷包括细胞因子、配体结合蛋白或两者。
19.如权利要求18所述的分离的多核苷酸，其中所述细胞因子包括白介素(IL)-12蛋白。
20.如权利要求15至19中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述第二区域包含多个脾脏去靶向传感器。
21.如权利要求20所述的分离的多核苷酸，其中所述多个脾脏去靶向传感器中的每一个是相同的。
22.如权利要求20所述的分离的多核苷酸，其中所述多个脾脏去靶向传感器中的一个或多个是不同的。
23. 如权利要求1至22中任一项所述的分离的多核苷酸，其还包含：(1)内部核糖体进入位点(IRES)，(2)非翻译区(UTR)，(3)编码信号肽的序列，(4)翻译起始序列，(5)聚A序列，(6)编码RNA结合蛋白的序列，(7) 5'-帽，(8)编码2A核糖体跳跃肽的序列，(9)翻译增强子元件，或(10) (1)至(9)的任何组合。
24.一种合成回路，其包含如权利要求1至23中任一项所述的分离的多核苷酸。
25.一种合成回路，其基本上由如权利要求1至23中任一项所述的分离的多核苷酸组成。
26.一种合成回路，其由如权利要求1至23中任一项所述的分离的多核苷酸组成。
27.一种复制子，其包含如权利要求1至23中任一项所述的分离的多核苷酸或如权利要求24至26中任一项所述的合成回路，其中所述复制子是自我复制的。
28.如权利要求27所述的复制子，其衍生自甲病毒。
29.如权利要求28所述的复制子，其中所述甲病毒包括委内瑞拉马脑炎(VEE)病毒。
30.一种纳米颗粒，其包含(a)如权利要求1至23中任一项所述的分离的多核苷酸、如权利要求24至26中任一项所述的合成回路或如权利要求27至29中任一项所述的复制子，和(b)脂质和/或脂质样材料。
31.如权利要求30所述的纳米颗粒，其中所述脂质包括可电离脂质、阳离子脂质、类脂质、非阳离子辅助脂质、磷脂、甾醇或其他结构脂质或它们的组合。
32. 如权利要求31所述的纳米颗粒，其中所述可电离脂质包括((4-羟基丁基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯) (ALC-0315)、8-((2-羟基乙基)(6-氧代-6-(十一烷基氧基)己基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(SM-102)、8-((2-羟基乙基)(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(脂质5)、9-((4-(二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)-壬-2-烯-1-基)酯(L319)、3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4-三(十二烷基)-1-哌嗪乙胺(KL10)、Nl-[2 (双十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三(十二烷基) 1,4-哌嗪二乙胺(KL22)、14,25-双十三烷基-15,18,21,24-四氮杂-三十八烷(KL25)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、三十七烷-6,9,28,31-四烯-19-基-4-(二甲基氨基)丁酸酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环(DLin-KC2-DMA)、1,2-二油氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DODMA)、2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA)、(2R)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA (2R))和(2S)-2-({8-[(3β)-胆甾-5-烯-3-基氧基]辛基}氧基)-N,N-二甲基-3-[(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基]丙-1-胺(辛基-CLinDMA (2S))或它们的组合。
33. 如权利要求31所述的纳米颗粒，其中所述阳离子脂质包括l,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)、脂质体转染试剂、N-[l-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵(DOTMA)、l-[2-(油酰氧基)乙基]-2-油基-3-(2-羟乙基)氯化咪唑鎓(DOTEVI)、2,3-二油氧基-N-[2 (精胺甲酰氨基)乙基]-N,N-二甲基-l-三氟乙酸丙铵(DOSPA)、N,N-二硬脂酰-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(l,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、N-(l,2-二油酰氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DORIE)、N,N-二油基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、l,2-二月桂酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DLePC)、l,2-二硬脂酰-3-三甲基铵-丙烷(DSTAP)、l,2-二棕榈酰-3-三甲基铵-丙烷(DPTAP)、l,2-二亚油酰-3-三甲基铵-丙烷(DLTAP)、l,2-二肉豆蔻酰-3-三甲基铵-丙烷(DMTAP)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DSePC)、l,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DPePC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DMePC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DOePC)、l,2-二-(9Z-十四碳烯酰基)-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(14: 1 EPC)、l-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(16:0-18: 1 EPC)或它们的任何组合。
34. 如权利要求31所述的纳米颗粒，其中所述类脂质包括1,1′-((2-(4-(2-((2-(双(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)(2-羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪-1-基)乙基)氮烷二基)双(十二烷-2-醇) (C12-200)、3,6-双(4-(双(2-羟基十二烷基)氨基)丁基)哌嗪2,5-二酮(cKK-E12)、四(8-甲基壬基)3,3′,3″,3-(((甲基氮烷二基)双(丙烷-3,1-二基))双(氮烷三基))四丙酸酯(306Oi10)、G0-C14、5A2-SC8、3,6-双(4-(双((9Z,12Z)-2-羟基十八碳9,12-二烯-1-基)氨基)丁基)哌嗪-2,5-二酮(OF-02)、(((3,6-二氧代哌嗪-2,5-二基)双(丁烷-4,1-二基))双(氮烷三基))四(乙烷2,1-二基)(9Z,9′Z,9″Z,9Z,12Z,12′Z,12″Z,12Z)-四(十八碳-9,12-二烯酸酯) (OF-Deg-Lin)、(((3,6-二氧代哌嗪-2,5-二基)双(丁烷-4,1-二基))双(氮烷三基))四(丁烷-4,1-二基)(9Z,9′Z,9″Z,9Z,12Z,12′Z,12″Z,12Z)-四(十八碳-9,12-二烯酸酯) (OF-C4-Deg-Lin)、N1,N3,N5-三(3-(双十二烷基氨基)丙基)苯1,3,5-三甲酰胺(TT3)、六(辛-3-基) 9,9′,9″,9,9″″,9″-((((苯-1,3,5-三羰基)三(氮烷二基))三(丙烷-3,1-二基))三(氮烷三基))己基壬酸酯(FTT5)、PL-1、98N12-5、5,5-二((Z)-十七碳-8-烯-1-基)-1-(3-(吡咯烷-1-基)丙基)-2,5-二氢-1H-咪唑-2-甲酸乙酯(A2-Iso5-2DC18 (A2))、A12-Iso5-2DC18 (A12)或它们的任何组合。
35. 如权利要求31所述的纳米颗粒，其中所述磷脂选自由以下各项组成的组：1,2-二亚油酰-sn-甘油-3磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰-sn甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-双十一烷酰-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0二醚PC)、1-油酰-2-胆固醇基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16 Lyso PC)、1,2-二亚麻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0 PE)、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、鞘磷脂、1-肉豆蔻酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(14:0-16:0 PC，MPPC)、1-肉豆蔻酰-2硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(14:0-18:0 PC，MSPC)、1-棕榈酰2-乙酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-02:0 PC)、1-棕榈酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-14:0 PC，PMPC)、1-棕榈酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-18:0 PC，PSPC)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-18:1 PC，POPC)、1-棕榈酰-2-亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-18:2PC，PLPC)、1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(16:0-20:4 PC)、1-棕榈酰-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(14:0-22:6 PC)、1-硬脂酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-14:0 PC，SMPC)、1-硬脂酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-16:0PC，SPPC)、1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-18:1 PC，SOPC)、1-硬脂酰-2-亚油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-18:2 PC)、1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-20:4 PC)、1-硬脂酰-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0-22:6 PC)、1-油酰-2-肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-14:0 PC，OMPC)、1-油酰-2-棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-16:0 PC，OPPC)、1-油酰-2-硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:1-18:0PC，OSPC)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(16:0-18:1 PE，POPE)、1-棕榈酰-2-亚油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(16:0-18:2 PE)、1-棕榈酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(16:0-20:4 PE)、1-棕榈酰-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(16:0-22:6 PE)、1-硬脂酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:0-18:1 PE)、1-硬脂酰-2-亚油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:0-18:2 PE)、1-硬脂酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:0-20:4 PE)、1-硬脂酰-2-二十二碳六烯酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(18:0-22:6PE)、1-油酰-2-胆固醇基半琥珀酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)以及它们的任何组合。
36.如权利要求31所述的纳米颗粒，其中所述甾醇包括胆固醇、粪甾醇、谷甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇、番茄碱、番茄苷、熊果酸、α-生育酚以及它们的组合。
37.如权利要求31所述的纳米颗粒，其中所述脂质和/或脂质样材料是聚乙二醇化的。
38.如权利要求30至37中任一项所述的纳米颗粒，其还包含靶向配体。
39.一种药物组合物，其包含(a)如权利要求1至23中任一项所述的分离的多核苷酸、如权利要求24至26中任一项所述的合成回路、如权利要求27至29中任一项所述的复制子、如权利要求30至38中任一项所述的纳米颗粒，和(b)药学上可接受的载剂。
40. 一种减少有需要的受试者的免疫细胞内的有效载荷的表达(有效载荷表达)的方法，其包括向所述受试者施用(a)如权利要求1至23中任一项所述的分离的多核苷酸，(b)如权利要求24至26中任一项所述的合成回路，(c)如权利要求27至29中任一项所述的复制子，(d)如权利要求30至38中任一项所述的纳米颗粒，(e)如权利要求39所述的药物组合物，或(f) (a)至(e)的任何组合。
41. 如权利要求40所述的方法，其中与参考受试者(例如，接受缺乏所述免疫细胞去靶向传感器的对应多核苷酸的受试者)相比，减少所述有效载荷表达包括(a)减少由所述免疫细胞表达的有效载荷的量，(b)减少所述免疫细胞的有效载荷表达的持续时间，或(c) (a)和(b)两者。
42.如权利要求41所述的方法，其中在所述施用后，与所述参考受试者相比，由所述免疫细胞表达的有效载荷的量减少至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或约100%。
43.如权利要求41或42所述的方法，其中在所述施用后，与所述参考受试者相比，所述免疫细胞的所述有效载荷表达的所述持续时间减少至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或约100%。
44.如权利要求40至43中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞包括T细胞、巨噬细胞或两者。
45. 一种在有需要的受试者的非免疫细胞中选择性表达有效载荷的方法，其包括向所述受试者施用(a)如权利要求1至23中任一项所述的分离的多核苷酸，(b)如权利要求24至26中任一项所述的合成回路，(c)如权利要求27至29中任一项所述的复制子，(d)如权利要求30至38中任一项所述的纳米颗粒，(e)如权利要求39所述的药物组合物，或(f) (a)至(e)的任何组合。
46. 如权利要求45所述的方法，其中在所述施用后，与所述受试者的所述免疫细胞中的对应的量和/或持续时间相比，(a)在所述非免疫细胞中表达的所述有效载荷的量，(b)所述非免疫细胞中的所述有效载荷的表达的持续时间，或(c) (a)和(b)两者均增加。
47. 一种减少有需要的受试者的淋巴组织内的有效载荷的表达(有效载荷表达)的方法，其包括向所述受试者施用(a)如权利要求1至23中任一项所述的分离的多核苷酸，(b)如权利要求24至26中任一项所述的合成回路，(c)如权利要求27至29中任一项所述的复制子，(d)如权利要求30至38中任一项所述的纳米颗粒，(e)如权利要求39所述的药物组合物，或(f) (a)至(e)的任何组合。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述淋巴组织包括脾脏、淋巴结或两者。
49. 如权利要求47或48所述的方法，其中与参考受试者(例如，接受缺乏所述免疫细胞去靶向传感器的对应多核苷酸的受试者)相比，减少所述有效载荷表达包括(a)减少在所述淋巴组织中表达的有效载荷的量，(b)减少所述淋巴组织中的有效载荷表达的持续时间，或(c) (a)和(b)两者。
50.如权利要求49所述的方法，其中在所述施用后，与所述参考受试者相比，在所述淋巴组织中表达的有效载荷的量减少至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或约100%。
51.如权利要求49或50所述的方法，其中在所述施用后，与所述参考受试者相比，所述淋巴组织中的所述有效载荷表达的所述持续时间减少至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或约100%。
52. 一种减少有需要的受试者的脾脏内的有效载荷的表达(有效载荷表达)的方法，其包括向所述受试者施用(a)如权利要求1至23中任一项所述的分离的多核苷酸，(b)如权利要求24至26中任一项所述的合成回路，(c)如权利要求27至29中任一项所述的复制子，(d)如权利要求30至38中任一项所述的纳米颗粒，(e)如权利要求39所述的药物组合物，或(f)(a)至(e)的任何组合。
53. 如权利要求52所述的方法，其中与参考受试者(例如，接受缺乏所述脾脏去靶向传感器的对应多核苷酸的受试者)相比，减少所述有效载荷表达包括(a)减少在脾脏中表达的有效载荷的量，(b)减少脾脏中的有效载荷表达的持续时间，或(c) (a)和(b)两者。
54.如权利要求53所述的方法，其中在所述施用后，与所述参考受试者相比，在脾脏中表达的有效载荷的量减少至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或约100%。
55.如权利要求54所述的方法，其中在所述施用后，所述有效载荷不在所述脾脏中表达。
56.如权利要求53或54所述的方法，其中在所述施用后，与所述参考受试者相比，脾脏中的所述有效载荷表达的所述持续时间减少至少约5%、至少约10%、至少约20%、至少约30%、至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或约100%。
57. 一种在有需要的受试者的非淋巴组织中选择性表达有效载荷的方法，其包括向所述受试者施用(a)如权利要求1至23中任一项所述的分离的多核苷酸，(b)如权利要求24至26中任一项所述的合成回路，(c)如权利要求27至29中任一项所述的复制子，(d)如权利要求30至38中任一项所述的纳米颗粒，(e)如权利要求39所述的药物组合物，或(f) (a)至(e)的任何组合。
58. 如权利要求57所述的方法，其中在所述施用后，与所述受试者的脾脏中的对应的量和/或持续时间相比，(a)在所述非淋巴组织中表达的所述有效载荷的量，(b)所述非脾脏组织中的所述有效载荷的表达的持续时间，或(c) (a)和(b)两者均增加。
59. 一种在有需要的受试者的非脾脏组织中选择性表达有效载荷的方法，其包括向所述受试者施用(a)如权利要求1至23中任一项所述的分离的多核苷酸，(b)如权利要求24至26中任一项所述的合成回路，(c)如权利要求27至29中任一项所述的复制子，(d)如权利要求30至38中任一项所述的纳米颗粒，(e)如权利要求25所述的药物组合物，或(f) (a)至(e)的任何组合。
60. 如权利要求59所述的方法，其中在所述施用后，与所述受试者的脾脏中的对应的量和/或持续时间相比，(a)在所述非脾脏组织中表达的所述有效载荷的量，(b)所述非脾脏组织中的所述有效载荷的表达的持续时间，或(c) (a)和(b)两者均增加。
61. 一种治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，其包括向所述受试者施用(a)如权利要求1至23中任一项所述的分离的多核苷酸，(b)如权利要求24至26中任一项所述的合成回路，(c)如权利要求27至29中任一项所述的复制子，(d)如权利要求30至38中任一项所述的纳米颗粒，(e)如权利要求39所述的药物组合物，或(f) (a)至(e)的任何组合。
62.如权利要求61所述的方法，其中所述疾病或病症包括癌症、炎性病症、单基因病症、神经病症、精神病症或它们的组合。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述癌症包括黑色素瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞状细胞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝肿瘤、胃癌、头颈癌或它们的组合。
64.如权利要求40至63中任一项所述的方法，其中所述分离的多核苷酸、所述合成回路、所述复制子、所述纳米颗粒和/或所述药物组合物经由静脉内、肿瘤内、鞘内、肌内、皮下、吸入、皮内、淋巴内、眼内、腹膜内、胸膜内、脊柱内、血管内、经鼻、经皮、舌下、粘膜下、透皮或经粘膜施用来施用于所述受试者。
65.如权利要求40至64中任一项所述的方法，还包括向所述受试者施用另外的治疗剂。
CN202480042549.9A 2023-07-25 2024-07-25 包含微小rna去靶向传感器的多核苷酸及其用途 Pending CN121398856A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202363515514P 2023-07-25 2023-07-25
US63/515,514 2023-07-25
US202463644296P 2024-05-08 2024-05-08
US63/644,296 2024-05-08
PCT/US2024/039618 WO2025024704A1 (en) 2023-07-25 2024-07-25 Polynucleotides comprising a micro rna detargeting sensor and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN121398856A true CN121398856A (zh) 2026-01-23

Family

ID=92409311

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202480042549.9A Pending CN121398856A (zh) 2023-07-25 2024-07-25 包含微小rna去靶向传感器的多核苷酸及其用途

Country Status (3)

Country Link
CN (1) CN121398856A (zh)
AU (1) AU2024299882A1 (zh)
WO (1) WO2025024704A1 (zh)

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US6015686A (en) 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
AU744755B2 (en) 1997-11-12 2002-03-07 Brigham And Women's Hospital The translation enhancer element of the human amyloid precursor protein gene
AU2001231171B2 (en) 2000-01-28 2007-01-04 The Scripps Research Institute Synthetic internal ribosome entry sites and methods of identifying same
JP5225087B2 (ja) 2005-08-24 2013-07-03 ザ スクリプス リサーチ インスティチュート 翻訳エンハンサーエレメント依存性のベクター系
SG188866A1 (en) 2007-12-11 2013-04-30 Scripps Research Inst Compositions and methods related to mrna translational enhancer elements
PL215513B1 (pl) 2008-06-06 2013-12-31 Univ Warszawski Nowe boranofosforanowe analogi dinukleotydów, ich zastosowanie, czasteczka RNA, sposób otrzymywania RNA oraz sposób otrzymywania peptydów lub bialka
WO2012009644A2 (en) 2010-07-16 2012-01-19 Arizona Board Of Regents Methods to identify synthetic and natural rna elements that enhance protein translation
JP2014511694A (ja) 2011-04-03 2014-05-19 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレーション ドゥーイング ビジネス アズ マサチューセッツ ジェネラル ホスピタル 修飾型ｒｎａ（ｍｏｄ−ｒｎａ）を使用する効率的なインビボタンパク質発現
SI2922554T1 (sl) * 2012-11-26 2022-06-30 Modernatx, Inc. Terminalno modificirana RNA
US11351271B2 (en) * 2014-09-08 2022-06-07 Massachusetts Institute Of Technology RNA-based logic circuits with RNA binding proteins, aptamers and small molecules
WO2018160540A1 (en) 2017-02-28 2018-09-07 Sanofi Therapeutic rna
MY207334A (en) 2019-03-08 2025-02-19 Massachusetts Inst Technology Synthetic oncolytic lnp-replicon rna and uses for cancer immunotherapy
AU2022205679A1 (en) 2021-01-08 2023-07-06 Strand Therapeutics Inc. Expression constructs and uses thereof
EP4355882A2 (en) * 2021-06-15 2024-04-24 Modernatx, Inc. Engineered polynucleotides for cell-type or microenvironment-specific expression

Also Published As

Publication number Publication date
AU2024299882A1 (en) 2026-01-08
WO2025024704A1 (en) 2025-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7561134B2 (ja) 合成腫瘍溶解性ｌｎｐレプリコンｒｎａおよびがん免疫治療のための使用
US20230295257A1 (en) Lipid nanoparticle comprising modified nucleotides
JP2019519516A (ja) がんの治療のためのｍＲＮＡ併用療法
CA3001003A1 (en) Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs
US20240166707A1 (en) Expression constructs and uses thereof
KR20240099279A (ko) Rna 분자
JP2018520155A (ja) ポリリボヌクレオチドをコードするａｔｐ結合カセットファミリーおよびその製剤
US12084703B2 (en) Synthetic self-amplifying mRNA molecules with secretion antigen and immunomodulator
KR20250021330A (ko) 원숭이두창 항원 전달을 위한 rna 조성물 및 관련 방법
Wei et al. Technological breakthroughs and advancements in the application of mRNA vaccines: a comprehensive exploration and future prospects
CN117043343A (zh) 用于突变型冠状病毒的核酸疫苗
US20250152737A1 (en) Lipid nanoparticles comprising venezuelan equine encephalitis (vee) replicon and uses thereof
CN121398856A (zh) 包含微小rna去靶向传感器的多核苷酸及其用途
KR20260003656A (ko) 합성 회로 및 이의 용도
RU2774677C2 (ru) Рнк для терапии рака
Brown Development of Genetic Medicines for the Treatment and Prevention of Infectious Disease, Cancer, and Aging
WO2026030275A1 (en) Rna molecules
JP2026501211A (ja) Ｂ型肝炎組成物
WO2025129137A1 (en) Two-component platform for trans amplifying rna (tarna) vaccination
HK40090392A (zh) 治疗性核酸分子、混合物、药物及在治疗实体瘤中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication