CN121338111A - 一种脱细胞基质气凝胶修复材料及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医用材料及组织工程领域，具体涉及一种脱细胞基质气凝胶修复材料及其制备方法与应用。进一步地，本发明涉及该材料的综合制备方法，特别是包含物理、化学及超临界流体等技术相结合的极低免疫原性脱细胞工艺，以及基于超临界干燥的独特气凝胶成型技术。更进一步的，本发明涉及该材料的应用，主要涉及软组织修复、医学美容、骨/软骨损伤修复领域。

Description

一种脱细胞基质气凝胶修复材料及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医用材料及组织工程领域，具体涉及一种脱细胞基质气凝胶修复材料及其制备方法，以及其在软组织修复、医学美容、骨/软骨损伤修复等领域中的应用。

背景技术

组织损伤修复与再生医学领域对外科植入材料的需求日益增长，尤其在医美塑形（如鼻整形）、骨及软骨修复等方面。理想的植入材料应具备良好的生物相容性、可降解性、适当的力学性能以提供支撑。

目前，临床常用的植入材料主要包括自体组织、异体/异种组织、人工合成材料等。自体组织（如自体软骨、自体骨）虽是“金标准”，但来源有限，会造成供区二次损伤。异体或异种组织则存在疾病传播风险和免疫排斥问题。人工合成材料（如聚乳酸、聚己内酯等）虽然可定制力学性能，但其生物惰性、降解产物可能引起的炎症反应等问题限制了其应用。

脱细胞基质（Decellularized Extracellular Matrix, dECM）材料为解决上述问题带来了希望。dECM通过去除组织中的细胞成分，保留了细胞外基质的天然成分和三维结构，具有良好的生物相容性和诱导再生能力。然而，现有的dECM材料仍面临两大核心挑战：

第一，免疫原性控制不彻底。传统的脱细胞方法（如单纯使用SDS或Triton X-100处理）可能无法完全去除细胞碎片、核酸、脂质等免疫原性物质，可能引发宿主免疫反应，影响修复效果并存在安全隐患。

第二，材料形式与性能的局限。常规的dECM补片等支架材料，其孔结构不均一、结构松散、机械性能不足，且往往需要使用化学交联剂来增强稳定性，这可能引入毒性并降低生物相容性；而dECM水凝胶存在力学强度差、体内降解快、难以预塑形等问题；dECM粉末微粒则不易塑形，且注射后易迁移。

因此，本领域迫切需要开发一种新型的dECM基材料，它必须满足：（1）具有极低的免疫原性，确保在较高浓度及强度下的植入安全；（2）具备优越的三维多孔结构和力学性能，支持细胞长入和组织再生；（3）可被精确雕刻塑形，适应外科手术需求；（4）降解性能可控，能与组织修复速率匹配。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述缺陷，提供一种免疫原性极低、生物安全性高、具有优良三维多孔结构且可外科手术雕刻的脱细胞基质气凝胶修复材料，其中所述气凝胶由极低免疫原性脱细胞基质制备而成。

本发明的目的还在于提供上述材料的一整套严谨、可重复的脱细胞基质气凝胶修复材料的制备方法。该方法通过一系列创新的工艺组合，确保在彻底去除细胞成分和免疫原性物质的同时，最大程度地保留细胞外基质的天然结构和生物活性，并最终通过超临界CO₂技术形成结构稳定的气凝胶。

进一步的，所述脱细胞基质气凝胶修复材料的制备方法包括如下步骤：

（1）制备极低免疫原性脱细胞基质；

（2）将步骤（1）所述极低免疫原性脱细胞基质进行粉碎，制备脱细胞基质微粒；

（3）将步骤（2）所述脱细胞基质微粒制备成脱细胞基质预凝胶；

（4）将步骤（3）所述脱细胞基质预凝胶制备成脱细胞基质气凝胶。

优选地，所述步骤（1）中极低免疫原脱细胞基质的制备方法包括一套综合处理流程：从原料预处理开始，经历反复冻融、低/高渗处理、系列有机溶剂（乙醇、甲醇/乙醚、丙酮）处理、过氧乙酸消毒、超临界CO₂流体渗透预处理、系列酶（胰蛋白酶）和去垢剂（TritonX-100, SDS, CHAPS,脱氧胆酸钠）处理、核酸酶处理，以及最终的彻底清洗。这一组合策略能系统性去除各类免疫原性物质，制备出极低免疫原性脱细胞基质。

更优选的，所述步骤（1）中极低免疫原性脱细胞基质的制备方法包括以下步骤：

1）将原料进行清洗、切割预处理；

2）对预处理后的材料进行反复冻融；

3）反复冻融后用低渗和/或高渗盐溶液处理；

4）在步骤3）之后依次用乙醇、甲醇/乙醚混合液、丙酮、过氧乙酸处理；

5）在步骤4）之后用超临界CO₂流体渗透处理；

6） 在步骤5）之后依次用胰蛋白酶、曲拉通X-100（TritonX-100）、十二烷基硫酸钠（SDS）、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐（CHAPS）、脱氧胆酸钠（SD）、核酸酶处理；

7）在步骤6）之后用生理盐水和/或磷酸盐缓冲液处理，之后用纯化水和/或无菌注射用水处理。

更优选的，所述步骤3)-4)或步骤6)-7)中各处理方式可使用浸润、震荡、灌注、超声中的一种或多种。

更优选的，步骤２）中所述反复冻融在-5℃以下和2℃以上两个温度区间进行反复冻融，不小于1个循环；

更优选的，步骤３）中所述用低渗和/或高渗盐溶液处理不少于10分钟；

更优选的，步骤４）中所述用乙醇处理不小于10分钟；和／或所述用甲醇/乙醚混合液处理不小于20分钟；和／或所述用丙酮处理不小于20分钟；和／或所述用过氧乙酸处理不小于10分钟；

更优选的，步骤５）中所述超临界CO₂流体渗透为用31.1℃的7.38MP超临界CO₂流体渗透不小于30分钟；

更优选的，步骤６）中所述用胰蛋白酶处理不小于10分钟；和／或所述用曲拉通X-100（TritonX-100）处理不小于30分钟；和／或所述用十二烷基硫酸钠（SDS）处理不小于30分钟；和／或所述CHAPS处理不小于30分钟；和／或所述用SD处理不小于30分钟；和／或所述用核酸酶处理不小于1小时；

更优选的，步骤７）中所述用生理盐水和/或磷酸盐缓冲液处理不小于30分钟；和／或所述用纯化水和/或无菌注射用水处理不小于30分钟。

更优选的，所述步骤（1）中极低免疫原性脱细胞基质原料来源于人或动物的器官、组织或细胞中的一种或多种。

根据本发明的另一方面，所述步骤（3）中脱细胞基质预凝胶的制备采用多酶分步酶解法：依次使用胶原酶、中性蛋白酶和胃蛋白酶进行消化，并通过精确调控pH（先碱化至≥8.5以永久失活胃蛋白酶，再回调至生理pH）和离子浓度，形成均一、稳定的预凝胶溶液。

优选的，所述步骤（3）中脱细胞基质预凝胶的制备方法包括以下步骤：

1）用胶原酶溶液于20~42℃震荡酶解脱细胞基质不小于20分钟，至无肉眼可见颗粒；

2）用中性蛋白酶溶液于20~42℃震荡酶解脱细胞基质，不小于20分钟，至无色或类白色黏液；

3）用含盐酸和/或乙酸的pH 1.5~2.5胃蛋白酶溶液于20~42℃震荡酶解脱细胞基质，不少于20分钟，裂解外源酶和/或其他免疫原性序列；

4）用氢氧化钠溶液调节酸性酶解液至pH≥8.5，失活胃蛋白酶；

5）用盐酸和/或乙酸调节碱性酶解液至pH 6.0~8.0；

6）用生理盐水和/或磷酸盐缓冲液调节酶解液至270~360 mOsmol/kg；

7）混匀并去除气泡，在20~37℃条件下静置不少于15分钟，得到脱细胞基质预凝胶。

根据本发明的另一方面，所述步骤（4）中脱细胞基质气凝胶的成型采用超临界CO₂技术：包括模具塑形、水洗脱盐、乙醇梯度脱水，最后利用超临界CO₂流体进行干燥。此方法避免了常规冷冻干燥可能导致的冰晶破坏和结构坍塌，并能实现无需化学交联剂的物理强化，从而获得多孔结构完整、力学性能增强且生物活性保留更好的气凝胶。

优选的，所述步骤（4）中脱细胞基质气凝胶的制备方法包括以下步骤：

1）将脱细胞基质预凝胶置于模具内，在20~37℃条件下静置不少于15分钟塑形，得到脱细胞基质凝胶块；

2）用无菌注射用水浸泡/透析脱细胞基质预凝胶，不少于2小时，期间换水不少于1次，以去除凝胶块中的盐分等小分子；

3）用50%、75%、90%、100%乙醇梯度浸泡脱细胞基质预凝胶，每种浓度不小于20分钟，以去除凝胶中的水分；

4）用40~50℃的10~14MPa超临界CO₂流体渗透不小于2小时，以去除凝胶中的乙醇，此步骤兼具除菌作用；

5）在40~120℃的5~10MPa CO₂中维持不小于2小时，得到脱细胞基质气凝胶。

该气凝胶具有多孔网状结构、极轻质、高强度、高生物相容性等特点。

根据本发明的另一方面，所述的脱细胞基质预凝胶的制备方法还可进一步使用交联剂，以增强材料性能；和/或可进一步复合羟基磷酸钙和／或合成高分子材料，以增强材料性能。

根据本发明的另一方面，本发明还提供一种脱细胞基质气凝胶修复材料，该脱细胞基质气凝胶修复材料由前述的脱细胞基质气凝胶修复材料的制备方法制备获得。

根据本发明的另一方面，本发明还提供一种极低免疫原脱细胞基质，其采用前述的极低免疫原性脱细胞基质的制备方法制备获得。

根据本发明的另一方面，提供一种该气凝胶修复材料，所述的脱细胞基质气凝胶修复材料的制备方法和/或所述的一种极低免疫原脱细胞基质在临床上的应用，特别是在对材料生物相容性和力学性能可调性要求较高的软组织修复、医学美容、骨/软骨损伤修复等领域的用途。优选的，在制备用于软组织修复、医学美容、骨/软骨损伤修复的材料中的用途。更优选的，所述材料为植入材料。更优选的，所述材料通过注射的方式使用。

本发明具有以下有益效果：

1. 极低的免疫原性：通过物理、化学、酶学和超临界流体技术相结合的综合脱细胞方案，能彻底清除细胞碎片、核酸、脂质等关键免疫原性物质，为安全植入奠定基础。DNA含量可低至0.11ng/mg干重的脱细胞基质，远低于常规制备技术。

2.优越的微观结构与力学性能：基于超临界CO₂干燥技术成型的气凝胶，具有高孔隙率、高比表面积和良好的三维互联网络结构，其力学强度可通过预凝胶浓度、模具塑形加压强度等进行调节，满足不同修复场景的需求。

3. 良好的生物相容性与降解性：材料源于天然ECM，且制备过程温和，最大程度保留了生物活性。体内外实验证明其细胞相容性好，降解速率可控，能与组织修复过程良好匹配。

4. 卓越的可加工性与临床适用性：材料为固态块状，易于使用手术刀或激光进行精细雕刻，实现个性化塑形，并通过手术精准植入，特别适用于鼻整形、骨缺损填充等需要复杂形状和稳定支撑的领域。

附图说明

图1：极低免疫原性真皮脱细胞基质。

图2：极低免疫原性肝脏脱细胞基质。

图3：常规肝脏脱细胞基质。

图4：脱细胞基质气凝胶。

图5：脱细胞基质气凝胶显微图（HE染色）。

图6：脱细胞基质气凝胶体外降解趋势图。

图7：体内植入材料引发炎症因子表达情况。

图8：脱细胞基质气凝胶用于鼻部整形效果图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明进行进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1极低免疫原性猪真皮与猪肝脏脱细胞基质的制备

1.极低免疫原性猪真皮脱细胞基质制备：

取新鲜猪皮，无菌条件下剔除皮下脂肪及毛发，用PBS溶液反复冲洗，切割成2cm× 3 cm的组织块。

(1) 反复冻融：组织块置于-80℃冻结2小时，随后转移至4℃融化2小时，此为一个循环，共进行2个循环。

(2) 渗透压处理：先用纯化水（低渗）震荡处理30分钟，再用1 M NaCl溶液（高渗）震荡处理30分钟。

(3) 系列溶剂处理：依次用75%乙醇震荡处理30分钟；甲醇:乙醚（1:1, v/v）混合溶液震荡处理1小时；丙酮震荡处理1小时。

(4) 消毒处理：用1%过氧乙酸溶液震荡处理30分钟。

(5)超临界CO₂处理：将过氧乙酸处理后的组织转移至超临界萃取装置，在31.1℃、7.38 MPa条件下，用超临界CO₂流体渗透处理1小时。

(6)酶与去垢剂系列处理：超临界CO₂处理后，依次用以下溶液在37℃摇床上震荡处理：0.25%胰蛋白酶溶液处理30分钟；1% Triton X-100溶液处理2小时；0.5% SDS溶液处理2小时；1% CHAPS溶液处理2小时；0.5%脱氧胆酸钠（SD）溶液处理2小时。每次处理后均用PBS彻底清洗。

(7) 核酸酶解： 酶与去垢剂系列处理后用含有50 U/mL DNase和1 U/mL RNase的PBS缓冲液，在37℃下酶解处理4小时。

(8) 终末清洗：核酸酶解后用PBS震荡清洗3次，每次30分钟；最后用无菌注射用水清洗2次，每次30分钟。

所得脱细胞真皮基质呈柔软白色（图1），经检测，DNA残留量为0.16 ng/mg干重（表1）。

2.极低免疫原性猪肝脏脱细胞基质制备：取新鲜猪肝脏，先用PBS浸润清洗。后续处理流程与猪真皮基本

相同，但因肝脏组织更脆弱，切成小块非最优选项，因其具有完整血管网络，用经血管灌注法可高效制得极低免疫原性猪肝脏脱细胞基质。脱细胞液和处理时间一致，肝基质处理方式是经血管灌注，真皮是切块后震荡。所得肝脏脱细胞基质呈柔软白色，局部细节图可见固有肝小叶形态基本完整（图2），经检测DNA残留量为0.11ng/mg干重（表1）。

实施例2常规脱细胞基质制备

以猪肝脏脱细胞基质为例。取新鲜猪肝脏，先用PBS浸润清洗。采用经血管灌注法进行脱细胞处理。灌注1%过氧乙酸30分钟进行病毒灭活，灌注1% Triton X-100溶液12小时，灌注1% SDS溶液24小时，在37℃恒温箱中灌注含有50 U/mL DNase和1 U/mL RNase的PBS缓冲液8小时，灌注PBS 1.5小时，灌注注射水1小时。所得肝脏脱细胞基质呈柔软暗白色，局部细节图可见固有肝小叶形态已开始塌陷破坏（图3），经检测DNA残留量为19.78ng/mg干重（表1），满足行业对脱细胞基质的基本要求（＜50ng/mg干重），但DNA残留量是本发明极低免疫原性肝脏脱细胞基质的179.82倍，在大浓度植入材料应用方面的风险增加。

实施例3脱细胞基质微粒的制备

将实施例1中制备的冻干猪真皮和猪肝脏脱细胞基质，分别使用

液氮预冷的冷冻研磨仪进行粉碎。粉碎后的粉末过60目筛网，收集得到粒径小于250微米的脱细胞基质微粒，分装备用。

实施例4脱细胞基质预凝胶及气凝胶的制备（以猪真皮为例，肝脏源操作步骤相同）

1. 预凝胶制备：

(1) 胶原酶解：将4.0g真皮脱细胞基质微粒悬浮于100 mL含有0.4%胶原酶（II型）的PBS中，37℃、150 rpm震荡消化1小时，至溶液均一无明显颗粒。

(2) 中性蛋白酶解：加入终浓度0.2%的中性蛋白酶，继续37℃震荡消化1小时，溶液变为均一粘稠液。

(3) 胃蛋白酶解：用1M HCl调节溶液pH至2.5，加入终浓度0.2%的胃蛋白酶，37℃震荡消化1小时。

(4) 预凝胶化：在冰浴下，用1M NaOH将溶液pH缓慢调至8.5，静置30分钟。再用1MHCl将pH回调至7.0。加入适量10X PBS调节溶液至生理渗透压，再按各步综合加液情况，将基质浓度调整至35mg/mL。将溶液去除气泡，37℃静置20分钟，形成均一的脱细胞基质预凝胶。

2. 气凝胶制备：

(1) 塑形与水洗：将预凝胶置入预定形状的聚四氟乙烯模具中，盖上盖板，施加0.5MPa压力，37℃静置2小时成形。

(2) 脱盐脱水：将成形的凝胶块小心取出，置于无菌注射用水中浸泡4小时，期间换水两次，以充分去除盐分；依次将凝胶块放入50%、75%、90%、100%的乙醇溶液中，每级浓度浸泡30分钟进行梯度脱水。

(3)超临界干燥与稳定：将脱水后的凝胶块转移至超临界干燥装置中。在45℃、12MPa条件下，用超临界CO₂流体处理2.5小时，彻底去除乙醇。随后，将体系温度升至80℃，压强7 MPa，维持2.5小时，使材料结构进一步稳定。最后，缓慢释放CO₂至常压，得到预定形状的真皮来源脱细胞基质气凝胶（图4）。显微观察显示其具有优良的三维多孔网络结构（图5）。

实施例5材料物理性能表征

对实施例4制备的真皮和肝脏来源的气凝胶（密度分别采用30mg/cm³、40mg/cm³、50mg/cm³、60mg/cm³、70mg/cm³）进行准静态单轴压缩力学性能测试。

(1)样品制备：使用活检穿孔器将气凝胶块体制备成直径8mm、高度约5mm的圆柱体试样（n=5）。

(2)测试方法：采用万能材料试验机，配备直径20mm的平压头，以0.5 mm/min的恒定速率对试样进行压缩，直至应变达到60%。记录载荷-位移数据。

(3)数据分析：将数据转换为应力-应变曲线。压缩模量通过计算应力-应变曲线线性段的斜率得出。

结果如表2所示。

数据显示，真皮来源的气凝胶在同密度下表现出比肝脏来源更高的压缩模量，这与不同组织ECM的成分和微观结构差异有关。结果表明，通过选择不同来源的基质和调控制备参数，可以获得满足不同组织修复所需不同力学性能的材料。

实施例6材料体外降解与细胞相容性评价

以肝基质材料为例，将2 cm见方标准尺寸和质量的气凝胶材料，浸入无菌PBS中（pH=7.4，无酶），无菌密封后于37℃摇床进行体外降解实验。定期冻干称重计算质量损失。结果显示，气凝胶在10周内质量损失缓慢（<5%），表明其具有较好的体外稳定性（图6）。 采用MTT法检测小鼠成纤维细胞（L929）与dECM材料37℃、60rpm、72小时浸提液培养后的细胞活性。其中浸提介质为90% MEM+10%

BSA，空白对照为浸提介质培养，阴性对照为无菌高密度聚乙烯树脂

于37℃、60rpm、72小时浸提液培养，阳性对照为10%DMSO培养，

结果如表3所示。

其中相对存活率为检测组平均OD值与空白对照组平均OD值的比值。结果表明材料无细胞毒性，生物相容性良好。

实施例7材料体内降解性能评价

材料分组：设6组：(A)肝来源气凝胶; (B)肝来源微粒化基质; (C)肝来源预凝胶;(D)真皮来源气凝胶; (E)真皮来源微粒化基质; (F)真皮来源预凝胶。本实施例气凝胶及预凝胶密度为35 mg/cm³，植入体积为0.2 cm³；相应的微粒化基质用PBS配置成35 mg/mL混悬液，植入量为200μL，保证每组植入物干重均为7 mg。动物手术： SD大鼠，麻醉后于背部皮下植入材料。气凝胶组通过小切口植入块状材料；预凝胶和微粒组同样进行切口，注射植入。结果：定期取材，HE染色观察。降解时间数据如表4所示。

数据显示，气凝胶形式能显著延缓dECM在体内的降解速率，使其更适用于需要长期支撑的修复场景。

实施例8材料体内炎症反应评价

将实验动物分为5组：(A) 肝来源气凝胶; (B) 肝来源微粒化基质; (C) 肝来源预凝胶；（D）空白对照组；（E）PLLA阳性对照组。将上述材料分别植入实验动物，于植入时间点后1、4、12周取材，进行RNA提取、反转录cDNA后，对各组的IL-1β和TNF-α的基因表达水平进行RT-qPCR检测。结果显示，本发明制备的脱细胞基质材料皮下注射后未引起炎症因子高表达，证明了其极低的免疫原性（图7）。

实施例9材料外科手术应用

以鼻尖塑形为例。选取大鼠为实验对象，术前拍照记录大鼠鼻部

照片（图8），根据大鼠鼻部状况设计植入体形状。术中，从无菌包装中取出预制的脱细胞基质气凝胶块体（真皮来源，密度50 mg/cm³），例如dECM^®的脱细胞基质气凝胶块体，用无菌生理盐水充分浸润。在无菌操作台上，使用精细手术刀和雕刻刀，将材料雕刻成所需的移植物形状。通过鼻尖切口，在鼻尖皮下分离出合适的腔隙，将雕刻好的气凝胶植入物植入并调整至最佳位置，缝合切口，消毒擦拭后拍照记录术后即刻照片（图8）。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种脱细胞基质气凝胶修复材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）制备极低免疫原性脱细胞基质；

（2）将步骤（1）所述极低免疫原性脱细胞基质进行粉碎，制备脱细胞基质微粒；

（3）将步骤（2）所述脱细胞基质微粒制备成脱细胞基质预凝胶；

（4）将步骤（3）所述脱细胞基质预凝胶制备成脱细胞基质气凝胶。

2.根据权利要求1所述的脱细胞基质气凝胶修复材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中极低免疫原性脱细胞基质的制备方法包括以下步骤：

1）将原料进行清洗、切割预处理；

2）对预处理后的材料进行反复冻融；

3）反复冻融后用低渗和/或高渗盐溶液处理；

4）在步骤3）之后依次用乙醇、甲醇/乙醚混合液、丙酮、过氧乙酸处理；

5）在步骤4）之后用超临界CO₂流体渗透处理；

6） 在步骤5） 之后依次用胰蛋白酶、曲拉通X-100、十二烷基硫酸钠、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐、脱氧胆酸钠、核酸酶处理；

7）在步骤6）之后用生理盐水和/或磷酸盐缓冲液处理，之后用纯化水和/或无菌注射用水处理。

3.根据权利要求2所述的脱细胞基质气凝胶修复材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中极低免疫原性脱细胞基质原料来源于人或动物的器官、组织或细胞中的一种或多种。

4.根据权利要求2所述的脱细胞基质气凝胶修复材料的制备方法，其特征在于：还包括如下一个或者多个步骤：

步骤２）所述反复冻融在-5℃以下和2℃以上两个温度区间进行反复冻融，不小于1个循环；

步骤３）中所述用低渗和/或高渗盐溶液处理不少于10分钟；

步骤４）中所述用乙醇处理不小于10分钟；和／或所述用甲醇/乙醚混合液处理不小于20分钟；和／或所述用丙酮处理不小于20分钟；和／或所述用过氧乙酸处理不小于10分钟；

步骤５）中所述超临界CO₂流体渗透为用31.1℃的7.38MP超临界CO₂流体渗透不小于30分钟；

步骤６）中所述用胰蛋白酶处理不小于10分钟；和／或所述用曲拉通X-100处理不小于30分钟；和／或所述用十二烷基硫酸钠处理不小于30分钟；和／或所述3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐处理不小于30分钟；和／或所述用脱氧胆酸钠处理不小于30分钟；和／或所述用核酸酶处理不小于1小时；

步骤７）中所述用生理盐水和/或磷酸盐缓冲液处理不小于30分钟；和／或所述用纯化水和/或无菌注射用水处理不小于30分钟。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的脱细胞基质气凝胶修复材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（3）中脱细胞基质预凝胶的制备方法包括以下步骤：

1）用胶原酶溶液于20~42℃震荡酶解脱细胞基质不小于20分钟，至无肉眼可见颗粒；

2）用中性蛋白酶溶液于20~42℃震荡酶解脱细胞基质，不小于20分钟，至无色或类白色黏液；

3）用含盐酸和/或乙酸的pH 1.5~2.5胃蛋白酶溶液于20~42℃震荡酶解脱细胞基质，不少于20分钟，裂解外源酶和/或其他免疫原性序列；

4）用氢氧化钠溶液调节酸性酶解液至pH≥8.5，失活胃蛋白酶；

5）用盐酸和/或乙酸调节碱性酶解液至pH6.0~8.0；

6）用生理盐水和/或磷酸盐缓冲液调节酶解液至270~360 mOsmol/kg；

7）混匀并去除气泡，在20~37℃条件下静置不少于15分钟，得到脱细胞基质预凝胶。

6.根据权利要求5所述的脱细胞基质气凝胶修复材料的制备方法，其特征在于：所述步骤（4）中脱细胞基质气凝胶的制备方法包括以下步骤：

1）将脱细胞基质预凝胶置于模具内，在20~37℃条件下静置不少于15分钟塑形，得到脱细胞基质凝胶块；

2）用无菌注射用水浸泡/透析脱细胞基质预凝胶，不少于2小时，期间换水不少于1次，以去除凝胶块中的盐分小分子；

3）用50%、75%、90%、100%乙醇梯度浸泡脱细胞基质预凝胶，每种浓度不小于20分钟，以去除凝胶中的水分；

4）用40~50℃的10~14MPa超临界CO₂流体渗透不小于2小时，以去除凝胶中的乙醇，此步骤兼具除菌作用；

5）在40~120℃的5~10MPa CO₂中维持不小于2小时，得到脱细胞基质气凝胶。

7.根据权利要求6所述的脱细胞基质气凝胶修复材料的制备方法，其特征在于：可进一步使用交联剂，和/或进一步复合羟基磷酸钙和/或合成高分子材料，以增强材料性能。

8.一种脱细胞基质气凝胶修复材料，其特征在于：由权利要求1-7中任一项所述的脱细胞基质气凝胶修复材料的制备方法制备获得。

9.一种极低免疫原脱细胞基质，其特征在于：采用权利要求４中所述极低免疫原性脱细胞基质的制备方法制备获得。

10.一种如权利要求1-7中任一项所述的脱细胞基质气凝胶修复材料的制备方法、权利要求8所述的脱细胞基质气凝胶修复材料或权利要求9所述的一种极低免疫原脱细胞基质在制备用于软组织修复、医学美容、骨/软骨损伤修复的材料中的应用。