CN121337026A - 一种透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及食品加工技术领域，公开了一种透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元及其制备方法和应用。通过透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖，延长脂质体在肠道的滞留时间，使益生元释放周期延长，确保与益生菌的持续作用。采用透明质酸钠修饰脂质体包埋的低聚果糖和发酵混合果蔬汁搭配制备成具有润肠通便作用的益生元果蔬发酵饮品。该饮品可促进肠道蠕动并修复黏膜屏障，形成菌群调节加肠道修复的双重功效，还可以增加肠道有益菌群，降低肠道内有害菌群等作用，解决了益生元在肠道内停留时间短、利用率低的问题，为益生菌食品的开发提供了新的方法和原料。

Description

一种透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元及其制备方 法和应用

技术领域

本发明属于食品加工技术领域，尤其涉及一种透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元及其制备方法和应用。

背景技术

随着高通量测序技术、多组学技术的发展和大数据分析方法的进步，人们对微生物群落组成及其与宿主健康的关系有了更加全面的认知，建立了益生元干预宿主菌群的方法，观察到了益生元对于宿主健康的促进效应。因此，益生元受到广泛的关注。益生元发挥健康促进效应的作用方式可以被概括为两个方面。一是益生元被宿主的部分微生物直接利用，或通过交叉喂养( cross-feeding) 间接性刺激有益微生物的生长，从而起到菌群调节作用；二是益生元被菌群代谢后产生有益于宿主健康的代谢产物，如乙酸、丙酸和丁酸等短链脂肪酸(short chain fatty acid，SCFA) 。目前研究发现益生元具有缓解便秘、促进骨骼健康、缓解肥胖、抑制致病菌、减少炎症、免疫调节等多种健康促进效应。目前研究人员一般将益生元分为三大类别，分别是公认的(established) 益生元、新兴的(emerging) 益生元和潜在的(candidate) 益生元。公认的益生元一般有较长的使用历史、属于非消化性低聚糖、对人体健康有明确的益生作用，主要以果聚糖类(fructan)和半乳聚糖类(galactan)为主。例如菊粉(inulin) 、低聚果糖(fructooligosaccharide，FOS) 、低聚半乳糖(galactooligosaccharide，GOS) 和乳果糖(lactulose) ，目前为市场上最为常见的益生元。新兴的益生元则包括低聚木糖( xylo-oligosaccharide，XOS) 、低聚异麦芽糖 (isomaltooligosaccharide，IMO) 、棉子糖、水苏糖、β-葡聚糖、抗性淀粉等。潜在的益生元不仅包括母乳寡糖(human milk oligosaccharides，HMOs) ，还包括了一些非碳水化合物类物质，如植物多酚、共轭亚油酸和多不饱和脂肪酸 ( polyunsaturated fatty acid，PUFA )等。

低聚果糖（fructo-oligosaccharides，FOS）是一种非还原性糖，它是由1～3个果糖基通过β（2→1）糖苷键与蔗糖中的果糖基结合生成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等功能性低聚糖，聚合度为2-9，是一种天然活性成分，也是一种优良的水溶性膳食纤维。低聚果糖广泛存在于多种植物中，如香蕉、大蒜、洋葱、大麦、小麦和麦芽等植物。作为研究最多、应用范围最广的益生元之一，低聚果糖已被证实是唯一同时具有超强双歧因子和水溶性膳食纤维的双生理学特性的全天然配料，并被广泛应用于食品、保健品、酒类、化妆品以及饲料领域。但是目前常规的低聚果糖益生元在高酸性环境（pH＜4）下的稳定性不佳、受热易分解等问题，限制了其在产品中的应用范围。且低聚果糖益生元在肠道内留存时间短，与肠道益生菌的作用时间有限，并且不能靶向肠道益生菌，造成利用效率低的问题。

发明内容

本发明旨在提供一种透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元及其制备方法和应用，通过透明质酸钠修饰脂质体表面，其糖链结构与肠道黏液层的糖胺聚糖高度同源，使脂质体与肠道上皮的粘附效率提升，形成“黏液层仿生锚定”效应。透明质酸钠的葡糖醛酸残基可与肠道黏液层的黏蛋白通过氢键结合，延长脂质体在肠道的滞留时间，使益生元释放周期延长，确保与益生菌的持续作用。

为达到上述目的，本发明提供一种透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元的制备方法，包括以下步骤：

S1. 将氢化大豆磷脂、植物甾醇和维生素E溶于氯仿，旋转蒸发蒸干溶剂，形成均匀磷脂薄膜；加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，水浴振荡，得粗脂质体混悬液；高压均质得空白脂质体；

S2. 将透明质酸钠溶于柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，加入1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌均匀得到活化的透明质酸钠溶液；将活化的透明质酸钠溶液滴入所述空白脂质体，磁力搅拌；加入溶有低聚果糖的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，孵育；膜超滤，减压浓缩，得透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元。

优选地，S1中，所述的氢化大豆磷脂、植物甾醇和维生素E的质量比为15:（2.5~3.5）:（0.8~1.2）；所述氯仿和氢化大豆磷脂的比为（0.18~0.22）L:15g；所述的旋转蒸发温度为40~50℃。

优选地，S1中，所述的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和氢化大豆磷脂的比为（0.08~0.12）L:15g；所述的水浴振荡温度为60~70℃，时间为30~50min；所述的高压均质压强为130~170MPa。

优选地，S2中，所述的透明质酸钠和柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的比为（0.8~1.2g）:100mL；所述的透明质酸钠、1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为2:（0.13~0.17）:（0.06~0.1）。

优选地，S2中，所述的溶有低聚果糖的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的体积比为（0.9~1.1）:2，浓度为含质量分数18%～22%低聚果糖的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；所述的膜超滤滤膜截留分子量为30kDa，压力为0.05~0.15MPa；所述的减压浓缩为浓缩后体积与柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的体积比为（5~7）:4。

本发明还提供一种透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元，采用上述的一种透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元的制备方法得到。

本发明还提供一种上述的透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元在制备益生元果蔬发酵饮品中的应用。

本发明还提供一种益生元果蔬发酵饮品的制备方法，包括以下步骤：

S3. 苹果、西梅、胡萝卜清洗后切块、打浆，滤网过滤得澄清汁；加入白砂糖，搅拌溶解，第一次柠檬酸调pH，加水定容得到混合果蔬汁；杀菌，冷却；向混合果蔬汁中加入长双歧杆菌长亚种BB536（Bifidobacterium longum subsp.longum BB536），植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum ）；厌氧发酵，第一次巴氏杀菌，冷却得到发酵果蔬汁；

S4. 向发酵果蔬汁中加入上述的透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元和乳糖醇，搅拌至完全溶解；第二次用柠檬酸调pH；添加山梨酸钾和茶多酚后无菌水定容，高压均质使体系均一；第二次巴氏杀菌，分装至小瓶中，密封常温储存。

优选地，S3中，所述苹果、西梅和胡萝卜的质量比为3:（1.5~2.5）:（1~2）；所述的白砂糖与苹果的质量比为（0.8-1.2）:10；所述的第一次柠檬酸调pH为pH至5.0~5.4；所述的杀菌为65~75℃杀菌10~20min，所述的冷却温度为35~40℃。

优选地，S3中，所述的长双歧杆菌长亚种BB536和混合果蔬汁的量的比为（0.5×10⁹~0.8×10⁹）CFU:700mL，所述的植物乳植杆菌和混合果蔬汁的量的比为（0.3×10⁹~0.5×10⁹）CFU:700mL；所述的厌氧发酵温度为35~40℃，时间为12~20h；所述的第一次巴氏杀菌为80~90℃灭菌20~40min。

优选地，S4中，所述的透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元和发酵混合果蔬汁的体积比为（12~13）:35；所述的乳糖醇的添加量和发酵混合果蔬汁的比例为（4-6g）:100mL；所述的第二次用柠檬酸调pH至3.8~4.2。

优选地，S4中，所述的山梨酸钾的添加量和茶多酚的质量比为10:1；所述的第二次巴氏杀菌为70~80℃灭菌20~30 min。

与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：

（1）通过透明质酸钠修饰脂质体表面，其糖链结构与肠道黏液层的糖胺聚糖高度同源，使脂质体与肠道上皮的粘附效率提升，形成“黏液层仿生锚定”效应。透明质酸钠的葡糖醛酸残基可与肠道黏液层的黏蛋白通过氢键结合，延长脂质体在肠道的滞留时间，使益生元释放周期延长，确保与益生菌的持续作用。

（2）脂质体粒径控制在100~200nm，可被益生菌通过内吞作用直接摄取，益生菌表面糖蛋白与透明质酸钠形成特异性识别。脂质体的磷脂成分作为益生菌细胞膜合成原料，增强其活性。释放的益生元被肠道益生菌代谢产生短链脂肪酸，可促进肠道蠕动并修复黏膜屏障，形成菌群调节和肠道修复的双重功效。苹果、西梅和胡萝卜中富含膳食纤维和维生素，这些成分经过益生菌发酵，益生菌的灭活，得到具有肠道调节功能的后生元，进一步改善肠道健康状态。

附图说明

图1为实施例1益生元果蔬发酵饮品实物图；

图2为低聚果糖标准品高效液相色谱检测图；

图3为低聚果糖标准品检测含量绘制的标准曲线图；

图4为实施例1-3和对比例1-5的小鼠粪便中各类菌含量变化的热图。

具体实施方式

以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例与对比例主要使用化合物均为市售商品，未做任何进一步纯化处理。

实施例和对比例所用的长双歧杆菌长亚种BB536的保藏编号为：ATCC BAA-999，分类命名为长双歧杆菌长亚种（Bifidobacterium longum subsp.longum）；植物乳植杆菌的保藏编号为：CICC 20263，分类命名为植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）。

实施例1

一种益生元果蔬发酵饮品的制备方法，包括以下步骤：

S1. 将150g氢化大豆磷脂、30g植物甾醇、10g维生素E溶于2L氯仿，45℃旋转蒸发蒸干溶剂，形成均匀磷脂薄膜；加入1L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，65℃水浴振荡水合40min，得粗脂质体混悬液；150MPa高压均质3次，得粒径200±20nm的空白脂质体；

S2. 将2g透明质酸钠溶于200mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，加入150mg 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺和80mg N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌30min得到活化的透明质酸钠溶液；将活化的透明质酸钠溶液缓慢滴入空白脂质体，4℃磁力搅拌6h；加入100mL溶有20g低聚果糖的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，45℃孵育1.5h；以0.1MPa通过30kDa膜超滤，减压浓缩至300mL，得透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元；

S3. 苹果300g、西梅200g、胡萝卜150g清洗后切块，8000rpm打浆3min，200目滤网过滤得澄清汁；加入30g白砂糖，50℃搅拌溶解，第一次用柠檬酸调pH至5.2，定容至700mL；70℃第一次巴氏灭菌15min，冷却至37℃备用；加入0.6g 1×10⁹CFU/g长双歧杆菌长亚种BB536，0.4g 1×10⁹CFU/g植物乳植杆菌；37℃厌氧发酵16h，85℃水浴灭菌30min，彻底灭活乳酸菌及杂菌，冷却至40℃；

S4. 向灭菌果蔬汁中加入250mL透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元、50g乳糖醇，40℃搅拌30min至完全溶解；第二次用柠檬酸调pH至4.0；添加0.4g山梨酸钾、0.04g茶多酚，无菌水定容至1L，90MPa高压均质2次使体系均一；第二次75℃巴氏杀菌25min后分装至50mL棕色玻璃小瓶中，密封储存，得到如图1所示的具有润肠通便作用的益生元果蔬发酵饮品。

实施例2

一种益生元果蔬发酵饮品的制备方法，包括以下步骤：

S1. 将150g氢化大豆磷脂、25g植物甾醇、8g维生素E溶于1.8L氯仿，40℃旋转蒸发蒸干溶剂，形成均匀磷脂薄膜；加入0.8L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，60℃水浴振荡水合50min，得粗脂质体混悬液；130MPa高压均质3次，得粒径200±20nm的空白脂质体；

S2. 将1.6g透明质酸钠溶于200mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，加入104mg 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺和48mg N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌30min得到活化的透明质酸钠溶液；将活化的透明质酸钠溶液缓慢滴入空白脂质体，4℃磁力搅拌6h；加入90mL溶有16.2g低聚果糖的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，45℃孵育1.5h；以0.05MPa通过30kDa膜超滤，减压浓缩至250mL，得透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元；

S3. 苹果300g、西梅150g、胡萝卜200g清洗后切块，8000rpm打浆3min，200目滤网过滤得澄清汁；加入24g白砂糖，50℃搅拌溶解，第一次用柠檬酸调pH至5.0，定容至700mL；第一次65℃巴氏灭菌20min，冷却至35℃备用；加入0.5g 1×10⁹CFU/g长双歧杆菌长亚种BB536，0.3g 1×10⁹CFU/g植物乳植杆菌；35℃厌氧发酵20h，80℃水浴灭菌40min，彻底灭活乳酸菌及杂菌，冷却至40℃；

S4. 向灭菌果蔬汁中加入240mL透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元、40g乳糖醇，40℃搅拌30min至完全溶解；第二次用柠檬酸调pH至3.8；添加0.3g山梨酸钾、0.03g茶多酚，加水定容至1L，90MPa高压均质2次使体系均一；第二次70℃巴氏杀菌30min后分装至50mL棕色玻璃小瓶中，密封储存，得到具有润肠通便作用的益生元果蔬发酵饮品。

实施例3

一种益生元果蔬发酵饮品的制备方法，包括以下步骤：

S1. 将150g氢化大豆磷脂、35g植物甾醇、12g维生素E溶于2.2L氯仿，50℃旋转蒸发蒸干溶剂，形成均匀磷脂薄膜；加入1.2L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，70℃水浴振荡水合30min，得粗脂质体混悬液；170MPa高压均质3次，得粒径200±20nm的空白脂质体；

S2. 将2.4g透明质酸钠溶于200mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，加入204mg 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺和120mg N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌30min得到活化的透明质酸钠溶液；将活化的透明质酸钠溶液缓慢滴入空白脂质体，4℃磁力搅拌6h；加入110mL溶有24.2g低聚果糖的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，45℃孵育1.5h；以0.15MPa通过30kDa膜超滤，减压浓缩至350mL，得透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元；

S3. 苹果300g、西梅250g、胡萝卜100g清洗后切块，8000rpm打浆3min，200目滤网过滤得澄清汁；加入36g白砂糖，50℃搅拌溶解，第一次用柠檬酸调pH至5.4，定容至700mL；第一次75℃巴氏灭菌10min，冷却至40℃备用；加入0.8g 1×10⁹CFU/g长双歧杆菌长亚种BB536，0.5g 1×10⁹CFU/g植物乳植杆菌；40℃厌氧发酵12h，90℃水浴灭菌20min，彻底灭活乳酸菌及杂菌，冷却至40℃；

S4. 向灭菌果蔬汁中加入260mL透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元、60g乳糖醇，40℃搅拌30min至完全溶解；第二次用柠檬酸调pH至4.2；添加0.5g山梨酸钾、0.05g茶多酚，加水定容至1L，90MPa高压均质2次使体系均一；第二次80℃巴氏杀菌20min后分装至50mL棕色玻璃小瓶中，密封储存，得到具有润肠通便作用的益生元果蔬发酵饮品。

对比例1

一种未用透明质酸钠修饰的益生元果蔬发酵饮品的制备方法，包括以下步骤：

S1. 将150g氢化大豆磷脂、30g植物甾醇、10g维生素E溶于2L氯仿，45℃旋转蒸发蒸干溶剂，形成均匀磷脂薄膜；加入1L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，65℃水浴振荡水合40min，得粗脂质体混悬液；150MPa高压均质3次，得粒径200±20nm的空白脂质体；

S2. 将空白脂质体中加入100mL溶有20g低聚果糖的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，45℃孵育1.5h；以0.1MPa通过30kDa膜超滤，减压浓缩至300mL，得脂质体-低聚果糖复合物；

S3. 苹果300g、西梅200g、胡萝卜150g清洗后切块，8000rpm打浆3min，200目滤网过滤得澄清汁；加入30g白砂糖，50℃搅拌溶解，第一次用柠檬酸调pH至5.2，定容至700mL；第一次70℃巴氏灭菌15min，冷却至37℃备用；加入0.6g 1×10⁹CFU/g长双歧杆菌长亚种BB536，0.4g 1×10⁹CFU/g植物乳植杆菌；37℃厌氧发酵16h，85℃水浴灭菌30min，彻底灭活乳酸菌及杂菌，冷却至40℃；

S4. 向灭菌果蔬汁中加入250mL脂质体-低聚果糖复合物、50g乳糖醇，40℃搅拌30min至完全溶解；第二次用柠檬酸调pH至4.0；添加0.4g山梨酸钾、0.04g茶多酚，加水定容至1L，90MPa高压均质2次使体系均一；第二次75℃巴氏杀菌25min后分装至50mL棕色玻璃小瓶中，密封储存，得到未用透明质酸钠改性的益生元果蔬发酵饮品。

对比例2

一种未用脂质体包裹的益生元果蔬发酵饮品的制备方法，包括以下步骤：

S1. 将苹果300g、西梅200g、胡萝卜150g清洗后切块，8000rpm打浆3min，200目滤网过滤得澄清汁；加入30g白砂糖，50℃搅拌溶解，第一次用柠檬酸调pH至5.2，定容至700mL；第一次70℃巴氏灭菌15min，冷却至37℃备用；加入0.6g 1×10⁹CFU/g长双歧杆菌长亚种BB536，0.4g 1×10⁹CFU/g植物乳植杆菌；37℃厌氧发酵16h，85℃水浴灭菌30min，彻底灭活乳酸菌及杂菌，冷却至40℃；

S2. 向灭菌果蔬汁中加入250mL 20g低聚果糖复合物、50g乳糖醇，40℃搅拌30min至完全溶解；第二次用柠檬酸调pH至4.0；添加0.4g山梨酸钾、0.04g茶多酚，加水定容至1L，90MPa高压均质2次使体系均一；第二次75℃巴氏杀菌25min后分装至50mL棕色玻璃小瓶中，密封储存，得到未用脂质体包裹的益生元果蔬发酵饮品。

对比例3

一种未加低聚果糖的果蔬发酵饮品的制备方法，包括以下步骤：

S1. 将150g氢化大豆磷脂、30g植物甾醇、10g维生素E溶于2L氯仿，45℃旋转蒸发蒸干溶剂，形成均匀磷脂薄膜；加入1L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，65℃水浴振荡水合40min，得粗脂质体混悬液；150MPa高压均质3次，得粒径200±20nm的空白脂质体；

S2. 将2g透明质酸钠溶于200mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，加入150mg 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺和80mg N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌30min得到活化的透明质酸钠溶液；将活化的透明质酸钠溶液缓慢滴入空白脂质体，4℃磁力搅拌6h；加入100mL的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，45℃孵育1.5h；以0.1MPa通过30kDa膜超滤去除游离透明质酸钠和低聚果糖，减压浓缩至300mL，得透明质酸钠修饰脂质体；

S3. 苹果300g、西梅200g、胡萝卜150g清洗后切块，8000rpm打浆3min，200目滤网过滤得澄清汁；加入30g白砂糖，50℃搅拌溶解，第一次用柠檬酸调pH至5.2，定容至700mL；第一次70℃巴氏灭菌15min，冷却至37℃备用；加入0.6g 1×10⁹CFU/g长双歧杆菌长亚种BB536，0.4g 1×10⁹CFU/g植物乳植杆菌；37℃厌氧发酵16h，85℃水浴灭菌30min，彻底灭活乳酸菌及杂菌，冷却至40℃；

S4. 向灭菌果蔬汁中加入250mL透明质酸钠修饰脂质体、50g乳糖醇，40℃搅拌30min至完全溶解；第二次用柠檬酸调pH至4.0；添加0.4g山梨酸钾、0.04g茶多酚，加水定容至1L，90MPa高压均质2次使体系均一；第二次75℃巴氏杀菌25min后分装至50mL棕色玻璃小瓶中，密封储存，得到未加低聚果糖的果蔬发酵饮品。

对比例4

一种益生元果蔬未发酵饮品的制备方法，包括以下步骤：

S1. 将150g氢化大豆磷脂、30g植物甾醇、10g维生素E溶于2L氯仿，45℃旋转蒸发蒸干溶剂，形成均匀磷脂薄膜；加入1L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，65℃水浴振荡水合40min，得粗脂质体混悬液；150MPa高压均质3次，得粒径200±20nm的空白脂质体；

S2. 将2g透明质酸钠溶于200mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，加入150mg 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺和80mg N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌30min得到活化的透明质酸钠溶液；将活化的透明质酸钠溶液缓慢滴入空白脂质体，4℃磁力搅拌6h；加入100mL溶有20g低聚果糖的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，45℃孵育1.5h；以0.1MPa通过30kDa膜超滤去除游离透明质酸钠和低聚果糖，减压浓缩至300mL，得透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元；

S3. 苹果300g、西梅200g、胡萝卜150g清洗后切块，8000rpm打浆3min，200目滤网过滤得澄清汁；加入30g白砂糖，50℃搅拌溶解，第一次用柠檬酸调pH至5.2，定容至700mL；第一次70℃巴氏灭菌15min，冷却至37℃备用；

S4. 向灭菌果蔬汁中加入250mL透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元、50g乳糖醇，40℃搅拌30min至完全溶解；第二次用柠檬酸调pH至4.0；添加0.4g山梨酸钾、0.04g茶多酚，加水定容至1L，90MPa高压均质2次使体系均一；第二次75℃巴氏杀菌25min后分装至50mL棕色玻璃小瓶中，密封储存，得到益生元果蔬未发酵饮品。

对比例5

一种益生元发酵饮品的制备方法，包括以下步骤：

S1. 将150g氢化大豆磷脂、30g植物甾醇、10g维生素E溶于2L氯仿，45℃旋转蒸发蒸干溶剂，形成均匀磷脂薄膜；加入1L柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，65℃水浴振荡水合40min，得粗脂质体混悬液；150MPa高压均质3次，得粒径200±20nm的空白脂质体；

S2. 将2g透明质酸钠溶于200mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，加入150mg 1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺和80mg N-羟基琥珀酰亚胺，室温搅拌30min得到活化的透明质酸钠溶液；将活化的透明质酸钠溶液缓慢滴入空白脂质体，4℃磁力搅拌6h；加入100mL溶有20g低聚果糖的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，45℃孵育1.5h；以0.1MPa通过30kDa膜超滤去除游离透明质酸钠和低聚果糖，减压浓缩至300mL，得透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元；

S3. 30g白砂糖，50℃搅拌溶解，第一次用柠檬酸调pH至5.2，定容至700mL；第一次70℃巴氏灭菌15min，冷却至37℃备用；加入0.6g 1×10⁹CFU/g长双歧杆菌长亚种BB536，0.4g 1×10⁹CFU/g植物乳植杆菌；37℃厌氧发酵16h，85℃水浴灭菌30min，彻底灭活乳酸菌及杂菌，冷却至40℃；

S4. 向灭菌发酵液中加入250mL透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元、50g乳糖醇，40℃搅拌30min至完全溶解；第二次用柠檬酸调pH至4.0；添加0.4g山梨酸钾、0.04g茶多酚，加水定容至1L，90MPa高压均质2次使体系均一；第二次75℃巴氏杀菌25min后分装至50mL棕色玻璃小瓶中，密封储存，得到益生元发酵饮品。

实验例1

小肠运动实验

SPF级KM小鼠，共60只，雄性，分成10组，末次给予受试样品后各组小鼠禁食不禁水16h后，除空白对照组外，实施例1-3组、对比例1-5组和模型对照组灌胃复方地芬诺酯(5mg/kgBW)0.5h，空白对照组灌胃纯水。实施例1-3组和对比例1-5组灌胃对应饮品(含5%活性碳粉、10%阿拉伯树胶)，空白对照组、模型对照组灌胃墨汁。25 min 后立即脱颈椎处死动物，打开腹腔，分离肠系膜，剪取上端自幽门、下端至回盲部的肠管，置于托盘上，轻轻将小肠拉成直线，测量肠管长度为“小肠总长度”，从幽门至墨汁前沿为“墨汁推进长度”。按下式计算：墨汁推进率(%)=墨汁推进长度(cm)/小肠总长度(cm)×100%。实验结果如表1所示。

表1：益生元果蔬发酵饮品对小鼠肠道运动的促进效果

根据表1数据可知，实施例1-3方法制备的饮品能够显著促进小鼠肠道的蠕动，对比例1未进行透明质酸钠修饰脂质体制备的饮品对肠道的蠕动促进效果不如实施例1-3，对比例2未进行脂质体包裹益生元制备的饮品对肠道蠕动的促进效果更差，说明采用透明质酸钠修饰的脂质体对低聚果糖进行包埋，能更有效地促进小鼠肠道蠕动。对比例3未添加低聚果糖，对肠道促进效果不大，对比例4是未进行益生菌的发酵，其促进肠道的效果也低于实施了1-3，说明益生菌发酵后产生了一定促进肠道蠕动的后生元。对比例5未添加果蔬汁，其促进肠道蠕动效果较差，说明果蔬汁中的膳食纤维等物质能有效地促进肠道蠕动，果蔬汁的发酵也有利于后生元等促进肠道蠕动的物质产生。

实验例2

小鼠排便试验

SPF级KM小鼠，共60只，雄性，分成10组，末次给予受试样品后各组小鼠禁食不禁水16h后，除空白对照组外，实施例1-3组、对比例1-5组和模型对照灌胃复方地芬诺酯(5mg/kgBW)0.5h，空白对照组灌胃纯水。实施例1-3组和对比例1-5组灌胃对应饮品(含5%活性碳粉、10%阿拉伯树胶)，空白对照组、模型对照组灌胃墨汁。同时开始计时。每只动物均单独饲养，正常饮水、进食，观察记录每只小鼠首次排便时间、5h内排便粒数及重量，结果如表2所示。

表2：益生元果蔬发酵饮品对小鼠排便的促进作用

根据表2数据可知，实施了1-3方法制备的饮品能够显著促进小鼠排便，相比于对比例1-5，实施例1-3方法制备的饮品促进小鼠排便的效果更好，说明实施例方法制备的益生元果蔬发酵饮可用于改善便秘等症状，具有促进排便的功效。

实验例3

小鼠粪便中低聚果糖检测

分别称取50mg（精确至0.1mg）蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖标准品于10mL容量瓶中，用水溶解定容，4℃冰箱中保存。根据灵敏度和使用需要，用流动相将上述储备液稀释至200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL、12.5μg/mL、6.25μg/mL现用现配。

分别称取约50mg实验例2中实施例1-3和对比例1-5小鼠的粪便于离心管中；加入3mL蒸馏水混匀振荡至无结块，超声5min，14000g离心15min后取上清液，加入到10mL容量瓶，用乙腈定容至刻度，充分摇匀，静置30 min后滤纸过滤，滤液通过0.45μm滤膜过滤，供液相色谱分析。色谱柱：high performance carbohydrate cartridge（250 mm×4.6 mm，4μm）；流速1mL/min；进样量10μL；柱温35 ℃；流动相为乙腈:水为70∶30（V/V）。分别将标液和样品进行色谱分析，标准品色谱分析如图2所示，绘制标准曲线如图3所示，计算得到样品中低聚果糖的含量如下表3所示。

表3：小鼠粪便中低聚果糖浓度

如图2为低聚果糖的液相色谱，三个峰依次是蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖，图3为根据低聚果糖的标准品进行检测绘制的标准曲线，其数值为三种糖的总和，即低聚果糖的含量；根据表3数据可知，服用实施例1-3方法制备饮品的小鼠，相比于对比例1和对比例2，粪便中低聚果糖含量较低，说明用透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖能延长低聚果糖在小鼠肠道的停留时间，更有利于被肠道益生菌吸收利用。对比例3粪便中低聚果糖含量低的原因是因为对比例3中未添加低聚果糖。

实验例4

调节小鼠肠道菌群功能的评价

选取昆明小鼠80只，雌雄各半，随机分配成8组，每组10只，分别为实施例1-3组、对比例1-5组，分别灌胃实施例1-3组、对比例1-5组的饮品，每天灌胃量为0.2mL，连续灌胃15天，所有小鼠自由饮水进食，分别在给予灌胃前和第14天灌胃24h后，无菌采取各组的小鼠粪便1g，置于干燥灭菌试管中，加入无菌水稀释至10^-6，分别接种到双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌、肠球菌、产气荚膜梭菌培养基上，分别在有氧与无氧环境下培养48h，计数并计算每克湿便菌落数，取对数。对比灌胃前后各菌数量的变化，结果绘制热图如图4所示。

如图4所示，服用益生元果蔬发酵饮品后小鼠粪便中双歧杆菌和乳杆菌这两类益生菌的数量增加，而肠杆菌、肠球菌和产气荚膜梭菌这类有害的菌减少，实施例1-3的作用效果更好，说明了采用透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖能有效促进肠道益生菌的增殖，降低肠道有害细菌的数量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变形，这些改进和变形也应视为本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1. 将氢化大豆磷脂、植物甾醇和维生素E溶于氯仿，旋转蒸发蒸干溶剂，形成均匀磷脂薄膜；加入柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，水浴振荡，得粗脂质体混悬液；高压均质得空白脂质体；

S2. 将透明质酸钠溶于柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，加入1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺，搅拌均匀得到活化的透明质酸钠溶液；将活化的透明质酸钠溶液滴入所述空白脂质体，磁力搅拌；加入溶有低聚果糖的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，孵育；膜超滤，减压浓缩，得透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元。

2.根据权利要求1所述的一种透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元的制备方法，其特征在于，S1中，所述的氢化大豆磷脂、植物甾醇和维生素E的质量比为15:（2.5~3.5）:（0.8~1.2）；所述氯仿和氢化大豆磷脂的比为（0.18~0.22）L:15g；所述的旋转蒸发温度为40~50℃。

3.根据权利要求1所述的一种透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元的制备方法，其特征在于，S1中，所述的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和氢化大豆磷脂的比为（0.08~0.12）L:15g；所述的水浴振荡温度为60~70℃，时间为30~50min；所述的高压均质压强为130~170MPa。

4.根据权利要求1所述的一种透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元的制备方法，其特征在于，S2中，所述的透明质酸钠和柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的比为（0.8~1.2g）:100mL；所述的透明质酸钠、1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的质量比为2:（0.13~0.17）:（0.06~0.1）。

5.根据权利要求1所述的一种透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元的制备方法，其特征在于，S2中，所述的溶有低聚果糖的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的体积比为（0.9~1.1）:2，浓度为含质量分数18%～22%低聚果糖的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；所述的膜超滤滤膜截留分子量为30kDa，压力为0.05~0.15MPa；所述的减压浓缩为浓缩后体积与柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的体积比为（5~7）:4。

6.一种透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元，其特征在于，采用权利要求1-5中任意一项所述的一种透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元的制备方法得到。

7.一种如权利要求6所述的透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元在制备益生元果蔬发酵饮品中的应用。

8.一种益生元果蔬发酵饮品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S3. 苹果、西梅、胡萝卜清洗后切块、打浆，滤网过滤得澄清汁；加入白砂糖，搅拌溶解，第一次柠檬酸调pH，加水定容得到混合果蔬汁；杀菌，冷却；向混合果蔬汁中加入长双歧杆菌长亚种BB536（Bifidobacterium longum subsp.longum BB536），植物乳植杆菌（Lactiplantibacillus plantarum ）；厌氧发酵，第一次巴氏杀菌，冷却得到发酵果蔬汁；

S4. 向发酵果蔬汁中加入权利要求6所述的透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元和乳糖醇，搅拌至完全溶解；第二次用柠檬酸调pH；添加山梨酸钾和茶多酚后无菌水定容，高压均质使体系均一；第二次巴氏杀菌，分装至小瓶中，密封常温储存。

9.根据权利要求8所述的一种益生元果蔬发酵饮品的制备方法，其特征在于，S3中，所述苹果、西梅和胡萝卜的质量比为3:（1.5~2.5）:（1~2）；所述的白砂糖与苹果的质量比为（0.8-1.2）:10；所述的第一次柠檬酸调pH为pH至5.0~5.4；所述的杀菌为65~75℃杀菌10~20min，所述的冷却温度为35~40℃。

10.根据权利要求8所述的一种益生元果蔬发酵饮品的制备方法，其特征在于，S3中，所述的长双歧杆菌长亚种BB536和混合果蔬汁的量的比为（0.5×10⁹~0.8×10⁹）CFU:700mL，所述的植物乳植杆菌和混合果蔬汁的量的比为（0.3×10⁹~0.5×10⁹）CFU:700mL；所述的厌氧发酵温度为35~40℃，时间为12~20h；所述的第一次巴氏杀菌为80~90℃灭菌20~40min。

11.根据权利要求8所述的一种益生元果蔬发酵饮品的制备方法，其特征在于，S4中，所述的透明质酸钠修饰脂质体包埋低聚果糖益生元和发酵混合果蔬汁的体积比为（12~13）:35；所述的乳糖醇的添加量和发酵混合果蔬汁的比例为（4-6g）:100mL；所述的第二次用柠檬酸调pH至3.8~4.2。

12.根据权利要求8所述的一种益生元果蔬发酵饮品的制备方法，其特征在于，S4中，所述的山梨酸钾的添加量和茶多酚的质量比为10:1；所述的第二次巴氏杀菌为70~80℃灭菌20~30 min。