CN121335978A

CN121335978A - 一种人源MeCp2启动子及其用途

Info

Publication number: CN121335978A
Application number: CN202480037445.9A
Authority: CN
Inventors: 韩荣荣; 刘洪洋; 李忠
Original assignee: Staidson Beijing Biopharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Staidson Beijing Biopharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2023-06-16
Filing date: 2024-06-13
Publication date: 2026-01-13
Also published as: WO2024255792A1

Abstract

公开了一种核酸分子，以及一种重组核酸分子，其包含所述核酸分子、编码外源蛋白的核酸序列和多聚腺苷酸序列(即polyA)。还公开了一种重组腺相关病毒，其包含AAV衣壳和载体基因组，所述载体基因组包含上述重组核酸分子。还公开了所述重组腺相关病毒用于更有效地治疗脊髓损伤的用途。

Description

一种人源MeCp2启动子及其用途

技术领域

本发明涉及生物领域，涉及一种人源启动子，尤其涉及应用该人源启动子构建的治疗脊髓损伤的重组腺相关病毒载体及其应用。

背景技术

脊髓损伤(spinalcordinjury，SCI)是脊柱损伤最严重的并发症，往往导致损伤节段以下肢体感觉和运动功能障碍。致病因素的持续存在和世界范围内的高发率使SCI成为人类健康的严重威胁，也给社会和家庭带来了沉重的经济负担。

对于SCI，当前治疗最突出的问题是如何有效重建损伤平面两侧神经环路，恢复患者肢体运动和感觉功能。然而当前SCI治疗难以满足临床需求和神经环路重建的要求。已上市的小分子类药物，如糖皮质激素受体激动剂、磷脂酶A抑制剂、α2肾上腺素受体激动剂等均是针对原发性SCI继发的病理级联反应，发挥抗炎、抗缺血、抑制免疫反应和神经保护作用；手术治疗亦是针对继发性损伤，在SCI患者生命体征平稳后的24小时内进行，减轻出血和去除坏死组织等。在研药物中，处于II期和III期的干细胞结合神经营养因子疗法仅能从结构上重建损伤两侧神经环路而无法重建功能环路。虽然，目前研究中已有利用重组病毒载体携带编码全长K+-Cl-协同转运蛋白(全长KCC2)的核酸序列治疗脊髓损伤的文献报道(WO2019226643A1)，但其治疗效果仍有进一步改进的空间，以获得更好的疗效。对于神经系统疾病的基因治疗，临床前研究多采用神经元特异性启动子以增强目的基因在特定细胞类型的表达效率，并降低目的基因非特异性表达引起的免疫反应或副作用，但是目前已上市的神经系统疾病基因治疗产品均为广泛表达的启动子，仍需要探索在神经元表达效率高且免疫原性低的启动子并进行临床转化。目前的研究依然无法满足SCI的临床需求。

因此目前亟需探索创新的、更安全的、能有效治疗脊髓损伤的药物和方法。

发明内容

第一方面，本发明提供了一种核酸分子，其具有如SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：6或7具有80％以上(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上)序列同一性的核苷酸序列。

在一些具体实施方案中，所述核酸分子是一种启动子，可启动编码外源蛋白的核酸序列在细胞内的转录。在一些具体实施方案中，所述核酸分子是人源的MeCp2启动子。

第二方面，本发明提供了一种重组核酸分子，其包含上述的核酸分子、编码外源蛋白的核酸序列和多聚腺苷酸序列(即polyA)。

在一些具体实施方案中，所述polyA为BGH polyA，优选地，其序列如SEQ ID NO：8所示。

在一些具体实施方案中，所述外源蛋白为KCC2蛋白，优选地，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

在一些具体实施方案中，所述KCC2蛋白的编码序列具有选自以下的核苷酸序列：

1)SEQ ID NO：2所示核苷酸序列；

2)SEQ ID NO：2所示核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸而得到的核苷酸序列；或

3)与SEQ ID NO：2具有80％以上序列同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的序列；更优选地，具有98％或99％以上同一性的序列；在更优选地实施方案中，所述多核苷酸序列是密码子优化的序列。

在一些具体实施方案中，所述重组核酸分子还进一步包含Kozak序列、WPRE和转录后调节元件中的一种或多种。

在一些优选实施方案中，所述重组核酸分子包含选自以下的核苷酸序列：

1)SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列；

2)SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸而得到的核苷酸序列；或

3)与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有80％以上序列同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的序列；更优选地，具有98％或99％以上同一性的序列。

在某些具体实施方案中，所述重组核酸分子还包含AAV反向末端重复序列；优选地，所述AAV反向末端重复序列选自不同血清型的AAV；优选地，所述AAV反向末端重复序列选自进化支A-F中的任意血清型的AAV或AAV1型、AAV2型、AAV3型、AAV4型、AAV5型、AAV6型、AAV7型、AAV8型、AAV9型或其杂交/嵌合型中的任意一个；更优选地，所述AAV反向末端重复序列来自AAV2型。

第三方面，本发明提供一种重组载体，其包含前述的核酸分子或重组核酸分子，所述载体选自质粒载体、噬菌体载体和病毒载体，其中所述病毒载体选自腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体和杂合病毒载体。

第四方面，本发明提供一种重组腺相关病毒，所述重组腺相关病毒包含AAV衣壳和载体基因组，其中，所述载体基因组包含前述的核酸分子或重组核酸分子；在某些具体实施方案中，所述重组核酸分子包含AAV反向末端重复序列、编码KCC2蛋白的核酸序列和引导KCC2蛋白的核酸序列在宿主细胞中表达的表达控制序列、PolyA序列；在一些实施方案中，所述AAV衣壳选自进化支A-F中的任意血清型的AAV或AAV1型、AAV2型、AAV3型、AAV4型、AAV5型、AAV6型、AAV7型、AAV8型、AAV9型或其杂交/嵌合型中的任意一个，在某些优选实施方案中，所述重组腺相关病毒的衣壳为AAV9，其氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。

第五方面，本发明提供一种分离的宿主细胞，其包含前述的核酸分子或重组核酸分子或前述的重组载体或重组腺相关病毒。

在一些具体实施方案中，所述细胞为神经元细胞。在一些具体实施方案中，所述细胞为胆碱能神经元细胞、去甲肾上腺素能神经元细胞、多巴胺能神经元细胞、5-羟色胺能神经元细胞、γ-氨基丁酸能神经元细胞。在一些具体实施方案中，所述细胞为神经细胞系，包括NG108-15、N1E115、PC12、SHSY5Y、F11、ND7-23、N27、SN4741细胞系。

第六方面，本发明提供一种药物组合物，其包含前述的核酸分子或重组核酸分子、重组载体或重组腺相关病毒和/或前述的宿主细胞以及药学上可接受的赋形剂。在一些优选实施方案中，所述药物组合物可配制为用于静脉注射、鞘内注射、脑室内注射、脊髓内注射、胸腔注射、口服、吸入、鼻内、气管内、动脉内、眼内、肌内、腹内和/或其它肠胃外途径进行给药。在一些优选实施方案中，所述药物组合物还可以包括其他的可用于治疗脊髓损伤的药物。

第七方面，本发明提供了前述的核酸分子、重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒、宿主细胞和/或前述的药物组合物在制备用于预防或治疗脊髓损伤的药物中的用途。在某些具体实施方案中，所述重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒、宿主细胞和/或药物组合物可以与另一疗法结合施用。

第八方面，本发明提供了在受试者中治疗脊髓损伤的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用前述的重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒、宿主细胞和/或前述的药物组合物。在某些优选实施方案中，所述组合物静脉内施用；在某些优选实施方案中，所述组合物鞘内施用；在某些优选实施方案中，所述组合物脊髓内施用；在另一些优选实施方案中，所述受试者是哺乳动物；在更优选实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述治疗方法还可以与其他的疗法联合使用。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的核酸分子(特别的，其是人源的MeCp2启动子)可以启动和/或调控编码外源蛋白(特别的，KCC2蛋白)在细胞中(特别的，神经细胞中)更高效的转录和/或表达。相比现有技术中的用于神经系统的其他启动子，本申请的核酸分子或启动子用于KCC2基因治疗药物中可以更安全地、有效地治疗脊髓损伤，并且相对于鼠源MeCp2启动子具有更低的免疫风险。

下面结合附图和具体实施方式对本公开做进一步说明，并非对本公开的限制。凡是依照本公开内容所进行的任何本领域等同替换，均属于本专利的保护范围。

附图说明

图1.重组腺相关病毒中包含不同启动子的载体基因组的主体结构图。

图2.穿梭质粒pSNAV2.0-K-Syn-KCC2-BGH构建过程的质粒图谱。

图3.包含不同启动子的穿梭质粒的图谱。

图4.不同重组病毒感染神经元细胞后的免疫荧光检测结果。

图5.不同重组病毒体外生物学活性检测结果。

图6.不同重组病毒的体内药效检测结果(BMS评分)。

图7.不同重组病毒的体内药效检测结果(存活率)。

发明详述

定义

除非另外指出，本发明的实践将采用本领域技术中的常规化学、生物化学、重组DNA技术和免疫学的方法。这样的技术在文献中有充分解释(参见例如FundamentalVirology，第二版，vol.I&II(B.N.Fields和D.M.Knipe编)；Handbook of ExperimentalImmunology，VoIs.I-FV(D.M.Weir和CC.Blackwell编，Blackwell ScientificPublications)；T.E.Creighton， Proteins:Structures and MolecularProperties(W.H.Freeman和Company，1993)；A.L.Lehninger，Biochemistry(Worth Publishers,Inc.，current addition)；Sambrook,等，Molecular Cloning:ALaboratory Manual(第2版，1989)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编，Academic Press,Inc.)。

为了便于理解本公开内容的各个实施方案，提供了特定术语的以下解释：

腺相关病毒(AAV)：感染人和其他一些灵长类物种的小的复制缺陷性无包膜病毒。已知AAV不造成疾病并且引起非常轻微的免疫应答。使用重组AAV载体可以感染分裂细胞和静止期细胞，并且可以保持染色体外状态而不整合到宿主细胞的基因组中。这些特征使得AAV成为用于基因疗法的有吸引力的病毒载体。

给药/给予：通过有效的途径向受试者提供或给予药剂，例如治疗剂(例如，重组AAV)。示例性给药途径包括但不限于注射(例如，皮下、肌内、真皮内、腹膜内、静脉内、脑室内、鞘内、脊髓内)、口服、导管内、舌下、直肠、经皮、鼻内、阴道和吸入途径。

密码子优化的：“密码子优化的”核酸是指已经被改变以使得密码子最适于特定系统(例如，特定物种或物种的组)中的表达的核酸序列。例如，核酸序列可以被优化用于在哺乳动物细胞或特定哺乳动物物种(例如，人细胞)中表达。密码子优化不改变所编码蛋白质的氨基酸序列。

增强子：通过提高启动子的活性来提高转录效率的核酸序列。

反向末端重复(ITR)：有效复制所需的、腺相关病毒基因组中的、对称核酸序列。ITR序列分别位于AAVDNA基因组的每一端。ITR充当病毒DNA合成的复制起点，并且是产生AAV整合型载体的必要的顺式元件。

分离的：“分离的”生物组分(例如，核酸分子、蛋白质、病毒或细胞)已经被从天然存在的生物体的细胞或组织中或者生物体本身的其他生物组分(例如，其他染色体和染色体外DNA和RNA、蛋白质和细胞)中基本上分离或纯化。已经“分离”的核酸分子和蛋白质包括通过标准纯化方法纯化的那些。该术语还包括通过在宿主细胞中重组表达制备的核酸分子和蛋白质，以及化学合成的核酸分子和蛋白质。

可操作地连接：当第一核酸序列与第二核酸序列被放置为具有功能关系时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子与编码序列可操作地连接。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且当有必要连接两个蛋白质编码区时，其在相同阅读框中。

可药用载体：本公开内容中可以使用的可药用载体(溶剂(vehicle))是常规的。Remington’s Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,MackPublishing Co.,Easton,PA,15th Edition(1975)描述了适合一种或更多种治疗性化合物、分子或试剂的药物递送的组合物和制剂。

通常，载体的性质取决于所使用的特定给药方式。例如，胃肠外制剂通常包含可注射流体，其包括药学和生理学上可接受的流体，例如水、生理盐水、平衡盐溶液、水性右旋糖、甘油等作为溶剂。对于固体组合物(例如，粉末剂、丸剂、片剂或胶囊剂形式)，可以包含常规无毒固体载体，例如药物级甘露醇、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学中性载体外，待给予的药物组合物还可以包含少量无毒辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、防腐剂和pH缓冲剂等，例如醋酸钠或脱水山梨糖醇单月桂酸酯。

预防、治疗或改善疾病：“预防”疾病是指抑制疾病的全面发生。“治疗”是指在疾病开始发生后改善疾病或病理病症的体征或症状的治疗性介入。“改善”是指降低疾病的体征或症状的数目或严重性。

启动子：指导/引起核酸(例如，基因)转录的DNA区域。启动子包括转录起始位点附近的必要核酸序列。通常，启动子位于其转录的基因附近。启动子区域还任选地包括远端增强子或阻遏物元件，其可以位于距转录起始位点数千个碱基对远。

重组：重组核酸分子是指这样的核酸分子，其具有非天然存在的序列，或者具有通过两个序列片段的人为组合(否则地话，其将是分开的)制备的序列。这种人为组合可以通过化学合成或者通过分离的核酸分子片段的人为操作(如通过基因工程技术)实现。

同样地，重组病毒是包含非天然存在的序列或通过至少两个不同来源的序列的人为组合制备的序列的病毒。术语“重组”还包括仅通过天然核酸分子、蛋白质或病毒的一部分的添加、置换或缺失改变的核酸、蛋白质和病毒。本文使用的“重组AAV”是指其中包装有重组核酸分子(例如，编码G6Pase-α的重组核酸分子)的AAV颗粒。

血清型：通过抗原的特征组区分的一类密切相关的微生物(例如，病毒)。

受试者：活的多细胞脊椎动物生物体，包括人和非人哺乳动物的类别。具体地，本文描述的受试者是患有脊髓损伤的个体，所述个体可能具有残余的内源KCC2蛋白活性，或者没有可测量的活性。

合成：通过人工手段在实验室产生，例如合成核酸可以在实验室化学合成。

治疗有效量：足以在用试剂治疗的受试者或者细胞中取得所需效果的特定药物或治疗试剂(例如重组AAV)的量。试剂的有效量取决于多种因素，包括但不限于被治疗的受试者或细胞，以及治疗性组合物的给药方式。

载体：载体是允许插入外源核酸而不破坏载体在宿主细胞中复制和/或整合的能力的核酸分子。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制起点。载体还可以包含一种或更多种选择性标记基因和其他遗传元件。表达载体是包含必要的调控序列以允许插入的基因转录和翻译的载体。在本文的一些实施方案中，载体是AAV载体。

序列同一性：两个或更多个核酸序列之间或者两个或更多个氨基酸序列之间的同一性或相似性是根据序列之间的同一性或相似性表示。序列同一性可以根据百分比同一性测量；百分比越高，序列越相同。序列相似性可以根据百分比相似性测量(考虑保守性氨基酸置换)；百分比越高，序列越相似。当使用标准方法比对时，核酸或氨基酸序列的同源物或直系同源物具有相对高的序列同一性/相似性程度。与来自相关性更远的物种(例如，人和线虫(C.elegans)序列)相比，当直系同源蛋白质或cDNA来自更紧密相关的物种(例如，人和小鼠序列)时，这种同源性更显著。

序列同一性比较的长度可在基因组的全长上，基因编码序列的全长，或至少大约500至5000个核苷酸的片段是期望的。但是，在较小片段(例如具有至少大约9个核苷酸，通常至少大约20至24个核苷酸、至少大约28至32个核苷酸、至少大约36或更多个核苷酸)中的同一性也可以是期望的。

可在全长的蛋白、多肽、大约32个氨基酸、大约330个氨基酸或其肽片段或相应的核酸编码序列上容易地测定氨基酸序列的百分比同一性。合适的氨基酸片段的长度可以为至少大约8个氨基酸，并可以为至最多大约700个氨基酸。通常，当提到两种不同序列之间的“同一性”、“同源性”或“相似性”时，参照“比对”序列确定“同一性”、“同源性”或“相似性”。“比对”序列或“比对”是指多个核酸序列或蛋白(氨基酸)序列，其通常含有与参考序列相比缺失或额外的碱基或氨基酸的校正。

使用任何公共或市售可得的多序列比对程序来进行比对。序列比对程序可用于氨基酸序列，例如“Clustal X”、“MAP”、“PIMA”、“MSA”、“BLOCKMAKER”、“MEME”和“Match-Box”程序。通常，这些程序中的任一种以默认设置使用，尽管本领域技术人员可以按需改变这些设置。或者，本领域技术人员可以采用至少提供如参考算法或程序所提供的同一性或比对水平的另一算法或计算机程序。参见例如J.D.Thomson等人,Nucl.Acids.Res.,“Acomprehensive comparison ofmultiple sequence alignments”,27(13):2682-2690(1999)。

多序列比对程序还可用于核酸序列。此类程序的实例包括“ClustalW”、“CAPSequence Assembly”、“BLAST”、“MAP”和“MEME”，其可以通过互联网上的Web服务器来访问。此类程序的其它来源是本领域技术人员已知的。或者，还使用VectorNTI应用程序。还存在许多可用于测量核苷酸序列同一性的本领域已知的算法，包括在上述程序中包含的那些。作为另一实例，可以使用Fasta^TM(GCGVersion 6.1中的一个程序)来比较多核苷酸序列。Fasta^TM提供了询问与搜索序列之间最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性。例如，可以使用Fasta^TM以其在GCGVersion 6.1(经此引用并入本文)中提供的默认参数(字长为6，和用于打分矩阵的NOPAM因子)来确定核酸序列之间的百分比序列同一性。

“复制缺陷型病毒”或“病毒载体”是指合成或人工病毒粒子，其中含有相关基因的表达盒包装在病毒衣壳或包膜中，其中也包装在该病毒衣壳或包膜中的任何病毒基因组序列是复制缺陷的，即它们不能产生子代病毒体，但是保留了感染靶细胞的能力。在一个实施方案中，该病毒载体的基因组不包括编码复制所需的酶的基因(该基因组可以被工程化为“无内容”——仅含有侧接扩增和包装人工基因组所需信号的相关转基因)，但是这些基因可以在生产过程中提供。因此，其被认为对用于基因疗法是安全的，因为除了在复制所需病毒酶的存在下，复制和被子代病毒体感染不会发生。此类复制缺陷型病毒可以是腺相关病毒(AAV)、腺病毒、慢病毒(整合或非整合)或另一合适的病毒源。

“自身互补型AAV”是指其中重组AAV所携带的编码区被设计为形成分子内双链DNA模板的构建体。在感染时而不是等待第二链的细胞介导合成，该scAAV的两个互补半部将缔合以形成准备即时复制和转录的一个双链DNA(dsDNA)单元，参见例如D M McCarty等人,“Self-complementary recombinant adeno-associated virus(scAAV)vectorspromote efficienttransduction independently ofDNA synthesis”,Gene Therapy(2001年8月),第8卷,第16期,第1248-1254页。自身互补型AAV描述在例如US6,596,535B1、US7,125,717B2和US7,456,683B2中，其各自经此引用全文并入本文。

术语“表达”在本文中以其最广泛的含义使用，并包括生产DNA或RNA和蛋白。就RNA而言，术语“表达”或“翻译”特别涉及生产肽或蛋白。表达可以是瞬时的，或可以是稳定的。

在本发明上下文中的术语“翻译”涉及在核糖体处理的过程，其中mRNA链控制氨基酸序列的组装以生成蛋白或肽。

术语“一种”或“一个”是指一种(个)或多种(个)。由此，术语“一种”(或“一个”)、“一种或多种”和“至少一种”在本文中可互换使用。

词语“包含”应解释为包含性的而非排他性的。词语“由……组成”及其变体应解释为排他性的而非包含性的。虽然说明书中的各种实施方案出现使用“包含”的语言，但是在其它情况下，相关实施方案也意在使用“由……组成”或“基本由……组成”的语言来解释和描述。

本文中所用的术语“大约”是指与给定的参考值相差10％(±10％)，除非另行规定。

本文中所用的“疾病”、“障碍”和“病症”可互换使用，以指示受试者体内的异常状态。

启动子

本发明第一方面提供了一种核酸分子，其具有如SEQ ID NO：6或7所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：6或7具有80％以上(例如，85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上)序列同一性的核苷酸序列。特别地，所述核酸分子是一种启动子；更特别地，所述核酸分子为一种人源的MeCp2启动子。

MeCp2是编码甲基化CpG结合蛋白2(murine methyl-CpG-bindingprotein 2)的基因，在中枢神经系统神经元中高表达，对维持神经元间的突触连接起到重要作用。

MeCp2启动子为甲基CpG结合蛋白2(murine methyl-CpG-bindingprotein 2)的启动子，在基因组中位于MeCp2基因起始密码子的上游，可调控和启动该基因DNA序列的转录。

在本发明的一些优选实施方案中，所述启动子为mMeCp2启动子，所述mMeCp2为鼠的MeCp2基因的天然启动子。

重组核酸分子

本发明第二方面提供了一种重组核酸分子，其包含上述核酸分子(或者，也可称之为启动子)、编码外源蛋白的核酸序列和多聚腺苷酸序列(即polyA)。

在一个实施方案中，所述外源蛋白为KCC2蛋白。

KCC2蛋白及编码其的核酸序列

KCC2为K⁺-Cl^-协同转运蛋白2，也称为溶质载体家族12成员5，是由SLC12A5基因编码的神经元特异性K⁺-Cl^-协同转运蛋白，主要介导神经元特异性K⁺-Cl^-的转运。KCC2蛋白具有12个跨膜区、以及6个胞外loop环、一个较短的胞内氨基末端(NTD)以及一个较长的胞内羧基末端(CTD)。KCC2具有两个亚型：KCC2a和KCC2b，其区别在于KCC2a的NTD比KCC2b的NTD多23个氨基酸。目前已从多种物种中发现KCC2蛋白，包括人KCC2蛋白、小鼠KCC2蛋白、大鼠KCC2蛋白、兔、狗、猪等的KCC2蛋白，各种KCC2蛋白的氨基酸序列和核苷酸序列是已知的，在NCBI等多种生物信息数据库中可以查到，例如人 KCC2a全长的NCBI Gene ID为57468，其氨基酸序列编号为NCBI RefSeq:NP_001128243.1(SEQ ID NO：3)，其mRNA序列编号为NCBI RefSeq:NM_001134771.2。

本发明所述的KCC2蛋白可以来源于不同物种。在一个实施方案中，本发明的KCC2蛋白是天然存在的成熟KCC2蛋白。在另一实施方案中，本发明的KCC2蛋白包括保留了生物学活性的各种突变体或衍生物。

在一个实施方案中，提供了修饰或优化的KCC2蛋白编码序列。在一个实施方案中，所述KCC2蛋白编码序列是密码子优化的序列，针对其在受试物种中的表达而进行了优化。本文中所用的“受试者”是哺乳动物，例如人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪或非人灵长类，如猴子、黑猩猩、狒狒或大猩猩。在一个优选实施方案中，该受试者是人。在一个实施方案中，该序列经密码子优化用于在人体内表达。

密码子优化的编码区可以通过各种不同的方法来设计。可以使用可在线获得的方法(例如GeneArt)、公开的方法、或提供密码子优化服务的公司，例如DNA2.0(Menlo Park,CA)来进行这种优化。例如，在国际专利公开号WO 2015/012924A2中描述了一种密码子优化方法，其经此引用全文并入本文。还参见例如US2014/0032186A1和US2006/0136184A1。适当地，修改该产品的开放阅读框(ORF)的整个长度。但是，在一些实施方案中，可以仅改变ORF的片段。通过使用这些方法中的一种，可以对任意给定的多肽序列施加所述频率，并生产编码该多肽的密码子优化的编码序列。

许多选择可用于对密码子进行实际改变或用于合成如本文中所述设计的密码子优化的编码区。可以使用本领域普通技术人员熟知的标准和常规的分子生物学操作来进行此类修饰或合成。在一种方法中，通过标准方法合成了各自长度为80-90个核苷酸并跨越所需序列长度的一系列互补寡核苷酸对。合成这些寡核苷酸对，使得它们在退火时形成含有粘性末端的80-90个碱基对的双链片段，例如合成该对中的各寡核苷酸以超出与该对中另一寡核苷酸互补的区域延伸3、4、5、6、7、8、9、10或更多个碱基。各寡核苷酸对的单链末端被设计为与另一寡核苷酸对的单链末端退火。使该寡核苷酸对退火，并随后使这些双链片段中的大约五至六个经由粘性单链末端一起退火，和随后它们连接在一起并克隆到标准细菌克隆载体中，例如可获自Invitrogen Corporation,Carlsbad,Calif的载体。随后通过标准方法对该构建体进行测序。制备数个由连接在一起的5至6个80至90个碱基对的片段(即大约500个碱基对的片段)组成的这些构建体，以使整个所需序列显示为一系列的质粒构建体。随后用适当的限制酶切割这些质粒的插入物，并连接在一起以形成最终构建体。最终构建体随后克隆到标准细菌克隆载体中，并进行测序。另外的方法对本领域技术人员会是显而易见的。此外，基因合成容易购得。

本文中描述的编码KCC2蛋白的核苷酸序列可以使用本领域中熟知的技术合成产生。例如，可以采用长DNA序列方法的基于PCR的精确合成(PAS)，如Xiong等人,PCR-basedaccurate synthesis oflong DNA sequences,Nature Protocols 1,791-797(2006)所述。由Young和Dong描述了结合双不对称PCR和重叠延伸PCR法的方法，Two-step totalgene synthesis method,Nucleic Acids Res.2004；32(7):e59。还参见Gordeeva等人,J Microbiol Methods.Improved PCR-based gene synthesis method and itsapplication to the Citrobacter freundii phytase gene codon modification.2010年5月；81(2):147-52.Epub 2010年3月10日；还参见关于寡核苷酸合成和基因合成的以下专利，Gene Seq.2012年4月；6(1):10-21；US 8008005和US 7985565。这些文献各自经此引用并入本文。此外，经由PCR生成DNA的试剂盒与方案是市售可得的。这些包括使用聚合酶，包括但不限于Taq聚合酶、(New England Biolabs)、High-Fidelity DNA聚合酶(New England Biolabs)和G2聚合酶(Promega)。还可以由用含有本文中所述的KCC2蛋白序列的质粒转染的细胞生成DNA。试剂盒和方案是已知和市售可得的，并包括但不限于QIAGEN质粒试剂盒、Pro Filter质粒试剂盒(Invitrogen)和GenElute^TM质粒试剂盒(Sigma Aldrich)。在本文中可用的其它技术包括序列特异性等温扩增方法，其消除了对热循环的需要。这些方法通常使用链置换DNA聚合酶如Bst DNA聚合酶、大片段(Large Fragment)(New England Biolabs)而非加热来分离双链体DNA。DNA还可以经由使用逆转录酶(RT)通过扩增由RNA分子生成，所述逆转录酶是RNA依赖性DNA聚合酶。RT聚合与原始RNA模板互补的DNA链，并被称为cDNA。这种cDNA随后可以通过PCR或如上所述的等温法进一步扩增。定制DNA也可以经商业途径由公司生成，所述公司包括但不限于GenScript、(Life Technologies)和Integrated DNATechnologies。

在本发明的一些具体实施方案中，所述KCC2蛋白的编码核酸分子是DNA或RNA。在本发明一些具体实施方案中，所述KCC2蛋白的编码核酸分子具有选自以下的多核苷酸序列：

1)SEQ ID NO：2所示的多核苷酸序列；

2)SEQ ID NO：2所示的多核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸而得到的核苷酸序列；或

3)与SEQ ID NO：2具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的序列；更优选地，具有98％或99％以上同一性的序列；在更优选地实施方案中，所述多核苷酸序列是密码子优化的序列。

多聚腺苷酸序列(PolyA)

在本发明的一些实施方案中，所述多聚腺苷酸序列(polyA)为BGH polyA。

BGH polyA为牛生长激素多聚腺苷酸信号(bovine growth hormone polyadenylation signal)，其为真核生物的一种转录终止信号。在本发明的一个具体实施方案中，所述BGH polyA的序列如SEQ ID NO：8所示。

其他调控元件

在本发明的一些具体实施方案中，所述重组核酸分子还进一步包含其他的表达调控元件，例如Kozak序列、WPRE和转录后调节元件中的一种或多种。其中Kozak序列可以增强翻译效率，WPRE序列可增强与稳定mRNA表达。

在本发明的一些优选实施方案中，所述重组核酸分子包含选自以下多核苷酸序列：

1)SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示的多核苷酸序列；

2)SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示的多核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸而得到的核苷酸序列；或

3)与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有80％以上序列同一性的多核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的序列；更优选地，具有98％或99％以上同一性的序列。

其中，SEQ ID NO:12所示的多核苷酸序列包含以下元件：hMeCp2启动子、编码全长KCC2的核酸序列、BGH polyA序列。SEQ ID NO:13所示的多核苷酸序列包含以下元件：short hMeCp2启动子、编码全长KCC2蛋白的核酸序列、BGH polyA序列。

重组载体或重组腺相关病毒

本发明第三方面还提供了一种重组载体，其包含前述的核酸分子(或者，也可称之为启动子)或重组核酸分子。

在一些具体实施方案中，所述载体选自质粒载体、噬菌体载体或病毒载体，其中病毒载体选自腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体或杂合病毒载体。

在一些具体实施方案中，将本文中描述的编码KCC2蛋白的核酸分子可工程化为可用于生成病毒载体和/或递送至宿主细胞的合适的遗传元件(载体)，例如裸DNA、噬菌体、转座子、粘粒、游离基因等等，其传送在其上携带的编码KCC2蛋白的核酸分子。所选载体可以通过任何合适的方法来递送，包括转染、电穿孔、脂质体递送、膜融合技术、高速DNA包覆小球、病毒感染和原生质体融合。用于制造此类构建体的方法是核酸操作领域技术人员已知的，并包括基因工程、重组工程和合成技术。参见例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY。

本发明第四方面还提供了一种重组腺相关病毒，所述重组腺相关病毒包含AAV衣壳和载体基因组，其中，所述载体基因组包含前述的核酸分子(或者，也可称之为启动子)或重组核酸分子。

腺相关病毒(AAV)病毒载体是用于递送至靶细胞的可将外源核酸序列包装至AAV蛋白衣壳之中的AAVDNase抗性粒子。AAV衣壳由60个衣壳蛋白亚基VP1、VP2和VP3组成，这三种蛋白亚基根据AAV亚型的不同以大约1:1:10至1:1:20的比例以二十面体对称排列。该AAV衣壳可以选自本领域已知的那些AAV衣壳，包括其变体。

在一个实施方案中，该AAV衣壳选自可有效转导神经元细胞的那些AAV衣壳。在一个实施方案中，该AAV衣壳选自AAV1、AAV2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.10、AAV5、AAVhu.11、AAV8DJ、AAVhu.32、AAVhu.37、AAVpi.2、AAVrh.8、AAVhu.48R3及其变体，参见Royo等人,Brain Res,2008年1月,1190:15-22；Petrosyan等人,Gene Therapy,2014年12月,21(12):991-1000；Holehonnur等人,BMC Neuroscience,2014,15:28；以及Cearley等人,Mol Ther.2008年10月,16(10):1710-1718，其各自经此引用并入本文。

本文中可用的其它AAV衣壳，包括AAVrh.39、AAVrh.20、AAVrh.25、AAV10、AAVbb.1和AAVbb.2及其变体。作为AAV病毒载体(DNase抗性病毒粒子)的衣壳的来源，可以选择其它AAV血清型，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAVrh64R1、AAVrh64R2、AAVrh8、AAVrh.10、任何已知或提及的AAV的变体或尚待发现的AAV，参见例如US20070036760A1、US20090197338A1、EP 1310571A2。还参见WO 2003/042397A2(AAV7和其它猿猴AAV)、US7790449B2和 US7282199B2(AAV8)、WO2005/033321A2和US 7,906,111B2(AAV9)、以及WO 2006/110689A2和WO 2003/042397 A2(AAVrh.10)。或者，基于任何所述AAV的重组AAV可以用作AAV衣壳的来源。这些文献还描述了可以选择用于生成AAV的其它AAV，并经此引用并入。在一些实施方案中，用于该病毒载体的AAV衣壳可以通过前述AAV衣壳之一或其编码核酸的诱变(即通过插入、缺失或取代)来产生。

在一些具体实施方案中，该AAV衣壳是嵌合的，包含来自两种或三种或四种或更多种前述AAV衣壳蛋白的结构域。在一些实施方案中，该AAV衣壳是来自两种或三种不同的AAV或重组AAV的Vpl、Vp2和Vp3单体的嵌合体。如本文中所用，关于AAV，术语变体是指从已知AAV序列衍生的任何AAV序列，包括在氨基酸或核酸序列上共享至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或更大的序列同一性。在另一实施方案中，该AAV衣壳包括与任何所述或已知AAV衣壳序列包含至最多大约10％变异的变体。也就是说，该AAV衣壳与本文中提供的和/或本领域已知的AAV衣壳共享大约90％～99.9％的同一性、大约95％～99％的同一性、或大约97％～98％的同一性。在一个实施方案中，该AAV衣壳与AAV衣壳共享至少95％的同一性。当确定AAV衣壳的百分比同一性时，可以对任何可变蛋白(例如vp1、vp2或vp3)进行该比较。在另一实施方案中，使用自身互补型AAV(scAAV)。在另一个实施方案中，使用单链AAV(ssAAV)。

在一些优选实施方案中，所述AAV衣壳选自进化支A-F中的任意血清型的AAV或AAV1型、AAV2型、AAV3型、AAV4型、AAV5型、AAV6型、AAV7型、AAV8型、AAV9型或其杂交/嵌合型中的任意一个，在某些优选实施方案中，所述重组腺相关病毒的衣壳为AAV9，其氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示。在一些优选实施方案中，所述重组腺相关病毒为单链重组腺相关病毒。

在一些具体实施方案中，本文所述的重组核酸分子可以包装到病毒载体(例如病毒粒子)的衣壳中。通常，用于生成病毒载体的此类重组核酸分子含有本文中描述的KCC2蛋白的编码序列，其侧接病毒基因组的包装信号，以及其它表达控制序列，如本文中描述的那些。例如，对于AAV病毒载体而言，包装信号是5'反向末端重复(ITR)和3'ITR。当包装到AAV衣壳中时，该重组核酸分子以及与之结合的ITRs在本文中被称为“重组AAV(rAAV)基因组”或“载体基因组”。

在一些具体实施方案中，本发明提供的重组腺相关病毒载体(rAAV)包含AAV衣壳和本文所述的载体基因组。在一些具体实施方案中，所述载体基因组包含编码KCC2蛋白的核酸分子以及引导和/或调控上述核酸分子在宿主细胞中表达的调控序列(如本文描述的核酸分子(或者，也可称之为启动子))。在一些具体实施方案中，所述载体基因组包含本发明中所述的重组核酸分子。在另一些具体实施方案中，该载体基因组中还包含AAV的ITR序列。在一个实施方案中，该ITRs来自于与提供衣壳不同的AAV血清型。在一个优选实施方案中，该ITR序列来自AAV2，或其缺失变体(ΔITR)，其可能因方便起见而使用并加速调节许可(regulatory approval)。但是，可以选择来自其它AAV来源的ITR。当ITR的来源是来自AAV2且AAV衣壳来自另一AAV源时，所得载体可以被称为是假型的。通常，AAV载体基因组包含AAV 5'ITR以及AAV3'ITR。已经描述了其中缺失D-序列和末端解析位点(trs)的5'ITR的缺失变体(称为ΔITR)。在一些实施方案中，使用全长AAV的5'和3'ITRs。各血清型的ITR或ΔITR序列是本领域技术人员所熟知的。

在一个实施方案中，该衣壳是AAV9衣壳(其氨基酸序列如SEQ ID NO：14所示)或其变体。

在一个实施方案中，可以选择单链AAV(ssAAV)。

在一个实施方案中，可以选择双链AAV，或自身互补型AAV(scAAV)。

生成和分离适于递送至受试者的AAV病毒载体的方法在本领域中是已知的。参见例如US2007/0036760A1(2007年2月15日)、US7790449B2、US7282199B2、WO 2003/042397 A2、WO 2005/033321 A2、WO 2006/110689A2和US7588772B2。在一种系统中，用编码侧接ITR的转基因的构建体和编码rep与cap的构建体瞬时转染生产细胞系。在第二系统中，用编码侧接ITR的转基因的构建体瞬时转染稳定提供rep和cap的包装细胞系。在各自这些系统中，AAV病毒体响应于感染辅助腺病毒或疱疹病毒而产生，其中需要从污染病毒中分离rAAV。后来，开发了不需要用辅助病毒感染以回收AAV的系统，由该系统以反式提供了所需辅助功能(即腺病毒E1、E2a、VA和E4或疱疹病毒UL5、UL8、UL52和UL29以及疱疹病毒聚合酶)，在这些系统中，辅助功能可以通过用编码所需辅助功能的构建体瞬时转染该细胞来提供，或者该细胞可以被工程化以稳定含有编码该辅助功能的基因，其表达可以以转录水平或转录后水平来控制。在又一种系统中，通过用基于杆状病毒的载体感染将侧接ITR的转基因和rep/cap基因引入到昆虫细胞中。对于这些生产系统的概述，通常参见例如Zhang等人,2009,“Adenovirus-adeno-associated virus hybrid for large-scale recombinant adeno-associated virus production”,Human Gene Therapy 20:922-929，其各自的内容经此引用全文并入本文。制造和使用这些和其它AAV生产系统的方法还描述在下列美国专利中，其各自的内容经此引用全文并入本文，这些美国专利的专利号为：5,139,941、5,741,683、6,057,152、6,204,059、6,268,213、6,491,907、6,660,514、6,951,753、7,094,604、7,172,893、7,201,898、7,229,823和7,439,065。

任选地，本文中所述的重组核酸分子也可用于产生其它的病毒载体。此类其它病毒载体可以包括适于可采用的基因疗法的任何病毒，包括但不限于腺病毒；疱疹病毒；慢病毒；逆转录病毒等等。合适地，当产生这些其它载体中的一种时，其作为复制缺陷型病毒载体产生。

细胞

本发明第五方面还提供一种分离的宿主细胞，其包含前述的核酸分子(或者，也可称之为启动子)或重组核酸分子或前述的重组载体或重组腺相关病毒。

在一些具体实施方案中，所述细胞为神经元细胞；在一些具体实施方案中所述细胞为胆碱能神经元细胞、去甲肾上腺素能神经元细胞、多巴胺能神经元细胞、5-羟色胺能神经元细胞、γ-氨基丁酸能神经元细胞；在一些具体实施方案中，所述细胞为神经细胞系，包括NG108-15、N1E115、PC12、SHSY5Y、F11、ND7-23、N27、SN4741细胞系。

药物组合物

本发明第六方面还提供一种药物组合物，其包含前述的核酸分子(或者，也可称之为启动子)或重组核酸分子、重组载体或重组腺相关病毒和/或前述的宿主细胞以及药学上可接受的赋形剂。在一些优选实施方案中，所述药物组合物可配制为用于静脉注射、鞘内注射、脑室内注射、脊髓内注射、胸腔注射、口服、吸入、鼻内、气管内、动脉内、眼内、肌内、腹内和/或其它肠胃外途径进行给药。在一些优选实施方案中，所述药物组合物还可以包括其他的可用于治疗脊髓损伤的药物。

在一些具体实施方案中，本发明所述的药物组合物可设计为通过任何合适的途径或不同途径的组合递送至需要其的受试者。在一个实施方案中，该组合物经由静脉注射来递送。在一个实施方案中，该药物组合物经由脊髓内注射递送。在一个实施方案中，可经由鞘内注射来进行。在一个实施方案中，该组合物经由脑室内注射来递送。在另一实施方案中，该组合物经由胸腔注射来递送。在另一个实施方案中，可以进行靶组织的原位注射。或者，可以选择其它施用途径(例如口服、吸入、鼻内、气管内、动脉内、眼内、肌内、腹内和其它肠胃外途径)。

在一些具体实施方案中，本文中描述的重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒或分离的宿主细胞可以以单一组合物或多种组合物递送。任选地，可以递送两种或多种不同的AAV(参见例如WO 2011/126808A2和WO 2013/049493A1])。在另一实施方案中，此类多种病毒可以含有不同的复制缺陷型病毒(例如AAV、腺病毒和/或慢病毒)。或者，可以通过非病毒载体，例如“裸DNA”、“裸质粒DNA”、RNA和mRNA来介导递送；与各种递送组合物和纳米粒子结合，包括例如胶束、脂质体、阳离子脂质-核酸组合物、聚多糖(poly-glycan)组合物和其它聚合物、基于脂质和/或胆固醇-核酸缀合物，以及如本文中所述的其它构建体，参见例如X.Su等人,Mol.Pharmaceutics,2011,8(3),第774-787页；网络出版:2011年3月21日；WO2013/182683A1、WO 2010/053572A2和WO 2012/170930A1，其均经此引用并入本文，此类非病毒KCC2递送载体可以通过前述途径施用。

在一些具体实施方案中，上述病毒载体或非病毒DNA或RNA转移部分，可以用生理可接受载体配制以用于基因转移和基因疗法。在一些具体实施方案中，所述递送载体，可以选择多种合适的纯化方法，描述适于从载体粒子中分离空衣壳的纯化方法的实例，例如2016年12月9日提交的国际专利申请号PCT/US16/65976及其优先权文件，2016年4月13日提交的美国专利临时申请号62/322,098和2015年12月11日提交的且题为“Scalable Purification Method forAAV8”的美国专利临时申请号62/266,341中描述的方法，其经此引用并入本文。还参见以下文献中描述的纯化方法：2016年12月9日提交的国际专利申请号PCT/US16/65974及其优先权文件，2016年4月13日提交的美国专利临时申请号62/322,083，和2015年12月11日提交的62/266,351(AAV1)，2016年12月9日提交的国际专利申请号PCT/US16/66013及其优先权文件，2016年4月13日提交的美国临时申请号62/322,055和2015年12月11日提交的62/266,347(AAVrh10)，2016年12月9日提交的国际专利申请号PCT/US16/65970及其优先权申请美国临时申请号62/266,357和62/266,357(AAV9)，其经此引用并入本文。在一个实施方案中，纯化包括两步骤的纯化方案，其从rAAV生产细胞培养物的澄清浓缩上清液中选择性捕获并分离含有基因组的rAAV载体粒子。该方法利用了在高盐浓度下进行的亲和捕获方法，随后是在高pH下进行的阴离子交换树脂方法，以提供基本不含rAAV中间体的rAAV载体粒子。在另一个实施方案中，纯化包括亲和层析、超速离心、分子筛层析等。

在AAV病毒载体的情况下，病毒基因组(vg)的定量可以用作制剂中所含剂量的量度。以本文公开的方法施用的rAAV的剂量将根据例如特定的rAAV、施用方式、治疗目标、个体和靶向的细胞类型而变化，并且可以通过本领域标准方法确定。剂量可以以病毒基因组(vg) 为单位表示(即，分别为1×10⁷vg、1×10⁸vg、1×10⁹vg、1×10¹⁰vg、1×10¹¹vg、1×10¹²vg、1×10¹³vg、1×l0¹⁴vg、1×10¹⁵vg、1×10¹⁶vg)。剂量也可以以每千克(kg)体重的病毒基因组(vg)为单位表示(即，分别为1×10⁶vg/kg、1×10⁷vg/kg、1×10⁸vg/kg、1×10⁹vg/kg、分别为1×10¹⁰vg/kg、1×10¹¹vg/kg、5×10¹¹vg/kg、1×10¹²vg/kg、5×10¹²vg/kg、1×10¹³vg/kg、1×10¹⁴vg/kg、1×10¹⁵vg/kg、1×10¹⁶vg/kg)。滴定AAV的方法描述于Clark等人，《人类基因治疗(Hum.GeneTher)》1999年；10:1031-1039。

这些上述剂量可以在各种体积的载体、赋形剂或缓冲剂制剂中施用，所述体积在大约25微升至大约15毫升的范围内，包括该范围内的所有数字，取决于待处理的区域的尺寸、所用病毒滴度、施用途径和该方法的预期效果。在一个实施方案中，载体、赋形剂或缓冲剂的体积为至少大约25μL。在一个实施方案中，该体积为大约50μL。在另一实施方案中，该体积为大约100μL。在另一实施方案中，该体积为大约200μL。在另一实施方案中，该体积为大约300μL。在另一实施方案中，该体积为大约400μL。在另一实施方案中，该体积为大约500μL。在又一实施方案中，该体积为大约600μL。在另一实施方案中，该体积为大约700μL。在又一实施方案中，该体积为大约800μL。在又一实施方案中，该体积为大约900μL。在又一实施方案中，该体积为大约1mL。在又一实施方案中，该体积为大约2mL。在另一实施方案中，该体积为大约3mL。在另一实施方案中，该体积为大约4mL。在另一实施方案中，该体积为大约5mL。在另一实施方案中，该体积为大约6mL。在另一实施方案中，该体积为大约7mL。在另一实施方案中，该体积为大约8mL。在另一实施方案中，该体积为大约9mL。在另一实施方案中，该体积为大约10mL。在另一个实施方案中，该体积为大约15ml。

该rAAV优选悬浮在生理相容性载体中，可以施用于人或非人哺乳动物患者。在另一实施方案中，该组合物包括药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂和/或佐剂。合适的载体可以由本领域技术人员鉴于转移病毒针对的适应症容易地选择。例如，包括盐水，其可以用多种缓冲溶液(例如磷酸盐缓冲盐水)配制。其它示例性载体包括无菌盐水、乳糖、蔗糖、磷酸钙、明胶、葡聚糖、琼脂、果胶、花生油、芝麻油和水。该缓冲剂/载体应包括防止rAAV附着到输注管但不会干扰rAAV体内结合活性的组分。

任选地，本发明的组合物除了rAAV与药学上可接受的载体之外可以含有其它常规药物成分，如防腐剂或化学稳定剂。合适的示例性防腐剂包括氯丁醇、山梨酸钾、山梨酸、二氧化硫、没食子酸丙酯、对羟基苯甲酸酯类、乙基香草醛、甘油、苯酚和对氯苯酚。合适的化学稳定剂包括明胶和白蛋白。

本发明的组合物可以包含如上定义的药学上可接受的载体。合适地，本文中描述的组合物包含悬浮在药学上合适的载体中和/或与合适的赋形剂混合的有效量的一种或多种AAV，其设计为经由注射、渗透泵、鞘内导管递送至受试者，或通过另一装置或途径递送。

本文中描述的病毒载体可用于制备药物以便将编码KCC2蛋白的核酸分子递送至需要其的受试者(例如人患者)、向受试者提供KCC2蛋白治疗脊髓损伤。治疗过程可以任选包括重复施用相同的病毒载体(例如AAV9载体)或不同的病毒载体(例如AAV9和AAV10)。仍可以使用本文中描述的病毒载体和非病毒递送系统选择其它组合。

制药用途与治疗方法

本发明第七方面还提供了前述的核酸分子(或者，也可称之为启动子)、重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒、宿主细胞和/或前述的药物组合物在制备用于预防或治疗脊髓损伤的药物中的用途。在某些具体实施方案中，所述重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒、宿主细胞和/或药物组合物可以与另一疗法结合施用。

本发明第八方面还提供了在受试者中治疗脊髓损伤的方法，所述方法包括向需要其的受试者施用前述的重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒、宿主细胞和/或前述的药物组合物；在某些优选实施方案中，所述组合物静脉内施用；在某些优选实施方案中，所述组合物鞘内施用；在某些优选实施方案中，所述组合物脊髓内施用；在另一些优选实施方案中，所述受试者是哺乳动物；在更优选实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述治疗方法还可以与其他的疗法联合使用。

在一些具体实施方案中，上述重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒、宿主细胞和/或前述的药物组合物可以重复施用。任选地，允许超过一次的重复施用。此类重复施用可以具有相同类型的载体、不同的病毒载体、或经由本文中所述的非病毒递送。例如，如果用携带编码KCC2蛋白的核酸分子的rAAV9治疗患者，并需要二次治疗的话，可以随后施用携带上述核酸分子的rAAV10，并且反之亦然。

脊髓损伤患者的治疗可能需要联合疗法，如在本发明的一些实施方案中，本发明的药物组合物可与包括但不限于CLP290、骨桥蛋白、生长因子或4-胺基吡啶等任一种物质联合应用。如在本发明的另一些具体实施方案中，在用本发明的组合物治疗之前、期间和/或之后用免疫抑制剂瞬时共治疗。用于此类共疗法的免疫抑制剂包括但不限于类固醇、抗代谢物、T细胞抑制剂和烷化剂。例如，此类瞬时治疗可以包括以递减剂量每日一次服用类固醇(例如泼尼松(prednisole))7天，开始为大约60毫克的量，且每天减少10毫克(第7天无剂量)。可以选择其它剂量和免疫抑制剂。

除非在本说明书中另有定义，本文中使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员，并且通过参照公开文本通常理解的相同的含义，其向本领域技术人员提供了对许多本申请中使用的术语的一般指导。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例及其附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域的常规方法。

实施例1、表达盒设计及携带该表达盒的穿梭质粒的构建

1、包含不同启动子的表达盒的设计

为了验证本发明所涉的人源启动子(SEQ ID NO：6，下称hMeCp2启动子；或SEQ ID NO：7，下称short hMeCp2启动子)的效果，本实施例采用了多种启动子(Syn、mMeCp2、short mMeCp2、hMeCp2或short hMeCp2)以设计多个包含多种不同启动子的表达盒。同时，以腺相关病毒载体作为递送载体，验证了不同启动子对于人野生型全长KCC2蛋白在神经系统中表达的影响。

包含所述组合的表达盒及其核酸序列如下所示(其结构和组成示意图可参见图1，图中还示出了位于表达盒两侧的ITR，所述ITR来自于AAV2)：

(1)Syn-KCC2-BGH poly A(SEQ ID NO：9)；

(2)mMeCp2-KCC2-BGH polyA(SEQ ID NO：10)；

(3)short mMeCp2-KCC2-BGH polyA(SEQ ID NO：11)；

(4)hMeCp2-KCC2-BGH polyA(SEQ ID NO：12)；

(5)short hMeCp2-KCC2-BGH polyA(SEQ ID NO：13)。

其中，Syn-KCC2-BGH poly A(SEQ ID NO：9)为现有文献中已经公开的表达盒(参见WO2019226643A1)，在本实施例中作为阳性对照。

各启动子和poly A的核苷酸序列如下表1所示：

表1

2、携带上述表达盒的穿梭质粒的构建

基于上述各个表达盒，构建携带上述表达盒的穿梭质粒，用于包装相应的重组腺相关病毒载体。

2.1携带表达盒Syn-KCC2-BGH poly A的穿梭质粒的构建

(1)利用限制性内切酶Sal Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pSNAV2.0-Syn-EGFP载体(图2A)，回收大片段(约6329bp)。

(2)分别合成人源Syn启动子(人源synapsinⅠ启动子，人源突触蛋白Ⅰ启动子，SEQ ID NO：1)及其无缝连接引物(正向引物：5'-TGGTGGCGGCGATATCCTGCGCTCTCAGGCACGACAC-3'，反向引物：5'-GGGTTCCTCTGCTCGAGCAGTGCAAGTGGGTTTTAGG-3')和KCC2编码序列(Genebank NM_001134771.2)(SEQ ID NO：2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示)及其无缝连接引物(正向引物：5'-TCGAGGCAGATCTGTCGAC-3'，反向引物：5'-CAGGATATCGCCGCCACCATGAGCCGCAGGTTCACGGTC-3')(由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成)。

(3)通过无缝克隆PCR方法将Syn启动子、KCC2蛋白的编码序列插入到骨架载体5'ITR序列与BGH多聚腺苷酸之间，构建好的质粒命名为pSNAV2.0-Syn-KCC2(图2B)。

(4)将上述的质粒pSNAV2.0-Syn-KCC2再用SwaI和NruI进行双酶切，回收约6.2kb的载体片段。

(5)用无缝连接引物对1(正向引物：

5'-CAGCTGAACCAACTCGCGAATTCCACAGCTGCCTCGCGC-3'，反向引物：

5'-GGTGGCGGCGATATCCTGCGCTCTCAGGCACGAC-3')和引物对2(正向引物：

5'-CCGTTGAATATGGCTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTA-3'，反向引物：

5'-AGGTTAAGTCCTCATTTAAATTAGGCAA-3')以上述质粒pSNAV2.0-Syn-KCC2为模板进行PCR扩增原载体上的片段1(约1.27kb)和片段2(约270bp)。

(6)用无缝连接引物对3(正向引物：5'-TTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATG-3'，反向引物：5'-ATGAGCCATATTCAACGGGA-3')以合成的1902-Kan(含kana抗性编码基因)为模板PCR扩增kana抗性编码基因，命名为片段3。

(7)利用PCR在载体和片段1之间、片段1和片段3、片段3和片段2、片段2与载体之间添加同源臂，利用无缝连接方式将片段1、片段2、片段3和pSNAV2.0-Syn-KCC2的载体片段连接，获得的穿梭质粒命名为pSNAV2.0-K-Syn-KCC2-BGH(图2C，其载体基因组的主体结构如图1A所示)。

2.2携带mMeCp2-KCC2-BGH polyA表达盒的穿梭质粒的构建

(1)利用限制性内切酶SalⅠ和XhoⅠ双酶切pSNAV2.0-K-Syn-KCC2-BGH载体(如图3A)，回收大片段(约4.5kb)。

(2)分别合成mMeCp2启动子(SEQ ID NO：4)及其无缝连接引物(正向引物：5'-TGGTGGCGGCGATATCTCCGCTCGGCGCGGCGGC-3'，反向引物：5'-CTAGGGGTTCCTCTGCTCGAGCACACACCATCTGCCCATTATAAACGTC-3')及KCC2编码序列(Genebank NM_001134771.2)(SEQ ID NO：2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3)及其无缝连接引物(正向引物：同2.1节，反向引物：5'-GATATCGCCGCCACCATGAGC-3')，由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成。

(3)通过无缝克隆PCR方法将mMeCp2启动子、KCC2蛋白的编码序列插入到骨架载体5'ITR序列与BGH polyA序列之间，构建获得的穿梭质粒命名为pSNAV2.0-K-mMeCp2-KCC2-BGH(图3B，其载体基因组的主体结构如图1B所示)。

2.3携带shortmMeCp2-KCC2-BGH表达盒的穿梭质粒的构建

(1)利用限制性内切酶Sal Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切pSNAV2.0-K-Syn-KCC2-BGH载体(如图3A)，回收大片段(约4.5kb)。

(2)分别合成short mMeCp2启动子(SEQ ID NO：5)及其无缝连接引物(正向引物：同2.2节，反向引物：5'- CTAGGGGTTCCTCTGCTCGAGCACAACCAATGAAGGGTAATCTCGACAAAG-3')和KCC2编码序列(Genebank NM_001134771.2)(SEQ ID NO：2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3)及其无缝连接引物(正向引物：同2.2节，反向引物：同2.2节)，由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成。

(3)通过无缝克隆PCR方法将short mMeCp2启动子、KCC2编码序列插入到骨架载体5'ITR序列与BGH polyA序列之间，构建获得的穿梭质粒命名为pSNAV2.0-K-short mMeCp2-KCC2-BGH(图3C，其载体基因组的主体结构如图1C所示)。

2.4携带hMeCp2-KCC2-BGH polyA表达盒的穿梭质粒的构建

(1)利用限制性内切酶Sal Ⅰ和Xho Ⅰ酶切pSNAV2.0-K-Syn-KCC2-BGH载体(如图3A)，回收大片段(约4.5kb)。

(2)分别合成hMeCp2启动子(SEQ ID NO：6)及其无缝连接引物(正向引物：5'-CATGGTGGCGGCGATATCCGCGGCGGCGGCGGCGGC-3'，反向引物：5'-CTAGGGGTTCCTCTGCTCGAGCAAGCCAGGGTTGCGATTTGTTG-3')和KCC2编码序列(GenebankNM_001134771.2)(SEQ ID NO：2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3)及其无缝连接引物(正向引物：5'-GTCGAGGCAGATCTGTCGACTCAGGAGTAGATGGTGATGACCTC-3'，反向引物：5'-GATATCGCCGCCACCATGAGCC-3')，由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成。

(3)通过无缝克隆PCR方法将hMeCp2启动子、KCC2蛋白的编码序列插入到骨架载体5'ITR序列与BGH polyA序列之间，构建获得的穿梭质粒命名为pSNAV2.0-K-hMeCp2-KCC2-BGH(如图3D，其载体基因组的主体结构如图1D所示)。

2.5携带short hMeCp2-KCC2-BGH polyA表达盒的穿梭质粒的构建

(1)利用限制性内切酶SalⅠ+XhoⅠ酶切pSNAV2.0-K-Syn-KCC2-BGH载体(如图3A)，回收大片段(约4.5kb)。

(2)分别合成short hMeCp2启动子(SEQ ID NO：7)及其无缝连接引物(正向引物：5'-TCATGGTGGCGGCGATATCGGCGGCGGCGGCGGCGGC-3'，反向引物：5'-ACTAGGGGTTCCTCTGCTCGAGCACTCCCCGTCCCAGCCCGG-3')和KCC2蛋白的编码序列(GenebankNM_001134771.2)(SEQ ID NO：2，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3)及其无缝连接引物(正向引物：同2.4节，反向引物：同2.4节)，由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成。

(3)通过无缝克隆PCR方法将short hMeCp2启动子、KCC2蛋白的编码序列插入到骨架载体5'ITR序列与BGH polyA序列之间，构建获得的穿梭质粒命名为pSNAV2.0-K-short hMeCp2-KCC2-BGH(如图3E，其载体基因组的主体结构如图1E所示)。

实施例2、病毒包装、纯化

本发明采用HEK293T细胞作为生产细胞系，常规三质粒包装系统生产AAV病毒载体。所使用实验方法均为本领域常规方法。(例如，参见Xiao Xiao,Juan Li,and Richard Jude Samulski.Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.J.Virol.1998,72(3):2224)。

利用实施例1中所获得的穿梭质粒(pSNAV2.0-K-Syn-KCC2-BGH、pSNAV2.0-K-mMeCp2-KCC2-BGH、pSNAV2.0-K-short mMeCp2-KCC2-BGH、pSNAV2.0-K-hMeCp2-KCC2-BGH和pSNAV2.0-K-short hMeCp2-KCC2-BGH)，分别包装出携带上述不同启动子和表达盒的重组腺相关病毒载体，分别命名为ssAAV 2/9-Syn-KCC2-BGH polyA、ssAAV 2/9-mMeCp2-KCC2-BGH polyA、ssAAV 2/9-short mMeCp2-KCC2-BGHpolyA、ssAAV 2/9-short hMeCp2-KCC2-BGHpolyA和ssAAV 2/9-short hMeCp2-KCC2-BGH polyA。

包装生产出的AAV病毒载体采用AAV9亲和层析(Thermo Scientific POROS CaptureSelect AAV9亲和树脂A27359)-超速离心-G25层析进行纯化，之后通过Q-PCR检测病毒载体的基因组滴度。PCR检测时采用的引物探针序列如表2所示，各重组AAV病毒基因组滴度检测结果如表3所示。

表2基因组滴度检测时使用的引物和探针序列

表3基因组滴度检测结果

实施例3、体外药效评价

1、原代神经元体系免疫荧光检测

分离P0大鼠皮层原代神经元进行体外培养，具体为：将出生后12h内的SD大鼠，置于显微镜下仔细剥除软脑膜组织，皮层经木瓜蛋白酶消化后，吹打为单细胞悬液，在含有1％FBS、2％B27的Neurobasal培养基(Invitrogen，21103-049)中培养。

携带含有不同启动子表达盒的重组病毒载体ssAAV 2/9-mMeCp2-KCC2-BGH polyA、ssAAV 2/9-shortmMeCp2-KCC2-BGHpolyA、ssAAV 2/9-hMeCp2-KCC2-BGHpolyA、ssAAV 2/9-short hMeCp2-KCC2-BGH polyA分别以相同的MOI(1E+6)感染神经元，阴性对照组(negative control，NC)则加入相同体积的病毒溶剂，37℃、5％CO₂培养箱中培养7天后进行免疫荧光检测。用4％PFA固定神经元10min，之后用含1％BSA、0.1％Triton X-100封闭液室温封闭1h，一抗anti-rabbit KCC2(Millipore，07-432)，1:500，4℃孵育过夜。第二天，加入二抗Goat anti-Rabbit IgG(H+L)Alexa FluorTMPlus 555(Invitrogen，A32732)，1:1000，室温孵育1h，用含DAPI的防淬灭封片剂封片，荧光显微镜(Olympus，IX71)观察拍照。用Fiji ImageJ软件进行平均光密度统计，计算不同组神经元中KCC2蛋白的水平相对NC组的变化。

结果如图4所示，与NC相比，所有重组腺相关病毒感染组中KCC2蛋白在神经元细胞膜上的表达水平均有显著提高，表明上述启动子均能有效启动外源的KCC2基因在原代神经细胞中的表达。其中，ss-AAV2/9-hMeCp2-KCC2-BGH polyA感染组与ss-AAV2/9-mMeCp2-KCC2-BGH polyA感染组相比，ss-AAV2/9-short hMeCp2-KCC2-BGH polyA感染组与ss-AAV2/9-short mMeCp2-KCC2-BGH polyA感染组相比，KCC2蛋白在神经元细胞膜上表达水平没有显著差异，表明人源MeCp2启动子和鼠源MeCp2启动子在神经细胞中启动外源基因转录效力基本相当。

2、体外生物学活性检测

本实施例中通过检测胞内氯离子(Cl^-)的水平来评估上述不同重组病毒载体的体外活性。KCC2蛋白的生物学功能是将神经元胞内Cl^-转运到胞外，维持神经元内较低的Cl^-浓度。因此，Cl^-的外排活性是评估KCC2蛋白生物学活性的重要指标。其中，采用SuperClomeleon(参见Grimley,J.S.；Li,L.；Wang,W.；Wen,L.；Beese,L.S.；Hellinga,H.W.；Augustine,G.J.(2013).Visualization of Synaptic Inhibition with an Optogenetic Sensor Developedby Cell-Free Protein Engineering Automation.Journal of Neuroscience,33(41),16297–16309.)技术来评估细胞内Cl^-的水平。SuperClomeleon是细胞内融合表达的CFP突变体与YFP突变体荧光蛋白，可作为胞内氯离子(Cl^-)浓度变化的荧光报告分子。Cl^-与SuperClomeleon结合后会导致其构象变化，其中的两种荧光蛋白变体之间的荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)效率即发生变化，通过检测该变化，能够反映SuperClomeleon与Cl^-的结合，以间接反映胞内氯离子的水平。检测的激发波长为440nm，发散波长为485nm和535nm，通过535nm/485nm的比率(ratio)值表征FRET的效率，以此作为胞内氯离子水平的指标，最终结果图把阴性对照(NC)的结果设为1，比较其它重组腺相关病毒结果相对于阴性对照的倍数。

首先，包装表达SuperClomeleon的慢病毒，然后，体外分离P0大鼠皮层原代神经元，将实施例2中包装获得的重组腺相关病毒ssAAV 2/9-mMeCp2-KCC2-BGH polyA、ssAAV 2/9-short mMeCp2-KCC2-BGH polyA、ssAAV 2/9-hMeCp2-KCC2-BGH polyA、ssAAV 2/9-short hMeCp2-KCC2-BGH polyA分别以相同MOI(1E+6)感染神经元，阴性对照组(negative control，NC)为在神经元细胞中加相同体积的病毒溶剂，37℃、5％CO₂培养箱中培养，感染5天后加入表达SuperClomeleon的慢病毒(MOI＝2.5)感染神经元，48h后通过酶标仪检测荧光强度，计算535nm/485nm的比值，比较含不同启动子的KCC2病毒载体的氯离子外排活性。

结果如图5所示，与NC相比，所有重组腺相关病毒载体组中氯离子外排活性均有提高，其中，重组腺相关病毒ss-AAV2/9-hMeCp2-KCC2-BGH polyA感染组与ss-AAV2/9-mMeCp2-KCC2-BGH polyA感染组相比，ss-AAV2/9-short hMeCp2-KCC2-BGH polyA感染组与ss-AAV2/9-short mMeCp2-KCC2-BGH polyA感染组相比，氯离子外排活性没有显著差异。该结果与免疫荧光实验中获得的结果基本一致。

上述结果进一步证实，与鼠源的mMeCp2或short mMeCp2相比，本申请技术方案中采用人源的hMeCp2或short hMeCp2启动子，并未影响KCC2蛋白在神经元细胞膜上的表达水平及体外生物学活性，上述启动子在神经细胞中均具有较高的启动外源基因表达的效力。

实施例4、体内药效评价

为进一步评估和验证本发明所述的重组腺相关病毒载体在体内的效果，进行了体内药效评价实验。

1、模型动物运动功能恢复评估

首先，采用C57BL/6小鼠，8周龄，雌性，用1％戊巴比妥钠，以65mg/kg剂量麻醉。然后，通过T7和T10的双侧半切造成双下肢瘫痪的脊髓损伤模型(Chen,Bo等，(2018)，Cell,174(6)1599.doi:10.1016)。简而言之，在小鼠胸椎T7和T10同时进行两个横向半切，T10横向半切终止于脊髓中线，T7横向半切位于T10损伤对侧，略超出脊髓中线。造模后，尾静脉注射病毒溶剂(作为模型对照组)或者本申请的重组腺相关病毒(以ssAAV 2/9-short hMeCp2-KCC2-BGH polyA为例)和阳性对照ssAAV2/9-Syn-KCC2-BGH polyA各200μL，注射剂量分别为1E+12vg/只动物，术后连续2天注射抗生素防止感染。每周通过BMS行为学评分(评分标准见表4)评估动物运动功能恢复情况，观察周期为5周。

表4

评估结果如图6所示，在14天时，ssAAV 2/9-short hMeCp2-KCC2-BGHpolyA重组病毒感染组中小鼠BMS行为学评分与阳性对照组(ss-AAV 2/9-Syn-KCC2-BGHpolyA)基本相当；在第21、28、35天时，甚至优于阳性对照组。在整个观察期间，ssAAV 2/9-short hMeCp2-KCC2-BGH polyA感染组和阳性对照组小鼠的BMS行为学评分均显著高于模型对照组(即图6中的“Model”)。上述结果表明，本申请技术方案中采用人源的hMeCp2或short hMeCp2启动子，在体内同样能够有效恢复脊髓损伤小鼠的运动功能。

2、动物存活率检测

小鼠模型及给药过程同4.1，每周检测及计算小鼠存活率，观察周期为5周，其中存活率＝每周动物存活数/开始造模并给药的动物数量(以百分比表示)。该实验中同样以ssAAV 2/9-short hMeCp2-KCC2-BGH polyA作为示例。

动物存活率检测结果如图7所示，从第21天起，ssAAV 2/9-short hMeCp2-KCC2-BGH polyA重组病毒感染组中的小鼠存活率高于阳性对照组(ss-AAV 2/9-Syn-KCC2-BGH polyA)中小鼠的存活率。该结果在一定程度上表明，采用人源hMeCp2或short hMeCp2启动子，其安全性优于现有技术中的其他启动子，这在将来的临床应用中具有很大的优势。

综合以上体内实验，在动物运动功能恢复评估中，ssAAV 2/9-short hMeCp2-KCC2-BGH polyA重组病毒感染组取得了与现有技术阳性对照ss-AAV 2/9-Syn-KCC2-BGH polyA基本相当甚至更优的效果；在存活率检测实验中，ssAAV 2/9-short hMeCp2-KCC2-BGH polyA重组病毒感染组中小鼠存活率高于现有技术阳性对照组(ss-AAV 2/9-Syn-KCC2-BGH polyA)中小鼠的存活率。进一步证实了本申请技术方案中所采用的人源的hMeCp2或short hMeCp2启动子，同其体外效果一致，同样具有令人惊奇的、更优的体内活性，也能带来更高的安全性。

Claims

一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子具有如SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列，或与SEQ ID NO：6或7具有80％以上序列同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上序列同一性。
根据权利要求1所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸是一种启动子，其可启动编码外源蛋白的核酸在细胞内的转录。
一种重组核酸分子，其特征在于，所述重组核酸分子包含如权利要求1或2所述的核酸分子、编码外源蛋白的核酸序列和多聚腺苷酸序列(polyA)。
根据权利要求3所述的重组核酸分子，其特征在于，所述多聚腺苷酸序列为BGH polyA，优选的，所述BGH polyA的序列如SEQ ID NO：8所示。
根据权利要求3或4中所述的重组核酸分子，其特征在于，所述外源蛋白为KCC2蛋白，优选地，其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
根据权利要求5中所述的重组核酸分子，其特征在于，所述KCC2蛋白的编码序列选自：

1)如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

2)如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸而得到的核苷酸序列；或

3)与SEQ ID NO：2具有80％以上序列同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的序列；更优选地，具有98％或99％以上同一性的序列；更优选地，所述核苷酸序列是密码子优化的序列。
根据权利要求3-6中任一所述的重组核酸分子，其特征在于，所述重组核酸分子还包含如下的一种或多种调控元件：Kozak序列、WPRE和转录后调节元件。
根据权利要求3-7中任一所述的重组核酸分子，其特征在于，所述重组核酸分子包含选自以下的核苷酸序列：

1)SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列；

2)SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个核苷酸而得到的核苷酸序列；或

3)与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：13具有80％以上序列同一性的核苷酸序列，优选具有85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％以上同一性的序列；更优选地，具有98％或99％以上同一性的序列。
根据权利要求3-8中任一所述的重组核酸分子，其特征在于，所述重组核酸分子还包含 AAV反向末端重复序列；优选地，所述AAV反向末端重复序列选自不同血清型的AAV；优选地，所述AAV反向末端重复序列选自进化支A-F中的任意血清型的AAV或AAV1型、AAV2型、AAV3型、AAV4型、AAV5型、AAV6型、AAV7型、AAV8型、AAV9型或其杂交/嵌合型中的任意一个；更优选地，所述AAV反向末端重复序列来自AAV2型。
一种重组载体，其特征在于，所述重组载体包含权利要求1或2所述的核酸分子或权利要求3-8中任一所述的重组核酸分子，其中，所述载体选自质粒载体、噬菌体载体和病毒载体，其中所述病毒载体选自腺相关病毒载体、腺病毒载体、慢病毒载体和杂合病毒载体。
一种重组腺相关病毒，其特征在于，所述重组腺相关病毒包含AAV衣壳和载体基因组，所述载体基因组包含权利要求1或2所述的核酸分子或权利要求3-9中任一项所述的重组核酸分子。
根据权利要求11中所述的重组腺相关病毒，其特征在于，所述重组腺相关病毒的衣壳来源于AAV进化支A-F中的任意血清型的AAV或AAV1型、AAV2型、AAV3型、AAV4型、AAV5型、AAV6型、AAV7型、AAV8型、AAV9型或其杂交/嵌合型中的任意一个，优选地，来源于AAV9。
一种分离的宿主细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求1或2所述的核酸分子、权利要求3-9中任一所述的重组核酸分子或权利要求10所述的重组载体或权利要求11或12所述的重组腺相关病毒。
一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含权利要求1或2所述的核酸分子、权利要求3-9中任一所述的重组核酸分子、权利要求10所述的重组载体、权利要求11或12所述的重组腺相关病毒和/或权利要求13所述的宿主细胞，以及药学上可接受的赋形剂。
根据权利要求14中所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物被配制用于静脉注射、鞘内注射、脑室内注射、脊髓内注射、胸腔注射、口服、吸入、鼻内、气管内、动脉内、眼内、肌内、腹内和/或其它肠胃外途径进行给药。
根据权利要求14或15所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还进一步包含其他的可用于治疗脊髓损伤的药物。
权利要求1或2所述的核酸分子、权利要求3-9中任一所述的重组核酸分子、权利要求10所述的重组载体、权利要求11或12所述的重组腺相关病毒、权利要求13所述的宿主细胞和/或权利要求14-16任一项所述的药物组合物在制备用于预防或治疗脊髓损伤的药物中的用途。
根据权利要求17所述的用途，其特征在于，所述重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒、宿主细胞和/或药物组合物可以与另一疗法结合施用。
根据权利要求17或18所述的用途，其特征在于，所述重组核酸分子、重组载体、重组腺相关病毒、宿主细胞和/或药物组合物可以以大约1×10⁶vg/kg至大约1×10¹⁸vg/kg的剂量施用；优选地，所述重组腺相关病毒可以以大约5×10¹²vg/kg的剂量施用；优选地，所述重组腺相关病毒可以以大约5×10¹¹vg/kg的剂量施用；优选地，所述载体或组合物可以施用超过一次。
一种治疗脊髓损伤的方法，其特征在于，所述方法包括向需要治疗的受试者施用权利要求3-9中任一所述的重组核酸分子、权利要求10所述的重组载体、权利要求11或12所述的重组腺相关病毒、权利要求13所述的宿主细胞和/或权利要求14-16任一项所述的药物组合物；优选地，所述组合物静脉内、鞘内或脊髓内施用；优选地，所述受试者是哺乳动物；更优选地，所述受试者是人。
根据权利要求20所述的方法，其特征在于，所述方法还可以与其他的疗法联合使用。