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CN121311507A - 抗cd28 x抗trop2抗体 - Google Patents

抗cd28 x抗trop2抗体

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CN121311507A
CN121311507A CN202480038716.2A CN202480038716A CN121311507A CN 121311507 A CN121311507 A CN 121311507A CN 202480038716 A CN202480038716 A CN 202480038716A CN 121311507 A CN121311507 A CN 121311507A
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CN
China
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antibody
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CN202480038716.2A
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M·J·博尔奈特
Y·K·金
谭朝芳
P·阿尔普
E·罗德里格斯
T·安泽隆
G·摩尔
D·H·那姆
K·N·艾维瑞
T·B·特鲁昂
W·Y·叶
J·贾辛托
J·迪亚兹
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Original Assignee
Xencor Inc
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Abstract

本文提供了新颖抗CD28 x抗TROP2抗体以及使用此类抗体来治疗TROP2相关癌症的方法。主题抗CD28 x抗TROP2抗体能够与T细胞上的CD28共刺激分子和肿瘤细胞上的TROP2激动性地结合。因此，此类抗体选择性地增强肿瘤部位处的抗肿瘤活性，同时最小化外周毒性。本文所提供的主题抗体特别地可与其他抗癌疗法联合使用，所述其他抗癌疗法包括例如用于治疗TROP2相关癌症的双特异性抗体。

Description

抗CD28 X抗TROP2抗体
优先权声明
本申请要求2023年4月14日提交的美国临时申请号63/496,372和2023年10月27日提交的美国临时申请号63/593,942的优先权和权益，所述临时申请的内容特此以引用的方式整体并入。
背景技术
肿瘤相关钙信号转导蛋白2 (TROP2)是一种在多种恶性肿瘤中过表达的跨膜蛋白，并且是一种与恶性肿瘤的发生、侵袭和转移相关的致癌基因。过表达TROP2的示例性癌症包括子宫内膜癌、胰腺癌、结肠癌、食管癌、胆管癌、口腔癌和神经胶质瘤。由于TROP2在多种肿瘤上过表达，它是靶向治疗剂开发的候选物。
基于抗体的治疗剂已成功用于治疗多种疾病，包括癌症。一种日益流行的正在探索中的途径是工程改造出共衔接两种不同抗原的单个免疫球蛋白分子。此类衔接两种不同抗原的替代抗体形式通常被称为双特异性抗体。一种针对双特异性抗体的特定方法是工程改造出衔接CD3的第一结合结构域和衔接与癌细胞相关或在癌细胞上上调的抗原(例如TROP2)的第二结合结构域，使得双特异性抗体重定向CD3+ T细胞来破坏癌细胞。
然而，随着时间的推移，TIL由于抑制性免疫检查点的上调而丧失其细胞毒性能力。虽然检查点阻断已经证明相对于其他治疗选项增加了临床反应率，但许多患者仍然不能实现对检查点阻断的反应。TIL上的共刺激受体的衔接有可能提供能够克服免疫检查点的负向信号的正向信号。激动性共刺激受体抗体的临床前和临床研究确实证明了，共刺激受体的激动作用可产生令人印象深刻的抗肿瘤反应，从而激活T细胞来攻击肿瘤细胞。
通过特异性地破坏肿瘤细胞、同时最小化外周毒性来增强抗肿瘤活性对于癌症疗法也是重要的。在这种情形中，至关重要的是，仅在存在靶标肿瘤细胞的情况下，才向T细胞提供共刺激信号。然而，单特异性全长抗体对共刺激受体的激动作用可能无法区分TIL对外周T细胞对导致自身免疫毒性的自身抗原反应性T细胞。
虽然已经尝试了靶向TROP2的免疫疗法，但仍然需要新颖的免疫反应增强组合物来治疗TROP2相关癌症。
发明内容
本文提供了新颖抗CD28 x抗TROP2抗体以及使用此类抗体来治疗TROP2相关癌症的方法。主题抗CD28 x抗TROP2抗体能够与T细胞上的CD28共刺激分子和肿瘤细胞上的TROP2激动性地结合。因此，此类抗体选择性地增强肿瘤部位处的抗肿瘤活性，同时最小化外周毒性。本文所提供的主题抗体特别地可与其他抗癌疗法联合使用，所述其他抗癌疗法包括例如用于治疗TROP2相关癌症的双特异性抗体。
在第一方面，本文提供了一种抗CD28 x抗TROP2异源二聚抗体，所述抗体包含a)第一单体；b)第二单体；以及c)轻链。所述第一单体包含：i)单链可变片段(scFv)；和ii)第一Fc结构域，其中所述scFv使用结构域接头共价连接至所述第一Fc结构域的N端。所述第二单体从N端至C端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH1是第一可变重链结构域并且CH2-CH3是第二Fc结构域。所述轻链从N端至C端包含VL1-CL，其中VL1是第一可变轻链结构域并且CL是恒定轻链结构域。所述scFv包含第二VH结构域(VH2)、scFv接头和第二可变轻链结构域(VL2)。VH1和VL1一起形成第一抗原结合结构域(ABD)，并且VH2和VL2一起形成第二ABD。此外，第一ABD和第二ABD中的一者是CD28结合结构域，并且第一ABD和第二ABD中的另一者是肿瘤相关钙信号转导蛋白2 (TROP2)结合结构域。
在一些实施方案中，所述scFv从N端至C端包含VH2-scFv接头-VL2。在一些实施方案中，所述scFv从N端至C端包含VL2-scFv接头-VH2。
在示例性实施方案中，第一ABD是TROP2结合结构域，并且第二ABD是CD28结合结构域。在一些实施方案中，VH1和VL1是图23-26和图52-56中的任何TROP2结合结构域的VH和VL或其变体。在一些实施方案中，VH2和VL2选自以下一者：1)图16、图19和图22中的任何CD28结合结构域的VH和VL或其变体；或2) (i)图16、图17或图34中的VH或其变体；和(ii)图16、图18或图36中的VL或其变体。
在一些实施方案中，第一Fc结构域和第二Fc结构域各自是变体Fc结构域。
在一些实施方案中，第一和第二Fc结构域包含一组选自以下异源二聚化变体的异源二聚化偏斜变体：S364K/E357Q : L368D/K370S；S364K : L368D/K370S；S364K : L368E/K370S；D401K : T411E/K360E/Q362E；以及T366W : T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号。在一些实施方案中，第一和第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q :L368D/K370S，其中编号是根据EU编号。
在某些实施方案中，第一和第二Fc结构域各自包含一个或多个消融变体。在示例性实施方案中，所述一个或多个消融变体包含E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，第一或第二单体中的一者还包含一个或多个pI变体。在一些实施方案中，所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，第一Fc结构域包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号。在示例性实施方案中，第一和第二变体Fc结构域各自还包含氨基酸变体428L/434S。
在一些实施方案中，所述scFv接头是GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS (SEQ ID NO:24)。
另一方面，本文提供了一种抗CD28 x抗TROP2异源二聚抗体，所述抗体包含a)第一单体；b)第二单体；c)第一轻链；以及d)第二轻链。所述第一单体从N端至C端包含VH1-CH1-第一结构域接头-scFv-第二结构域接头-CH2-CH3，其中VH1是第一可变重链结构域，并且CH2-CH3是第一Fc结构域。所述第二单体从N端至C端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域。所述第一和第二轻链各自从N端至C端包含VL1-CL，其中VL1是第一可变轻链结构域并且CL是恒定轻链结构域。所述scFv包含第二VH结构域(VH2)、scFv接头和第二可变轻链结构域(VL2)。所述第一单体的VH1与所述第一轻链的VL1以及所述第二单体的VH1与所述第二轻链的VL1各自形成第一抗原结合结构域(ABD)，并且所述VH2与所述VL2形成第二ABD。此外，第一ABD和第二ABD中的一者是CD28结合结构域，并且第一ABD和第二ABD中的另一者是肿瘤相关钙信号转导蛋白2 (TROP2)结合结构域。
在一些实施方案中，所述scFv从N端至C端包含VH2-scFv接头-VL2。在一些实施方案中，所述scFv从N端至C端包含VL2-scFv接头-VH2。
在示例性实施方案中，第一ABD是TROP2结合结构域，并且第二ABD是CD28结合结构域。在一些实施方案中，VH1和VL1选自以下一者：1)图23-26和图52-56中的任何TROP2结合结构域的VH和VL或其变体。在一些实施方案中，VH2和VL2选自以下一者：1)图16、图19和图22中的任何CD28结合结构域的VH和VL或其变体；或2) (i)图16、图17或图34中的VH或其变体；和(ii)图16、图18或图36中的VL或其变体。
在一些实施方案中，第一Fc结构域和第二Fc结构域各自是变体Fc结构域。
在一些实施方案中，第一和第二Fc结构域包含一组选自以下异源二聚化变体的异源二聚化偏斜变体：S364K/E357Q : L368D/K370S；S364K : L368D/K370S；S364K : L368E/K370S；D401K : T411E/K360E/Q362E；以及T366W : T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号。在一些实施方案中，第一和第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q :L368D/K370S，其中编号是根据EU编号。
在某些实施方案中，第一和第二Fc结构域各自包含一个或多个消融变体。在示例性实施方案中，所述一个或多个消融变体包含E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，第一或第二单体中的一者还包含一个或多个pI变体。在一些实施方案中，所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，第一Fc结构域包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号。在示例性实施方案中，第一和第二变体Fc结构域各自还包含氨基酸变体428L/434S。
在一些实施方案中，所述scFv接头是GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS (SEQ ID NO:24)。
另一方面，本文提供了一种抗CD28 x抗TROP2异源二聚抗体，所述抗体包含a)第一单体；b)第二单体；c)第一轻链；以及d)第二轻链。所述第一单体从N端至C端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域接头-scFv，其中VH1是第一可变重链结构域，并且CH2-CH3是第一Fc结构域。所述第二单体从N端至C端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH1是第一可变重链结构域并且CH2-CH3是第二Fc结构域。所述第一和第二轻链各自从N端至C端包含VL1-CL，其中VL1是第一可变轻链结构域并且CL是恒定轻链结构域。所述scFv包含第二VH结构域(VH2)、scFv接头和第二可变轻链结构域(VL2)。所述第一单体的VH1与所述第一轻链的VL1以及所述第二单体的VH1与所述第二轻链的VL1各自形成第一抗原结合结构域(ABD)，并且所述VH2与所述VL2形成第二ABD。此外，第一和第二ABD中的一者结合人CD28，并且第一和第二ABD中的另一者结合TROP2。
在一些实施方案中，所述scFv从N端至C端包含VH2-scFv接头-VL2。在一些实施方案中，所述scFv从N端至C端包含VL2-scFv接头-VH2。
在示例性实施方案中，第一ABD是TROP2结合结构域，并且第二ABD是CD28结合结构域。在一些实施方案中，VH1和VL1选自以下一者：1)图23-26和图52-56中的任何TROP2结合结构域的VH和VL或其变体。在一些实施方案中，VH2和VL2选自以下一者：1)图16、图19和图22中的任何CD28结合结构域的VH和VL或其变体；或2) (i)图16、图17或图34中的VH或其变体；和(ii)图16、图18或图36中的VL或其变体。
在一些实施方案中，第一Fc结构域和第二Fc结构域各自是变体Fc结构域。
在一些实施方案中，第一和第二Fc结构域包含一组选自以下异源二聚化变体的异源二聚化偏斜变体：S364K/E357Q : L368D/K370S；S364K : L368D/K370S；S364K : L368E/K370S；D401K: T411E/K360E/Q362E；以及T366W : T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号。在一些实施方案中，第一和第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q :L368D/K370S，其中编号是根据EU编号。
在某些实施方案中，第一和第二Fc结构域各自包含一个或多个消融变体。在示例性实施方案中，所述一个或多个消融变体包含E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，第一或第二单体中的一者还包含一个或多个pI变体。在一些实施方案中，所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，第一Fc结构域包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号。在示例性实施方案中，第一和第二变体Fc结构域各自还包含氨基酸变体428L/434S。
在一些实施方案中，所述scFv接头是GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS (SEQ ID NO:24)。
另一方面，本文提供了一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：a) TROP2结合结构域，其包含i)第一可变重链结构域(VH1)，和ii)第一可变轻链结构域(VL1)；和b)抗CD28结合结构域，其包含i)第二可变重链结构域(VH2)，和ii)第二可变轻链结构域(VL2)。在一些实施方案中，VH1和VL1选自以下一者：1)图23-26和图52-56中的任何TROP2结合结构域的VH和VL或其变体。在一些实施方案中，VH2和VL2选自以下一者：1)图16、图19和图22中的任何CD28结合结构域的VH和VL或其变体；或2) (i)图16、图17或图34中的VH或其变体；和(ii)图16、图18或图36中的VL或其变体。
在所述双特异性抗体的一些实施方案中，第一Fc结构域和第二Fc结构域各自是变体Fc结构域。
在所述双特异性抗体的一些实施方案中，第一和第二Fc结构域包含一组选自以下异源二聚化变体的异源二聚化偏斜变体：S364K/E357Q : L368D/K370S；S364K : L368D/K370S；S364K : L368E/K370S；D401K : T411E/K360E/Q362E；以及T366W : T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号。在一些实施方案中，第一和第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q : L368D/K370S，其中编号是根据EU编号。
在某些实施方案中，第一和第二Fc结构域各自包含一个或多个消融变体。在示例性实施方案中，所述一个或多个消融变体包含E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，第一或第二单体中的一者还包含一个或多个pI变体。在一些实施方案中，所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号。
一方面，本文提供了一种多价抗体，所述多价抗体包含第一单体、第二单体、第一共同轻链以及第二共同轻链。所述第一单体从N端至C端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH1是第一可变重链结构域并且CH2-CH3是第一Fc结构域。所述第二单体从N端至C端包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH2是第二可变重链结构域并且CH2-CH3是第二Fc结构域。所述第一共同轻链和第二共同轻链各自包含VL-CL，其中VL是可变结构域并且CL是恒定轻链结构域。VH1和所述第一共同轻链的VL形成第一抗原结合结构域(ABD)，并且VH2和所述第二共同轻链的VL一起形成第二ABD，并且所述第一共同轻链和第二共同轻链具有相同的氨基酸序列。此外，第一ABD和第二ABD中的一者是CD28结合结构域，并且第一ABD和第二ABD中的另一者是肿瘤相关钙信号转导蛋白2 (TROP2)结合结构域。
在一些实施方案中，第一ABD是TROP2结合结构域，并且第二ABD是CD28结合结构域。在一些实施方案中，VH1是图36或图52-56中的可变重链结构域，VH2是图34中的可变重链结构域，并且第一和第二共同轻链的VL是1F11-1A3.315[TROP2]_L1可变轻链结构域(参见图36A)。
在一些实施方案中，第一Fc结构域和第二Fc结构域各自是变体Fc结构域。
在一些实施方案中，第一和第二Fc结构域包含一组选自以下异源二聚化变体的异源二聚化偏斜变体：S364K/E357Q : L368D/K370S；S364K : L368D/K370S；S364K : L368E/K370S；D401K : T411E/K360E/Q362E；以及T366W : T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号。在一些实施方案中，第一和第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q :L368D/K370S，其中编号是根据EU编号。
在某些实施方案中，第一和第二Fc结构域各自包含一个或多个消融变体。在示例性实施方案中，所述一个或多个消融变体包含E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，第一或第二单体中的一者还包含一个或多个pI变体。在一些实施方案中，所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，第一Fc结构域包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号。在示例性实施方案中，第一和第二变体Fc结构域各自还包含氨基酸变体428L/434S。
另一方面，本文提供了一种多价抗体，所述多价抗体包含第一单体、第二单体、第一共同轻链、第二共同轻链以及第三共同轻链。所述第一单体从N端至C端包含VH1-CH1-接头-VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH1各自是第一可变重链结构域，并且CH2-CH3是第一Fc结构域。所述第二单体从N端至C端包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH2是第二可变重链结构域并且CH2-CH3是第二Fc结构域。所述第一共同轻链、第二共同轻链以及第三共同轻链各自包含VL-CL，其中VL是可变结构域并且CL是恒定轻链结构域。所述第一单体的VH1各自与所述第一共同轻链或第二共同轻链的VL配对以形成两个第一抗原结合结构域(ABD)，并且VH2和所述第三共同轻链的VL形成第二ABD，并且所述第一共同轻链、第二共同轻链以及第三共同轻链各自具有相同的氨基酸序列。此外，第一ABD各自是CD28结合结构域，并且第二ABD是肿瘤相关钙信号转导蛋白2 (TROP2)结合结构域，或者第一ABD各自是TROP2结合结构域，并且第二ABD是CD28结合结构域。
在一些实施方案中，第一ABD各自是TROP2结合结构域，并且第二ABD是CD28结合结构域。在一些实施方案中，VH1各自是图36或图52-56中的可变重链结构域，VH2是图34中的可变重链结构域，并且第一、第二以及第三共同轻链的VL是1F11-1A3.315[TROP2]_L1可变轻链结构域(参见图36A)。
在一些实施方案中，第一Fc结构域和第二Fc结构域各自是变体Fc结构域。
在一些实施方案中，第一和第二Fc结构域包含一组选自以下异源二聚化变体的异源二聚化偏斜变体：S364K/E357Q : L368D/K370S；S364K : L368D/K370S；S364K : L368E/K370S；D401K : T411E/K360E/Q362E；以及T366W : T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号。在一些实施方案中，第一和第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q :L368D/K370S，其中编号是根据EU编号。
在某些实施方案中，第一和第二Fc结构域各自包含一个或多个消融变体。在示例性实施方案中，所述一个或多个消融变体包含E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，第一或第二单体中的一者还包含一个或多个pI变体。在一些实施方案中，所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，第一Fc结构域包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号。在示例性实施方案中，第一和第二变体Fc结构域各自还包含氨基酸变体428L/434S。
本文还提供了包含编码本文所述的抗体的核酸的核酸组合物，包括此类核酸的表达载体组合物，用于制备所述抗体的包含所述表达载体组合物的宿主细胞，以及制备所述抗体的方法。
另一方面，本文提供了一种治疗有需要的患者的TROP2相关癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用如本文所述的抗CD28 x抗TROP2双特异性抗体。
另一方面，本文提供了一种治疗有需要的患者的TROP2相关癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用如本文所述的抗CD28 x抗TROP2双特异性抗体；和抗CD3 x抗TROP2双特异性抗体。
一方面，本文提供了一种TROP-2结合构建体，其包含可变重链结构域和可变轻链结构域，所述结构域选自以下：1)图23-26和图52-56中的任何TROP2结合结构域VH和VL的VH和VL或其变体；和2)图36所描绘的VH或其变体，和1F11-1A3.315 L1 VL (参见图36A)或其变体。
附图说明
图1A-1B描绘了人、小鼠和食蟹猴CD28的序列。此类CD28可用于开发交叉反应性CD28抗原结合结构域，以便于临床开发。
图2描绘了人、小鼠和食蟹猴TROP2的序列。此类TROP2可用于开发交叉反应性TROP2抗原结合结构域，以便于临床开发。
图3A-3F描绘了多对有用的异源二聚化变体组(包括偏斜变体和pI变体)。在图3F中，存在并无对应的“单体2”变体的变体。此类变体是pI变体，其可单独用于双特异性抗体(例如，TROP2 x CD28 bsAb)的任一单体上，或例如包括在利用scFv作为组分的形式的非scFv侧，并且可在利用scFv作为CD28结合结构域的第二单体上使用适当的带电scFv接头。图6示出了合适的带电接头。
图4描绘了等排变体抗体恒定区和其各自的取代的列表。pI_(-)指示较低pI变体，而pI_(+)指示较高pI变体。这些变体可任选地并且独立地与本文所概述的其他变体(包括异源二聚化变体)组合。
图5描绘了消融FcγR结合的有用的消融变体(也称为“敲除”或“KO”变体)。在一些实施方案中，此类消融变体包括在本文所述的主题抗体的两个单体的Fc结构域中。在其他实施方案中，所述消融变体仅包括在仅一个变体Fc结构域上。
图6A-6B描绘了多种带电scFv接头，所述接头可用于增加或减小如本文所述的利用一个或多个scFv作为组分的主题异源二聚双特异性抗体(例如，TROP2 x CD28 bsAb)的pI。(+H)正电性接头可特别用于本文中，特别是与本文所示的抗CD28 VL和VH序列一起使用。根据Whitlow等人, Protein Engineering 6(8):989-995 (1993)，具有单个电荷的单个现有技术scFv接头被称为“Whitlow”。应注意，这种接头用于减少scFv中的聚集并增强scFv中的蛋白水解稳定性。此类带电scFv接头可用于本文所公开的包括scFv的任何主题抗体形式(例如，1 + 1 Fab-scFv-Fc和2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式)中。
图7描绘了多种示例性结构域接头。在一些实施方案中，这些接头可用于将单链Fv连接至Fc链。在一些实施方案中，这些接头可以任何取向进行组合。例如，GGGGS接头(SEQID NO:37)可以在N端或C端与“下半铰链”接头组合。
图8示出了对本发明的TROP2 x CD28 bsAb特别有用的双特异性抗体平台。虽然所述平台是在1 + 1 Fab-scFv-Fc形式的背景下描述的，但它可以适用于其他双特异性抗体形式。
图9描绘了可与本文所述的异源二聚抗体一起使用的多种异源二聚偏斜变体氨基酸取代。
图10A-10D示出了基于人IgG1的几种有用的异源二聚TROP2 x CD28 bsAb骨架的序列，不含细胞因子序列。异源二聚Fc骨架1是基于人IgG1 (356E/358M同种异型)，并且包括在第一异源二聚Fc链上的L368D/K370S偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、在第二异源二聚Fc链上的S364K/E357Q偏斜变体以及在两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。异源二聚Fc骨架2是基于人IgG1 (356E/358M同种异型)，并且包括在第一异源二聚Fc链上的L368D/K370S偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、在第二异源二聚Fc链上的S364K偏斜变体以及在两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。异源二聚Fc骨架3是基于人IgG1 (356E/358M同种异型)，并且包括在第一异源二聚Fc链上的L368E/K370S偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、在第二异源二聚Fc链上的S364K偏斜变体以及在两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。异源二聚Fc骨架4是基于人IgG1 (356E/358M同种异型)，并且包括在第一异源二聚Fc链上的K360E/Q362E/T411E偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、在第二异源二聚Fc链上的D401K偏斜变体以及在两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。异源二聚Fc骨架5是基于人IgG1 (356D/358L同种异型)，并且包括在第一异源二聚Fc链上的L368D/K370S偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、在第二异源二聚Fc链上的S364K/E357Q偏斜变体以及在两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。异源二聚Fc骨架6是基于人IgG1 (356E/358M同种异型)，并且包括在第一异源二聚Fc链上的L368D/K370S偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、在第二异源二聚Fc链上的S364K/E357Q偏斜变体以及在两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体和去除糖基化的N297A变体。异源二聚Fc骨架7是基于人IgG1 (356E/358M同种异型)，并且包括在第一异源二聚Fc链上的L368D/K370S偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、在第二异源二聚Fc链上的S364K/E357Q偏斜变体以及在两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体和去除糖基化的N297S变体。异源二聚Fc骨架8是基于人IgG4，并且包括在第一异源二聚Fc链上的L368D/K370S偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、在第二异源二聚Fc链上的S364K/E357Q偏斜变体以及在两条链上的消融Fab臂交换(如本领域中已知)的S228P (根据EU编号，在Kabat中是S241P)变体。异源二聚Fc骨架9是基于人IgG2，并且包括在第一异源二聚Fc链上的L368D/K370S偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、在第二异源二聚Fc链上的S364K/E357Q偏斜变体。异源二聚Fc骨架10是基于人IgG2，并且包括在第一异源二聚Fc链上的L368D/K370S偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、在第二异源二聚Fc链上的S364K/E357Q偏斜变体以及在两条链上的S267K消融变体。异源二聚Fc骨架11是基于人IgG1 (356E/358M同种异型)，并且包括在第一异源二聚Fc链上的L368D/K370S偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、在第二异源二聚Fc链上的S364K/E357Q偏斜变体以及在两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体和M428L/N434S Xtend变体。异源二聚Fc骨架12是基于人IgG1(356E/358M同种异型)，并且包括在第一异源二聚Fc链上的L368D/K370S偏斜变体、在第二异源二聚Fc链上的S364K/E357Q偏斜变体和P217R/P229R/N276K pI变体以及在两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体。异源二聚Fc骨架13是基于人IgG1 (356D/358L同种异型)，并且包括在第一异源二聚Fc链上的L368D/K370S偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、在第二异源二聚Fc链上的S364K/E357Q偏斜变体以及在两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体和M428L/N434S Xtend变体。异源二聚Fc骨架14是基于人IgG1 (356E/358M同种异型)，并且包括在第一异源二聚Fc链上的L368D/K370S偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、在第二异源二聚Fc链上的S364K/E357Q偏斜变体以及在两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体和M428L/N434AXtend变体。异源二聚Fc骨架15是基于人IgG1 (356D/358L同种异型)，并且包括在第一异源二聚Fc链上的L368D/K370S偏斜变体和Q295E/N384D/Q418E/N421D pI变体、在第二异源二聚Fc链上的S364K/E357Q偏斜变体以及在两条链上的E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体和M428L/N434A Xtend变体。
在这些骨架中的每一者内包括与所列举的序列90、95、98和99%相同(如本文所定义)和/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个另外的氨基酸取代的序列(与图中的“亲本”相比，如本领域技术人员应理解，与亲本人IgG1 (或IgG2或IgG4，这取决于骨架)相比，所述“亲本”已经含有多个氨基酸修饰)。也就是说，除了这个图中的骨架内所含的偏斜变体、pI变体和消融变体以外或作为其替代方案，所列举的骨架可以含有另外的氨基酸修饰(通常是氨基酸取代)。另外，本文所描绘的骨架可以包括C端甘氨酸(K446_)和/或赖氨酸(K447_)的缺失。所述C端甘氨酸和/或赖氨酸缺失可以有意地进行工程改造以减少异质性，或在某些双特异性形式(诸如mAb-scFv形式)的背景下。另外，C端甘氨酸和/或赖氨酸缺失可以天然地发生，例如在生产和存储期间。
图11描绘了用于2 + 1 mAb-scFv形式中的异源二聚TROP2 x CD28 bsAb骨架的说明性序列。此处所描绘的形式是基于如图10所描绘的异源二聚Fc骨架1，但还包括单体1(-)上的G446_和单体2 (+)上的G446_/K447_。应注意，图10所描绘的任何另外的骨架均可适用于2 + 1 mAb-scFv形式中，无论是否在一条或两条链上包括K447_。应注意，这些序列还可以包括M428L/N434S变体。
图12描绘了可用于TROP2 x CD28 bsAb的实施方案中的“CH1”的序列。
图13描绘了可用于TROP2 x CD28 bsAb的实施方案中的“铰链”的序列。
图14描绘了可用于利用Fab结合结构域的主题TROP2 x CD28 bsAb中的同源轻链的恒定结构域。
图15A-15N描绘了本发明的双特异性形式。图15A描绘了“1 + 1 Fab-scFv-Fc”形式，具有结合第一抗原的第一Fab臂和结合第二抗原的第二scFv臂。所述1 + 1 Fab-scFv-Fc形式包含第一单体，所述第一单体包含(任选地通过接头)共价连接至第一异源二聚Fc骨架的N端的第一重链可变区(VH1)；第二单体，所述第二单体包含(任选地通过接头)共价连接至第二对应的异源二聚Fc骨架的N端的单链Fv；以及第三单体，所述第三单体包含共价连接至轻链恒定结构域的轻链可变区，其中所述轻链可变区与VH1互补。图15B描绘了“2 + 1Fab2-scFv-Fc”形式，具有第一Fab臂和第二Fab-scFv臂，其中Fab结合第一抗原并且scFv结合第二抗原。所述2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式包含第一单体，所述第一单体包含(任选地通过接头)共价连接至第一异源二聚Fc骨架的N端的第一重链可变区(VH1)；第二单体，所述第二单体包含共价连接(任选地通过接头)至单链Fv的VH1，所述单链Fv共价连接(任选地通过接头)至第二对应的异源二聚Fc骨架的N端；以及第三单体，所述第三单体包含共价连接至轻链恒定结构域的轻链可变区，其中所述轻链可变区与VH1互补。图15C描绘了“1 + 1共同轻链”或“1 + 1 CLC”形式，具有包含结合第一抗原的第一Fab臂的第一Fc和包含结合第二抗原的第二Fab臂的第二Fc。所述1 + 1 CLC形式包含第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3；第二单体，所述第二单体包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3；以及第三单体，所述第三单体包含VL-CL。VL与VH1配对以形成具有第一抗原结合特异性的结合结构域；并且VL与VH2配对以形成具有第二抗原结合特异性的结合结构域。图15D描绘了“2 + 1共同轻链”或“2 + 1 CLC”形式，具有包含2个各自结合第一抗原的Fab臂的第一Fc和包含1个结合第二抗原的Fab臂的第二Fc。所述2 + 1 CLC形式包含第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-接头-VH1-CH1-铰链-CH2-CH3；第二单体，所述第二单体包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3；以及第三单体，所述第三单体包含VL-CL。VL与第一和第二VH1配对以形成具有第一抗原结合特异性的结合结构域；并且VL与VH2配对以形成具有第二抗原结合特异性的结合结构域。图15E描绘了“2 + 1 mAb-scFv”形式，具有包含结合第一抗原的N端Fab臂的第一Fc和包含结合第一抗原的N端Fab臂和结合第二抗原的C端scFv的第二Fc。所述2 + 1 mAb-scFv形式包含第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3；第二单体，所述第二单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3-scFv；以及第三单体，所述第三单体包含VL-CL。VL与第一和第二VH1配对以形成对第一抗原具有结合特异性的结合结构域。图15N描绘了2 + 1 Fab2-Fc x scFv-Fc形式(还称为“堆叠式开瓶器”)。这种形式包括第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-结构域接头-VH1-CH1-铰链-CH2-CH3；第二单体，所述第二单体包含共价连接至Fc结构域(CH2-CH3)的scFv；以及第三单体，所述第三单体包含VL-CL。VL与所述第一单体的第一和第二VH1配对以形成对第一抗原具有结合特异性的结合结构域，并且所述scFv对第二抗原具有结合特异性。另外的双特异性形式包括F)双scFv，G)单臂scFv-mAb，H) scFv-mAb，I)双特异性mAb，J)单臂中心scFv，K) mAb-Fv，L)中心Fv，以及M)三叉戟。
图16描绘了1A7 (一种示例性的噬菌体源性CD28结合结构域)的可变重链序列和可变轻链序列，以及XENP28428 (一种基于1A7和具有E233P/L234V/L235A/G236del/S267K消融变体的IgG1骨架的抗CD28 mAb)的序列。CDR加下划线，并且斜线指示可变区与恒定结构域之间的边界。如本文所述并且对本文中含有CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确标识可能略有不同，这取决于所使用的编号(如表2所示)，并且因此本文中不仅包括加下划线的CDR，而且还包括使用其他编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或以Fab形式使用。
图17A-17F描绘了来自抗CD28克隆1A7的亲和力优化的可变重链结构域的序列。应注意，所述可变重链结构域可与图16和图18中所描绘的任何其他可变轻链结构域配对。
图18A-18I描绘了来自抗CD28克隆1A7的亲和力优化的可变轻链结构域的序列。应注意，所述可变重链结构域可与图16和图17中所描绘的任何其他可变重链结构域配对。
图19A-19C描绘了说明性的亲和力优化的1A7 VH/VL对的序列。应注意，这些对可构建成Fab或scFv形式。另外，在scFv形式中，这些对可以VHVL取向或VLVH取向构建形式。
图20A-20B描绘了抗CD28克隆1A7可变重链结构域变体和可变轻链结构域变体的共有框架区(FR)和互补决定区(CDR) (如Kabat中)。
图21描绘了在scFv的背景下(在1 + 1 Fab-scFv-Fc bsAb形式的背景下)说明性的亲和力工程改造的1A7 VH/VL对以及其结合亲和力。
图22A-22H描绘了可用于本发明的TROP2 x CD28 bsAb中的另外的CD28结合结构域的可变重链序列和可变轻链序列。如本文所述并且对本文中含有CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确标识可能略有不同，这取决于所使用的编号(如表2所示)，并且因此本文中不仅包括加下划线的CDR，而且还包括使用其他编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或以Fab形式使用。
图23A-23M描绘了可用于本发明的TROP2 x CD28 bsAb中的示例性TROP2结合结构域的可变重链序列和可变轻链序列。如本文所述并且对本文中含有CDR的每个序列都是如此，CDR位置的标识可以根据如表2所示的编号方案来确定。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或以Fab形式使用。
图24描绘了可用于本发明的TROP2 x CD28 bsAb中的示例性TROP2结合结构域的可变重链序列和可变轻链序列。本图中的每个可变重链结构域均可以与本图中的任何可变轻链结构域配对。如本文所述并且对本文中含有CDR的每个序列都是如此，CDR位置的标识可以根据如表2所示的编号方案来确定。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或以Fab形式使用。
图25描绘了可用于本发明的TROP2 x CD28 bsAb中的示例性TROP2结合结构域的可变重链序列和可变轻链序列。本图中的每个可变重链结构域均可以与本图中的任何可变轻链结构域配对。如本文所述并且对本文中含有CDR的每个序列都是如此，CDR位置的标识可以根据如表2所示的编号方案来确定。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或以Fab形式使用。
图26描绘了可用于本发明的TROP2 x CD28 bsAb中的示例性TROP2结合结构域的可变重链序列和可变轻链序列。本图中的每个可变重链结构域均可以与本图中的任何可变轻链结构域配对。如本文所述并且对本文中含有CDR的每个序列都是如此，CDR位置的标识可以根据如表2所示的编号方案来确定。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或以Fab形式使用。
图27描绘了可用于本发明的TROP2 x CD28 bsAb中的示例性TROP2结合结构域的可变重链序列和可变轻链序列。本图中的每个可变重链结构域均可以与本图中的任何可变轻链结构域配对。如本文所述并且对本文中含有CDR的每个序列都是如此，CDR位置的标识可以根据如表2所示的编号方案来确定。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或以Fab形式使用。
图28A-28B描绘了可用于本发明的TROP2 x CD28 bsAb中的示例性TROP2结合结构域的可变重链序列和可变轻链序列。本图中的每个可变重链结构域均可以与本图中的任何可变轻链结构域配对。如本文所述并且对本文中含有CDR的每个序列都是如此，CDR位置的标识可以根据如表2所示的编号方案来确定。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或以Fab形式使用。
图29A-29B描绘了A)经典T细胞/APC相互作用，和B)通过将CD3双特异性抗体与CD28双特异性抗体组合来复制经典T细胞/APC相互作用。在经典T细胞/APC相互作用中，存在由TCR与肽-MHC的反应性提供的第一信号(信号1)和由在APC上表达的CD80/CD86与CD28的交联提供的第二信号(信号2)，所述信号一起完全激活T细胞。相比之下，在使用CD3双特异性抗体的治疗中，仅提供了第一信号。CD28信号可由CD28双特异性抗体提供，旨在通过CD28共刺激来促进激活和增殖。在一些实施方案中，TAA1和TAA2可以是不同的抗原。在一些实施方案中，TAA1和TAA2可以是相同抗原，但表位不同。在一些实施方案中，TAA1和TAA2可以是相同抗原和相同表位。
图30A-30B描绘了呈1 + 1 Fab-scFv-Fc形式的说明性TROP2 x CD28 bsAb的序列。斜线指示可变结构域与其他结构域(例如，结构域接头和恒定结构域)的边界。另外，命名约定说明了scFv从N端至C端的取向。如本文所述并且对本文中含有CDR的每个序列都是如此，CDR位置的标识可以根据如表2所示的编号方案来确定。应注意，TROP2 x CD28 bsAb可以利用90、95、98和99%相同(如本文所定义)的可变区、Fc区和恒定结构域序列，和/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。另外，本文所概述的每个序列可在一个或优选两个Fc结构域中包括或排除M428L/N434S变体，包括M428L/N434S会导致更长的血清半衰期。
图31描绘了呈2 + 1 mAb-scFv形式的说明性TROP2 x CD28 bsAb的序列。斜线指示可变结构域与其他结构域(例如，结构域接头和恒定结构域)的边界。另外，命名约定说明了scFv从N端至C端的取向。如本文所述并且对本文中含有CDR的每个序列都是如此，CDR位置的标识可以根据如表2所示的编号方案来确定。应注意，TROP2 x CD28 bsAb可以利用90、95、98和99%相同(如本文所定义)的可变区、Fc区和恒定结构域序列，和/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。另外，本文所概述的每个序列可在一个或优选两个Fc结构域中包括或排除M428L/N434S变体，包括M428L/N434S会导致更长的血清半衰期。
图32A-32F描绘了适用于可以与本发明的CD28双特异性抗体组合的CD3双特异性抗体的示例性抗CD3结合结构域的序列。CDR加下划线，scFv接头加双下划线(在所述序列中，scFv接头是带正电荷的scFv (GKPGS)4接头(SEQ ID NO: 24)，不过本领域技术人员应理解，这个接头可以被其他接头替换，包括不带电或带负电荷的接头，其中一些描绘在图6中)，并且斜线指示可变结构域的边界。另外，命名约定说明了scFv从N端至C端的取向。如本文所述并且对本文中含有CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确标识可能略有不同，这取决于所使用的编号(如表2所示)，并且因此本文中不仅包括加下划线的CDR，而且还包括使用其他编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或以Fab形式使用。
图33A-33B描绘了纯化的T细胞与αCD3转染的A431-β21缺失细胞以A) 10:1或B)1:1效应子:靶标比率一起孵育时，对IL2分泌的诱导。
图34A-34C描绘了经亲和力工程改造以与IGKV1-39种系序列配对的新颖1A7 VH，以及共有框架区(FR)和互补决定区(CDR)。
图35描绘了与IGKV1-39人种系VL配对的新颖1A7变体对人CD28的亲和力。
图36A-36C描绘了新颖TROP2结合结构域克隆1F11-1A3.315，以及可以与L1 (应注意，L1是IGKV1-39种系序列)配对的说明性的亲和力工程改造的VH变体。另外，描绘了1F11-1A3.315 VH的共有框架区(FR)和互补决定区(CDR)。如本文所述并且对本文中含有CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确标识可能略有不同，这取决于所使用的编号(如表2所示)，并且因此本文中不仅包括加下划线的CDR，而且还包括使用其他编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或以Fab形式使用。
图37描绘了亲和力工程改造的抗TROP2克隆1F11-1A3.315针对人和食蟹猴TROP2的KD结合常数、缔合常数(ka)和解离常数(kd)。
图38A-38E描绘了呈1 + 1 CLC形式的说明性TROP2 x CD28 bsAb的序列。CDR加下划线，并且斜线指示可变区、接头、Fc区与恒定结构域之间的边界。应注意，TROP2 x CD28bsAb可以利用90、95、98和99%相同(如本文所定义)的可变区、Fc区和恒定结构域序列，和/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。另外，本文所概述的每个序列可在一个或优选两个Fc结构域中包括或排除M428L/N434S变体，这会导致更长的血清半衰期。
图39A-39D描绘了呈2 + 1 CLC形式的说明性TROP2 x CD28 bsAb的序列。CDR加下划线，并且斜线指示可变区、接头、Fc区与恒定结构域之间的边界。应注意，TROP2 x CD28bsAb可以利用90、95、98和99%相同(如本文所定义)的可变区、Fc区和恒定结构域序列，和/或含有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。另外，本文所概述的每个序列可在一个或优选两个Fc结构域中包括或排除M428L/N434S变体，这会导致更长的血清半衰期。
图40A-40B描绘了RSV对照(即，用“沉默的” RSV结合结构域交换TROP2或CD28结合结构域的bsAb)的序列。这些对照是用于多种实验目的，包括充当所述分子在TROP2阴性细胞上将如何行为的替代物。
图41描绘了1 µg/mL的说明性B7H3 x CD3 bsAb与具有不同的TROP2和CD28结合亲和力的TROP2 x CD28 bsAb的组合在以下各物存在下对IL-2分泌的诱导：A) 647-V (TROP高)，B) A431 (TROP中等)，C) MDA-MB-231 (TROP低-中等)，以及D) DU145 (TROP低-中等)肿瘤细胞(1:10效应子:靶标)。
图42描绘了1 µg/mL的说明性B7H3 x CD3 bsAb与具有不同的TROP2结合亲和力并呈多种形式的TROP2 x CD28 bsAb的组合在OVCAR5肿瘤细胞(1:1效应子:靶标)存在下对IL-2分泌的诱导。
图43描绘了1 µg/mL的说明性B7H3 x CD3 bsAb与具有不同的TROP2和CD28结合亲和力并呈多种形式的TROP2 x CD28 bsAb的组合在OVCAR5肿瘤细胞(1:1效应子:靶标)存在下对IL-2分泌的诱导。
图44描绘了1 µg/mL的说明性B7H3 x CD3 bsAb与具有不同的TROP2和CD28结合亲和力的TROP2 x CD28 bsAb的组合在以下各物存在下对IL-2分泌的诱导：A) DU145，B)MCF7，C) OVCAR5，以及D) MDA-MB-231肿瘤细胞(1:1效应子:靶标)。
图45描绘了1 µg/mL的说明性B7H3 x CD3 bsAb与具有不同的TROP2和CD28结合亲和力的TROP2 x CD28 bsAb的组合在DU145、MDA-MB-231、OVCAR5或MCF7肿瘤细胞(1:1效应子:靶标)存在下对IL-2分泌的诱导的EC50。
图46描绘了TROP2 x CD28 bsAb单独或与10 µg/ml的PD-1 mAb组合在MDA-MB-231肿瘤细胞(1:10效应子:靶标)存在下对IL-2分泌的诱导。数据显示出，与PD-1 mAb组合增强了TROP x CD28 bsAb的活性。
图47描绘了1 µg/ml的TROP2 x CD28 bsAb XENP44599与T细胞和OVCAR5细胞共培养物以及剂量滴定的说明性B7H3 x CD3 bsAb一起孵育时，对T细胞激活(A)、T细胞增殖(如ki67 (B)和T细胞计数(C)所指示)和肿瘤细胞杀伤(D)的诱导。
图48描绘了1 µg/mL的说明性B7H3 x CD3 bsAb与具有不同的TROP2和CD28结合亲和力的TROP2 x CD28 bsAb的组合在以下各物存在下对IFNγ分泌的诱导：A) DU145，B)MCF7，C) OVCAR5，以及D) MDA-MB-231肿瘤细胞(1:1效应子:靶标)。
图49描绘了剂量滴定的说明性B7H3 x CD3 bsAb与1 µg/ml的具有不同的TROP2和CD28结合亲和力的TROP2 x CD28 bsAb的组合在以下各物存在下对IL-2分泌的诱导：A)647-V (TROP高)，B) A431 (TROP中等)，C) MDA-MB-231 (TROP低-中等)，以及D) DU145 (TROP低-中等)肿瘤细胞(1:10效应子:靶标)。
图50描绘了1 µg/mL的说明性B7H3 x CD3 bsAb与具有不同的TROP2结合亲和力并呈多种形式的TROP2 x CD28 bsAb的组合在pp65-MDA-MB-231肿瘤细胞(1:1效应子:靶标)存在下对IL-2分泌的诱导。
图51描绘了1 µg/mL的说明性B7H3 x CD3 bsAb与具有不同的TROP2和CD28结合亲和力并呈多种形式的TROP2 x CD28 bsAb的组合在pp65-MDA-MB-231肿瘤细胞(1:1效应子:靶标)存在下对IL-2分泌的诱导。
图52描绘了新颖TROP2结合结构域克隆2C5A3.316 (应注意，L1是IGKV1-39种系序列)。如本文所述并且对本文中含有CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确标识可能略有不同，这取决于所使用的编号(如表2所示)，并且因此本文中不仅包括加下划线的CDR，而且还包括使用其他编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或以Fab形式使用。
图53描绘了新颖TROP2结合结构域克隆1A3A4.312 (应注意，L1是IGKV1-39种系序列)。如本文所述并且对本文中含有CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确标识可能略有不同，这取决于所使用的编号(如表2所示)，并且因此本文中不仅包括加下划线的CDR，而且还包括使用其他编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或以Fab形式使用。
图54描绘了新颖TROP2结合结构域克隆1B2A4.312 (应注意，L1是IGKV1-39种系序列)。如本文所述并且对本文中含有CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确标识可能略有不同，这取决于所使用的编号(如表2所示)，并且因此本文中不仅包括加下划线的CDR，而且还包括使用其他编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或以Fab形式使用。
图55描绘了新颖TROP2结合结构域克隆1B11A3.316 (应注意，L1是IGKV1-39种系序列)。如本文所述并且对本文中含有CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确标识可能略有不同，这取决于所使用的编号(如表2所示)，并且因此本文中不仅包括加下划线的CDR，而且还包括使用其他编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或以Fab形式使用。
图56描绘了新颖TROP2结合结构域克隆1C9A4.313 (应注意，L1是IGKV1-39种系序列)。如本文所述并且对本文中含有CDR的每个序列都是如此，CDR位置的精确标识可能略有不同，这取决于所使用的编号(如表2所示)，并且因此本文中不仅包括加下划线的CDR，而且还包括使用其他编号系统的VH和VL结构域内所包括的CDR。此外，对于图中的所有序列，这些VH和VL序列可以scFv形式或以Fab形式使用。
图57描绘了食蟹猴中XENP44599和XENP44595随时间变化的血清浓度。
图58描绘了纯化的T细胞与1 µg/ml的说明性EpCAM x CD3 bsAb和具有不同的TROP2和CD28结合亲和力的TROP2 x CD28 bsAb的组合在OVCAR5TROP2high肿瘤细胞(1:1效应子:靶标比率)存在下一起孵育时，对IL-2分泌的诱导。
图59A-59I描绘了纯化的T细胞与1 µg/ml的说明性EpCAM x CD3 bsAb和具有不同的TROP2和CD28结合亲和力的TROP2 x CD28 bsAb的组合在OVCAR5 TROP2高或OVCAR3 TROP2低肿瘤细胞(1:1效应子:靶标比率)存在下一起孵育时，对IL-2分泌的诱导，以及每种细胞系上的效力和功效变化。
图60描绘了纯化的T细胞与2.5 ng/mL的说明性EpCAM x CD3 bsAb和剂量滴定的TROP2 x CD28 bsAb的组合在OVCAR5 TROP2高肿瘤细胞(1:1 E:T比率；72小鼠)存在下一起孵育后，A)靶标细胞杀伤和B) T细胞增殖。
具体实施方式
I. 概述
TROP2是一种I型跨膜糖蛋白，它具有信号转导功能并在细胞自我更新、增殖和转化方面发挥调节作用。TROP 2在数种癌症中过表达，所述癌症包括子宫内膜癌、胰腺癌、结肠癌、食管癌、胆管癌、口腔癌和神经胶质瘤。因此，TROP2是治疗此类癌症的潜在靶标。
在癌症治疗中，正在对T细胞的激活进行广泛研究。T细胞的完全激活和分化需要多重信号。如图29A所示，信号1 (通过由T细胞受体(TCR)识别肽-MHC (pMHC)复合物所促进)是T细胞激活绝对需要的。信号2与信号1协同作用并对其进行放大，通常是由CD28配体CD80和CD86与CD28本身的相互作用提供的。尽管单独的CD28衔接通常是惰性的，但当与信号1激活组合时，它会促进额外的激活、存活和增殖信号，包括IL-2分泌。由于CD80和CD86仅由专业抗原呈递细胞(APC)天然表达，肿瘤环境中CD28共刺激的程度可能具有高度可变性。因此，本发明针对一类新颖的肿瘤靶向抗CD28 x抗TROP2双特异性抗体，其CD28的CD80/CD86衔接模拟了CD28的CD80/CD86衔接，从而提供信号2的人工来源(图29B)。值得注意的是，信号1可以由肿瘤细胞的天然TCR:pMHC识别提供，或者它可以由CD28双特异性抗体与CD3双特异性抗体(例如，抗CD3 x抗TROP2)的组合提供，从而可以模拟信号1。
因此，本文提供了新颖抗CD28 x抗TROP2 (也称为“αCD28 x αTROP2”，并且有时称为“CD28 x TROP2”)双特异性抗体以及使用此类抗体来治疗TROP2相关癌症的方法。在许多情况下，这些双特异性抗体是异源二聚的。主题αCD28 x αTROP2抗体能够与T细胞上的CD28共刺激分子激动性地结合并且靶向表达TROP2的肿瘤细胞上的TROP2。因此，此类抗体选择性地增强表达TROP2的肿瘤部位处的抗肿瘤活性，同时最小化外周毒性。本文所提供的主题抗体单独地作为单一疗法或当与其他抗癌疗法组合使用时对于增强抗肿瘤活性特别有用，如本文更广泛描述。
因此，一方面，本文提供了与两种不同抗原结合的异源二聚抗体，例如，所述抗体是“双特异性的”，因为它们结合两种不同的靶标抗原，通常是如下所述的CD28和TROP2。这些异源二聚抗体可以单价地(例如，存在单个抗原结合结构域，诸如可变重链结构域和可变轻链结构域对)或二价地(存在两个抗原结合结构域，其各自独立地结合抗原)结合每一种靶标抗原。在一些实施方案中，本文所提供的异源二聚抗体包括一个CD28结合结构域和一个TROP2结合结构域(例如本文所述的呈“1 + 1 Fab-scFv-Fc”形式的异源二聚抗体，因此是双特异性和二价的)。在其他实施方案中，本文所提供的异源二聚抗体包括一个CD28结合结构域和两个TROP2结合结构域(例如本文所述的呈“2 + 1 Fab2-scFv-Fc”形式的异源二聚抗体，因此是双特异性但三价的，因为它们含有三个抗原结合结构域(ABD))。本文所提供的异源二聚抗体是基于使用含有氨基酸取代(即，“偏斜变体”)的不同单体，所述取代使异源二聚体的形成相对于同源二聚体发生“偏斜”，如下文更全面地概述。在一些实施方案中，所述异源二聚体抗体也与纯化变体(例如“pI变体”)偶联，从而允许从同源二聚体中简单地纯化出异源二聚体，如下文类似地概述。所提供的异源二聚双特异性抗体通常依赖于使用可在生产细胞中自组装以产生异源二聚蛋白质的工程改造的或变体Fc结构域，以及生成和纯化此类异源二聚蛋白质的方法。
II. 命名法
特定抗原结合结构域(例如，TROP2和CD28结合结构域)的命名法使用“Hx.xx_Ly.yy”类型的形式，其中编号是特定可变链序列的唯一标识符。因此，例如，CD28结合结构域“1A7[CD28]_H1_L1” (图16)包括可变重链结构域H1和可变轻链结构域L1。在这些序列用作scFv的情况下，名称“H1_L1”指示了，所述结合结构域包括可变重链结构域“H1”与可变轻链结构域“L1”的组合，并且从N端至C端呈VH-接头-VL取向。这种具有相同的重链可变结构域和轻链可变结构域序列但呈相反顺序(从N端至C端是VL-接头-VH取向)的分子将被指定为“L1_H1”。同样，不同构建体可能“混合和匹配”重链和轻链，如从序列表和附图中将显而易见的。
III. 定义
为了可以更完全地理解本申请，下文阐述了若干定义。此类定义意图涵盖语法等效词。
本文中，“CD28”、“分化簇28”和“Tp44” (例如，Genebank登录号NP_001230006(人)、NP_001230007 (人)、NP_006130 (人)和NP_031668 (小鼠))意指在T细胞上表达的B7受体，其提供了T细胞激活和存活所需的共刺激信号。除了T细胞受体(TCR)以外，通过CD28进行的T细胞刺激也为各种白细胞介素的产生提供了强效信号。CD28是CD80 (B7.1)和CD86(B7.2)蛋白的受体。CD28包括具有YMNM基序(SEQ ID NO:749)的细胞间结构域，所述基序对于募集含SH2结构域的蛋白质(特别是PI3K)至关重要。CD28还包括两个富脯氨酸基序，所述基序能够结合含SH3的蛋白质。图1描绘了示例性CD28序列。除非另有说明，否则对CD28的提及是指人CD28序列。
本文中，“TROP2”、“肿瘤相关钙信号转导蛋白2”、“TACSTD2”、“表皮糖蛋白1”和“EGP-1”意指一种跨膜糖蛋白，它是肿瘤相关钙信号转导蛋白(TACSTD)家族的一部分。TROP2具有信号转导功能并在细胞自我更新、增殖和转化方面发挥调节作用。例如，图2描绘了TROP2序列。TROP2在特定癌症中表达，所述癌症包括子宫内膜癌、胰腺癌、结肠癌、食管癌、胆管癌、口腔癌和神经胶质瘤。
本文中，“消融”意指活性的降低或去除。因此，例如，“消融FcγR结合”意指与不含特定变体的Fc区相比，Fc区氨基酸变体具有小于50%的起始结合，其中超过70-80-90-95-98%的活性损失是优选的，并且一般来说，活性低于Biacore、SPR或BLI测定中可检测的结合水平。在FcγR结合的消融中特别有用的是图5所示的那些，它们通常添加至两个单体中。
如本文所用，“ADCC”或“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”意指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶标细胞上结合的抗体并且随后引起靶标细胞的溶解。ADCC与FcγRIIIa结合相关；与FcγRIIIa的结合增加使得ADCC活性增加。
如本文所用，“ADCP”抗体依赖性细胞介导的吞噬作用意指细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性吞噬细胞识别靶标细胞上结合的抗体并且随后引起靶标细胞的吞噬。
如本文所用，术语“抗体”广泛地使用。本文所提供的抗体可采取如本文所述的多种形式，包括本文所述的传统抗体以及抗体衍生物、片段和模拟物。
传统的免疫球蛋白(Ig)抗体是“Y”形四聚体。每个四聚体通常由两对相同的多肽链构成，每对具有一个“轻链”单体(通常具有约25 kDa的分子量)和一个“重链”单体(通常具有约50-70 kDa的分子量)。
其他有用的抗体形式包括但不限于本文所提供的“1 + 1 Fab-scFv-Fc”和“2 + 1Fab2-scFv-Fc”形式(参见例如图15)。另外有用的抗体形式包括但不限于“1 + 1共同轻链”和“2 + 1共同轻链”、“mAb-Fv”、“mAb-scFv”、“中心Fv”、“单臂scFv-mAb”、“scFv-mAb”、“双scFv”和“三叉戟”形式抗体(图15)。还参见US20180127501A1，其以引用的方式并入本文中，特别是涉及抗体形式的相关部分(参见例如US20180127501A1的图2)。
抗体重链通常包括可变重链(VH)结构域，其包括vhCDR1-3；和Fc结构域，其包括CH2-CH3单体。在一些实施方案中，抗体重链包括铰链和CH1结构域。传统的抗体重链是从N端至C端如下组织的单体：VH-CH1-铰链-CH2-CH3。CH1-铰链-CH2-CH3统称为抗体的重链“恒定结构域”或“恒定区”，其中有五种不同的类别或“同种型”：IgA、IgD、IgG、IgE和IgM。
在一些实施方案中，本文所提供的抗体包括IgG同种型恒定结构域，其具有若干亚类，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在免疫球蛋白IgG亚类中，重链中存在若干免疫球蛋白结构域。本文中，“免疫球蛋白(Ig)结构域”意指免疫球蛋白中具有独特的三级结构的区域。本发明关注的是重链结构域，包括恒定重链(CH)结构域和铰链结构域。在IgG抗体的背景下，IgG同种型各自具有三个CH区。因此，在IgG的背景下，“CH”结构域如下：“CH1”是指根据如Kabat中的EU索引的位置118-215。“铰链”是指根据如Kabat中的EU索引的位置216-230。“CH2”是指根据如Kabat中的EU索引的位置231-340，并且“CH3”是指根据如Kabat中的EU索引的位置341-447。如表1所示，重链结构域的确切编号和布置在不同的编号系统中可有所不同。如本文所示和下文所述，pI变体可处于下文所讨论的一个或多个CH区以及铰链区中。
应注意，IgG1具有不同的同种异型，在356 (D或E)和358 (L或M)处具有多态性。本文所描绘的序列使用356E/358M同种异型，然而本文中包括其他同种异型。也就是说，本文所包括的任何包括IgG1 Fc结构域的序列均可具有356D/358L，替换了356E/358M同种异型。应理解，治疗抗体也可包含同种型和/或亚类的杂合体。例如，如以引用的方式并入的美国公布2009/0163699所示，在一些实施方案中，本发明抗体包括人IgG1/G2杂合体。
如本文所用，“Fc”或“Fc区”或“Fc结构域”意指包含抗体的恒定区的多肽，在一些情况下，排除了第一恒定区免疫球蛋白结构域(例如，CH1)的全部或其一部分，并且在一些情况下，任选地包括铰链的全部或一部分。对于IgG，Fc结构域包含免疫球蛋白结构域CH2和CH3 (Cγ2和Cγ3)，以及任选的在CH1 (Cγ1)与CH2 (Cγ2)之间的铰链区的全部或一部分。因此，在一些情况下，Fc结构域从N端至C端包括CH2-CH3和铰链-CH2-CH3。在一些实施方案中，Fc结构域是来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc结构域，其中IgG1铰链-CH2-CH3和IgG4铰链-CH2-CH3在许多实施方案中有特别用途。另外，在人IgG1 Fc结构域的情形中，铰链可以包括C220S氨基酸取代。另外，在人IgG4 Fc结构域的情形中，铰链可以包括S228P氨基酸取代。尽管Fc区的边界可以变化，但人IgG重链Fc区通常被定义成在其羧基端包括残基E216、C226或A231，其中编号是根据如Kabat中的EU索引。在一些实施方案中，如下文更全面地描述，对Fc区进行氨基酸修饰，例如以改变与一种或多种FcγR或与FcRn的结合。
本文中，“重链恒定区”意指抗体(或其片段)的CH1-铰链-CH2-CH3部分，排除了可变重链结构域；在人IgG1的EU编号中，这是氨基酸118-447。本文中，“重链恒定区片段”意指含有较少来自N端或C端中任一端或两端的氨基酸但仍保留与另一重链恒定区形成二聚体的能力的重链恒定区。
重链的另一种类型的结构域是铰链区。本文中，“铰链”或“铰链区”或“抗体铰链区”或“铰链结构域”意指包含抗体的第一恒定结构域与第二恒定结构域之间的氨基酸的柔性多肽。在结构上，IgG CH1结构域在EU位置215处终止，并且IgG CH2结构域在残基EU位置231处开始。因此，对于IgG，抗体铰链在本文中被定义成包括位置216 (IgG1中的E216)至230 (IgG1中的P230)，其中编号是根据如Kabat中的EU索引。在一些情况下，使用“铰链片段”，其在铰链结构域的N端和C端中任一端或两端含有较少氨基酸。如本文所述，也可在铰链区中制备pI变体。本文中，许多抗体在根据EU编号(铰链区)的位置220处至少有一个半胱氨酸被丝氨酸替换。一般来说，这种修饰是在本文所描绘的大多数序列的“scFv单体”侧(当使用1+1或2+1形式时)，不过它也可以在“Fab单体”侧或在这两侧以减少二硫键形成。本文序列中特别包括这些半胱氨酸中的一个或两个被替换(C220S)。
本领域技术人员应理解，重链恒定区结构域(即，CH1、铰链、CH2和CH3结构域)的确切编号和布置在不同的编号系统中可有所不同。对根据EU和Kabat的重链恒定区编号的有用比较如下，参见Edelman等人, 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85，和Kabat等人, 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版, UnitedStates Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda，所述文献以引用的方式整体并入。
表1
抗体轻链通常包含两个结构域：可变轻链结构域(VL)，其包括轻链CDR vlCDR1-3；和恒定轻链区(通常称为CL或Cκ)。抗体轻链通常从N端至C端如下组织：VL-CL。
本文中，“抗原结合结构域”或“ABD”意指一组六个互补决定区(CDR)，其在作为多肽序列的一部分存在时特异性地结合如本文所讨论的靶标抗原(例如，TROP2或CD28)。如本领域中已知，这些CDR通常作为第一组可变重链CDR (vhCDR或VHCDR)和第二组可变轻链CDR(vlCDR或VLCDR)存在，各组包含三个CDR：vhCDR1、vhCDR2、vhCDR3可变重链CDR，以及vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3 vhCDR3可变轻链CDR。CDR存在于可变重链结构域(vhCDR1-3)和可变轻链结构域(vlCDR1-3)中。可变重链结构域和可变轻链结构域来自Fv区。
本发明提供了大量的不同CDR组。在这种情况下，“全CDR组”包含三个可变轻链CDR和三个可变重链CDR，例如vlCDR1、vlCDR2、vlCDR3、vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3。这些可以分别是较大的可变轻链结构域或可变重链结构域的一部分。另外，如本文更全面地概述，当使用重链和轻链时(例如当使用Fab时)，可变重链结构域和可变轻链结构域可处于单独的多肽链上，或在scFv序列的情况下可处于单个多肽链上。
本领域技术人员应理解，CDR的确切编号和布置在不同的编号系统中可有所不同。然而，应理解，可变重链序列和/或可变轻链序列的公开内容包括相关(固有) CDR的公开内容。因此，每个可变重链区的公开内容是vhCDR (例如，vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)的公开内容，并且每个可变轻链区的公开内容是vlCDR (例如，vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)的公开内容。对CDR编号的有用比较如下，参见Lafranc等人, Dev. Comp. Immunol. 27(1):55-77(2003):
表2
在本说明书通篇中，当提及可变结构域中的残基(大致是轻链可变区的残基1-107和重链可变区的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统，并且关于Fc区，通常使用EU编号系统(例如Kabat等人,同上(1991))。
CDR有助于形成抗原结合结构域和抗体的抗原结合位点，或更具体地说，表位结合位点。“表位”是指与抗体分子的可变区中的特定抗原结合位点(称为互补位)相互作用的决定簇。表位是诸如氨基酸或糖侧链的分子分组，并且通常具有特定的结构特征以及特定的电荷特征。单一抗原可具有超过一个表位。
表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)和未直接参与结合的其他氨基酸残基，诸如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基；换句话说，所述氨基酸残基在特异性抗原结合肽的足迹内。
表位可以是构象或线性的。构象表位是由来自线性多肽链的不同区段的空间并置的氨基酸产生的。线性表位是由多肽链中的相邻氨基酸残基产生的表位。构象和非构象表位的区别可在于在存在变性溶剂的情况下，与前者而非后者的结合丧失。
在独特的空间构象中，表位典型地包括至少3个并且更通常地至少5个或8-10个氨基酸。识别相同表位的抗体可用简单的免疫测定来验证，所述免疫测定显示一种抗体阻断另一抗体与靶标抗原结合的能力，例如“分箱(binning)”。如下文所概述，本发明不仅包括本文所列举的抗原结合结构域和抗体，而且包括竞争与所列举的抗原结合结构域所结合的表位的结合的那些。
在一些实施方案中，抗原结合结构域的六个CDR由可变重链结构域和可变轻链结构域提供。在“Fab”形式中，一组6个CDR由两个不同的多肽序列、可变重链结构域(vh或VH；含有vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3)和可变轻链结构域(vl或VL；含有vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)提供，其中vh结构域的C端连接至重链的CH1结构域的N端并且vl结构域的C端连接至恒定轻链结构域的N端(并且因此形成轻链)。在scFv形式中，vh和vl结构域通常通过使用如本文所概述的接头(“scFv接头”)共价连接成单个多肽序列，所述多肽序列可以是(从N端开始)vh-接头-vl或vl-接头-vh，前者通常是优选的(包括每侧任选的结构域接头，这取决于所使用的形式)。一般来说，scFv结构域的C端连接至第二单体中全部或部分铰链的N端。
如本文所用，“可变区”或“可变结构域”意指免疫球蛋白中的区域，所述区域包含大体上由分别构成κ、λ和重链免疫球蛋白遗传基因座的Vκ、Vλ和/或VH基因中的任一者编码的一个或多个Ig结构域，并且含有赋予抗原特异性的CDR。因此，“可变重链结构域”与“可变轻链结构域”配对以形成抗原结合结构域(“ABD”)。另外，每个可变结构域包含从氨基端至羧基端按以下顺序排列的三个高变区(“互补决定区”，“CDR”) (可变重链结构域的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3，以及可变轻链结构域的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3)和四个框架(FR)区：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
如本文所用，“Fab”或“Fab区”意指包含VH、CH1、VL以及CL免疫球蛋白结构域的抗体区域，所述结构域通常在两条不同的多肽链上(例如，VH-CH1在一条链上并且VL-CL在另一条链上)。Fab可以指单独的这一区域，或在本发明的双特异性抗体的背景下的这一区域。在Fab的背景下，除了CH1和CL结构域以外，Fab还包含Fv区。
如本文所用，“Fv”或“Fv片段”或“Fv区”意指包含VL和VH结构域的抗体区域。Fv区可构建成Fab (如上文所讨论，通常是两个不同多肽，所述多肽还包括如上文所概述的恒定区)和单链Fv (scFv)形式，其中vl和vh结构域包括在单个肽中，通常用如本文所讨论的接头连接。
本文中，“单链Fv”或“scFv”意指通常使用如本文所讨论的scFv接头共价连接至可变轻链结构域的可变重链结构域，以形成scFv或scFv结构域。scFv结构域从N端至C端可呈任一取向(vh-接头-vl或vl-接头-vh)。在序列表和附图所描绘的序列中，vh和vl结构域的顺序以名称指示，例如，H.X_L.Y意指N端至C端是vh-接头-vl，并且L.Y_H.X是vl-接头-vh。
本文所提供的主题抗体的一些实施方案包含至少一个scFv结构域，所述结构域虽然不是天然存在的，但通常包括通过scFv接头连接在一起的可变重链结构域和可变轻链结构域。如本文所概述，虽然scFv结构域通常从N端至C端取向为VH-scFv接头-VL，但对于任何scFv结构域(或使用Fab的vh和vl序列构建的那些)，这可逆转为VL-scFv接头-VH，在一端或两端具有任选的接头，这取决于形式。
本文中，“修饰”或“变体”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失，或化学连接至蛋白质的部分的改变。例如，修饰可以是连接至蛋白质的碳水化合物或PEG结构改变。本文中，“氨基酸修饰”意指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。为清楚起见，除非另有说明，否则氨基酸修饰总是针对由DNA编码的氨基酸，例如在DNA和RNA中具有密码子的20种氨基酸。
本文中，“氨基酸取代”或“取代”意指用不同的氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸。特别地，在一些实施方案中，取代是针对并未天然存在于特定位置处的氨基酸，即并未天然存在于生物体内或任何生物体内。例如，取代E272Y是指变体多肽，在这一情况下是指Fc变体，其中位置272处的谷氨酸被酪氨酸替换。为清楚起见，已被工程改造成改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如，将CGG (编码精氨酸)交换成CGA (仍编码精氨酸)以增加宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取代”；也就是说，尽管产生编码相同蛋白质的新基因，但如果蛋白质在其开始的特定位置处具有相同氨基酸，则所述蛋白质不是氨基酸取代。
如本文所用，“氨基酸插入”或“插入”意指在亲本多肽序列中的特定位置处添加氨基酸序列。例如，-233E或233E表示在位置233之后和位置234之前插入谷氨酸。另外，-233ADE或A233ADE表示在位置233之后和位置234之前插入AlaAspGlu。
如本文所用，“氨基酸缺失”或“缺失”意指去除亲本多肽序列中的特定位置处的氨基酸序列。例如，E233-或E233#、E233()或E233del表示位置233处的谷氨酸的缺失。另外，EDA233-或EDA233#表示从位置233处开始的序列GluAspAla的缺失。
如本文所用，“变体蛋白质”或“蛋白质变体”或“变体”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本蛋白质不同的蛋白质。与亲本蛋白质相比，蛋白质变体具有至少一个氨基酸修饰，但并未多到使变体蛋白质将无法使用比对程序(诸如下文所述的程序)与亲本蛋白质进行比对。一般来说，使用下文所述的比对程序(诸如BLAST)发现，变体蛋白质(诸如本文所概述的变体Fc结构域等)通常与亲本蛋白质至少75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%相同。
如本文所用，“变体”还指赋予特定功能的特定氨基酸修饰(例如，“异源二聚化变体”、“pI变体”、“消融变体”等)。
如下文所述，在一些实施方案中，亲本多肽(例如Fc亲本多肽)是人野生型序列，诸如来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定结构域或Fc区，不过具有变体的人序列也可用作“亲本多肽”，例如可包括美国公布2006/0134105的IgG1/2杂合体。本文中的蛋白质变体序列优选地将与亲本蛋白质序列具有至少约80%同一性，并且最优选地至少约90%同一性，更优选地至少约95-98-99%同一性。因此，如本文所用，“抗体变体”或“变体抗体”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本抗体不同的抗体，如本文所用，“IgG变体”或“变体IgG”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本IgG (再次，在许多情况下，来自人IgG序列)不同的抗体，并且如本文所用，“免疫球蛋白变体”或“变体免疫球蛋白”意指由于至少一个氨基酸修饰而与亲本免疫球蛋白序列不同的免疫球蛋白序列。如本文所用，“Fc变体”或“变体Fc”意指与人IgG1、IgG2或IgG4的Fc结构域相比，在Fc结构域中包含氨基酸修饰的蛋白质。
如本文所用，“Fc变体”或“变体Fc”意指在Fc结构域中包含氨基酸修饰的蛋白质。修饰可以是添加、缺失或取代。Fc变体是根据构成它们的氨基酸修饰来定义的。因此，例如，N434S或434S是相对于亲本Fc多肽在位置434处具有丝氨酸取代的Fc变体，其中编号是根据EU索引。同样，M428L/N434S定义了相对于亲本Fc多肽具有取代M428L和N434S的Fc变体。WT氨基酸的身份可能未指出，在所述情况下前述变体被称为428L/434S。应注意，提供取代的顺序是任意的，也就是说，例如，428L/434S是与434S/428L相同的Fc变体，等等。对于本文所讨论的涉及抗体或其衍生物和片段(例如，Fc结构域)的所有位置，除非另有说明，否则氨基酸位置编号是根据EU索引。“EU索引”或“如Kabat中的EU索引”或“EU编号”方案是指EU抗体的编号(Edelman等人, 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85，特此以引用的方式整体并入)。修饰可以是添加、缺失或取代。
一般来说，变体Fc结构域与对应的亲本人IgG Fc结构域具有至少约80、85、90、95、97、98或99%同一性(使用下文所论述的同一性算法，其中一个实施方案利用本领域中已知的BLAST算法，使用默认参数)。或者，与亲本Fc结构域相比，变体Fc结构域可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰。或者，与亲本Fc结构域相比，变体Fc结构域可具有多达1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸修饰。另外，如本文所讨论，本文所述的变体Fc结构域仍然保留与另一Fc结构域形成二聚体的能力，如使用如本文所述的已知技术(诸如非变性凝胶电泳)所测量。
如本文所用，“蛋白质”意指至少两个共价连接的氨基酸，其包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。另外，构成本发明抗体的多肽可以包括一个或多个侧链或末端的合成衍生化、糖基化、PEG化、环状排列、环化、与其他分子的接头、与蛋白质或蛋白质结构域的融合以及肽标签或标记的添加。
如本文所用，“残基”意指蛋白质中的位置和其相关的氨基酸身份。例如，天冬酰胺297 (也称为Asn297或N297)是人抗体IgG1中位置297处的残基。
如本文所用，“IgG亚类修饰”或“同种型修饰”意指一种氨基酸修饰，所述氨基酸修饰将一种IgG同种型的一个氨基酸转化为不同的对齐的IgG同种型中的对应氨基酸。例如，因为在EU位置296处，IgG1包含酪氨酸且IgG2包含苯丙氨酸，所以IgG2中的F296Y取代被视为IgG亚类修饰。
如本文所用，“非天然存在的修饰”意指并非同种型的氨基酸修饰。例如，因为人IgG在位置434处均不包含丝氨酸，所以IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 (或其杂合体)中的取代434S被视为非天然存在的修饰。
如本文所用，“氨基酸”和“氨基酸身份”意指由DNA和RNA编码的20种天然存在的氨基酸之一。
如本文所用，“效应功能”意指由抗体Fc区与Fc受体或配体的相互作用引起的生物化学事件。效应功能包括但不限于ADCC、ADCP和CDC。
如本文所用，“IgG Fc配体”意指来自任何生物体的与IgG抗体的Fc区结合以形成Fc/Fc配体复合物的分子，优选地是多肽。Fc配体包括但不限于FcγRI、FcγRII、FcγRIII、FcRn、C1q、C3、甘露聚糖结合凝集素、甘露糖受体、葡萄球菌蛋白A、链球菌蛋白G和病毒FcγR。Fc配体还包括Fc受体同源物(FcRH)，它们是与FcγR同源的Fc受体家族(Davis等人,2002, Immunological Reviews 190:123-136，以引用的方式整体并入)。Fc配体可以包括未发现的结合Fc的分子。特定的IgG Fc配体是FcRn和Fcγ受体。如本文所用，“Fc配体”意指来自任何生物体的与抗体的Fc区结合以形成Fc/Fc配体复合物的分子，优选地是多肽。
如本文所用，“Fcγ受体”、“FcγR (FcgammaR)”意指结合IgG抗体Fc区并由FcγR基因编码的蛋白质家族的任何成员。在人体内，这一家族包括但不限于：FcγRI (CD64)，包括同工型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII (CD32)，包括同工型FcγRIIa (包括同种异型H131和R131)、FcγRIIb (包括FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；和FcγRIII(CD16)，包括同工型FcγRIIIa (包括同种异型V158和F158)和FcγRIIIb (包括同种异型FcγRIIb-NA1和FcγRIIb-NA2) (Jefferis等人, 2002, Immunol Lett 82:57-65,以引用的方式全文并入)以及任何未发现的人FcγR或FcγR同工型或同种异型。FcγR可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。小鼠FcγR包括但不限于FcγRI (CD64)、FcγRII (CD32)、FcγRIII (CD16)和FcγRIII-2 (CD16-2)以及任何未发现的小鼠FcγR或FcγR同工型或同种异型。
如本文所用，“FcRn”或“新生儿Fc受体”意指结合IgG抗体Fc区并且至少部分地由FcRn基因编码的蛋白质。FcRn可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。如本领域中已知，功能性FcRn蛋白包含两种多肽，通常被称为重链和轻链。轻链是β-2-微球蛋白并且重链由FcRn基因编码。除非本文另外指出，否则FcRn或FcRn蛋白是指FcRn重链与β-2-微球蛋白的复合物。多种FcRn变体用于增加与FcRn受体的结合，并且在一些情况下，用于增加血清半衰期。“FcRn变体”是有助于增加与FcRn受体的结合的氨基酸修饰，并且下文示出了合适的FcRn变体。
如本文所用，“亲本多肽”意指随后经修饰以生成变体的起始多肽。亲本多肽可以是天然存在的多肽，或天然存在的多肽的变体或工程改造形式。因此，如本文所用，“亲本免疫球蛋白”意指经修饰以生成变体的未修饰的免疫球蛋白多肽，并且如本文所用，“亲本抗体”意指经修饰以生成变体抗体的未修饰的抗体。应注意，“亲本抗体”包括如下文所概述的已知的商业上重组产生的抗体。在这种背景下，“亲本Fc结构域”将是相对于所列举的变体；因此，“变体人IgG1 Fc结构域”与人IgG1的亲本Fc结构域进行比较，“变体人IgG4 Fc结构域”与人IgG4的亲本Fc结构域进行比较，等。
如本文所用，“位置”意指蛋白质序列中的位置。位置可以依序编号，或根据已建立的形式进行编号，例如用于抗体结构域(例如，CH1、CH2、CH3或铰链结构域)的编号的EU索引。
如本文所用，“靶标抗原”意指由包含给定抗体的可变区的抗原结合结构域特异性地结合的分子。
在本文中，在本发明的异源二聚抗体的单体的背景下，“链状特性(strandedness)”意指类似于DNA的“相匹配”的两条链，将异源二聚化变体并入每个单体中以便保持“相匹配”以形成异源二聚体的能力。例如，如果一些pI变体被工程改造成单体A(例如，使pI更高)，则同样可作为“电荷对”利用的空间变体不会干扰pI变体，例如，使pI更高的电荷变体被放在同一个“链”或“单体”上以保持两种功能性。同样，对于如下文更全面地概述的以成对的组出现的“偏斜”变体，熟练技术人员将考虑pI来决定所述对中的一组将会进入哪条链或哪个单体中，使得也使用偏斜变体的pI来使pI分离最大化。
如本文所用，“靶标细胞”意指表达靶标抗原的细胞。
在本文中，在产生根据本发明的双特异性抗体的背景下，“宿主细胞”意指含有编码所述双特异性抗体的组分的外源核酸并且能够在合适条件下表达所述双特异性抗体的细胞。下文讨论了合适的宿主细胞。
本文中，“野生型”或“WT”意指在自然界中发现的氨基酸序列或核苷酸序列，包括等位变异。WT蛋白质具有未经有意修饰的氨基酸序列或核苷酸序列。
本文提供了多个与人抗体结构域具有序列同一性的抗体结构域(例如，Fc结构域)。两个相似序列(例如，抗体可变结构域)之间的序列同一性可通过算法来测量，诸如以下文献的算法：Smith, T.F.和Waterman, M.S. (1981) “Comparison Of Biosequences,”Adv. Appl. Math. 2:482 [局部同源性算法]；Needleman, S.B.和Wunsch, CD. (1970)“A General Method Applicable To The Search For Similarities In The Amino AcidSequence Of Two Proteins,” J. Mol. Biol. 48:443 [同源比对算法]；Pearson, W.R.和Lipman, D.J. (1988) “Improved Tools For Biological Sequence Comparison,”Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 [相似性搜索方法]；或Altschul, S.F.等人, (1990) “Basic Local Alignment Search Tool,” J. Mol. Biol. 215:403-10，即“BLAST”算法，参见https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。当使用前述算法中的任一种时，使用默认参数(关于窗口长度、空位罚分等)。在一个实施方案中，使用BLAST算法，使用默认参数来完成序列同一性
本发明的抗体通常是分离的或重组的。在用于描述本文所公开的各种多肽时，“分离的”意指已经从表达多肽的细胞或细胞培养物中鉴定并且分离和/或回收的多肽。通常，分离的多肽将通过至少一个纯化步骤来制备。“分离的抗体”是指大体上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。“重组”意指抗体使用重组核酸技术在外源宿主细胞中生成，并且它们也可被分离。
“特异性结合”特定抗原或表位或与其“特异性地结合”或对其“具特异性”意指与非特异性相互作用显著不同的结合。特异性结合可如下测量：例如，与对照分子的结合相比，确定一种分子的结合，所述对照分子通常是不具有结合活性的类似结构的分子。例如，特异性结合可通过与类似于靶标的对照分子竞争来确定。
对特定抗原或表位的特异性结合可例如由如下抗体展现，所述抗体对抗原或表位的KD是至少约10-4 M、至少约10-5 M、至少约10-6 M、至少约10-7 M、至少约10-8 M、至少约10-9M，或者至少约10-10 M、至少约10-11 M、至少约10-12 M或更大，其中KD是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。通常，特异性地结合抗原的抗体对对照分子的KD相对于所述抗原或表位将大20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍。
另外，对特定抗原或表位的特异性结合可例如由如下抗体展现，所述抗体对抗原或表位的KA或Ka是对所述表位相对于对照大至少20倍、50倍、100倍、500倍、1000倍、5,000倍、10,000倍或更多倍，其中KA或Ka是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率。结合亲和力通常使用Biacore、SPR或BLI测定来测量。
IV. 抗CD28 x抗TROP2抗体
一方面，本文提供了新颖抗CD28 x抗TROP2抗体。在一些实施方案中，本文所述的抗CD28 x抗TROP2抗体能够与T细胞上的CD28共刺激分子和肿瘤细胞上的TROP2激动性地结合。此类抗体选择性地增强TROP2相关肿瘤部位处的抗肿瘤活性，同时最小化外周毒性。本文所提供的主题抗体特别地可与其他抗癌疗法联合使用，所述其他抗癌疗法包括例如用于治疗TROP2相关癌症的双特异性抗体。
所述抗CD28 x抗TROP2抗体是多价的并且包括至少两个抗原结合结构域(ABD)，其中至少一个抗原结合结构域是CD28结合结构域并且至少一个抗原结合结构域是TROP2结合结构域。主题抗CD28 x抗TROP2抗体可包括任何合适的CD28结合结构域和TROP2结合结构域，包括例如本文所提供的CD28结合结构域和TROP2结合结构域。
本文所提供的抗原结合结构域通常包括具有VH-CDR1、VH-CDR-2和VH-CDR-3的可变重链结构域(VH)；以及具有VL-CDR1、VL-CDR-2和VL-CDR-3的可变轻链结构域(VL)。
另外，如上文所讨论，序列表和附图中使用的用于鉴定CDR的编号是Kabat，然而，可使用不同的编号，所述不同的编号将改变如表2所示的CDR的氨基酸序列。
对于本文所列出的所有可变重链和轻链结构域，可制备其他变体。如本文所概述，在一些实施方案中，一组6个CDR可具有0、1、2、3、4或5个氨基酸修饰(其中氨基酸取代特别有用)，以及可变重链和轻链结构域的框架区的变化，只要框架(CDR除外)与选自美国专利号7,657,380的图1所列出的那些的人种系序列保持至少约80、85、90、95或99%同一性，所述美国专利的附图和图例以引用的方式整体并入本文中。因此，例如，如本文所述的相同CDR可与来自人种系序列的不同框架序列组合，只要框架区与选自美国专利号7,657,380的图1所列出的那些的人种系序列保持至少80、85或90%同一性。或者，所述CDR可具有氨基酸修饰(例如，一组CDR中的1、2、3、4或5个氨基酸修饰(也就是说，所述CDR可进行修饰，只要一组6个CDR的总变化数目小于6个氨基酸修饰，其中CDR的任何组合均发生变化；例如，vlCDR1中可以有一个变化，vhCDR2中可以有两个变化，vhCDR3中没有变化，等))，以及具有框架区变化，只要框架区与选自美国专利号7,657,380的图1所列出的那些的人种系序列保持至少80、85、95至99%同一性。
本领域技术人员应理解，任一组6个CDR或VH和VL结构域均可呈scFv形式或呈Fab形式，所述形式接着被添加至重链恒定结构域和轻链恒定结构域中，其中重链恒定结构域包含变体(包括在CH1结构域以及Fc结构域内)。
另外，在主题抗体包括scFv的实施方案中，所述scFv从N端至C端可呈VH-scFv接头-VL或VL-scFv接头-VH取向。在一些形式中，一个或多个ABD通常是Fab，所述Fab在一条蛋白质链上包括VH结构域(通常作为重链的组分)并且在另一条蛋白质链上包括VL (通常作为轻链的组分)。图6描绘了用于主题抗体的示例性scFv接头。
在一些实施方案中，所述抗CD28 x抗TROP2抗体是双特异性抗体。在一些实施方案中，所述抗CD28 x抗TROP2抗体是二价抗体。在一些实施方案中，所述抗CD28 x抗TROP2抗体是三价抗体。在一些实施方案中，所述抗CD28 x抗TROP2抗体是双特异性二价抗体。在一些实施方案中，所述抗CD28 x抗TROP2抗体包括一个CD28结合结构域和一个TROP2结合结构域。在示例性实施方案中，所述抗CD28 x抗TROP2抗体是双特异性三价抗体。在一些实施方案中，所述抗CD28 x抗TROP2抗体包括一个CD28结合结构域和两个TROP2结合结构域。
本文所提供的抗CD28 x抗TROP2抗体可呈任何有用的形式，包括例如规范的免疫球蛋白，以及本文所述的“1 + 1 Fab-scFv-Fc”、“2 +1 “mAb-scFv”和“2 + 1 Fab2-scFv-Fc”形式(图15)。另外有用的形式包括但不限于：本文所提供的“mAb-Fv”、“中心Fv”、“单臂scFv-mAb”、“scFv-mAb”、“双scFv”和“三叉戟”形式(参见例如图15)。还参见US20180127501A1，其以引用的方式并入本文中，特别是涉及抗体形式的相关部分(参见例如图2)。在一些实施方案中，所述抗CD28 x抗TROP2抗体是包括具有本文所述的异源二聚化偏斜变体、pI变体和/或消融变体中的任一者的变体Fc结构域的异源二聚双特异性抗体。参见例如图8。
应注意，除非本文另有说明，否则以名称列出的抗原的顺序不赋予结构；也就是说，抗TROP2 x抗CD28 1 + 1 Fab-scFv-Fc抗体可具有与TROP2或CD28结合的scFv，不过在一些情况下，所述顺序指定了所指示的结构。
本文所提供的抗CD28 x抗TROP2抗体还包括不同的抗体结构域。如本文所述以及本领域中已知，本文所述的抗体包括重链和轻链内的不同结构域，所述结构域也可以是重叠的。这些结构域包括但不限于Fc结构域、CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域、铰链结构域、重链恒定结构域(CH1-铰链-Fc结构域或CH1-铰链-CH2-CH3)、可变重链结构域、可变轻链结构域、轻链恒定结构域、Fab结构域和scFv结构域。
如本文所示，存在多个可用于共价连接所列举的结构域(例如，scFv、Fab、Fc结构域、VH结构域、VL结构域等)的合适的接头(用作结构域接头或scFv接头)，包括通过重组技术生成的传统肽键。图7描绘了使主题抗体的结构域彼此连接的示例性接头。在一些实施方案中，接头肽可以主要包括以下氨基酸残基：Gly、Ser、Ala或Thr。接头肽的长度应足以连接两个分子，其方式使得它们相对于彼此呈现正确的构象，从而使它们保留所需活性。在一个实施方案中，所述接头是约1至50个氨基酸长，优选地是约1至30个氨基酸长。在一个实施方案中，可以使用1至20个氨基酸长的接头，其中约5至约10个氨基酸在一些实施方案中有用。有用的接头包括甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 750)、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 751)和(GGGS)n (SEQ ID NO: 752)，其中n是至少为1 (并且通常是3至4)的整数)、甘氨酸-丙氨酸聚合物、丙氨酸-丝氨酸聚合物和其他柔性接头。或者，多种非蛋白质聚合物可以用作接头，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇、聚氧亚烷基或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。
其他接头序列可以包括CL/CH1结构域的任何长度的任何序列，但不包括CL/CH1结构域的所有残基；例如，CL/CH1结构域的前5-12个氨基酸残基。接头可源自免疫球蛋白轻链，例如Cκ或Cλ。接头可源自任何同种型的免疫球蛋白重链，包括例如Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4、Cα1、Cα2、Cδ、Cε和Cμ。接头序列也可以源自其他蛋白质，诸如Ig样蛋白(例如，TCR、FcR、KIR)、铰链区源性序列以及来自其他蛋白质的其他天然序列。
在一些实施方案中，接头是“结构域接头”，用于将如本文所概述的任何两个结构域连接在一起。例如，在2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式中，可以存在将Fab的CH1结构域的C端连接至scFv的N端的结构域接头，其中另一个任选的结构域接头将scFv的C端连接至CH2结构域(不过在许多实施方案中，铰链用作这一结构域接头)。虽然可使用任何合适的接头，但许多实施方案利用甘氨酸-丝氨酸聚合物(包括例如(GS)n、(GSGGS)n (SEQ ID NO: 750)、(GGGGS)n (SEQ ID NO: 751)和(GGGS)n (SEQ ID NO: 752)，其中n是至少为1 (并且通常是3至4至5)的整数)作为结构域接头，以及允许两个结构域重组连接并具有足够长度和柔性以使得每个结构域保留其生物功能的任何肽序列。在一些情况下并且关注“链状特性”时，如下文所概述，可使用如在scFv接头的一些实施方案中使用的带电结构域接头。示例性的有用的结构域接头描绘于图7中。
在一些实施方案中，所述接头是用于共价连接如本文所讨论的VH和VL结构域的scFv接头。在许多情况下，所述scFv接头是带电scFv接头，其中多个在图6中示出。因此，本文提供了带电scFv接头，以促进第一单体与第二单体之间的pI分离。也就是说，通过并入带正电荷或负电荷(或在使用不同单体上的scFv的支架的情况下，两者皆有)的带电scFv接头，这允许包含带电接头的单体改变pI而不使Fc结构域发生进一步变化。这些带电接头可被取代至含有标准接头的任何scFv中。再次，本领域技术人员应理解，根据所需的pI变化，将带电scFv接头用在正确的“链”或单体上。例如，如本文所讨论，为了制备1 + 1 Fab-scFv-Fc形式的异源二聚抗体，计算每个所需抗原结合结构域的Fv区的原始pI，并选择一个来制备scFv，并且根据pI选择带正电荷或负电荷的接头。带电结构域接头也可用于增加本发明单体的pI分离，并且因此，图4中所包括的那些可用于本文中利用接头的任何实施方案中。
例如，图30和图31描绘了示例性的主题抗CD28 x抗TROP2抗体。在本文所提供的抗CD28 x抗TROP2抗体的细胞培养生产过程中，C端赖氨酸残基或C端赖氨酸和甘氨酸残基可从重链单体上裂解下来，从而产生具有C端“修剪”的变体。参见例如Jiang等人, Journalof Pharmaceutical Sciences 105:2066-2072 (2016)。因此，在本文所提供的一些实施方案中，所述抗CD28 x抗TROP2抗体是一种抗CD28 x抗TROP2抗体的变体，包括在本文所述的抗CD28 x抗TROP2抗体的一个或两个Fc结构域中缺失C端赖氨酸(-K)端或C端赖氨酸和甘氨酸(-GK)残基。在一些实施方案中，缺失是G446del和/或K447del (EU编号)。
下文更详细地描述了所述抗CD28 x抗TROP2抗体的各方面。
A. CD28结合结构域
本文所提供的抗CD28 x抗TROP2抗体包括至少一个CD28结合结构域。任何合适的CD28结合结构域均可包括在本文所提供的抗CD28 x抗TROP2抗体中。在示例性实施方案中，所述CD28结合结构域是激动性CD28 ABD，其有利地提供了T细胞共刺激活性。
本领域技术人员应理解，合适的CD28结合结构域可包含如附图所描绘的一组6个CDR (它们加下划线或在使用不同编号方案的情况下，如本文所述并如表2所示)，即在图16、图19和图22所描绘的那些CD28结合结构域的可变重链(VH)结构域和可变轻链结构域(VL)序列内使用其他比对所鉴定的CDR。图17、图18和图34描绘了可用于主题抗体的示例性CD28结合结构域的另外的VH和VL序列。合适的CD28 ABD也可包括如这些序列和附图所描绘的完整VH和VL序列，用作scFv或Fab。
在一个实施方案中，所述CD28抗原结合结构域包括本文所述的任何CD28结合结构域(包括但不限于图16、图19和图22所描绘的那些)的6个CDR (即，vhCDR1-3和vlCDR1-3)。在一些实施方案中，结合人CD28的CD28 ABD是以下CD28 ABD之一：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.1_L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1、9G2[CD28]_H0L0、9G2[CD28]_H1L1、2F10A3.140[CD28]_H1L1和TN228[CD28]_H4L2 (图16、图19和图22)。在一些实施方案中，所述CD28 ABD包括选自图16-19、图22和图34所描绘的VH和VL的VH/VL对。
除了附图和序列表中所公开的形成CD28 ABD的亲本CDR组以外，本文还提供了具有包括本文所公开的CD28 ABD CDR的至少一个修饰的CDR的变体CD28 ABD (例如，(图16、图19和图22，以及序列表)。在一个实施方案中，主题抗CD28 x抗TROP2抗体的CD28 ABD包括一组6个CDR，所述CDR与如本文(包括附图和序列表)所述的CD28 ABD的6个CDR相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸修饰。在示例性实施方案中，主题抗CD28 x抗TROP2抗体的CD28 ABD包括一组6个CDR，所述CDR与以下CD28 ABD之一的6个CDR相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸修饰：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.1_L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1、9G2[CD28]_H0L0、9G2[CD28]_H1L1、2F10A3.140[CD28]_H1L1和TN228[CD28]_H4L2 (图16、图19和图22)。在某些实施方案中，主题抗CD28 x抗TROP2抗体的CD28 ABD能够结合CD28抗原，如通过以下至少一者所测量：Biacore、表面等离子体共振(SPR)、流式细胞术和/或BLI (生物层干涉法，例如Octet测定)，其中后者在许多实施方案中特别有用。在特定实施方案中，所述CD28 ABD能够结合人CD28抗原(参见图1)。
在一些实施方案中，主题抗CD28 x抗TROP2抗体的CD28 ABD包括6个CDR，所述CDR与如本文(包括附图和序列表)所述的CD28 ABD的6个CDR至少90、95、97、98或99%相同。在示例性实施方案中，主题抗CD28 x抗TROP2抗体的CD28 ABD包括6个CDR，所述CDR与以下CD28ABD之一的6个CDR至少90、95、97、98或99%相同：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.1_L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1、9G2[CD28]_H0L0、9G2[CD28]_H1L1、2F10A3.140[CD28]_H1L1和TN228[CD28]_H4L2 (图16、图19和图22)。在某些实施方案中，所述CD28 ABD能够与CD28结合，如通过以下至少一者所测量：Biacore、表面等离子体共振(SPR)、流式细胞术和/或BLI (生物层干涉法，例如Octet测定)，其中后者在许多实施方案中特别有用。在特定实施方案中，所述CD28 ABD能够结合人CD28抗原(参见图1)。
在另一示例性实施方案中，主题抗CD28 x抗TROP2抗体的CD28 ABD包括本文(包括附图和序列表)所述的任一CD28 ABD的可变重链(VH)结构域和可变轻链(VL)结构域。在示例性实施方案中，所述CD28 ABD是以下CD28 ABD之一：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.1_L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1、9G2[CD28]_H0L0、9G2[CD28]_H1L1、2F10A3.140[CD28]_H1L1和TN228[CD28]_H4L2 (图16、图19和图22)。在一些实施方案中，所述CD28 ABD包括选自图16-19、图22和图34所描绘的VH和VL的VH和VL对。
在一些实施方案中，所述抗CD28 x抗TROP2抗体包括CD28 ABD，所述CD28 ABD包括可变重链结构域和/或可变轻链结构域，所述结构域是本文所公开的CD28 ABD VH和VL结构域的变体。在一个实施方案中，所述变体VH结构域和/或VL结构域与本文(包括附图和序列表)所述的CD28 ABD的VH和/或VL结构域相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化。在示例性实施方案中，所述变体VH结构域和/或VL结构域与以下CD28 ABD之一的VH和/或VL结构域相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.1_L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1、9G2[CD28]_H0L0、9G2[CD28]_H1L1、2F10A3.140[CD28]_H1L1和TN228[CD28]_H4L2 (图16、图19和图22)。在一些实施方案中，所述变化处于图16-19和图22所描绘的VH结构域中。在一些实施方案中，所述变化处于图16-19和图22所描绘的VL结构域中。在一些实施方案中，所述变化处于图16-19和图22所描绘的VH和VL结构域中。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸变化处于VH和/或VL框架区(FR1、FR2、FR3和/或FR4)中。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸变化处于一个或多个CDR中。在某些实施方案中，所述CD28 ABD能够与CD28结合，如通过以下至少一者所测量：Biacore、表面等离子体共振(SPR)、流式细胞术和/或BLI (生物层干涉法，例如Octet测定)，其中后者在许多实施方案中特别有用。在特定实施方案中，所述CD28ABD能够结合人CD28抗原(参见图1)。
在一个实施方案中，所述变体VH和/或VL结构域与如本文(包括附图和序列表)所述的CD28 ABD的VH和/或VL至少90、95、97、98或99%相同。在示例性实施方案中，所述变体VH和/或VL结构域与以下CD28 ABD之一的VH和/或VL至少90、95、97、98或99%相同：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.1_L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1、9G2[CD28]_H0L0、9G2[CD28]_H1L1、2F10A3.140[CD28]_H1L1和TN228[CD28]_H4L2 (图16、图19和图22)。在一些实施方案中，所述CD28 ABD包括与图16-19和图22所描绘的VH结构域至少90、95、97、98或99%相同的VH。在一些实施方案中，所述CD28 ABD包括与图16-19和图22所描绘的VL结构域至少90、95、97、98或99%相同的VL。在一些实施方案中，所述CD28 ABD包括与图16-19和图22所描绘的VH结构域和VL结构域至少90、95、97、98或99%相同的VH和VL。在某些实施方案中，所述CD28 ABD能够与CD28结合，如通过以下至少一者所测量：Biacore、表面等离子体共振(SPR)、流式细胞术和/或BLI (生物层干涉法，例如Octet测定)，其中后者在许多实施方案中特别有用。在特定实施方案中，CD28 ABD能够结合人CD28抗原(参见图1)。
在一些实施方案中，主题抗CD28 x抗TROP2抗体的CD28结合结构域包括VH，所述VH包括图20A所描绘的VHCDR1-3或HFR1-4序列中的任一者。在一些实施方案中，所述CD28结合结构域包括VL，所述VL包括图20B所描绘的VLCDR1-3或LFR1-4序列中的任一者。
在一些实施方案中，所述抗CD28 x抗TROP2抗体包括CD28结合结构域，所述结构域包括选自以下的VH和VL：
(i) VH，所述VH包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3，其分别具有图16、图19和图22所描绘的任何CD28结合结构域的VH或其变体的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的氨基酸序列；和(ii)VL，所述VL包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3，其分别具有图16、图19和图22所描绘的CD28结合结构域的VL或其变体的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的氨基酸序列；或
(i) VH，所述VH包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3，其分别具有图17所描绘的VH或其变体的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的氨基酸序列；和(ii) VL，所述VL包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3，其分别具有图18所描绘的VL或其变体的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗CD28 x抗TROP2抗体包括CD28结合结构域，所述结构域包括选自以下的VH和VL：
(i) VH，所述VH具有图16、图19和图22所描绘的任何CD28结合结构域的VH或其变体的氨基酸序列；和(ii) VL，所述VL具有图16、图19和图22所描绘的CD28结合结构域的VL或其变体的氨基酸序列；或
(i) VH，所述VH具有图17或图34所描绘的VH或其变体的氨基酸序列；和(ii) VL，所述VL具有图18所描绘的VL或其变体的氨基酸序列。
1. 另外的CD28结合结构域
在一些实施方案中，本文所提供的抗CD28 x抗TROP2抗体包括CD28结合结构域，所述结构域包括共同轻链，其中所述共同轻链也可以用作TROP2结合结构域的轻链。在一些实施方案中，抗CD28 x抗TROP2抗体包括此类CD28结合结构域，所述CD28结合结构域和TROP2结合结构域各自包括所述共同轻链。利用包括共同轻链的CD28结合结构域的示例性抗CD28x抗TROP2抗体形式包括本文所述的1+1共同轻链(CLC)和2+1共同轻链形式。
在一个实施方案中，所述CD28抗原结合结构域包括图34所描绘的任何CD28可变重链结构域的vhCDR1-3，和1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)的vlCDR1-3。
在一个实施方案中，主题抗CD28 x抗TROP2抗体的CD28 ABD包括a)与图34所描绘的一个CD28可变重链结构域的vhCDR1、vhCDR2和/或vhCDR3相比分别具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸修饰的vhCDR1、vhCDR2和/或vhCDR3，和/或b)与1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)的vlCDR1、vlCDR2和/或vlCDR3相比分别具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸修饰的vlCDR1、vlCDR2和/或vlCDR3。在某些实施方案中，主题抗CD28 x抗TROP2抗体的CD28 ABD能够结合CD28抗原，如通过以下至少一者所测量：Biacore、表面等离子体共振(SPR)、流式细胞术和/或BLI (生物层干涉法，例如Octet测定)，其中后者在许多实施方案中特别有用。在特定实施方案中，所述CD28 ABD能够结合人CD28抗原(参见图1)。
在一个实施方案中，主题抗CD28 x抗TROP2抗体的CD28 ABD包括分别与图34所描绘的一个CD28可变重链结构域的vhCDR1、vhCDR2和/或vhCDR3至少90、95、97、98或99%相同的vhCDR1、vhCDR2和/或vhCDR3，和/或分别与1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)的vlCDR1、vlCDR2和/或vlCDR3至少90、95、97、98或99%相同的vlCDR1、vlCDR2和/或vlCDR3。在某些实施方案中，所述CD28 ABD能够与CD28结合，如通过以下至少一者所测量：Biacore、表面等离子体共振(SPR)、流式细胞术和/或BLI (生物层干涉法，例如Octet测定)，其中后者在许多实施方案中特别有用。在特定实施方案中，所述CD28 ABD能够结合人CD28抗原(参见图1)。
在另一示例性实施方案中，主题抗CD28 x抗TROP2抗体的CD28 ABD包括图34所描绘的一个CD28可变重链结构域的可变重链(VH)结构域，和1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)。
在一些实施方案中，所述抗CD28 x抗TROP2抗体包括CD28 ABD，所述CD28 ABD包括可变重链结构域，所述可变重链结构域是图34所描绘的一个CD28可变重链结构域的变体，和/或可变轻链结构域，所述可变轻链结构域是1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)的变体。在一些实施方案中，所述变体VH结构域与图34所描绘的一个CD28可变重链结构域相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化，和/或所述可变轻链结构域与1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸变化处于VH和/或VL框架区(FR1、FR2、FR3和/或FR4)中。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸变化处于一个或多个CDR中。在某些实施方案中，所述CD28 ABD能够与CD28结合，如通过以下至少一者所测量：Biacore、表面等离子体共振(SPR)、流式细胞术和/或BLI (生物层干涉法，例如Octet测定)，其中后者在许多实施方案中特别有用。在特定实施方案中，所述CD28 ABD能够结合人CD28抗原(参见图1)。
在一个实施方案中，所述变体VH结构域与图34所描绘的一个CD28可变重链结构至少90、95、97、98或99%相同，和/或所述可变轻链结构域与1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)至少90、95、97、98或99%相同。在某些实施方案中，所述CD28 ABD能够与CD28结合，如通过以下至少一者所测量：Biacore、表面等离子体共振(SPR)、流式细胞术和/或BLI(生物层干涉法，例如Octet测定)，其中后者在许多实施方案中特别有用。在特定实施方案中，所述CD28 ABD能够结合人CD28抗原(参见图1)。
在一些实施方案中，主题抗CD28 x抗TROP2抗体的CD28结合结构域包括VH，所述VH包括图34C所描绘的VHCDR1-3或HFR1-4序列中的任一者。在一些实施方案中，所述CD28结合结构域包括1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)的VLCDR1-3或LFR1-4序列中的任一者。
B. TROP2结合结构域
本文所提供的抗CD28 x抗TROP2抗体包括至少一个TROP2结合结构域。包括此类TROP2抗原结合结构域的主题抗体(例如，抗TROP2 x抗CD3双特异性抗体)有利地靶向表达高水平的TROP2的细胞，而不是表达多种水平的TROP2的那些(例如，正常细胞)。
本领域技术人员应理解，合适的TROP2结合结构域可包含如序列表和图23-28所描绘的一组6个CDR (所述CDR加下划线或在使用不同编号方案的情况下，如本文所述并如表2所示)，即在图23-28以及序列表所描绘的那些的可变重链(VH)结构域和可变轻链结构域(VL)序列内使用其他比对所鉴定的CDR (参见表2)。合适的TROP2 ABD也可包括如这些序列和附图所描绘的完整VH和VL序列，用作scFv或Fab结构域。
在示例性实施方案中，所述抗CD28 x抗TROP2抗体的TROP2 ABD包括本文(包括附图和序列表)所述的任一TROP2 ABD的可变重链(VH)结构域和可变轻链(VL)结构域。在示例性实施方案中，TROP2 ABD是图23所描绘的TROP2 ABD。在示例性实施方案中，TROP2 ABD包含选自图23-28所描绘的那些的VH和VL对。
除了本文所公开的亲本TROP2可变重链结构域和可变轻链结构域以外，本文还提供了TROP2 ABD，所述TROP2 ABD包括可变重链结构域和/或可变轻链结构域，所述结构域是本文所公开的TROP2 ABD VH和VL结构域的变体。在一个实施方案中，所述变体VH结构域和/或VL结构域与本文(包括附图和序列表)所述的TROP2 ABD的VH和/或VL结构域相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化。在示例性实施方案中，所述变体VH结构域和/或VL结构域与图23所描绘的TROP2 ABD的VH和/或VL结构域相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化。在示例性实施方案中，所述变体VH结构域和/或VL结构域与图23-28所描绘的VH和/或VL结构域相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化。在一些实施方案中，所述变化处于图23-28所描绘的VH结构域中。在一些实施方案中，所述变化处于图23-28所描绘的VL结构域中。在一些实施方案中，所述变化处于图23-28所描绘的VH和VL结构域中。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸变化处于VH和/或VL框架区(FR1、FR2、FR3和/或FR4)中。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸变化处于vhCDR1-3和/或vlCDR1-3中的一者或多者中。在某些实施方案中，所述抗CD28 x抗TROP2抗体的TROP2 ABD能够与TROP2结合，如通过以下至少一者所测量：Biacore、表面等离子体共振(SPR)、流式细胞术和/或BLI (生物层干涉法，例如Octet测定)，其中后者在许多实施方案中特别有用。在特定实施方案中，所述TROP2 ABD能够结合人TROP2抗原(图2)。
在一个实施方案中，所述变体VH和/或VL结构域与如本文(包括附图和序列表)所述的TROP2 ABD的VH和/或VL至少90、95、97、98或99%相同。在示例性实施方案中，所述变体VH和/或VL结构域与图23所描绘的TROP2 ABD的VH和/或VL至少90、95、97、98或99%相同。在示例性实施方案中，所述变体VH和/或VL结构域与图23-28所描绘的VH和/或VL至少90、95、97、98或99%相同。在一些实施方案中，所述TROP2 ABD包括与图23-28所描绘的VH结构域至少90、95、97、98或99%相同的VH。在一些实施方案中，所述TROP2 ABD包括与图23-28所描绘的VL结构域至少90、95、97、98或99%相同的VL。在一些实施方案中，所述TROP2 ABD包括与图23-28所描绘的VH结构域和VL结构域至少90、95、97、98或99%相同的VH和VL。在某些实施方案中，所述抗CD28 x抗TROP2抗体的TROP2 ABD能够与TROP2结合，如通过以下至少一者所测量：Biacore、表面等离子体共振(SPR)、流式细胞术和/或BLI (生物层干涉法，例如Octet测定)，其中后者在许多实施方案中特别有用。在特定实施方案中，所述TROP2 ABD能够结合人TROP2抗原(图2)。
在一些实施方案中，所述抗CD28 x抗TROP2抗体是包括一个TROP2结合结构域的二价抗体(例如，1+1 Fab-scFv-Fc形式抗体)。在其他实施方案中，所述抗CD28 x抗TROP2抗体是包括两个TROP2结合结构域的三价抗体(例如，2+1 mAb-scFv和2+1 Fab2-scFv-Fc形式抗体)。
1. 另外的TROP2结合结构域
本文提供了包括共同可变轻链结构域的TROP2结合结构域组合物，其中所述共同可变轻链结构域也可有利地包括在本文所述的特定CD28和PDL1结合结构域中。在一些实施方案中，所述TROP2抗原结合结构域包括图36所描绘的一个TROP2可变重链结构域，以及1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A，本文中也称为“IGKV1-39”可变轻链结构域)。在一些实施方案中，所述TROP2抗原结合结构域包括图52-56所描绘的一个TROP2抗原结合结构域的可变重链结构域和可变轻链结构域或其变体。
在一些实施方案中，本文所提供的抗CD28 x抗TROP2抗体包括TROP2结合结构域，所述结构域包括共同轻链，其中所述共同轻链也可以用作CD28结合结构域的轻链。在一些实施方案中，抗CD28 x抗TROP2抗体包括此类TROP2结合结构域，所述CD28结合结构域和TROP2结合结构域各自包括所述共同轻链。利用包括共同轻链的TROP2结合结构域的示例性抗CD28 x抗TROP2抗体形式包括本文所述的1+1共同轻链(CLC)和2+1共同轻链形式。
在一个实施方案中，所述TROP2抗原结合结构域包括图36所描绘的任何TROP2可变重链结构域的vhCDR1-3，和1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)的vlCDR1-3。在一些实施方案中，所述TROP2抗原结合结构域包括图52-56所描绘的任一TROP2抗原结合结构域的vhCDR1-3和vlCDR1-3。
在一个实施方案中，主题抗CD28 x抗TROP2抗体的TROP2 ABD包括a)与图36和图52-56所描绘的一个TROP2可变重链结构域的vhCDR1、vhCDR2和/或vhCDR3相比分别具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸修饰的vhCDR1、vhCDR2和/或vhCDR3，和/或b)与1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A和图52-56)的vlCDR1、vlCDR2和/或vlCDR3相比分别具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个氨基酸修饰的vlCDR1、vlCDR2和/或vlCDR3。在某些实施方案中，主题抗CD28 x抗TROP2抗体的TROP2 ABD能够结合TROP2抗原，如通过以下至少一者所测量：Biacore、表面等离子体共振(SPR)、流式细胞术和/或BLI (生物层干涉法，例如Octet测定)，其中后者在许多实施方案中特别有用。在特定实施方案中，所述TROP2 ABD能够结合人TROP2抗原(参见图2)。
在一个实施方案中，主题抗CD28 x抗TROP2抗体的TROP2 ABD包括分别与图36和图52-56所描绘的一个TROP2可变重链结构域的vhCDR1、vhCDR2和/或vhCDR3至少90、95、97、98或99%相同的vhCDR1、vhCDR2和/或vhCDR3，和/或分别与1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A和图52-56)的vlCDR1、vlCDR2和/或vlCDR3至少90、95、97、98或99%相同的vlCDR1、vlCDR2和/或vlCDR3。在某些实施方案中，所述TROP2 ABD能够与TROP2抗原结合，如通过以下至少一者所测量：Biacore、表面等离子体共振(SPR)、流式细胞术和/或BLI (生物层干涉法，例如Octet测定)，其中后者在许多实施方案中特别有用。在特定实施方案中，所述TROP2 ABD能够结合人TROP2抗原(参见图2)。
在另一示例性实施方案中，主题抗CD28 x抗TROP2抗体的TROP2 ABD包括图36和图52-56所描绘的一个TROP2可变重链结构域的可变重链(VH)结构域，和1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A和图52-56)。
在一些实施方案中，所述抗CD28 x抗TROP2抗体包括TROP2 ABD，所述TROP2 ABD包括可变重链结构域，所述可变重链结构域是图36和图52-56所描绘的一个TROP2可变重链结构域的变体，和/或可变轻链结构域，所述可变轻链结构域是1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)的变体。在一些实施方案中，所述变体VH结构域与图36和图52-56所描绘的一个TROP2可变重链结构域相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化，和/或所述可变轻链结构域与1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A和图52-56)相比具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸变化。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸变化处于VH和/或VL框架区(FR1、FR2、FR3和/或FR4)中。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸变化处于一个或多个CDR中。在某些实施方案中，所述TROP2 ABD能够与TROP2结合，如通过以下至少一者所测量：Biacore、表面等离子体共振(SPR)、流式细胞术和/或BLI (生物层干涉法，例如Octet测定)，其中后者在许多实施方案中特别有用。在特定实施方案中，所述TROP2ABD能够结合人TROP2抗原(参见图2)。
在一个实施方案中，所述变体VH结构域与图36和图52-56所描绘的一个TROP2可变重链结构至少90、95、97、98或99%相同，和/或所述可变轻链结构域与1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A和图52-56)至少90、95、97、98或99%相同。在某些实施方案中，所述TROP2 ABD能够与TROP2结合，如通过以下至少一者所测量：Biacore、表面等离子体共振(SPR)、流式细胞术和/或BLI (生物层干涉法，例如Octet测定)，其中后者在许多实施方案中特别有用。在特定实施方案中，所述TROP2 ABD能够结合人TROP2抗原(参见图2)。
在一些实施方案中，主题抗CD28 x抗TROP2抗体的TROP2结合结构域包括VH，所述VH包括图36C所描绘的VHCDR1-3或HFR1-4序列中的任一者。在一些实施方案中，所述TROP2结合结构域包括1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)的VLCDR1-3或LFR1-4序列中的任一者。
C. 嵌合抗体和人源化抗体
在某些实施方案中，本文所提供的主题抗体包括来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。例如，此类抗体可以包含人抗体或由其组成，所述人抗体包含作为特定种系序列的“产物”或“源自”特定种系序列的重链或轻链可变区。因而，可通过将人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较并且选择与人抗体的序列在序列上最接近(即，最大同一性%)的人种系免疫球蛋白序列(使用本文所概述的方法)来鉴定作为人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“源自”人种系免疫球蛋白序列的人抗体。由于例如天然存在的体细胞突变或有意引入定点突变，作为特定人种系免疫球蛋白序列的“产物”或“源自”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体与种系序列相比可以含有氨基酸差异。然而，人源化抗体的氨基酸序列通常与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90%相同，并且在与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠科动物种系序列)进行比较时，所含的氨基酸残基将所述抗体鉴定为源自人序列。在某些情况下，人源化抗体的氨基酸序列可与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少95、96、97、98或99%，或甚至至少96%、97%、98%或99%相同。通常，源自特定人种系序列的人源化抗体将展现出与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比不超过10-20个氨基酸差异(在引入本文的任何偏斜变体、pI变体和消融变体之前；也就是说，在引入本发明的变体之前，变体数目通常较低)。在某些情况下，所述人源化抗体可展现出与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列相比不超过5个或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异(同样，在引入本文的任何偏斜变体、pI变体和消融变体之前；也就是说，在引入本发明的变体之前，变体数目通常较低)。
在一个实施方案中，已对亲本抗体进行亲和力成熟，如本领域中已知。可以采用基于结构的方法来进行人源化和亲和力成熟，例如，如USSN 11/004,590中所述。可以采用基于选择的方法对抗体可变区进行人源化和/或亲和力成熟，所述方法包括但不限于以下文献所述的方法：Wu等人, 1999, J. Mol. Biol. 294:151-162；Baca等人, 1997, J. Biol.Chem. 272(16):10678-10684；Rosok等人, 1996, J. Biol. Chem. 271(37): 22611-22618；Rader等人, 1998, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8910-8915；Krauss等人,2003, Protein Engineering 16(10):753-759，均以引用的方式整体并入。其他人源化方法可能涉及仅移植部分CDR，所述方法包括但不限于以下文献所述的方法：USSN 09/810,510；Tan等人, 2002, J. Immunol. 169:1119-1125；De Pascalis等人, 2002, J.Immunol. 169:3076-3084，均以引用的方式整体并入。
D. 异源二聚抗体
在示例性实施方案中，本文所提供的抗CD28 x抗TROP2抗体是包括两个变体Fc结构域序列的异源二聚双特异性抗体。此类变体Fc结构域包括氨基酸修饰以促进异源二聚抗体的自组装和/或纯化。
抗体技术中持续存在的一个问题是期望“双特异性”抗体同时与两种不同抗原结合，通常由此允许所述不同抗原接近，从而产生新功能和新疗法。通常，这些抗体是通过将每条重链和轻链的基因包括在宿主细胞中而产生的。这通常使得形成所需的异源二聚体(A-B)以及两个同源二聚体(A-A和B-B (不包括轻链异源二聚问题))。然而，形成双特异性抗体的主要障碍是难以偏向于形成所需的异源二聚抗体而非形成同源二聚体，和/或难以从同源二聚体中纯化出异源二聚抗体。
有多种机制可用于生成主题异源二聚抗体。另外，本领域技术人员应理解，可将这些不同的机制组合起来以确保高度异源二聚化。促进异源二聚体的产生和纯化的氨基酸修饰通常统称为“异源二聚化变体”。如下文所讨论，异源二聚化变体包括“偏斜”变体(例如，下文所述的“杵和臼”和“电荷对”变体)以及“pI变体”，这允许从同源二聚体中纯化出异源二聚体。如美国专利号US 9,605,084 (特此以引用的方式整体并入，并具体地针对下文对异源二聚化变体的讨论)总体上所述，有用的异源二聚化机制包括如美国专利号US 9,605,084所述的“杵和臼” (“KIH”)、如美国专利号US 9,605,084所述的“静电转向”或“电荷对”、如美国专利号US 9,605,084所述的pI变体以及如美国专利号US 9,605,084和下文所概述的一般的额外Fc变体。
下文更详细地讨论了可用于形成和纯化主题异源二聚抗体(例如，双特异性抗体)的异源二聚化变体。
1. 偏斜变体
在一些实施方案中，所述异源二聚抗体包括偏斜变体，所述偏斜变体是在第一Fc结构域(A)和/或第二Fc结构域(B)中的一个或多个氨基酸修饰，所述修饰有利于形成Fc异源二聚体(包括第一Fc结构域和第二Fc结构域的Fc二聚体；(A-B)，而非Fc同源二聚体(包括两个第一Fc结构域或两个第二Fc结构域的Fc二聚体；A-A或B-B)。合适的偏斜变体包括在美国公布申请号2016/0355608 (特此以引用的方式整体并入，并具体地针对其关于偏斜变体的公开内容)的图29，以及图3和图9中。
一种特定类型的偏斜变体在本领域中通常被称为“杵和臼”，是指产生空间影响以有利于异源二聚体形成而不利于同源二聚体形成的氨基酸工程改造，如以下文献所述：USSN 61/596,846；Ridgway等人, Protein Engineering 9(7):617 (1996)；Atwell等人,J. Mol. Biol. 1997 270:26；美国专利号8,216,805，均特此以引用的方式整体并入，并具体地针对“杵和臼”突变的公开内容。这在本文中有时被称为“空间变体”。附图标识出了多个依赖于“杵和臼”的“单体A -单体B”对。另外，如Merchant等人, Nature Biotech. 16:677 (1998)中所述，这些“杵和臼”突变可与二硫键组合以进一步有利于形成Fc异源二聚体。
另一种可用于生成异源二聚体的方法有时被称为“静电转向”，如Gunasekaran等人, J. Biol. Chem. 285(25):19637 (2010)中所述，所述文献特此以引用的方式整体并入。这在本文中有时被称为“电荷对”。在这一实施方案中，静电用于使形成朝着异源二聚化偏斜。本领域技术人员应理解，这些变体还可能影响pI并因此影响纯化，并且因此在一些情况下也可能被视为pI变体。然而，由于这些变体是为了迫使进行异源二聚化而生成的并且未被用作纯化工具，它们被归类为“偏斜变体”。这些变体包括但不限于与D221R/P228R/K409R配对的D221E/P228E/L368E (例如，这些变体是“单体对应组”)，和与C220R/E224R/P228R/K409R配对的C220E/P228E/368E。
在一些实施方案中，所述偏斜变体有利地并且同时地有利于基于“杵和臼”机制以及“静电转向”机制的异源二聚化。在一些实施方案中，异源二聚抗体包括一组或多组此类异源二聚化偏斜变体。这些变体以“成对”的“组”出现。也就是说，将一组所述对并入第一单体中并且将另一组所述对并入第二单体中。应注意，这些组未必表现为“杵臼”变体，其中在一个单体上的残基与另一单体上的残基之间存在一一对应。也就是说，这些成对的组反而可以在两个单体之间形成界面，所述界面促使异源二聚体形成而不促使同源二聚体形成，从而允许在生物条件下自发形成的异源二聚体的百分比超过90%，而非预期的50% (25%同源二聚体A/A:50%异源二聚体A/B:25%同源二聚体B/B)。图3和图9描绘了示例性的异源二聚化“倾斜”变体。此类“倾斜”变体包括但不限于：S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S: S364K；L368E/K370S : S364K；T411T/E360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q (EU编号)。
在示例性实施方案中，异源二聚抗体包括S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411T/E360E/Q362E : D401K；L368D/K370S :S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q；或T366S/L368A/Y407V : T366W (任选地包括桥接二硫键，T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C) “偏斜”变体氨基酸取代组(EU编号)。在一个示例性实施方案中，异源二聚抗体包括“S364K/E357Q : L368D/K370S”氨基酸取代组。就命名法来说，对“S364K/E357Q : L368D/K370S”意指一个单体包括包含氨基酸取代S364K和E357Q的Fc结构域，并且另一单体包括包含氨基酸取代L368D和K370S的Fc结构域；如上，这些对的“链状特性”取决于起始pI。
在一些实施方案中，本文所提供的偏斜变体可任选地并且独立地与任何其他修饰(包括但不限于其他偏斜变体(参见例如美国公布申请号2012/0149876的图37，以引用的方式并入本文中，特别是其关于偏斜变体的公开内容)、pI变体、同种型变体、FcRn变体、消融变体等)一起并入异源二聚抗体的第一和第二Fc结构域中的一者或两者中。此外，个别修饰也可独立地并且任选地包括在主题异源二聚抗体中或从主题异源二聚抗体中排除。
在一些实施方案中，本文所概述的偏斜变体可任选地并且独立地与任何pI变体(或其他变体，诸如Fc变体、FcRn变体等)一起并入一个或两个重链单体中，并且可独立地并且任选地包括在主题异源二聚抗体中或从主题异源二聚抗体中排除。
2. 纯化变体
在一些实施方案中，异源二聚抗体包括纯化变体，所述纯化变体有利地允许将异源二聚蛋白质(例如，抗CD28 x抗TROP2双特异性抗体)与同源二聚蛋白质分离。
有数种基本机制可使得容易地纯化异源二聚抗体。例如，对抗体重链单体A和B中的一者或两者进行修饰，使得每个单体具有不同的pI，从而允许从单体A-A和B-B蛋白质中等电纯化异源二聚A-B抗体。或者，一些支架形式允许基于大小进行分离，诸如“1 + 1 Fab-scFv-Fc”形式和“2 + 1 Fab2-scFv-Fc”形式。如上文所述，也有可能使用偏斜变体使异源二聚体的形成相对于同源二聚体发生“偏斜”。因此，异源二聚化偏斜变体和纯化变体的组合特别可用于本文所提供的异源二聚抗体中。
另外，如下文更全面地概述，根据异源二聚抗体的形式，可使用单体的恒定区和/或Fc结构域内所含的纯化变体，和/或结构域接头。在一些实施方案中，异源二聚抗体包括针对替代功能的额外修饰，所述修饰也可产生pI变化，诸如Fc、FcRn和KO变体。
在一些实施方案中，本文所提供的主题异源二聚抗体包括至少一个单体，所述单体具有一个或多个改变单体的pI的修饰(即，“pI变体”)。一般来说，本领域技术人员应理解，pI变体存在两种通用类别：增加蛋白质的pI的那些(碱性变化)和降低蛋白质的pI的那些(酸性变化)。如本文所述，可进行这些变体的所有组合：一个单体可以是野生型，或者是未展现出与野生型显著不同的pI的变体，并且另一单体可更具碱性或更具酸性。或者，使每个单体均发生变化，一个单体更具碱性并且一个单体更具酸性。
根据异源二聚体抗体的形式，pI变体可含于单体的恒定结构域和/或Fc结构域内，或者可使用带电接头(结构域接头或scFv接头)。也就是说，利用scFv的抗体形式(诸如“1 +1 Fab-scFv-Fc”形式)可包括带电scFv接头(带正电荷或负电荷)，所述接头为纯化目的给出了进一步pI提高。本领域技术人员应理解，一些1 + 1 Fab-scFv-Fc和2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式仅在与带电scFv接头一起时有用而无另外的pI调节，不过本发明还提供了在一个或两个单体上的pI变体和/或带电结构域接头。另外，针对替代功能的另外的氨基酸工程改造也可能赋予pI变化，诸如Fc、FcRn和KO变体。
在将pI用作分离机制以允许纯化异源二聚蛋白质的主题异源二聚抗体中，将氨基酸变体引入一个或两个单体多肽中。也就是说，可将一个单体(本文中为简便起见称为“单体A”)的pI工程改造成远离单体B，或者使单体A和B变化均发生变化，其中单体A的pI增加，而单体B的pI降低。如下文更全面地概述，任一个或两个单体的pI变化可通过以下方式进行：去除或添加带电残基(例如，用带正电荷或带负电荷的氨基酸残基置换中性氨基酸，例如甘氨酸变成谷氨酸)，使带电残基从带正电荷或带负电荷变成相反电荷(天冬氨酸变成赖氨酸)，或使带电残基变成中性残基(例如，失去电荷；赖氨酸变成丝氨酸)。图4示出了多种这些变体。
因此，在一些实施方案中，主题异源二聚抗体在恒定区中包括氨基酸修饰，所述修饰通过将氨基酸取代(“pI变体”或“pI取代”)并入一个或两个单体中来改变二聚蛋白质的至少一个(如果不是两个)单体的等电点(pI)以形成“pI抗体”)。如本文所示，如果两个单体的pI差别小至0.1 pH单位，则可实现异源二聚体与两种同源二聚体的分离，其中0.2、0.3、0.4和0.5或更高均可用于本发明。
本领域技术人员应理解，为获得良好的分离，每个单体或两个单体上打算包括的pI变体的数目将部分地取决于组分的起始pI，例如在1+1 Fab-scFv-Fc、2 + 1 Fab2-scFv-Fc、1 + 1 CLC和2 + 1 CLC形式中，取决于感兴趣的scFv (1+1 Fab-scFv-Fc、2 + 1 Fab2-scFv-Fc)和Fab的起始pI。也就是说，为了确定对哪个单体进行工程改造或朝哪个“方向”(例如，更具正电性或更具负电性)，计算两种靶标抗原的Fv序列并据此作出决定。如本领域中已知，不同的Fv将具有不同的起始pI，在本发明中对所述起始pI进行探究。一般来说，如本文所概述，对pI进行工程改造，使得每个单体的总pI差异达到至少约0.1 log，优选是0.2至0.5，如本文所概述。
在使用pI变体来实现异源二聚化的情况下，通过使用重链的恒定区，提供了用于设计和纯化双特异性蛋白质(包括抗体)的更加模块化的方法。因此，在一些实施方案中，异源二聚化变体(包括偏斜和pI异源二聚化变体)未包括在可变区中，使得必须对每个个别抗体进行工程改造。另外，在一些实施方案中，通过导入来自不同IgG同种型的pI变体以在不引入显著免疫原性的情况下使pI发生变化，显著地降低了pI变体导致免疫原性的可能性。因此，待解决的另一个问题是阐明具有高人序列含量的低pI恒定结构域，例如最小化或避免任何特定位置处的非人残基。或者或除了同种型取代以外，通过利用等排取代(例如，Asn变成Asp；以及Gln变成Glu)显著降低了pI变体导致免疫原性的可能性。
如下文所讨论，这种pI工程改造可能带来的附带益处还有血清半衰期延长以及FcRn结合增加。也就是说，如美国公布申请号US 2012/0028304 (以引用的方式整体并入)中所述，降低抗体恒定结构域(包括在抗体和Fc融合物中发现的那些)的pI可使得体内血清保留更久。这些pI变体增加血清半衰期，也有利于pI变化以实现纯化。
另外，应注意，所述pI变体为双特异性抗体的分析和质量控制过程提供了另外的益处，因为在同源二聚体存在时进行消除、最小化和区分的能力很重要。同样，可靠地测试异源二聚抗体产生的再现性的能力也很重要。
一般来说，特别用途的实施方案依赖于变体组，所述变体组包括促使异源二聚化形成而非同源二聚化形成的偏斜变体，加上增加两个单体之间的pI差异以促进从同源二聚体中纯化出异源二聚体的pI变体。
pI变体的示例性组合在图3和图4以及美国公布申请号2016/0355608的图30中示出，均以引用的方式整体并入本文中，并具体地针对关于pI变体的公开内容。图3和图4示出了pI变体的优选组合。如本文所概述并且如附图所示，这些变化是相对于IgG1示出的，但所有同种型以及同种型杂合体均可按这种方式改变。在重链恒定结构域来自IgG2-4的情况下，还可使用R133E和R133Q。
在一个实施方案中，pI变体的优选组合具有一个包含208D/295E/384D/418E/421D变体(在相对于人IgG1时是N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D)的单体(负电性Fab侧)和包含带正电荷的scFv接头(包括(GKPGS)4 (SEQ ID NO:24))的第二单体(正电性scFv侧)。然而，本领域技术人员应理解，第一单体包括CH1结构域，包括位置208。因此，在不包括CH1结构域的构建体中(例如对于在一个结构域上不利用CH1结构域的抗体)，优选的负电性pI变体Fc组包括295E/384D/418E/421D变体(在相对于人IgG1时是Q295E/N384D/Q418E/N421D)。
因此，在一些实施方案中，一个单体具有图8中的一组取代并且另一单体具有带电接头(呈带电scFv接头的形式，因为所述单体包含scFv，或呈如形式所指示的带电结构域接头的形式，所述带电结构域接头可选自图6所描绘的那些)。
在一些实施方案中，在Fc结构域的铰链中进行修饰，包括基于EU编号的位置216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229和230。因此，可在位置216-230中的一者或多者中进行pI突变并且特别是取代，其中1、2、3、4或5个突变是有用的。同样，考虑了所有可能的组合(单独，或与其他结构域中的其他pI变体一起)。
可用于降低铰链结构域的pI的特定取代包括但不限于位置221处的缺失、位置222处的非天然缬氨酸或苏氨酸、位置223处的缺失、位置224处的非天然谷氨酸、位置225处的缺失、位置235处的缺失以及位置236处的缺失或非天然丙氨酸。在一些情况下，仅在铰链结构域中进行pI取代，而在其他情况下，这些取代以任何组合添加至其他结构域中的其他pI变体中。
在一些实施方案中，可在CH2区中进行突变，包括基于EU编号的位置233、234、235、236、274、296、300、309、320、322、326、327、334和339。应注意，可使233-236发生变化以增加IgG2骨架中的效应功能(连同327A)。同样，可进行这14个位置的所有可能的组合；例如，本文所提供的抗体可以包括具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个CH2 pI取代的变体Fc结构域。
可用于降低CH2结构域的pI的特定取代包括但不限于位置274处的非天然谷氨酰胺或谷氨酸、位置296处的非天然苯丙氨酸、位置300处的非天然苯丙氨酸、位置309处的非天然缬氨酸、位置320处的非天然谷氨酸、位置322处的非天然谷氨酸、位置326处的非天然谷氨酸、位置327处的非天然甘氨酸、位置334处的非天然谷氨酸、位置339处的非天然苏氨酸以及CH2内和与其他结构域的所有可能的组合。
在这一实施方案中，所述修饰可独立地并且任选地选自CH3区的位置355、359、362、384、389、392、397、418、419、444和447 (EU编号)。可用于降低CH3结构域的pI的特定取代包括但不限于位置355处的非天然谷氨酰胺或谷氨酸、位置384处的非天然丝氨酸、位置392处的非天然天冬酰胺或谷氨酸、位置397处的非天然甲硫氨酸、位置419处的非天然谷氨酸、位置359处的非天然谷氨酸、位置362处的非天然谷氨酸、位置389处的非天然谷氨酸、位置418处的非天然谷氨酸、位置444处的非天然谷氨酸以及位置447处的缺失或非天然天冬氨酸。
在一些实施方案中，所述抗CD28 x抗TROP2抗体在一个其Fc结构域中包括氨基酸取代，所述取代降低了与蛋白A的结合。此类纯化变体产生了与蛋白A具有不对称结合的异源二聚体，进而可用于通过pH梯度将异源二聚体群体与同源二聚体群体分离。减少与蛋白A的结合的示例性的纯化氨基酸取代包括但不限于H435R和Y436F (IgG1 CH3结构域，EU编号)。参见例如US2010331527，其以引用的方式整体并入，并具体地针对关于Fc结构域修饰以减少蛋白A结合的相关公开内容。
3. 同种型变体
另外，主题异源二聚抗体的许多实施方案依赖于将来自一种IgG同种型的特定位置处的pI氨基酸“导入”另一IgG同种型中，从而降低或消除将不想要的免疫原性引入变体中的可能性。美国公布2014/0370013的图21示出了多种这些变体，所述美国公布特此以引用的方式并入。也就是说，出于多种原因(包括高效应功能)，IgG1是治疗抗体的常见同种型。然而，IgG1的重链恒定区具有比IgG2的重链恒定区高的pI (8.10相对于7.31)。通过将特定位置处的IgG2残基引入IgG1骨架中，使得所得单体的pI降低(或增加)并且另外表现出较长的血清半衰期。例如，在位置137处IgG1具有甘氨酸(pI 5.97)，而IgG2具有谷氨酸(pI3.22)；导入谷氨酸将影响所得蛋白质的pI。如下文所述，通常需要多个氨基酸取代来显著影响所述变体抗体的pI。然而，应注意，如下文所讨论，即便是IgG2分子发生变化也允许血清半衰期增加。
在其他实施方案中，进行非同种型氨基酸变化，以降低所得蛋白质的总电荷状态(例如，通过将较高pI的氨基酸变成较低pI的氨基酸)，或允许在结构上进行调节以实现稳定性等，如下文进一步描述。
另外，通过对重链和轻链恒定结构域进行pI工程改造，可见异源二聚体的每个单体的显著变化。如本文所讨论，使两个单体的pI相差至少0.5可允许通过离子交换色谱法或等电聚焦或其他对等电点敏感的方法进行分离。
4. 计算pI
本文所提供的抗体的每个单体的pI可取决于变体重链恒定结构域的pI和总单体的pI，所述总单体包括变体重链恒定结构域和融合搭配物。因此，在一些实施方案中，使用美国公布2014/0370013的图19中的图表，基于变体重链恒定结构域计算pI变化。如本文所讨论，对哪个单体进行工程改造通常由Fv和支架区的固有pI来决定。或者，可比较每个单体的pI。
5. 还赋予更好的FcRn体内结合的pI变体
在pI变体降低单体的pI的情况下，所述pI变体可具有改进体内血清保留的附加益处。
尽管仍在研究中，Fc区被认为在体内具有较长的半衰期，因为在内体中在pH 6下与FcRn的结合隔绝了Fc (Ghetie和Ward, 1997 Immunol Today. 18(12): 592-598，以引用的方式整体并入)。内体区室接着使Fc再循环至细胞表面。一旦所述区室向细胞外空间开放，较高的pH (约7.4)诱导将Fc释放回血液中。在小鼠中，Dall’ Acqua等人表明，在pH 6和pH 7.4下具有增加的FcRn结合的Fc突变体实际上具有降低的血清浓度以及与野生型Fc相同的半衰期(Dall’ Acqua等人2002, J. Immunol. 169:5171-5180，以引用的方式整体并入)。在pH 7.4下Fc对FcRn的亲和力增加被认为阻止了Fc释放回血液中。因此，将增加Fc的体内半衰期的Fc突变将理想地增加较低pH下的FcRn结合，同时仍允许在较高pH下释放Fc。在6.0至7.4的pH范围内，氨基酸组氨酸使其电荷状态发生了变化。因此，在Fc/FcRn复合物中的重要位置处发现His残基不足为奇。
最近，已经提出，包含具有较低等电点的可变区的抗体还可以具有较长的血清半衰期(Igawa等人, 2010 PEDS. 23(5): 385-392，以引用的方式整体并入)。然而，对其机制仍知之甚少。此外，可变区因抗体而有所不同。如本文所述，具有降低的pI和延长的半衰期的恒定区变体将提供更加模块化的方法来改进抗体的药代动力学特性。
E. 用于另外的功能的另外的Fc变体
除了上文所讨论的异源二聚化变体以外，还有多种有用的Fc氨基酸修饰，所述修饰可出于各种原因而进行，包括但不限于改变与一种或多种FcγR受体的结合、改变与FcRn受体的结合等，如下文所讨论。
因此，本文所提供的抗体(异源二聚抗体以及同二聚抗体)可包括此类氨基酸修饰，具有或不具有本文所概述的异源二聚化变体(例如，pI变体和空间变体)。每组变体可独立地并且任选地包括在任何特定的异源二聚蛋白质中或从任何特定的异源二聚蛋白质中排除。
1. FcγR和FcRn变体
因此，可进行多种有用的Fc取代，以改变与一种或多种FcγR受体的结合。在某些实施方案中，主题抗体包括改变与一种或多种FcγR受体的结合的修饰(即，“FcγR变体”)。导致增加的结合以及减少的结合的取代可以是有用的。例如，已知增加与FcγRIIIa的结合通常导致增加的ADCC (抗体依赖性细胞介导的细胞毒性；细胞介导的反应，其中表达FcγR的非特异性毒性细胞识别靶标细胞上的结合抗体并且随后引起靶标细胞的溶解)。同样，在一些情况下，减少与FcγRIIb (一种抑制受体)的结合也可能是有益的。可用于主题抗体中的氨基酸取代包括美国专利号8,188,321 (特别是图41)和8,084,582以及美国公布申请号20060235208和20070148170中列出的那些，所述申请均明确地以引用的方式整体并入本文中，并具体地针对其中所公开的影响Fcγ受体结合的变体。可用的特定变体包括但不限于236A、239D、239E、332E、332D、239D/332E、267D、267E、328F、267E/328F、236A/332E、239D/332E/330Y、239D、332E/330L、243A、243L、264A、264V和299T。此类修饰可以包括在主题抗体的一个或两个Fc结构域中。
在一些实施方案中，主题抗体包括一个或多个增加血清半衰期的Fc修饰。如USSN12/341,769 (特此以引用的方式整体并入)中具体公开的可用于增加与FcRn受体的结合并增加血清半衰期的Fc取代包括但不限于434S、434A、428L、308F、259I、428L/434S、259I/308F、436I/428L、436I或V/434S、436V/428L、259I/308F/428L以及M252Y/S254T/T256E。此类修饰可以包括在主题抗体的一个或两个Fc结构域中。
2. 消融变体
在一些实施方案中，异源二聚抗体包括一个或多个修饰，所述修饰降低或去除Fc结构域与一种或多种或所有Fcγ受体(例如，FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)的正常结合以避免另外的作用机制。此类修饰被称为“FcγR消融变体”或“Fc敲除(FcKO或KO)”变体。在这些实施方案中，对于一些治疗应用，期望降低或去除Fc结构域与一种或多种或所有Fcγ受体(例如，FcγR1、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa等)的正常结合以避免另外的作用机制。也就是说，例如，在许多实施方案中，特别是在使用单价地结合CD28的双特异性抗体时，通常期望消融FcγRIIIa结合以消除或显著降低ADCC活性。在一些实施方案中，在本文所述的主题抗体中，至少一个Fc结构域包含一个或多个Fcγ受体消融变体。在一些实施方案中，在本文所述的主题抗体中，两个Fc结构域均包含一个或多个Fcγ受体消融变体。图5描绘了这些消融变体，并且每个消融变体可独立地并且任选地包括在内或从中排除，其中优选的方面利用了选自由以下组成的组的消融变体：L234A/L235A/D265S、G236R/L328R、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K、E233P/L234V/L235A/G236del/S239K/A327G、E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/A327G和E233P/L234V/L235A/G236del。应注意，本文所提及的消融变体消融FcγR结合，但通常不消融FcRn结合。
如本领域中已知，人IgG1的Fc结构域具有与Fcγ受体的最高结合，并且因此，在异源二聚抗体的骨架中的恒定结构域(或Fc结构域)是IgG1时，可使用消融变体。或者或除了IgG1背景下的消融变体以外，糖基化位置297处的突变(通常突变成A或S)可显著消融与例如FcγRIIIa的结合。人IgG2和IgG4具有天然降低的与Fcγ受体的结合，并且因此那些骨架可在具有或不具有消融变体的情况下使用。
F. 异源二聚变体和Fc变体的组合
本领域技术人员应理解，所有所列举的异源二聚化变体(包括偏斜和/或pI变体)均可任选地并且独立地以任何方式组合，只要它们保留其“链状特性”或“单体分配”。另外，所有这些变体可组合成任何异源二聚化形式。
就pI变体来说，虽然附图示出了特别有用的实施方案，但可遵循改变两个单体之间的pI差异以促进纯化的基本规则，生成其他组合。
另外，任何异源二聚化变体(偏斜变体和pI变体)也独立地并且任选地与Fc消融变体、Fc变体、FcRn变体组合，如本文总体上所概述。
图8包括异源二聚1+1 Fab-scFv-Fc、2 + 1 mAb-Fc和2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式抗体的一些实施方案中所包括的变体的示例性组合。在一些实施方案中，异源二聚抗体包括如图8所描绘的变体的组合。
G. 有用的抗体形式
本领域技术人员应理解并如下文更全面地讨论，本文所提供的异源二聚双特异性抗体可采取几种不同的配置，如图15总体上所描绘。
本领域技术人员应理解，本发明的异源二聚形式可具有不同的价态，以及可以是双特异性的。也就是说，本发明的异源二聚抗体可以是二价和双特异性的，或三价和双特异性的，其中第一抗原由两个结合结构域结合，并且第二抗原由第二结合结构域结合。如本文所概述，当CD28是靶标抗原之一时，优选CD28仅单价地进行结合。
本发明利用CD28结合结构域与TROP2结合结构域的组合。本领域技术人员应理解，可使用如任一附图(特别地，参见图16-19和图22)所描绘的抗CD28 CDR、抗CD28可变轻链结构域和可变重链结构域、Fab和scFv或其变体的任何集合。同样，可使用任何TROP2抗原结合结构域，无论是如任一附图(例如图23-28)所描绘的CDR、可变轻链结构域和可变重链结构域、Fab和scFv抑或其变体，任选地并且独立地以任何组合进行组合。
1. 1 + 1 CLC形式
可特别用于本文所提供的主题抗CD28 x抗TROP2抗体中的一种异源二聚抗体形式是“1 + 1共同轻链”或“1 + 1 CLC”形式，所述形式在图15C中描绘出。所述1 + 1 CLC形式抗体包括第一单体，所述第一单体包括VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH1是第一可变重链结构域并且CH2-CH3是第一Fc结构域；第二单体，所述第二单体包括VH2-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH2是第二可变重链结构域并且CH2-C3是第二Fc结构域；以及第三单体“共同轻链”，所述共同轻链包含VL-CL，其中VL是共同可变轻链结构域并且CL是恒定轻链结构域。在一些实施方案中，所述1+1 CLC包括两条相同的共同轻链。在此类实施方案中，一条共同轻链的VL与VH1配对以形成具有第一抗原结合特异性(即，CD28或TROP2)的第一结合结构域；并且另一条共同轻链的VL与VH2配对以形成具有第二抗原结合特异性(即，CD28或TROP2)的第二结合结构域。在一些实施方案中，所述1 + 1 CLC形式抗体是二价抗体。
在一些实施方案中，所述1 + 1 CLC形式的第一和第二Fc结构域是包括异源二聚化偏斜变体(例如，如图3和图9所示的一组氨基酸取代)的变体Fc结构域。特别有用的异源二聚化偏斜变体包括S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S :S364K；T411T/E360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V : T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C (EU编号)。在示例性实施方案中，第一或第二变体Fc结构域中的一者包括异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第一或第二变体Fc结构域中的另一者包括异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号。在示例性实施方案中，第一变体Fc结构域包括异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，所述变体Fc结构域包括消融变体(包括图5所示的那些)。在一些实施方案中，第一和第二变体Fc结构域中的每一者均包括消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，第一或第二单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包括pI变体(包括图4所示的那些)。在示例性实施方案中，第一或第二单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，本文所提供的1 + 1 CLC形式抗体包括FcRn变体M428L/N434S，其中编号是根据EU编号。
在示例性实施方案中，第一变体Fc结构域包括异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q，并且第二变体Fc结构域包括异源二聚化偏斜变体L368D/K370S；第一和第二变体Fc结构域中的每一者均包括消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K；并且第二单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且第一Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，本文所提供的1 + 1 CLC形式抗体还包括FcRn变体M428L/N434S，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，第一结合结构域或第二结合结构域中的一者结合CD28，并且另一结合结构域结合TROP2。主题1 + 1 CLC形式抗体可包括任何合适的CD28结合结构域和TROP2结构域，包括本文所提供的任何CD28结合结构域和TROP2结合结构域或其变体。
在一些实施方案中，所述CD28结合结构域包括图34所描绘的一个CD28可变重链结构域的vhCDR1-3，和1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)的vlCDR1-3。在一些实施方案中，所述CD28结合结构域包括以下CD28可变重链结构域之一的vhCDR1-3：1A7[CD28]_H1.129和1A7[CD28]_H1.106 (图34)，和1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)的vlCDR1-3。在另一示例性实施方案中，主题抗CD28 x抗TROP2抗体的CD28 ABD包括图34所描绘的一个CD28可变重链结构域的可变重链(VH)结构域或其变体，和1F11-1A3.315L1可变轻链结构域(参见图36A)或其变体。在一些实施方案中，所述CD28结合结构域包括以下CD28可变重链结构域之一的可变重链结构域：1A7[CD28]_H1.129和1A7[CD28]_H1.106(图34)或其变体，和1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)或其变体。
在一些实施方案中，所述TROP2结合结构域包括图36和图52-56所描绘的一个TROP2可变重链结构域的vhCDR1-3，和1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)的vlCDR1-3。在一些实施方案中，所述TROP2结合结构域包括以下TROP2可变重链结构域之一的vhCDR1-3：1F11-1A3.315[Trop2]_H1、1F11-1A3.315[Trop2]_H1.10、1F11-1A3.315[Trop2]_H1.19、2C5A3.316[TROP2]_H1、1A3A4.312[TROP2]_H1、1B2A4.312[TROP2]_H1、1B11A3.316[TROP2]_H1和1C9A4.313[TROP2]_H1 (图36和图52-56)，和1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)的vlCDR1-3。在另一示例性实施方案中，主题抗CD28 x抗TROP2抗体的TROP2结合结构域包括图36所描绘的一个TROP2可变重链结构域的可变重链(VH)结构域或其变体，和1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)或其变体。在一些实施方案中，所述TROP2结合结构域包括以下TROP2可变重链结构域之一的可变重链结构域：1F11-1A3.315[Trop2]_H1、1F11-1A3.315[Trop2]_H1.10、1F11-1A3.315[Trop2]_H1.19、2C5A3.316[TROP2]_H1、1A3A4.312[TROP2]_H1、1B2A4.312[TROP2]_H1、1B11A3.316[TROP2]_H1和1C9A4.313[TROP2]_H1 (图36和图52-56)或其变体，和1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)或其变体。
图38描绘了呈1+1 CLC形式的示例性的主题抗CD28 x抗TROP2抗体。
2. 2 + 1 CLC形式
可特别用于本文所提供的主题CD28 x抗TROP2抗体中的另一异源二聚抗体形式是“2 + 1共同轻链”或“2 + 1 CLC”形式，所述形式在图15D中描绘出。所述2 + 1 CLC形式包括第一单体，所述第一单体包括VH1-CH1-接头-VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH1各自是第一可变重链结构域并且CH2-CH3是第一Fc结构域；第二单体，所述第二单体包括VH2-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH2是第二可变重链结构域并且CH2-CH3是第二Fc结构域；以及第三单体，所述第三单体包括“共同轻链” VL-CL，其中VL是共同可变轻链结构域并且CL是恒定轻链结构域。在一些实施方案中，所述2+1 CLC形式包括三个相同的共同轻链(即，第一、第二以及第三共同轻链)。在此类实施方案中，第一和第二共同轻链的VL各自与第一单体的一个VH1配对以形成两个第一结合结构域，所述结构域各自具有第一抗原结合特异性；并且第三共同轻链的VL与VH2配对以形成具有第二抗原结合特异性的第二结合结构域。第一单体的接头可以是任何合适的接头，包括图7所描述的任一结构域接头或它们的组合。在一些实施方案中，所述2 + 1 CLC形式抗体是三价抗体。
在一些实施方案中，所述2 + 1 CLC形式的第一和第二Fc结构域是包括异源二聚化偏斜变体(例如，如图3和图9所示的一组氨基酸取代)的变体Fc结构域。特别有用的异源二聚化偏斜变体包括S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S :S364K；T411T/E360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V : T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C (EU编号))。在示例性实施方案中，第一或第二变体Fc结构域中的一者包括异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第一或第二变体Fc结构域中的另一者包括异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号。在示例性实施方案中，第一变体Fc结构域包括异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，所述变体Fc结构域包括消融变体(包括图5所示的那些)。在一些实施方案中，第一和第二变体Fc结构域中的每一者均包括消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，第一或第二单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包括pI变体(包括图4所示的那些)。在示例性实施方案中，第一或第二单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，本文所提供的2 + 1 CLC形式抗体还包括FcRn变体M428L/N434S，其中编号是根据EU编号。
在示例性实施方案中，第一变体Fc结构域包括异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q；第一和第二变体Fc结构域中的每一者均包括消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K；并且第一单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号。在一些实施方案中，本文所提供的2 + 1 CLC形式抗体还包括FcRn变体M428L/N434S，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且第一Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，所述两个第一结合结构域中的每一者均结合肿瘤TROP2，并且所述第二结合结构域结合CD28。主题2 + 1 CLC形式抗体可包括任何合适的CD28结合结构域和TROP2结构域，包括本文所提供的任何CD28结合结构域和TROP2结合结构域或其变体。
在一些实施方案中，所述CD28结合结构域包括图34所描绘的一个CD28可变重链结构域的vhCDR1-3，和1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)的vlCDR1-3。在一些实施方案中，所述CD28结合结构域包括以下CD28可变重链结构域之一的vhCDR1-3：1A7[CD28]_H1.129和1A7[CD28]_H1.106 (图34)，和1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)的vlCDR1-3。在另一示例性实施方案中，主题抗CD28 x抗TROP2抗体的CD28 ABD包括图34所描绘的一个CD28可变重链结构域的可变重链(VH)结构域或其变体，和1F11-1A3.315L1可变轻链结构域(参见图36A)或其变体。在一些实施方案中，所述CD28结合结构域包括以下CD28可变重链结构域之一的可变重链结构域：1A7[CD28]_H1.129和1A7[CD28]_H1.106(图34)或其变体，和1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)或其变体。
在一些实施方案中，所述TROP2结合结构域包括图36和图52-56所描绘的一个TROP2可变重链结构域的vhCDR1-3，和1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)的vlCDR1-3。在一些实施方案中，所述TROP2结合结构域各自包括以下TROP2可变重链结构域之一的vhCDR1-3：1F11-1A3.315[Trop2]_H1和1F11-1A3.315[Trop2]_H1.19、2C5A3.316[TROP2]_H1、1A3A4.312[TROP2]_H1、1B2A4.312[TROP2]_H1、1B11A3.316[TROP2]_H1和1C9A4.313[TROP2]_H1 (图36和图52-56)，和1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)的vlCDR1-3。在另一示例性实施方案中，主题抗CD28 x抗TROP2抗体的TROP2结合结构域各自包括图36和图52-56所描绘的一个TROP2可变重链结构域的可变重链(VH)结构域或其变体，和1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)或其变体。在一些实施方案中，所述TROP2结合结构域各自包括以下TROP2可变重链结构域之一的可变重链结构域：1F11-1A3.315[Trop2]_H1和1F11-1A3.315[Trop2]_H1.19、2C5A3.316[TROP2]_H1、1A3A4.312[TROP2]_H1、1B2A4.312[TROP2]_H1、1B11A3.316[TROP2]_H1和1C9A4.313[TROP2]_H1 (图36和图52-56)或其变体，和1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)或其变体。
图39描绘了呈2+1 CLC形式的示例性的主题抗CD28 x抗TROP2抗体。
3. 1 + 1 Fab-scFv-Fc形式
可特别用于本文所提供的主题抗CD28 x抗TROP2抗体中的一种异源二聚抗体形式是“1 + 1 Fab-scFv-Fc”或“开瓶器”形式，如图15A所示。所述1 + 1 Fab-scFv-Fc形式抗体包括第一单体，所述第一单体是“常规”重链(VH1-CH1-铰链-CH2-CH3)，其中VH1是第一可变重链结构域并且CH2-CH3是第一Fc结构域。所述1 + 1 Fab-scFv-Fc还包括轻链，所述轻链包括第一可变轻链结构域VL1和恒定轻链结构域CL。所述轻链与所述第一单体的VH1-CH1相互作用以形成第一抗原结合结构域，即Fab。所述抗体的第二单体包括第二结合结构域和第二Fc结构域，所述第二结合结构域是单链Fv (“scFv”，如下文所定义)。所述scFv包括第二可变重链结构域(VH2)和第二可变轻链结构域(VL2)，其中VH2使用可能带电的scFv接头连接至VL2 (参见例如图6)。所述scFv使用结构域接头连接至重链(参见例如图7)。通过在恒定区(例如，Fc结构域、CH1结构域和/或铰链区)中使用促进异源二聚抗体形成的氨基酸变体(例如，上文所讨论的异源二聚化变体)使两个单体结合在一起，如下文更全面地描述。由于与开瓶器具有粗略的视觉相似性，这种结构在本文中有时被称为“开瓶器”形式。在一些实施方案中，所述1 + 1 Fab-scFv-Fc形式抗体是二价抗体。
本发明的“1 + 1 Fab-scFv-Fc”形式具有几种独特优势。如本领域中已知，依赖于两个scFv构建体的抗体类似物常常具有稳定性和聚集问题，所述问题在本发明中可通过添加“常规”重链和轻链配对来缓解。另外，与依赖于两条重链和两条轻链的形式相反，不存在重链和轻链错误配对(例如重链1与轻链2配对，等)的问题。
在所述1 + 1 Fab-scFv-Fc形式抗体的一些实施方案中，第一或第二抗原结合结构域中的一者是CD28结合结构域并且另一结合结构域是TROP2结合结构域。在所述1 + 1Fab-scFv-Fc的一些实施方案中，scFv与CD28结合并且Fab结合TROP2。图30描绘了呈1 + 1Fab-scFv-Fc形式的示例性抗CD28 x抗TROP2双特异性抗体。
在一些实施方案中，所述1 + 1 Fab-scFv-Fc形式抗体的第一和第二Fc结构域是包括异源二聚化偏斜变体(例如，如图3和图9所示的一组氨基酸取代)的变体Fc结构域。特别有用的异源二聚化偏斜变体包括S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411T/E360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S: S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V : T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C (EU编号))。在示例性实施方案中，第一或第二变体Fc结构域中的一者包括异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第一或第二变体Fc结构域中的另一者包括异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号。在示例性实施方案中，第一变体Fc结构域包括异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，所述变体Fc结构域包括消融变体(包括图5所示的那些)。在一些实施方案中，第一和第二变体Fc结构域中的每一者均包括消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，第一单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包括pI变体(包括图3和图4所示的那些)。在示例性实施方案中，第一单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号。
在示例性实施方案中，所述1 + 1 Fab-scFv-Fc形式抗体包括如图8所描绘的氨基酸修饰的组合。在此类实施方案中，第一单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，第二Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，本文所提供的1 + 1 Fab-scFv-Fc形式抗体的scFv包括带电scFv接头(包括图6所示的那些)。在一些实施方案中，本文所提供的1 + 1 Fab-scFv-Fc形式抗体包括FcRn变体M428L/N434S，其中编号是根据EU编号。
在1 + 1 Fab-scFv-Fc形式抗体的示例性实施方案中，第一Fc结构域包括异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第二Fc结构域包括异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q；第一和第二Fc结构域中的每一者均包括消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K；并且第一单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号。在一些实施方案中，本文所提供的1 + 1 Fab-scFv-Fc形式抗体的scFv包括(GKPGS)4带电scFv接头(SEQ ID NO:24)。在一些实施方案中，本文所提供的1 + 1Fab-scFv-Fc形式抗体包括FcRn变体M428L/N434S，其中编号是根据EU编号。在一些实施方案中，本文所提供的1 + 1 Fab-scFv-Fc形式抗体的scFv包括带电scFv接头(包括图6所示的那些)。
主题1 + 1 Fab-scFv-Fc形式抗体可包括任何合适的CD28结合结构域，包括本文所提供的任何CD28结合结构域。在一些实施方案中，所述CD28结合结构域是以下CD28结合结构域或其变体之一：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.1_L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1、9G2[CD28]_H0L0、9G2[CD28]_H1L1、2F10A3.140[CD28]_H1L1和TN228[CD28]_H4L2 (图16、图19和图22)。图16、图17、图18、图34和图36描绘了可用于主题1+ 1 Fab-scFv-Fc形式抗体的示例性CD28结合结构域的另外的VH和VL序列。
在1+1 Fab-scFv-Fc形式的一些实施方案中，所述抗CD28 ABD具有选自以下的VH和VL结构域：
(i) VH，所述VH包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3，其分别具有图16、图19和图22所描绘的任何CD28结合结构域的VH或其变体的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的氨基酸序列；和(ii)VL，所述VL包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3，其分别具有图16、图19和图22所描绘的CD28结合结构域的VL或其变体的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的氨基酸序列；
(i) VH，所述VH包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3，其分别具有图16、图17或图34所描绘的VH或其变体的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的氨基酸序列；和(ii) VL，所述VL包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3，其分别具有图16、图18或图36所描绘的VL或其变体的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的氨基酸序列；或
(i) VH，所述VH包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3，其分别具有图34所描绘的VH或其变体的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的氨基酸序列；和(ii) VL，所述VL包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3，其分别具有1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)或其变体的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的氨基酸序列。
在1+1 Fab-scFv-Fc形式的一些实施方案中，所述抗CD28 ABD具有选自以下的VH和VL结构域：
(i) VH，所述VH具有图16、图19和图22所描绘的任何CD28结合结构域的VH或其变体的氨基酸序列；和(ii) VL，所述VL具有图16、图19和图22所描绘的CD28结合结构域的VL或其变体的氨基酸序列；
(i) VH，所述VH具有图16、图17或图34所描绘的VH或其变体的氨基酸序列；和(ii)VL，所述VL具有图16、图18或图36所描绘的VL或其变体的氨基酸序列；或
(i) VH，所述VH具有图34所描绘的VH或其变体的氨基酸序列；和(ii) VL，所述VL具有1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)或其变体的氨基酸序列。
主题1 + 1 Fab-scFv-Fc形式抗体可包括任何合适的TROP2结合结构域，包括本文所提供的任何TROP2结合结构域。图23描绘了可用于主题1 + 1 Fab-scFv-Fc形式抗体的示例性TROP2结合结构域。图24-28、图36和图52-56描绘了可用于主题1 + 1 Fab-scFv-Fc形式抗体的示例性TROP2结合结构域的另外的VH和VL序列。
在1+1 Fab-scFv-Fc形式的一些实施方案中，所述抗TROP2 ABD具有选自以下的VH和VL结构域：
(i) VH，所述VH具有图23所描绘的任一TROP2结合结构域的VH或其变体的氨基酸序列；和(ii) VL，所述VL具有图23所描绘的TROP2结合结构域的VL或其变体的氨基酸序列；
(i) VH，所述VH具有图24-28所描绘的VH或其变体的氨基酸序列；和(ii) VL，所述VL具有图24-28所描绘的VL或其变体的氨基酸序列；或
(i) VH，所述VH具有图36所描绘的VH或其变体的氨基酸序列；和(ii) VL，所述VL具有1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)或其变体的氨基酸序列。
图10示出了可用于1 + 1 Fab-scFv-Fc形式抗体的一些示例性Fc结构域序列。图10所描绘的“单体1”序列通常是指“Fab-Fc重链”的Fc结构域，并且“单体2”序列是指“scFv-Fc重链”的Fc结构域。另外，图12和图13提供了可包括在1 + 1 Fab-scFv-Fc形式的第一或第二单体中的示例性CH1-铰链结构域、CH1结构域和铰链结构域。此外，图14提供了可用于这一形式的有用的CL序列。
4. 2+1 mAb-scFv形式
可特别用于主题双特异性抗CD28 x抗TROP2抗体中的一种异源二聚抗体形式是图15E所示的2 + 1 mAb-scFv形式。这种抗体形式包括三个抗原结合结构域：两个Fab部分，和连接至一条重链的C端的scFv。在这种形式的一些实施方案中，所述Fab部分各自结合TROP2(在这种情况下是人TROP2)，并且“额外的” scFv结构域结合CD28。也就是说，这种mAb-scFv形式是三价抗体。
在这些实施方案中，第一链或单体从N端至C端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，第二单体从N端至C端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域接头-scFv结构域，其中scFv结构域包含第二VH (VH2)、第二VL (VL2)和scFv接头。所述抗体还包括两条轻链，所述轻链各自包括VL1-CL，其中VL1是第一可变轻链结构域。所述scFv结构域包含第二VH (VH2)、第二VL(VL2)和scFv接头。在一些实施方案中，所述第一单体的VH1与所述两条轻链之一的VL1以及所述第二单体的VH1与所述两条轻链中的另一者的VL1各自形成第一抗原结合结构域(ABD)。所述VH2与VL2形成第二ABD。在一些实施方案中，第一ABD各自与人TROP2结合，并且第二ABD结合人CD28。
关于本文中的所有scFv结构域，所述scFv结构域从N端至C端可呈任一取向，即VH2-scFv接头-VL2或VL2-scFv接头-VH2。因此，第二单体从N端至C端可包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域接头-VH2-scFv接头-VL2或VH1-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域接头-VL2-scFv接头-VH2。
在一些实施方案中，所述2+1 mAb-scFv形式抗体的第一和第二Fc结构域是包括异源二聚化偏斜变体(例如，如图3和图9所示的一组氨基酸取代)的变体Fc结构域。特别有用的异源二聚化偏斜变体包括S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411T/E360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S :S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V : T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C(EU编号))。在示例性实施方案中，第一或第二变体Fc结构域中的一者包括异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第一或第二变体Fc结构域中的另一者包括异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号。在示例性实施方案中，第一变体Fc结构域包括异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，所述变体Fc结构域包括消融变体(包括图5所示的那些)。在一些实施方案中，第一和第二变体Fc结构域中的每一者均包括消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，第一单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包括pI变体(包括图4所示的那些)。在示例性实施方案中，第一单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，本文所提供的2 + 1 mAb-scFv形式抗体的scFv包括带电scFv接头(包括图6所示的那些)。在一些实施方案中，本文所提供的2 + 1 mAb-scFv形式抗体包括FcRn变体M428L/N434S，其中编号是根据EU编号。
在示例性实施方案中，所述2 + 1 mAb-scFv形式抗体包括如图8所描绘的氨基酸修饰的组合。在此类实施方案中，第一变体Fc结构域包括异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q；第一和第二变体Fc结构域中的每一者均包括消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K；并且第一单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号。在一些实施方案中，本文所提供的2 + 1 mAb-scFv形式抗体的scFv包括(GKPGS)4带电scFv接头(SEQ ID NO:24)。在一些实施方案中，本文所提供的2 + 1 mAb-scFv形式抗体包括FcRn变体M428L/N434S，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，所述2 + 1 mAb-scFv形式抗体的第二单体的scFv是CD28结合，并且第一和第二单体的VH1与共同轻链的VL1各自形成结合TROP2的结合结构域。所述2+ 1 mAb-scFv形式抗体可包括任何合适的TROP2结合结构域和CD28结合结构域，包括本文所提供的任何TROP2结合结构域和CD28结合结构域以及相关的VH和VL或其变体(参见例如图16-19、图22-28、图34、图36和图52-56)。
在2 + 1 mAb-scFv形式的一些实施方案中，所述抗CD28 ABD具有选自以下的VH和VL结构域：
(i) VH，所述VH包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3，其分别具有图16、图19和图22所描绘的任何CD28结合结构域的VH或其变体的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的氨基酸序列；和(ii)VL，所述VL包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3，其分别具有图16、图19和图22所描绘的CD28结合结构域的VL或其变体的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的氨基酸序列；或
(i) VH，所述VH包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3，其分别具有图16、图17或图34所描绘的VH或其变体的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的氨基酸序列；和(ii) VL，所述VL包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3，其分别具有图16、图18或图36所描绘的VL或其变体的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的氨基酸序列。
在2 + 1 mAb-scFv形式的一些实施方案中，所述抗CD28 ABD具有选自以下的VH和VL结构域：
(i) VH，所述VH具有图16、图19和图22所描绘的任何CD28结合结构域的VH或其变体的氨基酸序列；和(ii) VL，所述VL具有图16、图19和图22所描绘的CD28结合结构域的VL或其变体的氨基酸序列；或
(i) VH，所述VH具有图16、图17或图34所描绘的VH或其变体的氨基酸序列；和(ii)VL，所述VL具有图16、图18或图36所描绘的VL或其变体的氨基酸序列。
在2 + 1 mAb-scFv形式的一些实施方案中，所述抗TROP2 ABD中的每一者均具有选自以下的VH和VL结构域：
(i) VH，所述VH具有图23所描绘的任一TROP2结合结构域的VH或其变体的氨基酸序列；和(ii) VL，所述VL具有图23所描绘的TROP2结合结构域的VL或其变体的氨基酸序列；或
(i) VH，所述VH具有图24-28所描绘的VH或其变体的氨基酸序列；和(ii) VL，所述VL具有图24-28所描绘的VL或其变体的氨基酸序列。
图11示出了可用于2 + 1 mAb-scFv形式抗体的一些示例性Fc结构域序列。另外，图12和图13提供了可包括在2 + 1 mAb-scFv形式的第一或第二单体中的示例性CH1-铰链结构域、CH1结构域和铰链结构域。此外，图14提供了可用于这一形式的有用的CL序列。
图31描绘了呈2 + 1 mAb-scFv形式的示例性抗CD28 x抗TROP2抗体。
5. 2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式
可特别用于本文所提供的主题抗CD28 x抗TROP2抗体中的一种异源二聚抗体形式是图15B所示的2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式(还称为“中心scFv形式”)。这种抗体形式包括三个抗原结合结构域：两个Fab部分，和插入一个单体的VH-CH1与CH2-CH3区之间的scFv。在这种形式的一些实施方案中，所述Fab部分各自结合TROP2，并且“额外的” scFv结构域结合CD28。在一些实施方案中，所述2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式抗体是三价抗体。
在2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式的一些实施方案中，第一单体包括标准重链(即，VH1-CH1-铰链-CH2-CH3)，其中VH1是第一可变重链结构域并且CH2-CH3是第一Fc结构域。第二单体包括另一个第一可变重链结构域(VH1)、CH1结构域(和任选的铰链)、第二Fc结构域以及scFv，所述scFv包括scFv可变轻链结构域(VL2)、scFv接头和scFv可变重链结构域(VH2)。所述scFv使用任选的结构域接头共价连接在第二单体的CH1结构域的C端与第二Fc结构域的N端之间(VH1-CH1-[任选的接头]-VH2-scFv接头-VH2-[任选的接头]-CH2-CH3，或对于scFv呈相反取向，即VH1-CH1-[任选的接头]-VL2-scFv接头-VH2-[任选的接头]-CH2-CH3)。所述任选的接头可以是任何合适的肽接头，包括例如图7中所包括的结构域接头。这一实施方案还利用了各自包括第一可变轻链结构域(VL1)和恒定轻链结构域(CL)的第一和第二共同轻链。第一和第二单体的VH1-CH1各自与两条共同轻链之一相互作用以形成两个相同的Fab。在一些实施方案中，所述相同的Fab是TROP2结合结构域，并且所述scFv是CD28结合结构域。关于本文中的许多实施方案，这些构建体可包括如所需并如本文所述的偏斜变体、pI变体、消融变体、另外的Fc变体等。
在一些实施方案中，所述2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式抗体的第一和第二Fc结构域是包括异源二聚化偏斜变体(例如，如图3和图9所示的一组氨基酸取代)的变体Fc结构域。特别有用的异源二聚化偏斜变体包括S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411T/E360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S: S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V : T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C (EU编号))。在示例性实施方案中，第一或第二变体Fc结构域中的一者包括异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第一或第二变体Fc结构域中的另一者包括异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号。在示例性实施方案中，第一变体Fc结构域包括异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，所述变体Fc结构域包括消融变体(包括图5所示的那些)。在一些实施方案中，第一和第二变体Fc结构域中的每一者均包括消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，第一单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包括pI变体(包括图4所示的那些)。在示例性实施方案中，第一单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，本文所提供的2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式抗体的scFv包括带电scFv接头(包括图6所示的那些)。在一些实施方案中，本文所提供的2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式抗体包括FcRn变体M428L/N434S，其中编号是根据EU编号。
在示例性实施方案中，所述2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式抗体包括如图8所描绘的氨基酸修饰的组合。在此类实施方案中，第一变体Fc结构域包括异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q；第一和第二变体Fc结构域中的每一者均包括消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K；并且第一单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号。在一些实施方案中，本文所提供的2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式抗体的scFv包括(GKPGS)4带电scFv接头(SEQ ID NO:24)。在一些实施方案中，本文所提供的2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式抗体包括FcRn变体M428L/N434S，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，第一单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且第二Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，所述2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式抗体的第二单体的scFv是CD28结合，并且第一和第二单体的VH1与共同轻链的VL1各自形成结合TROP2的结合结构域。主题2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式抗体可包括任何合适的CD28结合结构域，包括本文所提供的任何CD28结合结构域。在一些实施方案中，所述CD28结合结构域是以下CD28结合结构域或其变体之一：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.1_L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1、9G2[CD28]_H0L0、9G2[CD28]_H1L1、2F10A3.140[CD28]_H1L1和TN228[CD28]_H4L2 (图16、图19和图22)。
在2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式的一些实施方案中，所述抗CD28 ABD具有选自以下的VH和VL结构域：
(i) VH，所述VH包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3，其分别具有图16、图19和图22所描绘的任何CD28结合结构域的VH或其变体的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的氨基酸序列；和(ii)VL，所述VL包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3，其分别具有图16、图19和图22所描绘的CD28结合结构域的VL或其变体的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的氨基酸序列；或
(i) VH，所述VH包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3，其分别具有图16、图17或图34所描绘的VH或其变体的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的氨基酸序列；和(ii) VL，所述VL包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3，其分别具有图16、图18或图36所描绘的VL或其变体的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的氨基酸序列。
在1+1 Fab-scFv-Fc形式的一些实施方案中，所述抗CD28 ABD具有选自以下的VH和VL结构域：
(i) VH，所述VH具有图16、图19和图22所描绘的任何CD28结合结构域的VH或其变体的氨基酸序列；和(ii) VL，所述VL具有图16、图19和图22所描绘的CD28结合结构域的VL或其变体的氨基酸序列；或
(i) VH，所述VH具有图16、图17或图34所描绘的VH或其变体的氨基酸序列；和(ii)VL，所述VL具有图16、图18或图36所描绘的VL或其变体的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一和第二单体的VH1与所述2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式抗体的共同轻链的VL1各自形成结合TROP2的结合结构域。主题2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式抗体可包括任何合适的TROP2结合结构域，包括本文所提供的任何TROP2结合结构域。图23描绘了可用于主题2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式抗体的示例性TROP2结合结构域。图24-28、图36和图52-56描绘了可用于主题2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式抗体的示例性TROP2结合结构域的另外的VH和VL序列。
在2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式的一些实施方案中，所述抗TROP2 ABD各自包括选自以下的VH和VL结构域：
(i) VH，所述VH具有图23所描绘的任一TROP2结合结构域的VH或其变体的氨基酸序列；和(ii) VL，所述VL具有图23所描绘的TROP2结合结构域的VL或其变体的氨基酸序列；或
(i) VH，所述VH具有图24-28所描绘的VH或其变体的氨基酸序列；和(ii) VL，所述VL具有图24-28所描绘的VL或其变体的氨基酸序列。
图10示出了可用于2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式抗体的一些示例性Fc结构域序列。另外，图12和图13提供了可包括在2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式的第一或第二单体中的示例性CH1-铰链结构域、CH1结构域和铰链结构域。此外，图14提供了可用于这一形式的有用的CL序列。
6. 2 + 1 Fab2-Fc x scFv-Fc形式
可特别用于本文所提供的主题抗CD28 x抗TROP2抗体中的一种异源二聚抗体形式是图15N所示的2 + 1 Fab2-Fc x scFv-Fc形式(还称为“堆叠式开瓶器”)。这种形式包括第一单体、第二单体和两条共同轻链。所述第一单体从N端至C端包括：VH1-CH1-结构域接头-VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH1各自是第一可变重链结构域，并且CH2-CH3是第一变体Fc结构域。所述结构域接头可以是任何有用的结构域接头(参见例如图7)。所述第二单体包括通过结构域接头共价连接至第二变体Fc结构域的单链Fv (“scFv”) (scFv-结构域接头-CH2-CH3)。所述两条共同轻链各自包括VL1-CL，其中VL1各自是第一可变轻链结构域。所述第二单体的scFv包括通过scFv接头连接至第二可变轻链结构域(VL2)的第二可变重链结构域(VH2)。在这一实施方案中，所述第一单体的两个VH1-CH1各自与所述两条共同轻链之一相互作用以形成两个相同的第一抗原结合结构域，并且VH2和VL2形成第二抗原结合结构域。在一些实施方案中，每个第一抗原结合结构域均是TROP2结合结构域，并且第二抗原结合结构域是CD28结合结构域。关于本文中的许多实施方案，这些构建体可包括如所需并如本文所述的偏斜变体、pI变体、消融变体、另外的Fc变体等。
在一些实施方案中，所述2 + 1 Fab2-Fc x scFv-Fc形式抗体的第一和第二Fc结构域是包括异源二聚化偏斜变体(例如，如图3和图9所示的一组氨基酸取代)的变体Fc结构域。特别有用的异源二聚化偏斜变体包括S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S :S364K；L368E/K370S : S364K；T411T/E360E/Q362E : D401K；L368D/K370S : S364K/E357L；K370S : S364K/E357Q；T366S/L368A/Y407V : T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C: T366W/S354C (EU编号))。在示例性实施方案中，第一或第二变体Fc结构域中的一者包括异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第一或第二变体Fc结构域中的另一者包括异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号。在示例性实施方案中，第一变体Fc结构域包括异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，所述变体Fc结构域包括消融变体(包括图5所示的那些)。在一些实施方案中，第一和第二变体Fc结构域中的每一者均包括消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，第一单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包括pI变体(包括图4所示的那些)。在示例性实施方案中，第一单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，本文所提供的2 + 1 Fab2-Fc x scFv-Fc形式抗体包括带电scFv接头(包括图6所示的那些)。在一些实施方案中，本文所提供的2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式抗体包括FcRn变体M428L/N434S，其中编号是根据EU编号。
在示例性实施方案中，所述2 + 1 Fab2-Fc x scFv-Fc形式抗体包括如图8所描绘的氨基酸修饰的组合。在此类实施方案中，第一变体Fc结构域包括异源二聚化偏斜变体L368D/K370S，并且第二变体Fc结构域包括异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q；第一和第二变体Fc结构域中的每一者均包括消融变体E233P/L234V/L235A/G236_/S267K；并且第一单体的恒定结构域(CH1-铰链-CH2-CH3)包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号。在一些实施方案中，本文所提供的2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式抗体的scFv包括(GKPGS)4带电scFv接头(SEQ ID NO:24)。在一些实施方案中，本文所提供的2 + 1Fab2-scFv-Fc形式抗体包括FcRn变体M428L/N434S，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，第一单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，并且第二Fc结构域包含氨基酸变体S364K/E357Q/E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号。
在一些实施方案中，所述2 + 1 Fab2-Fc x scFv-Fc形式抗体的第二单体的scFv是CD28结合，并且第一和第二单体的VH1与共同轻链的VL1各自形成结合TROP2的结合结构域。主题2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式抗体可包括任何合适的CD28结合结构域，包括本文所提供的任何CD28结合结构域。在一些实施方案中，所述CD28结合结构域是以下CD28结合结构域或其变体之一：1A7[CD28]_H1L1、1A7[CD28]_H1.1_L1、1A7[CD28]_H1_L1.71、1A7[CD28]_H1.1_L1.71、1A7[CD28]_H1.14_L1、1A7[CD28]_H1.14_L1.71、CD28.3[CD28]_H0L0、hCD28.3[CD28]_H1L1、5.11A1[CD28]_H0L0、TGN1412_H1L1、341VL34[CD28]_H1L1、341VL36[CD28]_H1L1、281VL4[CD28]_H1L1、HuTN228[CD28]_H1L1、PV1[CD28]_H0L0、m9.3[CD28]_H0L0、hu9.3[CD28]_H1L1、9G2[CD28]_H0L0、9G2[CD28]_H1L1、2F10A3.140[CD28]_H1L1和TN228[CD28]_H4L2 (图16、图19和图22)。
在2 + 1 Fab2-Fc x scFv-Fc形式的一些实施方案中，所述抗CD28 ABD具有选自以下的VH和VL结构域：
(i) VH，所述VH包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3，其分别具有图16、图19和图22所描绘的任何CD28结合结构域的VH或其变体的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的氨基酸序列；和(ii)VL，所述VL包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3，其分别具有图16、图19和图22所描绘的CD28结合结构域的VL或其变体的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的氨基酸序列；或
(i) VH，所述VH包含vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3，其分别具有图16、图17或图34所描绘的VH或其变体的vhCDR1、vhCDR2和vhCDR3的氨基酸序列；和(ii) VL，所述VL包含vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3，其分别具有图16、图18或图36所描绘的VL或其变体的vlCDR1、vlCDR2和vlCDR3的氨基酸序列。
在2 + 1 Fab2-Fc x scFv-Fc的一些实施方案中，所述抗CD28 ABD具有选自以下的VH和VL结构域：
(i) VH，所述VH具有图16、图19和图22所描绘的任何CD28结合结构域的VH或其变体的氨基酸序列；和(ii) VL，所述VL具有图16、图19和图22所描绘的CD28结合结构域的VL或其变体的氨基酸序列；或
(i) VH，所述VH具有图16、图17或图34所描绘的VH或其变体的氨基酸序列；和(ii)VL，所述VL具有图16、图18或图36所描绘的VL或其变体的氨基酸序列。
在一些实施方案中，第一和第二单体的VH1与所述2 + 1 Fab2-Fc x scFv-Fc形式抗体的共同轻链的VL1各自形成结合TROP2的结合结构域。主题2 + 1 Fab2-Fc x scFv-Fc形式抗体可包括任何合适的TROP2结合结构域，包括本文所提供的任何TROP2结合结构域。图23描绘了可用于主题2 + 1 Fab2-Fc x scFv-Fc形式抗体的示例性TROP2结合结构域。图24-28和图52-56描绘了可用于主题2 + 1 Fab2-Fc x scFv-Fc抗体的示例性TROP2结合结构域的另外的VH和VL序列。
在2 + 1 Fab2-Fc x scFv-Fc形式的一些实施方案中，所述抗TROP2 ABD各自包括选自以下的VH和VL结构域：
(i) VH，所述VH具有图23所描绘的任一TROP2结合结构域的VH或其变体的氨基酸序列；和(ii) VL，所述VL具有图23所描绘的TROP2结合结构域的VL或其变体的氨基酸序列；或
(i) VH，所述VH具有图24-28所描绘的VH或其变体的氨基酸序列；和(ii) VL，所述VL具有图24-28所描绘的VL或其变体的氨基酸序列。
图10示出了可用于2 + 1 Fab2-Fc x scFv-Fc形式抗体的一些示例性Fc结构域序列。另外，图12和图13提供了可包括在2 + 1 Fab2-Fc x scFv-Fc形式的第一或第二单体中的示例性CH1-铰链结构域、CH1结构域和铰链结构域。此外，图14提供了可用于这一形式的有用的CL序列。
7. 双scFv形式
可特别用于主题双特异性抗CD28 x抗TROP2抗体中的一种异源二聚抗体形式是双scFv形式，如本领域中已知并如图15F所示。在这一实施方案中，所述异源二聚双特异性抗体由两个scFv-Fc单体构成(均呈(vh-scFv接头-vl-[任选的结构域接头]-CH2-CH3)形式或(vl-scFv接头-vh-[任选的结构域接头]-CH2-CH3)形式，或者一个单体呈一种取向并且另一单体呈另一取向。
在这种情况下，所有ABD均呈scFv形式。呈双scFv形式的抗CD28 x抗TROP2抗体可包括任何合适的TROP2结合结构域和CD28结合结构域，包括本文所提供的任何TROP2结合结构域和CD28结合结构域。
另外，所述双scFv形式的Fc结构域包含偏斜变体(例如，如图3和图9所示的一组氨基酸取代，其中特别有用的偏斜变体选自由以下组成的组：S364K/E357Q : L368D/K370S；L368D/K370S : S364K；L368E/K370S : S364K；T411T/E360E/Q362E : D401K；L368D/K370S: S364K/E357L，K370S : S364K/E357Q，T366S/L368A/Y407V : T366W和T366S/L368A/Y407V/Y349C : T366W/S354C)、任选的消融变体(包括图5所示的那些)、任选的带电scFv接头(包括图6所示的那些)，并且重链包含pI变体(包括图4所示的那些)。
在一些实施方案中，所述双scFv形式包括偏斜变体、pI变体和消融变体。因此，一些实施方案包括包含以下的形式：a)第一单体，所述第一单体包含偏斜变体S364K/E357Q、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及结合第一抗原的scFv (VH1-scFv接头-VL1-[任选的结构域接头]-CH2-CH3或VL1-scFv接头-VH1-[任选的结构域接头]-CH2-CH3)；和b)第一单体，所述第一单体包含偏斜变体L368D/K370S、消融变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K以及结合第二抗原的scFv (VH1-scFv接头-VL1-[任选的结构域接头]-CH2-CH3或VL1-scFv接头-VH1-[任选的结构域接头]-CH2-CH3)。pI变体可如本文所概述，但最常见的将是针对每个单体带相反电荷的带电scFv接头。可任选地包括FcRn变体，特别是428L/434S。
所述双scFv形式可包括任何合适的TROP2结合结构域和CD28结合结构域，包括本文所提供的任何TROP2结合结构域和CD28结合结构域以及相关的VH和VL或其变体(参见例如图16-19、图22-28、图34、图36和图52-56)。
8. 单臂中心scFv
可特别用于本文所提供的主题抗CD28 x抗TROP2抗体中的一种异源二聚抗体形式是图15J所示的单臂中心scFv形式。在这一实施方案中，一个单体仅包含Fc结构域，而另一单体包括Fab结构域(第一抗原结合结构域)、scFv结构域(第二抗原结合结构域)和Fc结构域，其中scFv结构域插入Fc结构域与Fc结构域之间。
在这一实施方案中，一个单体包含第一重链，所述第一重链包含第一可变重链结构域、CH1结构域和Fc结构域，其中scFv包含scFv可变轻链结构域、scFv接头和scFv可变重链结构域。所述scFv使用结构域接头共价连接在重链恒定结构域的CH1结构域的C端与第一Fc结构域的N端之间，呈任一取向，即VH1-CH1-[任选的结构域接头]-VH2-scFv接头-VL2-[任选的结构域接头]-CH2-CH3或VH1-CH1-[任选的结构域接头]-VL2-scFv接头-VH2-[任选的结构域接头]-CH2-CH3。第二单体包含Fc结构域(CH2-CH3)。这一实施方案还利用了包含可变轻链结构域和恒定轻链结构域的轻链，所述轻链与重链缔合以形成Fab。关于本文中的许多实施方案，这些构建体包括如所需并如本文所述的偏斜变体、pI变体、消融变体、另外的Fc变体等。
所述单臂中心scFv形式可包括任何合适的TROP2结合结构域和CD28结合结构域，包括本文所提供的任何TROP2结合结构域和CD28结合结构域以及相关的VH和VL或其变体(参见例如图16-19、图22-28、图34、图36和图52-56)。
9. 单臂scFv-mAb形式
可特别用于本文所提供的主题抗CD28 x抗TROP2抗体中的一种异源二聚抗体形式是图15G所示的单臂mAb-scFv形式。这种形式包括：1)第一单体，所述第一单体包含“空” Fc结构域；2)第二单体，所述第二单体包括第一可变重链结构域(VH)、scFv结构域(第二抗原结合结构域)和Fc结构域，其中scFv结构域连接至第一可变重链结构域的N端；和3)轻链，所述轻链包括第一可变轻链结构域和恒定轻链结构域。第一可变重链结构域和第一可变轻链结构域形成第一抗原结合结构域，并且所述scFv是第二抗原结合结构域。在这种形式中，第一抗原结合结构域和第二结合结构域中的一者结合CD28，并且另一抗原结合结构域结合TROP2。关于本文中的许多实施方案，这些构建体包括如所需并如本文所述的偏斜变体、pI变体、消融变体、另外的Fc变体等。
所述单臂scFv-mAb形式抗体可包括任何合适的TROP2结合结构域和CD28结合结构域，包括本文所提供的任何TROP2结合结构域和CD28结合结构域以及相关的VH和VL或其变体(参见例如图16-19、图22-28、图34、图36和图52-56)。
10. scFv-mAb形式
可特别用于本文所提供的主题抗CD28 x抗TROP2抗体中的一种异源二聚抗体形式是图15H所示的mAb-scFv形式。在这一实施方案中，所述形式依赖于使用scFv与一个单体的N端连接，从而形成第三抗原结合结构域，其中两个单体的Fab部分各自结合一个靶标，并且“额外的” scFv结构域结合不同的靶标。
在这一实施方案中，第一单体包含第一重链(包含可变重链结构域和恒定结构域)，其中N端共价连接的scFv包含scFv可变轻链结构域、scFv接头和scFv可变重链结构域，呈任一取向((vh1-scFv接头-vl1-[任选的结构域接头]-vh2-CH1-铰链-CH2-CH3)或(在scFv呈相反取向时) ((vl1-scFv接头-vh1-[任选的结构域接头]-vh2-CH1-铰链-CH2-CH3))。第二单体包含重链VH2-CH1-铰链-CH2-CH3。这一实施方案还利用了包含可变轻链结构域和恒定轻链结构域的共同轻链，所述轻链与重链缔合以形成两个相同的Fab。关于本文中的许多实施方案，这些构建体包括如所需并如本文所述的偏斜变体、pI变体、消融变体、另外的Fc变体等。
所述scFv-mAb抗体形式可包括任何合适的TROP2结合结构域和CD28结合结构域，包括本文所提供的任何TROP2结合结构域和CD28结合结构域以及相关的VH和VL或其变体(参见例如图16-19、图22-28、图34、图36和图52-56)。
11. mAb-Fv形式
可特别用于本文所提供的主题抗CD28 x抗TROP2抗体中的一种异源二聚抗体形式是mAb-Fv形式(图15K)。在这一实施方案中，所述形式依赖于使用“额外的”可变重链结构域与一个单体的C端连接，以及“额外的”可变轻链结构域与另一单体的C端连接，从而形成第三抗原结合结构域(即，“额外的” Fv结构域)，其中两个单体的Fab部分结合CD28，并且“额外的” Fv结构域结合TROP2。
在这一实施方案中，第一单体包含第一重链，所述第一重链包含第一可变重链结构域和包含第一Fc结构域的第一恒定重链结构域，其中第一可变轻链结构域使用结构域接头共价连接至第一Fc结构域的C端(vh1-CH1-铰链-CH2-CH3-[任选的接头]-vl2)。第二单体包含第二可变重链结构域、包含第二Fc结构域的第二恒定重链结构域以及使用结构域接头共价连接至第二Fc结构域的C端的第三可变重链结构域(vh1-CH1-铰链-CH2-CH3-[任选的接头]-vh2。这一实施方案还利用了包含可变轻链结构域和恒定轻链结构域的共同轻链，所述轻链与重链缔合以形成两个相同的Fab，所述Fab包括两个相同的Fv。两个C端连接的可变结构域构成了“额外的”第三Fv。关于本文中的许多实施方案，这些构建体包括如所需并如本文所述的偏斜变体、pI变体、消融变体、另外的Fc变体等。
所述mAb-Fv形式可包括任何合适的TROP2结合结构域和CD28结合结构域，包括本文所提供的任何TROP2结合结构域和CD28结合结构域以及相关的VH和VL或其变体(参见例如图16-19、图22-28、图34、图36和图52-56)。
12. 中心Fv形式
可特别用于本文所提供的主题抗CD28 x抗TROP2抗体中的一种异源二聚抗体形式是图15L所示的中心Fv形式。在这一实施方案中，所述形式依赖于使用插入的Fv结构域，从而形成“额外的”第三抗原结合结构域，其中两个单体的Fab部分结合TROP2，并且“额外的”中心Fv结构域结合CD28。Fv结构域插入单体的Fc结构域与CH1-Fv区之间，从而提供第三抗原结合结构域，其中每个单体均含有Fv的组分(例如，一个单体包含可变重链结构域，并且另一单体包含“额外的”中心Fv结构域的可变轻链结构域)。
在这一实施方案中，一个单体包含第一重链，所述第一重链包含第一可变重链结构域、CH1结构域和Fc结构域以及另外的可变轻链结构域。所述另外的可变轻链结构域使用结构域接头共价连接在重链恒定结构域的CH1结构域的C端与第一Fc结构域的N端之间(vh1-CH1-[任选的接头]-vl2-铰链-CH2-CH3)。另一单体包含第一重链，所述第一重链包含第一可变重链结构域、CH1结构域和Fc结构域以及另外的可变重链结构域(vh1-CH1-[任选的接头]-vh2-铰链-CH2-CH3)。所述另外的可变重链结构域使用结构域接头共价连接在重链恒定结构域的CH1结构域的C端与第一Fc结构域的N端之间。这一实施方案利用了包含可变轻链结构域和恒定轻链结构域的共同轻链，所述轻链与重链缔合以形成两个相同的Fab，所述Fab各自结合TROP2。所述另外的可变重链结构域和另外的可变轻链结构域形成结合CD28的“额外的”中心Fv。关于本文中的许多实施方案，这些构建体包括如所需并如本文所述的偏斜变体、pI变体、消融变体、另外的Fc变体等。
所述中心Fv形式可包括任何合适的TROP2结合结构域和CD28结合结构域，包括本文所提供的任何TROP2结合结构域和CD28结合结构域以及相关的VH和VL或其变体(参见例如图16-19、图22-28、图34、图36和图52-56)。
13. 非异源二聚双特异性抗体
本领域技术人员应理解，本文所提供的抗CD28 x抗TROP2抗体也可包括在非异源二聚双特异性形式中(参见图15I)。在这种形式中，所述抗CD28 x抗TROP2包括：1)第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3；2)第二单体，所述第二单体包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3；3)第一轻链，所述第一轻链包含VL1-CL；以及4)第二轻链，所述第二轻链包含VL2-CL。在此类实施方案中，VH1与VL1形成第一抗原结合结构域，并且VH2与VL2形成第二抗原结合结构域。第一或第二抗原结合结构域中的一者结合CD28，并且另一抗原结合结构域结合TROP2。
呈非异源二聚双特异性抗体形式的抗CD28 x抗TROP2抗体可包括任何合适的TROP2结合结构域和CD28结合结构域，包括本文所提供的任何TROP2结合结构域和CD28结合结构域以及相关的VH和VL或其变体(参见例如图16-19、图22-28、图34、图36和图52-56)。
14. 三叉戟形式
在一些实施方案中，本文所提供的抗CD28 x抗TROP2抗体是呈“三叉戟”形式，如WO2015/184203总体上所述，所述文献特此明确地以引用的方式整体并入，并特别地针对关于“异源二聚体促进结构域”或“HPD” (包括“K螺旋”和“E螺旋”序列)的附图、图例、定义和序列。三叉戟依赖于使用两个不同的HPD，所述HPD缔合形成异源二聚结构作为所述结构的组分，参见图15M。在这一实施方案中，所述三叉戟形式包括“传统”重链和轻链(例如VH1-CH1-铰链-CH2-CH3和VL1-CL)、包含第一“双功能抗体类型结合结构域”或“DART®”的第三链(VH2-(接头)-VL3-HPD1)以及包含第二DART®的第四链(VH3-(接头)-(接头)-VL2-HPD2)。VH1与VL1形成第一ABD，VH2与VL2形成第二ABD，并且VH3与VL3形成第三ABD。在一些情况下，如图15M所示，第二和第三ABD结合相同的抗原。
所述三叉戟形式可包括任何合适的TROP2结合结构域和CD28结合结构域，包括本文所提供的任何TROP2结合结构域和CD28结合结构域以及相关的VH和VL或其变体(参见例如图16-19、图22-28、图34、图36和图52-56)。
V. 核酸
另一方面，本文提供了编码本文所提供的抗CD28 x抗TROP2抗体的核酸组合物。核酸组合物可以指一个或多个多核苷酸。
本领域技术人员应理解，核酸组合物将依赖于异源二聚蛋白质的形式和支架。因此，例如，当所述形式需要三个氨基酸序列时，诸如对于1+1 CLC、2+1 CLC、1 + 1 Fab-scFv-Fc、2 + 1 mAb-scFv或2 + 1 Fab2-scFv-Fc形式来说，可将三个多核苷酸并入一个或多个表达载体中以供表达。在示例性实施方案中，每个多核苷酸并入不同的表达载体中。
如本领域中已知，编码本文所公开的结合结构域和抗体的组分的核酸可并入表达载体中，如本领域中已知，并且取决于用于产生本发明的异源二聚抗体的宿主细胞。通常，所述核酸可操作地连接至多个调控元件(启动子、复制起点、选择性标志物、核糖体结合位点、诱导物等)。所述表达载体可以是染色体外或整合载体。
接着，将本发明的多核苷酸和/或表达载体转化至本领域中众所周知的多种不同类型的宿主细胞(包括哺乳动物、细菌、酵母、昆虫和/或真菌细胞)中，其中哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)可用于许多实施方案中。
在一些实施方案中，编码每个单体的多核苷酸各自包含在单个表达载体中，通常在不同或相同的启动子控制下。在特别用于本发明的实施方案中，这些多核苷酸中的每一者包含在不同的表达载体上。如本文和US 62/025,931 (特此以引用的方式并入)所示，可使用不同的载体比率来驱动异源二聚体形成。也就是说，令人惊讶的是，虽然所述蛋白质包含1:1:2比率的第一单体:第二单体:轻链(就本文中具有构成异源二聚抗体的三个多肽的许多实施方案来说)，但这些并非产生最佳结果的比率。
通过培养包含本领域中众所周知的表达载体的宿主细胞来制备本文所提供的抗体。一旦产生，就进行传统的抗体纯化步骤，包括离子交换色谱法步骤。如本文所讨论，使两个单体的pI相差至少0.5可允许通过离子交换色谱法或等电聚焦或其他对等电点敏感的方法进行分离。也就是说，包括改变每个单体的等电点(pI)的pI取代使得每个单体具有不同的pI并且异源二聚体也具有独特的pI，从而促进“1 + 1 Fab-scFv-Fc”异源二聚体的等电纯化(例如，阴离子交换柱、阳离子交换柱)。这些取代也有助于在纯化后确定和监测任何污染性的双scFv-Fc和mAb同源二聚体(例如，IEF凝胶、cIEF和分析型IEX柱)。
VI. 抗CD28 x抗TROP2抗体的生物和生物化学功能
通常将本文所述的抗CD28 x抗TROP2抗体施用于患有TROP2相关癌症的患者，并以如本文所述的多种方式评估功效。因此，在可进行标准功效测定(诸如癌症负荷、肿瘤大小、评估转移的存在或程度等)时，也可基于免疫状态评估来评估免疫肿瘤学治疗。这可以多种方式进行，包括体外和体内测定。
A. 用于体内施用的抗体组合物
本发明的实施方案涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的任一抗CD28 x抗TROP2抗体和药学上可接受的载体。通过将具有所需纯度程度的抗体与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂混合(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版, Osol, A.编[1980])来制备本文所述的抗CD28 x抗TROP2抗体的制剂，以供以冻干制剂或水溶液的形式进行存储。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且包括缓冲液，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁基或苄基醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)的多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖以及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖类，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，例如钠；金属配合物(例如，Zn-蛋白质配合物)；和/或非离子型表面活性剂，例如TWEEN™、PLURONICS™或聚乙二醇(PEG)。
VII. 治疗
一旦制成，本发明组合物就可通过治疗癌症用于多种肿瘤学应用，通常是通过增强免疫反应(例如，T细胞激活和增殖)，特别是在与抗癌疗法(诸如抗肿瘤双特异性抗体)一起使用时。在一些实施方案中，本文所提供的抗体通过在表达TROP2的肿瘤微环境中对T细胞提供激动性共刺激来增强免疫反应(例如，T细胞激活和增殖)。
在一些实施方案中，本文所提供的抗CD28 x抗TROP2双特异性抗体与抗肿瘤疗法一起施用，所述抗肿瘤疗法包括例如抗肿瘤相关抗原(TAA)双特异性抗体。
A. 抗CD28 x抗TROP2/抗TROP2双特异性抗体
在一些实施方案中，本文所提供的抗CD28 x抗TROP2抗体与抗TROP2双特异性抗体一起施用，所述双特异性抗体是T细胞衔接双特异性抗体，例如与人CD3结合的那些。
在经典T细胞/APC相互作用中，存在由TCR与肽-MHC的反应性提供的第一信号(信号1)和由在APC上表达的CD80/CD86与CD28的交联提供的第二信号(信号2)，所述信号一起完全激活T细胞(参见图29A)。相比之下，在使用靶向肿瘤相关抗原(TAA)的CD3双特异性抗体(即，抗CD3 x抗TROP2双特异性抗体)的治疗中，仅提供了第一信号。
不受任何特定操作理论的束缚，据信本文所提供的抗CD28 x抗TROP2双特异性抗体可通过CD28共刺激来增强抗CD3 x抗TROP2双特异性抗体的抗肿瘤反应(参见图29B)。因此，一方面，本文提供了通过向患者施用本文所提供的抗CD3 x抗TROP2双特异性抗体和抗CD28 x抗TROP2双特异性抗体来治疗患者的TROP2相关癌症的方法。
可用于与主题抗CD28 x抗TROP2抗体组合提供“信号1”的抗CD3 x抗TROP2抗体包括具有本文所提供的任何CD3结合结构域和TROP2结合结构域的那些(参见例如图23-28和图32)。此类抗CD3 x抗TROP2抗体的合适抗体形式包括但不限于本文所述的抗体形式(参见例如图15)。在一些实施方案中，组合使用的抗CD3 x抗TROP2抗体和抗CD28 x抗TROP2抗体与同一TROP2表位结合。在一些实施方案中，组合使用的抗CD3 x抗TROP2抗体和抗CD28 x抗TROP2抗体与不同的TROP2表位结合。
B. 施用模式
本文所提供的抗体根据已知的方法施用于受试者，诸如以推注形式静脉内施用或通过在一段时间内连续输注。
C. 治疗模式
在本发明的方法中，疗法用于针对疾病或疾患提供积极的治疗反应。
“积极的治疗反应”意指疾病或疾患的改进，和/或与疾病或疾患相关的症状的改进。例如，积极的治疗反应将指以下疾病改进中的一者或多者：(1)赘生性细胞数目减少；(2)赘生性细胞死亡增加；(3)抑制赘生性细胞存活；(5)抑制(即，在一定程度上减缓，优选地停止)肿瘤生长；(6)患者存活率增加；以及(7)与疾病或疾患相关的一种或多种症状的一些缓解。
任何给定的疾病或疾患的积极治疗反应可通过特定针对所述疾病或疾患的标准化反应标准来确定。可使用筛选技术，诸如磁共振成像(MRI)扫描、x射线照相成像、计算机断层(CT)扫描、骨扫描成像、内窥镜检查和肿瘤活检取样(包括骨髓抽吸(BMA)和对循环中的肿瘤细胞计数)，针对肿瘤形态(即，总体肿瘤负荷、肿瘤大小等)的变化来评估肿瘤反应。
除了这些积极治疗反应以外，正接受疗法的受试者还可能经历与疾病相关的症状改进的有益效应。
根据本发明的治疗包括“治疗有效量”的所用药物。“治疗有效量”是指在必需的剂量和时间段内有效实现所需治疗结果的量。
治疗有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及药物在个体中引发所需反应的能力等因素而变化。治疗有效量也是其中抗体或抗体部分的任何毒性或有害效应被治疗有益效应超过的量。
针对肿瘤疗法的“治疗有效量”也可以通过其稳定疾病进展的能力来测量。可在预示人肿瘤功效的动物模型系统中评估化合物抑制癌症的能力。
或者，可以通过利用熟练从业人员已知的体外测定检查化合物抑制细胞生长或诱导凋亡的能力来评估组合物的这种特性。治疗有效量的治疗性化合物可以减小肿瘤大小或以其他方式改善受试者的症状。本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者的体型、受试者症状的严重程度以及所选的特定组合物或施用途径等因素来确定此类量。
调节剂量方案以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单个大丸药，可以随时间推移施用几个分开的剂量，或者可如治疗情形的紧急性所指示按比例减少或增加剂量。肠胃外组合物可以配制成剂量单位形式，以便于施用和剂量的均匀性。如本文所用，剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理离散单元；各单元含有预定量的活性化合物，所述量经过计算与所需的药物载体联合产生所需的治疗效应。
本发明的剂量单位形式的规格受制于并且直接取决于(a)活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗效应，和(b)混配此类用于治疗个体敏感性的活性化合物的领域所固有的限制。
用于本发明的双特异性抗体的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或疾患并且可以由本领域技术人员确定。
实施例
实施例1：CD28结合结构域
人、小鼠和食蟹猴CD28的序列描绘于图1A-1B中，并且可用于开发交叉反应性CD28抗原结合结构域以便于临床开发。
1A：新颖CD28结合结构域
为了避免与TGN1412相关的超激动作用而考虑的一种方法是生成与TGN1412相比对CD28具有较低结合亲和力和/或与不同的CD28表位结合的新颖CD28结合结构域。在一次生成此类新颖CD28结合结构域的活动中，对内部从头噬菌体文库进行了针对CD28的筛选。
1A(a)：噬菌体源性克隆1A7
应注意，这一噬菌体文库利用了人种系VL并将多样性引入LCDR3中。图16描绘了示例性的噬菌体源性克隆1A7的氨基酸序列。
为了优化CD28 bsAb，通过对VH变体(如图17A-17F和SEQ ID NO: 117-185所描绘的说明性序列)、VL变体(如图18A-18I和SEQ ID NO: 186-291所描绘的说明性序列)、共有序列(图20A-20B所描绘)以及它们的组合(图19A-19C所描绘的说明性序列)进行工程改造，开发了多种1A7亲和力变体。图21描绘了在scFv背景下说明性变体的单价亲和力。
另外，期望在共同轻链形式中利用1A7结合结构域。用于发现CD28克隆1A7的噬菌体文库与用于发现TROP2结合结构域1F11-1A3.315的噬菌体文库利用了相同的亲本人种系VL，如实施例2A中将描述。意外地发现，克隆1A7的可变轻链结构域与亲本种系VL的差异仅在于LCDR3中的单个氨基酸；然而，尽管只有单个氨基酸的差异，1A7的VH却不能与亲本种系VL很好地配对，导致结合减弱。因此，生成了亲和力优化文库，重点在于仅在1A7的可变重链结构域中进行取代(以确保所述种系VL充当来自实施例2A的TROP2结合结构域的共同轻链的能力不受干扰)。图34和SEQ ID NO: XXX-YYY描绘了示例性的亲和力优化的1A7可变结构域的氨基酸序列。通过Octet确定亲和力工程改造的1A7 Fab变体的单价KD，其数据描绘于图35中。应注意，数字可能因实验和批次而异。例如，在另一组实验中，1A7_H1.129_IGKV1-39_L1结构域示出了60-70 nM的亲和力；而1A7_H1.118_IGKV1-39_L1结构域示出了约400nM的亲和力。然而，趋势仍然相同，例如1A7_H1.129_IGKV1-39_L1具有比1A7_H1.118_IGKV1-39_L1更紧密的亲和力。尽管如此，本文中仍将使用图35中的KD来描述所述结合结构域。
1B：另外的CD28结合结构域
图22A-22H描绘了可用于本发明的TROP2 x CD28 bsAb中的另外的CD28结合结构域的序列。
实施例2：TROP2结合结构域
人、小鼠和食蟹猴TROP2的序列描绘于图2中，并且可用于开发交叉反应性TROP2抗原结合结构域以便于临床开发。
2A：新颖TROP2结合结构域
为了对TROP2 x CD28 bsAb进行工程改造，探索了共同轻链形式，因为仅利用Fab结构域的双特异性抗体形式与利用scFv结构域的那些相比可能具有更低免疫原性和稳定性。使用了利用恒定人种系VL (利用与实施例1A(a)中相同的人种系VL，但不具有任何多样性)和VH多样性的噬菌体文库。图36描绘了示例性的噬菌体源性TROP2克隆1F11-1A3.315的氨基酸序列。
为了调整对TROP2的结合亲和力(以及所述双特异性分子的效力)，工程改造出一个亲和力梯度(图36所描绘的说明性序列)。最初，在二价形式中确定亲和力工程改造的1F11-1A3.315变体的KD，其数据描绘于图37中。随后，确定了单价KD，并且1F11-1A3.315_H1L1是13 nM，1F11-1A3.315_H1.10_L1是5 nM，并且1F11-1A3.315_H1.19_L1是2 nM。虽然这些变体较弱(因为这些变体是单价的)，但趋势与二价一致，即H1L1 < H1.10_L1 <H1.19_L1。
虽然上述亲和力成熟活动试图改进1F11-1A3.315克隆的结合亲和力，但所探索的另一个途径是较弱亲和力的TROP2结合。因此，鉴定出了另外的噬菌体源性TROP2克隆，其序列描绘于图52-56中。KD经确定如下：1C9A4.313 (40 nM)、1B11A3.316 (54 nM)、1B2A4.312(64 nM)、1A3A4.312 (80 nM)以及2C5A3.316 (345 nM)。
2B：另外的TROP2结合结构域
图23-28描绘了可用于本发明的TROP2 x CD28 bsAb中的TROP2结合结构域的序列。
实施例3：工程改造TROP2 x CD28 bsAb
T细胞的完全激活和分化需要多重信号。信号1 (通过由T细胞受体(TCR)识别肽-MHC (pMHC)复合物所促进)是T细胞激活绝对需要的。信号2与信号1协同作用并对其进行放大，通常是由CD28配体CD80和CD86与CD28本身的相互作用提供的。尽管单独的CD28衔接通常是惰性的，但当与信号1激活组合时，它会促进额外的激活、存活和增殖信号，包括IL2分泌(参见图29)。由于CD80和CD86仅由专业抗原呈递细胞(APC)天然表达，肿瘤环境中CD28共刺激的程度可能具有高度可变性。通过创建这类新颖的肿瘤靶向CD28双特异性抗体，可以模拟CD28的CD80/CD86衔接，从而提供信号2的人工来源。值得注意的是，信号可以通过肿瘤细胞的天然TCR:pMHC识别来提供，或它可由CD28双特异性抗体与CD3双特异性抗体(其可模拟信号1)的组合提供。考虑到这些概念，构思了TROP2 x CD28 bsAb，并考虑使用多种形式，其示意图概述于图15中。
3A：1 + 1 Fab-scFv-Fc形式
利用Fab结构域和scFv的一种示例性形式是1 + 1 Fab-scFv-Fc形式(示意性地描绘于图15A中)，其包含第一单体，所述第一单体包含共价连接至第一异源二聚Fc结构域的具有第一抗原结合特异性的单链Fv (“scFv”)，即scFv-结构域接头-CH2-CH3；第二单体，所述第二单体包含重链，即VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是与第一异源二聚Fc结构域互补的第二异源二聚Fc结构域；以及轻链(LC)，所述轻链被单独转染，使得与可变重链结构域形成具有第二抗原结合特异性的Fab结构域。本领域中已知的多种异源二聚化方法可用于这种(和其他)双特异性形式中，结合多种从污染性的同源二聚体中纯化异源二聚体的方法(包括图3所描绘的那些)。本领域中已知的多种接头可用于连接scFv的VH和VL结构域。最后，最大化bsAb的血清半衰期可能是有用的，并且本领域中已知的多种半衰期延长变体可用于这些bsAb中。
特别地，1 + 1 Fab-scFv-Fc bsAb可以利用图10中的骨架1或11。所述骨架利用了L368D/K370S (在HC上) : S364K/E357Q (在scFv-Fc上)异源二聚Fc变体。HC侧还包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，以增加重链的负电荷。所述scFv利用了VH与VL结构域之间带正电荷的(GKPGS)4接头(SEQ ID NO: 24)，以增加scFv-Fc链的正电荷。总的来说，这两种方法使得容易地从污染性的同源二聚体中纯化异源二聚体。这一平台中利用的FcγR消融变体是HC和scFv-Fc单体上的E233P/L234V/L235A/G236_/S267K取代。在一些情况下，bsAb包括M428L/N434S半衰期延长变体。图30描绘了呈1 + 1 Fab-scFv-Fc形式的说明性TROP2 x CD28 bsAb的序列。
3B：2 + 1 mAb-scFv形式
利用Fab结构域和scFv的另一示例性形式是2 + 1 mAb-scFv形式(示意性地描绘于图15E中，其包含第一单体，所述第一单体包含共价连接至具有第一抗原结合特异性的单链Fv (“scFv”)的第一重链，即VH-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域接头-scFv，其中CH2-CH3是第一异源二聚Fc结构域；第二单体，所述第二单体包含重链，即VH-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是与第一异源二聚Fc结构域互补的第二异源二聚Fc结构域；以及轻链(LC)，所述轻链被单独转染，使得与两个VH结构域形成具有第二抗原结合特异性的Fab结构域。特别地，1+ 1 Fab-scFv-Fc bsAb可以利用图10中的骨架1或11。所述骨架利用了L368D/K370S (在HC上) : S364K/E357Q (在HC-scFv侧)异源二聚Fc变体。HC还包括pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，以增加重链的负电荷。所述scFv利用了VH与VL结构域之间带正电荷的(GKPGS)4接头(SEQ ID NO: 24)，以增加HC-scFv链的正电荷。总的来说，这两种方法使得容易地从污染性的同源二聚体中纯化异源二聚体。这一平台中利用的FcγR消融变体是HC和scFv-Fc单体上的E233P/L234V/L235A/G236_/S267K取代。在一些情况下，bsAb包括M428L/N434S半衰期延长变体。图31描绘了呈2 + 1 mAb-scFv形式的说明性TROP2 x CD28 bsAb的序列。
3C：1 + 1共同轻链(CLC)形式
一种共同轻链形式是1 + 1共同轻链(CLC)形式(示意性地描绘于图15A中)，所述形式包含第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3；第二单体，所述第二单体包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3；以及第三单体，所述第三单体包含VL-CL。VL与VH1配对以形成具有第一抗原结合特异性的结合结构域；并且VL与VH2配对以形成具有第二抗原结合特异性的结合结构域。图38描绘了呈1 + 1 CLC形式的说明性TROP2 x CD28 bsAb (基于如此处所述的结合结构域)的序列。
3D：2 + 1共同轻链(CLC)形式
另一共同轻链形式是2 + 1 CLC形式(示意性地描绘于图15B中)，所述形式包含第一单体，所述第一单体包含VH1-CH1-接头-VH1-CH1-铰链-CH2-CH3；第二单体，所述第二单体包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3；以及第三单体，所述第三单体包含VL-CL。VL与第一和第二VH1配对以形成具有第一抗原结合特异性的结合结构域；并且VL与VH2配对以形成具有第二抗原结合特异性的结合结构域。图39描绘了呈2 + 1 CLC形式的说明性TROP2 x CD28 bsAb(基于如此处所述的结合结构域)的序列。
尽管实施例3A为1 + 1 Fab-scFv-Fc提供了特别有用的骨架(其可适用于其他形式)，本领域中已知的多种异源二聚化方法可用于所述双特异性形式中，结合多种从污染性的同源二聚体中纯化异源二聚体的方法(包括图3-4所描绘的那些)。本领域中已知的多种接头可用于连接scFv的VH和VL结构域。最后，最大化bsAb的血清半衰期可能是有用的，并且本领域中已知的多种半衰期延长变体可用于这些bsAb中。无论bsAb形式如何，CD28双特异性抗体对CD28来说都是单价的，并且并入了经工程改造以消融FcγR结合的Fc变体，以避免潜在的超激动作用。此类Fc变体包括图5所描绘的那些。
实施例4：TROP2 X CD28 bsAb在信号存在下诱导T细胞分泌细胞因子
将10,000个表达αCD3 scFv (作为信号1的替代物)的A431-ß2M缺失细胞(TROP2高)接种过夜。接着，在纯化的T细胞存在下，以10:1和1:1的E:T比率用剂量滴定的TROP2 xCD28 bsAb或PBS对照处理A431细胞。在T细胞接种后1天，使用MSD测定(Meso ScaleDiscovery, Rockville, Md.)来测量IL2分泌。图33所描绘的数据表明，具有单价和二价TROP2结合两者的TROP2 x CD28 bsAb在诱导细胞因子分泌方面具活性。
实施例5：与CD3 bsAb组合
如实施例3所述，TROP2 x CD28 bsAb预期与CD3 bsAb组合。此类CD3 bsAb可以利用如图32所描绘的CD3结合结构域。另外，TROP2 x CD28 bsAb可与TROP2 x CD3 bsAb组合(参见例如美国专利号9,382,329、美国专利号10,245,321以及Liu H, Bai L, Huang L等人Bispecific antibody targeting TROP2 x CD3 suppresses tumor growth of triplenegative breast cancer. J Immunother Cancer. 2021;9(10):e003468. doi:10.1136/jitc-2021-003468，特此以引用的方式并入)。它们还可以与其他CD3 bsAb组合。
XENP44424和XENP44505是基于新颖1F11 TROP2结合结构域的TROP2 x CD28bsAb，呈1 + 1 Fab-scFv-Fc形式(分别具有呈VHVL或VLVH取向的CD28 scFv)，与1 µg/ml的说明性B7H3 x CD3 bsAb和以下具有不同细胞密度的癌细胞系在1:10的低效应子:靶标比率下一起孵育：647-V (TROP2高)、A431 (TROP2中等)、MDA-MB-231 (TROP2低-中等)和DU145 (TROP2低-中等)，以评估效应细胞的细胞因子分泌。如图41所描绘的数据表明，两种TROP2 x CD28 bsAb均剂量依赖性地与B7H3 x CD3 bsAb有效地组合，以诱导细胞因子分泌。值得注意的是，CD3 scFv的取向并不影响活性。在一个类似的实验中，将1 µg/ml的XENP44424或XENP44505与剂量滴定的说明性B7H3 x CD3 bsAb一起孵育。如图X所描绘的数据与如图41所描绘的数据一致。
实施例6：调整TROP2 x CD28 bsAb
在替代形式中研究了TROP2 x CD28 bsAb，特别是1 + 1 CLC和2 + 1 CLC形式。此外，在2 + 1 CLC形式中，研究了第2 TROP2结合结构域的替代取向(即，堆叠在第1 TROP2结合结构域之上或CD28结合结构域之上)。另外，还研究了调整TROP2结合结构域的结合亲和力的影响。在以下实验中，研究了体现这些不同参数的分子。
在第一个实验中，将剂量滴定的TROP2 x CD28 bsAb与1 µg/ml的说明性B7H3 xCD3 bsAb和OVCAR5 (TROP2高)或pp65-MDA_MB-231癌细胞以1:1效应子:靶标比率一起孵育。图42-43和图50-51示出了描绘24小时后的IL2分泌的数据(未示出的IFNγ数据描绘了相同的趋势)。
在第二个实验中，将剂量滴定的TROP2 x CD28 bsAb与1 µ/ml的说明性B7H3 xCD3 bsAb和DU145、MCF7、OvCAR5和MDA-MB-231癌细胞以1:1效应子:靶标比率一起孵育。图44-45示出了描绘24小时后的IL2分泌的数据。图48所描绘的IFNγ数据示出了相同的趋势。
总的来说，数据表明，更紧密的TROP2亲和力变体能够实现更高的效力(例如，比较图42、图44和图50中的XENP 44595、44597和44599，它们仅在TROP2结合结构域中有所不同)。另外，2 + 1 CLC形式并未传达TROP2亲合力效应(例如，比较图42-44中的XENP44595和XENP44601)。然而，在2 + 1 CLC形式中，第2 TROP2结合结构域的取向确实很重要，因为如同XENP44869和XENP44871中将TROP2结合结构域堆叠在CD28结合结构域上会降低效力(参见图42和图50)。值得注意的是，对照RSV x CD28 bsAb XENP44623和XENP44624不具活性。
实施例7：与PD-1阻断组合
检查点阻断(例如PD-1阻断)可能是与TIL上的T细胞共刺激受体和激动剂抗体的衔接相叠加的一种有用的治疗模式，因为它将在实体肿瘤中提供广泛效用并规避CTLA4对CD28通路的抑制。因此，研究了TROP2 x CD28双特异性抗体XENP44880与XENP16432 (一种基于纳武单抗的可变区的二价抗PD-1 mAb)的组合。将剂量滴定的TROP2 x CD28 bsAb与说明性PD-1 mAb和MDA-MB-231癌细胞以10:1效应子:靶标比率一起孵育。图46描绘了24小时后的IL2分泌，并显示出，组合TROP2 x CD28 bsAb会与PD-1阻断有效地组合。
实施例8：T细胞扩增和细胞毒性
将1 µg/ml的TROP2 x CD28 bsAb XENP44599与纯化的T细胞和OVCAR5细胞的共培养物以及剂量滴定的说明性B7H3 x CD3 bsAb一起孵育。图47描绘了T细胞激活和增殖以及肿瘤细胞杀伤，并表明TROP2 x CD28改进了T细胞扩增和CD3 T细胞衔接子的细胞毒性。
实施例9：药代动力学
用具有2 nM或13 nM TROP2结合结构域的TROP2 x CD28 bsAb(分别是XENP44599和XENP44595)对食蟹猴给药。如图X所描绘，由于TMDD，具有较高TROP2亲和力的bsAb明显迅速；而另一方面，具有13 nM TROP2亲和力的bsAb则表现出好得多的血清半衰期。
实施例10：选择性
虽然TROP2在癌细胞上高度表达，但它也在正常细胞上表达。呈1 + 1 CLC形式的TROP2 x CD28 bsAb具有2、5或13 nM TROP2结合结构域和21、43或63 nM CD28结合结构域。将OvCAR5 (TROP2高)和OvCAR3 (TROP2低)与T细胞以1:1效应子:靶标比率、1 µg/ml的说明性EpCAM x CD3 bsAb和剂量滴定的TROP2 x CD28 bsAb一起孵育，其数据描绘于图X和图Y中，示出了TROP2高对TROP2低细胞系上的效力和功效偏移。
在另一项实验中，将所选的TROP2 x CD28 bsAb与说明性EpCAM x CD3 bsAb、纯化的T细胞和OVCAR5细胞一起孵育，以研究由CD28 bsAb诱导的细胞毒性和T细胞增殖。图60所描绘的数据表明，每个CD28 bsAb均剂量依赖性地诱导了靶标细胞杀伤和T细胞增殖。效力与前一实验一致。
所有引用的参考文献均明确地以引用的方式整体并入本文中。
尽管已经出于说明目的在上文描述了本发明的特定实施方案，本领域技术人员应理解，在不脱离如所附权利要求书所述的本发明的情况下可以做出许多细节变化。

Claims (97)

1.一种异源二聚抗体，所述异源二聚抗体包含：
a) 第一单体，所述第一单体包含：
i) 单链可变片段(scFv)；和
ii) 第一Fc结构域，其中所述scFv使用结构域接头共价连接至所述第一Fc结构域的N端；
b) 第二单体，所述第二单体从N端至C端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH1是第一可变重链结构域并且CH2-CH3是第二Fc结构域；以及
c) 轻链，所述轻链从N端至C端包含VL1-CL，其中VL1是第一可变轻链结构域并且CL是恒定轻链结构域，
其中所述scFv包含第二VH结构域(VH2)、scFv接头和第二可变轻链结构域(VL2)，
其中所述VH1和所述VL1一起形成第一抗原结合结构域(ABD)，并且所述VH2和所述VL2一起形成第二ABD，并且
其中所述第一ABD和第二ABD中的一者是CD28结合结构域，并且所述第一ABD和第二ABD中的另一者是肿瘤相关钙信号转导蛋白2 (TROP2)结合结构域。
2.根据权利要求1所述的异源二聚抗体，其中所述scFv从N端至C端包含VH2-scFv接头-VL2。
3.根据权利要求1所述的异源二聚抗体，其中所述scFv从N端至C端包含VL2-scFv接头-VH2。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一ABD是所述TROP2结合结构域，并且所述第二ABD是所述CD28结合结构域。
5. 根据权利要求4所述的异源二聚抗体，其中VH1和VL1选自：
(1) 图23-26和图52-56中的任何TROP2结合结构域的VH和VL或其变体；和
(2) VH，所述VH具有图36所描绘的VH或其变体的氨基酸序列；和VL，所述VL具有1F11-1A3.315 L1可变轻链结构域(参见图36A)或其变体的氨基酸序列。
6. 根据权利要求4或5所述的异源二聚抗体，其中VH2和VL2选自以下一者：
(1) 图16、图19和图22中的任何CD28结合结构域的VH和VL或其变体；或
(2) (i)图16、图17或图34中的VH或其变体；和(ii)图16、图18或图36中的VL或其变体。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和第二Fc结构域各自是变体Fc结构域。
8. 根据权利要求7所述的异源二聚抗体，其中所述第一和第二Fc结构域包含一组选自以下异源二聚化变体的异源二聚化偏斜变体：S364K/E357Q : L368D/K370S；S364K :L368D/K370S；S364K : L368E/K370S；D401K: T411E/K360E/Q362E；以及T366W : T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号。
9. 根据权利要求8所述的异源二聚抗体，其中所述第一和第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q : L368D/K370S，其中编号是根据EU编号。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一和第二Fc结构域各自包含一个或多个消融变体。
11.根据权利要求10所述的异源二聚抗体，其中所述一个或多个消融变体包含E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号。
12.根据权利要求7-11中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一或第二单体中的一者还包含一个或多个pI变体。
13.根据权利要求12所述的异源二聚抗体，其中所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号。
14.根据权利要求7至13中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，
其中所述第一Fc结构域包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/S364K/E357Q，
并且其中编号是根据EU编号。
15.根据权利要求8-14中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一和第二变体Fc结构域各自还包含氨基酸变体428L/434S。
16. 根据权利要求1至15中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述scFv接头是GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS (SEQ ID NO: 24)。
17.一种异源二聚抗体，所述异源二聚抗体包含：
a) 第一单体，所述第一单体从N端至C端包含VH1-CH1-第一结构域接头-scFv-第二结构域接头-CH2-CH3，
其中VH1是第一可变重链结构域，并且CH2-CH3是第一Fc结构域；
b) 第二单体，所述第二单体从N端至C端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中CH2-CH3是第二Fc结构域；和
c) 第一轻链，所述第一轻链从N端至C端包含VL1-CL，其中VL1是第一可变轻链结构域并且CL是恒定轻链结构域；以及
d) 第二轻链，所述第二轻链从N端至C端包含VL1-CL，其中VL1是第一可变轻链结构域并且CL是恒定轻链结构域；
其中所述scFv包含第二VH结构域(VH2)、scFv接头和第二可变轻链结构域(VL2)，
其中所述第一单体的VH1与所述第一轻链的VL1以及所述第二单体的VH1与所述第二轻链的VL1各自形成第一抗原结合结构域(ABD)，并且所述VH2与所述VL2形成第二ABD，
其中所述第一ABD和第二ABD中的一者是CD28结合结构域，并且所述第一ABD和第二ABD中的另一者是间皮素(TROP2)结合结构域。
18.根据权利要求17所述的异源二聚抗体，其中所述scFv从N端至C端包含VH2-scFv接头-VL2。
19.根据权利要求17所述的异源二聚抗体，其中所述scFv从N端至C端包含VL2-scFv接头-VH2。
20.根据权利要求17至19中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一ABD是所述TROP2结合结构域，并且所述第二ABD是所述CD28结合结构域。
21.根据权利要求20所述的异源二聚抗体，其中VH1和VL1是图23-26和图52-56中的任何TROP2结合结构域VH和VL的VH和VL或其变体。
22. 根据权利要求20或21所述的异源二聚抗体，其中VH2和VL2选自以下一者：
(1) 图16、图19和图22中的任何CD28结合结构域的VH和VL或其变体；或
(2) (i)图16、图17或图34中的VH或其变体；和(ii)图16、图18或图36中的VL或其变体。
23.根据权利要求17至22中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和第二Fc结构域各自是变体Fc结构域。
24. 根据权利要求23所述的异源二聚抗体，其中所述第一和第二Fc结构域包含一组选自以下异源二聚化变体的异源二聚化偏斜变体：S364K/E357Q : L368D/K370S；S364K :L368D/K370S；S364K : L368E/K370S；D401K: T411E/K360E/Q362E；以及T366W : T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号。
25. 根据权利要求24所述的异源二聚抗体，其中所述第一和第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q : L368D/K370S，其中编号是根据EU编号。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一和第二Fc结构域各自包含一个或多个消融变体。
27.根据权利要求26所述的异源二聚抗体，其中所述一个或多个消融变体包含E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号。
28.根据权利要求23-27中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一或第二单体中的一者还包含一个或多个pI变体。
29.根据权利要求28所述的异源二聚抗体，其中所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号。
30.根据权利要求23至29中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，
其中所述第一Fc结构域包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/S364K/E357Q，
并且其中编号是根据EU编号。
31.根据权利要求24-30中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一和第二变体Fc结构域各自还包含氨基酸变体428L/434S。
32. 根据权利要求17至31中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述scFv接头是GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS (SEQ ID NO: 24)。
33.一种异源二聚抗体，所述异源二聚抗体包含：
a) 第一单体，所述第一单体从N端至C端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3-结构域接头-scFv，
其中VH1是第一可变重链结构域，并且CH2-CH3是第一Fc结构域；
b) 第二单体，所述第二单体从N端至C端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH1是第一可变重链结构域并且CH2-CH3是第二Fc结构域；以及
c) 第一轻链，所述第一轻链从N端至C端包含VL1-CL，其中VL1是第一可变轻链结构域并且CL是恒定轻链结构域；以及
d) 第二轻链，所述第二轻链从N端至C端包含VL1-CL，其中VL1是第一可变轻链结构域并且CL是恒定轻链结构域，
其中所述scFv包含第二VH结构域(VH2)、scFv接头和第二可变轻链结构域(VL2)，
其中所述第一单体的VH1与所述第一轻链的VL1以及所述第二单体的VH1与所述第二轻链的VL1各自形成第一抗原结合结构域(ABD)，并且所述VH2与所述VL2形成第二ABD，并且
其中所述第一和第二ABD中的一者结合人CD28，并且所述第一和第二ABD中的另一者结合TROP2。
34.根据权利要求33所述的异源二聚抗体，其中所述scFv从N端至C端包含VH2-scFv接头-VL2。
35.根据权利要求33所述的异源二聚抗体，其中所述scFv从N端至C端包含VL2-scFv接头-VH2。
36.根据权利要求33至35中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一ABD是所述TROP2结合结构域，并且所述第二ABD是所述CD28结合结构域。
37.根据权利要求36所述的异源二聚抗体，其中VH1和VL1是图23-26和图52-56中的任何TROP2结合结构域VH和VL的VH和VL或其变体。
38. 根据权利要求36或37所述的异源二聚抗体，其中VH2和VL2选自以下一者：
(1) 图16、图19和图22中的任何CD28结合结构域的VH和VL或其变体；或
(2) (i)图16、图17或图34中的VH或其变体；和(ii)图16、图18或图36中的VL或其变体。
39.根据权利要求33至38中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一Fc结构域和第二Fc结构域各自是变体Fc结构域。
40. 根据权利要求39所述的异源二聚抗体，其中所述第一和第二Fc结构域包含一组选自以下异源二聚化变体的异源二聚化偏斜变体：S364K/E357Q : L368D/K370S；S364K :L368D/K370S；S364K : L368E/K370S；D401K: T411E/K360E/Q362E；以及T366W : T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号。
41. 根据权利要求40所述的异源二聚抗体，其中所述第一和第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q : L368D/K370S，其中编号是根据EU编号。
42.根据权利要求39-41中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一和第二Fc结构域各自包含一个或多个消融变体。
43.根据权利要求42所述的异源二聚抗体，其中所述一个或多个消融变体包含E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号。
44.根据权利要求39-43中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一或第二单体中的一者还包含一个或多个pI变体。
45.根据权利要求44所述的异源二聚抗体，其中所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号。
46.根据权利要求39至45中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，
其中所述第一Fc结构域包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/S364K/E357Q，
并且其中编号是根据EU编号。
47.根据权利要求40-46中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一和第二变体Fc结构域各自还包含氨基酸变体428L/434S。
48. 根据权利要求33至47中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述scFv接头是GKPGSGKPGSGKPGSGKPGS (SEQ ID NO: 24)。
49. 一种双特异性抗体，所述双特异性抗体包含：
a) TROP2结合结构域，所述结构域包含i)第一可变重链结构域(VH1)，和ii)第一可变轻链结构域(VL1)；和
b) 抗CD28结合结构域，所述结构域包含i)第二可变重链结构域(VH2)，和ii)第二可变轻链结构域(VL2)。
50.如权利要求49所述的双特异性抗体，其中VH1和VL1是图23-26和图52-56中的任何TROP2结合结构域VH和VL的VH和VL或其变体。
51. 根据权利要求49或50所述的双特异性抗体，其中VH2和VL2选自以下一者：
(1) 图16、图19和图23中的任何CD28结合结构域的VH和VL或其变体；或
(2) (i)图17中的VH或其变体；和(ii)图18中的VL或其变体。
52.根据权利要求49-51中任一项所述的双特异性抗体，其中双特异性抗体还包含第一Fc结构域和第二Fc结构域。
53. 根据权利要求52所述的双特异性抗体，其中所述第一和第二Fc结构域包含一组选自以下异源二聚化变体的异源二聚化偏斜变体：S364K/E357Q : L368D/K370S；S364K :L368D/K370S；S364K : L368E/K370S；D401K: T411E/K360E/Q362E；以及T366W : T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号。
54. 根据权利要求53所述的双特异性抗体，其中所述第一和第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q : L368D/K370S，其中编号是根据EU编号。
55.根据权利要求52-54中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一和第二Fc结构域各自包含一个或多个消融变体。
56.根据权利要求55所述的双特异性抗体，其中所述一个或多个消融变体包含E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号。
57.根据权利要求52-56中任一项所述的双特异性抗体，其中所述第一或第二单体中的一者还包含一个或多个pI变体。
58.根据权利要求57所述的双特异性抗体，其中所述pI变体是N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号。
59.一种核酸组合物，所述核酸组合物包含：
a) 第一核酸，所述第一核酸编码如权利要求1-48中任一项所述的第一单体；
b) 第二核酸，所述第二核酸编码如权利要求1-48中任一项所述的第二单体；以及
c) 第三核酸，所述第三核酸编码如权利要求1-16中任一项所述的轻链或如权利要求17-48中任一项所述的第一和第二轻链。
60.一种表达载体组合物，所述表达载体组合物包含：分别地，
a) 第一表达载体，所述第一表达载体包含如权利要求59所述的第一核酸；
b) 第二表达载体，所述第二表达载体包含如权利要求59所述的第二核酸；以及
c) 第三表达载体，所述第三表达载体包含如权利要求59所述的第三核酸。
61.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求60所述的表达载体组合物。
62.一种制备根据权利要求1-48中任一项所述的异源二聚抗体的方法，所述方法包括在其中表达所述异源二聚抗体的条件下培养如权利要求61所述的宿主细胞，和回收所述异源二聚抗体。
63.一种治疗有需要的患者的TROP2相关癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用根据权利要求1-48中任一项所述的异源二聚抗体。
64. 一种治疗有需要的患者的TROP2相关癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用根据权利要求1-48中任一项所述的异源二聚抗体；和抗CD3 x抗TROP2双特异性抗体。
65.一种治疗有需要的患者的TROP2相关癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用根据权利要求49-58中任一项所述的双特异性抗体。
66. 一种治疗有需要的患者的TROP2相关癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用根据权利要求49-58中任一项所述的双特异性抗体；和抗CD3 x抗TROP2双特异性抗体。
67.一种多价抗体，所述多价抗体包含：
a) 第一单体，所述第一单体从N端至C端包含VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH1是第一可变重链结构域并且CH2-CH3是第一Fc结构域；
b) 第二单体，所述第二单体从N端至C端包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH2是第二可变重链结构域并且CH2-CH3是第二Fc结构域；
c) 第一共同轻链和第二共同轻链，所述共同轻链各自包含VL-CL，其中VL是可变结构域并且CL是恒定轻链结构域；
其中所述VH1和所述第一共同轻链的VL形成第一抗原结合结构域(ABD)，并且所述VH2和所述第二共同轻链的VL一起形成第二ABD，
其中所述第一共同轻链和第二共同轻链具有相同的氨基酸序列，并且
其中所述第一ABD和第二ABD中的一者是CD28结合结构域，并且所述第一ABD和第二ABD中的另一者是肿瘤相关钙信号转导蛋白2 (TROP2)结合结构域。
68.根据权利要求67所述的多价抗体，其中所述第一ABD是所述TROP2结合结构域，并且所述第二ABD是所述CD28结合结构域。
69.根据权利要求68所述的多价抗体，其中VH1是图36或图52-56中的可变重链结构域，VH2是图34中的可变重链结构域，并且所述第一和第二共同轻链的VL是1F11-1A3.315[TROP2]_L1可变轻链结构域(参见图36A)。
70.根据权利要求67至69中任一项所述的多价抗体，其中所述第一Fc结构域和第二Fc结构域各自是变体Fc结构域。
71. 根据权利要求70所述的多价抗体，其中所述第一和第二Fc结构域包含一组选自以下异源二聚化变体的异源二聚化偏斜变体：S364K/E357Q : L368D/K370S；S364K : L368D/K370S；S364K : L368E/K370S；D401K: T411E/K360E/Q362E；以及T366W : T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号。
72. 根据权利要求71所述的多价抗体，其中所述第一和第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q : L368D/K370S，其中编号是根据EU编号。
73.根据权利要求70-72中任一项所述的多价抗体，其中所述第一和第二Fc结构域各自包含一个或多个消融变体。
74.根据权利要求73所述的多价抗体，其中所述一个或多个消融变体包含E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号。
75.根据权利要求71-74中任一项所述的多价抗体，其中所述第一或第二单体中的一者还包含一个或多个pI变体。
76.根据权利要求75所述的多价抗体，其中所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号。
77.根据权利要求70至76中任一项所述的多价抗体，其中所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，
其中所述第一Fc结构域包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/S364K/E357Q，
并且其中编号是根据EU编号。
78.根据权利要求71-77中任一项所述的异源二聚抗体，其中所述第一和第二变体Fc结构域各自还包含氨基酸变体428L/434S。
79.一种多价抗体，所述多价抗体包含：
a) 第一单体，所述第一单体从N端至C端包含VH1-CH1-接头-VH1-CH1-铰链-CH2-CH3，其中所述VH1各自是第一可变重链结构域，并且CH2-CH3是第一Fc结构域；
b) 第二单体，所述第二单体从N端至C端包含VH2-CH1-铰链-CH2-CH3，其中VH2是第二可变重链结构域并且CH2-CH3是第二Fc结构域；
c) 第一共同轻链、第二共同轻链以及第三共同轻链，所述共同轻链各自包含VL-CL，其中VL是可变结构域并且CL是恒定轻链结构域；
其中所述第一单体的VH1各自与所述第一共同轻链或第二共同轻链的VL配对以形成两个第一抗原结合结构域(ABD)，并且所述VH2和所述第三共同轻链的VL形成第二ABD，
其中所述第一共同轻链、第二共同轻链以及第三共同轻链各自具有相同的氨基酸序列，并且
其中所述第一ABD各自是CD28结合结构域，并且所述第二ABD是肿瘤相关钙信号转导蛋白2 (TROP2)结合结构域，或者所述第一ABD各自是TROP2结合结构域，并且所述第二ABD是CD28结合结构域。
80.根据权利要求79所述的多价抗体，其中所述第一ABD各自是TROP2结合结构域，并且所述第二ABD是所述CD28结合结构域。
81.根据权利要求80所述的多价抗体，其中所述VH1各自是图36中的可变重链结构域，VH2是图34或图52-56中的可变重链结构域，并且所述第一、第二以及第三共同轻链的VL是1F11-1A3.315[TROP2]_L1可变轻链结构域(参见图36A)。
82.根据权利要求79至81中任一项所述的多价抗体，其中所述第一Fc结构域和第二Fc结构域各自是变体Fc结构域。
83. 根据权利要求82所述的多价抗体，其中所述第一和第二Fc结构域包含一组选自以下异源二聚化变体的异源二聚化偏斜变体：S364K/E357Q : L368D/K370S；S364K : L368D/K370S；S364K : L368E/K370S；D401K : T411E/K360E/Q362E；以及T366W : T366S/L368A/Y407V，其中编号是根据EU编号。
84. 根据权利要求83所述的多价抗体，其中所述第一和第二Fc结构域包含异源二聚化偏斜变体S364K/E357Q : L368D/K370S，其中编号是根据EU编号。
85.根据权利要求82-84中任一项所述的多价抗体，其中所述第一和第二Fc结构域各自包含一个或多个消融变体。
86.根据权利要求85所述的多价抗体，其中所述一个或多个消融变体包含E233P/L234V/L235A/G236del/S267K，其中编号是根据EU编号。
87.根据权利要求83-86中任一项所述的多价抗体，其中所述第一或第二单体中的一者还包含一个或多个pI变体。
88.根据权利要求87所述的多价抗体，其中所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含pI变体N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，其中编号是根据EU编号。
89.根据权利要求82至88中任一项所述的多价抗体，其中所述第二单体的CH1-铰链-CH2-CH3包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/L368D/K370S/N208D/Q295E/N384D/Q418E/N421D，
其中所述第一Fc结构域包含氨基酸变体E233P/L234V/L235A/G236del/S267K/S364K/E357Q，
并且其中编号是根据EU编号。
90.根据权利要求83-89中任一项所述的多价抗体，其中所述第一和第二变体Fc结构域各自还包含氨基酸变体428L/434S。
91.一种核酸组合物，所述核酸组合物包含：
a) 第一核酸，所述第一核酸编码如权利要求67-90中任一项所述的第一单体；
b) 第二核酸，所述第二核酸编码如权利要求67-90中任一项所述的第二单体；以及
c) 第三核酸，所述第三核酸编码如权利要求67-90中任一项所述的共同轻链。
92.一种表达载体组合物，所述表达载体组合物包含：分别地，
a) 第一表达载体，所述第一表达载体包含如权利要求91所述的第一核酸；
b) 第二表达载体，所述第二表达载体包含如权利要求91所述的第二核酸；以及
c) 第三表达载体，所述第三表达载体包含如权利要求91所述的第三核酸。
93.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求92所述的表达载体组合物。
94.一种制备根据权利要求67-90中任一项所述的多价抗体的方法，所述方法包括在其中表达所述异源二聚抗体的条件下培养如权利要求93所述的宿主细胞，和回收所述异源二聚抗体。
95.一种治疗有需要的患者的TROP2相关癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用根据权利要求67-90中任一项所述的异源二聚抗体。
96. 一种治疗有需要的患者的TROP2相关癌症的方法，所述方法包括向所述患者施用根据权利要求67-90中任一项所述的异源二聚抗体；和抗CD3 x抗TROP2双特异性抗体。
97. 一种TROP-2结合构建体，其包含可变重链结构域和可变轻链结构域，所述结构域选自以下：
(1) 图23-26和图52-56中的任何TROP2结合结构域VH和VL的VH和VL或其变体；和
(2) 图36所描绘的VH或其变体，和1F11-1A3.315 L1 VL (参见图36A)或其变体。
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