CN121311226A

CN121311226A - 聚adp核糖聚合酶(parp)抑制剂在治疗癌症中的新用途

Info

Publication number: CN121311226A
Application number: CN202480032687.9A
Authority: CN
Inventors: T·C·吴; A·帕斯托; A·R·阿万
Original assignee: Texano Ltd
Current assignee: Texano Ltd
Priority date: 2023-05-17
Filing date: 2024-05-15
Publication date: 2026-01-09
Also published as: WO2024238587A1

Abstract

本发明涉及使用从患者衍生的类器官获得的信息来个性化癌症治疗的方法。可以使用IC50值(仅在类器官肿瘤细胞中测量)、用PARP抑制剂和DMSO处理的肿瘤细胞之间的细胞活力比率(在免疫细胞存在下测量)、从用铂疗法或PARP抑制剂治疗的患者衍生的类器官进行处理确定的外泌体DNA‑染色质复合物中的DNA长度，或通过对先前疗法的应答来确定个性化的治疗方案。

Description

聚ADP核糖聚合酶(PARP)抑制剂在治疗癌症中的新用途

技术领域

本发明涉及使用从患者衍生的类器官获得的信息来个性化癌症治疗的方法。可以使用IC50值(仅在类器官肿瘤细胞中测量)、用PARP抑制剂和DMSO处理的肿瘤细胞之间的细胞活力比率(在免疫细胞存在下测量)、从用铂疗法或PARP抑制剂治疗的患者衍生的类器官进行处理确定的外泌体DNA-染色质复合物中的DNA长度，或通过对先前疗法的应答来确定个性化的治疗方案。

背景技术

癌症是一个严重的公共健康问题，仅在2009年，US的562,340人死于癌症。癌症治疗中的主要挑战之一是识别患者癌症的临床有用特征，并且然后基于这些特征，施用最适合于患者癌症的治疗计划。

免疫检查点阻断(ICB)是很有前途的新型癌症疗法。然而，迄今为止，仅一小部分患者(范围为20%至40% (Robert, 2020, Nature Communications, 11: 3801))受益于对给定免疫治疗性疗法的完全和持久应答。这种不同的应答与不同类型癌症(基于浸润性免疫细胞的比率分类为热(发炎的)或冷(非发炎的)，并与蛋白质/免疫检查点标志物的总表达水平相关)间的免疫浸润差异相关。

临床上已经尝试使用热癌症表型或冷癌症表型和免疫检查点的高表达或低表达来对患者进行分层并预测治疗进程。迄今为止，这种方法已经取得了有限的成功。这可能反映了免疫检查点蛋白相互作用网络的复杂性，该相互作用网络不仅涉及PD-1、PD-L1、CTLA4、CD80，还涉及其他共抑制受体，诸如TIM3、TIGIT、CD96和PVRIG。

继发性癌细胞系和异种移植模型已经长期用作癌症的模型。然而，这些模型不能够预测患者对特定抗癌治疗的结果从而促进个性化医疗。

继发性细胞系不能够预测对疗法的应答，因为它们是高度突变的，并且不再准确反映原发性肿瘤。此外，由于培养物的性质，细胞错过了将在肿瘤微环境中发生的关键细胞间相互作用。异种移植物更能反映它们所基于的肿瘤，尽管生长异种移植物所花费的时间(通常为4-6个月)使它们与早期治疗应答预测不相容。

为了克服这些障碍，已经建立了称为类器官的三维(3D)培养物。类器官是衍生自原发性人肿瘤组织的体外3D细胞聚集体，其类似于原发性组织的建筑结构。实际上，类器官是从嵌入到3D基底膜基质(BME，Matrigel)中的原发赘生性细胞生成的，该3D基底膜基质允许细胞与细胞间和细胞与基质间的如在肿瘤组织中进行组织。已经显示，衍生自多种肿瘤类型的类器官保留了原发性肿瘤中所见的突变情形。重要的是，已经显示，类器官的基因表达谱(profile)在类器官中稳定1-4个月。由于这个原因，类器官有时被称为患者肿瘤的生物双胞胎。

类器官可以在正常癌症疗法的时间框架内(6-9周，相当于例如3-4个疗法周期)衍生。这意味着来自类器官的离体应答数据可以用于个性化治疗用于其生成的肿瘤。例如，Yao及同事已经表明，衍生自原发性直肠肿瘤的类器官对放射疗法的敏感性/抗性与临床中患者的应答相关(Cell Stem Cell 2020, 26(1): 17- 26)。还证明了伊立替康治疗后来自转移性结直肠癌(mCRC)患者的类器官的生长率抑制对于mCRC患者的RECIST应答是预测性的(Ooft et al. Sci. Transl. Med., 2019,11:513)。迄今为止，类器官代表了预测患者对用于个性化医疗的药物的应答的最有前景的平台(综述于Corsini & Knoblich, 2022,Cell, 185: 2756-2769)。

为个体癌症患者鉴定合适治疗的新方法受到急切期待。

发明内容

在第一方面，本发明提供了用于治疗人患者的癌症的方法，其中：

a)当癌症的特征在于对PARP抑制剂具有<1.2 μM的IC50时，用PARP抑制剂治疗患者；或者

b)当癌症的特征在于对PARP抑制剂具有>1.2 μM的IC50时，用PARP抑制剂和PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗患者。

在第二方面，本发明提供了用于治疗人患者的癌症的方法，其中：

a)当癌症的特征在于具有>1.1的外泌体DNA长度比率(PARP抑制剂/DMSO)时，用PARP抑制剂治疗患者；或者

当癌症的特征在于具有<1.1的外泌体DNA长度比率(PARP抑制剂/DMSO)时，用PARP抑制剂和PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗患者。

在第三方面，本发明提供了治疗人患者的癌症的方法，其中患者先前对铂疗法没有应答，其中用PARP抑制剂和PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗患者。

在第四方面，本发明提供了用于治疗人患者的癌症的方法，其中：

a)当癌症的特征在于具有<0.75的肿瘤细胞活力比率(PARP抑制剂/DMSO)时，用PARP抑制剂治疗患者；或者

b)当癌症的特征在于具有>0.75的肿瘤细胞活力比率(PARP抑制剂/DMSO)时，用PARP抑制剂和PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗患者。

在本文描述的发明的上下文中，术语PARP抑制剂指聚(ADP-核糖)聚合酶活性的抑制剂。应注意，提及PARP抑制剂还包括提及其药学上可接受的盐。换句话说，“PARP抑制剂”与“PARP抑制剂或其药学上可接受的盐”同义。

在相关的方面，本发明提供了用于确定对患有癌症的人患者合适的治疗方案的方法。

在进一步的方面，本发明提供了用于在用测试药物处理后确定癌症的治疗方案的一般方法，其包括以下步骤：

a)在存在或不存在测试药物的条件下培养衍生自所述癌症的患者衍生的类器官；

b)将患者衍生的类器官与活化的外周血单核细胞共培养；

c)确定在用测试药物处理后在浸润性免疫细胞和/或类器官肿瘤细胞上选择性上调的蛋白质；和

d)将合适的治疗方案确定为用测试药物和用c)中上调的蛋白质的调节剂进行的治疗。

附图说明

图1示出了多模态测定工作流程。在第0天，接种患者衍生的类器官(PDO)。5-7天后(根据每个样品的增殖速率)，PDO用尼拉帕利(1.4 μM)或DMSO (作为对照)处理7天。平行地，用不同剂量的尼拉帕利以及DMSO处理板以进行细胞毒性评价。在处理结束时，收集培养基用于外泌体分离，以允许评价DNA长度和蛋白质表达。对PDO的一部分进行RNA提取以用于qRT-PCR和RNAseq分析，并且将其余部分与预活化的免疫细胞共培养。48小时后，分别通过流式细胞术和multiplex IF进行免疫表型分析和蛋白质组分析。

图2A-2B显示了对尼拉帕利处理的应答和IC50值。A)处理期结束时尼拉帕利处理的PDO的代表性图片。上图显示了尼拉帕利耐药性PDO，而下图显示了对尼拉帕利更敏感的PDO。B)从6种不同头颈(HN)癌PDO和4种不同非小细胞肺癌(Lu-P) PDO确定的尼拉帕利IC50值。

图3A-3E提供了关于PDO中免疫细胞浸润的信息。A、C)在DMSO或尼拉帕利(Nir)处理1周并与免疫细胞共培养48小时后，敏感性(A)或耐药性(C)PDO中EpCAM和CD45表达的流式细胞术分析。B、D)用DMSO或尼拉帕利处理1周并与免疫细胞(鉴定为CD45阳性)共培养48小时后，敏感性(B)和耐药性(D) PDO的多重成像的代表性图片。比例尺50 μm。E) DMSO或尼拉帕利处理的PDO的免疫细胞浸润的流式细胞术分析；数据表示为n=10个样品(n=6个HNSCC和n=4个NSCLC PDO)中CD45阳性细胞的百分比。

图4A-4B显示浸润尼拉帕利耐药性PDO的CD4阳性T细胞上调PD1表达。A)流式细胞术分析单独培养的CD4阳性细胞(从底部开始的第一个峰)或在预处理的PDO存在下培养的CD4阳性细胞上的PD1表达(从底部开始的第二个峰指示浸润PDO的免疫细胞亚群，并且从底部开始的第三个峰指示未浸润PDO的相同亚群)。尼拉帕利(Nir)敏感性PDO和耐药性PDO的代表性图。B)尼拉帕利IC50值与浸润(左图)和未浸润(右图)PDO的CD4阳性细胞中PD1表达之间的相关性图；n=5个HNSCC和n=2个NSCLC PDO。

图5A-5C显示尼拉帕利处理后与PBMC共培养的尼拉帕利耐药性PDO中PDL1上调。A)用尼拉帕利(Nir)或对照(DMSO)处理然后与活化的PBMC共培养48小时的耐药性PDO的多重成像分析的代表性图片。比例尺100 μm。右侧是从玻片/条件中的所有PDO分析的平均PDL1信号强度的直方图。B)与活化的PBMC共培养或者单独放置48小时的用尼拉帕利(NIR)或DMSO (作为对照)处理的耐药性PDO中PDL1表达的流式细胞术分析。数据表示为来自n=3个HNSCC和n=4个NSCLC PDO的平均荧光强度(MFI)。C)在n=3个HNSCC和n=2个NSCLC PDO中通过流式细胞术和多重成像评价的PDL1表达之间的相关性。

图6A-6B显示exoDNA长度与PDO中尼拉帕利IC50相关。A)显示在3个耐药性和3个敏感性HNSCC PDO中从尼拉帕利或DMSO处理的PDO分离的exoDNA长度的图。在每个图下为对应的IC50值。B)显示所有6个HNSCC (HN)和3个NSCLC (Lu-P) PDO的尼拉帕利IC50值与exoDNA长度之间相关性的图。

图7A-7C显示PDO对尼拉帕利和顺铂的应答相似。A-B)在4个耐药性(A，3个HNSCC和1个NSCLC) PDO和2个敏感性(B，HNSCC) PDO中以不同药物剂量(尼拉帕利为0、0.25、0.5、1、2和10 μM；顺铂为0.4、1.1、3.3、10和30 μM)处理6天后评价的顺铂(空点)和尼拉帕利(灰色三角形)的剂量应答曲线。C)药物处理6天后，顺铂或尼拉帕利在5个HNSCC (HN) PDO和1个NSCLC (Lu-P) PDO中的IC50值之间的相关性，Spearman r为0.8857，P(双尾)为0.033*。

图8A-8C显示PDO对尼拉帕利和顺铂的应答相似。A)从用顺铂或尼拉帕利或对照处理的代表性耐药性(HNX40) PDO和敏感性(HNX29) PDO分离的exoDNA的长度。B)浸润盐水或顺铂处理的PDO的CD45阳性细胞的流式细胞术分析；数据表示为n=5个样品中CD45阳性细胞的百分比。样品描述：根据尼拉帕利IC50值分类为敏感的n=1个NSCLC和耐药的n=4个(3个NSCLC和1个HNSCC)。C)与活化的PBMC共培养或单独放置48小时的用顺铂或盐水溶液(作为对照)处理的耐药性PDO中PD-L1表达的流式细胞术分析。数据表示为来自n=1个HNSCC和n=3个NSCLC PDO的平均荧光强度(MFI)。

图9显示了在对尼拉帕利敏感和耐药的PDO中，在用1.4 μM尼拉帕利或DMSO(作为对照)处理7天并与PBMC共培养48小时后，通过流式细胞术分析计算为EpCAM阳性细胞内活细胞的百分比的细胞活力。n=10个样品(n=6个HNSCC PDO和n=4个NSCLC PDO)。

具体实施方式

实施例和图3显示，施用PARP抑制剂尼拉帕利(niraparib)对患者衍生的类器官具有如下两种离散的效应：

1)细胞毒性效应，其可以通过IC50测量。

2)对CD45阳性细胞浸润到患者衍生的类器官中的效应。

实施例和图3显示，这些效应不是相互独立的，而是浸润效应取决于细胞毒性效应，使得在具有高IC50的患者中，尼拉帕利治疗导致增加的CD45阳性细胞浸润，而在具有低IC50的患者中，尼拉帕利治疗导致减少的CD45阳性细胞的浸润。基于来自多种肿瘤类型的大量患者衍生的类器官观察到增加的浸润的IC50拐点为1.2 μM。

虽然众所周知，尼拉帕利通过经由碱基切除途径破坏单链断裂修复来导致细胞死亡，但其触发CD45阳性细胞浸润的机制尚不清楚。然而，不受理论束缚，这种效应可能是由尼拉帕利处理触发的细胞因子或外泌体释放引起的。一种可能的解释是，在尼拉帕利耐药肿瘤中，尼拉帕利处理诱导的DNA损伤不足以引发细胞死亡。在这些细胞中，损伤可以通过释放外泌体DNA-染色质导致先天免疫应答的激活，外泌体DNA-染色质经由导致I型干扰素(IFN)释放的环GMP-AMP合成酶-干扰素基因的刺激因子(cGAS-STING)途径感知。因此，干扰素释放可能导致图3中观察到的CD45阳性细胞浸润增加。即使情况并非如此，1型干扰素也可能是最终导致CD45阳性细胞浸润的在肿瘤中发生的变化的生物标志物。此外，如下文进一步讨论的，cGAS-STING途径的激活还可以通过外泌体DNA释放以依赖于外泌体中DNA长度的方式进行修改。因此，外泌体DNA长度可以形成最终导致CD45阳性细胞浸润的在肿瘤中发生的变化的另一生物标志物。

如说明书的背景技术中所解释的，高水平的T细胞浸润与“热”癌症表型相关联。对于对尼拉帕利具有高IC50的患者的尼拉帕利治疗在尼拉帕利治疗后展示出CD45阳性细胞浸润水平增加的观察结果证明该患者群体可能受益于免疫治疗性疗法。已经评估了许多患者衍生的类器官，并且从流式细胞术数据计算浸润性CD45细胞的增加或减少。该分析允许我们确定阈值比率，从而允许我们区别敏感样品与耐药样品。该阈值(与CD45阳性细胞浸润的增加和热表型的诱导相关)计算为1.2 μM的IC50。来自额外的患者衍生的类器官的数据可以使得该阈值能够被细化，但是相信阈值落在1-1.5 μM的范围内，更特别地是1.2-1.5 μM。

图4显示浸润的CD45阳性细胞展示出高水平的PD1表达，并且图5显示尼拉帕利耐药患者衍生的类器官展示出高水平的PD-L1或PD-L1上调，这清楚地表明PD1/PD-L1信号传导途径在展示出大于阈值水平的尼拉帕利IC50值的癌症中的作用。相信阻断该信号传导途径将在这些类型的癌症中提供治疗性益处，并且广义上讲在衍生出PDO的患者中提供治疗性益处。

鉴于其共同的作用机制，有理由预期用其他PARP抑制剂处理患者衍生的类器官将导致细胞毒性、外泌体DNA变化(这反过来又与cGAS-STING途径相关)和免疫细胞浸润。

这些观察可以用于确定有效的个性化癌症疗法。

相应地，在第一方面，本发明提供了用于治疗人患者的癌症的方法，其中：

在另一方面，本发明提供了PARP抑制剂，其用于治疗人患者的癌症，其中：

在进一步的方面，本发明提供了PARP抑制剂在制备用于在治疗人患者的癌症中使用的药物中的用途，其中：

在替代性的方面，确定治疗方案的性质的IC50阈值是1.0 μM。在另一方面，确定治疗方案的性质的IC50阈值是1.1 μM。在另一方面，确定治疗方案的性质的IC50阈值是1.3 μM。在另一方面，确定治疗方案的性质的IC50阈值是1.4 μM。在另一方面，确定治疗方案的性质的IC50阈值是1.5 μM。

通过确定来自患者衍生的类器官的PARP抑制剂的IC50来确定治疗方案的性质。患者衍生的类器官可以使用本领域已知的方法容易地获得，并且实际上，用于提供患者衍生的类器官的服务在优先权日是商业上可获得的(例如CELLphenomics)。患者衍生的类器官对PARP抑制剂的IC50可以通过本领域普通技术人员已知的方法来确定。在一个实施方案中，在用PARP抑制剂处理患者衍生的类器官7天后，从剂量应答曲线确定IC50。在其中PARP抑制剂是尼拉帕利的更具体的实施方案中，在用尼拉帕利或其药学上可接受的盐处理患者衍生的类器官7天后，从剂量应答曲线确定IC50。实施例中提供了确定IC50的合适方法。虽然实施例涉及PARP抑制剂尼拉帕利，但可以使用类似的方法来确定其他PARP抑制剂的IC50。

在癌症的特征在于对PARP抑制剂具有<1.2 μM (或替代性阈值)的IC50的实施方案中，用PARP抑制剂治疗患者。

本文进一步描述了合适的PARP抑制剂和治疗方案。

在一个实施方案中，所选的用于治疗的PARP抑制剂是用于IC50计算的PARP抑制剂。例如，尼拉帕利或其药学上可接受的盐用于治疗对尼拉帕利或其药学上可接受的盐具有<1.2 μM (或替代性阈值)的IC50的癌症。

在癌症的特征在于对PARP抑制剂具有>1.2 μM (或替代性阈值)的IC50的实施方案中，用PARP抑制剂和PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗患者。PARP抑制剂和PD1抑制剂或PD-L1抑制剂可以一起施用或分别施用，并且当分别施用时，施用可以以任何顺序同时发生或序贯发生。在一个实施方案中，在用PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗之前，用PARP抑制剂治疗患者。在替代性实施方案中，患者在同一时间段内用PARP抑制剂和PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗。

本文进一步描述了合适的PARP抑制剂、PD1抑制剂、PD-L1抑制剂和治疗方案。

在一个实施方案中，所选的用于治疗的PARP抑制剂是用于IC50计算的PARP抑制剂。例如，尼拉帕利或其药学上可接受的盐用于治疗对尼拉帕利或其药学上可接受的盐具有>1.2 μM (或替代性阈值)的IC50的癌症。

本文进一步描述了合适的PD-L1抑制剂和PD1抑制剂。

癌症疫苗可以用于引发免疫应答以识别由癌症产生的肿瘤特异性抗原(新抗原)。WO2020/097291描述了使用包含多种患者/肿瘤特异性新抗原的个性化癌症疫苗来提高识别这些新抗原的患者T细胞的数量和抗肿瘤活性的方法。此外，KEYNOTE-942试验已经证明了这种方法在III/IV期黑色素瘤患者中的临床功效。在该试验中，与派姆单抗(KEYTRUDA)单一疗法相比，癌症疫苗mRNA-4157/V940与派姆单抗组合的使用展示出优异的功效。

实施例显示，在通过施用PARP抑制剂诱导为热表型的癌细胞中PD-L1表达增加。在这种情况下，引发免疫应答以识别PD-L1的癌症疫苗可以提高检查点抑制剂疗法的治疗功效。

在癌症的特征在于对PARP抑制剂具有>1.2 μM (或替代性阈值)的IC50的一个实施方案中，用PARP抑制剂、PD1抑制剂或PD-L1抑制剂和针对新抗原的癌症疫苗治疗患者。

在癌症的特征在于对PARP抑制剂具有>1.2 μM (或替代性阈值)的IC50的另一个实施方案中，用PARP抑制剂、PD1抑制剂或PD-L1抑制剂和针对由该癌症生成的新抗原的个性化癌症疫苗治疗患者。

在癌症的特征在于对PARP抑制剂具有>1.2 μM (或替代性阈值)的IC50的另一个实施方案中，用PARP抑制剂、PD1抑制剂或PD-L1抑制剂和包含mRNA4157/V940的个性化癌症疫苗治疗患者。

在一个实施方案中，在用PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗之前，用PARP抑制剂治疗患者。有技术的读者将认识到，用PARP抑制剂的初始治疗将导致CD45阳性T细胞浸润并将癌症转变为热表型。这种表型可以通过测量CD45阳性细胞浸润在患者活检中识别。识别“热”表型的其他方法包括测量患者活检或血液样品中cGAS/STING途径的下游变化。在一个实施方案中，通过测量患者活检或血液样品(特别是血液样品)中的1型干扰素水平来鉴定热表型。在进一步的实施方案中，通过测量患者肿瘤活检中的PD-L1水平来鉴定热表型。在进一步的实施方案中，通过测量在用PARP抑制剂处理之前和之后所取的血液样品中的外泌体DNA长度来鉴定热表型。更特定地，<1.1的外泌体DNA长度比率(用PARP抑制剂处理后/用PARP抑制剂处理前)指示经由例如STING激活(可以将肿瘤从冷变为热的机制之一)的免疫致敏。

在一个实施方案中，在用PD1抑制剂或PDL1抑制剂治疗之前，用PARP抑制剂和针对新抗原的癌症疫苗(更特定地，针对由癌症生成的新抗原的个性化癌症疫苗，并且甚至更特定地，包含mRNA4157/V940的个性化癌症疫苗)治疗患者。

虽然IC50可以用于区分对PARP抑制剂敏感或耐药的癌症，并从而分配适当的治疗方案，但已发现从患者衍生的类器官取得的其他测量展示出与IC50的高水平相关性。技术人员将认识到，这将使得这些测量能够替代性地用于区分两个癌症组并分配适当的治疗方案。一个值得特别注意的测量是用PARP抑制剂和DMSO处理的肿瘤细胞之间的细胞活力的变化。这可以更好地反映体内情况，因为它是在免疫细胞存在下测量的。图9显示，细胞活力的变化仅在对PARP抑制剂尼拉帕利敏感的癌症中明显。对PARP抑制剂敏感或耐药的癌症之间细胞活力变化的相关阈值为0.75，即实验细胞活力减少0.75倍。

相应地，在一个方面，本发明提供了用于治疗人患者的癌症的方法，其中：

a)当癌症的特征在于对PARP抑制剂具有<0.75的肿瘤细胞活力比率(PARP抑制剂/DMSO)时，用PARP抑制剂治疗患者；或者

b)当癌症的特征在于对PARP抑制剂具有>0.75的肿瘤细胞活力比率(PARP抑制剂/DMSO)时，用PARP抑制剂和PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗患者。

与IC50一样，患者衍生的类器官对PARP抑制剂在肿瘤细胞活力中的比率(PARP抑制剂/DMSO)可以通过本领域普通技术人员已知的方法来确定。在一个实施方案中，在用PARP抑制剂或DMSO处理患者衍生的类器官7天，然后与预刺激的PBMC共培养48小时后，确定肿瘤细胞活力的比率。用于7天处理的PARP抑制剂的剂量是通过细胞毒性分析确定的IC30值。在其中PARP抑制剂是尼拉帕利的更特定的实施方案中，在用1.4 μM尼拉帕利或其药学上可接受的盐或DMSO处理患者衍生的类器官7天，然后与预刺激的PBMC共培养48小时后，确定肿瘤细胞活力的比率。在实施例中提供了用于确定肿瘤细胞活力比率的合适方法。虽然实施例涉及PARP抑制剂尼拉帕利，但可以使用类似的方法来确定其他PARP抑制剂的肿瘤细胞活力比率。

与IC50一样，由于对PARP抑制剂敏感或耐药的患者衍生的类器官之间的肿瘤细胞活力比率的大差距，一旦另外的患者衍生的类器官可用，阈值可能会轻微改变。因此，在替代性的方面，确定治疗方案的性质的肿瘤细胞活力比率阈值为0.6。在另一方面，确定治疗方案的性质的肿瘤细胞活力比率阈值为0.7。在另一方面，确定治疗方案的性质的肿瘤细胞活力比率阈值为0.8。在另一方面，确定治疗方案的性质的肿瘤细胞活力比率阈值为0.9。

特征在于具有<0.75 (或替代性阈值)的肿瘤细胞活力比率(PARP抑制剂/DMSO)的癌症的治疗方案与上述特征在于具有<1.2 μM (或替代性阈值)的IC50的癌症的治疗方案相同。

特征在于具有＞0.75 (或替代性阈值)的肿瘤细胞活力比率(PARP抑制剂/DMSO)的癌症的治疗方案与上述特征在于具有＞1.2 μM (或替代性阈值)的IC50的癌症的治疗方案相同。

实施例显示，来自患者衍生的类器官的其他测量显示出与活力的良好相关性。如本领域技术人员将理解的，用于确定合适药物方案的任何测量的关键目标是最大化选择“正确”治疗方案的个体的数量并最小化假阳性和假阴性(其中将患者分配到“不正确”治疗方案)。假阳性和假阴性的数量可以从ROC曲线和Youden指数确定。这些通常称为灵敏度和特异性。表1显示单独的以下变量能够预测活力，并因此将患者分配到特定的治疗方案：

表1

技术人员将理解，与肿瘤细胞活力比率(PARP抑制剂/DMSO)良好相关的测量，诸如表1中的那些，可能反映在用于单链断裂修复的生物途径中或在导致肿瘤发展出“热”表型的途径中发生的变化。这些测量可以是直接或间接涉及的(即因果性的或关联性的)。然而，无论哪种方式，如上述灵敏度和特异性分析所示，可以使用个体测量来分配具有不同准确度的治疗方案。单个测量可以通过机器学习组合以产生得分，该得分可以是类成员的更好预测物，并且具有比任何单个测量更高的灵敏度和特异性。通常，组合大量变量(协变量)的模型具有更高的准确性。

使用除了IC50或活力以外的测量的益处在于，它们可以更容易地直接从患者样品测量，从而潜在地避免了为每种癌症产生患者衍生的类器官的需要。本领域技术人员还将理解，组合易于测量的多个协变量的模型可以用作“更难”测量的单个测量的替代物。

从表中可以看出，患者衍生的类器官对PARP抑制的耐药性也与从外泌体分离的DNA (exoDNA)的长度高度相关。图6显示，在对PARP抑制剂尼拉帕利更加耐药的患者衍生的类器官中，来自PARP抑制剂尼拉帕利处理的患者衍生的类器官的exoDNA更短(与来自DMSO处理的对应物的exoDNA相比)。接受者操作特性(ROC)曲线通过绘制尼拉帕利和DMSO处理的患者衍生的类器官的外泌体DNA长度与10个患者衍生的类器官的IC50值之间的比率来计算。该分析允许我们鉴定与CD45阳性T细胞浸润增加和热表型诱导相关的阈值比率。从表中可以看出，这被计算为1.1，其中灵敏度为100%，并且特异性为67%。

b)当癌症的特征在于具有<1.1的外泌体DNA长度比率(PARP抑制剂/DMSO)时，用PARP抑制剂和PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗患者。

在进一步的方面，本发明提供了PARP抑制剂在制备用于治疗人患者的癌症的药物中的用途，其中：

在这些方面，通过计算在用PARP抑制剂或者DMSO处理后来自患者衍生的类器官的外泌体DNA长度比率来确定治疗的性质。如前所述，可以使用本领域已知的方法容易地获得患者衍生的类器官。用于确定外泌体DNA长度的方法是本领域众所周知的。在一个实施方案中，在用PARP抑制剂或DMSO处理患者衍生的类器官7天后确定外泌体DNA长度。用于7天处理的PARP抑制剂的剂量是通过细胞毒性分析确定的IC30值。在其中PARP抑制剂是尼拉帕利或其药学上可接受的盐的一个实施方案中，在用1.4 μM尼拉帕利或其药学上可接受的盐或DMSO处理患者衍生的类器官7天后确定外泌体DNA长度。实施例中提供了用于确定外泌体DNA长度比率的合适方法。虽然实施例涉及PARP抑制剂尼拉帕利，但可以使用类似的方法来确定其他PARP抑制剂的比率。

用于特征在于具有>1.1的外泌体DNA长度比率(PARP抑制剂/DMSO)的癌症的治疗方案与上述用于特征在于具有<1.2 μM (或替代性阈值)的IC50的癌症的治疗方案相同。

用于特征在于具有<1.1的外泌体DNA长度比率(PARP抑制剂/DMSO)的癌症的治疗方案与上述用于特征在于具有>1.2 μM (或替代性阈值)的IC50的癌症的治疗方案相同。

因为患者衍生的类器官中的应答能够预测患者临床应答，据信患者衍生的类器官的外泌体DNA长度比率(PARP抑制剂/DMSO)将反映用PARP抑制剂处理前后的外泌体DNA长度比率。在治疗过程中测量血液样品中的外泌体DNA长度将允许医生确定肿瘤转化为“热”表型的点，并因此鉴定何时用PD1抑制剂或PD-L1抑制剂的疗法将是有益的。

a)患者正在用PARP抑制剂进行治疗；和

b)当来自患者的血液样品中的外泌体DNA比率(用PARP抑制剂治疗后/用PARP抑制剂治疗前) <1.1时，用PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗患者。

在另一方面，本发明提供了PD1抑制剂或PD-L1抑制剂，其用于治疗人患者的癌症，其中：

a)患者正在用PARP抑制剂进行治疗；和

在进一步的方面，本发明提供了PD1抑制剂或PD-L1抑制剂在制备用于治疗人患者的癌症的药物中的用途，其中：

a)患者正在用PARP抑制剂进行治疗；和

b) 当来自患者的血液样品中的外泌体DNA比率(用PARP抑制剂治疗后/用PARP抑制剂治疗前) <1.1时，用PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗患者。

在特定实施方案中，用于其外泌体DNA比率(用PARP抑制剂治疗后/用PARP抑制剂治疗前) <1.1的正在用PARP抑制剂治疗的患者的治疗方案与上述用于特征在于具有>1.2μM (或替代性阈值)的IC50的癌症的治疗方案相同。

如上所述，还观察到患者衍生的类器官的尼拉帕利耐药性与在患者或患者活检中可直接观察到的其他表型高度相关。由于患者衍生的类器官中的应答能够预测患者的临床应答，这些关联可以用于确定患者的癌症的尼拉帕利敏感性是否高于或低于1.2 μM的IC50阈值，因此允许在不需要生成患者衍生的类器官的情况下确定合适的治疗过程。

已经观察到，用顺铂处理类器官导致与用PARP抑制剂处理相似的效应。更具体地，图7A和B显示，在分类为对尼拉帕利处理耐药的PDO中，顺铂处理导致CD45阳性细胞增加的浸润，并且在分类为对尼拉帕利处理敏感的PDO中，顺铂处理导致CD45阳性细胞癌减少的浸润。图8显示，在对PARP抑制剂尼拉帕利更加耐药的患者衍生的类器官中，来自顺铂处理的患者衍生的类器官的exoDNA更短。换句话说，患者衍生的类器官对顺铂治疗的应答反映了对尼拉帕利的应答。

实施例1和图7C证明顺铂和尼拉帕利的IC50值在患者衍生的类器官中高度相关(p=0.033，r 0.8857)，并且因此在用于生成患者衍生的类器官的癌症中高度相关。因此，对含铂药物(诸如顺铂)的应答可以用于确定尼拉帕利耐药性癌症。如前所述，可以逐步用尼拉帕利或其药学上可接受的盐，然后用PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗尼拉帕利耐药性癌症。

因此，在另一方面，本发明提供了用于治疗人患者的癌症的方法，其中患者先前对铂疗法没有应答，其中用PARP抑制剂和PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗患者。

在进一步的方面，本发明提供了PARP抑制剂，其用于治疗先前对铂疗法无应答的人患者的癌症，其中用PARP抑制剂和PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗患者。

在又一方面，本发明提供了PARP抑制剂在制备用于在治疗先前对铂疗法无应答的人患者的癌症中使用的药物中的用途，其中用PARP抑制剂和PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗患者。

在本发明的上下文中，根据RECIST 1.1指南评估对铂疗法的应答，并且当患者对最近一轮的铂疗法没有展示出完全应答(CR)或部分应答(PR)时，认为患者对铂疗法没有应答。

在一个实施方案中，铂疗法是用选自由以下组成的组的药剂进行治疗：顺铂、卡铂、奥沙利铂、奈达铂、三铂四硝酸酯、phenanthriplatin、吡铂和沙铂，任选地与另一种化疗剂例如紫杉烷(例如紫杉醇或多西他赛)组合。

用于先前对铂疗法无应答的患者的治疗方案与上述用于特征在于具有>1.2 μM(或替代性阈值)的IC50的癌症的治疗方案相同。

已经讨论了能够区分耐药性癌症和敏感性癌症的多种变量。这些变量可以通过机器学习组合，以产生相比任何一个单独的变量是类成员的更好的预测物的得分。通常，组合大量变量(协变量)的模型具有更高的准确性。从ROC曲线和Youden指数可以确定决定类成员的截断值，并且然后可以计算类成员的敏感性和特异性。

在上述所有方面，癌症可以是实体瘤，例如细胞学或组织学证实的转移性或局部晚期实体瘤。在实施方案中，癌症的定义还旨在包括稳定的疾病。

在特定实施方案中，癌症选自由以下组成的组：头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结直肠癌、卵巢癌(例如上皮性卵巢癌，或更特别地高级别浆液性卵巢癌或以浆液性组织学为主的高级别卵巢癌)、输卵管癌、宫颈癌、子宫内膜癌、原发性腹膜癌、胃癌、肾癌、肝癌、膀胱癌、皮肤癌(例如黑色素瘤)、甲状腺癌、神经内分泌癌、尤文氏肉瘤、骨肉瘤、神经母细胞瘤、肾上腺皮质癌、横纹肌肉瘤和套细胞淋巴瘤。

在一个实施方案中，癌症选自由以下组成的组：头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)、乳腺癌、卵巢癌(例如上皮性卵巢癌，或更特别地高级别浆液性卵巢癌或以浆液性组织学为主的高级别卵巢癌)、输卵管癌和原发性腹膜癌。在更特定的实施方案中，癌症是头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)或非小细胞肺癌(NSCLC)。

在一个实施方案中，癌症是乳腺癌。乳腺癌包括但不限于那些包括原位导管癌、小叶癌、炎性乳腺癌、侵袭性导管癌、乳头佩吉特病、乳头状乳腺癌、髓样癌、乳腺癌(mammarycarcinoma) (PAM-50类别，包括基底性(三阴性)、HER2阳性、luminal A、luminal B和正常样)和具有BRCA1和/或BRCA2突变的患者中的乳腺癌(breast cancer)。在特定实施方案中，乳腺癌是指三阴性乳腺癌(TNBC)或人表皮生长因子2阴性(HER2-) BRCA突变的乳腺癌。

在一个实施方案中，癌症是卵巢癌。卵巢癌包括但不限于那些包括上皮癌；无性细胞瘤、畸胎瘤；内胚层窦肿瘤；胚胎癌；性索间质瘤；以及在BRCA1和/或BRCA2中具有突变的患者中的卵巢癌。

在一个实施方案中，当PARP抑制剂是尼拉帕利，更具体地是尼拉帕利甲苯磺酸盐一水合物时，癌症可以是原发性或转移性脑癌。在一些实施方案中，原发性脑癌选自由以下组成的组：间变性星形细胞瘤、胶质母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、脑膜瘤、垂体癌、神经鞘瘤、少突胶质细胞瘤、室管膜瘤、髓母细胞瘤、星形细胞瘤、脑干胶质瘤、非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤、松果体瘤、弥漫内生型脑桥胶质瘤、IDH1/2(+) ATRX突变体胶质瘤、恶性胶质瘤和脑的原始神经外胚层肿瘤。在更特别的实施方案中，原发性脑癌是WHO IV级肿瘤。在一个实施方案中，原发性脑癌是胶质母细胞瘤。

在一个实施方案中，癌症先前已经用铂疗法进行治疗。

癌症治疗的功效可以以本领域公知的方式测量，例如，通过测量无进展存活(PFS)、总体存活(OS)、至第一次后续疗法的时间(TFST)、至第二次后续疗法的时间(TSST)、无化疗间隔(CFI)、客观应答率(ORR)或通过计算疾病进展的风险比。在一个实施方案中，在本文概述的治疗方案之后观察到这些参数中的一个或多个的改善。

PARP抑制剂

在一个实施方案中，PARP抑制剂选自由以下组成的组：尼拉帕利、奥拉帕利(olaparib)、他拉唑帕利(talazoparib)、芦卡帕利(rucaparib)、维利帕尼(veliparib)和AZD5305或其药学上可接受的盐。PARP抑制剂还可以选自由以下组成的组：THG-008、RBN-2397、TSL-1502、NMS-03305293、HWH-340、STP06-1002、JPI-547、ABT-767、希明哌瑞(simmiparib)、stenoparib、IDX-1197、SC-10914、AMXI-5001、阿美帕利(amelparib)二盐酸盐二水合物、CK-102、IMP-4297、帕米帕利(pamiparib)和氟唑帕利(fluzoparib)或其药学上可接受的盐。

AZD5305描述于WO 2021/013735中并且已知为5-[4-[(7-乙基-6-氧代-5H-1,5-萘啶-3-基)甲基]哌嗪-1-基]-N-甲基-吡啶-2-甲酰胺并且具有以下结构：。

在实施方案中，PARP抑制剂选自由以下组成的组：尼拉帕利、奥拉帕利、他拉唑帕利和芦卡帕利或其药学上可接受的盐。在进一步的实施方案中，PARP抑制剂选自由以下组成的组：尼拉帕利、他拉唑帕利和芦卡帕利或其药学上可接受的盐。

在实施方案中，相对于PARP2，PARP抑制剂对PARP1具有选择性。

在实施方案中，PARP抑制剂是如上定义的AZD5305或其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，PARP抑制剂是尼拉帕利或其药学上可接受的盐。

尼拉帕利游离碱为((3S)-3-[4-{7-(氨基羰基)-2H-吲唑-2-基}苯基]哌啶。尼拉帕利的药学上可接受的盐包括甲苯磺酸盐或其溶剂化或水合形式。在特定实施方案中，尼拉帕利或其药学上可接受的盐指尼拉帕利甲苯磺酸盐一水合物(((3S)-3-[4-{7-(氨基羰基)-2H-吲唑-2-基}苯基]哌啶鎓4-甲基苯磺酸盐一水合物)。尼拉帕利甲苯磺酸盐一水合物可以如WO2008/084261的实施例5和WO2009/087381的实施例1中所述进行制备。

在一个实施方案中，可以使用尼拉帕利甲苯磺酸盐一水合物的结晶形式，其中结晶形式的特征在于选自以下的至少一个X射线衍射图样反射：使用在40 kV和44 ma下操作的Cu长精细聚焦管作为X射线源，9.5±0.2、12.4±0.2、13.2±0.2、17.4±0.2、18.4±0.2、21.0±0.2、24.9±0.2、25.6±0.2、26.0±0.2和26.9±0.2的2θ值。尼拉帕利的其他盐或尼拉帕利甲苯磺酸盐一水合物的结晶形式是本领域已知的，并且可以用于本文公开的治疗方案中。特别地，本发明考虑使用WO 2018/183354、US20210017151、WO2020072860、WO2020072797、WO2020072796和CN108530425中公开的形式。

治疗方案

本文所述的发明提供了两种不同的治疗方案。向患有对PARP抑制敏感的癌症的患者施用一种治疗方案，该患者通过如下方式确定：

i)对PARP抑制剂具有<1.2 μM的IC50的患者衍生的类器官；或者

ii)具有<0.75的肿瘤细胞活力比率(PARP抑制剂/DMSO)；或者

iii)具有>1.1的外泌体DNA长度比率(PARP抑制剂/DMSO)；

其中用PARP抑制剂治疗患者。

本领域技术人员可以确定用于该治疗方案的PARP抑制剂的合适剂量。

在一个实施方案中，PARP抑制剂是尼拉帕利或其药学上可接受的盐。技术人员可以容易地确定尼拉帕利或其药学上可接受的盐的适当剂量。在更特定的实施方案中，治疗方案包括用每日一次至多300 mg尼拉帕利或其药学上可接受的盐(基于游离碱的重量)的口服剂量进行治疗。在一些实施方案中，治疗方案包括每日一次300 mg、200 mg或100 mg尼拉帕利或其药学上可接受的盐(基于游离碱的重量)的口服剂量。尼拉帕利或其药学上可接受的盐的剂量可以以一种或多种单位剂型施用。尼拉帕利的100 mg胶囊是目前可获得的，并且每日剂量可以通过提供适当数量的胶囊进行施用。

尼拉帕利或其药学上可接受的盐的剂量可以根据临床经验(例如应答于不良事件)进行调整。可以根据美国国家癌症研究所不良事件通用术语标准(National CancerInstitute Common Terminology Criteria for Adverse Events) (NCI-CTCAE) v4.03评价不良事件。对于CTCAE≥3级的治疗相关不良反应，在认为预防不可行或尽管治疗，不良反应仍持续存在的情况下，应考虑与表1一致减少剂量。

在一个实施方案中，PARP抑制剂是奥拉帕利或其药学上可接受的盐。技术人员可以容易地确定奥拉帕利或其药学上可接受的盐的适当剂量。在更特定的实施方案中，治疗方案包括用每日两次服用300 mg剂量的奥拉帕利进行治疗，这相当于总共600 mg的每日剂量。该剂量可以作为胶囊提供，特别是含有50 mg奥拉帕利的硬胶囊。因此，为了达到300 mg的剂量，患者需要服用六粒胶囊。剂量也可以以100 mg或150 mg片剂的形式提供，其中片剂可以是具有薄膜包衣的。

在另一个实施方案中，PARP抑制剂是芦卡帕利或其药学上可接受的盐，特别是芦卡帕利樟脑磺酸盐。在实施方案中，治疗方案包括用每日两次服用600 mg剂量的芦卡帕利进行治疗，这相当于总共1200 mg芦卡帕利的每日剂量。该剂量可以以片剂的形式提供，该片剂作为200 mg、250 mg和300 mg是可获得的，其可以是具有薄膜包衣的。

在另一个实施方案中，PARP抑制剂是他拉唑帕利或其药学上可接受的盐，特别是他拉唑帕利甲苯磺酸盐。在实施方案中，治疗方案包括用每日一次服用1 mg剂量的他拉唑帕利进行治疗。该剂量可以作为含有相当于0.25 mg或1 mg他拉唑帕利的他拉唑帕利甲苯磺酸盐的胶囊来提供。

向患有对PARP抑制具有耐药性的癌症的患者施用不同的治疗方案，该患者通过以下方式确定：

i)对PARP抑制剂具有>1.2 μM的IC50的患者衍生的类器官；或者

ii)具有>0.75的肿瘤细胞活力比率(PARP抑制剂/DMSO)；或者

iii)具有<1.1的外泌体DNA长度比率(尼拉帕利/DMSO)；或者

iv)对先前的铂疗法无应答；

其中用PARP抑制剂、PD1抑制剂或PD-L1抑制剂和任选地针对新抗原的癌症疫苗(更特定地，针对由该癌症生成的新抗原的个性化癌症疫苗，并且甚至更特定地，包含mRNA4157/V940的个性化癌症疫苗)治疗患者。

如上所述，用PARP抑制剂进行治疗在癌症中诱导热表型。本领域技术人员可以确定PARP抑制剂的合适剂量。将理解，用于转化至热表型的PARP抑制剂的剂量可以不同于用于对PARP抑制敏感的癌症的治疗方案中使用的PARP抑制的剂量。

在一个实施方案中，在用PD1抑制剂或PDL1抑制剂治疗之前，用PARP抑制剂治疗患者。在一个实施方案中，用PARP抑制剂进行预处理的时间段将是1周、2周、3周或1个月。所需时间可以通过监测患者活检或血液样品的“热”表型标志物来确定。

治疗方案还需要用PD1或PDL1的抑制剂进行治疗。

PD1和PDL1抑制剂是本领域众所周知的，并且几种PD1抑制剂和PDL1抑制剂已获得上市批准。PD1抑制剂包括纳武单抗、派姆单抗、西米普利单抗(cemiplimab)和多塔利单抗(dostarlimab)、伏派利单抗(vopratelimab)、斯巴达珠单抗(spartalizumab)、卡瑞利珠单抗(camrelizumab)、信迪利单抗(sintilimab)、替雷利珠单抗(tislelizumab)、特瑞普利单抗(torpalimab)、INCMGA00012、AMP224、AMP514和acrixolimab。PDL1抑制剂包括阿替利珠单抗(atezolizumab)、阿维鲁单抗(avelumab)、度伐利尤单抗(durvalumab)、KN035、柯希利单抗(cosibelimab)、AUNP12、CA-170和BMS-986189。PD1抑制剂或PDL1抑制剂的合适剂量和合适配制剂可以由本领域技术人员容易地确定。在PD1或PDL1疗法已经获得批准的情况下，技术人员将理解剂量可以不同于先前批准的剂量。

在一些实施方案中，治疗方案需要用针对新抗原的癌症疫苗(更特定地，针对由该癌症生成的新抗原的个性化癌症疫苗，并且甚至更特定地，包含mRNA4157/V940的个性化癌症疫苗)进行治疗。适用于在本发明中使用的癌症疫苗也是本领域已知的。这包括WO 2020/097291中公开的mRNA-4157/V940。在一个实施方案中，在用PD1抑制剂或PDL1抑制剂治疗之前，用PARP抑制剂和针对新抗原的癌症疫苗(更特定地，针对由癌症生成的新抗原的个性化癌症疫苗，并且甚至更特定地，包含mRNA4157/V940的个性化癌症疫苗)治疗患者。

确定用于治疗的患者

在一个方面，本发明提供了用于确定用于患有癌症的人患者的合适治疗方案的方法，其包括：

a)计算由所述癌症生成的患者衍生的类器官的PARP抑制剂的IC50；

b)基于患者衍生的类器官对PARP抑制剂的敏感性确定合适的治疗方案，其中在患者衍生的类器官具有<1.2 μM的IC50的情况下，合适的治疗方案包括用PARP抑制剂进行治疗，并且其中在患者衍生的类器官具有>1.2 μM的IC50的情况下，合适的治疗方案包括用PARP抑制剂然后用PD1抑制剂或PD-L1抑制剂进行逐步治疗。

在另一方面，本发明提供了用于确定用于患有癌症的人患者的合适治疗方案的方法，其包括：

a)计算由所述癌症生成的患者衍生的类器官的肿瘤细胞活力的比率(PARP抑制剂/DMSO)；

b)基于患者衍生的类器官对PARP抑制剂的敏感性确定合适的治疗方案，其中在患者衍生的类器官具有<0.75的肿瘤细胞活力比率(PARP抑制剂/DMSO)的情况下，合适的治疗方案包括用PARP抑制剂进行治疗，并且其中在患者衍生的类器官具有>0.75的肿瘤细胞活力比率(PARP抑制剂/DMSO)的情况下，合适的治疗方案包括用PARP抑制剂然后用PD1抑制剂或PD-L1抑制剂进行逐步治疗。

在进一步的方面，本发明提供了用于确定用于患有癌症的人患者的合适治疗方案的方法，其包括：

a)在用PARP抑制剂或DMSO处理患者衍生的类器官后，确定外泌体DNA长度比率(尼拉帕利/DMSO)；

b)基于外泌体DNA长度比率(尼拉帕利/DMSO)确定合适的治疗方案，其中在患者衍生的类器官具有>1.1的比率(尼拉帕利/DMSO)的情况下，合适的治疗方案包括用PARP抑制剂治疗，并且其中在患者衍生的类器官具有<1.1的比率(尼拉帕利/DMSO)的情况下，合适的治疗方案包括用PARP抑制剂然后用PD1抑制剂或PD-L1抑制剂进行逐步治疗。

在相关方面，本发明提供了用于治疗受试者的癌症的方法，其包括向患者施用合适的治疗方案。

免疫阻断疗法的确定

实施例中描述的多模态测定允许在尼拉帕利耐药患者衍生的类器官中确定合适的免疫阻断疗法，因为其特异性地调查了免疫浸润和抗原呈递对浸润性免疫细胞的影响。该方法能够具有普遍适用性。

在一个方面，本发明提供了用于在用测试药物处理后确定癌症的治疗方案的方法，其包括以下步骤：

b)将患者衍生的类器官与活化的外周血单核细胞共培养；

用于培养患者衍生的类器官以及与PBMC共培养的合适方法的细节在实施例中提供。

可以使用本领域已知的方法确定在浸润性免疫细胞上选择性上调的蛋白质(即，与在不存在测试药物的情况下相比，在存在测试药物的情况下以更高水平存在于浸润性免疫细胞上)或在免疫细胞所浸润的类器官肿瘤细胞上选择性上调的蛋白质。在一个实施方案中，可以使用使用针对识别候选蛋白的抗体的流式细胞术。实施例中提供了用于进行流式细胞术的合适方法。在一个实施方案中，方法可以使用识别免疫检查点抑制剂蛋白的抗体。在一个实施方案中，方法可以使用识别多种蛋白质的一组抗体。在一个实施方案中，该一组抗体可以识别以下蛋白质中的一种或多种：CD3、CD8、CD4、CD56、CD226、CD45、TIGIT、PD1、PDL1、EpCAM、PVRIG、TIM3、CD96、CD14和CD11b。

在一个实施方案中，c)中上调的蛋白质的调节剂是c)中上调的蛋白质的抑制剂。

实施例1

方案

开发了多模态测定来测试肿瘤细胞对尼拉帕利的应答以及处理对免疫细胞的影响。该测定如图1所示。图1显示，在第0天，将患者衍生的类器官(PDO)以1个圆顶(dome)/孔接种在24孔板中的15 μl基底膜(BME)中。5至7天后(根据每个PDO的增殖率)，用不同剂量的尼拉帕利和DMSO处理一个板，用于细胞毒性评估。剩余板的PDO用尼拉帕利(1.4 μM)、顺铂(4.7 uM)、DMSO或盐水溶液(对照)处理7天。在处理期后，收集来自一个平板/条件(即一个DMSO和一个尼拉帕利处理的板)的培养基用于外泌体分离和DNA长度分析，并处理PDO以提取RNA用于RNAseq和qRT-PCR (参见qRT-PCR分析章节中的细节)。对于尼拉帕利处理的样品和顺铂处理的样品(以及相应的对照)，从剩余的板收集PDO，在洗出BME后，与使用抗CD3组合抗CD28 (作为共刺激信号)抗体预刺激总共4天的外周血单核细胞(PBMC)以1比6的比率铺板到低粘附96孔板中。将PDO共培养48小时，之后收集所有细胞，洗去非浸润性免疫细胞，并将其余细胞消化为单细胞或固定并包埋为完整组织。对于流式细胞术分析，将单细胞封闭、用抗体混合物染色、固定，并在流式细胞仪上运行。为了成像，用不同的抗体标记包埋的类器官，透明化并成像。

用于进行形成多模态测定的一部分的每种测定的方案如下所示：

细胞毒性

将PDO作为单细胞以一定密度(根据其生长率)接种在15 μl BME/dome中。在24孔板中每孔1个dome，1 ml完全培养基/每孔。5/7天后(根据类器官的增殖率)，用补充有5个不同剂量的尼拉帕利(10、2、1、0.5和0.25 μM)和作为对照的DMSO或顺铂(50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.4和0.19 uM)和作为对照的盐水溶液的新鲜培养基替换培养基。1周后，去除培养基，并向每个孔中添加200 μl细胞滴度辉光缓冲液(在PBS中稀释1倍)。然后将板在搅动(240 RPM)中保持1小时。从每个孔收集150 μl溶液并转移至96孔板，以用于用Clariostar Plus (BMG Labtech)进行读数。每个剂量重复运行4次，并用GraphPad Prism9软件阐述结果以获得剂量/响应曲线。IC50的分析作为非线性剂量应答[抑制剂]与应答-可变斜率(四个参数)进行。

活力

在用1.4 μM尼拉帕利或DMSO (作为对照)处理7天后，在48 h的共培养后，通过流式细胞术分析评价细胞活力。细胞用Zombie染料染色，这使得能够进行对于EpCAM阳性细胞内活/死细胞的百分比的确定。

外泌体分析 (DNA长度，DNA测序和蛋白质表达)

通过以渐增的速度对从PDO培养物收集的培养基进行一系列离心和超速离心来获得外泌体。将每个样品分到两个管中，以用于超速离心(用于随后的蛋白质和基因组分析)。

通过QIAamp血液DNA提取试剂盒(QIAGEN)经由基于二氧化硅膜的核酸纯化从外泌体中提取DNA，并通过Qubit dsDNA HS试剂盒定量。将Agilent 4200 Tapestation系统上的基因组DNA ScreenTape测定用于评估DNA的长度，利用R package bioanalyzeR来获得DNA尺寸分布和不同尺寸的分子数量。使用Oxford Nanopore Promethion对部分外泌体DNA进行测序，以用于药物处理和对照实验。对于两种样品，然后使用minimap2将读段(read)与人基因组(hg38)对齐，并进行以下分析。对于存在任何对齐读段的每个基因，计算以下：

•每千碱基片段百万比(fragments per kilobase million) (FPKM)，其作为外泌体数据集中基因表示的归一化度量

•单个纳米孔读段覆盖的总基因长度的最大分数

•与该基因对齐的所有纳米孔读段覆盖的总基因长度的中值分数

•编码和非编码变体(对于存在20个读段的最小深度的所有碱基)

•编码变体的CpG岛的低甲基化

对于蛋白质评价，将外泌体收集到管中以用于多参数分析，并用抗人BM2、CD80、TIM3、PDL1、CD112、LAG3、CD63、CD155、PD1、半乳糖凝集素-9、S100A9、CD226、TIGIT、HMGB1、BAG6、CD96、ALIX、CD73和P4HA1抗体进行染色，使用图像流进行成像并通过image studio和IDEA软件进行分析。

RNA分析

对于qRT-PCR分析，使用TripLE收获细胞，然后在冷PBS中洗涤两次，并在QIAzol试剂中进行裂解。根据制造商的说明，使用miRNeasy micro试剂盒提取RNA (包括DNA酶处理)。然后使用Nanodrop分光光度计定量从细胞回收的RNA的浓度并评估纯度(260/280比率)。按照制造商的指南，使用随机六聚体引物和ProtoScript II第一链cDNA合成试剂盒将500至1500 ng的RNA转录成cDNA。在384孔板中设置定量PCR (qPCR)反应，其中每个孔含有10 ng与 IX PowerUp^TM SYBR^TM Green Master Mix和0.25 μM的正向引物和反向引物混合的cDNA。使用标准方案在QuantStudio Flex 7系统上运行板。针对每个样品测试一组96个基因，包括4个管家基因(HPRT1、ACTB、GAPDH和18S)。为了定量mRNA表达，通过减去管家基因的平均CT值，将每个基因的CT值归一化至这些管家基因。

对于RNAseq，进行具有无监督聚类(tSNE或UMAP)或主成分分析(PCA) (可能用其他公共细胞系数据)的QC以鉴定任何批次效应并表征PDO转录组谱。使用基因水平表达定量(读数计数或TPM)，进行尼拉帕利处理和DMSO对照之间的差异表达基因(DEG)的分析，以确定药物处理后显著上调或下调的基因。

对于复制应激特征分析，以从RNAseq分析收集的数据开始，我们使用参考基因特征(根据出版物McGrail et al., 2018, Cell Reports 23, 2095-2106和Sci Trans Med13, eabe6201, 2021)，并在参考特征(Log2FC参考)和NIR处理的PDO与匹配的DMSO对照PDO的Log2FC之间进行相关性分析计算，以详细说明RSRD变量。

流式细胞术分析

48 h共培养后，收集PDO。用细胞粗滤器分离非浸润性免疫细胞，而类器官和浸润性免疫细胞减少至单细胞水平。将细胞与Zombie染料在室温下孵育30分钟进行活死排除。在MACS缓冲液和抗人和小鼠IgG中的封闭步骤之后，在MACS缓冲液中用小鼠抗人CD3、CD8、CD4、CD56、CD226、CD45、TIGIT、PD1、PDL1、EpCAM、PVRIG、TIM3、CD96、CD14和CD11b抗体在4℃下进行染色1小时。然后将细胞固定并进行DNA染色。含有细胞的试管在CytoFLEX (BeckmanCoulter)上运行，并用FlowJo软件分析数据。

多重免疫荧光分析

对固定的冷冻PDO的单个6微米冷冻切片进行多重荧光成像分析。同一实验中所有处理组的PDO均被包埋在同一冷冻块中，以确保各组间切片和染色的一致性。然后使用Ventana autostainer用多达四种荧光团缀合的一抗进行靶抗原染色，在Leica Cell DIVE上进行免疫荧光成像，然后化学灭活抗体缀合的荧光团。然后重复该过程以包括额外的感兴趣的标志物。DAPI (核标志物)用于图像的近像素完美配准(registration)。抗体组包括：Ki67、p27、RPA32、yH2AX、EpCAM、CytoK、CD45、CD3、CD20、PDL1、PD1和CD96。

我们开发了一种用于图像分析的新策略：简而言之，使用3种不同标志物(即EpCAM、DAPI和CD45)的表达来生成五种不同类器官区室(类器官、细胞核、细胞质、免疫和非免疫)的二元掩码。然后将这些掩码用于从生物标志物组中的所有图像中靶向提取强度数据。单独或与来自每个不同处理组的PBMC共培养的每个样品生成单个平均强度值，并呈现为平均荧光强度的热图，以便于进行考虑到类器官占据的每个图像的比例(意指有助于数据分析的图像的比例)的比较。

用于R环检测的PLA测定

将来自所有处理组的患者衍生的类器官用4% PFA固定15 min，在TBS缓冲液中洗涤，与0.2% Tryton-X100在TBS中孵育10分钟，并用5% BSA在TBS中封闭。然后将样品与以下抗体在4度温育过夜：在添加DAPI的封闭溶液中稀释的抗PCNA-ab18197 (兔多克隆)和抗Pol-II-sc-56767(小鼠单克隆)。第二天，洗涤样品，并按照操作手册(Merk, DUO92013)中的描述进行测定。在最终洗涤后，用基于Mowiol的封固介质固定盖玻片，并在启用荧光的组织扫描仪(Hamamatsu, Nanozoomer)上对样品成像。在ImageJ软件上分析原始图像(16bit)。

结果

对抑制剂尼拉帕利的耐药性和敏感性由IC50值定义，IC50值从7天的处理后的剂量应答曲线计算。图2A显示了在处理结束时收集的对药物更耐药(上图)或更敏感(下图)的PDO的代表性图片。图2B显示了在处理结束时阐述的6个不同头颈(HN)癌和4个不同非小细胞肺癌(Lu-P) PDO的IC50值。

来自流式细胞术的结果(图3A、C和E)显示(还通过成像分析(图3B、D)得到证实)，肿瘤细胞对用尼拉帕利疗法的耐药性与TME(即类器官3D结构)中T细胞的浸润有关，该浸润表明肿瘤从冷表型转变为热表型。事实上，耐药样本中浸润经尼拉帕利处理的PDO的CD45阳性细胞的百分比增加(与DMSO相比)，而敏感样本中该百分比减少(图2E)。当尼拉帕利的IC50值超过1-1.2 μM之间的阈值时，观察到浸润增加的现象，而低于此阈值的IC50值与减少的浸润相关联。

在浸润PDO的PBMC的T细胞级分中，观察到免疫检查点受体PD1的调节与其在经尼拉帕利处理的PDO内的渗透能力相关。详细来说，在浸润性CD4阳性细胞中，PD1表达随着IC50值的增加而增加；相反，在非浸润性CD4阳性细胞中，PD1表达与尼拉帕利IC50值呈负相关(图4)。

在分类为耐药(根据尼拉帕利的IC50值)的PDO中，我们还观察到从与活化PBMC共培养48小时的类器官分离的经尼拉帕利处理的肿瘤细胞中PD-L1表达上调(图5)。这些结果通过多重成像和流式细胞术分析得到证实。

图9显示，在用1.4 μM尼拉帕利或DMSO (作为对照)处理7天并与PBMC共培养48小时后，分类为耐药(根据尼拉帕利的IC50值)的PDO也显示出肿瘤细胞活力的较高比率(尼拉帕利/DMSO)。

此外，确定了从外泌体分离的DNA (exoDNA)长度与对PARP抑制剂(尼拉帕利)的敏感性之间的相关性。事实上，在对PARP抑制剂更具耐药性的PDO中，来自经尼拉帕利处理的PDO的exoDNA更短(与来自经DMSO处理的对应物的exoDNA相比)。与来自经DMSO处理对应物的exoDNA相比，经尼拉帕利处理的衍生的exoDNA长度随着尼拉帕利敏感性的增加而增加(如图6A和B所示)。

此外，对药剂尼拉帕利的应答与对常规化疗药物顺铂的应答相似。在用不同剂量顺铂或尼拉帕利处理6天的6个PDO中，两种药物的IC50值显著相关(p=0.033，r 0.8857，图7C)。此外，从6天后收集的外泌体分离的DNA长度在两种处理后显示出相同的变化(与对药物的敏感性相关)。换句话说，在耐药PDO (以HNX40为代表)中，尼拉帕利或顺铂处理后exoDNA长度相似或更短(与对照相比)，而在敏感PDO (以HNX29为代表，图8A)中，两种处理后exoDNA长度更高。我们还观察到，分类为对尼拉帕利处理耐药的肿瘤细胞在顺铂处理后表现出更高的CD45阳性细胞浸润(图8B)。此外，对于经尼拉帕利处理的肿瘤细胞，我们显示从与活化的PBMC共培养48小时的类器官分离的经顺铂处理的肿瘤细胞中PDL1表达的上调(图8C)。

来自患者衍生的类器官的额外测量具有将相关癌症分类为对尼拉帕利耐药或敏感的效用。表3列出了许多变量以及从ROC曲线和Youden指数确定的灵敏度和特异性值，以及Pearson相关系数。

表3

如上所述测量IC50。如下测量其他变量：

表4

Claims

1.用于治疗人患者的癌症的方法，其中：

a)当所述癌症的特征在于对PARP抑制剂具有<1.2 μM的IC50时，用PARP抑制剂治疗所述患者；或者

b)当所述癌症的特征在于对PARP抑制剂具有>1.2 μM的IC50时，用PARP抑制剂和PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗所述患者。

2.PARP抑制剂，其用于治疗人患者的癌症的治疗方案中，其中：

3.PARP抑制剂在制备用于在治疗人患者的癌症的治疗方案中使用的药物中的用途，其中：

4.根据权利要求1所述的方法、根据权利要求2所述使用的PARP抑制剂或根据权利要求3所述的用途，其中所述癌症的特征在于对PARP抑制剂具有<1.2 μM，并且其中用PARP抑制剂治疗所述患者。

5.根据权利要求1所述的方法、根据权利要求2所述使用的PARP抑制剂或根据权利要求3所述的用途，其中所述癌症的特征在于对PARP抑制剂具有>1.2 μM的IC50，并且其中用PARP抑制剂和PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗所述患者。

6.根据权利要求5所述的方法、根据权利要求5所述使用的PARP抑制剂或根据权利要求5所述的用途，其中所述癌症的特征在于对PARP抑制剂具有>1.2 μM的IC50，并且其中用包含mRNA4157/V940的个性化癌症疫苗进一步治疗所述患者。

7.用于治疗人患者的癌症的方法，其中：

a)当所述癌症的特征在于具有<0.75的肿瘤细胞活力比率(PARP抑制剂/DMSO)时，用PARP抑制剂治疗所述患者；或者

b)当所述癌症的特征在于具有>0.75的肿瘤细胞活力比率(PARP抑制剂/DMSO)时，用PARP抑制剂和PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗所述患者。

8.PARP抑制剂，其用于治疗人患者的癌症的治疗方案中，其中：

a)当所述癌症的特征在于对PARP抑制剂具有<0.75的肿瘤细胞活力比率(PARP抑制剂/DMSO)时，用PARP抑制剂治疗所述患者；或者

b)当所述癌症的特征在于对PARP抑制剂具有>0.75的肿瘤细胞活力比率(PARP抑制剂/DMSO)时，用PARP抑制剂和PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗所述患者。

9.PARP抑制剂在制备用于在治疗人患者的癌症的治疗方案中使用的药物中的用途，其中：

10.根据权利要求7所述的方法、根据权利要求8所述使用的PARP抑制剂或根据权利要求9所述的用途，其中所述癌症的特征在于具有<0.75的肿瘤细胞活力比率(PARP抑制剂/DMSO)，并且其中用PARP抑制剂治疗所述患者。

11.根据权利要求7所述的方法、根据权利要求8所述使用的PARP抑制剂或根据权利要求9所述的用途，其中所述癌症的特征在于具有>0.75的肿瘤细胞活力比率(PARP抑制剂/DMSO)，并且其中用PARP抑制剂和PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗所述患者。

12.根据权利要求11所述的方法、根据权利要求11所述使用的PARP抑制剂或根据权利要求11所述的用途，其中所述癌症的特征在于具有>0.75的肿瘤细胞活力比率(PARP抑制剂/DMSO)，并且其中用包含mRNA4157/V940的个性化癌症疫苗进一步治疗所述患者。

13.用于治疗人患者的癌症的方法，其中：

a)当所述癌症的特征在于具有>1.1的外泌体DNA长度比率(PARP抑制剂/DMSO)时，用PARP抑制剂治疗所述患者；或者

b)当所述癌症的特征在于具有<1.1的外泌体DNA长度比率(PARP抑制剂/DMSO)时，用PARP抑制剂和PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗所述患者。

14.PARP抑制剂，其用于治疗人患者的癌症的治疗方案中，其中：

b)当所述癌的特征在于具有<1.1的外泌体DNA长度比率(PARP抑制剂/DMSO)时，用PARP抑制剂和PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗所述患者。

15.PARP抑制剂在制备用于在治疗人患者的癌症的治疗方案中使用的药物中的用途，其中：

b)当所述癌症的特征在于具有<1.1的外泌体DNA长度比率(PARP抑制剂/DMSO)时，用PARP抑制剂和PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗患者。

16.根据权利要求13所述的方法、根据权利要求14所述使用的PARP抑制剂或根据权利要求15所述的用途，其中所述癌症的特征在于具有>1.1的外泌体DNA长度比率(PARP抑制剂/DMSO)，并且其中用PARP抑制剂治疗患者。

17.根据权利要求13所述的方法、根据权利要求14所述使用的PARP抑制剂或根据权利要求15所述的用途，其中所述癌症的特征在于具有<1.1的外泌体DNA长度比率(PARP抑制剂/DMSO)，并且其中用PARP抑制剂和PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗所述患者。

18.根据权利要求17所述的方法、根据权利要求17所述使用的PARP抑制剂或根据权利要求17所述的用途，其中所述癌症的特征在于具有<1.1的外泌体DNA长度比率(PARP抑制剂/DMSO)，并且其中用包含mRNA4157/V940的个性化癌症疫苗进一步治疗所述患者。

19.治疗人患者的癌症的方法，其中所述患者先前对铂疗法没有应答，其中用PARP抑制剂和PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗所述患者。

20.PARP抑制剂，其用于治疗先前对铂疗法无应答的人患者的癌症的治疗方案中，其中用PARP抑制剂和PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗所述患者。

21.PARP抑制剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗先前对铂疗法无应答的人患者的癌症的治疗方案中，其中用PARP抑制剂和PD1抑制剂或PD-L1抑制剂治疗所述患者。

22.根据权利要求15所述的方法、根据权利要求15所述使用的PARP抑制剂或根据权利要求15所述的用途，其中用包含mRNA4157/V940的个性化癌症疫苗进一步治疗所述患者。

23.根据权利要求1、4-7、10-13、16-19或22中任一项所述的方法，根据权利要求2、4-6、8、10-12、14、16-18、20或22中任一项所述使用的PARP抑制剂，或者根据权利要求3-6、9-12、15-18或21-22中任一项所述的用途，其中所述癌症是实体癌。

24.根据权利要求1、4-7、10-13、16-19或22-23中任一项所述的方法，根据权利要求2、4-6、8、10-12、14、16-18、20或22-23中任一项所述使用的PARP抑制剂，或者根据权利要求3-6、9-12、15-18或21-23中任一项所述的用途，其中所述PARP抑制剂是尼拉帕利或其药学上可接受的盐。

25.根据权利要求24所述的方法、根据权利要求24所述使用的PARP抑制剂或根据权利要求24所述的用途，其中所述PARP抑制剂是尼拉帕利甲苯磺酸盐一水合物。