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CN121311108A - 针对异噁草酰胺除草剂耐受性的方法和组合物 - Google Patents

针对异噁草酰胺除草剂耐受性的方法和组合物

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CN121311108A
CN121311108A CN202480038609.XA CN202480038609A CN121311108A CN 121311108 A CN121311108 A CN 121311108A CN 202480038609 A CN202480038609 A CN 202480038609A CN 121311108 A CN121311108 A CN 121311108A
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CN
China
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seq
plant
amino
isoxazole
difluorophenyl
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Pending
Application number
CN202480038609.XA
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A·凯珀
C·T·拉鲁
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Monsanto Technology LLC
Original Assignee
Monsanto Technology LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

本公开涉及生物技术领域，并且提供了用于赋予对异噁草酰胺除草剂的耐受性的新型重组DNA分子。本公开还提供了包含所述重组DNA分子的除草剂耐受转基因植物、种子、细胞和植物部分及其使用方法。

Description

针对异噁草酰胺除草剂耐受性的方法和组合物
相关申请的交叉引用
本申请要求2023年6月14日提交的美国临时申请序列号63/508,094和2023年12月5日提交的美国临时申请序列号63/606,492的优先权，其各自的全部公开内容以引用方式并入本文。
序列表的并入
名称为“MONS562WO_ST26.xml”的文件中所包含的序列表为77.1千字节(在MS-Windows中测量)并且于2024年5月23日创建，通过电子提交与本申请一起提交，并且以全文引用的方式并入本文。
技术领域
本公开涉及生物技术领域。更具体地，本公开涉及编码提供对异噁草酰胺(icafolin)除草剂的耐受性的酶的重组DNA分子。
背景技术
农作物生产通常利用使用生物技术方法产生的转基因性状。可将异源基因(也称为转基因)引入植物中，以产生转基因性状。转基因在植物中表达赋予植物诸如除草剂耐受性等性状。转基因除草剂耐受性性状的非限制性实例包括草甘膦耐受性、草铵膦耐受性、麦草畏耐受性和PPO除草剂耐受性。随着对常用除草剂具有抗性的杂草种类增加，本领域中需要新的除草剂耐受性性状。特别感兴趣的除草剂包括异噁草酰胺除草剂。异噁草酰胺除草剂提供对一系列除草剂抗性杂草的控制，从而使得赋予对这些除草剂的耐受性的性状在耕作系统中特别有用。在特定实施方案中，异噁草酰胺耐受性性状可与一种或多种其他除草剂耐受性性状组合。
发明内容
一方面，本公开提供了一种重组DNA分子，其包含与编码多肽的多核苷酸序列可操作地连接的异源启动子，该多肽包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28具有至少约94%序列同一性的氨基酸序列，其中该异源启动子在植物细胞中是有功能的。在一个实施方案中，所编码的多肽赋予对异噁草酰胺除草剂的耐受性。在另一个实施方案中，多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31具有至少约95%序列同一性，或与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36具有至少约85%序列同一性的核酸序列。在又一个实施方案中，所编码的多肽包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在再一个实施方案中，核酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35和SEQ ID NO:36。在一个实施方案中，多核苷酸序列还包含编码靶向序列的核酸序列，该靶向序列起到将所编码的多肽定位在细胞内的作用。在另一个实施方案中，异噁草酰胺除草剂选自由以下组成的组：(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]-氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；以及它们中的任一者的组合。在又一个实施方案中，本公开提供了一种包含如本文所描述的重组DNA分子的DNA构建体。在一个实施方案中，DNA构建体可包含重组DNA分子，该重组DNA分子包含与编码多肽的多核苷酸序列可操作地连接的异源启动子，该多肽包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:16、SEQID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28具有至少约94%序列同一性的氨基酸序列，其中该异源启动子在植物细胞中是有功能的。在另一个实施方案中，将本公开的重组DNA分子整合到转基因植物、种子、植物部分或细胞的基因组中。
在另一方面，本公开提供了一种转基因植物、种子、细胞或植物部分，其包含重组DNA分子，该重组DNA分子包含与编码多肽的多核苷酸序列可操作地连接的异源启动子，该多肽包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28具有至少约85%序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，转基因植物、种子、细胞或植物部分具有对异噁草酰胺除草剂的耐受性。在另一个实施方案中，转基因植物、种子、细胞或植物部分是大豆、玉米、棉花、大麦、高粱、水稻、小麦、甘蔗、甜菜、苜蓿或芸苔属植物、种子、细胞或植物部分。在又一个实施方案中，异噁草酰胺除草剂选自由以下组成的组：(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]-氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；以及它们中的任一者的组合。在再一个实施方案中，本公开的转基因植物、种子、细胞或植物部分可包含对至少一种另外的除草剂的耐受性。
在又一方面，本公开提供了一种赋予植物、种子、细胞或植物部分除草剂耐受性的方法，该方法包括使本公开的重组DNA分子在该植物、种子、细胞或植物部分中表达。在一个实施方案中，重组DNA分子包含与编码多肽的多核苷酸序列可操作地连接的异源启动子，该多肽包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28具有至少约94%序列同一性的氨基酸序列，其中该异源启动子在植物细胞中是有功能的。在另一个实施方案中，植物、种子、细胞或植物部分具有对异噁草酰胺除草剂的耐受性。在又一个实施方案中，异噁草酰胺除草剂选自由以下组成的组：(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]-氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；以及它们中的任一者的组合。
在再一方面，本公开提供了一种产生转基因植物或其部分的方法，该方法包括：a)将包含异源启动子的重组DNA分子引入植物细胞中，该异源启动子与编码多肽的多核苷酸序列可操作地连接，该多肽包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28具有至少约85%序列同一性的氨基酸序列；以及b)从包含该重组DNA分子的细胞或其后代细胞再生该转基因植物或其部分。在一个实施方案中，该方法还可包括选择具有对异噁草酰胺除草剂的耐受性的再生的转基因植物。在另一个实施方案中，异噁草酰胺除草剂选自由以下组成的组：(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]-氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；以及它们中的任一者的组合。在又一个实施方案中，该方法还可包括使再生的转基因植物与其自身或与第二植物杂交以产生种子。在再一个实施方案中，所编码的多肽包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:16、SEQID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的氨基酸序列。在一个实施方案中，多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31具有至少约95%序列同一性，或与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:20；SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36具有至少约85%序列同一性的核酸序列。在另一个实施方案中，该方法还可包括使包含重组DNA分子的再生的转基因植物或其后代植物与其自身或第二植物杂交以产生种子；其中该种子包含该重组DNA分子。在又一个实施方案中，本公开提供了一种通过本文所描述的方法产生的种子。在再一个实施方案中，本公开进一步提供了一种通过本文所描述的方法产生的转基因植物或其部分，其中该转基因植物或其部分包含重组DNA分子。
一方面，本公开提供了一种用于控制植物生长区域中的杂草的方法，该植物生长区域包含本公开的转基因植物或种子，该方法包括使该植物生长区域与异噁草酰胺除草剂接触，其中该转基因植物或种子对该异噁草酰胺除草剂耐受，并且其中杂草在该植物生长区域中得到控制。在一个实施方案中，异噁草酰胺除草剂选自由以下组成的组：(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]-氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；以及它们中的任一者的组合。在另一个实施方案中，转基因植物或种子是大豆、玉米、棉花、大麦、高粱、水稻、小麦、甘蔗、甜菜、苜蓿或芸苔属植物或种子。
在另一方面，本公开提供了一种鉴定对异噁草酰胺除草剂和至少一种另外的除草剂具有耐受性的植物的方法，该方法包括：a)获得本公开的转基因植物，该转基因植物包含对异噁草酰胺除草剂和至少一种另外的除草剂的耐受性；b)将该至少一种另外的除草剂施用于该植物或其部分；以及c)将该植物鉴定为对该至少一种另外的除草剂表现出耐受性。
在又一方面，本公开提供了一种用于减少植物生长区域中除草剂耐受杂草的发育的方法，该植物生长区域包含本公开的转基因植物或种子，该转基因植物或种子包含对异噁草酰胺除草剂和至少一种另外的除草剂的耐受性，该方法包括使该植物生长区域与该异噁草酰胺除草剂和至少一种另外的除草剂接触，其中该转基因植物或种子对该异噁草酰胺除草剂和该至少一种另外的除草剂耐受。在一个实施方案中，异噁草酰胺除草剂选自由以下组成的组：(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]-氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；以及它们中的任一者的组合。在另一个实施方案中，该至少一种另外的除草剂选自由以下组成的组：ACC酶抑制剂、ALS抑制剂、EPSPS抑制剂、合成生长素、光合作用抑制剂、谷氨酰胺合成抑制剂、HPPD抑制剂、PPO抑制剂、PDS抑制剂和长链脂肪酸抑制剂。
本公开的任何方面或实施方案可与本文所描述的任何其他方面或实施方案组合使用。
序列简述
SEQ ID NO:1是长芒苋(Amaranthus palmeri)CYP12蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:2是长芒苋CYP13蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是长芒苋CYP14蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:4是长芒苋CYP15蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是包含在位置2处插入的丝氨酸氨基酸的CYP12蛋白变体的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是编码SEQ ID NO:1的长芒苋核苷酸序列。
SEQ ID NO:7是编码SEQ ID NO:2的长芒苋核苷酸序列
SEQ ID NO:8是编码SEQ ID NO:3的长芒苋核苷酸序列。
SEQ ID NO:9是编码SEQ ID NO:4的长芒苋核苷酸序列
SEQ ID NO:10是编码SEQ ID NO:5的核苷酸序列，密码子经优化以用于双子叶植物表达。
SEQ ID NO:11是编码SEQ ID NO:2的核苷酸序列，密码子经优化以用于双子叶植物表达。
SEQ ID NO:12是编码SEQ ID NO:3的核苷酸序列，密码子经优化以用于双子叶植物表达。
SEQ ID NO:13是编码SEQ ID NO:4的核苷酸序列，密码子经优化以用于双子叶植物表达。
SEQ ID NO:14是包含拟南芥(Arabidopsis thaliana)泛素3的启动子、前导序列和内含子的表达元件的核苷酸序列。
SEQ ID NO:15是蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)光系统II的终止子序列的核苷酸序列。
SEQ ID NO:16是长芒苋CYP21蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:17是长芒苋CYP52蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18是编码SEQ ID NO:16的长芒苋核苷酸序列。
SEQ ID NO:19是编码SEQ ID NO:17的长芒苋核苷酸序列。
SEQ ID NO:20是编码SEQ ID NO:16的核苷酸序列，密码子经优化以用于双子叶植物表达。
SEQ ID NO:21是编码SEQ ID NO:17的核苷酸序列，密码子经优化以用于双子叶植物表达。
SEQ ID NO:22是编码SEQ ID NO:17的核苷酸序列，密码子经优化以用于单子叶植物表达。
SEQ ID NO:23是糙果苋(Amaranthus tuberculatus)CYP28蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:24是编码SEQ ID NO:23的糙果苋核苷酸序列。
SEQ ID NO:25是编码SEQ ID NO:23的核苷酸序列，密码子经优化以用于双子叶植物表达。
SEQ ID NO:26是繁穗苋(Amaranthus cruentus)CYP34蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:27是长芒苋CYP55蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:28是长芒苋CYP56蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO:29是编码SEQ ID NO:26的繁穗苋核苷酸序列。
SEQ ID NO:30是编码SEQ ID NO:27的长芒苋核苷酸序列。
SEQ ID NO:31是编码SEQ ID NO:28的长芒苋核苷酸序列。
SEQ ID NO:32是编码SEQ ID NO:26的核苷酸序列，密码子经优化以用于双子叶植物表达。
SEQ ID NO:33是编码SEQ ID NO:27的核苷酸序列，密码子经优化以用于双子叶植物表达。
SEQ ID NO:34是编码SEQ ID NO:27的核苷酸序列，密码子经优化以用于单子叶植物表达。
SEQ ID NO:35是编码SEQ ID NO:28的核苷酸序列，密码子经优化以用于双子叶植物表达。
SEQ ID NO:36是编码SEQ ID NO:28的核苷酸序列，密码子经优化以用于单子叶植物表达。
附图说明
图1：显示了遵循各种异噁草酰胺处理方案的代表性大豆植物。在处理后3周拍摄照片。
具体实施方式
以下提供详细描述以帮助本领域技术人员实践本公开的实施方案。在不背离本公开的实质或范围的情况下可以对本文描述的实施方案进行修改和变动。
本公开提供了编码赋予对异噁草酰胺除草剂的耐受性的细胞色素P450酶(CYP)的新型重组DNA分子。CYP酶是据报道催化不同底物上的大量反应的酶超家族的成员，并且见于原核和真核物种两者中。细胞色素P450超家族是植物中最大的酶促蛋白家族，具有数百个成员，这些成员参与具有不同和复杂功能的许多代谢途径(Xu等人，The cytochromeP450 superfamily: Key players in plant development and defense,J. of Integrative Agric., 14:9, 1673-1686, 2015)。一些CYP酶与在某些杂草物种中观察到的除草剂抗性有关(参见，例如，Siminszky, B. Plant cytochrome P450-mediatedherbicide metabolism.Phytochem Rev5, 445–458, 2006)。植物P450酶被命名并归类为CYP71-CYP99和CYP701-CYP999基因家族(参见Nelson DR. Cytochrome P450 diversityin the tree of life.Biochim Biophys Acta Proteins Proteom. 1866 (1):141-154.2018)。
CYP14和CYP15属于细胞色素P450酶的CYP81E亚家族。CYP81E8基因已被鉴定为在对除草剂2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)具有抗性的水麻(糙果苋)群体中差性异表达(参见PCT公开号WO2022/051340和Giacomini,等人，Coexpression Clusters and Allele-SpecificExpression in Metabolism-Based Herbicide Resistance. Genome Biol Evol.;12:2267-2278, 2020)。类似地，在对4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂除草剂环磺酮(tembotrione)具有抗性的长芒苋群体中也注意到CYP81E8基因的表达增加(参见Kuepper,A., Molecular genetics of herbicide resistance in palmer amaranth (Amaranthus palmeri): Metabolic tembotrione resistance and geographic origin ofglyphosate resistance PhD Thesis., Colorado State University, Fort Collins,CO, 2018以及Aarthy等人,Front. Agron.，第4卷，Rapid metabolism, and increasedexpression of CYP81E8 gene confer high level of resistance to tembotrione ina multiple-resistant Palmer amaranth, 2022 https://doi.org/10.3389/fagro.2022.1010292)。
在某些实施方案中，本公开进一步提供了编码用于在细胞和植物中表达的CYP蛋白的载体和表达盒。还提供了产生对异噁草酰胺除草剂耐受的细胞和植物的方法。本公开进一步提供了使用蛋白质工程化技术和生物信息学工具来获得和改善赋予异噁草酰胺耐受性的酶的方法和组合物。
A.异噁草酰胺除草剂
异噁草酰胺是一种新型出苗后异噁唑除草剂，其作用于双子叶(阔叶)和单子叶(窄叶/草)杂草。异噁草酰胺具有以下结构：
(2R, 4R)-异构体(酸形式)
(2S, 4S)-异构体(酸形式)
在某些实施方案中，异噁草酰胺可以作为两种异构体(2R, 4R或2S, 4S)的混合物施用，或者可以作为单独的异构体施用。在一些实施方案中，异噁草酰胺可以以酸形式(如上所示)或作为甲酯(如下所示)施用。
(2R, 4R)-异构体(甲酯)
(2S, 4S)-异构体(甲酯)
可根据本公开的实施方案使用的异噁草酰胺除草剂的非限制性实例包括：(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]-氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸，以及它们中的任一者的组合。
异噁草酰胺和相关化合物描述于美国专利申请公开号2021/292312中，其公开内容以全文引用的方式并入本文。
B.重组多核苷酸分子和所编码的蛋白质
在具体方面，本公开提供了重组DNA分子和蛋白质。如本文所用，术语“重组”是指非天然存在的DNA、蛋白质、细胞、种子或生物体，其是遗传工程化的结果，且因此通常不见于自然界中。如本文所用，“重组DNA分子”是包含在自然界中不天然存在且因此是人为干预的结果的DNA序列的DNA分子，诸如包含至少两个彼此异源的DNA分子的DNA分子。在一个实施方案中，重组DNA分子是本文提供的编码赋予对异噁草酰胺除草剂的耐受性的蛋白质的DNA分子，该DNA分子可操作地连接至异源调控元件或其他元件，诸如异源启动子。如本文所用，“重组蛋白”是包含不天然存在且因此是人为干预的结果的氨基酸序列的蛋白质。在一个实施方案中，重组蛋白可以是工程化蛋白或嵌合蛋白。在另一个实施方案中，重组细胞、种子或生物体可以是包含转基因DNA的细胞、种子或生物体。重组细胞、种子或生物体可以是例如作为植物转化的结果产生并且包含重组DNA分子的转基因细胞、种子、植物或植物部分。
如本文所用，术语“异源”是指在没有人为干预的情况下，在经遗传修饰的细胞中不天然存在或不以相同形式或结构天然存在的多核苷酸分子或蛋白质。例如，异源多核苷酸分子可不天然存在于被转化或修饰的植物物种中，或者可以以不同于在被转化或修饰的物种中发现的天然表达模式或基因组背景的方式或基因组背景表达。例如，在一些实施方案中，异源多核苷酸分子可过表达。在特定实施方案中，异源多核苷酸分子可以是两种或更多种多核苷酸分子的组合，其中这种组合通常不见于自然界中。在某些实施方案中，两种多核苷酸分子可来源于不同的物种，或者可来源于不同的基因，如来自相同物种的不同基因或来自不同物种的相同基因。在一些实施方案中，异源多核苷酸分子可包含不见在任何天然存在的多核苷酸分子中并置或可操作地连接的两个多核苷酸序列。在进一步的实施方案中，异源多核苷酸分子可包含与可转录的多核苷酸序列可操作地连接的启动子或其他调控序列，其中该启动子或其他调控序列和该可转录的多核苷酸序列不在任何天然存在的多核苷酸分子中可操作地连接。
如本文所用，短语“通常不见于自然界中”意指在没有人为干预的情况下不见于自然界中。在某些实施方案中，重组多核苷酸或蛋白质分子可包含以下多核苷酸或蛋白质序列，该多核苷酸或蛋白质序列(i)与在自然界中彼此邻近存在的其他多核苷酸或蛋白质序列分开，或(ii)与在自然界中彼此不邻近的其他多核苷酸或蛋白质序列相邻(或连续)。在一些实施方案中，重组多核苷酸分子或蛋白质还可以指已经在细胞外遗传工程化或构建的多核苷酸或蛋白质分子或序列。例如，重组多核苷酸分子可包括任何工程化或人造质粒、载体或构建体，并且可包括线性或环状多核苷酸分子。在某些实施方案中，此类质粒、载体或构建体可含有各种维持元件，包括例如原核复制起点或选择性标记基因，以及一个或多个转基因或表达盒。
如本文所用，术语“分离的”是指至少部分地使分子与在其天然状态下通常与它缔合的其他分子分离。在一个实施方案中，术语分离的是指与在其天然状态下通常位于DNA分子侧翼的核酸分离的DNA分子。例如，编码天然存在于特定植物物种中的蛋白质的DNA分子如果不在编码该蛋白质的该DNA分子所天然见于的植物物种的DNA内，则是分离的DNA分子。因此，在本文中例如因重组DNA或植物转化技术而融合至或可操作地连接至在自然界中不相关的一个或多个其他DNA分子的DNA分子被认为是分离的。此类分子即使在与其他DNA分子一起整合至宿主细胞的染色体中或存在于核酸溶液中时也被认为是分离的。
如本文所用，术语“蛋白质编码DNA分子”是指包含编码蛋白质的核苷酸序列的DNA分子。如本文所用，“蛋白质编码序列”是指编码蛋白质的DNA序列。如本文所用，“序列”是指核苷酸或氨基酸的依序排列。在某些实施方案中，蛋白质编码序列的边界可由5'末端处的翻译起始密码子和3'末端处的翻译终止密码子确定。在一些实施方案中，蛋白质编码分子可包含编码蛋白质序列的DNA序列。如本文所用，“转基因表达”、“表达转基因”、“蛋白质表达”和“表达蛋白质”是指通过将DNA分子转录成信使RNA (mRNA)并将mRNA翻译成多肽链，多肽链最终折叠成蛋白质的过程来产生蛋白质。在某些实施方案中，蛋白质编码DNA分子可与异源启动子在DNA构建体中可操作地连接，用于在用重组DNA分子转化的细胞中表达蛋白质。如本文所用，“可操作地连接”是指以使得一个可以影响另一个的功能的方式连接的两个DNA分子。可操作地连接的DNA分子可以是单个连续分子的一部分，并且可以相邻或可以不相邻。举例来说，在DNA构建体中启动子与编码蛋白质的DNA分子可操作地连接，其中两个DNA分子如此排列使得启动子可影响转基因的表达。
如本文所用，“DNA构建体”是指包含两个或更多个异源DNA序列的重组DNA分子。DNA构建体可用于转基因表达，并且可包含在载体或质粒内。DNA构建体可用于载体中以用于转化目的，即将异源DNA引入宿主细胞中，以产生转基因植物和细胞，且因此也可包含在转基因植物、种子、细胞或植物部分的质体DNA或基因组DNA中。如本文所用，“载体”是指可用于细菌或植物转化目的的任何重组DNA分子。本公开提供的重组DNA分子可例如作为构建体的一部分插入载体中，该构建体具有与基因表达元件可操作地连接的重组DNA分子，该基因表达元件在植物中起作用以影响由该重组DNA分子编码的工程化蛋白的表达。可用于操作DNA分子以制备和使用重组DNA构建体和植物转化载体的一般方法本领域中熟知的，并且详细描述于例如包括MR Green和J Sambrook, “Molecular Cloning: A LaboratoryManual” (第四版) ISBN:978-1-936113-42-2, Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY (2012)的手册和实验规程中。在某些实施方案中，用于DNA构建体或包含DNA构建体的载体的组件可包括与可转录DNA序列可操作地连接的一个或多个基因表达元件，诸如以下：用于表达可操作地连接的DNA的启动子、可操作地连接的编码蛋白质的DNA分子和可操作地连接的3'非翻译区(UTR)。可用于实践本公开的实施方案的基因表达元件包括但不限于以下类型的元件中的一者或多者：启动子、5' UTR、增强子、前导序列、顺式作用元件、内含子、靶向序列、3' UTR和一种或多种选择性标记转基因。
本公开的DNA构建体可包含与本公开提供的编码蛋白质的DNA分子可操作地连接的启动子，其中启动子驱动重组蛋白分子的表达。可用于实践本公开的实施方案的启动子包括在细胞中起作用以表达可操作地连接的多核苷酸的那些启动子，诸如细菌启动子、病毒启动子或植物启动子。植物启动子是多种多样的并且是本领域中熟知的，并且包括例如诱导型、病毒型、合成型、组成型、时间调控型、空间调控型和/或时空调控型的那些启动子。
在本公开的一个实施方案中，本文提供的DNA构建体包含与编码赋予对异噁草酰胺除草剂的耐受性的多肽分子的异源核酸分子可操作地连接的靶向序列，其中该靶向序列促进将多肽分子定位在细胞内。靶向序列在本领域中已知为信号序列、靶向肽、定位序列和转运肽。靶向序列的非限制性实例包括叶绿体转运肽(CTP)、线粒体靶向序列(MTS)和叶绿体和线粒体双重靶向肽。通过促进蛋白质在细胞内的定位，靶向序列可增加重组蛋白的累积，保护蛋白质免于蛋白水解降解，和/或提高除草剂耐受性水平，从而降低施用除草剂后转基因细胞、种子或生物体中的损伤水平。
可以结合本公开使用的CTP和其他靶向分子是本领域中已知的，并且包括但不限于拟南芥EPSPS CTP (Klee等人,Mol Gen Genet.210:437-442, 1987)，矮牵牛EPSPS CTP(della-Cioppa等人,PNAS83:6873-6877, 1986)，玉米cab-m7信号序列(Becker等人,Plant Mol Biol.20:49-60, 1992；PCT WO 97/41228)，线粒体前序列(例如，Silva Filho等人,Plant Mol Biol30:769-780, 1996)和豌豆谷胱甘肽还原酶信号序列(Creissen等人,Plant J.8:167-175, 1995；PCT WO 97/41228)。
本公开的重组DNA分子可以通过本领域已知的方法完全或部分地合成和修饰，其中期望提供可用于DNA操作的序列(诸如限制性酶识别位点或基于重组的克隆位点)、植物优选序列(诸如植物密码子使用或Kozak共有序列)或可用于DNA构建体设计的序列(诸如间隔区或接头序列)。在特定实施方案中，本公开的重组DNA分子或蛋白质可包含或编码与SEQID NO:1-36中的任一者或其片段具有至少约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或100%序列同一性的序列，包括其间可导出的任何范围。在一些实施方案中，当在植物细胞中表达时，本公开的重组DNA分子或蛋白质可赋予异噁草酰胺除草剂耐受性。在某些实施方案中，来源于SEQ ID NO:1-36中任一者的序列可具有其所来源的碱基序列的活性，例如除草剂耐受性活性。如本文所用，术语“序列同一性百分比”或“序列同一性%”是指当对两个序列进行最佳比对(在比较窗口中具有共计不到参考序列的20%的适当核苷酸或氨基酸插入、缺失或空位)时，与测试(“目标”)序列(或其互补链)相比，在参考(“查询”)序列(或其互补链)的线性多核苷酸或多肽序列中相同核苷酸或氨基酸的百分比。用于比对比较窗口的最佳序列比对是本领域技术人员熟知的，并且可通过诸如Smith和Waterman的局部同源性算法、Needleman和Wunsch的同源性比对算法、Pearson和Lipman的相似性搜索方法等工具来执行，并且通过这些算法(诸如作为以下序列分析软件包的一部分可得到的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA：GCG® WisconsinPackage® (Accelrys Inc., San Diego, CA)、MEGAlign (DNAStar Inc., 1228 S. ParkSt., Madison, WI 53715)和MUSCLE (3.6版) (Edgar, “MUSCLE: multiple sequencealignment with high accuracy and high throughput”Nucleic Acids Research32(5):1792-7 (2004)))的计算机化实施方式来执行，例如利用默认参数。测试序列与参考序列的比对区段的“同一性分数”为两个所比对序列共同拥有的相同组分的数目除以参考序列区段中所比对的部分(即整个参考序列或参考序列的更小的确定部分)中的组分总数目。序列同一性百分比以同一性分数乘以100表示。可将一个或多个序列与全长序列或其部分或与更长的序列比较。
本公开的重组DNA分子或蛋白质可包含或编码SEQ ID NO:1-36中任一者的片段。例如，本公开提供了包含SEQ ID NO:6-15、18-22、24-25或29-36的至少50个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少300个、至少350个、至少400个、至少450个、至少500个、至少550个、至少600个、至少650个、至少700个、至少750个、至少800个、至少850个、至少900个、至少950个、至少1000个、至少1100个、至少1200个、至少1300个、至少1400个、至少1500个、至少1600个、至少1700个、至少1800个、至少1900个、至少2000个或更多个连续核苷酸的DNA分子。SEQ ID NO:6-15、18-22、24-25或29-36的此类片段可具有其所来源的碱基序列的活性，例如除草剂耐受性活性。在一些实施方案中，本公开的蛋白质提供了包含SEQ IDNO:1-5、16、17、23或26-28中任一者的至少25、至少50、至少75、至少100、至少125、至少150、至少175、至少200、至少225、至少250、至少300、至少325、至少350、至少375、至少400、至少425、至少450、至少475、至少500、至少525、至少550、至少575、至少600、至少625、至少650、至少675、至少700、至少725、至少750、至少775、至少800、至少825、至少850、至少875、至少900、至少925、至少950、至少975、至少1000、或更多个连续氨基酸的片段。SEQ ID NO:1-5、16、17、23或26-28的此类片段可具有其所来源的碱基序列的活性，例如除草剂耐受性活性。
工程化蛋白可通过改变(即，修饰)野生型蛋白以产生新蛋白质来产生，该新蛋白具有经修饰特性，例如特定的细胞定位模式，诸如靶向叶绿体或线粒体，或有用蛋白质特性，诸如改变的Vmax、Km、Ki、IC50、Kcat、底物特异性、抑制剂/除草剂特异性、底物选择性、与细胞中的其他组分(诸如配偶体蛋白或膜)相互作用的能力以及蛋白质稳定性等的新组合。在某些实施方案中，可在蛋白质中的特定氨基酸位置处进行修饰。在一个实施方案中，可以用不同的氨基酸取代在自然界(即，在野生型蛋白中)的特定氨基酸位置处发现的氨基酸。因此，本公开提供的工程化蛋白提供了相对于自然界中发现的类似蛋白质具有一种或多种改变的蛋白质特性的新蛋白质。在本公开的一个实施方案中，工程化蛋白具有改变的蛋白质特性，诸如与类似的野生型蛋白相比引起对一种或多种除草剂的敏感性降低的那些特性，或改进的赋予表达工程化蛋白的转基因植物除草剂耐受性的能力。在另一个实施方案中，本公开提供了一种工程化蛋白和编码它的重组DNA分子，该工程化蛋白分子包含至少一个选自表1的氨基酸取代，并且与本文提供的工程化蛋白序列中(包括但不限于包含SEQ IDNO:1-36中的任一者或由其编码的那些蛋白质序列)的任一者具有至少约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%或约99%序列同一性，包括其间可导出的任何范围。氨基酸取代可作为蛋白质中的单个氨基酸取代或与一个或多个其他突变(诸如一个或多个其他氨基酸取代、缺失或添加)组合进行。突变可通过本领域技术人员已知的任何方法进行。
表1：氨基酸取代。
如本文所用，“野生型”意指天然存在的类似但不相同的蛋白质形式。“野生型DNA分子”或“野生型蛋白”是DNA分子或蛋白质的天然存在形式，即预先存在于自然界中的DNA分子或蛋白质的形式。
C.通过遗传工程化产生的经遗传修饰的植物
已经开发了各种遗传工程化技术，并且本领域技术人员可以利用这些技术将转基因或编辑的性状引入植物中。这些方法通常涉及将多核苷酸序列递送到植物细胞中，该多核苷酸序列通常可以是异源或重组多核苷酸分子。异源或重组多核苷酸分子可包括例如至少一种转基因、表达盒或RNA分子，诸如引导RNA (gRNA)。在具体实施方案中，异源或重组多核苷酸分子可以是核糖核蛋白(RNP)的一部分或其片段或引导RNA。异源或重组多核苷酸分子的表达可例如产生用于基因组编辑的gRNA/位点特异性核酸酶复合物。在某些实施方案中，通过将单一遗传基因座或转基因引入到植物的基因组中来将性状引入到植物中。在植物的基因组DNA中修饰、删除或插入转基因、编辑、突变和多核苷酸序列的遗传工程化方法是本领域中已知的。使用基因组编辑技术编辑植物细胞基因组或内源植物基因的分子方法是本领域中已知的。根据本发明的实施方案，可以使用本文所描述的方法将包含或编码基因组编辑工具或机器的多核苷酸或DNA分子，诸如引导RNA、位点特异性核酸酶和/或模板DNA分子引入植物细胞中。
如本文所用，“经遗传修饰的”植物、植物部分、植物组织或植物细胞包含遗传修饰。如本文所用，“遗传修饰”是指使用转化、诱变或基因组编辑技术将一个或多个转基因、突变或编辑引入植物、植物部分或植物细胞的基因组中。除了基因组编辑技术之外，诱变技术可包括任何化学、物理学、放射学或生物学(例如，转座子介导的)诱变技术或诱变剂。
如本文所用，“转基因”植物、植物部分、植物组织或植物细胞具有整合到植物、植物部分、植物组织或植物细胞的基因组中的外源核酸序列、基因组编辑或转基因。如本文所用，“转基因性状”是指由整合到植物基因组中的转基因、核酸序列、基因组编辑或转基因的存在传递或赋予的特性或表型。由于这种基因组改变，转基因植物明显不同于相关的野生型植物，并且转基因性状是不天然见于野生型植物中的性状。在某些实施方案中，本公开的转基因植物包含本文提供的重组DNA分子和工程化蛋白。
基因组编辑可用于在植物基因组中的所需靶位点处进行一个或多个编辑或突变，诸如以改变一个或多个基因的表达或活性，或在植物基因组中的所需位置处整合插入序列或转基因。可潜在地选择植物基因组内的任何位点或基因座，以用于进行转基因、构建体或可转录DNA序列的基因编辑或定点整合。如本文所用，基因组编辑或定点整合的“靶位点”是指植物基因组内的多核苷酸序列的位置，其被位点特异性核酸酶结合并切割，以将双链断裂(DSB)或单链切口引入到植物基因组内多核苷酸序列的核酸主链和/或其互补DNA链中。靶位点可包含例如至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个、至少26个、至少27个、至少29个或至少30个连续核苷酸。RNA引导的核酸酶的“靶位点”可包含双链核酸(DNA)分子的互补链或靶位点处的染色体的序列。位点特异性核酸酶可以与靶位点结合，如经由非编码引导RNA (例如但不限于如本文进一步描述的CRISPR RNA(crRNA)或单引导RNA (sgRNA))。本文提供的非编码引导RNA可以与靶位点互补(例如，与双链核酸分子的任一条链或靶位点处的染色体互补)。将要了解的是，非编码引导RNA与靶位点结合或杂交可以不需要完全的同一性或互补性。例如，例如，靶位点与非编码RNA之间可以容许至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少8个错配(或更多)。“靶位点”还指植物基因组内的多核苷酸序列的位置，其被可以不由非编码RNA分子引导的任何其他位点特异性核酸酶结合并切割，诸如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、巨核酸酶等，以将DSB或单链切口引入到多核苷酸序列和/或其互补DNA链中。如本文所用，“位点特异性核酸酶”包括任何锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、核糖核蛋白、巨核酸酶、重组酶、转座酶或可将双链断裂(DSB)或单链切口引入靶位点(诸如植物细胞的基因组内的靶位点)处或附近的多核苷酸序列中的其他核酸酶。如本文所用，“靶区域”或“靶向区域”是指侧接两个或更多个靶位点的多核苷酸序列或区域。不受限制地，在一些实施方案中，靶区域可经受突变、缺失、插入或倒位。如本文所用，“侧接”在用于描述多核苷酸序列或分子的靶区域时是指多核苷酸序列或分子的围绕靶区域的两个或更多个靶位点，其中在靶区域的每一侧有一个靶位点。
如本文所用，“靶向基因组编辑技术”是指允许使用位点特异性核酸酶对植物的基因组中的特定位置进行精确和/或靶向编辑(即，编辑是基本上或完全非随机的)的任何方法、方案或技术，所述位点特异性核酸酶是诸如大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、RNA指导的核酸内切酶(例如，CRISPR/Cas9系统或CRISPR/Cas12a系统)、TALE (转录激活因子样效应物)-核酸内切酶(TALEN)、重组酶或转座酶。如本文所用，“编辑”或“基因组编辑”是指产生内源植物基因组核酸序列的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少75个、至少100个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个、至少5000个、至少10,000个或至少25,000个核苷酸的靶向突变、缺失、插入、倒位或取代。如本文所用，“编辑”或“基因组编辑”还可以涵盖将至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少75、至少100、至少250、至少500、至少750、至少1000、至少1500、至少2000、至少2500、至少3000、至少4000、至少5000、至少10,000或至少25,000个核苷酸靶向插入或定点整合到植物的内源基因组中。单数形式的“编辑”或“基因组编辑”是指一个此类靶向突变、缺失、倒位、取代或插入，而复数的“编辑”或“基因组编辑”是指两个或更多个靶向突变、缺失、倒位、取代和/或插入，其中每个“编辑”经由靶向基因组编辑技术引入。
根据一些实施方案，位点特异性核酸酶可与供体模板分子共递送以用作模板，用于通过修复由位点特异性核酸酶产生的双链断裂(DSB)或切口，在所需靶位点处进行所需编辑、突变或插入基因组中。根据一些实施方案，位点特异性核酸酶可以与包含可选择或可筛选标记基因的DNA分子共递送。
本文提供的位点特异性核酸酶可选自由以下组成的组：锌指核酸酶(ZFN)、TALE-内切核酸酶(TALEN)、巨核酸酶、RNA引导的内切核酸酶、重组酶、转座酶或其任意组合。参见例如Khandagale等人(Plant Biotechnol Rep10:327-343, 2016)；和Gaj等人(Trends Biotechnol. 31(7):397-405, 2013。锌指核酸酶(ZFN)是由与切割结构域(或切割半结构域)融合的工程化锌指DNA结合结构域组成的合成蛋白质，其可来源于限制性内切核酸酶(例如，FokI)。DNA结合结构域可以是规范的(C2H2)或非规范的(例如，C3H或C4)。取决于靶位点，DNA结合结构域可包含一个或多个锌指(例如，2、3、4、5、6、7、8、9个或更多个锌指)，但通常可由3-4个(或更多个)锌指组成。DNA结合结构域中的多个锌指可由接头序列分隔。通过修饰锌指DNA结合结构域可以将ZFN设计成切割双链DNA的几乎任何段。ZFN由单体形成二聚体，这些单体由与DNA结合结构域融合的非特异性DNA切割结构域(例如，来源于FokI核酸酶)组成，该DNA结合结构域包含被工程化以结合靶位点DNA序列的锌指阵列。可以改变和定制相对于锌指α-螺旋起点的位置-1、+2、+3和+6处的氨基酸(其有助于与靶位点的位点特异性结合)以适合特异性靶序列。其他氨基酸可形成共有主链以产生具有不同序列特异性的ZFN。
设计用于靶向特异性靶序列并与特异性靶序列结合的ZFN的方法和规则是本领域中已知的。参见例如美国专利申请公布第2005/0064474、2009/0117617和2012/0142062号。FokI核酸酶结构域可能需要二聚化来切割DNA，因此需要两个具有C末端区域的ZFN来结合切割位点的相对DNA链(分隔5-7 bp)。如果两个ZF结合位点是回文的，则ZFN单体可以切割靶位点。如本文所用的ZFN是广义的，并且包括无需另一ZFN协助即可切割双链DNA的单体ZFN。术语ZFN也可用于指被工程化成在同一位点合作切割DNA的ZFN对的一个或两个成员。因为锌指结构域的DNA结合特异性可以采用各种方法之一重新设计，所以在理论上可以构建定制的ZFN以靶向几乎任何靶序列(例如，在植物基因组中的某个基因处或附近)。用于工程化锌指结构域的公开可用的方法包括情境依赖性组装(CoDA)、寡聚池工程化(OPEN)和模块化组装。
转录激活因子样效应子(TALE)可以被工程化以结合实际上任何DNA序列，如在植物中的某个基因的基因组基因座处或附近。TALE具有由13-28个重复单体组成的中心DNA结合结构域，这些重复单体为33-34个氨基酸的重复单体。除了在位置12和13的高变氨基酸残基外，每个单体的氨基酸都是高度保守的。这两种可变氨基酸被称为重复可变双残基(RVD)。RVD的氨基酸对NI、NG、HD和NN分别优先识别腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤/腺嘌呤，并且RVD的调节可识别连续的DNA碱基。氨基酸序列与DNA识别之间的这种简单关系允许通过选择含有适当RVD的重复区段的组合来工程化特异性DNA结合结构域。
TALEN是通过将TALE DNA结合结构域与核酸酶结构域融合而产生的人工限制性酶。在一些方面，核酸酶选自由PvuII、MutH、TevI、FokI、AlwI、MlyI、SbfI、SdaI、StsI、CleDORF、Clo051和Pept071组成的组。当TALEN对的每个成员与侧接靶位点的DNA位点结合时，FokI单体二聚化，并导致双链DNA在靶位点断裂。如本文所用的术语TALEN是广义的，并且包括无需另一TALEN协助即可切割双链DNA的单体TALEN。术语TALEN也指在同一位点合作切割DNA的TALEN对的一个或两个成员。
除了野生型FokI切割结构域之外，还已经设计了具有突变的FokI切割结构域的变体以提高切割特异性和切割活性。FokI结构域以二聚体形式起作用，从而需要两个具有适当定向和间隔的具有针对靶基因组中的位点的独特DNA结合结构域的构建体。TALEN DNA结合结构域与FokI裂解结构域之间的氨基酸残基的数目与两个单独TALEN结合位点之间的碱基的数目两者均是用于实现高活性水平的参数。PvuII、MutH、和TevI切割结构域是用于与TALE一起使用的FokI和FokI变体的有用替代者。当与TALE偶联时，PvuII作为高特异性切割结构域发挥作用(参见Yank等人，PLoS One8:e82539，2013)。MutH能够在DNA中引入链特异性切口(参见Gabsalilow等人，Nucleic Acids Research. 41:e83，2013)。TevI在靶向位点处的DNA中引入双链断裂(参见Beurdeley等人，Nature Communications4:1762，2013)。
氨基酸序列与TALE结合结构域的DNA识别之间的关系允许可设计的蛋白质。诸如DNAWorks的软件程序可用于设计TALE构建体。设计TALE构建体的其他方法是本领域技术人员已知的。参见Doyle等人(Nucleic Acids Research40:W117-122, 2012)；Cermak等人(Nucleic Acids Research39:e82, 2011)；和tale-nt.cac.cornell.edu/about。另一方面，本文提供的TALEN能够产生靶向DSB。
位点特异性核酸酶可以是巨核酸酶。通常在微生物中确认的巨核酸酶，如归巢内切核酸酶的LAGLIDADG家族，是具有高活性和长识别序列(>14 bp)的独特酶，其导致靶DNA的位点特异性消化。天然存在的巨核酸酶的工程化形式通常具有延长的DNA识别序列(例如，14至40 bp)。巨核酸酶的工程化可能比ZFN和TALEN更具挑战性，因为巨核酸酶的DNA识别和切割功能交织在单一结构域中。诱变和高通量筛选的专门方法已经用于产生识别独特序列并具有提高的核酸酶活性的新型巨核酸酶变体。
位点特异性核酸酶可以是RNA引导的核酸酶。根据一些实施方案，RNA引导的内切核酸酶可选自由以下组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4、Cas12a (也称为Cpf1)、CasX、CasY及其任何同源物或修饰形式，以及Argonaute (Argonaute蛋白的非限制性实例包括嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)Argonaute (TtAgo)、激烈热球菌(Pyrococcus furiosus)Argonaute (PfAgo)、格氏嗜盐碱杆菌(Natronobacterium gregoryi)Argonaute(NgAgo)及其任何同源物或修饰形式)。根据一些实施方案，RNA引导的内切核酸酶是Cas9或Cas12a酶。RNA引导的核酸酶可作为含或不含引导RNA的蛋白质递送，或者引导RNA可以与RNA引导的核酸酶复合，并作为核糖核蛋白(RNP)递送。
对于RNA引导的内切核酸酶，可以进一步提供引导RNA分子，以经由碱基配对或杂交将内切核酸酶导向植物的基因组中的靶位点，从而在靶位点处或附近导致DSB或切口。引导RNA可作为gRNA分子或作为重组DNA分子、构建体或载体被转化或引入到植物细胞或组织中，该重组DNA分子、构建体或载体包含编码与启动子可操作地连接的引导RNA的可转录DNA序列。如本领域中所了解，引导RNA可包括例如CRISPR RNA (crRNA)、tracrRNA、单链引导RNA (sgRNA)或可将内切核酸酶引导或指导至基因组中的特定靶位点的任何其他RNA分子。来自化脓性链球菌的原型CRISPR相关蛋白Cas9天然结合两种RNA，即CRISPR RNA (crRNA)引导分子和反式作用CRISPR RNA (tracrRNA)，以组装CRISPR核糖核蛋白(crRNP)。“单链引导RNA”(或“sgRNA”)是包含通过接头序列共价连接tracrRNA的crRNA的RNA分子，其可以表达为单一RNA转录物或分子。引导RNA包含与植物基因组内的靶位点(如在某一基因处或附近)相同或互补的引导或靶向序列(本文也称为“间隔序列”)。引导RNA通常是不编码蛋白质的非编码RNA分子。引导RNA的引导序列长度可以为至少10个核苷酸，如长度为12-40个核苷酸、12-30个核苷酸、12-20个核苷酸、12-35个核苷酸、12-30个核苷酸、15-30个核苷酸、17-30个核苷酸或17-25个核苷酸，或者长度为约12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或更多个核苷酸。引导序列可以与基因组靶位点处的DNA序列的至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个、至少21个、至少22个、至少23个、至少24个、至少25个或更多个连续核苷酸是至少95%、至少96%、至少97%、至少99%或100%相同或互补的。
如本文所用，关于给定的序列，“互补体”、“互补序列”和“反向互补体”可互换使用。所有三个术语均指核苷酸序列的反向互补序列，即指以核苷酸的反向顺序与给定序列互补的序列。
如本文所用，术语“反义”是指与特定的DNA或RNA序列互补的DNA或RNA序列。反义RNA分子是单链核酸，由于序列的互补性，其可以与有义RNA链或序列或mRNA组合以形成双链体。术语“反义链”是指与“有义”链互补的核酸链。基因或基因座的“有义链”是具有与由该基因或基因座转录的RNA分子相同的序列的DNA或RNA的链(RNA中的尿嘧啶和DNA中的胸腺嘧啶除外)。
基因组中可存在前间区序列相邻基序(PAM)，紧邻与引导RNA的靶向序列互补的基因组靶位点序列的5’端并在其上游 – 即，在基因组靶位点的有义(+)链的紧下游(3’) (相对于引导RNA的靶向序列)，如本领域中所已知。参见例如Wu等人(Quant Biol.2(2):59-70，2014)。邻近靶位点的有义(+)链上的基因组PAM序列(相对于引导RNA的靶向序列)可包含5’-NGG-3’。然而，引导RNA的相应序列(即，在引导RNA的靶向序列的紧下游(3’))通常可与基因组PAM序列不互补。
在一些实施方案中，位点特异性核酸酶是重组酶。可以使用的重组酶的非限制性实例包括连接于DNA识别基序的丝氨酸重组酶、连接于DNA识别基序的酪氨酸重组酶或本领域中已知连接于DNA识别基序的任何重组酶。在某些实施方案中，位点特异性核酸酶是重组酶或转座酶，其可以是与DNA结合结构域连接或融合的DNA转座酶或重组酶。重组酶的非限制性实例包括选自由以下组成的组的酪氨酸重组酶：连接于本文提供的DNA识别基序的Cre重组酶、Gin重组酶、Flp重组酶和Tnp1重组酶。在本公开的一方面，本文提供的Cre重组酶或Gin重组酶系连于锌指DNA结合结构域、TALE DNA结合结构域或Cas9核酸酶。另一方面，选自由PhiC31整合酶、R4整合酶和TP-901整合酶组成的组的丝氨酸重组酶可连接于本文提供的DNA识别基序。在又一方面，选自由TALE-piggyBac和TALE-Mutator组成的组的DNA转座酶可连接于本文提供的DNA结合结构域。
若干位点特异性核酸酶，诸如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、巨核酸酶和TALEN不是RNA引导的，而是依赖于它们的蛋白质结构确定它们的靶位点以产生DSB或切口，或它们融合、栓系或连接至DNA结合蛋白结构域或基序。位点特异性核酸酶的蛋白质结构(或融合/连接/系连的DNA结合结构域)可将位点特异性核酸酶靶向至靶位点。根据许多这些实施方案，可根据已知方法设计、工程化和构建非RNA引导的位点特异性核酸酶，诸如重组酶、锌指核酸酶(ZFN)、巨核酸酶和TALEN，以靶向并结合至植物的内源基因的基因组基因座处或附近的靶位点，从而在这种基因组基因座处产生DSB或切口。由非RNA引导的位点特异性核酸酶产生的DSB或切口可经由DSB或切口的修复导致基因表达的敲低，这可通过细胞修复机制导致DSB或切口位点处的序列突变或插入。这种细胞修复机制可由供体模板分子引导。
如本文所用，可以是重组多核苷酸、DNA或RNA供体模板或序列的“供体分子”、“供体模板”或“供体模板分子”(统称为“供体模板”)被定义为具有同源核酸模板或序列(例如，同源序列)和/或插入序列的核酸分子，该插入序列用于经由植物细胞的基因组中的切口或DSB的修复而定点靶向插入或重组到植物细胞的基因组中。供体模板可以是包含一个或多个同源序列和/或用于靶向整合的插入序列的单独的DNA分子，或者供体模板可以是还包含一个或多个其他表达盒、基因/转基因和/或可转录DNA序列的DNA分子的序列部分(即，供体模板区域)。供体模板可以是包含一个或多个其他表达盒、基因/转基因和/或可转录DNA序列的农杆菌转移DNA (T-DNA)分子。例如，“供体模板”可用于转基因或构建体的定点整合，或作为模板将突变(诸如插入、缺失、取代等)引入到植物的基因组内的靶位点中。本文提供的靶向基因组编辑技术可包括使用一种或多种、两种或更多种、三种或更多种、四种或更多种或五种或更多种供体分子或模板。本文提供的供体模板可包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个基因或转基因和/或可转录DNA序列。替代地，供体模板可不包含基因、转基因或可转录DNA序列。
不受限制地，供体模板的基因/转基因或可转录DNA序列可包括例如杀虫抗性基因、除草剂耐受性基因、氮利用效率基因、水分利用效率基因、产量增加基因、营养品质基因、DNA结合基因、选择性标记基因、RNAi或抑制构建体、位点特异性基因组修饰酶基因、CRISPR/Cas9系统的单一引导RNA、CRISPR/Cas12a系统的引导RNA、基于双生病毒的表达盒或植物病毒表达载体系统。根据其他实施方案，供体模板的插入序列可包含蛋白质编码序列或编码非编码RNA分子的可转录DNA序列，其可以靶向用于抑制的内源基因。供体模板可包含与编码序列、基因或可转录DNA序列可操作地连接的启动子，诸如组成型启动子、组织特异性或组织优选启动子、发育阶段启动子或诱导型启动子。供体模板可包含前导序列、增强子、启动子、转录起始位点、5'-UTR、一个或多个外显子、一个或多个内含子、转录终止位点、区域或序列、3'-UTR和/或聚腺苷酸化信号，其各自可与编码非编码RNA、引导RNA、mRNA和/或蛋白质的编码序列、基因(或转基因)或可转录DNA序列可操作地连接。供体模板可以是单链或双链DNA或RNA分子或质粒。
供体模板的“插入序列”是设计用于靶向插入到植物细胞的基因组中的序列，其可以具有任意合适的长度。例如，供体模板的插入序列长度可以是2个与50,000个之间、2个与10,000个之间、2个与5000个之间、2个与1000个之间、2个与500个之间、2个与250个之间、2个与100个之间、2个与50个之间、2个与30个之间、15个与50个之间、15个与100个之间、15个与500个之间、15个与1000个之间、15个与5000个之间、18个与30个之间、18个与26个之间、20个与26个之间、20个与50个之间、20个与100个之间、20个与250个之间、20个与500个之间、20个与1000个之间、20个与5000个之间、20个与10,000个之间、50个与250个之间、50个与500个之间、50个与1000个之间、50个与5000个之间、50个与10,000个之间、100个与250个之间、100个与500个之间、100个与1000个之间、100个与5000个之间、100个与10,000个之间、250个与500个之间、250个与1000个之间、250个与5000个之间或250个与10,000个之间的核苷酸或碱基对。供体模板还可具有至少一个同源序列或同源臂，如两个同源臂，以经由同源重组指导将突变或插入序列整合到植物的基因组内的靶位点中，其中同源序列或同源臂与植物的基因组内的靶位点处或附近的序列相同或互补，或具有同一性百分比或互补性百分比。当供体模板包含同源臂和插入序列时，同源臂将侧接或围绕供体模板的插入序列。每个同源臂与植物的基因组内的靶DNA序列的至少20个、至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少150个、至少200个、至少250个、至少500个、至少1000个、至少2500个或至少5000个连续核苷酸是至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少99%或100%相同或互补的。
本领域中已知用于定点整合的任何方法均可用于本公开。在存在具有插入序列的供体模板分子的情况下，可以通过供体模板的同源臂与植物基因组之间的同源重组或通过非同源末端连接(NHEJ)来修复DSB或切口，从而导致将插入序列定点整合到植物基因组中，以在DSB或切口的位点处产生靶向插入事件。因此，如果转基因、可转录DNA序列、构建体或序列位于供体模板的插入序列中，则可以实现转基因、可转录DNA序列、构建体或序列的位点特异性插入或整合。
DSB或切口的引入也可用于在植物的基因组中引入靶向突变。根据这种方法，可经由DSB或切口的不完全修复在靶位点处引入突变，如缺失、插入、倒位和/或取代，从而产生基因的敲除或敲低。即使不使用供体模板分子，也可以通过靶向基因座的不完全修复产生这类突变。基因的“敲除”可通过在基因的内源基因座处或附近诱导DSB或切口来实现，这会导致不表达蛋白质或表达非功能性蛋白质，而基因的“敲低”可通过在基因的内源基因座处或附近诱导DSB或切口而以类似的方式实现，该基因的内源基因座在不影响该基因的编码序列的位点处以消除所编码的蛋白质的功能的方式被不完全修复。例如，内源基因座内的DSB或切口的位点可以在该基因的上游或5’区域中(例如，启动子和/或增强子序列)，以影响或降低其表达水平。
类似地，可以用供体模板分子产生基因的这类靶向敲除或敲低突变，以经由DSB或切口的修复在靶位点处或附近指导特定或所需的突变。相对于DSB或切口的位点处或附近的靶向基因组序列，供体模板分子可包含同源序列，该同源序列含有或不含插入序列，并且包含一个或多个突变，诸如一个或多个缺失、插入、倒位和/或取代。例如，基因的靶向敲除或敲低突变可通过取代、插入、删除或倒位基因的至少一部分来实现，诸如通过将移码或提前终止密码子引入基因的编码序列中或破坏基因的启动子序列或另一非编码调控元件的序列。也可以通过在两个靶位点处产生DSB或切口并导致侧接靶位点的居间靶区域缺失来引入基因的一部分的缺失。
在进一步的实施方案中，植物的遗传修饰可包括转化植物、植物部分、植物组织或植物细胞，以将多核苷酸或DNA序列或转基因插入到植物、植物部分、植物组织或植物细胞的基因组中。本领域中已知并适用于许多作物物种的植物转化方法包括但不限于电穿孔、微粒或粒子轰击、微量注射、PEG介导的转化、农杆菌介导的转化及直接DNA摄取的其他方式。已知介导植物细胞转化的细菌包括可归属于根瘤菌目的除了农杆菌属之外的许多细菌属、菌种和菌株的物种,包括但不限于来自分类学科根瘤菌科(例如，根瘤菌属某些种、中华根瘤菌属某些种)、叶杆菌科(例如，中慢生根瘤菌属某些种、叶杆菌属某些种)、布鲁氏菌科(例如，苍白杆菌属某些种)、慢生根瘤菌科(例如,慢生根瘤菌属某些种)和黄色杆菌科(例如,固氮根瘤菌属某些种)等的菌种和菌株。根据一些实施方案，农杆菌介导的转化是由根癌农杆菌介导的。这种转化的靶标通常是未分化的愈伤组织，尽管分化的组织也已经用于瞬时和稳定的植物转化。如本领域中所熟知，可以利用其他植物转化方法，例如Miki等人,(1993, “Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants,”见于Methods inPlant Molecular Biology and Biotechnology, Glick B. R.和Thompson, J. E.编著,CRC Press, Inc., Boca Raton,第67-88页)所描述的方法。
在具体实施方案中，微粒轰击可用于将多核苷酸或DNA分子、载体、序列、区段或RNP递送至细胞。在这种方法中，颗粒被多核苷酸或多核苷酸/蛋白质复合物涂覆，并通过推进力被递送到细胞中。示例性颗粒可包括由钨、铂或金组成的那些。针对轰击，靶细胞可布置在固体培养基上。要被轰击的细胞位于射弹阻挡板下方适当的距离处。多核苷酸可通过使用基因枪(biolistics)颗粒递送系统进行加速而递送到植物细胞中，该基因枪颗粒递送系统可推动涂覆有DNA或多核苷酸分子的颗粒通过筛网，诸如不锈钢或Nytex筛网，并朝向定位在表面上的细胞。筛网可以分散颗粒，使得它们不会以大聚集体的形式被递送至受体细胞。微粒轰击技术应用广泛，并且可用于转化多种植物物种。
农杆菌介导的或根瘤菌介导的细胞转化是用于将异源和/或重组DNA分子引入植物细胞中的另一种广泛适用的系统。现代农杆菌介导的转化载体能够在大肠杆菌中以及在农杆菌中复制，从而允许进行方便的操作(参见例如Klee等人,Nat. Biotechnol., 3(7):637-642, 1985)。此外，用于农杆菌介导的基因转移的载体的最新技术进展已经改善了基因和限制性位点在载体中的布置，从而有助于构建能够表达各种多肽编码基因的载体。所描述的载体具有方便的多接头区域，其侧接启动子和聚腺苷酸化位点，用于直接表达插入的多肽编码基因。另外，含有带臂和去臂Ti质粒的农杆菌可用于转化。农杆菌介导的转化通常是许多植物物种选择的方法。使用农杆菌介导的植物整合载体将DNA引入到植物细胞中是本领域已知的(参见例如Fraley等人，Nat. Biotechnol.，3:629-635，1985；美国专利第5,563,055号)。
许多启动子和表达元件可用于任何可选择标记、可评分标记、转基因或任何具有农艺价值的其他基因的植物基因表达。启动子可包括任何组成型启动子、组织特异性启动子、器官特异性启动子、组织优选启动子、器官优选启动子、诱导型启动子、生殖组织启动子、发育阶段启动子、病毒启动子等。各种类型的启动子和表达元件的实例是本领域中已知的。可用于植物基因表达的表达元件可包括例如本领域中已知的各种启动子、增强子、前导序列、5'和3'非翻译区、内含子、终止子等。可选择或可筛选标记或所关注的基因也可以与转运肽或其他靶向序列融合。可通过将编码信号或靶向序列的核苷酸序列与编码所关注的蛋白质的基因的5'和/或3'区可操作地连接来实现将转基因产生的蛋白质转运到亚细胞区室(如叶绿体、液泡、过氧化物酶体、乙醛酸循环体、细胞壁、细胞核或线粒体)或用于分泌到质外体中。在结构基因的5'和/或3'端的靶向序列可以在蛋白质合成和加工期间确定编码蛋白最终被区室化的位置。信号序列的存在将多肽导向细胞内细胞器或亚细胞区室或用于分泌到质外体中。本领域中已知许多信号序列。参见，例如Becker等人(Plant Mol. Biol.,20:49, 1992)；Knox等人(Plant Mol. Biol., 9:3-17, 1987)；Lerner等人(Plant Physiol., 91:124-129, 1989)；Fontes等人(Plant Cell, 3:483-496, 1991)；Matsuoka等人(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:834, 1991)；Gould等人(J. Cell. Biol., 108:1657, 1989)；Creissen等人(Plant J., 2:129, 1991)；Kalderon等人(Cell, 39:499-509, 1984)；Steifel等人(Plant Cell, 2:785-793, 1990)。
组成型启动子的实例可包括例如花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子，其在大多数植物组织中赋予组成型高水平表达(参见例如Odel等人，Nature，313:810，1985)，包括单子叶植物(参见例如Dekeyser等人，Plant Cell,2:591，1990；Terada和Shimamoto，Mol. Gen. Genet., 220:389, 1990)；CaMV 35S启动子的串联复制形式、增强型35S启动子(e35S)、胭脂碱合酶启动子(An等人,Plant Physiol., 88:547, 1988)、章鱼碱合酶启动子(Fromm等人,Plant Cell, 1:977, 1989)；以及如美国专利第5,378,619号中所描述的玄参花叶病毒(FMV)启动子和FMV启动子的增强形式(eFMV) (其中FMV的启动子序列串联复制)、花椰菜花叶病毒19S启动子、甘蔗杆状病毒启动子、鸭跖草黄斑驳病毒启动子和已知在植物细胞中表达的其他植物DNA病毒启动子。组成型启动子还可包括来源于植物基因组的启动子，诸如玉米泛素启动子(Christensen等人, Plant Mol. Biol., 18: 675, 689, 1992)、玉米肌动蛋白启动子(McElroy,等人, Plant Cell, 2:163-171, 1990)或拟南芥S-腺苷甲硫氨酸合成酶启动子(参见美国专利号8,809,628)。
利用诱导型启动子，转录的速率响应诱导剂或信号而增加。根据本公开的实施方案可以使用任何诱导型启动子。响应环境、激素、化学和/或发育信号而受调控的多种植物基因启动子可用于在植物细胞中表达可操作地连接的基因，包括受以下调控的启动子：(1)热(例如，Callis等人，Plant Physiol.，88:965，1988)，(2)光(例如，豌豆rbcS-3A启动子，Kuhlemeier等人，Plant Cell,1:471，1989；玉米rbcS启动子，Schaffner和Sheen，Plant Cell,3:997，1991；或叶绿素a/b结合蛋白启动子，Simpson等人，EMBO J.,4:2723, 1985)，(3)激素，如脱落酸(Marcotte等人，Plant Cell,1:969，1989)，(4)创伤(例如，Siebertz等人，Plant Cell,1:961，1989)，或(5)化学物质，如茉莉酮酸甲酯、水杨酸或安全剂(Safener)。使用本领域中已知的器官特异性或组织特异性启动子也可能是有利的(例如，Roshal等人,EMBO J., 6:1155, 1987；Schernthaner等人,EMBO J., 7:1249, 1988；Bustos等人,Plant Cell, 1:839, 1989)。
可引入的示例性多核苷酸或DNA分子包括例如来自另一物种的DNA序列或基因，或甚至源自或存在于同一物种中的基因或序列，但通过遗传工程化方法而不是典型的繁殖或育种技术掺入受体细胞中。然而，术语“外源”也旨在指通常不存在于被转化的细胞中，或者可能不以形式、结构或位置存在的基因。多核苷酸可包括在植物细胞中已经存在、来自另一种植物、来自不同的生物体、外源或外部产生的DNA分子或序列。转基因或表达盒可编码用于抑制的mRNA和蛋白质或RNA分子，如miRNA、siRNA、dsRNA、反义RNA、反向重复RNA等。多核苷酸可以是外源的、异源的和/或重组的多核苷酸或DNA分子或序列。
根据本公开可潜在地引入许多不同的转基因或遗传修饰，其可提供具有转基因或修饰的作物植物的有益农艺性状。在特定实施方案中，引入植物细胞的基因组中的转基因或遗传修饰可包含或编码与SEQ ID NO:1-36中的任一者或其片段具有至少约70%、约75%、约80%、约85%、约90%、约91%、约92%、约93%、约94%、约95%、约96%、约97%、约98%、约99%或100%序列同一性的序列，包括其间可导出的任何范围。在一些实施方案中，引入植物细胞的基因组中的转基因或遗传修饰可赋予异噁草酰胺除草剂耐受性。
可选择引入细胞中的特定转基因或遗传修饰和对应表型的另外的非限制性实例包括一种或多种用于昆虫抗性(诸如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(B.t.)基因)、害虫耐受性(诸如用于真菌疾病控制的基因)、除草剂耐受性(诸如赋予草甘膦耐受性的基因)的基因以及用于质量改进，诸如产量、营养增强、环境或胁迫耐受性，或植物生理学、生长、发育、形态或植物产品的任何期望的变化的基因。例如，结构基因将包括赋予昆虫抗性的任何基因，包括但不限于如WO 99/31248 (以全文引用的方式并入本文)、美国专利第5,689,052号(以全文引用的方式并入本文)、美国专利第5,500,365和5,880,275号(以全文引用的方式并入本文)中所描述的芽孢杆菌昆虫控制蛋白基因。在一些实施方案中，结构基因可赋予对除草剂草甘膦的耐受性，如由包括但不限于以下的基因赋予的：农杆菌属菌株CP4草甘膦抗性EPSPS基因(aroA:CP4)，如美国专利第5,633,435号中所描述，该专利以全文引用的方式并入本文；或草甘膦氧化还原酶基因(GOX)，如美国专利第5,463,175号中所描述，该专利以全文引用的方式并入本文。
多种测定法是本领域中已知的，并且可用于确认遗传修饰、外源DNA序列、遗传标记、表达盒或转基因在经转化、编辑或遗传修饰的细胞、植物或植物部分中的存在。提供了用于筛选和/或确认细胞或植物等中靶向编辑或转基因的存在以及选择包含靶向编辑或转基因的细胞或植物的方法和技术，其可基于一种或多种表型或性状，或者基于细胞或植物中是否存在分子标记或多核苷酸或蛋白质序列。如本文所用，“分子学技术”是指分子生物学、生物化学、遗传学、植物生物学或生物物理学领域中已知涉及使用、操作或分析核酸、蛋白质或脂质的任何方法。不受限制地，可用于检测基因组中修饰序列的存在的分子学技术包括表型筛选；分子标记技术，如通过TaqMan®或Illumina/Infinium技术的SNP分析；Southern印迹杂交；PCR；酶联免疫吸附测定(ELISA)；和测序(例如，Sanger、Illumina®、454、Pac-Bio、Ion Torrent™)。一方面，本文提供的检测方法包括表型筛选。另一方面，本文提供的检测方法包括SNP分析。在进一步的方面，本文提供的检测方法包括Southern印迹杂交。在进一步的方面，本文提供的检测方法包括PCR。一方面，本文提供的检测方法包括ELISA。在进一步的方面，本文提供的检测方法包括确定核酸或蛋白质的序列。不受限制地，可以利用杂交来检测核酸。Sambrook等人(1989，Molecular Cloning: A LaboratoryManual，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)中详细讨论了核酸之间的杂交。
可以采用本领域中常规的技术来分离核酸或多核苷酸分子。例如，可以采用任何方法来分离核酸，包括但不限于重组核酸技术和/或PCR。一般性PCR技术描述于例如PCRPrimer: A Laboratory Manual，Dieffenbach和Dveksler编著，Cold Spring HarborLaboratory Press，1995中。重组核酸技术包括例如可用于分离核酸的限制性酶消化和连接。分离的核酸也可以是化学合成的，或者作为单一核酸分子，或者作为一系列寡核苷酸。
可以使用可与探针或抗体连接或缔合的可检测标记来实现(例如，扩增产物、杂交复合物、多肽的)检测。术语“标记”旨在涵盖直接标记和间接标记的使用。可检测标记包括酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。可以通过分子生物学领域的技术人员已知的任何方法来筛选和选择修饰的(例如，编辑的)植物或植物细胞。筛选和选择方法的实例包括但不限于Southern分析、用于检测多核苷酸的PCR扩增、Northern印迹杂交、RNA酶保护、引物延伸、用于检测RNA转录物的RT-PCR扩增、Sanger测序、下一代测序技术(例如，Illumina®、PacBio®、Ion Torrent™等)、用于检测多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的酶促测定以及用以检测多肽的蛋白质凝胶电泳、Western印迹分析、免疫沉淀和酶联免疫测定。其他技术如原位杂交、酶染色和免疫染色也可用于检测多肽和/或多核苷酸的存在或表达。进行所有提及的技术的方法是本领域中已知的。
如本文所用，术语“多肽”是指至少两个共价连接的氨基酸的链。多肽可由本文提供的多核苷酸编码。多肽的实例是蛋白质。本文提供的蛋白质可由本文提供的核酸分子编码。可通过已知的方法(如DEAE离子交换、凝胶过滤和羟基磷灰石色谱法)从天然来源(例如，生物样品)中纯化多肽。也可以例如通过在表达载体中表达核酸来纯化多肽。此外，可以通过化学合成获得纯化的多肽。多肽的纯度程度可采用任何适当的方法来测量，例如柱色谱法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法或HPLC分析。
可以使用抗体来检测多肽。用于使用抗体检测多肽的技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀和免疫荧光。本文提供的抗体可以是多克隆抗体或单克隆抗体。可采用本领域中熟知的方法产生对本文提供的多肽具有特异性结合亲和力的抗体。可采用本领域中已知的方法将本文提供的抗体连接于固体支持物，诸如微量滴定板。
D.经遗传修饰的植物和除草剂耐受性
本公开的一个方面包括包含本公开提供的重组DNA分子或工程化蛋白的经遗传修饰的植物细胞、植物组织、植物和种子。在某些实施方案中，这些细胞、组织、植物和种子表现出对至少一种异噁草酰胺除草剂的除草剂耐受性。在一个实施方案中，这些细胞、组织、植物和种子可任选地表现出对至少一种另外的除草剂的耐受性。
异噁草酰胺是一种新型出苗后异噁唑除草剂，其作用于双子叶(阔叶)和单子叶(窄叶/草)杂草。异噁草酰胺除草剂的非限制性实例包括(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]-氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸，以及它们中的任一者的组合。在某些实施方案中，本公开提供的细胞、种子、植物和植物部分表现出对至少一种异噁草酰胺除草剂的除草剂耐受性。
异噁草酰胺可作为用于控制杂草的方法施用于包含本公开提供的植物和种子的植物生长区域。替代地或另外地，异噁草酰胺可在种植本公开提供的种子之前施用于植物生长区域。在许多实施方案中，本公开提供的植物和种子包含除草剂耐受性性状，且因此对至少一种异噁草酰胺除草剂的施用耐受。异噁草酰胺除草剂的除草剂施用率可随外部条件而变化，包括但不限于温度、湿度和所用的特定异噁草酰胺除草剂。在一个具体实施方案中，异噁草酰胺除草剂施用可以是推荐的商业用量(1X)或其任何分数或倍数，诸如推荐的商业田间用量的一半(0.5X)或推荐的商业用量的两倍(2X)。除草剂比率可根据除草剂和制剂表示为每英亩每磅酸当量(lb ae/英亩)或每公顷每克酸当量(g ae/ha)或表示为每英亩活性成分磅数(lb ai/英亩)或每公顷活性成分克数(g ai/ha)。在一些实施方案中，异噁草酰胺除草剂的施用率可以是约0.001 kg/ha至约1.0 kg/ha或更多的活性物质、约0.005kg/ha至约750 kg/ha的活性物质、或约5 g/ha至约250 g/ha的活性物质。异噁草酰胺除草剂的1X标记用量为约5 g/ha至约250 g/ha活性物质。当使用(2R, 4R)-异构体和(2S, 4S)-异构体的混合物时，异构体可以以约1.2:0.8至约0.8:1.2的比率，优选地以约1.1:0.9至约0.9:1:1的比率存在于混合物中(例如，异构体可以以约1:1的比率存在)。在施用除草剂时，植物生长区域可包含或可不包含杂草植物。用于在防治杂草的区域中使用的异噁草酰胺除草剂的除草有效剂量在生长季节内可以是约0.1X至约30X标记用量。一(1)英亩相当于2.47105公顷，且一(1)磅相当于453.592克。除草剂施用率可如下在英制与公制之间转换：(lb ai/ac)乘以1.12 = (kg ai/ha)和(kg ai/ha)乘以0.89 = (lb ai/ac)。
一种或多种除草剂的施用可依序进行或与一种或多种除草剂的组合进行罐混合。一种除草剂或两种或更多种除草剂组合或单独的多次施用可在生长季节内用于包含本公开的转基因植物的区域，以用于防治广谱双子叶杂草、单子叶杂草或两者。在一些实施方案中，可以施用除草剂的两次施用(诸如种植前施用和出苗后施用或者出苗前施用和出苗后施用)或三次施用(诸如种植前施用、出苗前施用和出苗后施用或者出苗前施用和两次出苗后施用)。
如本文所用，“耐受性”或“除草剂耐受性”或“除草剂耐受性活性”是指植物、种子或细胞在施用时抵抗除草剂的毒性作用的能力。除草剂耐受作物可继续生长，并且不受所施用化学品的存在的影响或影响最小。如本文所用，“除草剂耐受性性状”是指与野生型植物相比赋予植物、植物部分、种子或细胞改善的除草剂耐受性的转基因性状。可产生的具有本公开的除草剂耐受性性状的植物的非限制性实例包括大豆植物、玉米植物、棉花植物、大麦植物、高粱植物、水稻植物、小麦植物、甘蔗植物、甜菜植物、苜蓿植物、芸苔属植物以及蔬菜植物和水果植物(例如，洋葱、番茄、胡椒、葫芦、豌豆、西兰花、卷心菜、胡萝卜、朝鲜蓟、生菜、萝卜、菠菜、花椰菜、西葫芦、韭菜、马铃薯、抱子甘蓝、粘果酸浆、豆类、秋葵、苹果、梨、樱桃、桃、杏、李子、香蕉、车前草、葡萄、柑橘、牛油果、芒果、浆果等)。
在某些方面，本公开的经遗传修饰的植物、子代、种子、植物细胞和植物部分还可含有一种或多种另外的性状。可通过将含有本公开提供的重组DNA分子的植物与含有一种或多种另外的性状的另一植物杂交来引入另外的性状。如本文所用，“杂交”是指培育两种个体植物以产生子代植物。因此，两种植物可杂交以产生含有来自每个亲本的期望性状的子代。如本文所用，“子代”是指亲本植物的任何世代的子代，并且转基因子代包含从至少一种亲本植物遗传的本公开提供的多核苷酸分子。另外的性状也可通过将用于另外的转基因性状的多核苷酸分子与包含本公开提供的重组多核苷酸分子的多核苷酸分子共转化，或通过将另外的性状插入包含本公开的多核苷酸分子的转基因植物或反之亦然(例如，通过使用植物转化或基因组编辑的任何方法)来引入。此类另外的性状包括但不限于增加的昆虫抗性、增加的疾病抗性(例如，对亚洲大豆锈病)、增加的水分利用效率、增加的产量表现、增加的抗旱性、增加的种子质量、改善的营养质量、杂交种子产量和除草剂耐受性，其中该性状是相对于野生型植物测量的。示例性的另外的除草剂耐受性性状可包括对一种或多种除草剂的转基因或非转基因耐受性，这些除草剂诸如ACC酶抑制剂(例如芳氧基苯氧基丙酸酯和环己二酮)、ALS抑制剂(例如磺酰脲、咪唑啉酮、三唑嘧啶和三唑啉酮)、EPSPS抑制剂(例如草甘膦)、合成生长素(例如苯氧基、苯甲酸、羧酸、缩氨基脲)、光合作用抑制剂(例如三嗪、三嗪酮、腈、苯并噻二唑和脲)、谷氨酰胺合成抑制剂(例如草铵膦)、HPPD抑制剂(例如异噁唑、吡唑啉酮和三酮)、PPO抑制剂(例如二苯醚、N-苯基邻苯二甲酰亚胺、芳基三嗪酮和嘧啶二酮)、PDS抑制剂(例如酰胺、哒嗪酮和吡啶)以及长链脂肪酸抑制剂(例如氯乙酰胺、氧乙酰胺和吡唑)等。示例性昆虫抗性性状可包括对鳞翅目、鞘翅目、半翅目和同翅目等中的一者或多者内的一个或多个昆虫成员的抗性。此类另外的性状是本领域技术人员熟知的；例如美国农业部(USDA)动植物健康检查服务部门(APHIS)提供了此类转基因性状的列表。
在某些实施方案中，可在将这种细胞再生成转基因植物之前或之后，针对多核苷酸分子或其所编码的多肽的存在，对用本公开的多核苷酸分子转化的细胞进行选择。在一些实施方案中，因此可通过鉴定包含多核苷酸分子或所编码的多肽和/或显示出相对于其他同基因对照植物改变的性状的转基因植物来选择包含这种多核苷酸的转基因植物。这种性状可以是例如对异噁草酰胺除草剂的耐受性。
含有本公开提供的转基因性状的转基因植物和子代可根据本领域中已知的任何育种方法使用。在包含两种或更多种转基因性状的植物品系中，转基因性状可独立地分离、连锁，或在包含三种或更多种转基因性状的植物品系中发生两者的组合。本公开还涵盖与亲本植物的回交和与非转基因植物的异交，同样涵盖营养繁殖。用于不同性状和作物的育种方法的描述是本领域技术人员熟知的。为了确认转基因在特定植物或种子中的存在，可进行多种测定。此类分析包括例如分子生物学测定，诸如Southern和northern印迹、PCR以及DNA测序；生物化学测定，诸如检测蛋白质产物的存在，例如通过免疫手段(ELISA和Western印迹)或通过酶功能；植物部分分析，诸如叶或根分析；以及通过分析整个植物的表型。
因回交转化过程实现转基因性状种质渗入植物基因型中。转基因性状已种质渗入其中之植物基因型可被称为回交转化的基因型、系、近交种或杂交种。类似地，缺乏所需转基因性状的植物基因型可被称为未转化基因型、系、近交种或杂交种。
术语“约”用于指示值包括用于确定该值的装置或方法的平均值的标准偏差。除非明确指出仅指替代方案或替代方案是相互排斥的，否则在权利要求书中使用术语“或”用于表示“和/或”。当在权利要求书中与词语“包含”或其他开放语言结合使用时，除非另外明确指出，否则词语“一个/种(a/an)”表示“一个(种)或多个(种)”。术语“包含(comprise)”、“具有(have)”和“包括(include)”是开放式连系动词。这些动词中一者或多者的任何形式或时态，如“包含(comprises)”、“包含(comprising)”、“具有(has)”、“具有(having)”、“包括(includes)”和“包括(including)”也是开放式的。例如，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个步骤的任何方法不限于仅具有这一个或多个步骤并且还涵盖其他未列出的步骤。类似地，“包含”、“具有”或“包括”一个或多个组成部分的任何系统或方法不限于仅具有那些组成部分，并且还涵盖其他未列出的组成部分。如本文所用，当关于本公开的核苷酸或氨基酸序列使用时，术语“基本上由……组成”意指该核苷酸序列或氨基酸序列可含有另外的核苷酸或氨基酸，只要另外的核苷酸或氨基酸不会实质性地改变所述序列的功能。当应用于本公开的核苷酸序列或氨基酸序列时，术语“实质性地改变”是指所编码的多肽的除草剂耐受性降低至少25%。例如，如果添加到本公开的核苷酸或氨基酸序列中的另外的核苷酸或氨基酸使所赋予的除草剂耐受性降低至少25%，则此类添加可被认为“实质性地改变”所编码的多肽或多肽序列。
根据本文提供的详细描述，本公开的其他目的、特征和优点是显而易见的。然而，应当理解的是，所提供的详细描述及任何具体的实施例虽然指示了本公开的具体实施方案，但仅是以说明的方式给出的，因为根据这种详细描述，在本公开的实质和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。本公开的任何实施方案可与本文所描述的任何其他实施方案组合使用。
本文中的所有参考文献以全文引用的方式并入本文。
实施例
实施例1：表达CYP蛋白的大豆植物的异噁草酰胺除草剂耐受性评估
本实施例描述了测试不同细胞色素P450基因赋予转基因植物对异噁草酰胺除草剂的耐受性的能力。
采用基于转基因植物的筛选方法来鉴定能够使异噁草酰胺失活的酶。探索的基因家族之一是细胞色素P450 (CYP)超家族。筛选了41种CYP蛋白对异噁草酰胺的耐受性，包括两个CYP72A家族成员CYP12 (SEQ ID NO:1)和CYP13 (SEQ ID NO:2)，以及两个CYP81E家族成员CYP14 (SEQ ID NO:3)和CYP15 (SEQ ID NO:4)，它们是先前从帕尔默猪草(长芒苋)群体中鉴定的。在对除草剂4-羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)抑制剂和2,4-D胺耐受的水麻(糙果苋)群体中的基因表达谱实验先前表明，CYP81E基因在2,4-D处理后显著上调。参见，PCT公开号WO2022/051340。CYP14和CYP15蛋白共有98.98%的序列同一性，相差5个氨基酸。
在植物转化之前，对编码CYP酶的帕尔默猪草核苷酸序列进行密码子优化以用于双子叶植物表达。还产生了CYP12_var，一种CYP12蛋白的变体，其包含插入在位置2处的丝氨酸氨基酸，并筛选了其对异噁草酰胺除草剂的耐受性。表2提供了对应于测试的蛋白质和核苷酸序列的序列标识符(SEQ ID NO)。
表2：长芒苋细胞色素p450基因。
将密码子优化的多核苷酸序列置于植物转化盒中，其中每个CYP编码序列与组成型表达元件可操作地连接，该组成型表达元件包含拟南芥泛素3的启动子、前导序列和内含子序列(SEQ ID NO:14)以及蒺藜苜蓿光系统II终止子(SEQ ID NO:15)。产生了四种植物转化载体，每种载体包含一个CYP基因表达盒和赋予对抗生素壮观霉素和链霉素的抗性的aadA选择性标记表达盒。使用本领域中已知的方法，通过农杆菌介导的转化，用载体转化大豆栽培品种AG3555种子来源的胚外植体，并基于在壮观霉素存在下的生长选择转化的小植株。使包含单拷贝事件的小植株在温室中生长以产生R1种子。随后通过幼叶组织的分子分析或通过种植前的种子芯片检测针对纯合CYP阳性植物对R1植物进行选择。然后筛选这些所选择的植物对异噁草酰胺除草剂的耐受性。
通过选择大致处于V2-V3发育阶段的R1植物并在标准温室条件下用履带式喷雾器施用异噁草酰胺除草剂来进行除草剂耐受性筛选。每个转基因筛选两个独立的转基因事件。用1% v/v甲基化种子油(MSO)和2.5% v/v硫酸铵(AMS)配制除草剂，并用XR喷嘴以15加仑/公顷(GPA)喷洒以模拟田间条件。本实施例以及实施例2至4中描述的实验中使用的异噁草酰胺是2R, 4R和2S, 4S异构体的甲酯形式的混合物。异噁草酰胺制剂以两种用量喷洒：5g活性成分(ai)/公顷(ha)和25 g ai/ha。在喷洒施用后将经除草剂处理的大豆植物放回温室，并使其在标准条件下生长。在处理后大约14天和21天(DAT)对植物进行除草剂损伤评级。未处理的转基因植物和对照(野生型)植物用于表型比较。除草剂损伤等级说明了相对于未处理的对照植物的植物畸形、发育迟缓、失绿、坏死和植物死亡。大约90%或以上的损伤等级指示植物几乎完全死亡。小于30%的损伤等级指示部分耐受性，并且小于20%的损伤等级指示耐受性良好。收集和分析损伤等级，并拍摄代表性植物的照片。损伤等级总结在表3中。
表3：在大豆中施用异噁草酰胺除草剂后的损伤等级(以%计)。
经处理的对照(野生型)大豆在5 g ai/ha用量下受到严重损伤，并且在25 g ai/ha用量下几乎完全杀死。表达CYP14和表达CYP15的转基因植物显示出对异噁草酰胺的意外耐受性。重复进行第二次除草剂喷雾处理，使用从CYP14和CYP15转化中的每一者产生的另外两个转基因事件。如表4所示，概括了在这些事件中对异噁草酰胺的耐受性。图1显示了代表性对照和表达CYP15的转基因植物在异噁草酰胺处理后的照片。
表4：在大豆中施用异噁草酰胺除草剂后的损伤等级(以%计)。
在较低的5 g ai/ha用量下，许多CYP14和CYP15转基因事件显示出小于30%的损伤，并且通常小于20%的损伤，而经处理的对照(野生型)植物在5 g ai/ha用量下趋向于约50%的损伤。在较高处理用量(25 g ai/ha)下，植物损伤对应增加，且变异性更大，一些事件趋向于约30%的损伤，而其他事件的损伤率接近于经处理的对照(约90%的损伤)。表达CYP12_var或CYP13的转基因植物未显示出对异噁草酰胺的任何明显耐受性(参见表3)，因为来自较低的5 g ai/ha用量和较高的25 g ai/ha用量两者的损伤率与在经处理的对照植物中观察到的类似。当与来自转基因植物筛选测定中测试的37种其他CYP的数据结合时，这些结果表明只有CYP14和CYP15能够提供对异噁草酰胺除草剂的显著耐受性。
实施例2：表达CYP15的转基因植物的除草剂耐受性评估
本实施例描述了评估表达CYP15的转基因大豆植物对四种不同类别除草剂的耐受性的结果。
设计筛选测定以确定表达CYP15的转基因大豆植物是否表现出对除异噁草酰胺以外的除草剂的耐受性增加。将表达CYP15的转基因大豆植物和对照(野生型)植物用代表四个不同除草剂家族的八种常见除草剂处理，如表5所示。
表5：在CYP15转基因大豆植物上测试的除草剂。
使表达CYP15的植物与对照植物一起在温室中生长，并在V2-V3生长阶段以类似于实施例1中描述的异噁草酰胺喷洒施用的方式用表5中列出的除草剂攻击。为了测定完全和部分耐受性，分别以全田间(1X)用量和半田间(0.5X)用量施用除草剂。在喷洒施用后将经处理的大豆植物放回温室，并使其在标准条件下生长。在喷洒施用后大约14 DAT和21 DAT对植物进行除草剂损伤评级。未处理的转基因植物和对照植物用于表型比较。除草剂损伤等级说明了相对于未处理的对照植物的植物畸形、发育迟缓、失绿、坏死和植物死亡。大约90%或以上的损伤等级指示植物几乎完全死亡。小于30%的损伤等级指示部分耐受性并且小于20%指示耐受性良好。收集和分析损伤等级，并拍摄代表性植物的照片。损伤等级总结在表6中。
表6：14 DAT时CYP15转基因大豆植物的除草剂损伤等级(以%计)。
结果表明，在14 DAT，除草剂损伤范围为大约30%至超过90%。在14 DAT时间点，在表达CYP15的植物中相对于对照植物没有观察到损伤等级的显著差异。在21 DAT时间点，在处理之间的植物再生中观察到一些可变性，然而，对照植物和表达CYP15的植物两者在所有处理中都显示出大约40%或更高的损伤，表明植物不耐受。综上所述，数据表明大豆植物中CYP15的表达不提供对烟嘧磺隆、甲酰胺磺隆、环磺酮、甲基磺草酮、苯嘧磺草胺、2,4-D或麦草畏的耐受性。
实施例3：另外的CYP蛋白的异噁草酰胺除草剂耐受性评估
本实施例描述了测试另外的细胞色素P450基因赋予植物对异噁草酰胺除草剂的耐受性的能力。
筛选公共和内部植物基因组数据库，包括长芒苋数据库，以鉴定另外的细胞色素P450基因来测试异噁草酰胺耐受性。选择21个另外的细胞色素P450基因，包括9个长芒苋CYP基因，并针对异噁草酰胺耐受性进行筛选。其中有来源于长芒苋的CYP21 (SEQ ID NO:16)和来源于糙果苋的CYP28 (SEQ ID NO:23)。在氨基酸水平上，CYP21和CYP28分别与CYP15共有98.8%的同一性和95.1%的同一性。
实施例1中描述的基于转基因植物的筛选方法用于筛选所选择的CYP的异噁草酰胺耐受性。对于植物转化，对编码CYP酶的蛋白质序列进行密码子优化以用于双子叶植物表达。表7提供了对应于蛋白质和核苷酸序列的序列标识符(SEQ ID NO)。
表7：长芒苋细胞色素p450基因。
将密码子优化的基因置于植物转化盒中，其中每个CYP编码序列与组成型表达元件可操作地连接，该组成型表达元件包含拟南芥泛素3的启动子、前导序列和内含子(SEQID NO:14)以及蒺藜苜蓿光系统II终止子(SEQ ID NO:15)。产生了两种植物转化载体，每种载体包含一个CYP基因盒和赋予对抗生素壮观霉素和链霉素的抗性的aadA选择性标记表达盒。使用本领域中已知的方法，通过农杆菌介导的转化，用上述载体转化大豆栽培品种AG3555种子来源的胚外植体，并基于在壮观霉素存在下的生长选择阳性转化的小植株。使包含单拷贝事件的小植株在温室中生长以产生R1种子。随后通过幼叶组织的分子分析或通过种植前的种子芯片检测针对纯合CYP阳性植物对R1植物进行选择。然后筛选这些所选择的植物对异噁草酰胺除草剂的耐受性。
通过选择大致处于V2-V3发育阶段的R1植物并在标准温室条件下在履带式喷雾器中施用异噁草酰胺除草剂来进行除草剂耐受性筛选。每个转基因选择两个独立的转基因事件用于筛选。用1% v/v甲基化种子油(MSO)和2.5% v/v硫酸铵(AMS)配制除草剂，并用XR喷嘴以15加仑/公顷(GPA)喷洒以模拟田间条件。异噁草酰胺制剂以两种用量喷洒：5 g活性成分(ai)/公顷(ha)和25 g ai/ha。在喷洒施用后将经处理的大豆植物放回温室，并使其在标准条件下生长。在处理后大约14天和21天(DAT)对植物进行除草剂损伤评级。未处理的转基因植物和对照(野生型)植物用于表型比较。除草剂损伤等级说明了相对于未处理的对照植物的植物畸形、发育迟缓、失绿、坏死和植物死亡。大约90%或以上的损伤等级指示植物几乎完全死亡。小于30%的损伤等级指示部分耐受性并且小于20%的损伤等级指示耐受性良好。收集和分析损伤等级，并拍摄代表性植物的照片。损伤等级总结在表8中。
表8：在大豆中施用异噁草酰胺除草剂后的损伤等级(以%计)。
在14 DAT，在较低的5 g ai/ha用量下，CYP21转基因事件显示出小于10%的损伤，并且CYP28转基因事件显示出小于30%的损伤。经处理的对照(野生型)植物在5 g ai/ha用量下趋向于约45%的损伤。在较高的处理(25 g ai/ha)用量下，植物损伤对应增加，且变异性更大。对照植物显示出约78%的损伤。一个CYP21事件显示出约50%的损伤，而另一个事件的损伤等级更接近于经处理的对照的损伤等级，为约72%的损伤。CYP28事件显示出趋向于约67.5%的损伤等级。在21 DAT等级中，相同的效果是明显的。总体而言，数据表明CYP21对异噁草酰胺具有良好的耐受性，并且CYP28在较低的喷洒用量下对异噁草酰胺具有部分耐受性。测试的其他19种CYP蛋白均未显示出异噁草酰胺耐受性。
实施例4：另外的CYP蛋白的异噁草酰胺除草剂耐受性评估
本实施例描述了测试细胞色素P450基因CYP34赋予植物对异噁草酰胺除草剂的耐受性的能力。
CYP34 (SEQ ID NO:26)来源于繁穗苋。在氨基酸水平上，CYP34与CYP15共有96.1%的同一性。
实施例1中描述的基于转基因植物的筛选方法用于筛选CYP34的异噁草酰胺耐受性。对于植物转化，对编码CYP34酶的蛋白质序列进行密码子优化以用于双子叶植物表达。表9提供了对应于蛋白质和核苷酸序列的序列标识符(SEQ ID NO)。
表9：繁穗苋细胞色素p450基因。
将密码子优化的基因置于植物转化盒中，其中CYP34编码序列与组成型表达元件可操作地连接，该组成型表达元件包含拟南芥泛素3的启动子、前导序列和内含子(SEQ IDNO:14)以及蒺藜苜蓿光系统II终止子(SEQ ID NO:15)。产生植物转化载体，其包含CYP34基因盒和赋予对抗生素壮观霉素和链霉素的抗性的aadA选择性标记表达盒。使用本领域中已知的方法，通过农杆菌介导的转化，用上述载体转化大豆栽培品种AG3555种子来源的胚外植体，并基于在壮观霉素存在下的生长选择阳性转化的小植株。使包含单拷贝事件的小植株在温室中生长以产生R1种子。随后通过幼叶组织的分子分析或通过种植前的种子芯片检测针对纯合CYP阳性植物对R1植物进行选择。然后筛选这些所选择的植物对异噁草酰胺除草剂的耐受性。
通过选择大致处于V2-V3发育阶段的R1植物并在标准温室条件下在履带式喷雾器中施用异噁草酰胺除草剂来进行除草剂耐受性筛选。每个转基因选择两个独立的转基因事件用于筛选。用1% v/v甲基化种子油(MSO)和2.5% v/v硫酸铵(AMS)配制除草剂，并用XR喷嘴以15加仑/公顷(GPA)喷洒以模拟田间条件。异噁草酰胺制剂以两种用量喷洒：5 g活性成分(ai)/公顷(ha)和25 g ai/ha。在喷洒施用后将经处理的大豆植物放回温室，并使其在标准条件下生长。在处理后(DAT)大约13天和21天针对除草剂损伤对植物进行评级。未处理的转基因植物和对照(野生型)植物用于表型比较。除草剂损伤等级说明了相对于未处理的对照植物的植物畸形、发育迟缓、失绿、坏死和植物死亡。大约90%或以上的损伤等级指示植物几乎完全死亡。小于30%的损伤等级指示部分耐受性并且小于20%的损伤等级指示耐受性良好。收集和分析损伤等级，并拍摄代表性植物的照片。损伤等级总结在表10中。
表10：在大豆中施用异噁草酰胺除草剂后的损伤等级(以%计)。
在13 DAT，在较低的5 g ai/ha用量下，CYP34转基因事件显示出小于15%的损伤。经处理的对照(野生型)植物在5 g ai/ha用量下趋向于约42%的损伤。在较高处理(25 gai/ha)用量下，对照植物显示出约70%的损伤，而CYP34事件显示出小于50%的损伤。在21DAT等级中观察到类似的趋势，其中与对照植物相比，CYP34转基因事件显示出较少的损伤。总体而言，数据表明CYP34对异噁草酰胺具有良好的耐受性。
实施例5：所选择的表达CYP14和CYP15的大豆植物的田间测试。
在美国九个地点的小规模田间试验中测定了表达CYP14或CYP15的大豆转基因植物对异噁草酰胺喷洒施用的耐受性。使植物生长在田间地块中，并在植物大致处于V3阶段的早期营养阶段期间进行喷洒。异噁草酰胺制剂以5g ai/ha或25g ai/ha施用率喷洒，其中每个位置重复2次处理。在处理后7、14、21和28天(DAT)对植物进行除草剂损伤评级。共测试了12个CYP14事件和11个CYP15事件。用非除草剂耐受性构建体转化的事件用作阴性对照以提供损伤的比较。
21 DAT时的损伤数据呈现在表11中。与在温室测试中观察到的类似，在5g ai/ha用量下，CYP14和CYP15两者都提供了对异噁草酰胺施用的视觉耐受性，其中损伤等级低于15%。在较高的25g ai/ha施用率下观察到不完全耐受性，其中植物显示出比对照更少的损伤，但遭受典型的异噁草酰胺损伤的显著损伤，其特征在于发育迟缓、叶片畸形和发育停滞。这表明，在温室和田间生长两种条件下，使用实施例1中描述的表达盒表达CYP14和CYP15两者在大豆中提供了对低施用率的异噁草酰胺的耐受性。
表11：在大豆中施用异噁草酰胺除草剂后表达CYP14或CYP15的植物的田间损伤等级(以%计)的总结。显示的损伤是在21 DAT，并跨重复、田间位置和事件进行平均。

Claims (42)

1. 一种重组DNA分子，其包含与编码多肽的多核苷酸序列可操作地连接的异源启动子，所述多肽包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28具有至少约94%序列同一性的氨基酸序列，其中所述异源启动子在植物细胞中是有功能的。
2.如权利要求1所述的重组DNA分子，其中所述多肽赋予对异噁草酰胺除草剂的耐受性。
3. 如权利要求1或2所述的重组DNA分子，其中所述多核苷酸序列包含与SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或SEQ ID NO:31具有至少约95%序列同一性，或与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36具有至少约85%序列同一性的核酸序列。
4. 如权利要求1至3中任一项所述的重组DNA分子，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28具有至少95%同一性的氨基酸序列。
5. 如权利要求1至3中任一项所述的重组DNA分子，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28具有至少96%同一性的氨基酸序列。
6. 如权利要求1至3中任一项所述的重组DNA分子，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28具有至少97%同一性的氨基酸序列。
7. 如权利要求1至3中任一项所述的重组DNA分子，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28具有至少98%同一性的氨基酸序列。
8. 如权利要求1至3中任一项所述的重组DNA分子，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28具有至少99%同一性的氨基酸序列。
9. 如权利要求1至3中任一项所述的重组DNA分子，其中所述多肽包含SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28的氨基酸序列。
10. 如权利要求3至9中任一项所述的重组DNA分子，其中所述多核苷酸序列包含与SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30或SEQ ID NO:31具有至少约96%序列同一性的核酸序列。
11. 如权利要求3至9中任一项所述的重组DNA分子，其中所述多核苷酸序列包含与SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30或SEQ ID NO:31具有至少约97%序列同一性的核酸序列。
12. 如权利要求3至9中任一项所述的重组DNA分子，其中所述多核苷酸序列包含与SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30或SEQ ID NO:31具有至少约98%序列同一性的核酸序列。
13. 如权利要求3至9中任一项所述的重组DNA分子，其中所述多核苷酸序列包含与SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30或SEQ ID NO:31具有至少约99%序列同一性的核酸序列。
14. 如权利要求3至9中任一项所述的重组DNA分子，其中所述核酸序列选自由以下组成的组：SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35和SEQ ID NO:36。
15.如权利要求1至14中任一项所述的重组DNA分子，其中所述多核苷酸序列还包含编码靶向序列的核酸序列，所述靶向序列起到将所编码的多肽定位在细胞内的作用。
16.如权利要求2至15中任一项所述的重组DNA分子，其中所述异噁草酰胺除草剂选自由以下组成的组：
(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；
(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]-氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；
(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；
(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；
(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；
(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；以及
它们中的任一者的组合。
17.一种DNA构建体，其包含如权利要求1至16中任一项所述的重组DNA分子。
18.如权利要求1至17中任一项所述的重组DNA分子，其中所述重组DNA分子整合到转基因植物、种子、植物部分或细胞的基因组中。
19. 一种转基因植物、种子、细胞或植物部分，其包含重组DNA分子，所述重组DNA分子包含与编码多肽的多核苷酸序列可操作地连接的异源启动子，所述多肽包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28具有至少约85%序列同一性的氨基酸序列。
20.如权利要求19所述的转基因植物、种子、细胞或植物部分，其中所述转基因植物、种子、细胞或植物部分具有对异噁草酰胺除草剂的耐受性。
21.如权利要求19或20所述的转基因植物、种子、细胞或植物部分，其中所述转基因植物、种子、细胞或植物部分是大豆、玉米、棉花、大麦、高粱、水稻、小麦、甘蔗、甜菜、苜蓿或芸 苔属植物、种子、细胞或植物部分。
22.如权利要求20或21所述的转基因植物、种子、细胞或植物部分，其中所述异噁草酰胺除草剂选自由以下组成的组：
(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；
(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]-氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；
(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；
(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；
(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；
(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；以及
它们中的任一者的组合。
23.如权利要求20至22中任一项所述的转基因植物、种子、细胞或植物部分，其中所述转基因植物、种子、细胞或植物部分包含对至少一种另外的除草剂的耐受性。
24.一种赋予植物、种子、细胞或植物部分除草剂耐受性的方法，所述方法包括使如权利要求1至18中任一项所述的重组DNA分子在所述植物、种子、细胞或植物部分中表达。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述植物、种子、细胞或植物部分具有对异噁草酰胺除草剂的耐受性。
26.如权利要求25所述的方法，其中所述异噁草酰胺除草剂选自由以下组成的组：
(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；
(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]-氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；
(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；
(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；
(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；
(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；以及
它们中的任一者的组合。
27. 一种生产转基因植物或其部分的方法，所述方法包括：
a) 将包含异源启动子的重组DNA分子引入植物细胞中，所述异源启动子与编码多肽的多核苷酸序列可操作地连接，所述多肽包含与SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28具有至少约85%序列同一性的氨基酸序列；以及
b) 从包含所述重组DNA分子的所述细胞或其后代细胞再生所述转基因植物或其部分。
28.如权利要求27所述的方法，其还包括选择具有对异噁草酰胺除草剂的耐受性的再生的转基因植物。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述异噁草酰胺除草剂选自由以下组成的组：
(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；
(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]-氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；
(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；
(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；
(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；
(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；以及
它们中的任一者的组合。
30.如权利要求27至29中任一项所述的方法，其还包括使所述再生的转基因植物与其自身或与第二植物杂交以产生种子。
31. 如权利要求27至30中任一项所述的方法，其中所述多肽包含SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27或SEQ IDNO:28的氨基酸序列。
32. 如权利要求27至31中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸序列包含与SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30或SEQ ID NO:31具有至少约95%序列同一性，或与SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:20；SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36具有至少约85%序列同一性的核酸序列。
33.如权利要求27至32中任一项所述的方法，其还包括使包含所述重组DNA分子的所述再生的转基因植物或其后代植物与其自身或第二植物杂交以产生种子；其中所述种子包含所述重组DNA分子。
34.一种通过如权利要求27至33中任一项所述的方法产生的转基因植物或其部分，其中所述转基因植物或其部分包含所述重组DNA分子。
35.一种种子，其通过如权利要求33所述的方法产生。
36.一种用于控制植物生长区域中的杂草的方法，所述植物生长区域包含如权利要求19至23中任一项所述的转基因植物或种子，所述方法包括使所述植物生长区域与异噁草酰胺除草剂接触，其中所述转基因植物或种子对所述异噁草酰胺除草剂耐受，并且其中杂草在所述植物生长区域中得到控制。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述异噁草酰胺除草剂选自由以下组成的组：
(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；
(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]-氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；
(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；
(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；
(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；
(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；以及
它们中的任一者的组合。
38.如权利要求36或37所述的方法，其中所述转基因植物或种子是大豆、玉米、棉花、大麦、高粱、水稻、小麦、甘蔗、甜菜、苜蓿或芸苔属植物或种子。
39.一种鉴定对异噁草酰胺除草剂和至少一种另外的除草剂具有耐受性的植物的方法，所述方法包括：
a) 获得根据权利要求20至23中任一项所述的植物；
b) 将所述至少一种另外的除草剂施用于所述植物或其部分；以及
c) 将所述植物鉴定为对所述至少一种另外的除草剂表现出耐受性。
40.一种用于减少植物生长区域中除草剂耐受杂草的发育的方法，所述植物生长区域包含根据权利要求20至23中任一项所述的转基因植物或种子，所述方法包括使所述植物生长区域与异噁草酰胺除草剂和至少一种另外的除草剂接触，其中所述转基因植物或种子对所述异噁草酰胺除草剂和所述至少一种另外的除草剂耐受。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述异噁草酰胺除草剂选自由以下组成的组：
(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；
(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]-氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；
(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸甲酯；
(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；
(2R,4R)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；
(2S,4S)-4-[[(5S)-3-(3,5-二氟苯基)-5-乙烯基-4H-异噁唑-5-羰基]氨基]四氢呋喃-2-甲酸；以及
它们中的任一者的组合。
42.如权利要求40或41所述的方法，其中所述至少一种另外的除草剂选自由以下组成的组：ACC酶抑制剂、ALS抑制剂、EPSPS抑制剂、合成生长素、光合作用抑制剂、谷氨酰胺合成抑制剂、HPPD抑制剂、PPO抑制剂、PDS抑制剂和长链脂肪酸抑制剂。
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