CN121253813A - 用于破伤风毒素检测的免疫传感器的制备和测试方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于破伤风毒素检测的免疫传感器的制备和测试方法。该方法包括：分别配制四氯金酸溶液与六氯铂酸溶液并滴加于该紫铜片，在紫外灯下烤干后，形成金铂纳米粒子催化剂层；将该紫铜片置于电子辅助热丝化学气相沉积系统设备的腔室内，用以生长金铂‑垂直石墨烯电极；取破伤风抗体溶液和牛血清蛋白溶液滴加在该金铂‑垂直石墨烯电极中，得到孵育有牛血清蛋白和破伤风抗体的金铂‑垂直石墨烯电极；取破伤风毒素溶液滴加到孵育有牛血清蛋白和破伤风抗体的金铂‑垂直石墨烯电极,得到用于破伤风毒素检测的免疫传感器。本发明抑制非特异吸附、稳定基线，支撑破伤风毒素低浓度定量及后续应用衔接。

Description

用于破伤风毒素检测的免疫传感器的制备和测试方法

技术领域

本发明涉及免疫领域，具体涉及一种用于破伤风毒素检测的免疫传感器的制备和测试方法。

背景技术

破伤风是指破伤风梭菌经皮肤或黏膜伤口侵入人体，在缺氧环境下生长繁殖，产生毒素而引起阵发性肌肉痉挛的一种急性感染性疾病。破伤风的危害主要体现在影响神经系统、影响呼吸系统、影响循环系统、影响消化系统、影响运动系统等方面。

破伤风是由破伤风梭菌引起的疾病，破伤风梭菌进入人体后会在缺氧的环境下大量繁殖，从而产生毒素，导致患者出现苦笑面容、角弓反张、抽搐等症状，严重时还可能会导致患者出现颅内压增高、脑水肿等情况；破伤风会导致患者的呼吸道受到刺激，使患者出现呼吸困难的情况，如果不及时进行治疗，还可能会引起患者出现窒息的情况；破伤风梭菌产生的毒素会影响患者的血液循环系统，可能会导致患者出现血压下降、脉搏加快等症状，严重时还可能会引起休克的情况；由于破伤风梭菌产生的毒素会影响患者的消化系统，导致患者出现腹痛、腹胀等症状，严重时还可能会引起胃肠道溃疡的情况；当破伤风发作时，会导致患者的肌肉出现持续性强直收缩的情况，使患者无法自主活动，严重时还会引起肌肉坏死的情况。

目前，破伤风的检测仍主要依赖于临床诊断，具有显著的滞后性。当患者出现明显的临床症状时，病情往往已进入不可逆阶段，错过了最佳干预时机。若成年人未经治疗，导致疾病持续发展，死亡率便会升高，可达到60％左右。若是儿童和老年人等免疫力低下的人群出现破伤风，症状较重，出现并发症的可能性会增加，如肺炎、心血管疾病等，治疗相对困难，此时死亡率可能会相应的升高，死亡率可达60％-70％。

近年来，电化学免疫分析采用电化学免疫传感器。电化学免疫传感器是一类基于抗原和抗体特异性反应的新型生物传感器，因其灵敏度高、成本低、响应快速等特点，在临床诊断领域备受关注。

然而，在面向破伤风毒素的近端免疫检测中，传统的电化学免疫传感器存在局限性，组成复杂，难以实现工业化量产，导致电化学免疫传感器的稳定性较低。

发明内容

根据本发明一个方面，提供了一种用于破伤风毒素检测的免疫传感器的制备方法，包括：打磨紫铜片去除表面氧化层，浸泡在超纯水或酒精中进行超声清洗并通过烤灯照射实现烘干；分别配制四氯金酸溶液与六氯铂酸溶液，将两者按照1：1配置混合并滴加于该紫铜片，在紫外灯下烤干后，形成金铂纳米粒子催化剂层；将该紫铜片置于电子辅助热丝化学气相沉积系统设备的腔室内，将该腔室抽真空并通入氢气和甲烷，打开交流灯丝电源并碳化后，改变气体流量，用以生长金铂-垂直石墨烯电极；取破伤风抗体溶液滴加在该金铂-垂直石墨烯电极中，得到孵育有破伤风抗体的金铂-垂直石墨烯电极，其中，该破伤风抗体溶液包括磷酸缓冲液和浓度为1500ng·mL^-1的破伤风抗体；取牛血清蛋白溶液滴加在孵育有破伤风抗体的金铂-垂直石墨烯电极，得到孵育有牛血清蛋白和破伤风抗体的金铂-垂直石墨烯电极，其中，该牛血清蛋白溶液包括磷酸缓冲液和牛血清蛋白；取破伤风毒素溶液滴加到孵育有牛血清蛋白和破伤风抗体的金铂-垂直石墨烯电极,得到用于破伤风毒素检测的免疫传感器，其中该破伤风毒素溶液包括磷酸缓冲液和浓度为0.1fg mL^-1～100ng mL^-1的破伤风毒素。

根据本发明另一个方面，提供了一种用于破伤风毒素检测的免疫传感器的测试方法，包括：基线采集：选用免疫传感器，通过同轴接口与矢量网络分析仪连接，在覆盖目标频段的扫描范围内进行至少三次S11扫频，记录空白参比曲线与其对应的基线谐振频率f_0,ref，其中所述基线谐振频率f_0,ref是所述空白参比曲线的极小点；标定曲线建立：在0.1fg·mL^-1～100ng·mL^-1的区间，配制一系列破伤风毒素标准溶液，分别滴加至所述免疫传感器的感测区，在预定条件下孵育、清洗与干燥后重复扫频，获得与谐振频率f_0,std；计算频移量Δf_std＝f_0,std-f_0,ref；以Δf_std与标准浓度c的lgc进行回归，得到用于定量的标定方程，并记录其有效工作区间。步骤S206，样品检测与定量：将待测含破伤风毒素的样品按与步骤(2)相同的条件处理并扫频，得到样品谐振频率f_0,sam；计算频移量Δf_sam＝f_0,sam-f_0,ref，将Δf_sam代入所述标定方程，求得所述样品中破伤风毒素的浓度；质量控制：上述扫频均采用不低于三次的重复测量并取平均，必要时剔除离群点；当空白或样品的非特异度量及基线一致性满足预设判据时判定结果有效，否则重测或更换免疫传感器。

本发明通过将四氯金酸/六氯铂酸前驱体在基底原位成膜并生长金铂-垂直石墨烯电极，免转移、窗口更宽、重复性好；金铂活性位与垂直石墨烯纳米叶片协同，获得高比表低界面阻抗；再配合抗体固定与牛血清蛋白封闭，抑制非特异吸附、稳定基线，支撑破伤风毒素低浓度定量及后续应用衔接。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是根据本发明实施例的用于破伤风毒素检测的免疫传感器的制备方法的流程图；

图2是根据本发明实施例1制备所得AuPt-垂直石墨烯电极的示意图；

图3是根据本发明实施例1制备所得垂直石墨烯电极的表面SEM的示意图；

图4是根据本发明实施例1制备所得垂直石墨烯电极的截面SEM的示意图；

图5是根据本发明实施例1制备所得AuPt-垂直石墨烯电极的EDS的示意图；

图6是根据本发明实施例2中天线正面尺寸图；

图7是根据本发明实施例2中天线接地面尺寸图；

图8是根据本发明实施例2中天线侧面图；

图9是根据本发明实施例2中天线总图；

图10是根据本发明实施例2中天线仿真各参数性能图；

图11是根据本发明实施例2中天线基板模具图；

图12是根据本发明实施例2中天线柔性基板图；

图13是根据本发明实施例2中AuPt-垂直石墨烯柔性天线传感器的示意图；

图14是根据本发明实施例2中天线滴加抗体、牛血清、抗原等操作的示意图；

图15是根据本发明实施例2中孵育图；

图16是根据本发明实施例2中天线在矢网部分测量图；

图17是根据本发明实施例2的抗原浓度定量曲线的示意图；

图18是根据本发明实施例2的抗原浓度线性回归方程的示意图；

图19是根据本发明实施例的用于破伤风毒素检测的免疫传感器的测试方法的流程图；以及

图20是根据本发明实施例3的检测多巴胺的频率偏移图。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

本发明实施例提供了一种电化学免疫传感器。图1是根据本发明实施例的用于破伤风毒素检测的免疫传感器的制备方法的流程图。如图1所示，包括如下的步骤S102至步骤S112。

步骤S102，打磨紫铜片去除表面氧化层，浸泡在超纯水或酒精中进行超声清洗并通过烤灯照射实现烘干。

步骤S104，分别配制四氯金酸溶液与六氯铂酸溶液，将两者按照1：1配置混合并滴加于该紫铜片，在紫外灯下烤干后，形成金铂纳米粒子催化剂层。

步骤S106，将该紫铜片置于电子辅助热丝化学气相沉积系统设备的腔室内，将该腔室抽真空并通入氢气和甲烷，打开交流灯丝电源并碳化后，改变气体流量，用以生长金铂-垂直石墨烯电极。

步骤S108，取破伤风抗体溶液滴加在该金铂-垂直石墨烯电极中，得到孵育有破伤风抗体的金铂-垂直石墨烯电极，其中，该破伤风抗体溶液包括磷酸缓冲液和浓度为1500ng·mL^-1的破伤风抗体。

步骤S110，取牛血清蛋白溶液滴加在孵育有破伤风抗体的金铂-垂直石墨烯电极，得到孵育有牛血清蛋白和破伤风抗体的金铂-垂直石墨烯电极，其中，该牛血清蛋白溶液包括磷酸缓冲液和牛血清蛋白。

步骤S112，取破伤风毒素溶液滴加到孵育有牛血清蛋白和破伤风抗体的金铂-垂直石墨烯电极,得到用于破伤风毒素检测的免疫传感器，其中该破伤风毒素溶液包括磷酸缓冲液和浓度为0.1fg mL^-1～100ng mL^-1的破伤风毒素。

在面向破伤风毒素的近端免疫检测中,普遍依赖贵金属电极或转移工艺，工艺窗口窄、批间差大；电极界面难以兼顾高比表与低阻，抗体固定不稳、非特异吸附高，低浓度噪声重。本发明实施例中，通过将四氯金酸/六氯铂酸前驱体在基底原位成膜并生长金铂-垂直石墨烯电极，免转移、窗口更宽、重复性好；金铂活性位与垂直石墨烯纳米叶片协同，获得高比表低界面阻抗；再配合抗体固定与牛血清蛋白封闭，抑制非特异吸附、稳定基线，支撑破伤风毒素低浓度定量及后续应用衔接。

下面结合实施例1和实施例2对本发明实施例的实现过程进行详细描述。

实施例1

本实施例1描述了AuPt-垂直石墨烯电极的制备方法，包括以下步骤：

步骤1，将宽10mm长13mm的紫铜片，用180目砂纸打磨掉铜片表面的氧化层，将其浸泡在超纯水中用超声机超声10～20min以进行清洗，通过285W烤灯照射1～2min烘干。

步骤2，用超纯水配制HAuCl₄(10^-3mM)和H₂PtCl₆(10^-4mM)溶液，然后将HAuCl₄(10^{- 3}mM)和H₂PtCl₆(10^-4mM)溶液进行1：1配置，使用移液枪将配置好的溶液滴加在金属片表面，然后放置在紫外灯(36W)下进行烤干120min备用，在金属片表面形成金铂纳米粒子催化剂层。

步骤3，将铜片放入电子辅助热丝化学气相沉积系统设备的腔室内，将5根钽丝悬挂在热丝铜架上，关闭腔室，关紧热丝CVD沉积系统的放气阀，开始抽真空，接着，通入18mL·min^-1甲烷气体和300mL·min^-1的氢气气体，反应腔室内压强到达2000Pa时，打开交流灯丝电源，通过铜架给五根钽丝两端施加120A电流，此时，电压约为10V。后调节粗抽与细抽，让反应室压强稳定在5000～5132Pa之间。稳定后开始计时碳化时间30min。碳化结束后，改变气路开关，使甲烷气体流量为20mL·min^-1，氢气气体流量为40mL·min^-1，调节直流偏压电源，使电流升至6A，此时电压约为30V，本次使用电子辅助热丝化学气相沉积系统设备生长垂直石墨烯时间为10min，整个垂直石墨烯电极的制备方法仅需4h就可得到成品，具有生长时间短、快速合成等优点。

如图2所示，AuPt-垂直石墨烯电极采用紫铜材料大大降低了成本；将AuPt-垂直石墨烯电极放至扫描电子显微镜下进行观察，垂直石墨烯为二维纳米片如图3所示,制备所得垂直石墨烯电极的截面SEM如图4所示。

实施例1制备所得AuPt-垂直石墨烯电极的EDS如图4所示。由图5可以观察到紫铜片上已经掺杂上金铂纳米粒子，并且可以观察出其嵌在石墨烯上。

实施例2

本实施例2描述了AuPt-垂直石墨烯柔性电极利用天线传感器测试破伤风毒素的流程，包括天线传感器的制备和测试。

步骤1，首先制作AuPt-垂直石墨烯柔性天线传感器，柔性天线传感器由辐射贴片、柔性基板和接地面组装成，天线的辐射片和接地面均采用紫铜(Cu)材料，介质基板采用高分子聚合材料聚二甲基硅氧烷(PDMS)，介电常数为2.8，正切损耗为0.03，长、宽和高的尺寸为14mm×14mm×3mm，凹槽用于滴加溶液或血液，其深为1mm。一般来讲，天线传感器用于2.45GHz频段，首先将天线辐射片形状设计成一个方形，目的是为了增大辐射面积，由于仿真结果没有谐振点，所以将其添加弯折结构，保持与接地面的平衡，此时，谐振产生。由于谐振点未达到理想状态的2.45GHz，所以再进行优化，继续添加贴片的弯折结构，最终达到了2.45GHz应用频段。对于柔性介质基板的制作，首先利用3D打印机制作出与仿真中镜像的模具，然后利用柔性材料PDMS做出仿真中的柔性基板。本天线传感器接地面可以用铜胶带进行雕刻出来，最后该传感器各部分(辐射片、柔性基板和接地面)用导电胶组装而成。步骤1中天线正面尺寸如图6所示，接地面尺寸如图7所示，侧面图如图8所示，天线总图如图9所示，天线仿真各参数性能如图10所示，基板模具如图11所示，柔性基板如图12所示。

步骤2，将辐射贴片浸入HAuCl₄(10^-3mM)和H₂PtCl₆(10^-4mM)混合液，然后放置在紫外灯(36W)下进行烤干120min备用，在金属片表面形成金铂纳米粒子催化剂层，然后在其正面进行石墨烯薄膜的制备，制备完成后可组装成AuPt-垂直石墨烯柔性天线传感器，随后使其进行抗体和牛血清的孵育，分别孵育120min和10min，完成后，用PBS溶液进行冲洗，并把天线器件在自然环境下自然风干，即可得到孵育好的天线免疫传感器，将其接到矢量网络分析仪上记录S₁₁与频率的关系曲线。步骤2中制备完AuPt-垂直石墨烯薄膜图如图2所示，AuPt-垂直石墨烯柔性天线传感器如图13所示，滴加抗体、牛血清、抗原等操作图片如图14所示；孵育图如图15所示。

为了本领域技术人员理解，本实施例继续描述利用天线传感器测试破伤风毒素的流程。

步骤3，准备抗原浓度，准备N份标准溶液，N＝10，每份标准溶液为抗原和磷酸缓冲液(PBS)的混合物，N份标准溶液中抗原(Ag)浓度不同，抗原为破伤风毒素溶液，10份标准溶液中抗原浓度为0.1fg·mL^-1、1fg·mL^-1、10fg·mL^-1、100fg·mL^-1、1pg·mL^-1、10pg·mL^-1、100pg·mL^-1、1ng·mL^-1、10ng·mL^-1和100ng·mL^-1。每份标准溶液为将1.6mg·mL^-1的破伤风毒素溶液使用磷酸缓冲液稀释而成。

步骤4，将N份所需要测的抗原孵育到柔性天线免疫传感器中，孵育20min，完成后用PBS溶液进行冲洗，风干，并接到矢量网络分析仪上记录S₁₁与频率的关系曲线。步骤4中在矢网部分测量图如图16所示，所得抗原浓度定量曲线如图17所示。

步骤5，将矢量网络分析仪原始数据导入分析软件中，进行数据分析，通过频率偏移量获得破伤风毒素的浓度线性方程。每次数据记录需要保存5组数据，通过比较两次谐振点的差值，即频率偏移量，可以检测破伤风毒素浓度。步骤5中抗原浓度线性回归方程如图18所示。

根据本发明的实施例，步骤S106生长金铂-垂直石墨烯电极包括：首先以18mL·min^-1通入甲烷并以300mL·min^-1通入氢气，使该腔室压强达到3999Pa；当该腔室内压强到达2000Pa时，打开该交流灯丝电源，通过铜架给五根钽丝两端施加120A电流，让该腔室的压强稳定在5000–5132Pa并碳化30min。

本发明实施例中，通过先以较高氢气流量配合少量甲烷使腔室压强爬升，在约2000Pa左右点火交流灯丝并稳定至5000–5132Pa进行碳化预处理，可在基底与催化剂层表面实现原位去氧/去污染与均匀活化：氢气选择性刻蚀弱结合碳与残留氧化物，配合灯丝热电子与自由基环境，使金/铂纳米位点分散度提高、成核更均一；同时在较高压强下提升碰撞频率与前驱体裂解效率，30min的碳化阶段形成致密稳定的“种子/缓冲”碳层，增强后续垂直石墨烯的附着力，降低片间接触电阻与批间差异，为快速有序生长打下低缺陷、低噪声的界面基础。

根据本发明的实施例，步骤S106生长金铂-垂直石墨烯电极还包括：改变气路开关，以20mL·min^-1通入甲烷并以40mL·min^-1通入氢气，调节直流偏压电源，使电流升至6A，继续生长10-15min。

本发明实施例中，切换为较低甲烷/适中氢气比，并施加直流偏压(约6A)进行10–15min快速生长，可在离子能量与化学沉积间取得平衡，抑制无定形碳堆积并促进片层各向异性外延，从而获得垂直取向、边缘位点丰富的石墨烯纳米叶片阵列；偏压加速电子/离子迁移与前驱体裂解，使金/铂活性位与碳骨架形成更牢固的电—化学耦合，降低界面电荷转移阻抗并提升机械稳定性。短时生长避免过度增厚引起的屏蔽与翘曲，带来高比表—低阻抗—高重复性的综合效果，直接支撑后续免疫固定/封闭与低浓度样本的灵敏检测。

根据本发明的实施例，步骤S106改变气路开关包括如下步骤(1)至(3)。

(1)确定归一化的稳压误差积分En用以度量压强偏差

其中，

t₀和t₁是时间区间的下限和上限，单位s，

p₀是目标压强，单位Pa，

p(t)是随时间变化的腔室实际压强，单位Pa；

(2)确定离散比例更新律用以更新控制量

u_k+1＝u_k-η(p_k-p₀)

其中，u_k是抽气端控制量，无量纲

p_k是离散采样时刻t_k监测的压强，单位Pa；

(3)若连续r次校正后仍不满足|p_k-p0|≤δ，则以甲烷流量微步长Δq_CH4和氢气流量微步长Δq_H2进行配比微调，直至E_n≤ε或达到安全次数上限，其中δ是压强阈值且单位Pa，ε是压强偏差阈值且无量纲。

本发明实施例中，以误差积分阈值与分层式离散校正显式量化稳压性能，并以“先抽气、后配比”的策略抑制过渡振荡，从而保障金铂-垂直石墨烯电极的有序生长与批内一致性。

进一步地，上述步骤(3)中，以甲烷流量微步长Δq_CH4和氢气流量微步长Δq_H2进行配比微调直至E_n≤ε或达到安全次数上限包括：

(Ⅰ)总流量修正且配比保持不变

对反应气体总流量Q＝q_CH4+q_H2进行微量调整，同时保持甲烷/氢气的目标气体配比r₀＝q_CH4/q_H2,其中Q是反应气体总流量且单位mL·min^-1，r₀是甲烷/氢气的目标气体配比且无量纲；

确定Q_k+1＝Q_k-sgn(p_k-p₀)ΔQ_step和

其中，

Q_k是配比微调时的当前总流量，单位mL·min^-1，

sgn()是符号函数，无量纲，

ΔQ_step是总流量单次微调步长，满足0<ΔQ_step≤ΔQ_max，单位mL·min^-1，

ΔQ_max是允许的总流量步长上限，单位mL·min^-1；

(Ⅱ)配比微调且总流量保持不变

若执行J次步骤(Ⅰ)后仍不满足|p_k-p0|≤δ，则在保持Q不变的条件下对气体配比r＝q_CH4/q_H2进行微量修正：

r_k+1＝r_k-κsgn(p_k-p₀)Δr_step

其中，

Δr_step是配比单次微调步长，无量纲，满足0<Δr_step≤Δr_max，

Δr_max是允许的配比微调步长上限，无量纲，

κ为步长系数，无量纲，

r_min≤r_k≤r_max，其中r_min和r_max是配比的安全边界，无量纲，用以防止化学计量超界，

Q_k是配比微调时的当前总流量，单位mL·min^-1，在本步骤(Ⅱ)中保持不变；

(Ⅲ)终止判据及终止条件

第一终止判据是误差积分判据：在En≤ε满足时终止，

第二终止判据是连续点判据：最近s次离散采样均满足压强偏差限时终止，其中p_j是第j次采样的腔室压强，单位Pa，

第三终止判据是安全保护判据，满足以下三种情形之一时终止：

(a)累计调整次数N≥Nmax，其中N是两步修正的总次数上限，是正整数，无量纲；

(b)总流量单位mL·min^-1；

(c)配比无量纲。

本发明实施例中，通过“先总流量、后配比”的两步离散校正，将压强调控与化学计量解耦：步骤(I)在保持甲烷/氢气配比不变的条件下，仅以有符号的小步长ΔQ_step单调修正总流量Q，优先消除由抽气或通气引起的总体压强偏差，避免因成分突变带来的等离子/热场扰动与过冲；若仍未达阈，则步骤(II)在保持Q不变的前提下，以无量纲小步长Δr_step微调配比r，细化离子/活性基团生成与表面反应的平衡区间，从而在不改变通量负载的情况下修正化学微环境。与之配套的“三重终止判据”(误差积分En达标、连续s次点内偏差达标、安全边界与次数上限)形成连续量+离散量的双重收敛与保护机制：既保证压强在时域内的整体稳定，又保证短时采样的局部稳定，同时为异常振荡、步长累积或越界情况设置“硬停止”。综合作用的结果是降低腔室压强与气氛的振荡幅度与频度，减少过渡段无定形碳/欠刻蚀风险，提升AuPt-VG原位生长的一致性(层间取向更均一、界面缺陷更少)，并为后续抗体固定与BSA封闭提供更稳定的物理化学基线。

根据本发明的实施例，步骤S108包括如下的步骤A至D。

步骤A，以表面覆盖度为控制目标，

步骤B，设单位面积覆盖度Γ(c)随抗体工作浓度c满足等温吸附模型：

Γ(c)＝(Γ_max·K·c)/(1+K·c)

其中，

Γ(c)是单位面积覆盖度，单位mol·m^-2，

Γ_max是最大覆盖度，单位mol·m^-2，

K是为吸附亲和常数，单位L·mol-1，

c是抗体工作浓度，单位mol·L-1；

步骤C，以面积积分约束∫_AΓ(c)dA≥Γ_target·A作为固定终止判据，其中，Γ_target是目标覆盖度,单位mol·m^-2，A是感测区面积，单位m²；

步骤D，当试滴测得的Γ(c)未满足该面积积分约束时，以迭代次数n，按c^(n+1)＝c^(n)·[Γ_target/Γ(c^(n))]更新工作浓度并重复固定-检测流程，直至满足该控制目标或达到预设迭代上限。

本发明实施例中，以等温吸附模型和面积积分约束将“目标覆盖度”显式化，并用迭代更新浓度的方式自适应收敛到目标区间，从而在不改变工艺主链的情况下提升抗体固定层的一致性与可复制性。

根据本发明的实施例，在该步骤S108后，还包括步骤E至G。

步骤E，将残留比ρ_m＝Q_m/Q作为第一清洗充分性判据，其中，Q_m是第m轮清洗后的回收液中蛋白残留的体积分数浓度,单位mg·L-1，Q是预设的蛋白残留的体积分数浓度,单位mg·L-1，ρ_m是第m轮清洗后的回收液中的蛋白残留比,无量纲；

步骤F，将作为第二清洗充分性判据，其中,R是第m轮清洗后的回收液中的蛋白残留比的算术平均值,无量纲；

步骤G，当R≤1时，判定清洗充分；当Q_m＞Q时进入第m+1轮清洗，否则终止；若m达到M仍存在ρ_m＞1，其中M为最大轮次，则执行延长时程的最终清洗并记录异常。

本发明实施例中，以“残留量—阈值—最大轮次”的闭环逻辑设定清洗终点，避免清洗不足或过度清洗，以便兼顾去除未结合抗体与保持固定层稳定性，降低批间与次间漂移风险。

根据本发明的实施例，步骤S110包括：

采用归一化非特异度量

其中，

f_L是频段下限，单位Hz，

f_H是频段上限，单位Hz，

F_BW是频段带宽，F_BW＝f_H-f_L，单位Hz，

S₁₁是散射参数，取幅值，无量纲，

S₁₁ ^(ref)(f)是封闭前参比曲线，

S₁₁ ^(after)(f)是封闭后参比曲线，

P_NS是在指定频段内的均方差积分的带宽归一化结果，无量纲；

构建代价函数J＝αP_NS+βt，其中，

α是带宽权重，无量纲，

β是时间权重，单位s^-1，

t是封闭时间，单位s，

J是代价函数，无量纲；

选择满足J≤τ的(c_BSA,t)组合作为封闭参数，其中，

τ为封闭阈值，无量纲，

c_BSA是封闭用牛血清白蛋白溶液的浓度，单位mg·mL-1。

本发明实施例中，用带宽归一化的频域积分量化非特异响应，并通过代价函数将“封闭充分性—时间成本”统一起来，实现对封闭浓度与时程的联合最优，获得稳定基线与更低背景噪声。

根据本发明的实施例，该免疫传感器采用方形辐射贴片，该方形辐射贴片的外形边长是10–20mm，并沿相邻两条边一体设置蛇形折弯段以延长等效电流路径，该蛇形折弯段由3–9个折弯单元串接构成，其中，

0.02≤w_b/a≤0.080并且0.06≤p/a≤0.20，

其中，

w_b是每个该折弯单元的折线线宽，单位mm，

p是每个该折弯单元的，单位mm，

a是该方形辐射贴片的外形边长，单位mm；

0.04≤d_b/a≤0.18并且0.15≤L_b/a≤0.45，

其中，

d_b是每个该折弯单元进入贴片内部的回折深度，单位mm，

L_b是该蛇形折弯段的总等效附加长度，单位mm；

该方形辐射贴片与接地面布置于柔性介质基板上，该接地面在与该蛇形折弯段对应的下方区域设置为缺陷地结构，该缺陷地结构包括一条或多条狭缝，其中，

0.09≤l_g/λ₀≤0.16并且0.01≤w_g/λ₀≤0.04，

其中，

l_g是单条狭缝的投影长度，单位mm，

w_g是单条狭缝的投影宽度，单位mm，

λ₀是目标中心频率2.45GHz对应的自由空间波长；

其中，该多条狭缝等距平行设置，每条狭缝端点与贴片边缘的水平投影距离满足0.01≤s/λ₀≤0.05，其中s是每条狭缝的端点与最近贴片外边缘之间的水平投影距离，单位mm；

该缺陷地结构的长边朝向与折弯段主导电流方向平行或形成不大于20°的夹角；接地面其余区域连续无缝，并通过同层或过孔与外部同轴馈线的屏蔽层电连接。

本发明实施例中，采用方形贴片相邻两边的蛇形折弯，在不增大外形下延长等效电流路径，将谐振下移并精细调谐至2.45GHz；通过线宽w_b、节距p与回折深度d_b的区间约束，兼顾辐射与损耗。于折弯下方布置与其走向一致的狭缝缺陷地结构，并以lg/λ₀、wg/λ₀及端点至贴片边缘距离s的归一化范围限定耦合，可抑制地面高阶电流与背向辐射、提升输入匹配与|S11|深度；几何参数归一化表述降低基板厚度/介电波动致的频移离散，增强重复性与传感稳定性。

根据本发明的实施例，还提供了一种用于破伤风毒素检测的免疫传感器的测试方法。图19是根据本发明实施例的用于破伤风毒素检测的免疫传感器的测试方法的流程图。如图19所示，包括如下的步骤S202至步骤S208。

步骤S202，基线采集：选用免疫传感器，通过同轴接口与矢量网络分析仪连接，在覆盖目标频段的扫描范围内进行至少三次S11扫频，记录空白参比曲线与其对应的基线谐振频率f_0,ref，其中所述基线谐振频率f_0,ref是所述空白参比曲线的极小点。

步骤S204，标定曲线建立：在0.1fg·mL^-1～100ng·mL^-1的区间，配制一系列破伤风毒素标准溶液，分别滴加至所述免疫传感器的感测区，在预定条件下孵育、清洗与干燥后重复扫频，获得与谐振频率f_0,std；计算频移量Δf_std＝f_0,std-f_0,ref；以Δf_std与标准浓度c的lgc进行回归，得到用于定量的标定方程，并记录其有效工作区间。

步骤S206，样品检测与定量：将待测含破伤风毒素的样品按与步骤(2)相同的条件处理并扫频，得到样品谐振频率f_0,sam；计算频移量Δf_sam＝f_0,sam-f_0,ref，将Δf_sam代入所述标定方程，求得所述样品中破伤风毒素的浓度。

步骤S208，质量控制：上述扫频均采用不低于三次的重复测量并取平均，必要时剔除离群点；当空白或样品的非特异度量及基线一致性满足预设判据时判定结果有效，否则重测或更换免疫传感器。

本发明实施例中，以同一传感器的空白基线f_0,ref为参照，配合多次S11扫频取平均，显著降低瞬时噪声与仪器漂移对谐振点判定的影响；通过在0.1fg·mL^-1～100ng·mL^-1区间内建立Δf_std—lgc标定，兼顾超宽动态范围与可拟合性，使低浓度灵敏、高浓度不饱和；样品检测严格复现标定时的孵育/清洗/干燥条件，控制界面一致性以削弱基质效应；并以非特异度量与离群剔除的质量控制判据保障结果有效性，从而实现破伤风毒素的快速、稳定、可追溯的定量检测。

下面结合实施例3对本发明实施例的实现过程进行详细描述。

实施例3

本实施例3描述了AuPt-垂直石墨烯柔性电极利用天线传感器检测多巴胺的流程。

步骤1，首先制作AuPt-垂直石墨烯柔性天线传感器，柔性天线传感器由辐射贴片、柔性基板和接地面组装成，天线的辐射片和接地面均采用紫铜(Cu)材料，介质基板采用高分子聚合材料聚二甲基硅氧烷(PDMS)，介电常数为2.8，正切损耗为0.03，长、宽和高的尺寸为14mm×14mm×3mm，凹槽用于滴加溶液或血液，其深为1mm。一般来讲，天线传感器用于2.45GHz频段，首先将天线辐射片形状设计成一个方形，目的是为了增大辐射面积，由于仿真结果没有谐振点，所以将其添加弯折结构，保持与接地面的平衡，此时，谐振产生。由于谐振点未达到理想状态的2.45GHz，所以再进行优化，继续添加贴片的弯折结构，最终达到了2.45GHz应用频段。对于柔性介质基板的制作，首先利用3D打印机制作出与仿真中镜像的模具，然后利用柔性材料PDMS做出仿真中的柔性基板。本天线传感器接地面可以用铜胶带进行雕刻出来，最后该传感器各部分(辐射片、柔性基板和接地面)用导电胶组装而成。

步骤2，检测AuPt-垂直石墨烯柔性电极下的天线谐振作为空白对照；分别检测0.1mmol/L、0.5mmol/L、1mmol/L、5mmol/L、10mmol/L浓度下的多巴胺的天线谐振；最终得到如图18所示。图18中可以看出不同浓度下的多巴胺谐振不同，浓度越大相应的偏移量也越大，对比与电化学检测法(金铂共掺垂直石墨烯/碳纤维微电极及其制备方法和应用-张鑫钰)可以看出相对现有技术制备的垂直石墨烯电极,本发明金掺垂直石墨烯天线传感器具有明显的频率偏移特性，这是实现无线检测的关键。

综上所述，根据本发明的上述实施例，提供了一种用于破伤风毒素检测的免疫传感器的制备和测试方法。本发明通过将四氯金酸/六氯铂酸前驱体在基底原位成膜并生长金铂-垂直石墨烯电极，免转移、窗口更宽、重复性好；金铂活性位与垂直石墨烯纳米叶片协同，获得高比表低界面阻抗；再配合抗体固定与牛血清蛋白封闭，抑制非特异吸附、稳定基线，支撑破伤风毒素低浓度定量及后续应用衔接。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于破伤风毒素检测的免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括：

(1)打磨紫铜片去除表面氧化层，浸泡在超纯水或酒精中进行超声清洗并通过烤灯照射实现烘干；

(2)分别配制四氯金酸溶液与六氯铂酸溶液，将两者按照1：1配置混合并滴加于所述紫铜片，在紫外灯下烤干后，形成金铂纳米粒子催化剂层；

(3)将所述紫铜片置于电子辅助热丝化学气相沉积系统设备的腔室内，将所述腔室抽真空并通入氢气和甲烷，打开交流灯丝电源并碳化后，改变气体流量，用以生长金铂-垂直石墨烯电极；

(4)取破伤风抗体溶液滴加在所述金铂-垂直石墨烯电极中，得到孵育有破伤风抗体的金铂-垂直石墨烯电极，其中，所述破伤风抗体溶液包括磷酸缓冲液和浓度为1500ng·mL^-1的破伤风抗体；

(5)取牛血清蛋白溶液滴加在孵育有破伤风抗体的金铂-垂直石墨烯电极，得到孵育有牛血清蛋白和破伤风抗体的金铂-垂直石墨烯电极，其中，所述牛血清蛋白溶液包括磷酸缓冲液和牛血清蛋白；

(6)取破伤风毒素溶液滴加到孵育有牛血清蛋白和破伤风抗体的金铂-垂直石墨烯电极,得到用于破伤风毒素检测的免疫传感器，其中所述破伤风毒素溶液包括磷酸缓冲液和浓度为0.1fg mL^-1～100ng mL^-1的破伤风毒素。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，生长金铂-垂直石墨烯电极包括：

首先以18mL·min^-1通入甲烷并以300mL·min^-1通入氢气，使所述腔室压强达到3999Pa；

当所述腔室内压强到达2000Pa时，打开所述交流灯丝电源，通过铜架给五根钽丝两端施加120A电流，

让所述腔室的压强稳定在5000–5132Pa并碳化30min。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，生长金铂-垂直石墨烯电极还包括：改变气路开关，以20mL·min^-1通入甲烷并以40mL·min^-1通入氢气，调节直流偏压电源，使电流升至6A，继续生长10-15min。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，改变气路开关包括：

确定归一化的稳压误差积分En用以度量压强偏差

其中，

t₀和t₁是时间区间的下限和上限，单位s，

p₀是目标压强，单位Pa，

p(t)是随时间变化的腔室实际压强，单位Pa；

确定离散比例更新律用以更新控制量

u_k+1＝u_k-η(p_k-p₀)

其中，u_k是抽气端控制量，无量纲

p_k是离散采样时刻t_k监测的压强，单位Pa；

若连续r次校正后仍不满足|p_k-p₀|≤δ，则以甲烷流量微步长Δq_CH4和氢气流量微步长Δq_H2进行配比微调，直至E_n≤ε或达到安全次数上限，其中δ是压强阈值且单位Pa，ε是压强偏差阈值且无量纲。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，以甲烷流量微步长Δq_CH4和氢气流量微步长Δq_H2进行配比微调直至E_n≤ε或达到安全次数上限包括：

(Ⅰ)总流量修正且配比保持不变

对反应气体总流量Q＝q_CH4+q_H2进行微量调整，同时保持甲烷/氢气的目标气体配比r₀＝q_CH4/q_H2,其中Q是反应气体总流量且单位mL·min^-1，r₀是甲烷/氢气的目标气体配比且无量纲；

确定Q_k+1＝Q_k-sgn(p_k-p₀)ΔQ_step和

其中，

Q_k是配比微调时的当前总流量，单位mL·min^-1，

sgn()是符号函数，无量纲，

ΔQ_step是总流量单次微调步长，满足0<ΔQ_step≤ΔQ_max，单位mL·min^-1，

ΔQ_max是允许的总流量步长上限，单位mL·min^-1；

(Ⅱ)配比微调且总流量保持不变

若执行J次步骤(Ⅰ)后仍不满足|p_k-p₀|≤δ，则在保持Q不变的条件下对气体配比r＝q_CH4/q_H2进行微量修正：

r_k+1＝r_k-κsgn(p_k-p₀)Δr_step

其中，

Δr_step是配比单次微调步长，无量纲，满足0<Δr_step≤Δr_max，

Δr_max是允许的配比微调步长上限，无量纲，

κ为步长系数，无量纲，

r_min≤r_k≤r_max，其中r_min和r_max是配比的安全边界，无量纲，用以防止化学计量超界，

Q_k是配比微调时的当前总流量，单位mL·min^-1，在本步骤(Ⅱ)中保持不变；

(Ⅲ)终止判据及终止条件

第一终止判据是误差积分判据：在En≤ε满足时终止，

第二终止判据是连续点判据：最近s次离散采样均满足压强偏差限时终止，其中p_j是第j次采样的腔室压强，单位Pa，

第三终止判据是安全保护判据，满足以下三种情形之一时终止：

(a)累计调整次数N≥Nmax，其中N是两步修正的总次数上限，是正整数，无量纲；

(b)总流量单位mL·min^-1；

(c)配比无量纲。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)包括：

以表面覆盖度为控制目标，

设单位面积覆盖度Γ(c)随抗体工作浓度c满足等温吸附模型：

Γ(c)＝(Γ_max·K·c)/(1+K·c)

其中，

Γ(c)是单位面积覆盖度，单位mol·m^-2，

Γ_max是最大覆盖度，单位mol·m^-2，

K是为吸附亲和常数，单位L·mol-1，

c是抗体工作浓度，单位mol·L-1；

并以面积积分约束∫_AΓ(c)dA≥Γ_target·A作为固定终止判据，

其中，

Γ_target是目标覆盖度,单位mol·m^-2，

A是感测区面积，单位m²；

当试滴测得的Γ(c)未满足所述面积积分约束时，以迭代次数n，按c^(n+1)＝c^(n)·[Γ_target/Γ(c^(n))]更新工作浓度并重复固定-检测流程，直至满足所述控制目标或达到预设迭代上限。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在所述步骤(4)后，还包括：

将残留比ρ_m＝Q_m/Q作为第一清洗充分性判据,其中,

Q_m是第m轮清洗后的回收液中蛋白残留的体积分数浓度,单位mg·L-1，

Q是预设的蛋白残留的体积分数浓度,单位mg·L-1，

ρ_m是第m轮清洗后的回收液中的蛋白残留比,无量纲；

将作为第二清洗充分性判据，其中,R是第m轮清洗后的回收液中的蛋白残留比的算术平均值,无量纲；

当R≤1时，判定清洗充分；

当Q_m＞Q时进入第m+1轮清洗，否则终止；

若m达到M仍存在ρ_m＞1，其中M为最大轮次，则执行延长时程的最终清洗并记录异常。

8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(5)包括：

采用归一化非特异度量

其中，

f_L是频段下限，单位Hz，

f_H是频段上限，单位Hz，

F_BW是频段带宽，F_BW＝f_H-f_L，单位Hz，

S₁₁是散射参数，取幅值，无量纲，

S₁₁ ^(ref)(f)是封闭前参比曲线，

S₁₁ ^(after)(f)是封闭后参比曲线，

P_NS是在指定频段内的均方差积分的带宽归一化结果，无量纲；

构建代价函数J＝αP_NS+βt，其中，

α是带宽权重，无量纲，

β是时间权重，单位s^-1，

t是封闭时间，单位s，

J是代价函数，无量纲；

选择满足J≤τ的(c_BSA,t)组合作为封闭参数，其中，

τ为封闭阈值，无量纲，

c_BSA是封闭用牛血清白蛋白溶液的浓度，单位mg·mL-1。

9.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述免疫传感器采用方形辐射贴片，所述方形辐射贴片的外形边长是10–20mm，并沿相邻两条边一体设置蛇形折弯段以延长等效电流路径，所述蛇形折弯段由3–9个折弯单元串接构成，其中，

0.02≤w_b/a≤0.080并且0.06≤p/a≤0.20，

其中，

w_b是每个所述折弯单元的折线线宽，单位mm，

p是每个所述折弯单元的，单位mm，

a是所述方形辐射贴片的外形边长，单位mm；

0.04≤d_b/a≤0.18并且0.15≤L_b/a≤0.45，

其中，

d_b是每个所述折弯单元进入贴片内部的回折深度，单位mm，

L_b是所述蛇形折弯段的总等效附加长度，单位mm；

所述方形辐射贴片与接地面布置于柔性介质基板上，所述接地面在与所述蛇形折弯段对应的下方区域设置为缺陷地结构，所述缺陷地结构包括一条或多条狭缝，其中，

0.09≤l_g/λ₀≤0.16并且0.01≤w_g/λ₀≤0.04，

其中，

l_g是单条狭缝的投影长度，单位mm，

w_g是单条狭缝的投影宽度，单位mm，

λ₀是目标中心频率2.45GHz对应的自由空间波长；

其中，所述多条狭缝等距平行设置，每条狭缝端点与贴片边缘的水平投影距离满足0.01≤s/λ₀≤0.05，其中s是每条狭缝的端点与最近贴片外边缘之间的水平投影距离，单位mm；

所述缺陷地结构的长边朝向与折弯段主导电流方向平行或形成不大于20°的夹角；接地面其余区域连续无缝，并通过同层或过孔与外部同轴馈线的屏蔽层电连接。

10.一种用于破伤风毒素检测的免疫传感器的测试方法，其特征在于，包括：

(1)基线采集：选用按照权利要求1–9中任一项该方法制备的免疫传感器，通过同轴接口与矢量网络分析仪连接，在覆盖目标频段的扫描范围内进行至少三次S11扫频，记录空白参比曲线与其对应的基线谐振频率f_0,ref，其中该基线谐振频率f_0,ref是该空白参比曲线的极小点；

(2)标定曲线建立：在0.1fg·mL^-1～100ng·mL^-1的区间，配制一系列破伤风毒素标准溶液，分别滴加至该免疫传感器的感测区，在预定条件下孵育、清洗与干燥后重复扫频，获得与谐振频率f_0,std；计算频移量Δf_std＝f_0,std-f_0,ref；以Δf_std与标准浓度c的lgc进行回归，得到用于定量的标定方程，并记录其有效工作区间；

(3)样品检测与定量：将待测含破伤风毒素的样品按与步骤(2)相同的条件处理并扫频，得到样品谐振频率f_0,sam；计算频移量Δf_sam＝f_0,sam-f_0,ref，将Δf_sam代入该标定方程，求得该样品中破伤风毒素的浓度；

(4)质量控制：上述扫频均采用不低于三次的重复测量并取平均，必要时剔除离群点；当空白或样品的非特异度量及基线一致性满足预设判据时判定结果有效，否则重测或更换免疫传感器。