CN121175028A

CN121175028A - Oca2调节剂、其组合物及其用途

Info

Publication number: CN121175028A
Application number: CN202480034728.8A
Authority: CN
Inventors: 兰·格林伯格
Original assignee: Aurora Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Aurora Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2023-03-28
Filing date: 2024-03-28
Publication date: 2025-12-19
Also published as: IL323566A; WO2024201471A1; EP4687826A1; KR20250166233A

Abstract

本公开涉及用于经由调节OCA2蛋白的水平和/或活性和/或稳定性来修改受试者眼睛颜色的方法。本公开还涉及至少一种OCA2蛋白调节剂或包含其的任何组合物及其用途。

Description

OCA2调节剂、其组合物及其用途

技术领域

本公开涉及化妆品应用领域。更具体地，本公开涉及调节受试者的眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白，例如用于修改所述受试者的眼睛颜色。

背景技术

以下列出了被认为与目前公开的主题的背景技术相关的参考文献：

-[1] Eiberg H等人(2008) Hum Genet. 2008 Mar;123(2):177–87.

-[2] Suarez P等人(2021).Sci Rep. 11(1):22530.

-[3] Park, S., Morya, V.K., Nguyen, D.H.等人(2015) Mol Cell Biochem403, 61–71.

-[4] WO2021146668

-[5] US9744237

本文对上述参考文献的承认不应被推断为意指这些参考文献以任何方式与目前公开的主题的专利性相关。

发明背景

许多人出于美容原因希望改变或增强眼睛、皮肤或头发的颜色。例如，改变眼睛颜色的产品有很大的市场。然而，传统方法（诸如隐形眼镜、植入物和激光手术）均未取得理想效果。此外，传统的皮肤和头发颜色处理方法也存在问题，需要多次应用可能具有毒性的产品。

服用青光眼药物的人群中还有一个日益凸显的问题是药物可能导致眼睛变暗，影响外观美观。随着人口老龄化和青光眼患病率上升，越来越多人正经历此问题。此外，由先天性或获得性异色症（例如霍纳氏综合征或富克斯氏虹膜睫状体炎）导致的不对称现象，可以通过治疗对侧眼或颜色较深的眼睛进行矫正。

眼睛颜色由多种内在因素决定，包括虹膜中黑色素的数量、黑色素类型（真黑素/褐黑素）与比例、黑素体数量及其成熟度、黑素体与细胞核之间的距离，以及虹膜中成纤维细胞和胶原蛋白的数量。角膜也赋予了眼睛颜色，因为移除角膜后，颜色的鲜艳度会显现出差异。

黑素细胞是存在于身体各种组织中的细胞，其主要作用是通过合成黑色素来调控组织中的色素沉着量。它们主要存在于眼睛（例如虹膜）、头发和皮肤中。

黑色素是棕色色素，其丰度是虹膜赋予棕色眼睛其颜色。然而，蓝色眼睛的蓝色并非源自色素，而是源于与天空产生蓝色类似的光学现象。整个色谱波长的光进入眼睛。长波（黄光和红光）相对不受阻碍地继续传播，直到被虹膜后部吸收；而短波（蓝光）由于缺乏黑色素，倾向于更频繁地发生散射（瑞利散射），这是一种在较短波长的光中发生得更为频繁的随机现象。

黑色素在称为黑素体的特殊细胞器中产生。黑素体必须维持适当的内部pH值才能成熟并充分色素化。由于OCA2蛋白的缺失，黑素体功能失常无法成熟，导致组织中的色素生产显著减少。绝大多数蓝眼睛个体OCA2蛋白含量降低，导致其虹膜基质中存在未成熟黑素体，从而减少色素沉着。

黑素体成熟发生在细胞质中，通常分为四个不同阶段，其中第四阶段被视为成熟阶段。黑素体成熟需要多种蛋白质参与。在棕色眼睛中，黑素体细胞器主要处于成熟第四阶段，而蓝色眼睛中大部分黑素体处于I至II阶段，少量处于III阶段，几乎不存在第IV阶段黑素体。

多数拥有浅色眼睛的人，其眼睛颜色是由于15号染色体上的HERC2基因发生了一个祖先突变所致[1]。尽管许多突变和遗传变化共同造就了人类皮肤、头发和眼睛的丰富色彩，但OCA2基因表达降低才是大多数浅色眼睛形成的主要原因。这两种基因，即OCA2基因本身和同样作为OCA2转录启动子的HERC2基因中的突变，共同决定了个体约90%的眼睛颜色表型（浅色/棕色）[2]。先前研究表明，抑制粉眼稀释蛋白（P蛋白，由OCA2基因产生）可以改变黑素体形态、类型以及它们的相应数量，并且可能在控制小鼠皮肤癌细胞的黑色素合成中发挥作用[3]。

WO2021146668 [4]公开了一种通过遗传操纵诱导虹膜基质中黑素细胞死亡来改变受试者虹膜颜色的方法。

US9744237 [5]公开了通过施用酪氨酸酶抑制剂来淡化虹膜颜色的方法和系统。

需要一种安全有效的方法来改变眼睛的颜色，同时也需要一种解决方案来逆转由青光眼药物引起的眼睛变色。此外，需要一种快速渗透的局部眼用药物，其能够克服当前抑制活性成分在眼中渗透的屏障（诸如角膜前和角膜因素），或另选地，能够通过巩膜-结膜途径或其他任何给药形式（结膜下、玻璃体内、前房内、视网膜下、全身给药或其他方式）发现的途径抵达靶组织——虹膜。此外，还需要一种化妆品或治疗剂的递送系统，该化妆品或治疗剂能够靶向虹膜色素组织并有效改变眼睛颜色或递送治疗，且不对患者造成不利影响。

发明内容

第一方面，本公开提供了一种修改受试者眼睛颜色的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的至少一种眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白调节剂，或者其任何媒介物、基质、纳米颗粒或微米颗粒，或者包含其的任何组合物。

另一方面，本公开提供了至少一种眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白调节剂，或者其任何媒介物、基质、纳米颗粒或微米颗粒，或者包含其的任何组合物，其用于修改受试者眼睛颜色的方法中，该方法包括向所述受试者施用有效量的所述至少一种OCA2蛋白调节剂。

又一方面，本公开提供了一种用于修改受试者眼睛颜色的组合物，该组合物包含至少一种眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白调节剂。

又一方面，本公开提供了一种药物组合物，该药物组合物包含至少一种眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白调节剂，以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

再一方面，本公开提供了一种用于修改受试者眼睛颜色的核酸分子，该核酸分子包含至少一种眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白调节剂。

又一方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的疾病/病症的方法，该方法包括向所述受试者施用有效量的至少一种眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白调节剂，或者其任何媒介物、基质、纳米颗粒或微米颗粒，或者包含其的任何组合物。

再一附加方面，本公开提供了至少一种眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白调节剂，或者其任何媒介物、基质、纳米颗粒或微米颗粒，或者包含其的任何组合物，其用于治疗有需要的受试者的疾病/病症的方法中，该方法包括向所述受试者施用有效量的所述至少一种OCA2蛋白调节剂。

附图说明

为了更好地理解本文所公开的主题并且举例说明如何在实践中实施该主题，现在将参考附图仅通过非限制性示例来描述实施方案，在附图中：

图1：黑色素评估。

在接种后第5天直接测量不同浓度B16-F10细胞的理性校准黑色素评估（360nm处的OD）。

图2：OCA2表达。

B16-F10细胞转染20nM或50nM OCA2 siRNA #1、#2或#3（如SEQ ID NO: 70至75所表示）后的OCA2表达。缩写：“neg”为阴性对照，“lipo only”（仅脂质体），“UN”（未转染组）。

图3：黑色素吸光度。

不同浓度B16-F10细胞转染OCA2 siRNA #1、#2或#3（如SEQ ID NO: 70至75所表示）后OD 360nm处的黑色素吸光度。

图4：虹膜活力测定。

在A、B、C三种类型的培养基中培养的小鼠虹膜外植体的活力测定。虹膜样本-4和虹膜样本-12从第一天起就无活性，并在整个研究期间持续如此。其余样本均保持其活力，仅观察到微小变化。

图5A至图5B：离体虹膜转染可视化。

图5A：虹膜样本的图片，该样本已转染荧光团偶联的对照siRNA（绿色），并用Hoechst（蓝色）进行复染，展示了siRNA在细胞结构内的共定位情况。红色方框指示位于虹膜6点钟方位附近的特定区域。

图5B：图5A中红色方框所示区域的放大图。

虹膜的完整形态如图5A所示。

图6：转染SOX10 siRNA或乱序对照siRNA后虹膜样本的SOX10表达。每组包含2个虹膜样本的混合池。

图7A至图7B：暴露于光源的效果。

三周间隔后头发样本的比较分析。

图7A：未经受光照暴露的对照组。

图7B：经受光照暴露的实验组。

该图展示了在不同条件下经历三周时间后，女性捐赠者的浅棕色头发与男性捐赠者的深色头发在色素沉着方面的差异。

图8A至图8D：离体活性虹膜样本中的脱色素作用– OCA2-siRNA处理前后的宏观照片。

图8A：虹膜样本的预处理图像。

图8B：OCA2-siRNA组虹膜样本的后处理图像。

图8C：对照组中虹膜样本的预处理图像（基线）。

图8D：对照组中虹膜样本的后处理图像。

图9：虹膜颜色饱和度。

该图表示出了处理组与对照组的平均虹膜颜色饱和度值。对所有图像的背景差异进行了校正，校正方法是从虹膜的颜色饱和度值中减去背景的颜色饱和度值。

图10A至图10C：处理后虹膜组织的比较显微分析。

图10A：经OCA2-siRNA和光漂白处理后虹膜组织的显微分析图片。

图10B：经乱序siRNA和光漂白处理后的虹膜组织的显微分析图片。

图10C：未经任何处理或光漂白的虹膜组织的显微分析图片。

具体实施方式

目前提出的用于修改眼睛颜色的解决方案并不令人满意，并且包括严重的副作用、远非自然的非美学效果，以及不便的使用方式。

本公开旨在以安全有效的方式满足改变眼睛颜色的未满足需求，并且涉及调节受试者眼睛中OCA2蛋白的水平。通过本文公开的所提出的组合物和方法，实现自然的美学外观和可察觉的眼睛颜色变化。

第一方面，本公开提供了一种修改受试者眼睛颜色的方法。该方法包括向所述受试者施用有效量的至少一种眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白调节剂，或者其任何媒介物、基质、纳米颗粒或微米颗粒，或者包含其的任何组合物。

如本文所用，眼皮肤白化病2（OCA2）基因涉及编码也称为P蛋白的OCA2蛋白的基因。在一些实施方案中，OCA2为人OCA2。在另一些进一步的实施方案中，人OCA2基因位于15号染色体上（位置15q12-q13.1）。在一些实施方案中，人OCA2 mRNA包含如登录号NM_000275.3所表示的核酸序列。在一些实施方案中，人OCA2 mRNA包含如SEQ ID NO: 65所表示的核酸序列。更进一步，在一些实施方案中，人OCA2 mRNA编码具有登录号NP_000266.2的OCA2蛋白。在一些实施方案中，人OCA2蛋白可以包含如SEQ ID NO: 66所表示的氨基酸序列。

如本文所用，OCA2蛋白的调节剂涉及任何可以通过直接作用（即，通过作用于OCA2蛋白本身或通过作用于OCA2基因及其转录）来改变（增加或减少）活性OCA2蛋白水平的作用剂。在另一些进一步的实施方案中，调节剂可以间接作用于控制和/或影响OCA2的表达和/或活性和/或稳定性和/或组织分布和/或细胞定位的任何靶分子或任何序列。在一些实施方案中，调节剂可以被修饰以提高其效率并减少其潜在的不利影响。在一些实施方案中，调节剂可以包括辅助材料，诸如具有明确作用的纳米颗粒包封物，以帮助递送药物穿过解剖学和生理学屏障，提高其在组织内的稳定性，将药物引入细胞并且提高内体逃逸事件的速率。该材料可以包括但不限于脂质、聚合物等。在一些实施方案中，调节剂可以与能够将包封物锚定至靶细胞的配体或分子缀合。在一些实施方案中，调节剂不激活免疫系统，例如，当通过测定（诸如体外测定）测量时，它不增加细胞因子水平，诸如TNF-α或IFN-α水平。

在一些实施方案中，OCA2蛋白调节剂可以是核酸分子、适体、肽、拟肽、免疫剂、小分子、蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）、聚糖以及它们的任何组合中的至少一者。

在一些实施方案中，眼睛颜色被修改成为蓝色、绿色、灰色、天蓝色、黄色、棕色、琥珀色、淡褐色、黑色、紫色、红色或可见光谱的任何颜色。

在一些实施方案中，OCA2蛋白调节剂可以是核酸分子。如本文所用，术语“核酸”、“核酸序列”、“寡核苷酸”或“多核苷酸”与“核酸分子”是指核苷酸的聚合物，并且包括但不限于脱氧核糖核酸（DNA）、核糖核酸（RNA）、DNA/RNA杂交体（包括规则和/或不规则地交替含有脱氧核糖基部分和核糖基部分的多核苷酸链（即，其中交替的核苷酸单元在糖部分的2’位具有-OH，然后具有-H，然后具有-OH，然后具有-H，依此类推））、异源核酸（XNA）（例如PNA等），以及这些种类多核苷酸的修饰，其中包含在任何位置将各种实体或部分附着到核苷酸单元。这些术语还应当理解为包括由核苷酸类似物制成的RNA或DNA的类似物作为等价物，以及适用于所述实施方案的单链（诸如有义或反义）和双链多核苷酸。核酸的制备是本领域熟知的。

在一些实施方案中，OCA2蛋白调节剂可以是PROTAC。如本文所用，PROTAC通常设计为三部分：(1)结合到和/或调节泛素连接酶的配体/分子；(2)靶向并募集感兴趣蛋白（例如OCA2）用于蛋白水解的结合部分；以及(3)将这两个分子连接在一起的连接子。因此，PROTAC通过让配体/分子结合到泛素连接酶来发挥作用，从而将感兴趣的靶蛋白募集到连接酶进行泛素化，并最终发生蛋白水解和降解。

然而，在文献中可以找到其他名称：例如，特异性和非遗传性IAP依赖性蛋白擦除剂（SNIPER）；降解剂；降解决定子模拟物；蛋白水解靶向肽（PROTAP）；蛋白降解探针（PDP）。PROTAC通过使连接酶和POI在空间上紧密接近并启动多聚泛素化过程，来劫持泛素E3连接酶的催化活性以介导蛋白酶体依赖性降解所选择的感兴趣蛋白（POI）。

在一些实施方案中，OCA2蛋白调节剂可以是适体。如本文所用，适体是一种短的单链DNA或RNA分子，通常长度在约20个至100个核苷酸范围内，能够以高亲和力和特异性与靶分子（例如OCA2蛋白）特异性结合。适体通常被称为“化学抗体”，因为它们能够识别并结合到特定靶标，诸如蛋白质、小分子，甚至整个细胞，其结合亲和力可与抗体相媲美，有时甚至超过抗体。对靶蛋白（例如OCA2）具有高亲和力和特异性的适体是采用SELEX（指数富集的配体系统进化技术）或类似过程筛选出来的。在SELEX期间，将包含海量随机序列核酸（DNA或RNA）的库暴露于靶蛋白，与蛋白紧密结合的序列被保留下来，而未结合的序列则被洗脱除去。

在一些实施方案中，OCA2蛋白调节剂可以是肽。在一些进一步的实施方案中，OCA2蛋白调节剂可以是拟肽。如本文所用，拟肽是一种模拟肽（短氨基酸链）的结构和/或功能的合成化合物，其被设计成与生物分子（诸如蛋白质，例如OCA2蛋白）相互作用。

在一些实施方案中，OCA2蛋白调节剂可以是免疫剂。如本文所用，免疫剂通常是指被设计成与感兴趣蛋白（即，源自免疫系统的OCA2蛋白）直接或间接相互作用的分子。这些免疫剂可以包括但不限于抗体、抗体衍生物、纳米抗体等。

在一些实施方案中，OCA2蛋白调节剂可以是小分子。如本文所用，小分子是指具有相对低分子量的化学化合物，其被设计成与特定蛋白质靶标（即OCA2蛋白）特异性相互作用。当这些小分子与蛋白质结合时，通常被称为“配体”。

在一些实施方案中，所述至少一种OCA2调节剂是适用于调节OCA2的表达和/或活性和/或稳定性的至少一种基因编辑剂。

如本文所用，基因编辑剂能够通过各种机制调节OCA2的表达和/或活性。例如，基因编辑剂可以通过染色体DNA的遗传修饰来调节OCA2的表达和/或活性，这可能产生敲低细胞、生物体等。此外，基因编辑剂可以通过瞬时/临时修饰（瞬时敲低）来调节OCA2的表达和/或活性。

根据本发明的组合物和方法的基因编辑剂在一些实施方案中可以是天然存在的化合物（诸如酶、短DNA或RNA寡核苷酸）、合成化合物或人工化合物。在一些实施方案中，至少一种基因编辑剂可以是寡核苷酸。此类寡核苷酸可以结合到活性基因或其任何转录本，并且通过例如以下方式导致表达降低：阻断转录（例如在反义寡核苷酸（ASO）结合基因的情况下）、降解mRNA转录本（例如通过小干扰RNA（siRNA）或RNase-H依赖性反义），或者通过阻断mRNA翻译、pre-mRNA剪接位点或用于其他功能性RNA（包括miRNA）成熟的核酸酶切割位点（例如通过吗啉代寡聚物或其他RNase-H非依赖性反义寡核苷酸）。

在一些实施方案中，所述OCA2调节剂可以是基因编辑剂，诸如成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas系统剂、转录激活因子样效应子核酸酶（TALEN）剂或锌指核酸酶（ZFN）剂中的任何一种。

在一些实施方案中，OCA2调节剂可以是成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas系统剂。如本文所用，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统是一种经过修饰用于基因组工程的细菌免疫系统。

CRISPR-Cas系统分为两类。1类系统使用多个Cas蛋白的复合物来降解外源核酸。2类系统使用单一大Cas蛋白用于相同目的。更具体地，1类可分为类型I、III和IV，并且2类可分为类型II、V和VI。

CRISPR-Cas系统在原核生物中进化，通过靶向外源DNA或RNA来保护免受噬菌体攻击和不期望的质粒复制。CRISPR-Cas系统基于短的同源DNA序列（称为存在于重复序列之间的间隔子）来靶向DNA分子。这些间隔子将CRISPR相关（Cas）蛋白指导至靶DNA（例如外源DNA）内匹配（和/或互补）的序列，称为原型间隔子，随后这些序列被切割。可以合理设计间隔子以靶向任何靶DNA序列，例如，OCA2基因序列内的序列。因此，在另一些具体实施方案中，用于本发明方法和组合物中的至少一个cas基因可以是II型CRISPR系统的至少一个cas基因。如本文所用，II型CRISPR系统需要包含两个基本组分：“指导”RNA（gRNA）和非特异性CRISPR相关核酸内切酶（Cas9）。gRNA是短的合成RNA，由Cas9结合所必需的“支架”序列（也称为tracrRNA）和约20个核苷酸长的“间隔子”或“靶向”序列组成，其定义了要修饰的基因组靶标。如本文所用，指导RNA（gRNA）是指内源性tracrRNA与靶向序列（也称为crRNA）的合成融合体，其为Cas9核酸酶提供支架/结合能力，还提供靶向特异性。

在一些实施方案中，OCA2调节剂可以是TALEN剂。如本文所用，TALEN是可以经工程化改造成切割特定DNA序列的限制性内切酶。它们通过将TAL效应子DNA结合结构域与核酸酶的DNA切割结构域融合而制成。更具体地，TALEN是通过将从TAL（转录激活因子样）效应子（TALE）蛋白获得的DNA结合结构域（每个由约34个氨基酸组成的几乎相同重复序列的倍数）与FokI核酸内切酶的切割结构域融合而设计的人工核酸内切酶。每个TALE重复序列通过两个可变残基[称为重复可变双残基（RVD）]独立识别其相应的核苷酸（nt）碱基，使得重复序列线性表示结合位点的核苷酸序列。

在一些实施方案中，OCA2调节剂可以是ZFN剂。ZFN是通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域融合而产生的人工限制性内切酶。锌指结构域可以经工程化改造成靶向特定的所需DNA序列，这使得锌指核酸酶能够靶向复杂基因组内的独特序列。更具体地，ZFN是通过将小的锌指（ZF；约30个氨基酸）DNA结合/识别结构域（Cys₂His₂）与来自FokI限制性内切酶的IIS型非特异性DNA切割结构域组合而产生的人工核酸内切酶。然而，FokI内切核酸酶的切割活性需要二聚化。由于ZF模块识别3bp序列，因此每个ZFN单体中需要多个指结构来识别和结合到更长的DNA靶序列。

在一些实施方案中，所述至少一种OCA2调节剂包含至少一种核酸分子。

在一些实施方案中，所述核酸分子包含至少一种如SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200所表示的核酸序列。

在一些具体实施方案中，所述核酸分子包含单链RNA（ssRNA）、单链DNA（ssDNA）、双链DNA（dsDNA）、双链RNA（dsRNA）、具有至少一个经修饰核苷酸的核酸分子以及它们的任何组合中的至少一者。

在一些更具体的实施方案中，所述核酸分子包含小干扰RNA（siRNA）、反义寡核苷酸（ASO）、指导RNA、短发夹RNA（shRNA）、微RNA（miRNA）、肽核酸（PNA）和锁核酸（LNA）中的至少一者。

在一些实施方案中，本发明的OCA2调节剂经由RNA沉默起作用。如本文所用，短语“RNA沉默”是指一组调控机制，例如RNA干扰（RNAi）、转录基因沉默（TGS）、转录后基因沉默（PTGS）、压制、共抑制，以及由RNA分子介导的翻译抑制，这些机制导致相应蛋白质编码基因或RNA序列的表达被抑制或“沉默”。在某些实施方案中，RNA沉默剂能够通过转录后沉默机制阻止mRNA分子的完全加工（例如，完全翻译和/或表达）。RNA沉默剂包括非编码RNA分子，例如包含配对链的RNA双链体，以及可以从中产生此类小非编码RNA的前体RNA。示例性RNA沉默剂包括但不限于dsRNA，诸如siRNA、miRNA、shRNA、piwi相互作用RNA（piRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）、反义寡核苷酸（ASO）、核酶、DNA指导的RNA（ddRNA）、小激活RNA（saRNA）、CRISPR RNA（crRNA）和Dicer底物siRNA（dsiRNA）。在一些实施方案中，RNA沉默剂能够诱导RNA干扰。在其他实施方案中，RNA沉默剂能够介导翻译抑制。更具体地，根据本发明的核酸剂可以编码“反义RNA”，这是一种单链RNA（ssRNA）分子，与特定靶基因产物的mRNA链互补。反义RNA可以通过与互补mRNA碱基配对并物理阻碍翻译机制来抑制其翻译。所谓“互补”，意指多核苷酸彼此形成碱基对的能力。碱基对通常由反向平行多核苷酸链中核苷酸单元之间的氢键形成。互补的多核苷酸链能够以Watson-Crick方式（例如，A与T，A与U，C与G）或以任何其他允许双链体形成的方式进行碱基配对。

在另一些具体实施方案中，本公开的核酸调节剂可以编码一种RNA，特别是参与RNA干扰的dsRNA分子。如上文所指出，RNA干扰（RNAi）是一种通用的保守真核生物途径，以序列特异性方式下调基因表达。它是动植物中序列特异性转录后基因沉默的过程，由在其双链区与沉默基因序列同源的siRNA引发。基因沉默由部分或完全双链RNA（dsRNA）的存在诱导并维持。被沉默的基因可以是生物体内源的或外源的，可以整合到染色体中或存在于未整合到基因组中的转染载体中。靶OCA2基因的表达被完全或部分抑制。

更具体地，本公开所涵盖的dsRNA调节剂可以选自由小干扰RNA（siRNA）、微RNA（miRNA）、短发夹RNA（shRNA）、PIWI相互作用RNA（piRNA）组成的组。

在一些进一步的具体实施方案中，OCA2调节剂可以是包含至少一种siRNA分子的核酸分子。在一些实施方案中，siRNA分子靶向编码或者直接或间接控制OCA2的水平和/或活性和/或稳定性的至少一个序列。

具体如本文所用，siRNA分子涉及一种包含两条链的分子：一条作为mRNA“指导”的反义链和一条不积极参与基因沉默的有义链。siRNA分子在组织中存留的持续时间取决于它们被核酸酶降解的程度。在一些实施方案中，siRNA可以用经修饰的糖磷酸骨架合成，这抑制了这些酶的活性，从而使siRNA分子能够在组织中存留更长的时间段。在一些具体实施方案中，siRNA包含平端。

在一些特定实施方案中，siRNA分子可以靶向OCA2转录本或mRNA中的至少一个区域。在一些具体实施方案中，siRNA分子可以靶向人OCA2转录本或mRNA中的至少一个区域。在一些实施方案中，所述人OCA2转录本或mRNA可以包含如65所表示的核酸分子。在一些实施方案中，siRNA分子可以靶向位于OCA2 mRNA转录本中375-420、1270-1370、1500-1600、1900-2400或2610-3143处的核苷酸区域。本公开siRNA可以靶向的其他合适区域在下文实施例5中描述。

在一些实施方案中，siRNA分子可以包含至少一种如SEQ ID NO: 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199或200所表示的核酸序列。

在一些另选实施方案中，所述核酸分子包含至少一种ASO。在一些进一步的实施方案中，如本文所用，反义寡核苷酸（ASO）是单链的合成RNA（或DNA）序列，它们可以被高度修饰，并且被设计成经由互补碱基配对选择性结合到编码感兴趣基因的RNA。ASO与靶标的结合在与其互补靶标结合时可能触发一系列结果。这些结果的范围从改变mRNA加工到降解靶转录本。合成的ASO可以：结合到pre-mRNA中的互补序列，改变剪接因子向该分子的募集，从而调控剪接事件；结合到成熟mRNA并阻止其与核糖体附着，从而阻断蛋白质翻译；或可以募集RNase H至靶转录本，随后该转录本将被降解。

在一些特定实施方案中，核酸剂调节剂（例如ASO或siRNA）可以通过本领域已知的标准方法合成，如下文进一步讨论，例如，使用自动化DNA/RNA合成仪，诸如可商购自例如Biosearch、Applied Biosystems, Inc.等公司的产品。本发明的dsRNA化合物可以使用两步程序制备。首先，分别制备dsRNA化合物的各条链。然后，对构成线材进行退火。dsRNA化合物的各条链可以使用溶液相或固相有机合成或两者来制备。有机合成的优点是，可以容易地制备包含非天然或经修饰核苷酸的寡核苷酸链。

在一些进一步的实施方案中，本发明的单链寡核苷酸可以使用溶液相或固相有机合成或两者来制备。

上述实施方案可以包括核酸分子剂，诸如siRNA、ASO或其他类型的RNA干扰剂，由于本文提供的寡核苷酸序列的性质，它们具有至少一条长度至少为17个核苷酸的链。与该核酸分子剂相比，可以预期上述仅在一端或两端缺少少数几个核苷酸的较短双链体具有同等效力。换句话讲，包含源自本文所述序列，且长度至少为15、16、17、18、19、20或更多个连续核苷酸的序列的核酸分子剂，若其抑制OCA2基因表达的能力与包含完整序列的核酸分子剂相比差异不超过30%，则被视为在本发明的范围内。在一些具体实施方案中，核酸分子剂可以包含19个核苷酸。

在本发明中，核酸分子剂可以包含与靶序列的一个或多个错配。一个实施方案描述了包含不超过三个错配的核酸分子剂。如果RNA治疗剂的反义链包含与靶序列的错配，则优选该错配不位于互补区的中心。相反，该错配应位于互补区5′端或3′端的最后五个核苷酸内。使用本文所述的方法或本领域已知的方法，可以确定含有与靶序列的错配的RNA治疗剂是否能有效抑制OCA2基因的表达。如果已知OCA2基因中的特定互补区在人群中存在多态性序列变异，则考虑具有错配的RNA治疗剂在抑制OCA2表达方面的功效是相关的。

尽管表2中描述的一些序列是未修饰和/或未缀合的序列，但本发明的RNA治疗剂的RNA，例如dsRNA，可以包括表2中描述的这些序列中的任一种，这些序列未经修饰，或未缀合，或者已以不同于其中描述的方式进行了修饰和/或缀合。

在一个实施方案中，本发明使用未修饰并且不包含本领域技术人员已知或本文所述的化学修饰或缀合的核酸分子剂。本发明的另一个实施方案包括对核酸分子剂进行化学修饰，以提高稳定性或其他有益特性（抗核酸酶性、通过内吞作用增加摄取、增加组织滞留、增加内体逃逸速率、增大黑色素附近的核酸分子库、提高沉默效率、更合适的药代动力学特征、更好地分布到前房和/或虹膜、RISC对指导链的摄取等）。在本发明的某些实施方案中，核酸分子试剂的基本上所有核苷酸都被修饰。例如，有义链的几乎所有核苷酸都是经修饰核苷酸，并且/或者反义链的几乎所有核苷酸都是经修饰核苷酸，并且/或者有义链和反义链两者的几乎所有核苷酸都是经修饰核苷酸。

在本发明的另一个实施方案中，核酸分子试剂的所有核苷酸都被修饰。在这种情况下，有义链的所有核苷酸都是经修饰核苷酸，并且/或者反义链的所有核苷酸都是经修饰核苷酸，并且/或者有义链和反义链两者的所有核苷酸都是经修饰核苷酸。

本发明的核酸分子试剂能够根据已知方法合成和/或修饰。这包括，例如，末端修饰，诸如5′-端修饰（磷酸化、缀合、反向连接）或3′-端修饰（缀合、DNA核苷酸、反向连接等）。碱基修饰，例如，用稳定碱基、去稳定碱基、与更多配对伙伴进行碱基配对的碱基进行替换，或移除碱基（无碱基核苷酸）。此外，还可采用糖修饰（诸如在2′或4′位进行修饰，例如2'-O-甲基（2'-OMe）、2'-氟（2'-F）、锁核酸（LNA）、5-甲基胞苷（5mC）、解锁核酸（UNA）、2'-O-(2-甲氧基乙基)（2'-MOE））或糖置换，以及对骨架的修饰，诸如修饰或置换磷酸二酯键。

可用于本文所述实施方案的核酸分子化合物的示例包括但不限于包含经修饰骨架的核酸分子或缺乏天然核苷间连接键的核酸分子。在具有经修饰骨架的核酸分子中，有一些缺乏磷原子。如本领域所提及，出于本说明书的目的，在其核苷间骨架中没有磷原子的经修饰核酸分子也可以被视为寡核苷。在一些实施方案中，经修饰核酸分子可以在其核苷间骨架中包含磷原子。

经修饰核酸分子骨架包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯（诸如3′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯）、次膦酸酯、磷酰胺酯（包括3′-氨基磷酰胺酯）。以及氨基烷基磷酰胺酯、硫代磷酰胺酯、硫代烷基膦酸酯、硫代烷基磷酸三酯和具有正常3′-5′连接键的硼烷磷酸酯、这些的2′-5′-连接类似物，以及具有反向极性的那些，其中相邻的核苷单元对以3′-5′连接到5′-3′或2′-5′连接到5′-2′的方式连接。还涵盖各种盐、混合盐和游离酸形式。

在本发明的其他实施方案中，合适的RNA模拟物可以用于产生RNA干扰。在这些实施方案中，核苷酸单元的糖和核苷间连接键（即骨架）均被新型基团替代。维持碱基单元用于与适当的核酸靶化合物杂交。根据本公开的一些实施方案，可以用作OCA2调节剂的肽核酸（PNA）是一种具有寡聚结构的RNA模拟化合物，其具有优异的杂交特性。PNA不是由磷酸二酯连接键组成，而是由肽键组成，其核碱基直接附着到N-甲基甘氨酸骨架上。其特性使PNA更稳定且不易降解，从而使其成为RNA干扰的有效方法。核碱基被保留并且直接或间接键合到骨架酰胺部分中的氮杂氮原子上。PNA化合物的制备是本领域已知的。还有其他适用于本发明iRNA的PNA化合物，例如，Nielsen等人，Science, 1991, 254, 1497-1500。

在另一个实施方案中，至少一种调节剂靶向OCA2转录本中的至少一个区域。

在又一个实施方案中，至少一种调节剂靶向OCA2基因中的至少一个区域。

在一些附加实施方案中，至少一种调节剂靶向OCA2基因或OCA2转录本的多个区域，例如2个至10个区域之间，例如2个至9个区域之间，例如2个至8个区域之间，例如2个至7个区域之间，例如2个至6个区域之间，例如2个至5个区域之间，或例如2个至4个区域之间。

在某个实施方案中，至少一种调节剂靶向OCA2转录本中易受RNA诱导沉默复合物（RISC）介导切割的至少一个区域。

在又一个实施方案中，至少一种调节剂通过阻断核糖体接近转录本（mRNA）来抑制翻译，从而靶向OCA2转录本中的至少一个区域。

在其他一些实施方案中，至少一种调节剂靶向OCA2转录本中易受RNA诱导沉默复合物（RISC）介导切割的至少一个区域，这可能包括RISC的Argonaute蛋白和外切核糖核酸酶Xrn1对转录本（mRNA）的降解。

在一些进一步的实施方案中，至少一种调节剂经由RNase H介导的切割靶向OCA2转录本中的至少一个区域。在某个具体实施方案中，其中至少一种调节剂是ASO，它可以与mRNA靶标形成双链体，从而募集RNase H酶来切割mRNA。

在一些进一步的实施方案中，至少一种调节剂经由空间位阻靶向OCA2转录本中的至少一个区域。在某个具体实施方案中，其中至少一种调节剂是ASO，它可以结合到mRNA并阻断核糖体的接近，从而阻止翻译。

在一些进一步的实施方案中，至少一种调节剂经由剪接调控靶向OCA2转录本中的至少一个区域。在某个具体实施方案中，其中至少一种调节剂是ASO，它可以改变pre-mRNA的剪接，导致特定外显子在最终mRNA中被排除或包含。

在一些进一步的实施方案中，至少一种调节剂经由激活无义介导的衰变靶向OCA2转录本中的至少一个区域。在某个具体实施方案中，其中至少一种调节剂是ASO，它可以靶向具有提前终止密码子（PTC）的mRNA，从而触发无义介导的衰变并导致mRNA降解。

在一些实施方案中，所述调节剂可以增加OCA2的表达和/或活性和/或稳定性。根据本公开的一些实施方案，OCA2调节剂可以增加OCA2的表达和/或活性（例如，在受试者细胞、组织、眼的前房或眼的任何其他分区中），增加至少约5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%，或者至少约99%或更多。

在某些实施方案中，所述OCA2调节剂影响所述受试者虹膜组织中的黑色素水平。在一些实施方案中，所述OCA2调节剂影响真黑素的水平。在其他一些实施方案中，所述OCA2调节剂影响褐黑素的水平。在其他一些实施方案中，所述OCA2调节剂影响黑素体的平均成熟度。

在一些实施方案中，所述调节剂抑制和/或降低OCA2的表达和/或活性和/或稳定性。因此，根据本公开的一些实施方案，OCA2调节剂可以减少/抑制OCA2的表达和/或活性（例如，在受试者细胞（例如虹膜基质细胞）、组织、眼的前房或眼的任何其他分区中），减少/抑制至少约5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%，或者至少约99%或更多。

应当理解，在提供百分比值的情况下，诸如，例如10%、50%、120%、500%等，可与“倍数变化”值互换，即分别为0.1、0.5、1.2、5等。

如上文提及的减少/抑制或增加可以通过与对照水平相比，与OCA2的表达和/或活性和/或稳定性相关联的一个或多个变量的绝对或相对水平的降低或增加来评估。对照水平可以是本领域使用的任何类型的对照，例如，给药前基线水平，或者从未经处理或用对照物（诸如，例如仅缓冲液对照或无活性剂对照）处理的类似受试者、细胞、细胞组或样品确定的水平，具体地，任何细胞（例如虹膜基质细胞）中未暴露于或接触本公开的OCA2调节剂的水平。

表达的降低可以使用本领域当前可用的任何方法进行评估。为了确定OCA2表达的降低，例如，可以使用本领域普通技术人员常用的方法（诸如Northern印迹和qRT-PCR）来量化该蛋白的mRNA表达水平。此外，可以通过采用本领域普通技术人员常规的方法（包括但不限于Western印迹、免疫学技术）来测量OCA2（也称为P蛋白）的蛋白水平。另选地，可以通过分析抑制的下游表型效应（例如，黑素体成熟度、色素沉着密度和黑素体内的pH值）来评估是否发生了成功的抑制。

在某些实施方案中，所述抑制降低了所述受试者虹膜组织中的黑色素水平。如本文所用，“黑色素”是一种由称为黑素细胞的特殊细胞产生的天然色素。它在全身具有多种功能，包括防护紫外线辐射以及决定皮肤、头发和眼睛等组织的颜色。在眼睛中，黑色素在虹膜（眼睛的有色部分）中起着至关重要的作用。虹膜内黑色素的数量和分布造就了在个体中观察到的各种眼睛颜色。具体地，有两种主要类型的黑色素参与眼睛颜色形成：真黑素和褐黑素。真黑素负责较深的色素沉着，并且有助于眼睛呈现棕色和黑色色调。褐黑素与较浅的色素沉着相关联，并且有助于产生红色和黄色色调，常见于较浅色的眼睛，诸如蓝色或绿色眼睛。

在一些实施方案中，所述抑制降低真黑素的水平。在其他一些实施方案中，所述抑制降低褐黑素的水平。

根据本公开的一些实施方案，OCA2调节剂可以在受试者细胞（例如虹膜基质细胞）、组织、眼的前房或眼的任何其他分区中减少/抑制黑色素，特别是真黑素和/或褐黑素的水平，减少/抑制至少约5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%，或者至少约99%或更多。

在一些进一步的实施方案中，所述抑制降低黑素体的平均成熟度。如本文所用，“黑素体”是在黑素细胞（即，负责产生黑色素的细胞）内发现的特殊细胞器。这些细胞器对于黑色素在细胞内的合成、储存和运输及其最终向周围组织的转移至关重要。在眼睛中，黑色素的产生发生在位于虹膜黑素细胞内的黑素体中。这些黑素体根据遗传和环境因素产生真黑素或褐黑素。在这些黑素体内合成的黑色素的类型和数量决定虹膜的颜色。虹膜中的黑素体在大小、形状和分布上可能因个体而异，从而影响眼睛颜色的强度和色调。例如，眼睛颜色较深的个体通常具有更密集、更大且含有更高水平真黑素的黑素体，而眼睛颜色较浅的个体则具有更少、更小的黑素体，通常含有更多褐黑素。

在一些实施方案中，所述抑制将黑素体的平均成熟度降低至少约5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%，或者至少约99%或更多。

在一些具体实施方案中，所述抑制发生在虹膜基质中。

在一些进一步的具体实施方案中，所述OCA2调节剂降低OCA2的表达和/或活性和/或稳定性，所述降低导致所述受试者的眼睛颜色变浅。

在一些更具体的实施方案中，所述至少一种OCA2调节剂靶向所述受试者的虹膜基质。

如本文所用，虹膜基质是虹膜的结缔组织层，位于虹膜前层与后层之间。它由成纤维细胞、胶原纤维、血管和称为基质黑素细胞的色素细胞组成。虹膜基质赋予虹膜结构完整性，并且主要通过色素细胞的分布来贡献其颜色。在一些实施方案中，所述OCA2调节剂靶向所述受试者的虹膜基质黑素细胞。

在一些实施方案中，所述至少一种OCA2调节剂靶向色素上皮、葡萄膜、脉络膜、睫状体、视网膜色素上皮（RPE）和/或虹膜色素上皮（IPE）中至少一者的细胞。

在一些实施方案中，所述至少一种OCA2调节剂靶向色素上皮的细胞。如本文所用，色素上皮的细胞构成视网膜的色素层，位于神经视网膜与脉络膜之间。色素上皮有助于吸收多余的光线，从而防止光在眼内的反射和散射。这些细胞还在感光细胞中的视色素再生中起作用。

在一些实施方案中，所述至少一种OCA2调节剂靶向葡萄膜的细胞。葡萄膜是眼睛的中层，由虹膜、睫状体和脉络膜组成。葡萄膜的细胞包括黑色素细胞、成纤维细胞和血管系细胞。黑素细胞为虹膜和脉络膜提供色素沉着，有助于眼睛颜色和光吸收。成纤维细胞有助于葡萄膜的结构完整性。血管相关细胞包括内皮细胞和周皮细胞，这些细胞参与维持血管功能。

在一些实施方案中，所述至少一种OCA2调节剂靶向脉络膜的细胞。脉络膜是位于视网膜与巩膜（眼睛的白色外层）之间的血管层。脉络膜细胞包括黑色素细胞、成纤维细胞、内皮细胞和周细胞。黑素细胞为脉络膜提供色素沉着，有助于光吸收并且减少眼内散射。内皮细胞和周皮细胞参与调节脉络膜血管系统内的血流和营养交换。

在一些实施方案中，所述至少一种OCA2调节剂靶向睫状体（CB）的细胞。睫状体是位于虹膜后方的肌肉结构。睫状体的细胞包括上皮细胞、肌细胞和分泌细胞。上皮细胞参与房水的产生，房水是一种滋养角膜和晶状体的液体。肌细胞控制晶状体的形状以实现调节（对不同距离的聚焦）。分泌细胞产生房水的组分并且调控其分泌和流出。

在一些实施方案中，所述至少一种OCA2调节剂靶向视网膜色素上皮（RPE）的细胞。视网膜色素上皮是位于神经视网膜和脉络膜之间的单层细胞。RPE细胞为视网膜的光感受器细胞（视杆细胞和视锥细胞）提供代谢支持。它们吞噬脱落的光感受器外节并且再循环视觉色素。RPE细胞也有助于构成血-视网膜屏障，并且调控营养物质和废物产物在视网膜与脉络膜之间的运输。

在一些实施方案中，所述至少一种OCA2调节剂靶向虹膜色素上皮（IPE）的细胞。IPE是位于虹膜后表面、面向眼前房的一层色素细胞。这些细胞有助于虹膜的颜色，并且通过调控瞳孔大小来帮助控制进入眼睛的光量。IPE细胞也在房水（一种填充眼前房的液体）的产生和循环中发挥作用。

在一些实施方案中，所述至少一种调节剂穿透角膜并且/或者进入眼前房。

在一些实施方案中，所述至少一种调节剂逃避内体-溶酶体系统的破坏。

在一些实施方案中，所述至少一种调节剂不激活免疫系统。

在一些实施方案中，所述至少一种调节剂被包封在至少一种纳米载体内部或由至少一种纳米载体包被。

在一些实施方案中，所述至少一种OCA2蛋白调节剂包含至少一种核酸分子，或者任何包含其的载体或宿主细胞。

在一些进一步的实施方案中，本公开的方法可以还包括将所述受试者暴露于至少一种光源的步骤。在一些实施方案中，所述步骤可以加速眼睛颜色变浅。

在一些实施方案中，可以采用任何形式的光照暴露，诸如来自太阳、环境光源或治疗性灯光，以任何合适的时间间隔、任何合适的强度和/或任何合适的波长进行光照暴露，使得受试者虹膜组织中的黑色素水平降低。

可以包括额外的步骤，这些步骤可能加速黑色素分解并且/或者可能与抑制新黑色素产生相结合。

在一些进一步的实施方案中，本公开的方法可以还包括施用额外的用于抑制黑色素产生的药理剂的步骤。

在一些进一步的实施方案中，本公开的方法可以还包括要求所述受试者进行长时间的水禁食的步骤。

自噬可以促进蛋白质（包括黑素体中的蛋白质）的分解，从而导致细胞中黑素体和黑色素水平的降低。因此，在一些实施方案中，自噬可以被加速或增强。值得注意的是，诸如长时间水禁食等行为可能促进自噬，而遗传倾向也可能在其中发挥作用。可能通过基因修饰使受试者表现出增强的自噬，并采用这些经修饰的动物作为模型。在一些实施方案中，利用这些模型，或要求受试者经历长时间的水禁食，以实现所述效果。

在一些实施方案中，可以多次重复施用有效量的至少一种眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白调节剂，例如2次至100次并且/或者以不同的时间间隔，例如1天至约1周。

在一些实施方案中，可以重复施用有效量的至少一种眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白调节剂约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50次，或者约60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200次。

在另一些进一步的实施方案中，眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白调节剂或其任何组合物及其任何组分可以作为单次日剂量或多次日剂量施用，优选每1至60天或每1至365天施用一次。具体设想，这种施用可以每天进行一次、两次、三次、四次、五次或六次，或者可以每天一次、每2天一次、每3天一次、每4天一次、每5天一次、每6天一次、每周一次、两周一次、三周一次、四周一次、每月一次、每两个月一次或甚至几个月至一年一次地进行。本发明组合物或其任何组分的施用可以持续长达一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、四周、一个月、两个月、三个月或甚至更久，例如持续受试者的整个生命周期。

在一些实施方案中，由于所述受试者眼组织的色素再沉着，可能需要所述重复施用。

在一些实施方案中，所述至少一种OCA2调节剂经由眼部施用来施用。

在某些实施方案中，所述至少一种OCA2调节剂经由局部施用来施用。在一些实施方案中，所述局部施用是施用到所述受试者的眼睛中。

在一些实施方案中，所述至少一种OCA2调节剂被包含在滴眼剂制剂中。

在一些另选实施方案中，将所述至少一种OCA2调节剂施用到眼前房中。

在一些实施方案中，本公开的方法用于美容目的。

在一些实施方案中，受试者是健康的。

术语“健康”是指未患病、未受伤或无疾病/病症的状态。在一些具体实施方案中，健康受试者是指不患有眼部病症的受试者。在一些具体实施方案中，健康受试者是指不患有癌症的受试者。在一些更具体的实施方案中，健康受试者是指不患有黑素细胞癌的受试者。

在一些实施方案中，本公开提供非治疗方法。在另一些进一步的实施方案中，本公开提供美容方法。

在一些另选实施方案中，受试者患有疾病。

在一些具体实施方案中，所述疾病可以是以下任何一种：色素沉着过度性眼部病症；色素沉着过度；青光眼药物引起的副作用；获得性异色症（例如，由于霍纳综合征或Fuchs异色性虹膜睫状体炎）和先天性异色症（例如，由于诸如瓦登伯革综合征等遗传综合征）；双侧弥漫性葡萄膜黑素细胞增生（BDUMP）；眼痣（例如，脉络膜痣）；色素分散综合征；眼黑素瘤；肤色相关性黑变病；原发性获得性黑变病；雀斑；Lisch结节；黑素细胞瘤；眼/眼皮肤黑变病（例如，太田痣）；和良性眼部增生或任何色素性眼部病症，以及在眼中呈现但由于全身性病变（诸如艾迪生病）引起的色素性病症。

又一方面，本公开提供了至少一种眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白调节剂，或者其任何媒介物、基质、纳米颗粒或微米颗粒，或者包含其的任何组合物，用于修改受试者眼睛颜色的方法中，该方法包括向所述受试者施用有效量的所述至少一种OCA2蛋白调节剂。

应当指出的是，上文定义的关于修改眼睛颜色方面的方法的所有先前描述的实施方案同样适用于本公开第二方面中涉及的、根据本公开使用的OCA2调节剂，也适用于本公开的任何方面。

第三方面，本公开提供了一种用于修改受试者眼睛颜色的组合物，该组合物包含至少一种眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白调节剂。任选地，本公开的组合物可以还包含任何载体稀释剂和任何合适的赋形剂。

在一些实施方案中，所述调节剂是适用于调节OCA2的表达和/或活性和/或稳定性的至少一种基因编辑剂。

在一些实施方案中，所述至少一种调节剂包含至少一种核酸分子。

在一些实施方案中，所述核酸分子包含单链DNA（ssDNA）、单链RNA（ssRNA）、双链DNA（dsDNA）、双链RNA（dsRNA）、具有至少一个经修饰核苷酸的核酸分子以及它们的任何组合中的至少一者。

在一些具体的实施方案中，所述核酸分子包含小干扰RNA（siRNA）、反义寡核苷酸（ASO）、指导RNA、短发夹RNA（shRNA）、微RNA（miRNA）、肽核酸（PNA）和锁核酸（LNA）中的至少一者。

在另一些更具体的实施方案中，所述核酸分子包含至少一种siRNA分子，其中所述siRNA分子靶向编码或者直接或间接控制OCA2的水平和/或活性和/或稳定性的至少一个序列。在一些另选实施方案中，所述核酸分子包含至少一种ASO。在某些实施方案中，至少一种OCA2调节剂靶向OCA2转录本中的至少一个区域。

在其他实施方案中，至少一种调节剂靶向OCA2基因中的至少一个区域。

在某些具体的实施方案中，至少一种调节剂靶向OCA2转录本中易受RNA诱导沉默复合物（RISC）介导切割的至少一个区域。

在某些实施方案中，所述OCA2调节剂抑制和/或降低OCA2的表达和/或活性和/或稳定性。

在一些实施方案中，所述抑制降低所述受试者虹膜组织中的黑色素水平。

在一些具体的实施方案中，所述抑制降低黑素体的平均成熟度。在一些进一步的具体实施方案中，所述抑制降低虹膜基质中黑素体的平均成熟度。

在一些实施方案中，所述OCA2调节剂降低OCA2的表达和/或活性和/或稳定性，所述降低导致所述受试者的眼睛颜色变浅。

在一些具体的实施方案中，所述至少一种OCA2调节剂靶向所述受试者的虹膜基质。

在一些进一步的实施方案中，所述至少一种OCA2调节剂靶向所述受试者的基质黑素细胞。

在其他一些实施方案中，所述至少一种调节剂能够靶向色素上皮、葡萄膜、脉络膜、睫状体、视网膜色素上皮（RPE）和/或虹膜色素上皮（IPE）中至少一者的细胞。

在一些实施方案中，所述至少一种调节剂穿透角膜并且进入眼前房。

在一些实施方案中，所述至少一种调节剂不激活免疫系统。

本发明的一个实施方案包括施用核酸分子剂，例如基于RNA的作用剂，以其“裸露”形式或作为“游离RNA”，例如“游离siRNA”。裸露核酸分子剂不包括任何药物组分。可以使用适当的缓冲溶液来容纳裸露核酸分子剂，例如基于RNA的作用剂。缓冲溶液可以由乙酸盐、柠檬酸盐、醇溶谷蛋白、碳酸盐或磷酸盐，或者这些物质（或任何其他药学上可接受的载体）的组合组成。在一个实施方案中，缓冲溶液是磷酸盐缓冲盐水（PBS）。可以调节含有核酸分子剂（例如基于RNA的作用剂）的缓冲溶液的pH值和渗透压，使其适用于向受试者施用。缓冲剂的益处是其在溶液中保持相对恒定的pH的能力。即使在添加大量的酸或碱时，缓冲液仍能有效稳定核酸分子剂（例如基于RNA的作用剂）并维持其活性。此外，缓冲剂是无毒的并且不会不利地影响生物系统。因此，通常认为其是生物相容的。该缓冲液也适用于大规模生产。

另选地，其他实施方案包括经由药物递送系统来递送该分子。该递送系统可以能够促进药物穿过生理和解剖屏障（如泪膜和角膜层）或穿过巩膜-结膜途径、改善其在组织内的稳定性（降低核酸分子剂（例如基于RNA的作用剂）被核酸酶降解的可能性）、改善细胞（主要是虹膜基质黑素细胞）对该作用剂的摄取，并且提高内体逃逸事件的速率。

通过修饰核酸分子剂（例如基于RNA的作用剂）或使用药物递送系统加以递送，防止该核酸分子剂在体内被内切核酸酶和外切核酸酶快速降解。对核酸分子或药物载体的修饰也可以促进RNA治疗剂组合物靶向靶组织、增加指导链加载到RISC中的可能性、改善向靶组织的生物分布、增加对RNase的稳定性并且防止不需要的脱靶效应。在一种另选实施方案中，OCA2调节剂（例如核酸分子剂）可以经由载体（例如纳米颗粒，例如树枝状聚合物、聚合物、脂质体和LNP（例如阳离子纳米颗粒或可电离脂质纳米颗粒））递送。

例如，就基于RNA的作用剂而言，RNA分子（带负电荷）可以附着到带正电荷的阳离子递送系统，从而促进结合并且增强在带负电荷的细胞膜处的相互作用，导致被细胞有效摄取。RNA分子可以结合到阳离子脂质、树枝状聚合物或聚合物，或者包裹在囊泡或胶束内（参见例如，Kim S H.等人，(2008) Journal of Controlled Release 129(2):107-116）。此外，囊泡或胶束的形成防止RNA分子的降解。本领域技术人员完全有能力制备和施用阳离子-iRNA复合物（参见例如，Sorensen, D R.等人，(2003) J. Mol. Biol 327:761-766；Verma, U N.等人，(2003) Clin. Cancer Res. 9:1291-1300；Arnold, A S等人，(2007)J. Hypertens.25:197-205，据此全文以引用方式并入）。

由于带电的LNP在静脉注射后从循环中被快速清除，因此开发了pKa值低于7的可电离阳离子脂质（参见例如，Rosin等人，Molecular Therapy，第19卷，第12期，第1286-2200页，2011年12月）。当可电离脂质显示正电荷时，可以在低pH值（例如pH 4）处将带负电荷的分子（诸如siRNA和寡核苷酸）加载到LNP中。在生理pH值处，LNP具有较低的表面电荷，使其能够循环更长的时间段，而不受免疫细胞的阻碍。

在某些实施方案中，所述至少一种OCA2调节剂被包封在至少一种纳米载体内部或由至少一种纳米载体包被。在一些实施方案中，所述纳米载体是至少一种脂质纳米颗粒（LNP）。如本文所用，脂质纳米颗粒（LNP）是由脂质和其他两亲性分子组成的胶体系统，这些分子自组装成纳米级结构。这些纳米颗粒通常用作各种生物活性分子（诸如药物、遗传材料（如mRNA或DNA）和成像剂）的递送系统。

在一些进一步的具体实施方案中，所述至少一种LNP包含可电离脂质纳米颗粒。

可以包含在脂质纳米载体内的物质包括可电离脂质、结构脂质、稳定脂质、结构化脂质、阳离子脂质，以及可以降低免疫原性的脂质。所有这些组分都有助于脂质纳米载体的整体功能，并且可以进行优化以增强其作为药物递送系统的性能和有效性。

除了控制脂质纳米载体的电荷和稳定性之外，可电离脂质组分可以促进靶细胞对纳米载体的摄取，并且通过改变内体膜双层构象为六方相来协助逃离内体-溶酶体系统。因此，活性成分，例如基于RNA的分子或RNAi（或另选地，基于DNA的分子）能够逃逸以避免被破坏并到达细胞质，在那里它能够对其靶mRNA发挥作用（参见例如，Schlich等人，Bioengineering&Translational Medicine，2021年3月20日；6(2):e10213）。

在生理环境（pH 7.4）中，可电离脂质是中性的，而在酸性环境（诸如逐渐酸化的内体环境）中，它们则带电荷。作为生理环境（诸如血液）中的中性分子，由于其中性分子结构，它们被免疫系统隔离的可能性较小。此外，随着内体成熟开始并且环境变得更酸性，可电离脂质的头部变为带正电并且开始与暴露在内体膜处的带负电脂质结合。这种结合扰乱内体膜原有的组织，导致非双层、六方（HII）结构的形成，引起膜融合与内体破裂，从而使包裹的核酸得以逃逸。

许多可电离阳离子脂质已被研究，包括1,2-二亚油酰-3-二甲基铵-丙烷（DLinDAP）、1,2-二亚油酰氧基-3-N,N-二甲基氨基丙烷（DLinDMA）、1,2-二亚油酰氧基-酮-N,N-二甲基-3-氨基丙烷（DLinKDMA）、1,2-二亚油酰-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧戊环（DLinKC2-DMA）和4-(二甲基氨基)-丁酸、(10Z,13Z)-1-(9Z,12Z)-9,12-十八碳二烯-1-基-10,13-十九碳二烯-1-基酯（DLin-MC3-DMA）。研究已表明，含有这些脂质的LNP siRNA系统表现出显著更好的基因沉默特性。

结构脂质提供了脂质纳米载体的基本结构和形状。一般来讲，它们由脂质的混合物组成，诸如胆固醇、甾醇和类固醇。这些组分一起形成明确且稳定的结构。

稳定脂质纳米载体的脂质防止其在储存或循环期间发生聚集和失稳。稳定脂质有多种类型，包括两性离子脂质和磷脂（例如，磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺等）。此处给出的示例并非旨在穷举。

用于降低免疫原性的纳米颗粒被设计成防止免疫系统对脂质纳米载体产生反应，从而提高药物递送系统的安全性和有效性。这些示例中包括含有免疫抑制部分的脂质、聚合物化合物和聚合物-脂质复合物，以及具有聚乙二醇（PEG）区域的聚乙二醇化脂质。PEG区可以使用任何分子量。根据该实施方案，PEG区域的分子量可以为200、300、350、400、500、550、750、1000、1500、2000、3000、3500、4000或5000Da。

在一些情况下，可以添加额外的脂质组分以便增强本发明的OCA2调节剂的递送。诸如该脂质组分的组分可能能够减少药物的副作用或增加其有效性。其中包括靶向部分、阳离子脂质等。

这些组分可以增强组织特异性并且促进药物在指定作用部位的积累，脂质纳米载体可以用特定的靶向部分进行精细修饰。类似于利用GalNAc进行靶向肝脏递送，可以利用其他对眼部环境中基质黑素细胞独特表达的标记物表现出高亲和力的缀合物来实现精确的眼部靶向。这种策略性修饰有助于将治疗剂定向递送到虹膜，从而可能放大治疗功效，同时减少系统分布和相关不良反应。通过体外和计算机上的迭代实验和优化过程，可以精细定制靶向部分和脂质成分的选择和比例，以满足眼部递送的严格需求，从而确保在靶向虹膜基质黑素细胞方面具有增强的特异性和功效。通过湿实验室和计算机模拟实验中的试错，可以定制和优化脂质的选择和脂质的比例。

本发明的一个实施方案包括使用包封在脂质制剂中的OCA2调节核酸剂来形成核酸-脂质颗粒。本发明的颗粒基本上是无毒的。核酸-脂质颗粒及其制备方法在本领域中有充分描述。

在一个实施方案中，脂质与药物的比例（质量/质量比例）（例如，脂质与dsRNA的比例）为约1:1至约50:1。

在一些实施方案中，对本发明的组合物和方法的OCA2调节剂的另一种修饰涉及将作用剂或递送系统（即纳米颗粒包膜）化学连接到一个或多个配体、部分或缀合物，该配体、部分或缀合物增强作用剂的活性、细胞分布或细胞摄取，以及将其锚定到靶细胞。

根据该实施方案，配体可以改变与其缀合的作用剂的分布、靶向或寿命。作为一个实施方案的示例，配体对特定靶标（例如，分子、细胞或细胞类型、区室、组织、器官或身体区域）提供增强的亲和力，这与缺乏这种配体的化合物相反。在一些实施方案中，在双链核酸的情况下，配体将不参与双链配对。

配体的示例可以是细胞或组织靶向剂，诸如抗体、凝集素、糖蛋白、脂质或含脂质的分子。这些靶向基团结合到特定类型的细胞。此外，配体可以是增强作用剂摄入靶细胞的物质，诸如药物。

在优选实施方案中，靶向配体可以结合到虹膜黑素细胞表面上发现的受体，诸如SCF受体、WNT受体、EGFR受体、儿茶酚胺受体、组胺受体、前列腺素受体，或任何其他将作用剂导向受试者虹膜黑素细胞的配体。

配体可以是蛋白质（例如糖蛋白）或肽（例如与共配体结合的分子），或抗体（例如结合到特定细胞类型（诸如黑素细胞）的抗体）。激素和激素受体也可用作配体。此外，它们也可以包括非肽种类，包括脂质（诸如胆固醇）、凝集素、碳水化合物、维生素（诸如维生素E）、辅因子、多价乳糖、氨基酸（诸如酪氨酸）等。

根据该实施方案，附着到作用剂的配体可以起到药代动力学调节剂（PK调节剂）的功能。PK调节剂有多种类型，包括亲脂物、胆汁酸、类固醇、磷脂类似物、肽、蛋白结合剂、PEG、维生素等。PK调节剂的示例包括胆固醇、脂肪酸、胆酸、石胆酸、二烷基甘油酯、二酰基甘油酯、磷脂、鞘脂、萘普生、布洛芬、维生素E、生物素等。

研究表明，含有多个硫代磷酸酯连接键的寡核苷酸结合血清蛋白，因此，在其骨架中含有多个硫代磷酸酯连接键的较短寡核苷酸（例如，约五个、十个、十五个或二十个碱基的寡核苷酸）也可以用作配体（例如，作为PK调节配体）。此外，结合血清组分（例如血清蛋白）的适体也可以在本文描述的实施方案中用作PK调节配体。

本发明的配体缀合寡核苷酸可以使用带有悬垂反应性官能团的寡核苷酸（例如通过连接分子附着形成）进行合成。这些反应性寡核苷酸可以直接与可商购获得的配体、带有保护基团合成的配体或带有连接部分的配体相互作用。此外，点击化学和位点特异性缀合技术提供附着配体的替代性策略。在一些实施方案中，所述至少一种OCA2调节剂经由眼部施用来施用。

在一些具体的实施方案中，所述至少一种OCA2调节剂经由局部施用来施用。在一些更具体的实施方案中，所述局部施用是施用到所述受试者的眼睛中。

在某些实施方案中，所述至少一种OCA2调节剂被包含在滴眼剂制剂中。

在一些实施方案中，根据本公开的组合物用作化妆品组合物。

在一些实施方案中，所述药物组合物如本公开关于组合物的前述方面所定义。

本公开的药物组合物可以包括但不限于溶液、乳液和含有载体（例如纳米载体）的制剂。可以使用各种组分来创建这些组合物，包括但不限于预成型液体、自乳化固体和自乳化半固体。靶向虹膜黑素细胞的制剂是特别优选的。

可以根据制药行业熟知的常规方法，以单位剂型制备本发明的药物制剂。在此类技术中，活性成分与药物载体或赋形剂结合。通常通过将活性成分与液体载体或细碎固体载体或两者均匀且紧密地混合，然后必要时成型来制备制剂。

本发明的组合物能够配制成多种剂型中的任何一种，诸如水性、非水性或混合介质中的混悬液。水性混悬液的粘度也可以通过诸如羧甲基纤维素钠、山梨醇和/或葡聚糖等物质增加。稳定剂也可以包含在该混悬液中。

在一些实施方案中，可以根据良好的医疗实践，通过本发明的方法全身性（例如静脉内）施用和给药该OCA2调节剂或者根据本公开的任何组合物或包含其的具体药物组合物。然而应当指出的是，本公开可以进一步涵盖额外的施用模式。在其他示例中，作用剂或者其任何组合物或药物组合物可以通过任何合适的途径引入部位，包括但不限于眼内注射、眼前房内、鼻内、局部、口服、皮下、皮内、静脉内、肌肉内施用，以及它们的任何组合。在一些特定实施方案中，作用剂可以经由滴眼剂或滴眼剂制剂滴注进行局部施用。

如本文所用，滴眼剂，也称为眼用滴剂或眼用药物，是直接施用于眼睛的无菌溶液或混悬液，用于美容、治疗、诊断或预防目的。滴眼剂制剂可以根据期望的具体结果或所治疗的病变而有很大差异。常见的滴眼剂制剂类型包括无菌溶液、固体颗粒分散在液体媒介物中的混悬液、乳液（即含有水相和油相并通过乳化剂稳定的双相制剂）、具有半固体稠度以提供与眼部表面的延长接触时间的凝胶，以及眼用软膏（其为一种或多种活性药物成分（API）分散在凡士林基质中的半固体制剂）。

在一些实施方案中，OCA2调节剂或包含其的任何组合物可以经由巩膜-结膜途径或任何形式的施用（诸如结膜下、玻璃体内、眼前房内、视网膜下、全身性等）中发现的其他途径施用。

在其他一些实施方案中，OCA2调节剂或者其任何组合物和药物组合物的施用可以经由储库注射进行。储库注射可以在延长的时间段内以一致的方式释放作用剂。因此，储库注射可以降低获得期望效果（例如，抑制OCA2或组织增亮）所需的给药频率。储库注射可以是眼内注射、皮下注射或肌肉内注射。在特定实施方案中，储库注射是眼内注射。

在一些实施方案中，根据本公开的OCA2调节剂或者包含其的任何组合物或具体药物组合物可以经由局部施用来施用。对于局部施用，药物组合物和制剂可以包括透皮贴剂、软膏、洗剂、乳膏、凝胶、滴剂、栓剂、喷雾剂、液体和粉末。可能有必要或希望使用常规药物载体，例如水性、粉末状或油性基质、增稠剂等。合适的局部制剂包括含有与脂质、脂质体、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、螯合剂或表面活性剂组合的本发明所述OCA2调节剂的那些。合适的脂质和脂质体包括中性（例如，二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱DMPC、二硬脂酰磷脂酰胆碱）、阴性（例如，二肉豆蔻酰磷脂酰甘油DMPG）和阳离子（例如，二油酰四甲基氨基丙烷DOTAP和二油酰磷脂酰乙醇胺DOTMA）或可电离脂质。

在一些实施方案中，根据本公开的OCA2调节剂或者包含其的任何组合物或具体药物组合物可以配制成溶液（例如缓冲盐水溶液，诸如PBS）或凝胶，用于局部施用于眼睛，诸如例如以滴眼剂的形式。在此类实施方案中，这些制剂可以包括粘度调节剂、张力剂和润湿剂，以及防腐剂、缓冲剂和润滑剂。这些包括但不限于阳离子乳液以及/或者包含生物聚合物（诸如聚(丙交酯-共-乙交酯)、卡波姆、透明质酸和聚丙烯酸）的制剂。

在一些进一步的实施方案中，根据本公开的OCA2调节剂或者包含其的任何组合物或具体药物组合物可以经由控释药物递送装置（诸如隐形眼镜）施用。在一些实施方案中，它不会显著损害或干扰患者的视力。该隐形眼镜包含光学通路，佩戴者的视线通过该通路。另外，该隐形眼镜包含基本上连续的载药区，该区域包含至少一种将通过隐形眼镜在眼睛附近释放的药物。

在某些实施方案中，本公开的组合物或药物组合物可以包含有效量的本发明调节剂。仍在一些进一步的实施方案中，本发明的方法可以指代施用有效量的OCA2调节剂或者包含其的任何组合物或具体药物组合物。

术语“有效量”涉及组合物/药物组合物中存在的活性剂（具体而言是本发明如本文所述的OCA2调节剂）的量，该量是为在受试者（例如眼睛）的血液中或作用部位处提供期望水平的活性剂以在施用这种组合物时提供期望效果（即生理反应）所需的。精确的量将取决于众多因素，例如活性剂、组合物的活性、储存中的优化稳定性、安全性特征、监管机构的熟悉程度、所采用的递送装置、组合物的物理特性、预期的患者用途（即每天施用的剂量次数）、患者考虑因素等，并且本领域技术人员可以基于本文提供的信息容易地确定。本发明OCA2调节剂的“有效量”可以通过一次施用或通过总计为有效量的多次施用给予。可使用标准临床程序来确定适当的施用量和定时。应当理解，“有效量”可为进行治疗的卫生保健专业人员和/或个人的经验和/或个体化（逐案）确定的结果。活性剂可以配制成立即起效，或者可以配制成持续释放。

在某些实施方案中，OCA2调节剂或者其任何组合物和药物组合物作为固定剂量施用于受试者。“固定剂量”（例如，以mg计的剂量）意味着无论任何特定的受试者相关因素（诸如年龄/体重）如何，对所有受试者使用一种剂量的作用剂。在其他实施方案中，本发明的作用剂作为基于体重的剂量施用于受试者。“基于体重的剂量”（例如，以mg/kg计的剂量）是RNA治疗剂的剂量，该剂量将根据受试者的体重而变化。

在一些实施方案中，所述药物组合物用于修改受试者眼睛颜色的方法中，该方法包括向所述受试者施用有效量的至少一种眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白调节剂，或者其任何媒介物、基质、纳米颗粒或微米颗粒，或者包含其的任何组合物。

在一些进一步的实施方案中，所述药物组合物用于治疗有需要的受试者的疾病/病症的方法中，该方法包括向所述受试者施用有效量的至少一种眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白调节剂，或者其任何媒介物、基质、纳米颗粒或微米颗粒，或者包含其的任何组合物。

在一些实施方案中，所述核酸分子包含小干扰RNA（siRNA）、反义寡核苷酸（ASO）、指导RNA、短发夹RNA（shRNA）、微RNA（miRNA）、肽核酸（PNA）和锁核酸（LNA）中的至少一者。

在一些具体的实施方案中，所述核酸分子包含至少一种siRNA分子，其中所述siRNA分子靶向编码或者直接或间接控制OCA2的水平和/或活性和/或稳定性的至少一个序列。

在另一些另选实施方案中，所述核酸分子包含至少一种ASO。

在一些实施方案中，所述核酸分子靶向OCA2转录本中的至少一个区域。

在另一个实施方案中，所述核酸分子靶向OCA2基因中的至少一个区域。

在某些实施方案中，核酸分子靶向OCA2转录本中易受RNA诱导沉默复合物（RISC）介导切割的至少一个区域。

在一些实施方案中，核酸分子抑制和/或降低OCA2的表达和/或活性和/或稳定性。

在一些具体的实施方案中，所述抑制降低黑素体的平均成熟度。在一些更具体的实施方案中，所述抑制降低虹膜基质中黑素体的平均成熟度。

在一些实施方案中，核酸分子降低OCA2的表达和/或活性和/或稳定性，所述降低导致所述受试者的眼睛颜色变浅。

在一些实施方案中，核酸分子靶向虹膜基质并且/或者在具体实施方案中，其靶向虹膜基质黑素细胞。

在一些实施方案中，核酸分子靶向色素上皮、葡萄膜、脉络膜、睫状体、视网膜色素上皮（RPE）和/或虹膜色素上皮（IPE）中至少一者的细胞。

在一些实施方案中，核酸分子穿透角膜并进入眼睛的前房。

在一些实施方案中，核酸分子逃避内溶酶体系统的破坏。

在一些实施方案中，核酸分子不活化免疫系统。

在一些实施方案中，所述核酸分子被包封在至少一种纳米载体内部或由至少一种纳米载体包被。

在某些实施方案中，核酸分子用作化妆品组合物。

又一方面，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的疾病/病症的方法，包括向所述受试者施用有效量的至少一种眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白调节剂，或者其任何媒介物、基质、纳米颗粒或微米颗粒，或者包含其的任何组合物。

在一些实施方案中，所述疾病或病症是OCA2相关病症。如本文所用，“OCA2相关病症”涉及受到受试者中OCA2的表达和/或活性影响的任何病症/疾病。因此，OCA2相关病症可以是其治疗/预防/护理可能受益于OCA2调节（即增加或降低OCA2的表达和/或活性）的任何病症。“OCA2相关病症”也可以指代其治疗/预防/护理或相关副作用可能受益于OCA2调节的病症。其治疗/预防/护理或相关副作用可能受益于OCA2调节的病症的一个示例是青光眼，具体地是由青光眼药物引起的眼睛变色。其治疗/预防/护理或相关副作用可能受益于OCA2调节的病症的其他示例是色素性眼部病症和Fuchs异色性虹膜睫状体炎。

在一些实施方案中，所述疾病/病症是眼部病症。在一些实施方案中，所述眼部病症是异色症、霍纳综合征、色素沉着过度或眼部青光眼中的任何一种。

如本文所用，术语“色素性眼部病症”涉及一组以眼内或眼周异常色素沉着为特征的眼部病变。这些病症涉及色素物质在各种眼组织中的沉积、迁移或分布，其可能影响视力和眼睛健康。色素性眼部病症可以涉及眼的前段（前部）和后段（后部）。常见的色素性眼部病症示例包括但不限于色素分散综合征（PDS）、色素性青光眼、眼黑变病、脉络膜痣和脉络膜黑素瘤。

眼部病症中的色素沉着过度是指由于黑色素生成增加或积累导致眼内或眼周组织变暗。这种病变可能影响眼的多个部分，包括眼睑、结膜、虹膜和视网膜。色素沉着过度可以由多种因素引起，包括炎症、创伤、遗传倾向、某些药物和潜在的系统性疾病。在眼部病症中，色素沉着过度可以表现为不同形式，诸如眼睑色素沉着过度、结膜色素沉着过度、虹膜色素沉着过度和视网膜色素沉着过度。

眼部青光眼是一组以视神经损伤为特征的眼病，通常与眼内压（IOP）升高相关联。视神经负责将视觉信息从眼睛传递到大脑。当该神经受损时，可能导致视力丧失，如果不治疗，最终会导致失明。青光眼主要有两类，开角型青光眼和闭角型青光眼。

开角型青光眼是最常见的青光眼形式。在开角型青光眼中，眼的引流角保持开放，但负责从眼引流房水（液体）的小梁网随时间推移效率变低。这导致眼内压逐渐增加，这可能损害视神经。

在闭角型青光眼中，眼的引流角被阻塞或变窄，防止房水正常引流。这可能导致眼内压突然升高，这被称为急性闭角型发作。这种类型的青光眼需要立即就医，因为如果不治疗，可能导致快速视力丧失。

如本公开进一步所提及，本发明的OCA2调节剂可以减轻由用于治疗青光眼的药物引起的副作用（眼睛变黑）。

霍纳综合征，也称为霍纳氏综合征或眼交感神经麻痹，是一种罕见病变，其特征是由于交感神经系统受损导致的特定症状组合，通常影响面部和眼睛的一侧。该综合征以瑞士眼科医生Johann Friedrich Horner的名字命名，他于1869年首次描述了该疾病。与霍纳综合征相关联的经典三联征包括上睑下垂、瞳孔缩小和无汗症。

如本文所用，异色症是一种以虹膜（围绕瞳孔的眼睛有色部分）颜色差异为特征的病变。它可以表现为一个虹膜与另一个虹膜颜色不同（完全性异色症），或单个虹膜内颜色变化（节段性或部分性异色症）。

Fuchs异色性虹膜睫状体炎（FHI）是一种罕见的慢性炎症性眼部病变，主要影响虹膜（眼睛的有色部分）和睫状体（虹膜后部产生房水的结构）。其特征是症状和发现的独特组合，包括虹膜异色症（受影响眼睛与未受影响眼睛之间的颜色差异）、前房炎症（虹膜炎）和青光眼。Fuchs异色性虹膜睫状体炎的关键标志是异色症、前房炎症（虹膜炎）和青光眼。

在一些进一步的实施方案中，色素沉着过度疾病是由于用于对抗眼部青光眼的前列腺素和/或前列腺素类似物引起的。

在一些具体的实施方案中，所述疾病/病症/病变由青光眼药物引起，具体地所述疾病/病症/病变是指由青光眼药物引起的眼睛变色。

在一些实施方案中，该效应是可逆的，并且/或者不杀死黑素细胞，并且/或者不会不利地影响眼睛其他组织（诸如视网膜色素上皮）中的色素生产。

在一些实施方案中，根据本公开的治疗方法要施用的组合物如上述先前方面中所定义。

在一些实施方案中，所述至少一种OCA2调节剂包含核酸分子或者任何包含其的载体或宿主细胞中的至少一者。

如本文所用，载体是指具有特定插入序列的核酸分子，其可以被引入宿主细胞中，从而产生转化的宿主细胞。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，诸如复制起点。载体还可包括一个或多个选择性标记物基因和本领域已知的其他遗传元件，包括引导核酸表达的启动子元件。许多可用于将核酸转移到靶细胞中的载体（例如质粒、粘粒、微环、噬菌体、病毒等）可以适用于本发明。包含核酸的载体可以保持为附加体形式，例如作为质粒、微环DNA、病毒诸如巨细胞病毒、腺病毒等，或者它们可以通过同源重组或随机整合而整合到靶细胞基因组中，例如逆转录病毒衍生的载体，诸如AAV、MMLV、HIV-1、ALV等。

载体可以直接提供给受试者细胞。换句话讲，使细胞与包含本发明核酸分子的载体接触，使得载体被细胞摄取。用质粒核酸载体接触细胞的方法，诸如电穿孔、氯化钙转染和脂转染，是本领域熟知的。DNA可作为裸核酸、作为与诸如脂质体或泊洛沙姆的试剂复合的核酸引入，或可通过病毒（例如腺病毒、AAV）递送。

更具体地，在一些实施方案中，载体可为病毒载体。在另一些特定实施方案中，这种病毒载体可以是重组腺相关载体（rAAV）、单链AAV（ssAAV）、自互补rAAV（scAAV）、猿猴空泡病毒40（SV40）载体、腺病毒载体、辅助依赖性腺病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体中的任何一种。

如上所述，在一些实施方案中，病毒载体可适用于本发明。术语“病毒载体”是指能够将核酸分子转移到宿主中的复制型或复制缺陷型病毒颗粒。

在一些实施方案中，本发明的核酸分子可以包含在腺相关病毒（AAV）内。术语“腺病毒”与术语“腺病毒载体”同义。AAV是具有小（~20nm）蛋白囊的单链DNA病毒，属于细小病毒科，并且具体地指腺病毒科病毒。术语腺病毒统称为乳腺腺病毒属的动物腺病毒，包括但不限于人、牛、羊、马、犬、猪、鼠和猿腺病毒亚属。具体地，人腺病毒包括A-F亚属及其单个血清型，单个血清型和A-F亚属包括但不限于人腺病毒1、2、3、4、4a、5、6、7、8、9、10、11（AdllA和Ad IIP）、12、13、14、15、16、17、18、19、19a、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、34a、35、35p、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48和91型。

在另一些进一步的实施方案中，HDAd载体可以适用于本发明的方法。辅助依赖性腺病毒（HDAd）载体HDAd具有创新的特征，包括完全不含病毒编码序列和介导高水平转基因表达的能力，且具有可忽略的慢性毒性。HDAd通过从腺病毒载体基因组中除去除包装序列和反向末端重复序列之外的所有病毒序列来构建，从而消除了与早期腺病毒载体相关的残留病毒基因表达的问题。

更进一步，在一些实施方案中，SV40可以用作适用于本公开的载体。SV40载体（SV40）是来源于对猿猴病毒-40（一种二十面体乳头瘤病毒）的修饰的载体。重组SV40载体是基因转移的良好候选载体，因为它们显示出一些独特的特征：SV40病毒是熟知的病毒，非复制型载体易于制造，并且可以10（12）IU/ml的滴度生产。它们还能有效转导静止细胞和分裂细胞，向多种细胞类型传递持久的转基因表达，并且是非免疫原性的。目前用于基因治疗的rSV40载体的缺点是克隆能力小，并且可能存在与病毒基因组随机整合到宿主基因组中相关的风险。

在某些实施方案中，本发明可以使用的合适载体可以是逆转录病毒载体。逆转录病毒载体由前病毒序列组成，这些序列可以容纳感兴趣基因，以允许两者共同并入靶细胞中。该载体还可以包含病毒和细胞基因启动子，以增强感兴趣基因在靶细胞中的表达。逆转录病毒载体稳定地整合到分裂的靶细胞基因组中，以便导入的基因在所有子细胞中传递和表达。其含有一种逆转录酶，可整合到宿主基因组中。

在又一些另选的实施方案中，慢病毒载体可用于本发明。慢病毒载体衍生自逆转录病毒亚类的慢病毒。常用的逆转录病毒载体是“缺陷型的”，即，无法产生生产性感染所需的病毒蛋白。将包含本发明核酸分子的逆转录病毒载体引入感兴趣靶细胞中的方法是本领域众所周知的。

在一些另选实施方案中，载体可以是非病毒载体。更具体地，这种载体在一些实施方案中可以是质粒、微环和线性DNA中的任何一种。

根据本发明，非病毒载体是指除病毒系统之外的所有物理和化学系统，通常包括化学方法，诸如阳离子脂质体和聚合物，或物理方法，如基因枪、电穿孔、粒子轰击、超声波利用和磁转染。

例如，用于体外和体内基因递送的物理方法是基于通过机械、电、超声波、流体动力学或基于激光的能量在细胞膜中进行瞬时穿透，从而促进DNA进入靶细胞。

在更具体的实施方案中，载体可为裸DNA载体。更具体地，此类载体可为例如质粒、微环或线性DNA。

应当理解，本文公开的所有DNA载体也可应用于本发明的所有不同方面。

更进一步，必须理解，本发明还提供了包含本发明公开的任何核酸分子的任何载体或媒介物，以及表达本发明公开的核酸分子的任何宿主细胞。

在一些实施方案中，所述至少一种核酸分子或者包含其的任何载体或宿主细胞如本公开上文详细述及的前述方面所限定。

本公开还涉及包含如上文定义的核酸分子的任何载体，以及包含所述载体的任何宿主细胞。

在一些实施方案中，所述至少一种OCA2调节剂经由局部施用来施用并且/或者在一些具体实施方案中施用于所述受试者的眼睛。

再一附加方面，本公开提供了至少一种眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白调节剂，或者其任何媒介物、基质、纳米颗粒或微米颗粒，或者包含其的任何组合物，用于治疗有需要的受试者的疾病/病症的方法中，该方法包括向所述受试者施用有效量的所述至少一种OCA2蛋白调节剂。

应当指出的是，上文定义的关于治疗疾病/病症方面的方法的所有先前描述的实施方案同样适用于本公开涉及的、根据本公开使用的OCA2调节剂的这一方面。

应当理解，如本文所用的术语“治疗（treat、treating、treatment）”或其形式是指预防、改善或延迟患有病理病患的受试者的疾病活动的一种或多种临床指征的发作。治疗是指治疗性治疗。需要治疗的受试者是患有病理性病患的受试者。特别地，提供“防护性治疗”（以预防）或“预防性治疗”以保护性方式起作用，以防御或预防某物，特别是病症或疾病。

如本文所用，术语“治疗或预防”是指向受试者施用治疗性积极效果的完整范围，包括抑制、减少、减轻和解除某种状况、疾病及其体征和症状，或者患者希望改变的不良副作用和美容障碍。更具体地，治疗或防止疾病恶化或复发包括防止或延缓疾病的发展、防止或延缓症状的发展，以及/或者降低将要发展或预期将要发展的此类症状的严重性。这些还包括改善现有症状、预防额外的症状，以及改善或预防症状的根本原因。

如上文所指出，本发明提供的方法和组合物可以用于治疗“病理紊乱”，该术语是指正常功能受到干扰的状况，以及身体或心灵的任何异常状况，其给受影响的人或与该人接触的人带来不适、功能障碍或痛苦。应当注意的是，术语“疾病”、“病患”、“病症”和“病”在本文中等同地使用。

应当理解，由本发明所述的任何方法和组合物可适用于治疗和/或改善本文所公开的任何病患或与其相关联的任何病症。应当理解，当在本文中提及病状时，可互换使用的术语“相关联的”、“联结的”和“相关的”意指具有以下特征中的至少一者的疾病、病患、病症或任何病状：共有因果关系，以高于巧合的频率共存，或者其中至少一种疾病、病患、病症或病状引起第二种疾病、病患、病症或病状。更具体地，如本文所用，“疾病”、“病症”、“病变”、“病状”等术语，当它们与受试者的健康或美容偏好（例如，不需要的眼部色素性病变、获得性或先天性异色症）相关时可互换使用并且具有赋予每个及所有此类术语的含义。

本发明涉及用于治疗有此需要的受试者或患者。所谓“患者”、“受试者”或“有需要的受试者”，意指任何可能受上文提及的状况影响的生物体，并且是需要本文所述治疗和预防方法的对象，包括人类、家养和非家养哺乳动物，诸如犬科和猫科受试者、牛科、猿科、马科和啮齿类动物，特别是鼠科受试者。更具体地，本发明方法旨在用于哺乳动物。所谓“哺乳动物受试者”意指需要所提出的疗法的任何哺乳动物，包括人类、牲畜、马科动物、犬科动物和猫科动物受试者，最特别地是人类。因此，意在使术语“受试者”指代任何动物，人类或非人类，优选脊椎动物，更优选哺乳动物。受试者可能包括转基因生物。最优选的是，受试者是人。

如本文所用，术语“约”表示可以比所提及的值最多向上或向下偏离1%、更具体地5%、更具体地10%、更具体地15%，并且在一些情况下最多向上或向下偏离20%的值，该偏离范围包括构成连续范围的整数值，如果适用的话，还包括非整数值。在一些实施方案中，术语“约”是指±10%。

除非明确指示相反的含义，否则如本文在说明书和权利要求书中所用的不定冠词“一个”和“一种”应当理解为意指“至少一个/种”。必须注意，如在本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代物，除非上下文另外清楚地说明并非如此。

如本文在说明书和权利要求书中所用的短语“和/或”应当理解为意指如此结合的要素（即，在一些情况下结合地存在，而在其他情况下分离地存在的要素）中的“任一者或两者”。用“和/或”列出的多个要素应当以相同的方式来解释，即，如此结合的要素中的“一者或多者”。可以可选地存在不同于由“和/或”条款具体指明的要素的其他要素，无论其与具体指明的那些要素相关还是不相关。因此，作为一个非限制性示例，在一个实施方案中，当与开放式语言诸如“包括”结合使用时，提到“A和/或B”可以仅指代A（可选地包括不同于B的要素）；在另一个实施方案中，仅指代B（可选地包括不同于A的要素）；在又一个实施方案中，指代A和B两者（可选地包括其他要素）；等等。

如本文在说明书和权利要求书中所用，“或”应当理解为具有与如上文定义的“和/或”相同的含义。例如，当将列表中的项目分开时，“或”或者“和/或”应当被解释为包括性的，即包括多个要素或要素列表中的至少一个要素，但也包括其中的多于一个要素，并且可选地包括附加的未列出的项目。只有术语清楚地表明相反的含义，诸如“……中的仅一者”或“……中的只有一者”，或者当在权利要求中使用时，“由……组成”才会指代包括多个要素或要素列表中的只有一个要素。一般来讲，如本文所用的术语“或”当在权利要求书中使用时，当后面有排他性术语诸如“……中的任一者”、“……中的一者”、“……中的仅一者”或“……中的只有一者”时，应当仅被解释为指示排他性替代方案（即，“一者或另一者，但不是两者皆有”）。“基本上由……组成”当在权利要求书中使用时，应当具有其在专利法领域中所使用的普通含义。

如本文在说明书和权利要求书中所用，关于一个或多个要素的列表的短语“至少一个”应当理解为意指选自该要素列表中的任何一个或多个要素的至少一个要素，但不一定包括在该要素列表内具体列出的每一个要素中的至少一者，也不排除该要素列表中的要素的任何组合。该定义还允许可以可选地存在不同于在短语“至少一个”所指的要素列表内具体指明的要素的一些要素，无论其与具体指明的那些要素相关还是不相关。因此，作为一个非限制性示例，在一个实施方案中，“A和B中的至少一者”（或等同地，“A或B中的至少一者”，或等同地，“A和/或B中的至少一者”）可以指代至少一个、可选地包括多于一个A，而不存在B（并且可选地包括不同于B的要素）；在另一个实施方案中，指代至少一个、可选地包括多于一个B，而不存在A（并且可选地包括不同于A的要素）；在又一个实施方案中，指代至少一个、可选地包括多于一个A，以及至少一个、可选地包括多于一个B（并且可选地包括其他要素）；等等。

还应当理解，除非清楚地相反指示，否则在本文受权利要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，该方法的步骤或动作的顺序不必限于该方法的步骤或动作被记载的顺序。

在本说明书和随后的实施例和权利要求书中自始至终，所有过渡性短语诸如“包含”、“包括”、“携带”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“由……构成”等应当理解为是开放式的，即，意味着包括但不限于。具体地，应当理解，暗示包括所述整数或步骤或整数或步骤的组，但不排除任何其他整数或步骤或整数或步骤的组。仅过渡性短语“由……组成”和“基本上由……组成”应当分别为美国专利局专利审查程序手册中所提出的封闭式或半封闭式过渡性短语。更具体地，术语“包含”、“含有”、“包括”、“具有”以及它们的词形变化均意味着“包括但不限于”。术语“由……组成”意味着“包括并限于”。术语“基本上由……组成”意味着组合物、方法或结构可以包括附加的成分、步骤和/或部分，但仅仅是在这些附加的成分、步骤和/或部分不会实质上改变要求权利的组合物、方法或结构的基本特征和新颖特征时。

应当注意的是，本发明的各种实施方案可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁起见，而不应被解释为对本方面的范围的非灵活限制。因此，对范围的描述应当被认为已经具体公开了所有可能的子范围，以及该范围内的各个数值。例如，对诸如从1至6的范围的描述应当被认为已经具体公开了诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等子范围，以及在该范围内的各个数字，例如1、2、3、4、5和6。不管范围的宽度如何，这都适用。每当本文指示数值范围时，都意在包括在所指示范围内的任何所引用数字（分数数字或整数数字）。第一指示数字与第二指示数字“之间的范围”和“从”第一指示数字“到”第二指示数字的“范围”这两个加引号短语在本文中可互换使用，意在包括第一指示数字和第二指示数字，以及两者之间的所有分数数字和整数数字。

如本文所用，术语“方法”是指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业者已知的或者由这些领域的从业者已知的方式、手段、技术和程序容易开发的那些方式、手段、技术和程序。

应当理解，为清晰起见在各独立实施方案的上下文中描述的本发明的某些特征，也可以组合形式提供在单个实施方案中。相反，为简明起见在单个实施方案的上下文中描述的本发明的各种特征也可以单独提供或以任何合适的子组合提供，或者在适当时，在本发明的任何其他所述实施方案中提供。在各种实施方案的上下文中描述的某些特征不被认为是那些实施方案的基本特征，除非该实施方案在没有那些要素的情况下就无法实施。

如上文所描述以及如下面的权利要求书部分中所要求保护的本发明的各种实施方案和方面在以下实施例中得到实验支持。

所公开和描述的，应当理解，本发明不限于本文所公开的具体实施例、方法步骤和组合物，因为此类方法步骤和组合物都可以稍微改变。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，而不旨在进行限制，因为本发明的范围将仅受到所附权利要求书及其等同物的限制。

以下实施例代表了由本发明人在进行本发明的多个方面时所采用的技术。应当理解，尽管这些技术是用于实践本发明的优选实施方案的示例，但是根据本公开，本领域技术人员将认识到，在不脱离本发明的实质和预期范围的情况下，可以进行许多修改。

实施例

无需进一步详细描述，据信本领域技术人员可使用前面的描述最大程度地利用本发明。因此，以下优选的具体实施方案应被解释为仅仅是说明性的，并且不以任何方式限制所要求保护的发明。

实验程序

黑色素吸光度定量试剂

使用以下材料和试剂：黑色素（Sigma，货号M0418）、氢氧化铵（Sigma，货号09859）、Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）（Biowest，货号L0102-500）、胎牛血清（FBS）（Gibco，货号10270-106）、青霉素/链霉素（Pen/Strep）（Gibco，货号15140-122）、标准96孔板（Greiner，货号655101）、UV-star 96孔板（Greiner，货号675801）、B16-F10小鼠黑素瘤细胞（ATCC，货号CRL-6475）、0.25%胰蛋白酶-EDTA（Gibco，货号25200-072）、磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sartorius，货号02-023-1A）、台盼蓝（Sigma，货号T8154）、T75培养瓶（Greiner，货号658170）、Nunclon Delta 6孔板（Thermo，货号140675）、ViewPlate白色96孔板，透明底板（Perkin Elmer，货号6005181）和CellTiter-Glo（Promega）。

Cell Titer Glo测定

CellTiter-Glo^®缓冲液在使用前解冻并平衡至室温，并在4℃下储存最多48小时。将冻干的CellTiter-Glo^®底物恢复至室温。取10ml CellTiter-Glo^®缓冲液添加到底物中以形成CellTiter-Glo^®试剂，该试剂在不使用时储存于-20℃下。温育72小时后，将板置于室温约30分钟。每孔添加100µl CellTiter-Glo^®试剂。将板在定轨振荡器上振荡2分钟以进行细胞裂解。板在室温处孵育10分钟，以稳定发光信号。使用Clariostar BMG酶标仪记录发光，每孔积分时间为1秒。

B16-F10黑素瘤细胞中的siRNA转染与qPCR mRNA（OCA2）

B16-F10小鼠黑素瘤细胞（ATCC CRL-6475）在补充有FBS和Pen/Strep的DMEM中培养，并且使用0.25%胰蛋白酶-EDTA传代。对于转染过程，使用了各种测试物品，包括三种不同的OCA2 siRNA和对照siRNA（乱序siRNA和GAPDH siRNA（Thermo-Fisher））。转染对照包括未转染的细胞和用Block-iT处理的细胞。

对于6孔板，表达实验使用的接种浓度为250,000和300,000细胞/孔，24小时后达到60%至80%汇合度。每2-3天更换培养基。对于96孔板，使用的接种浓度为7,500和10,000细胞/孔。

使用OptiMEM-Lipofectamine进行细胞转染

转染方案包括在1.5ml Eppendorf管中制备OptiMEM-Lipofectamine混合物，然后在单独的Eppendorf管中制备mRNA的主混合物。随后，将稀释的Lipofectamine RNAiMax试剂以1:1的比例添加到每管稀释的RNA中。该混合物在室温处孵育5分钟，然后添加到细胞中（250µl/孔）。随后，将细胞在37℃、5% CO2环境中孵育。转染后，在24小时收集细胞用于FACS分析和显微镜观察，并且在48小时用于RNA提取。

使用OptiMEM-Lipofectamine进行虹膜样本转染

将siRNA和Lipofectamine与Opti-MEM进行预孵育，以达到siRNA最终浓度为50nM，Lipofectamine最终浓度为5µl/ml。预孵育后，将100µl siRNA-Lipofectamine溶液添加到装有虹膜的孔中，孔中有500µl培养基。转染在600µl的终体积中进行。

使用BLOCK-iT进行转染对照–显微镜法与FACS

将Lipofectamine RNAiMax（Thermo，货号13778-030）和Block-iT荧光寡核苷酸（Thermo，货号2013）分别在OptiMEM（Gibco，货号31985-047）中稀释。然后将两种溶液以1:1的比例混合，并且在室温处孵育5分钟。将RNA-脂质复合物以每孔250µl的体积添加到6孔板的细胞中，96孔板每孔10µl。转染后，将细胞在37℃下孵育，并且在3至6小时后使用荧光显微镜评估，24至48小时后使用荧光显微镜和流式细胞术（FACS）两者进行评估。

转染后活力测试

转染后24小时使用Cell Titer Glo测定（Promega）评估细胞活力。

进行FACS分析以评估转染效率。用PBS洗涤细胞，胰蛋白酶消化，重悬于生长培养基中，然后转移到96孔U底板中进行分析。

RNA提取和PCR

根据细胞计数将B16-F10细胞沉淀重悬于TRI Reagent^®中（≤10^5细胞用100µl，≤10^6细胞用300µl，≤5*10^6细胞用600µl）。所有样品均用TRI Reagent^®标准化至300µl。RNA纯化：将裂解的样品与等体积的95%至100%乙醇混合，并且转移到Zymo-Spin^™IICR色谱柱中进行离心。在柱上进行DNase I处理，然后用RNA洗涤缓冲液和Direct-zol^™RNA预洗涤液洗涤。用无DNase/RNase水洗脱RNA，并且使用Nanodrop测量浓度和纯度。如先前所述进行RNA逆转录为cDNA。

鼠离体虹膜外植体的制备和分析

研究设计和伦理考虑伦理批准由“实验室动物照护与使用伦理行为委员会”授予。该研究遵守《动物福利法（动物研究）- 1994年（以色列国）》、美国实验动物资源研究所（ILAR）颁布的《实验室动物照护与使用指南》，以及美国国立卫生研究院（NIH）的指导原则。

实验使用了C57BL/6JOlaHsd与DBA2/J小鼠离体虹膜模型。由Envigo CRS（以色列）LTD提供。无特定病原体（SPF）。大约年龄：1至2个月。

虹膜样本显微解剖：

使用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉小鼠，随后实施安乐死。使用带有冷光源的立体解剖显微镜进行眼解剖，以尽量减少眩光和反射。

虹膜解剖按以下步骤进行：固定摘除的眼球；在角膜缘处做切口以进入；将眼睛分为前段和后段并分离周缘；从后眼杯中鉴定和解剖神经视网膜；使用锋利的剃须刀片在角膜缘后面切开；用弯曲的虹膜剪继续沿眼球切开；用精细镊子轻轻取出晶状体；从前段制取楔形组织块；去除睫状体后多余的巩膜、脉络膜和视网膜；用精细镊子和Tooke刀抓住中央角膜；打破虹膜-睫状体和角膜-巩膜之间的粘连；将分离的虹膜-睫状体碎片转移到装有培养基的24孔板中。

虹膜样本培养与活力评价

培养基和补充剂：TC DMEM F12（Gibco，货号11320074）、Pen/Strep（Gibco，货号15140-122）、丙酮酸钠（Sartorius，货号03-042-1B）、NEAA（Gibco，货号11140-035）、FBS（Gibco，货号10270-106）、B27（Gibco，货号17507-044）。

·培养基A：DMEM F12，含10% FBS，1X NEAA，1X丙酮酸钠，1X Pen/Strep

·培养基B：DMEM F12，含20% FBS，1X NEAA，1X丙酮酸钠，1X Pen/Strep

·培养基C：DMEM F12，含1X B27，1X NEAA，1X丙酮酸钠，1X Pen/Strep

用于活力测试：使用PrestoBlue^™细胞活力试剂/25ml（Rhenium，货号A13261）。

洗涤方案：将每个虹膜依次转移至三个装有无菌培养基的孔中进行去污。

然后将一个虹膜浸入70%乙醇中10分钟，洗涤后作为无活力虹膜。

活力定量：将Presto Blue试剂预热至室温。向培养基中的虹膜添加35µl PrestoBlue；向培养基中添加25µl。在37℃下孵育2.5小时。将12个小鼠虹膜在装有10% PrestoBlue的100µl培养基中孵育2.5小时。孵育后，将每个样本50µl转移到黑色96孔板中。测量吸光度和荧光强度。

虹膜样本中的SOX10敲低

本研究使用了如本文所述采集的小鼠虹膜。虹膜维持在培养基A中。对于转染过程，使用了各种测试物品，包括SOX10 siRNA及其核苷酸链序列：

有义链：5'- AGCCAGUAUAUACGACUCUAUCCCG -3’，如SEQ ID NO: 76所表示，和

反义链：3'- CGUCGGUCAUAUAUGCUGAGAUAGGGC -5’，如SEQ ID NO: 77所表示。

用来自Thermo-Fisher（目录号4390843）的乱序siRNA处理过的虹膜充当阴性对照。

转染方案包括在1.5ml Eppendorf管中制备OptiMEM-Lipofectamine混合物，然后在单独的Eppendorf管中制备mRNA的主混合物。随后，将稀释的Lipofectamine RNAiMax试剂以1:1的比例添加到每管稀释的RNA中。该混合物在室温处孵育5分钟，然后添加到虹膜中（100µl/孔）。随后，将虹膜在37℃、5% CO2环境中孵育。转染后24小时，更换培养基。转染后48小时，收获虹膜用于RNA提取。

从虹膜样本中提取RNA

使用的试剂包括DirectZol RNA Miniprep试剂盒（Zymo Research，货号R2053）（内含Tri-reagent）、无水乙醇（Gadot）、Maxima First Strand cDNA合成试剂盒（ThermoFisher）、超纯水（Thermo Fisher）、Taqman Fast Advanced Master Mix（Thermo Fisher）和PrimeTime基因表达Master Mix（IDT）。

对于转染实验，从DBA小鼠中采集了八个虹膜组织。实验组用Sox10-siRNA处理，对照组接受乱序siRNA。转染后48小时评估SOX10表达。除了8个转染的虹膜外，还采集了几个其他虹膜并立即进行RNA提取，随后还评价其SOX10、GAPDH和OCA2表达，这些虹膜未经过转染，用于优化RNA提取过程。

在均质化和RNA提取期间，虹膜样本用TriReagent和不锈钢珠处理，使用均质器，速度设置为10，每次1分钟，共三个循环。该过程有助于随后使用基于柱的试剂盒进行RNA提取，并严格遵循制造商的指南。使用NanoDrop分光光度计评估提取RNA的纯度和浓度。用合并的虹膜样品进行提取过程以增加RNA量。

哺乳动物虹膜基质黑素细胞的靶向脱色素

·伦理委员会批准

该研究在获得实验室动物照护与使用伦理行为委员会批准后启动，确保符合相关法规。

·动物福利合规性

该研究遵守：

·《动物福利法（动物研究）- 1994年（以色列国）》，

·ILAR颁布的《实验室动物照护与使用指南》，

·NIH指导原则：供应和文件

申办方提供了测试物品、储存溶液和特殊材料，以及涵盖样本处理、储存和物品鉴定的安全说明的全面文件。

·储存溶液和测试物品材料

对储存溶液和测试物品均已细致编目，其中包括以下产品：诸如BLOCK-iT^™AlexaFluor^®红色荧光寡核苷酸、Invivofectamine^®3.0入门试剂盒，以及Lipofectamine^®RNAiMAX试剂OCA2-siRNA（由IDT和Thermo-Fisher提供），这些产品主要由Invitrogen和Gibco供应。

·测试物品制备/配方

·Invivofectamine^®3.0-Block-iT复合物制备：制备过程包括将Block-iTTMAlexa Fluor^®与Opti-MEM^®培养基混合，然后与Invivofectamine^®3.0试剂复合。将混合物孵育、稀释并在体内递送前适当储存。

·Lipofectamine-Block-iT复合物制备：该过程从制备Block-iT溶液开始，然后稀释Lipofectamine^®RNAiMAX试剂，随后混合并孵育以形成Lipofectamine^®RNAiMAX-Block-iT复合物用于递送。

·Lipofectamine-OCA2-siRNA复合物制备：将稀释的Lipofectamine RNAiMAX试剂添加到每管稀释的RNA（以1:1的比例）中

·分组和给药

根据体重将动物分组，以确保同质治疗组。测试物品的给药经由玻璃体内（IVT）或前房（AC）注射执行，并详细说明了每种程序的麻醉方案。IVT与AC注射分组已划分明确，并且显微外科手术程序均使用特定设备。

该研究有条理地将受试者组织到特定组中，每组通过给药途径和使用的测试物品以及不同的剂量来区分，以评估它们对解剖的虹膜试样的影响。指定受试者经由玻璃体内（IVT）或前房（AC）注射接受Invivofectamine^®3.0-Block-iT或Lipofectamine^®RNAiMAX，剂量范围广泛。每个实验组包括两名受试者，最后两个对照组除外，它们接受安慰剂处理（TBD）并且每组仅由一名受试者组成。这种设置有助于在不同条件下进行彻底的影响检查，从而显著丰富研究结果。

·虹膜解剖：

该研究的最后阶段在施用测试物品24小时后进行，包括用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物对动物实施麻醉，随后实施安乐死。使用配备冷光源的立体解剖显微镜进行眼睛解剖，以尽量减少来自金属解剖仪器的眩光和反射。如先前离体样本描述中概述的解剖过程的详细步骤被严格遵守，以确保对虹膜试样的精确检查和分析。

玻璃体内注射程序：

该程序始于使用31号针头在小鼠眼结膜上制造一个微穿刺点，定位距角膜缘区域约1.0mm处，在睫状体平坦部水平处进入侧向巩膜。这一初始步骤确保在IVT注射前有轻微的玻璃体突出以降低眼内压。为避免造成创伤性白内障，将微针以45°角插入玻璃体。然后使用眼内注射汉密尔顿注射器（GA33-34）以受控速率缓慢注射测试物品/媒介物，实现成功的单侧IVT注射。注射后，短暂停顿后从注射部位小心撤出针头。

前房（眼内）注射程序：

类似地，使用31号针头在角膜上制造一个微穿刺点，位置距角膜缘区域约1.0mm处进入前房，以开始前房注射。将微针小心插入前房以防止创伤性白内障，然后使用眼内注射汉密尔顿注射器（GA33-34）缓慢注射测试物品/媒介物，实现成功的单侧AC注射。然后缓慢且谨慎地从注射部位移除针头。

光学显微镜检查：

将虹膜样本或完整眼球固定在缓冲福尔马林中，组织试样进行石蜡包埋处理。制备标准的五微米切片并安装到载玻片上。平行切片进行苏木精-伊红（HE）染色处理，用于组织病理学评价。对染色载玻片进行显微镜研究，并使用可商购获得的Fontana-Mason染色试剂盒进行评价。

透射电子显微镜（TEM）制备：

将虹膜和视网膜在1 TBS中洗涤，并置于在1 pin中制备的10%、20%和30%梯度蔗糖溶液中，然后进行冷冻包埋。之后，将组织包埋在冷冻包埋溶液中，在液氮中冷冻，并保持在-20℃直至进一步处理。使用Leica冷冻切片机CM1860切割10mm厚的切片。

TEM前包埋：

孵育48小时后，采集转染细胞和对照细胞，用0.1M磷酸盐缓冲液洗涤三次。这些细胞首先用含有4%多聚甲醛、1%戊二醛的0.1M磷酸盐缓冲固定液固定4小时，然后在4℃下用1%四氧化锇处理1小时，进行二次固定。之后进行脱水，使用递增浓度的乙醇，即在50%、70%、80%和90%中各10分钟，在95%中两次各15分钟，最后在100%中1小时。此步骤后，用环氧丙烷处理样本15分钟。使用Embed 812（一种商业快干环氧树脂胶，含有环氧树脂（混合物A和B）和1.4% DMP-30）包埋样本。混合物A包含Embed 812（EMS）和十二烷基琥珀酸酐，而混合物B则包含Embed 812（EMS）和甲基纳迪克酸酐。将己二醇（HG）和树脂（R）以1:2的比例混合，添加到培养皿中，并在转子混合器上混合2小时。接下来将树脂和己二醇以2:1的比例混合2小时，然后用100%树脂替换树脂和己二醇，并在60℃下混合6小时，持续3天。然后用超薄切片机（MTX ULTRAMICROTOME）获得样本的超薄切片。试样分别用乙酸双氧铀和柠檬酸铅处理30分钟和15分钟。

虹膜样本的照明和成像

所有样本（治疗组和对照组）均接受9W 6500K LED光源照射，光源距离8.5cm，该距离先前在早期研究中已被验证对孵育的虹膜样本无害。该接近程度已被证明不会改变样本周围温度，且持续光照暴露方案基于先前证据，表明其在维持所研究虹膜样本的完整性和健康方面具有安全性和有效性。在整个实验期间持续暴露于这种特定光照，仅在必要的程序（诸如拍照、活力评估和施用转染材料）时有短暂中断。

在实验基线时和第14天（第4次转染后3天，并在即将固定和组织学评价处理前）使用配备有Laowa 25mm f/2.8 2.5-5X超微距镜头的Panasonic Lumix G9相机进行成像。背光和环境光照条件的强度和开尔文温度（均为6500K，模拟日光色调）均受到严格控制。照片拍摄参数设定为光圈f/16，ISO 200，快门速度4秒。所有其他摄影参数均标准化，包括房间顶灯、相机和虹膜定位、板密封上的蒸气水平，以及与其他光源的接近程度。

实施例1

OCA2 基因的靶向

靶向OCA2基因的表达能够获得最美学上自然的结果，堪比天生蓝眼者，因为OCA2蛋白水平的降低及其在虹膜黑素细胞和虹膜组织中的下游效应在天生浅色眼睛的人群中是自然的。

与降低OCA1表达及其下游效应相比，这种方法的优势更加突出。OCA1 基因抑制导致酪氨酸酶减少以及视网膜色素上皮（RPE）和虹膜色素上皮（IPE）中的色素减少。这可能导致视力丧失和其他负面后果。与大多数继承降低OCA2表达突变且通常健康、视力良好的蓝眼睛个体相反，由于酪氨酸酶活性降低和OCA1基因表达减少而拥有亮色眼睛的个体遭受健康问题（诸如在伴有红色虹膜与视力丧失的白化病患者中所见）。

在该方法中，递送大分子，例如以滴眼剂形式，其穿透角膜并进入眼睛的前房，有效穿透虹膜基质黑素细胞，并避免被内体-溶酶体系统破坏，而不伤害其他细胞或激活眼睛中的免疫系统。此外，提出了一种生物靶向治疗，用于在体内和体外减少人和动物虹膜黑素细胞中的色素沉着。此外，该方法包含siRNA和/或反义寡核苷酸，其能够作为滴眼剂递送，并且特异性靶向虹膜基质内的色素生产。此外，治疗不影响其他眼睛功能，也不触发免疫系统。它在眼睛的前房中长时间停留而不被降解。而且，由于RNA治疗剂的沉默效应是暂时性的，所以停止治疗会导致色素逐渐再沉着。结果是可逆的眼睛颜色改变，不杀死黑素细胞，并且不对眼睛其他组织（诸如重要的视网膜色素上皮）中的色素生产造成不利影响。

在IPE和RPE细胞中，OCA2的调节不会导致像在基质黑素细胞中那样完全阻止黑素体成熟。因此，OCA2沉默对这些细胞中的色素沉着水平影响很小或完全没有影响。相反，酪氨酸酶抑制的OCA1沉默对这些细胞中的色素沉着具有实质性影响。首先，使用光学显微镜和电子显微镜的组织学研究表明，蓝眼睛个体（已知其细胞表达较少OCA2）和棕眼睛个体之间IPE内的色素沉着水平没有显著差异。然而，虹膜基质内的色素沉着量存在显著差异。大多数蓝眼睛的人也携带少数突变之一，所有这些突变都导致OCA2表达减少。然而，有证据表明，蓝眼睛的人在虹膜色素上皮（IPE）中具有正常的色素沉着。正如在深色和浅色眼睛的个体中观察到的那样，但在因OCA1突变导致的白化病患者中则不存在，具有正常色素沉着的IPE将光线反射回外部观察者，而不会显示由睫状体中血管引起的红色。如果不存在，则可见粉红色调。

靶向疗法选择性地干扰在疾病发展和进展中起作用的特定分子途径或基因突变。这些疗法比传统的非特异性疗法具有更高的功效和安全潜力。靶向疗法的安全性特征是另一个优点。与传统的非靶向疗法相比，靶向疗法的副作用更少，从而提高了患者的生活质量。该方法包括一种靶向疗法，其靶向眼皮肤白化病2（OCA2），其水平决定虹膜黑素细胞内产生的色素量，从而决定眼睛的颜色。由于OCA2基因上游增强子中的SNP调控其表达，所以浅色眼睛和深色眼睛的个体表现出不同的表型差异。当基质黑素细胞中的OCA2表达低时，黑素体不成熟，并且色素沉着保持较低。这在OCA2表达低的眼色素上皮细胞（诸如IPE和RPE）中似乎不会发生。因此，由于少数导致相同表型的SNP，绝大多数浅色眼睛的个体OCA2基因表达降低。相反，具有深色眼睛的人通常具有OCA2基因的充分表达。基于该方法，一种靶向疗法密切模拟上文提及的SNP以降低OCA2水平，将功能失调的未成熟黑素体赋予那些出生时具有正常OCA2水平的人的虹膜黑素细胞，从而减少他们的色素沉着并且改变他们的眼睛颜色。

实施例2

内体逃逸修饰和组合物递送

自2000年代siRNA被发现以来，科学界对开发基于RNA沉默的疗法始终寄予厚望。为了开发此类疗法，许多制药公司已进入该领域。这些尝试大多失败，原因是经内吞作用被细胞摄取的大分子无法从内体中逃逸以避免降解并到达细胞质。而细胞质正是靶mRNA分子所在的位置。在过去的二十年中，对内体系统以及有效的内体逃逸技术进行了广泛的研究。近年来，能够到达细胞质并有效沉默靶RNA的siRNA和反义寡核苷酸已实现商业化。例如，通过用脂质纳米颗粒（LNP）包被分子，它们便能够以更高的速率从内体中逃逸。

通过内吞过程可以将RNA治疗剂递送到细胞中，在该过程中，细胞将来自细胞外环境的大分子内化到细胞内环境中。在一些内吞途径中，siRNA分子在缀合物（诸如GalNac、胆固醇、维生素E等）的帮助或无需其帮助下，与特定的细胞表面受体结合。当细胞膜围绕siRNA分子内陷时，便形成内体。随后内体被运输至溶酶体，在那里被酸化和酶促降解。然而，siRNA分子无法在内体内沉默基因表达，因为RNA干扰仅发生在细胞质内。

通过使siRNA分子更抗降解或更有可能穿透内体脂质双层，可以克服这一局限性。使用特定的递送系统或对siRNA分子进行化学修饰来实现这一结果。通过将这些分子包封在LNP中，可以增加其从内体中逃逸的能力。例如，含有B-谷甾醇的LNP的内体逃逸效率已被证明是不含B-谷甾醇LNP的十倍（Herrera M等人，(2021) Biomater Sci.9(12):4289–300）。

因此，为了使眼睛颜色变亮，生产的滴眼剂其活性成分能够以合适的浓度到达虹膜、进入黑素细胞、逃逸内体-溶酶体降解，并且沉默OCA2的表达。

除了非病毒阳离子递送系统外，病毒载体（诸如腺相关病毒（AAV）和慢病毒）代表用于基于RNA的治疗剂的另一类有效递送媒介物。这些病毒载体利用病毒进入细胞的天然能力，从而为将RNA分子引入靶细胞提供了一种高效方法。使用AAV或慢病毒载体能够实现RNA治疗剂的稳定表达，可能克服与一些非病毒递送方法相关联的降解和瞬时表达有关的挑战。此类病毒递送系统用于治疗目的的工程化改造和应用已有充分文献记载，并且属于本领域技术人员的专业知识范围，为向多种细胞类型（包括那些使用传统方法难以转染的细胞）递送基于RNA的疗法提供了一个强大的平台。

实施例3

组合物递送和药代动力学

为了将组合物通过角膜局部递送到前房中，有两种主要方法可用：滴眼剂和/或直接眼内注射，诸如前房内注射。大多数患者偏好使用滴眼剂，因其可以在无医护人员协助的情况下在家自行给药。另选地，注射通过绕过角膜屏障来提高生物利用度。然而，患者认为注射具有威慑性、令人畏惧且疼痛。优选的解决方案是使用被设计成以足够浓度到达虹膜的滴眼剂。

在克服了角膜屏障或巩膜-结膜屏障后，分子能够通过内吞作用进入黑素细胞、逃逸内体-溶酶体系统，并最终使OCA2沉默。经由局部滴眼剂给药的组合物，其活性成分到达前房后，在虹膜中具有良好的生物分布，即在动物模型中没有系统分布，并且向眼睛后房的分布极少。这些组合物在眼各分区间的药代动力学为局部眼用药物提供了双重优势：首先，它们在靶区域以高浓度维持更长时间段，从而提高其有效性；其次，它们不分布到其他器官，从而显著减少药物负荷以及副作用的可能性。

作为一个隔离的器官，眼睛相对受到保护，不易发生药物的系统播散，从而提高药物的有效性（在靶区域中降解更少，且滞留更多）并减少其系统效应和脱靶效应。局部递送至眼睛表面的组合物可以穿过巩膜-结膜途径（Leclercq B、Mejlachowicz D、Behar-CohenF. Ocular Barriers and Their Influence on Gene Therapy Products Delivery.Pharmaceutics. 2022年5月6日；14(5):998）。另选地，该组合物可以通过角膜上皮以两种主要方式之一递送：要么穿过细胞（跨细胞途径），这是亲脂性分子的倾向；要么绕过细胞（细胞旁途径），这是亲水性分子的倾向。

开发基因沉默疗法的一个主要挑战是药物通常是大分子且带有电荷。这导致其药代动力学特性对药物递送具有挑战性。此外，药物必须克服各种障碍才能有效。这些屏障包括泪膜和角膜或巩膜-结膜孔的解剖学屏障，以及通过内吞作用进入靶细胞（基质黑素细胞）并且逃逸内体-溶酶体系统的降解。

与其他器官相比，眼睛的优势在于其具有免疫豁免特权，这意味着与其他器官相比，免疫系统对眼球内的外来物质相对不敏感。此外，由于该疗法是局部给药，没有系统吸收，所以预计不会产生脱靶效应。这些因素使得能够对眼睛进行安全有效的局部治疗。

实施例4

具有针对 OCA2 的 RNA 干扰（ RNAi ）的滴眼剂药物

生产一种滴眼剂药物，其通过靶向沉默OCA2基因诱导虹膜颜色变浅，从而有效抑制虹膜基质黑素细胞内的黑色素产生。这种治疗方法通过利用现有黑色素的自然光漂白作用，并阻碍新黑色素合成以维持色素平衡，从而启动渐进式脱色素过程。该治疗使得眼睛颜色能够沿着自然的人类眼睛颜色谱系进展，从深棕色到各种深浅的青绿色或灰色，具体取决于个体的反应和治疗持续时间。接受该治疗方案的患者可自主调整治疗强度以达到其偏好，允许在颜色谱系的任何期望点停止变浅过程，而无需达到完全无色素。这种定制化不是通过完全停止治疗来实现，而是通过延长给药间隔或过渡到维持剂量，从而保持已达到的眼睛颜色。

该治疗的美学效果复制了天然较浅色眼睛的外观，提供的虹膜颜色改变与天生具有浅色眼睛的个体无法区分。如果治疗调整为维持方案或增加给药间隔，则较浅的眼睛颜色得以维持。相反，如果治疗显著减少或停止，则虹膜中的黑素细胞恢复其合成黑色素的能力，从而开始逐渐恢复到虹膜原来的色调。这种色素再沉着过程类似于在许多婴儿虹膜中观察到的颜色变化，即最初较浅色的眼睛随着黑色素生产的增加而逐渐变深。通过这种方法，脱色素和色素再沉着的循环提供了一种可逆的、量身定制的用于改变虹膜颜色的解决方案，反映了眼内黑色素存在的复杂平衡。

该药物在到达虹膜基质中的黑素细胞后使OCA2基因沉默。给药后，该药物特异性靶向并抑制位于虹膜基质中的黑素细胞内的OCA2基因的活性。这种抑制导致OCA2表达减少，进而对黑素体的发育和功能产生负面影响。随着黑素体成熟效率降低和功能减弱，虹膜内的色素合成减弱，导致整体色素沉着下降。随着眼前房中基质色素沉着变浅，光线根据光学定律发生散射，并向观察者反射回明亮的颜色（例如蓝色和绿色）。所生产的药物由RNA治疗剂组成，例如siRNA或反义寡核苷酸（ASO）形式，它们具有至少一条与人OCA2 mRNA序列互补的序列。该序列由从OCA2 mRNA分子中选出的15个至30个核苷酸组成，该mRNA分子在某些人中包含大约3,143个核苷酸，例如，如SEQ ID NO: 65所表示。该RNA治疗剂通常不激活免疫系统，例如，它不增加细胞因子水平，诸如TNF-α或IFN-α水平。

实施例5

靶向 OCA2 的 siRNA 转染对 B16-F10 细胞中黑色素水平的影响

黑色素吸光度定量

在所有测试的光谱中，均观察到黑色素的线性回归，在OD405nm处背景略低。决定在360nm、410nm和490nm的吸光度波长处测量细胞中的黑色素。

细胞根据ATCC建议在37℃、5% CO2环境中用合适的培养基孵育。在接种后24、48和72小时进行检查和记录（包括拍照）。对于96孔板，使用CellTiter-Glo测定来测量活力。对于6孔板，细胞孵育最多至72小时后收集，用于RNA提取、RT-PCR和qPCR建立。

测试了不同的吸光度测量方法：直接在细胞上测量、裂解后测量或在培养基中测量（使用不同细胞浓度），如下文进一步详述。使用3种不同浓度的B16-F10细胞（通过在24孔板中接种3,000、7,500和15,000个细胞来制备）来校准黑色素测量条件。也接种了HEK-293细胞充当阴性对照细胞（无黑色素）。

黑色素吸光度测量涉及评估各种形式的黑色素：

1.直接在细胞上测量；

2.培养基中测量，基于Chung, S., Lim, G.J.和Lee, J.Y. Quantitativeanalysis of melanin content in a three-dimensional melanoma cell culture. SciRep 9, 780 (2019)中描述的方法；

3.在24孔板和12孔板中裂解后的细胞内黑色素。

测试了接种的细胞量与黑色素水平之间的相关性。

注意到B16细胞在达到汇合（应激状态）时产生更大量的黑色素。

在上文提及的所有三种方法中，唯一显示细胞量与分光光度计吸光度之间存在相关性的方法是—直接在细胞上测量，如图1所示。由于在裂解细胞和培养基中的测量不产生浓度依赖性结果，因此忽略这些方法。另外，直接在细胞上测量是最直接、技术依赖性较低、受“干预”较少的测定法。

然后用靶向OCA2基因的siRNA转染B16细胞。评价了三种不同序列的靶向鼠源OCA2的siRNA在两种浓度（20nM和50nM）下对B16细胞的mRNA敲低和黑色素脱色素效果：

OCA2 siRNA #1 –有义链：GAUCAUAUUUGAGAUUGUUTT，如SEQ ID NO: 70所表示；反义链：AACAAUCUCAAAUAUGAUCAG，如SEQ ID NO: 71所表示。

OCA2 siRNA #2 –有义链：CGAUGAUUCCUGUACUCCUTT，如SEQ ID NO: 72所表示；反义链：AGGAGUACAGGAAUCAUCGTA，如SEQ ID NO: 73所表示。

OCA2 siRNA #3 –有义链：GGUUGCUAAUUUUAGCUGATT，如SEQ ID NO: 74所表示；反义链：UCAGCUAAAAUUAGCAACCAG，如SEQ ID NO: 75所表示。

用上文提及的siRNA分子转染细胞，并使用FACS分析来测试转染效率。

转染后48小时采集细胞，提取其RNA并进行实时PCR分析，包括数据导出、熔解曲线分析，以及使用2–ΔΔCt方法计算倍数差异和标准化表达比率。RNA提取结果令人满意：吸光度比值260/280介于1.8至2.0之间，260/230介于2.0至2.2之间，并且无模板对照（NTC）的Ct值高于35。如图2所示，只有用OCA2 siRNA #1转染才导致细胞中OCA2表达的充分沉默。

OCA2敲减后的黑色素吸光度

直接在细胞上评估黑色素水平。与OCA2 mRNA敲低相关，OCA2 siRNA #1在所有3个波长（360、410和490nm）处使用分光光度法均显示黑色素减少。图3示出了使用上文提及的三种OCA2 siRNA在OD 360nm处的黑色素吸光度。显著降低基因表达的OCA2 siRNA #1也导致黑色素水平显著下降，进一步证实OCA2沉默与黑色素水平降低之间的联系。

实施例6

靶向 OCA2 的 siRNA 转染对葡萄膜黑素细胞中黑色素水平的影响

从死后人眼中分离原代黑素细胞的方法如下：根据《赫尔辛基宣言》的原则，组织获自眼库提供的眼球，捐献者均同意在其材料不适合移植时可以用于研究。

另选地或除此之外，使用葡萄膜黑素瘤92.1细胞系。细胞可以是任何葡萄膜黑素细胞：正常的、恶性的（诸如葡萄膜黑素瘤92.1细胞系）或永生化细胞，通过任何方法从任何哺乳动物物种获得：采集的原代细胞系或转化的iPSC或从细胞系供应商处购买。

用siRNA药物进行转染

然后将siRNA分子连同转染剂一起添加到培养物中。siRNA分子从Integrated DNATechnologies（IDT）购买，并按照制造商的说明进行转染。

分离的人原代葡萄膜黑素细胞按照制造商的标准方案用siRNA-LipofectamineRNAiMAX混合物处理。简言之，将人原代葡萄膜黑素细胞接种于不同的培养皿中。孵育24小时后（细胞单层达到60%至80%汇合度），用OCA2-siRNA或siRNA阴性对照（乱序siRNA）转染细胞。首先，用Opti-MEM GlutaMax培养基（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）洗涤细胞，然后用转染混合物（稀释的siRNA（分开）:稀释的Lipofectamine RNAiMAX = 1:1）进行转染，该混合物按照制造商的说明分别在Opti-MEM GlutaMax培养基中用siRNA和LipofectamineRNAiMAX制备。

阴性对照（如下文“对照组”所述）和OCA-2-siRNA均使用1nM至100nM的浓度范围。所有孔/皿具有相同的最终体积。在转染期间，细胞在转染混合物存在下培养4至48小时，然后用不含抗生素的新鲜培养基替换转染混合物。在新鲜培养基中孵育24小时后，收集细胞进行检查或重新接种以继续培养，以便在更长的时段内检查表型变化。

小干扰RNA（siRNA）的制备

另选地，为了靶向敲低OCA2，由Invitrogen（Carlsbad, CA, USA）基于来自OCA2基因的转录本（NCBI GenBank登录号NM_000275.3）合成OCA2 siRNA。示例性核苷酸序列如下：UAAAGAUUCCUGCUUUACAGA（有义链，如SEQ ID NO: 67所表示）和UGUAAAGCAGGAAUCUUUAGA（反义链，如SEQ ID NO: 2所表示）。阴性对照RNA治疗剂购自Thermo Fisher Scientific。

mRNA沉默的分析

为了量化虹膜黑素细胞中OCA2的沉默情况，对处理组和对照组培养物进行qRT-PCR。首先，通过裂解细胞并提取RNA来制备样品。作为下一步，使用逆转录酶将RNA逆转录成cDNA。添加OCA2基因的特异性引物和荧光探针后，建立qRT-PCR反应体系。使用qRT-PCR机分析反应，并收集数据。

另选地或除此之外，使用RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增（RLM-RACE）方法检测由于OCA2-siRNA作用导致的特定基因的切割（试剂盒购自Thermo-Fisher）。在该过程中，对降解的mRNA末端进行扩增和测序，以检测OCA2-mRNA的切割事件。

与qRT-PCR一样，首先从培养的细胞中分离总RNA，然后使用逆转录酶将其逆转录成cDNA。随后使用RNA连接酶将cDNA与特定的接头连接。该接头被设计成仅与RNAi产生的降解mRNA结合。连接cDNA后，通过聚合酶链式反应（PCR）生成大量降解mRNA的拷贝。为了鉴定靶基因的特异性切割位点，对扩增的cDNA进行克隆和测序。分析测序数据允许鉴定切割事件的具体位置和频率。

黑色素量分析：

分离原代黑素细胞并进行培养，随后以前一部分所述相同的方法进行转染。为了在转染后采集细胞，添加胰蛋白酶/EDTA溶液以便使其脱离并采集。采集后，用PBS洗涤细胞，重悬在提取缓冲液中，高温（70℃至100℃）加热0.5小时至2小时，然后转移到孔中。使用分光光度计设备在405nm处测量样本中的黑色素量。然后将处理细胞的黑色素含量与未转染siRNA的对照细胞的黑色素含量进行比较。

另选地，为了量化黑色素，采用上述方法，即在培养基中测量或直接在细胞上测量。

也可以在光学显微镜下观察黑色素。

透射电子显微镜（TEM）

下一步包括使用透射电子显微镜检查用OCA2-siRNA转染的细胞中黑素体的成熟阶段，并将处理细胞中黑素体的平均成熟阶段与对照细胞中黑素体的平均成熟阶段进行比较。这给出了OCA2-siRNA分子在减少黑色素产生中的有效性的指示。这可以用于评估OCA2-siRNA作为虹膜脱色素治疗的潜力。

TEM前包埋：

为了通过透射电子显微镜（TEM）观察组织，基于多种原因，包埋是必要的。首先，包埋保护样本在制备和成像期间免受损伤，从而保存组织的超微结构。此外，其能够制备TEM成像所必需的超薄切片。最后，它为组织样本提供结构支撑，使其能够被切片并装载到TEM载网上。

实验程序部分提供了代表性程序的描述。

经适当包埋后，使用透射电子显微镜（TEM）检查样本。观察并记录来自每个格子网格的单元。比较处理组与对照组之间的平均黑素体成熟度。

活力测试

进行活力测试以确定OCA2-siRNA是否损伤虹膜黑素细胞。活细胞与死细胞的区分基于各种机制，诸如膜完整性和正常代谢活性。

采用台盼蓝染色法：该染料穿透死细胞的膜并将其染成蓝色，而活细胞不被染色。使用显微镜和血细胞计数器，测定活细胞的百分比。通过比较经OCA2-siRNA处理的活细胞百分比与对照活细胞的百分比，可以确定处理毒性的程度。

在一种替代性方法（MTT测定法）中，将黄色化合物MTT添加到细胞中。活细胞中的酶会代谢该化合物，改变其化学组成和颜色，使其变为紫色。通过测量特定光波的吸光度，分光光度法对活细胞的数量进行计数。之后，将OCA2-siRNA处理的细胞的吸光度与对照细胞进行比较。

在另一种替代性的方法中，使用CellTiter-Glo测定法来测量活力。

实施例7

离体研究 — 小鼠虹膜外植体的活力

如上文实验程序部分中所详述制备小鼠虹膜外植体。随后进行了为期3周的离体虹膜培养和活力评估。

先前研究表明，离体采集的人虹膜可以培养延长的持续时间（TENENBAUM E,KORNBLUETH W. Cultivation of Adult Human Iris in Vitro.AMA Arch Ophthalmol.1958;60(2):312–318；以及Ringvold A, Nicolaissen B Jr. Culture of iris tissuefrom human eyes with and without pseudo exfoliation. Acta Ophthalmol(Copenh). 1990年6月；68(3):310-6）。其薄层结构允许充分的营养扩散，从而维持其存活能力。为了在虹膜上进行效率实验，评价了其在培养中的存活能力以及最佳条件。比较了三种不同的合理化培养基，即培养基A、B和C（如实验程序中所详述）随时间推移维持虹膜活力的能力。

最初采集了十二个虹膜，分为3组，每组4个虹膜，并在整个实验过程中在一种培养基（A、B或C）中培养。为了补充营养物和除去废物，每2-3天更换培养基。为操作方便，使用插入件（Millicell Hanging Cell Culture Insert，PET 0.4um，24孔（Mercury）；目录号：PTHT24H48）将虹膜从孔中取出进行培养基更换。

虹膜采集后，将其置于24孔板中的插入件上。孔中装有培养基，并在递送期间冷藏保存。

采用明场显微镜来捕获虹膜特征。每天在显微镜下检查虹膜的形态和细胞脱落情况，并拍照。

使用Presto Blue试剂进行活力测定。

在增益1100下测量荧光强度。如图4所示，在三周内，不同培养基（A、B和C –如上所述）之间的活力未见显著差异。该测定的荧光测量比吸光度更灵敏。虹膜在整个3周的培养中保持其大部分活力。

转染和荧光显微镜检查

所有虹膜均按照先前详述的既定方案培养，使用培养基A进行培养。该研究采用源自黑鼠的八个虹膜样本用于转染过程。用50nM荧光团偶联的对照siRNA（Thermo-Fisher的BLOCK-iT^™荧光寡核苷酸作为RNAi转染对照）与IDT定制的与荧光团偶联的乱序siRNA对虹膜进行转染。为建立比较基线，指定两个附加样本作为阴性对照，仅用Lipofectamine（不含siRNA）进行转染。在转染后20小时，采用荧光显微镜评估样本。转染的虹膜表现出对荧光团的成功摄取，其与核染色剂Hoechst呈现共定位，如图5所展示。这种共定位有助于鉴定细胞位置，并证实了转染过程的可行性。相比之下，阴性对照未表现出任何荧光，从而证实荧光信号对转染程序的特异性。

实施例8

离体研究 — 靶向 SOX10 基因作为替代

OCA2在虹膜的基质黑素细胞和虹膜色素上皮（IPE）中均有表达。因此，用OCA2siRNA处理虹膜并观察到OCA2表达减少，并不一定表明减少发生在靶细胞（基质黑素细胞）中。因此，OCA2表达减少并不自动意味着成功递送至预期的靶细胞群。此外，IPE构成小鼠虹膜中的主要细胞类型，并占虹膜的很大一部分。因此，即使OCA2表达减少仅在靶细胞群中实现，由于IPE细胞的高OCA2表达所产生的掩盖效应，其在相关基质黑素细胞中的减少也可能无法被检测到。这就是为什么使用递送基因替代物。

Sox10是在神经嵴来源细胞（包括黑素细胞）中表达的基因。

似乎在虹膜组织中，唯一表达Sox10的细胞类型是靶细胞（基质黑素细胞）（Mori T等人，SOX10 Expression as Well as BRAF and GNAQ/11 Mutations DistinguishPigmented Ciliary Epithelium Neoplasms From Uveal Melanomas. InvestOphthalmol Vis Sci.2017 Oct 1; 58(12):5445-5451）。

用siRNA使SOX10沉默，然后观察其在虹膜中表达的减少，是一种方法，最初在此用于观察siRNA在基质黑素细胞中的成功转染和功能。假设如果SOX10能够被沉默，那么经证明在体外对相同物种黑素细胞有效的OCA2-siRNA分子将在基质黑素细胞中使OCA2沉默。

培养小鼠虹膜组织并用于转染实验。遵循制造商的指南，使用LipofectamineRNAiMAX转染试剂将SOX10和乱序siRNA（各50nM浓度）转染到虹膜组织中。然后将虹膜在37℃下孵育。转染后24小时进行培养基更换。最后，在转染后48小时收集虹膜用于RNA提取。此外，还采集了一批未经过任何转染的虹膜充当附加对照，用于提取其RNA。

如上文实验程序中所述，从虹膜中提取RNA。然后使用标准方案将RNA样品逆转录成cDNA。

然后，进行定量PCR以评估GAPDH和SOX10基因的表达水平。

包括无模板对照（NTC）以及逆转录阴性对照（Neg ctrl RT）以确保qPCR结果的特异性和可靠性。

表达定量：使用2–ΔΔCt方法计算基因表达的倍数差异，以参考基因GAPDH进行标准化，并且与对照样本比较以确定SOX10的相对表达水平。图6展示了SOX10 siRNA转染后虹膜样本的SOX10表达。

在光照暴露下的活力

将具有可比较的活力指标的离体虹膜组织在标准培养箱中过夜（O.N.）培养。虹膜在两个独立的培养板中培养：一个暴露于放置在8厘米外的9W LED灯板（模拟环境光照暴露），另一个远离任何直接光源以充当对照。在整个实验中进行温度测量以确保虹膜的安全性。

暴露于光照过夜后，暴露组织的活力未显示任何显著下降。对于暴露于光照的组织，在Presto Blue中孵育2.5小时后的荧光活力读数在15,708至36,304相对荧光单位（RFU）范围内，平均活力为25,490 ± 8,007 RFU。相比之下，未暴露于光照的组织显示活力读数在12,990 RFU至31,942 RFU范围内，平均活力为24,876 ± 6,724 RFU。总体而言，所有样本的平均活力为25,207 ± 7,141 RFU。实验得出结论，与未暴露的虹膜组织相比，暴露于放置在8厘米外的9W LED灯板下过夜培养的离体虹膜组织没有显著的活力损失。

实施例9

利用小鼠虹膜样本的 OCA2 脱色素研究

本研究使用了九个小鼠虹膜样本，采集方法如本文档前文所详述。这些虹膜在培养基A中维持，并按照本文所述的方案孵育，每2至3天更换一次培养基（如先前研究所述），以保持其活力。每周进行三次的活力评估显示，虹膜在整个研究过程中保持其活力。处理组之间在活力上没有显著差异，表明这些处理具有良好的耐受性。使用了上述实施例5中经证实在B16黑素瘤细胞培养中降低OCA2-mRNA水平超过50%的相同OCA2 siRNA序列[OCA2siRNA #1 –有义链：GAUCAUAUUUGAGAUUGUUTT，如SEQ ID NO: 70所表示；反义链：AACAAUCUCAAAUAUGAUCAG，如SEQ ID NO: 71所表示。]

虹膜的转染于第1天开始，随后在第4、8和11天进行转染（总共4次转染，每3至4天一次）。每个虹膜在整个实验期间（全部4次转染）持续接受其分配的处理。6个虹膜接受50nM或100nM的OCA2 siRNA（“处理组”），另外3个虹膜接受100nM的乱序siRNA（“对照组”）。为减轻实验设置中的位置偏差，各组在板上采用交错分布的方式排列。每次转染均根据制造商的建议使用Lipofectamine RNAiMAX；虹膜在更换培养基以去除任何残留的转染试剂或siRNA前孵育24小时。

虹膜样本的照明条件如实验程序部分中所详述进行严格控制。

在实验基线时和第14天（第4次转染后3天，并在即将固定和组织学评价处理前）使用配备有Laowa 25mm f/2.8 2.5-5X超微距镜头的Panasonic Lumix G9相机进行成像，如实验程序部分中所详述。

经过全面努力，图像中可观察到的结果显示，经OCA2-siRNA处理的虹膜颜色发生巨大变化，而对照组未见此类变化（图8）。

视觉分析显示，经处理受试者的虹膜颜色发生显著且明显的变化（参见图8A至图8B，尤其在虹膜周边观察到明显差异），与阴性对照组中未改变的虹膜颜色形成鲜明对比（参见图8C至图8D，未观察到显著变化（即便有），包括周边区域）。

成像分析

使用ImageJ软件进一步分析图片。仔细掩蔽帧内的虹膜区域，以便对其边界内包含的像素进行特异性分析，并据此确定平均颜色饱和度。虹膜的背景是相同的白色漫射器（cyngustech），在所有图像中保持一致，并且在每张图像中测量其颜色饱和度（每个像素可以在0至255之间变化，0表示无颜色饱和度，255表示最高颜色饱和度）。然后，通过减去背景的颜色饱和度对每张图像中每个虹膜的颜色饱和度进行标准化。因此，保持所有图片之间的标准化。针对特定虹膜，将其在基线拍摄和第14天拍摄中获取的所有图像的颜色饱和度值进行平均，以进一步提升准确性。据此计算每个虹膜的处理前和处理后颜色饱和度值。

在Andersen等人2013年发表的工作中（Andersen JD等人，Genetic analyses ofthe human eye colors using a novel objective method for eye colorclassification. Forensic Sci Int Genet. 2013年9月；7(5):508-15），研究人员分析了不同虹膜颜色的图像，并使用HSV颜色空间测量眼睛颜色。HSV颜色空间的S分量有效地区分了虹膜的蓝色区域和棕色区域，并且显示蓝色区域与棕色区域之间的像素值差异最大。他们得出结论，颜色饱和度在定量眼睛颜色研究中可能是首选。

蓝眼中的蓝色主要来自光的瑞利散射。这种散射效应稀释了颜色强度，因为更多的波长混合在一起，导致感知到的颜色饱和度较低。存在的用于吸收光线的黑色素较少，因此颜色不那么鲜艳（颜色饱和度较低）。

棕色虹膜比蓝色虹膜含有更多黑色素，但尚未达到吸收所有光线的程度。这种最佳水平的黑色素允许棕色虹膜吸收足够的光线以减少散射，同时仍反射足够的光线以呈现黑色素的自然颜色。结果是更强烈、鲜艳的颜色，并且因此更高的感知颜色饱和度。

在Liu等人2010年的文章中（Liu F等人，Digital quantification of human eyecolor highlights genetic association of three new loci. PLoS Genet.2010年5月6日；6(5):e1000934），提到将数字提取的虹膜（眼睛）颜色量化为两个区间维度：色调（H）和颜色饱和度（S），同时文章中的图表清楚地呈现棕色虹膜比蓝色虹膜饱和度更高。

由于黑色素丰富，黑色虹膜吸收绝大部分光线，只有很少部分反射回观察者。这种吸收导致缺乏感知颜色，因此在颜色特性方面将黑色与低或无颜色饱和度的概念联系起来。

在对不同眼睛颜色图片进行的分析中，黑色（非常深的棕色）或蓝色的虹膜与分析的所有图像中饱和度最高的棕色虹膜相比，饱和度显著较低。总之，预计棕色虹膜比黑色（或非常深的棕色）虹膜具有更高的颜色饱和度。在从100%黑色（100%吸收）到棕色物体的光谱上，物体越接近纯黑色，其饱和度越低，反之亦然。

图像分析的结果详细呈现在表1中。虹膜A至F被分配接受OCA2-siRNA处理，而X、Y和Z则接受乱序siRNA。在基线时，各组的平均颜色饱和度（经背景标准化后）几乎相同（255分量中的48对49）。在虹膜的后处理图像中，两组之间存在明显区别（67对53）。

表1：由背景饱和度标准化的虹膜饱和度。

为计算每个虹膜颜色饱和度的百分比变化，应用了以下公式：

实验后平均颜色饱和度变化显示，处理组比对照组呈现颜色饱和度增加的明显趋势，如图9所示。

组织学评价：

随着经OCA2-siRNA处理的虹膜颜色饱和度增加（这一现象与更亮的棕色虹膜相关联），组织学分析显示，与在相同光漂白条件下用乱序siRNA处理的虹膜相比，这些虹膜表现出的色素沉着较少。图10提供了代表性显微图像。

对照处理的虹膜未显示脱色素的证据（图10B，图10C）。这些组织的组织学状况类似于未经处理（也未光漂白，图10C）的DBA/2J小鼠虹膜，该虹膜在解剖后数小时内固定并在显微镜下观察，未经任何干预处理。

实施例10

离体研究 — 人虹膜外植体的脱色素

从死后人眼中分离人虹膜的方法如下：根据《赫尔辛基宣言》的原则，组织获自眼库提供的眼球，捐献者均同意在其材料不适合移植时可以用于研究。

摘除眼睛，并解剖出葡萄膜（在角膜缘后面8mm的巩膜上做环形切口）。切除眼球的前部，包括前部巩膜、晶状体、虹膜和睫状体，并置于培养皿中）。在虹膜根部提取虹膜，随后将虹膜放入培养皿中，其后表面朝下。

细胞在培养基A中于24孔板、12孔板或更大的板中培养。每隔几天更换培养基。

每几天在Presto Blue中和显微镜下评价活力。

如小鼠离体实验中所述，用荧光标记的靶siRNA（诸如Cy5）评价转染效率，然后通过荧光和共聚焦显微镜观察。

如小鼠离体实验中所述进行SOX10敲低qPCR。

如小鼠离体实验中所述进行脱色素测定。

通过图像分析（如本文所述）、组织学检查或任何其他旨在量化黑色素水平的可用方法测量黑色素减少。在初始脱色素阶段之后，实验通过停止OCA2沉默处理而延长，同时继续将虹膜外植体维持在培养基A中存活。此停止期允许观察虹膜是否可能重新获得其色素，旨在记录其色素再沉着回原始色素沉着水平的过程和速率。色素再沉着评估包括通过图像分析、组织学检查和其他黑色素定量方法随时间推移监测黑色素合成，类似于初始脱色素测定。

实施例11

体内研究 — 哺乳动物虹膜基质黑素细胞的靶向脱色素

对啮齿动物（小鼠或大鼠）、兔科动物（例如，新西兰兔、荷兰带兔或欧洲兔）、灵长类动物（例如，食蟹猴）或猪科动物（例如，家猪）或任何其他哺乳动物，用OCA2-siRNA的眼内注射或滴眼剂进行处理。如本文所述，该分子根据以下规格进行设计（有关siRNA序列的更多详细信息见下文）。在该过程中，用麻醉剂（诸如氯胺酮（5mg/kg）和甲苯噻嗪（5mg/kg））麻醉哺乳动物，然后用浓度为0.1%直至6%、体积与哺乳动物眼睛大小成比例的活性成分处理。

针对哺乳动物的OCA2-siRNA被设计成与其OCA2 mRNA匹配。例如，兔子的OCA2mRNA序列检索自美国国立卫生研究院的GenBank数据库（>XM_008269748.3预测：家兔OCA2黑素体跨膜蛋白（LOC100340522），转录变体X1）。示例性核苷酸序列如下：GCAUCUAGAGAACAAAGAUGG（有义链，如SEQ ID NO: 68所表示）和AUCUUUGUUCUCUAGAUGCAU（反义链，如SEQ ID NO: 69所表示）。进一步优化以设计最有效的沉默序列，如下文进一步详述。

如先前所述（Kodjikian L等人，(2010) Invest Ophthalmol Vis Sci.51(8):4125–32），对动物受试者进行玻璃体内或前房内注射，注射物为含有OCA2-siRNA（裸露/与转染试剂偶联/与转染试剂混合）和/或SOX10-siRNA的混合物（对于替代实验，则使用荧光团偶联的RNA，诸如用于荧光生物分布实验的BLOCK-iT）。向对侧眼或对照组给予阴性对照（经验证不靶向该物种任何mRNA的乱序siRNA）的眼内注射，阴性对照也可以是未处理的，或者用PBS或单独载体处理的。

OCA2-siRNA在体内被虹膜黑素细胞有效摄取

在前房内施用OCA2-siRNA后，将荧光Cy5标记的siRNA注射到虹膜中。在注射后数小时至数天采集虹膜，并通过荧光/共聚焦显微镜评价荧光分布。另选地，将眼组织分解成单细胞，然后在注射后数小时至数天通过荧光激活细胞分选（FACS）分析分选其荧光。Cy5染色的存在与siRNA被细胞摄取一致。将Cy5标记的siRNA前房内注射，然后该siRNA扩散到虹膜细胞/黑素细胞中，在注射后数小时测量这些细胞内的荧光信号，并评估该荧光信号在这些细胞中的持续时间。Cy5荧光染料被细胞摄取后，产生明亮的荧光信号。然后可以测量该信号并用于确定siRNA是否已被细胞摄取。

为加强研究结果，还使用原位杂交法，用与OCA2-siRNA指导链互补的放射性标记寡核苷酸探针检测虹膜中的OCA2-siRNA。通过在一次前房内注射后使用“茎环”qPCR方法，发明人测量了注射后OCA2-siRNA在虹膜中仍可检测到的时间长度，以及其在组织中的哪些细胞中。

此外，为评估荧光团标记的siRNA在活体受试者虹膜中的生物分布，哺乳动物通过滴眼剂或眼内注射接受siRNA。给药后，用异氟烷（1.5%至2%）在氧气（流速1.5L/min）中麻醉受试者。使用IVIS Spectrum成像系统（Perkin Elmer, UK），针对该荧光团设定特定滤光片参数，以预定时间间隔对虹膜进行成像。使用LivingImage软件对荧光强度和分布进行分析，在所有受试者的虹膜内一致定义感兴趣区域（ROI）。这种方法允许对siRNA分布进行定量评价，这对于理解其在眼组织内的递送和定位至关重要。

OCA2-siRNA减少经处理眼中的OCA2-mRNA和/或作为替代物的SOX10

在注射后数小时至数天，从注射OCA2-siRNA和对照的眼睛中解剖出虹膜（参见离体解剖），经由珠子破碎（匀浆）。提取RNA，并最终（参见离体RT-PCR）进行qPCR分析，以证明OCA2-siRNA降低处理眼中的靶mRNA表达。对OCA2-siRNA处理的动物与对照动物中的OCA2mRNA水平表达情况进行比较。还沉默并测量了替代基因SOX10，以证明沉默精确地发生在黑素细胞中。虹膜由不同种类的细胞组成，其中基质黑素细胞和虹膜色素上皮都表达OCA2（两者都在黑素体中合成黑色素）。但只有基质黑色素细胞表达SOX10。敲低SOX10（仅在虹膜内的黑素细胞中表达的基因）不仅证明靶细胞的可转染性，而且证明siRNA在这些细胞内是有效的，并且能够利用细胞机制（即RISC）来影响基因表达。

OCA2-siRNA在体内诱导特异性的RNAi介导的OCA2-mRNA切割

为验证siRNA活性是由OCA2-siRNA在动物虹膜中玻璃体内给药后特异性诱导的，使用RNA连接酶介导的cDNA末端快速扩增（RLM-RACE）方法检测动物虹膜中OCA2特异性切割产物的存在。

从注射OCA2-siRNA的眼睛生成的RACE产物从凝胶中洗脱，然后进行克隆和测序，以确定切割是否发生在OCA2 mRNA中的预测位点处。为证明只有OCA2-siRNA能够切割OCA2-mRNA，对从媒介物处理的眼睛（阴性对照）和OCA2-siRNA处理的眼睛使用相同程序获得的测序克隆进行相同的分析，以便验证未检测到OCA2-siRNA介导的切割。

光源与脱色素：

据认为，基质黑素细胞中的黑色素不断暴露于光线，并且经历光漂白（总是如此，但在光照暴露下更快）与合成以维持色素平衡。终生眼睛变亮是罕见的，当发生时，通常与某些病理有关，诸如Fuchs异色性虹膜睫状体炎，甚至某些霍纳氏综合征病例（Beynat J,Soichot P, Bidot S, Dugas B, Creuzot-Garcher C, Bron A. J Fr Ophtalmol.2007年9月；30(7):e19），因为黑素细胞在积极合成黑色素。研究表明，即使在从成人虹膜采集的基质黑素细胞中，也会产生新的黑素体（Hu DN, McCormick SA, Orlow SJ, Rosemblat S,Lin AY, Wo K. Melanogenesis by human uveal melanocytes in vitro.InvestOphthalmol Vis Sci.1995年4月；36(5):931-8）。光漂白是一种物理现象，其无法在组织中直接暴露于光子的第一线色素细胞中避免。

因此，确定受试者在用OCA2-siRNA进行脱色素期间的光照暴露会影响脱色素的持续时间。已知与黑暗条件相比，光照暴露下光漂白发生率很高（Mokrzyński K, Sarna M,Sarna T. Photoreactivity and phototoxicity of experimentally photodegradedhair melanosomes from individuals of different skin phototypes.J PhotochemPhotobiol B.，2023年6月；243:112704）。人类在日光暴露量上存在显著差异–取决于地理位置、生活方式、职业、季节、文化习俗和其他参数。除日光外，人类在活动期间还暴露于人造光或室内照明，并且这种光的焦耳量差异很大。因此，在实验期间测试了几种光照条件，从中可以确定针对希望安全加速其脱色素过程而不造成伤害的用户的光照暴露建议。

在研究的初始日，发明人首先使用了从一位年轻女性和一位年轻男性捐赠者均匀剪裁的人头皮头发进行放置。男性的头发表现出较深的色素，特征为深棕色至黑色，而女性的头发则是较浅的棕色色调。在收集前，头发仅经过洗发水和护发素的标准清洁程序，未接触任何化学处理。样本分为两组，每组包含来自两个个体的发干，并同时引入不同的环境条件。对照组储存在避光环境中，而实验组则接受光漂白，放置在距离9W 6500K LED光源不到10厘米的位置。这种相同的照明设置后来被用于离体脱色素研究。在整个实验持续时间期间仔细记录温度测量值，以确保灯的热输出不影响周围环境，从而确认LED灯在最小化产热方面的效率。在第十天的观察显示变化极小，但截至第二十二天，在女性头发试样中，色素沉着的显著差异明显可见（参见图7A、图7B）。该实验对于校准诱导黑色素降解所需的最佳光强度至关重要。

光漂白现象与拥有较浅头发色调的个体的观察结果一致，这些头发在夏季趋于变亮，在冬季变深，这一过程先前在各种研究中已有记录，表明LED光可以促使脱色素。需要重点说明的是，发干没有活细胞，因此无法随时间推移合成黑色素。然而，活的色素组织（诸如虹膜）维持黑色素稳态。在具有较深虹膜的个体中，暴露于光触发基质黑素细胞内的黑色素降解—这一过程在浅色眼睛的个体中不存在或显著减少。尽管如此，黑素细胞继续合成新的黑色素，确保例如，棕色眼睛的个体在阳光暴露下不会经历眼睛颜色变浅。根据美国眼科学会（AAO）的说法，眼睛颜色的变化通常是病理学的标志。然而，在黑色素合成被有意抑制的情况下，光照暴露可以充当用于减少色素的催化剂。

此外，已证明与黑暗相比，在光照暴露下黑色素降解加快。任何形式的光照暴露，无论是来自太阳、环境光源，还是治疗灯，都可以加速色素减少，从而可能促进组织颜色变浅，包括从棕色眼睛到蓝色眼睛的转变。可能加速黑色素分解的附加方法—与抑制新黑色素生产相结合，诸如药物治疗或行为干预，例如长时间的水禁食，或者利用具有更高自噬率的遗传倾向或加速黑色素降解能力的动物模型。

表型分析

通过以下方法评价虹膜颜色的表型变化：

注射OCA2-siRNA后，进一步评价siRNA的脱色素效果。检查动物眼睛以确定前部虹膜色素沉着是否已在整个虹膜表面（整体性与点状）丢失。其目的是确定沉默的下游效应的模式和分布。每天拍摄用OCA2-siRNA处理的眼睛和未处理的眼睛或用阴性对照（PBS/或乱序siRNA）处理的眼睛的照片。眼睛的颜色变化通过肉眼观察（或采用计算机化软件分析，诸如先前所述（Andersen JD等人，(2013) Forensic Sci Int Genet. 7(5):508–15），将注射眼（注射siRNA）与对照眼（注射对照乱序siRNA）进行比较。该方法允许根据经验量化眼睛颜色及其变化。在整个研究过程中，定期（每隔几小时或每隔几天）评价色素沉着的量。此外，评价虹膜变得苍白、几乎无色素所需的时间长度。之后，持续进行测量以确定效果是持续、逆转，还是发生了任何其他变化。还评价色素再沉着持续时间。结合眼部褪色时间—这些持续时间有助于确定未来疗法的治疗方案：脱色素的治疗间隔（实现浅色眼睛）、维持间隔（维持已达到的效果—可能在人类眼睛颜色谱系上的任何位置，例如棕绿色）以及用户在停止治疗后恢复到其原始眼睛颜色所需的时间（虹膜中的天然黑色素聚集—类似于出生时蓝眼睛的婴儿在几周到几个月内发生的变为棕色的过程）。

在显微镜下虹膜色素沉着分析

为了进一步评价虹膜色素沉着的减少，对动物实施安乐死并摘除其眼睛。然后，经由光学显微镜和/或透射电子显微镜对动物组织进行彻底的组织学检查。

使用透射电子显微镜（TEM）评价动物虹膜中黑素体的成熟阶段。将OCA2-siRNA处理的动物虹膜基质中位于I-II期的黑素体百分比与对照动物虹膜基质的百分比进行比较。还对处理动物虹膜中IV期黑素体的百分比与对照动物虹膜中的百分比进行比较。还评价了IPE和RPE，以确定那里是否也发生了色素沉着丢失。通过这种方式，可以确定该治疗是否影响虹膜基质中的黑素体，以及是否改变其他重要眼组织中的色素沉着量。

OCA2蛋白量的量化：

将虹膜在裂解缓冲液中匀浆，并使用Bradford蛋白测定法（德国Roche）测量总蛋白。在动物OCA2的ELISA测定法之前，对样本进行总蛋白标准化。这样做是为了确保准确地测量每个样品中的OCA2的量。然后使用ELISA测定法比较注射了OCA2-siRNA的动物和对照动物中的OCA2蛋白水平。

不良反应

在基线时进行裂隙灯检查，然后进行视网膜电图检查。裂隙灯检查用于检查眼睛的结构，诸如角膜、虹膜和晶状体。它可以检测疾病或损伤的迹象。然后使用视网膜电图测量眼后部细胞产生的电脉冲，这有助于诊断某些眼部病变。在整个研究过程中进行一系列眼科检查，以便评估不良反应并捕捉眼睛的任何变化。

在研究期间，测量动物的所有其他参数（包括体重）。检查角膜和虹膜是否存在病理变化。检查前房的炎症和发红。进行镜片的检查以确定其透明度。彻底检查结膜、巩膜和眼后段。此外，使用OCT检测眼睛的结构变化。此检查的目的是确定眼睛是否因药物发生任何变化，诸如触发炎症、诱导感染，导致白内障、青光眼或任何其他眼部异常。

在研究期间，检查整个动物的毛发是否有色素减退或脱色素。此外，收集皮肤样本并在显微镜下检查，以便评估表皮黑素细胞中黑素体的成熟情况。旨在确定总体黑素体阶段的脱色素和退化。如果发生这种情况，可能表明OCA2-siRNA抑制毛囊中OCA2的表达，这意味着全身效应或局部治疗在眼睛和眼睑附近的溢出。

实施例12

滴眼剂制剂筛选以优化基质黑素细胞的生物分布

测试的制剂不仅必须匹配生理pH值以确保相容性，而且还必须随时间推移表现出稳定性，以保证活性成分的有效性得以维持。

引发刺激的制剂可能导致泪液分泌增加，并且在眼睛试图抵抗这种刺激时造成潜在的组织损伤。该反应可能显著影响眼部药物的生物分布，这凸显在体内实验早期阶段就开发无刺激性制剂的重要性。

粘性化合物（包括凝胶）因其在诸如结膜等眼部组织内滞留时间延长而备受关注，为延长药物递送提供了一条前景广阔的途径。本研究既涵盖稠度高达凡士林状的粘性制剂，也涵盖水溶液，同时还结合了对可商购获得的滴眼剂的分析。这种多方面的研究方法还包括对市场产品的逆向工程，以及针对药物在虹膜中分布的针对性报告和附带性报告进行全面文献综述。优选经FDA（美国食品药品监督管理局）和EMA（欧洲药品管理局）等监管机构批准用于眼科应用的赋形剂，因其具有已确立的安全性特征和监管熟悉程度。

为延长药物在眼部表面存留的持续时间，考虑使用具有滞留能力的粘性材料。然而，这些物质可能限制siRNA分子的释放。鉴于siRNA是水溶性的，但需要穿透脂质屏障才能有效到达眼内靶标，因此探索各种基于脂质的液体或双相制剂可能提供一条可行途径。在批准浓度范围内应用紧密连接穿透剂，诸如苯扎氯铵（BAK），可以进一步增强siRNA通过关键眼部屏障（包括角膜、结膜、巩膜、睫状体和虹膜）的渗透性。该策略性方法强调在制剂稳定性、相容性和渗透性之间取得微妙平衡的必要性，以优化眼部药物递送。

对啮齿动物（小鼠或大鼠）、兔科动物（例如，新西兰兔、荷兰带兔或欧洲兔）、灵长类动物（例如，食蟹猴）、猪科动物（例如，家猪）、犬类动物（例如，家犬）或任何其他哺乳动物，用含有OCA2-siRNA（与受试者物种mRNA（部分或完全）互补，能够敲低其OCA2表达）的滴眼剂进行局部处理。

在该体内实验中，通过局部眼部递送策略施用含有siRNA的制剂（下文称为“测试药物”），以增强其在前房的分布并绕过眼部屏障。一种方法包括将光学隐形眼镜浸入测试药物中，然后将镜片戴到眼睛上。在不同的方法中，将测试药物直接滴于眼部表面，随后佩戴隐形眼镜以维持制剂位置，并防止因泪液动力学造成的分散。然而，在另一种方法中，对动物受试者进行镇静以确保眼睛保持睁开，从而允许精确滴加药液，并防止不自主的眨眼或动作分散药物。测试药物也直接施用于眼睛，随后与玻璃表面接触，以利用表面张力防止液体制剂溢出。

可以考虑每日多次重复施用该滴眼剂，但在涉及镇静时，需限制在每日不超过两次，以减轻对动物的应激和潜在伤害。试图延长滴眼剂与眼表的接触时间，范围控制在5分钟至20分钟之间，以促进药物吸收和生物利用度的最优化。治疗是单侧或双侧。

如上文所详述，多种含有活性成分的制剂作为滴眼剂局部应用。施用后，对每种制剂进行生物分析评估，以评价其递送效果，所采用的方法与前述实施例中描述的方法相似。分析包括：

使用偶联标记物，诸如荧光团偶联的siRNA、β-半乳糖苷酶或其他能够在处理后24小时通过显微镜检查显示组织和细胞分布的试剂。需考虑这些偶联物对整个分子药代动力学的潜在影响。

施用含有OCA2-siRNA或SOX10-siRNA作为活性成分的制剂。处理后48小时，采集虹膜，提取其RNA，并使用qPCR（如前所述）进行分析，以评价任何敲低效应。该分析有助于确定由制剂赋予的生物分布。

应用原位杂交技术进一步研究测试药物向组织的递送，以及利用IVIS成像（尽管其分辨率较低）来获取对制剂总体分布模式的宏观了解。

这些方法共同建立了一个用于评价每种滴眼剂制剂的生物分布并鉴定最佳制剂的综合框架。

通过该过程，对最佳滴眼剂制剂进行严格筛选，以评估其与活性成分的相容性，并对其生物分布和药代动力学特性进行彻底评价。该评估包括对化学属性（诸如pH水平）的详细检查，以确保制剂的安全性和稳定性。这进而保证其在眼部使用的有效性和适用性。此外，还仔细考虑了高效扩大生产的潜力。

在本实施例中，正在测试一种包含纯化水、苯扎氯铵、氯化钠、羟丙基甲基纤维素和磷酸钠缓冲液的基础滴眼剂制剂向眼睛递送OCA2-siRNA的能力。对这些组分的选择基于其在眼部应用中的既定用途，重点在于确保制剂与眼部组织的相容性以及siRNA在眼内的有效分布。

实施例13

0 期临床试验

进行一项0期临床试验，以评价局部应用的含OCA2-siRNA的微剂量滴眼剂的安全性、耐受性、药代动力学和药效学。招募十至十五名健康人类志愿者，优选已拥有明亮眼睛者，以避免治疗引起的任何不对称性。受试者必须是18岁或以上并且健康的，以便参与研究。孕妇或哺乳期妇女、有眼病或眼科手术史的个体，以及已知对药物任何组分过敏的患者被排除在研究之外。

向研究中的受试者单侧施用固定微剂量的OCA2-siRNA滴眼剂。OCA2-siRNA药物根据siRNA设计进行选择（如下文进一步详述）。对侧眼作为对照。

密切监测志愿者与治疗相关联的不良反应或副作用。监测项目包括他们的视力、眼压以及眼睛结构或功能发生的任何变化。还使用体液样本（诸如血液、尿液和泪液）测量体内的siRNA水平。此外，检查皮肤和毛发的色素减退迹象。另外，通过包含监测体液和组织样本中OCA2-siRNA存在情况的分析，评估药物的生物分布。

为了评估治疗的任何长期影响，在治疗期后对志愿者进行随访。试验由研究人员和医生团队密切监督。基于从0期试验收集的数据，评价siRNA滴眼剂的安全性和生物分布。采取此项预防措施确保在后续使用更大样本量的研究中进行评价之前，该药物不会引起副作用或不会分布到身体不需要的部位。

实施例14

II/III 期临床试验

本研究的目的是评价局部应用含有全剂量OCA2-siRNA的滴眼剂的有效性和安全性。招募过程涉及招募几十至几百名健康人类志愿者。受试者必须年满18岁或以上，并且拥有非蓝色眼睛（例如，棕色、淡褐色）或患有异色症。怀孕或哺乳期个体、有眼病或眼科手术史者，或者已知对药物任何组分过敏者被排除在研究之外。进行基线裂隙灯检查并拍摄临床照片，然后将图像扫描进计算机，使用诸如先前所述（Andersen JD等人，(2013)Forensic Sci Int Genet. 7(5):508–15）的校准软件包进行分析，并记录。在整个研究过程中，在相同条件下（即，光照条件、相机角度、一天中的时间等）拍摄随访照片。这确保在研究过程中收集的数据准确且一致，并且虹膜颜色的任何变化都可以归因于治疗，而非环境或用于收集数据的设备的变化。

该研究在多个研究中心以双盲方式进行。采用随机化方法将参与者分配至治疗组或安慰剂组，这些组别在数月内每周一次接受固定剂量的OCA2-siRNA或安慰剂滴眼剂。OCA2-siRNA药物根据（参考siRNA设计）进行选择。在这种情况下，对侧眼用作对照。这使研究人员能够比较OCA2-siRNA的效果与安慰剂的效果，并且确定OCA2-siRNA药物是否产生积极效果。

在本研究中，主要结局是通过标准化的比色法测试/计算机化测试（诸如，如前所述测量虹膜颜色饱和度随时间推移的变化）或眼科医生的视觉检查，确定实现更明亮的眼睛颜色。次要终点包括与患者基线相比，通过标准化比色法测试或计算机化图像分析测试测量的色素沉着融合度以及眼睛颜色、颜色饱和度与亮度的百分比变化。在基线、整个研究和结束时进行测量。另一个次要终点评价在设定时间段内是否发生显著的颜色变化。在整个临床试验期间，密切监测药物的全身性和眼部组织不良反应。这些包括但不限于常规眼科检查（诸如裂隙灯检查和光学相干断层扫描）以及监测全身性副作用，诸如视力变化、头痛、血液检测指标，或者皮肤和毛发的色素沉着变化。

对照组

为了评估所公开的治疗的有效性和安全性，使用对照组。对照组包括例如未接受干预的受试者、接受空载体（即，仅含转染剂/纳米载体，无核酸）的受试者，或者接受非靶向siRNA序列的受试者，其中非靶向siRNA序列的核苷酸组成相同，但序列不同（序列经过乱序重排，并经过BLAST比对以验证该对照不靶向哺乳动物的任何mRNA）。

实施例15

在深度 siRNA 序列中

下表2中提供了序列表。

表2：RNA序列的示例

本文各实施例中所呈现序列的长度仅为说明性而非限制性；实际使用的序列可以基于所述序列在长度上有所变化，并且可以包含如本文所述的附加核苷酸或更少核苷酸。

附加的siRNA序列及其靶标由SEQ ID NO.78至200公开，其中大部分发现于以下靶区域：375-420、1270-1370、1500-1600、1900-2400和2610-3143。本公开提供RNA治疗剂（siRNA、ASO和其他RNA）。在RNA治疗剂由siRNA分子组成的实施方案中，其包含至少两个核苷酸序列，即有义序列和反义序列。有义链选自表2中所示的序列组。有义链的反义链选自表2中列出的序列。在这方面，这些序列之间存在互补性。反义序列与由OCA2表达产生的mRNA序列高度互补。

因此，一种siRNA包含两条寡核苷酸，其中一条寡核苷酸在表2中被描述为有义链，第二条寡核苷酸在表2中被描述为该有义链的反义链。本发明的一个实施方案中，siRNA的基本上互补的序列包含在分开的寡核苷酸上。在另一个实施方案中，在单个寡核苷酸上存在两个基本上互补的dsRNA序列。

在RNA治疗剂由ASO分子制成的实施方案中，其含有至少一个核苷酸序列。ASO序列与由OCA2表达产生的mRNA序列高度互补。

表2中所呈现的RNA鉴定OCA2转录本内通常易于发生RNA诱导沉默复合物（RISC）介导切割的一些位点，或能够以多种本领域技术人员所熟知的方式降低基因表达的替代性通路。因此，本发明也包括靶向一个或多个这些位点的RNA治疗剂。在该背景下，RNA治疗剂被定义为靶向RNA转录本内的特定位点。鉴于RNA治疗剂在该特定位点处促进切割，该转录本很可能将被切割。包含来自其中一个序列的至少15个连续核苷酸的RNA治疗剂示例在表2中列出。作为该过程的一部分，这些核苷酸序列可以与从OCA2基因中所选择序列的相邻区域获取的附加核苷酸序列偶联。

构成RNA治疗剂的每条寡核苷酸的长度可以在约15个至约30个核苷酸的范围内。

在RNA治疗剂为siRNA的实施方案中，寡核苷酸通常足够长，以充当Dicer酶的底物并且/或者用于RISC复合物中。例如，本领域熟知长度超过21至23个核苷酸的dsRNA可以充当Dicer的底物。对本领域普通技术人员而言，靶向切割的RNA区域通常是更大RNA分子的一部分这一点也是显而易见的。最常见的是信使RNA（mRNA）分子。

当siRNA分子被加载到RNA诱导的沉默复合物（RISC）上时，siRNA分子的反义链（指导链）充当指导识别并结合到特定的靶RNA，诸如OCA2-mRNA。一旦RISC与靶RNA结合，其催化组分Argonaute便切割该RNA，从而导致其降解。这导致对应基因（例如OCA2）的敲低。通过降解靶mRNA，RISC阻止其被翻译成蛋白质，从而阻止该基因表达。这进而导致该基因沉默，从而在基因调控方面产生预期效果。

RNA治疗剂能够以完全在本领域技术人员知识范围内的多种方式减少靶基因的表达。举例来说，siRNA可以通过RNA诱导的沉默复合物（RISC）切割靶mRNA链，或通过阻断核糖体接近mRNA来抑制翻译。ASO分子可以例如通过与靶mRNA形成双链体使RNase H酶能够切割它，或通过结合到mRNA并阻断其接近核糖体从而阻止翻译来实现类似的结果。

本文报告的每个实施例中均使用NIH GenBank数据，其中采用适当哺乳动物物种（例如，兔、猴、人等）的OCA2-mRNA序列。为设计RNA治疗剂的序列，在GenBank数据库中搜索感兴趣物种并审查其OCA2 mRNA序列。

另选地，如果GenBank数据库不包含所研究特定物种必需的OCA2-mRNA序列，则可以采用RNA测序（RNA-Seq）来阐明靶mRNA序列。该过程包括从感兴趣物种中分离RNA，将其转化为互补DNA（cDNA），随后进行高通量测序。通过分析序列数据，使得能够鉴定物种特异性OCA2-mRNA序列。一旦确定，便如本文所述精心设计小干扰RNA（siRNA），以精确靶向并沉默特定物种中的OCA2基因。一旦已鉴定哺乳动物的OCA2-mRNA序列，旨在沉默该基因的RNA治疗剂就按以下方式设计：

RNA核苷酸的类型

该方法包括向受试者施用核糖核酸（RNA）。例如，该RNA治疗剂是一种siRNA，该siRNA包含有义链和反义链，形成双链区，该双链区由与适当mRNA分子核苷酸序列相差不超过四个核苷酸的至少15个连续核苷酸组成，从而形成互补区。一个突出的示例是NCBIGenBank中的人类OCA2 mRNA变体1序列，其如SEQ ID NO: 65所表示。

所提到的RNA治疗剂抑制细胞内（诸如哺乳动物细胞内）OCA2基因的表达。该RNA治疗剂抑制患有OCA2相关病症或减少OCA2表达可能有益的情况（诸如异色症、眼部色素沉着过度病症，或用于美容目的）的人体内OCA2的表达。

因此，本发明涉及RNA治疗剂，包括反义寡核苷酸、小干扰RNA（siRNA）、微RNA（miRNA）、短发夹RNA（shRNA）、Dicer底物RNA（dsRNA）、piwi相互作用RNA（piRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）、CRISPR-Cas9指导RNA，以及任何其他能够抑制OCA2表达的RNA治疗剂或技术。

用于鉴定最佳沉默序列的算法

为敲低任何基因表达而鉴定最优siRNA序列是一种标准实践，完全在本领域技术人员的能力范围内，涉及应用既定指南、广泛可用的软件工具，以及本领域技术人员惯常使用的常规湿实验室验证方法。

通常认为，靶序列由15至30个核苷酸长度组成。然而，在此范围内，特定序列指导任何给定靶RNA切割的适宜性存在很大差异。本文提出的指南和各种软件包为鉴定任何给定基因靶标的最优靶序列提供了指导。

通过利用考虑热力学特性和GC含量等因素的指南和算法，并运行“BLAST”搜索以防止脱靶效应，可以在计算机模拟中预测最有效且特异性最高的序列。然而，本文描述的示例不限制其他优化规则和算法的使用。任何其他能够沉默基因表达的OCA2 RNA治疗剂序列，或任何其他优化RNA治疗剂沉默OCA2-mRNA的能力的方法（诸如不同的算法），只要遵循本主题技术的原则，都是合适的，如本文所述。这意味着尽管所呈现的实施例有限，但任何其他遵循相同原则的方法都可以使用。

siRNA序列选择原理：

在本文中，对整个OCA2-mRNA核苷酸序列进行筛选，以鉴定其中符合本文描述的任何或所有优化技术、算法和指南，以及本领域技术人员可获得的其他优化技术、算法和指南的序列。该过程允许有效鉴定已针对特定属性进行优化的序列，这些属性诸如稳定性、高效靶标结合、增加RISC摄取指导链的可能性、生物分布（例如，较短的siRNA分子表现出减小的分子量，可能有助于提高跨过眼部屏障的运输效率）、有效的基因沉默、最小的免疫原性、提高的靶标特异性，从而减少脱靶效应并提高安全性等特性。这些优化指南和算法被设计成鉴定具有最理想特性的序列，以增强基因沉默的效率和特异性。

RNA治疗剂链的长度应为30bp或更短。这是因为由较大RNA分子引起的干扰素反应导致非特异性基因的表达改变。该反应使许多基因的表达改变，并且可能导致副作用和无效沉默。当双链RNA治疗剂长于30bp时，干扰素反应被触发的频率显著更高，因为较长的分子迅速被细胞识别为外来物。细胞随后激活其干扰素反应，导致许多基因的表达发生改变，以试图对抗“外来”分子。这可导致非特异性基因沉默和副作用。使用较短的RNA治疗剂，这种情况发生的可能性要小得多（Persengiev SP等人，(2004) RNA N Y N. 12–8）。

由于在某些位置存在调控蛋白结合或二级结构极其复杂，应使用与人OCA2-mRNA的3.1K核苷酸上几个不同位置互补的siRNA序列，因为这可能降低被捕获的可能性。

通常，GC碱基应占组成的30%至65%，优选30%至55%。这是因为具有高GC的链结合更紧密，原因是一条链上的G核苷酸与另一条链上的C核苷酸形成三个共价键。这与A和T核苷酸之间的两个共价键相反。因此，高GC含量抑制双链体解链，从而导致基因表达抑制水平降低。

应避免使用由多于四个连续A或T核苷酸组成的序列。这是因为这些序列指示RNA聚合酶III酶的信号的末端。

已知含有GTCCTTCAA、TGTGT和CTGAATT等的序列会诱导免疫反应，因此最好避免使用（Birmingham, A.等人，Nat Protoc 2, 2068–2078 (2007)。

如果候选双链体含有相同碱基的五个或更多个连续碱基，则应将其消除。剔除含有种子序列的候选双链体可以降低脱靶效应（Vaish N等人，(2011) Nucleic Acids Res.39(5):1823–32）。

这是因为双链体的同质性将减弱其稳定性，使其不太可能结合其靶标。此外，该种子序列可能增加错配频率，这也可能削弱双链体的稳定性。

BLAST

为确保靶序列不存在于任何其他基因的mRNA中，并确保沉默对OCA2-mRNA具有特异性，将靶序列输入NCBI BLAST搜索引擎，并排除与其他基因具有同源性的序列。BLAST算法的描述可以见于Altschul等人（Altschul等人，(1997), Nucleic Acids Res.25: 3389-3402）。

为提高特异性，将候选siRNA序列在广泛且独特的mRNA数据库中进行比对，以去除非独特序列。如Jackson等人所建议（Jackson AL等人，(2003) Nat Biotechnol21(6):635–7），与不同mRNA共享超过11至15个连续核苷酸的候选siRNA应不予考虑。

随着“BLAST”数据库增长，其显著减少仅靶向一种特定mRNA的候选siRNA数量。因此，仅优选丢弃与超过2至5个unigene序列具有同源序列的siRNA。

通过先进的计算机模拟增强siRNA设计

通过模拟siRNA序列的二级结构并测量分子中的自由能，可以选择更好的候选物，因为具有较高自由能的分子往往不易折叠，因此是更好的候选物。此外，通过分析两个RNA序列（即siRNA和其在mRNA分子上的互补序列）之间相互作用的热力学特性，可以选择具有更高活性的siRNA候选物。热力学特性还决定哪条链将更有可能被加载到RISC中，从而进一步影响基因沉默的功效。

利用眼部药代动力学模型，可以评价各种siRNA序列（特别是不同长度）针对眼部屏障和虹膜生物分布的生物分布特征。这种方法鉴定具有最佳有效递送和基因沉默潜力的siRNA，从而简化候选物的选择以进行进一步开发。

热力学在选择siRNA序列中起着至关重要的作用，因为它影响siRNA-靶mRNA双链体的稳定性。焓（键合）力与熵（无序）力之间的平衡决定杂交，进而影响siRNA介导的基因沉默的特异性和有效性。对已公布siRNA序列的统计分析表明，功能性双链体通常在其5’反义端表现出比非功能性双链体更低的内部稳定性。这种较低的稳定性对于靶mRNA识别至关重要，因为它允许有义链5’端必要的灵活性，从而促进功能性双链体的形成。

另一种有效鉴定和区分高效与低效siRNA候选物的方法是模拟它们与Argonaute蛋白的对接。利用这种计算方法，可以深入了解Argonaute蛋白与siRNA候选物之间的物理相互作用。因此，可以评价这两种分子之间形成的复合物的强度和稳定性。此外，它还允许鉴定相互作用中的潜在弱点。这允许优化siRNA候选物与Argonaute蛋白的结合能力，从而选择具有增强沉默能力的候选物。

对该对接过程建模也可以提供关于siRNA候选物在与Argonaute蛋白结合时的取向和空间排列的信息。因此，鉴定哪些siRNA序列以最有效的构象与Argonaute蛋白结合是有益的。这将提供额外的机会来预测靶基因是否将被最优沉默。

经验性方法

另选地，也采用经验性方法，其中将特定大小（例如21个核苷酸）的“窗口”或“掩码”字面上或比喻性地（包括例如计算机模拟）置于靶RNA序列上，以便鉴定在该大小范围内可以用作靶序列的序列。对于任何给定的靶标大小，可以逐渐将序列“窗口”向上游或下游移动一个核苷酸，以鉴定下一个潜在的靶序列，直到鉴定所有可能的序列全集。

利用“窗口法”，然后使用本文实施例中描述的测定法或本领域熟知的其他方法测试siRNA候选物，可以鉴定最能有效沉默OCA2表达的RNA治疗剂序列。例如，表2中鉴定的序列，基于上文提及的算法方法和优化方法，被预测为有效的靶序列。然而，我们考虑通过将给定序列的窗口沿上游或下游方向逐步移动一个核苷酸，进一步优化基因抑制效率，以便鉴定具有相似或更优抑制特性的序列。

另外，设想对于任何鉴定的序列，诸如表2中的序列，可以通过系统地添加或去除核苷酸以生成更长或更短的序列，并且从鉴定点开始在靶RNA上向上或向下移动更长或更短大小的窗口来测试这些序列，从而实现进一步优化。通过将这种生成新候选靶标的方法与基于这些靶序列的RNA治疗剂在抑制测定法中的有效性测试相结合，可以进一步提高抑制效率，这是本领域已知并且/或者本发明所述的。

修饰

通过引入如本文所述或如本领域已知的经修饰核苷酸，可以进一步调整本文所述的序列。调整可以包括添加或修饰突出端、引入经修饰核苷酸或者进行本领域已知或本文讨论的其他修饰，以便进一步优化siRNA沉默效果。

这些调整旨在通过降低药物的降解速率来增强其在组织或细胞内环境内（特别是在内体环境中）的稳定性，并且延长其在房水和组织（诸如虹膜、巩膜、结膜和角膜）中的半衰期。此外，它们试图改善药物向细胞内的递送、靶向特定细胞类型（例如，虹膜基质黑素细胞）或位置、促进与沉默途径中涉及的酶的相互作用、增加RISC摄取指导链的可能性，以及减少脱靶效应。这些修饰还旨在降低免疫原性、最小化全身吸收，并增强内体逃逸以提高功效。

核苷酸选择、长度、与mRNA匹配、突出端

在RNA治疗剂为dsRNA的实施方案中，该dsRNA包含一条反义链，其序列与OCA2基因表达产生的mRNA的至少一部分互补。在RNA治疗剂为反义寡核苷酸的实施方案中，该寡核苷酸序列与OCA2基因表达生成的mRNA的至少一部分互补。

一般来讲，该互补区的长度为约30个核苷酸或更少（例如，约30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16或15个核苷酸）。当存在RNA治疗剂时，表达OCA2基因的细胞（诸如人细胞）其表达被抑制至少约10%，如通过例如基于PCR或分支DNA（bDNA）的RNA定量程序评估的。由OCA2基因活性产生的蛋白质表达可以通过蛋白质印迹和酶联免疫吸附测定（ELISA）进行定量评价，并通过免疫组织化学（IHC）进行组织内定位评价。流式细胞术可以用于分析细胞表面标记物和细胞内蛋白质，从而评估RNA治疗剂对与OCA2基因表达相关联的蛋白质水平的影响。

在使用dsRNA的条件下，两条互补的RNA链将形成双链结构。dsRNA的反义链包含与靶序列基本上互补且通常完全互补的互补区。靶序列可以来源于OCA2基因表达期间形成的mRNA序列。由于有义链与反义链互补，这两条链在适当条件下结合，并且在结合时形成双链体结构。如本领域已知，dsRNA的互补序列也可能包含在单个核酸分子上，而不是在分开的寡核苷酸上。

与靶序列互补的区域长度介于15个与30个核苷酸之间。本发明旨在涵盖所述范围和长度的中间部分。

dsRNA（或ASO）也可能包含一个或多个单链核苷酸突出端，诸如1、2、3或4个核苷酸。已有报道称，具有至少一个核苷酸突出端的dsRNA与其平端对应物相比，具有出乎意料的优异抑制特性。核苷酸突出端可以由核苷酸/核苷类似物组成，包括脱氧核苷酸/脱氧核苷类似物。突出端可以在有义链或反义链上，或在这两者的组合上。dsRNA突出端可以包含在反义链或有义链的5′端、3′端或两端处的核苷酸。根据该实施方案，可能允许更长的延伸突出端。

在RNA治疗剂开发中，在平端dsRNA与带有核苷酸突出端的dsRNA之间进行选择至关重要。尽管平端dsRNA更简单并且可能引发较少的免疫原性反应，使其在最小化免疫反应方面更受青睐，但是带有突出端的dsRNA通过提供增强的基因沉默功效而优于前者。这种优越性源于其与RISC复合物的结合能力更强，并且更近似于天然RNA加工产物，这些优势有助于实现更高效的基因靶向。然而，这种增强的功能也有其缺点；突出端与增加的免疫原性反应和更高的脱靶相互作用可能性相关联。因此，在这两种类型之间的抉择体现了一种谨慎的权衡，旨在最大化治疗功效，同时管理免疫激活和意外基因相互作用的风险。

订购

OCA2 siRNA被设计成靶向来自OCA2基因（NCBI GenBank登录号，NM_000275.3）的OCA2基因转录本。其核苷酸序列如下：UAAAGAUUCCUGCUUUACAGA（有义链，如SEQ ID 67所表示）和UGUAAAGCAGGAAUCUUUAGA（反义链，如SEQ ID 2所表示）。阴性对照RNA治疗剂购自Thermo-Fisher Scientific。

纯化

siRNA（或ASO）的纯化可以通过几种有效方法实现。结合到玻璃纤维后洗脱是一种常见方法，使用15%至20%丙烯酰胺凝胶进行凝胶纯化也是如此，这有助于去除多余的核苷酸、短寡聚物、蛋白质和盐。凝胶电泳对于化学合成的siRNA特别有用，可提供精确的尺寸选择。此外，离子交换色谱和反相HPLC（高效液相色谱）已成为纯化较大批次的标准方法，通过分别基于电荷或疏水性分离分子，提供高纯度和高特异性。另一种方法，尺寸排阻色谱，因其基于分子大小分离的能力而被采用，可用于去除较小的杂质。纯化方法的选择可以取决于对纯度、产量和下游应用的特定要求，并且本领域技术人员已知的任何其他方法也可以用于RNA纯化的目的。

混合使用siRNA序列

在本发明的一些用法中，诸如在体外实验和体内研究期间，建议将2至10个（优选2至4个）靶向OCA2基因的siRNA序列混合使用，通过靶向多个mRNA区域来增强沉默功效，从而提高敲低效率。

Claims

1.一种修改受试者眼睛颜色的方法，包括向所述受试者施用有效量的至少一种眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白调节剂，或者其任何媒介物、基质、纳米颗粒或微米颗粒，或者包含其的任何组合物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种调节剂包含至少一种核酸分子。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述核酸分子包含单链RNA（ssRNA）、单链DNA（ssDNA）、双链DNA（dsDNA）、双链RNA（dsRNA）、具有至少一个经修饰核苷酸的核酸分子以及它们的任何组合中的至少一者。

4.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中所述核酸分子包含小干扰RNA（siRNA）、反义寡核苷酸（ASO）、指导RNA、短发夹RNA（shRNA）、微RNA（miRNA）、肽核酸（PNA）和锁核酸（LNA）中的至少一者。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述核酸分子包含至少一种siRNA分子，其中所述siRNA分子靶向编码或者直接或间接控制OCA2的水平和/或活性和/或稳定性的至少一个序列。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中所述至少一种调节剂靶向OCA2转录本中的至少一个区域。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述调节剂抑制和/或降低OCA2的表达和/或活性和/或稳定性。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述抑制降低所述受试者的虹膜组织中的黑色素水平。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中所述OCA2调节剂降低OCA2的表达和/或活性和/或稳定性，所述降低导致所述受试者的眼睛颜色变浅。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述至少一种OCA2调节剂靶向所述受试者的虹膜基质。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，还包括将所述受试者暴露于光源的步骤。

12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述至少一种OCA2调节剂经由眼部施用来施用。

13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述至少一种OCA2调节剂经由局部施用来施用。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述至少一种OCA2调节剂被包含在滴眼剂制剂中。

15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其用于美容目的。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述受试者是健康的。

17.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述受试者患有疾病。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述疾病是色素沉着过度性眼部病症、眼部青光眼、霍纳综合征或异色症中的任一者。

19.至少一种眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白调节剂，或者其任何媒介物、基质、纳米颗粒或微米颗粒，或者包含其的任何组合物，其用于修改受试者眼睛颜色的方法中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的所述至少一种OCA2蛋白调节剂。

20.一种用于修改受试者眼睛颜色的组合物，包含至少一种眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白调节剂。

21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述至少一种调节剂包含至少一种核酸分子。

22.根据权利要求21所述的组合物，其中所述核酸分子包含单链DNA（ssDNA）、单链RNA（ssRNA）、双链DNA（dsDNA）、双链RNA（dsRNA）、具有至少一个经修饰核苷酸的核酸分子以及它们的任何组合中的至少一者。

23.根据权利要求20至22中任一项所述的组合物，其中所述核酸分子包含小干扰RNA（siRNA）、反义寡核苷酸（ASO）、指导RNA、短发夹RNA（shRNA）、微RNA（miRNA）、肽核酸（PNA）和锁核酸（LNA）中的至少一者。

24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述核酸分子包含至少一种siRNA分子，其中所述siRNA分子靶向编码或者直接或间接控制OCA2的水平和/或活性和/或稳定性的至少一个序列。

25.根据权利要求20至24中任一项所述的组合物，其中所述至少一种OCA2调节剂靶向OCA2转录本中的至少一个区域。

26.根据权利要求20至25中任一项所述的组合物，其中所述OCA2调节剂抑制和/或降低OCA2的表达和/或活性和/或稳定性。

27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述抑制降低所述受试者的虹膜组织中的黑色素水平。

28.根据权利要求20或27所述的组合物，其中所述OCA2调节剂降低OCA2的表达和/或活性和/或稳定性，所述降低导致所述受试者的眼睛颜色变浅。

29.根据权利要求20至28中任一项所述的组合物，其中所述至少一种OCA2调节剂靶向所述受试者的所述虹膜基质。

30.根据权利要求20至29中任一项所述的组合物，其中所述至少一种OCA2调节剂被包封在至少一种纳米载体内部或由至少一种纳米载体包被。

31.根据权利要求20至30中任一项所述的组合物，其中所述至少一种OCA2调节剂经由眼部施用来施用。

32.根据权利要求20至21中任一项所述的组合物，其中所述至少一种OCA2调节剂经由局部施用来施用。

33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述至少一种OCA2调节剂被包含在滴眼剂制剂中。

34.根据权利要求20至33中任一项所述的组合物，其用作化妆品。

35.一种药物组合物，包含至少一种眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白调节剂，以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂和/或赋形剂。

36.根据权利要求35所述的药物组合物，其中所述组合物在权利要求20至34中任一项中被定义。

37.一种用于修改受试者眼睛颜色的核酸分子，包含至少一种眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白调节剂。

38.根据权利要求37所述的核酸分子，包含单链DNA（ssDNA）、单链RNA（ssRNA）、双链DNA（dsDNA）、双链RNA（dsRNA）、具有至少一个经修饰核苷酸的核酸分子以及它们的任何组合中的至少一者。

39.根据权利要求37或38所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含小干扰RNA（siRNA）、反义寡核苷酸（ASO）、指导RNA、短发夹RNA（shRNA）、微RNA（miRNA）、肽核酸（PNA）和锁核酸（LNA）中的至少一者。

40.根据权利要求39所述的核酸分子，其中所述核酸分子包含至少一种siRNA分子，其中所述siRNA分子靶向编码或者直接或间接控制OCA2的水平和/或活性和/或稳定性的至少一个序列。

41.根据权利要求37至40所述的核酸分子，其靶向OCA2转录本中的至少一个区域。

42.根据权利要求35至39中任一项所述的核酸分子，其抑制和/或降低OCA2的表达和/或活性和/或稳定性。

43.根据权利要求42所述的核酸分子，其中所述抑制降低所述受试者的虹膜组织中的黑色素水平。

44.根据权利要求37至43中任一项所述的核酸分子，其中所述至少一种OCA2调节剂降低OCA2的表达和/或活性和/或稳定性，所述降低导致所述受试者的眼睛颜色变浅。

45.根据权利要求37至44所述的核酸分子，其中所述核酸分子被包封在至少一种纳米载体内部或由至少一种纳米载体包被。

46.根据权利要求37至45所述的核酸分子，其用作化妆品。

47.一种治疗有需要的受试者的疾病/病症的方法，包括向所述受试者施用有效量的至少一种眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白调节剂，或者其任何媒介物、基质、纳米颗粒或微米颗粒，或者包含其的任何组合物。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述疾病/病症是眼部病症。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述眼部病症是异色症、霍纳综合征或色素沉着过度中的任一者。

50.根据权利要求47至49中任一项所述的方法，其中所述组合物由权利要求20至36限定。

51.根据权利要求47至50中任一项所述的方法，其中所述至少一种OCA2调节剂包含以下中的至少一者：核酸分子、或者任何包含其的载体或宿主细胞。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所述至少一种核酸分子由权利要求37至46限定，或者包含其的任何载体或宿主细胞。

53.根据权利要求47至52中任一项所述的方法，其中所述至少一种OCA2调节剂经由眼部施用来施用。

54.根据权利要求47至53中任一项所述的方法，其中所述至少一种OCA2调节剂经由局部施用来施用。

55.根据权利要求54所述的方法，其中所述至少一种OCA2调节剂被包含在滴眼剂制剂中。

56.至少一种眼皮肤白化病2（OCA2）蛋白调节剂，或者其任何媒介物、基质、纳米颗粒或微米颗粒，或者包含其的任何组合物，其用于治疗有需要的受试者的疾病/病症的方法中，所述方法包括向所述受试者施用有效量的所述至少一种OCA2蛋白调节剂。