CN121160739A - 大豆GmENOD93基因在提高大豆产量中的应用 - Google Patents

Abstract

大豆GmENOD93基因在提高大豆产量中的应用，属于基因工程技术领域。为挖掘具有明确且强大增产效应的关键基因，以用于高产大豆的育种，本发明通过克隆大豆GmENOD93基因，构建含有该基因的重组表达载体及重组农杆菌，获得了过表达大豆GmENOD93基因的转基因大豆植株，并且通过对转基因大豆植株的结瘤表型和农业性状进行鉴定，发现过表达GmENOD93基因能够促进大豆结瘤并提高大豆产量。本发明为高产大豆品种的辅助育种提供了新的思路，具有重要的理论意义和实践价值。

Description

大豆GmENOD93基因在提高大豆产量中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，具体涉及大豆GmENOD93基因在提高大豆产量中的应用。

背景技术

大豆[Glycine max(L.)Merr.]是世界范围内重要的油料作物和粮食作物，其籽粒富含优质蛋白质、不饱和脂肪酸、微量元素与膳食纤维，具有极高的营养价值，在人类饮食和动物饲料中扮演着不可或缺的角色。

目前，提高大豆产量的传统途径主要包括品种选育、栽培技术优化及化肥农药的合理施用。虽然这些方法取得了一定成效，但其增产潜力已逐渐接近瓶颈，且可能伴随环境成本上升等问题。随着分子生物学技术的飞速发展，通过基因工程手段挖掘并利用关键功能基因，实现对大豆产量性状的精准遗传改良，已成为当前农业生物技术的研究热点与前沿方向。

本领域已知，大豆产量是一个由多基因控制的复杂数量性状，涉及光合效率、养分吸收、胁迫耐受及生殖发育等多个生物学过程。尽管已有一些与大豆生长发育相关的基因被报道，但其在直接且显著提高大豆单产方面的效果有限，或存在基因功能冗余、负调控效应等局限性。因此，本领域迫切需要鉴定出具有明确且强大增产效应的关键基因，并以此为基础开发出高效、可靠的新型分子育种技术，以应对当前大豆生产中面临的产量瓶颈问题。

发明内容

为了挖掘具有明确且强大增产效应的关键基因，以用于高产大豆的育种，本发明通过克隆大豆GmENOD93基因，构建含有该基因的重组表达载体及重组农杆菌，获得了过表达大豆GmENOD93基因的转基因大豆植株，并且通过对转基因大豆植株的结瘤表型和农业性状进行鉴定，发现过表达GmENOD93基因能够促进大豆结瘤并提高大豆产量。

为解决上述技术问题并实现相应的技术效果，本发明提供了如下技术方案：

本发明的第一个目的是提供大豆GmENOD93基因的应用，所述应用是将大豆GmENOD93基因用于提高大豆产量，所述大豆GmENOD93基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供大豆GmENOD93基因的应用，所述应用是利用大豆GmENOD93基因培育产量提高的大豆品种，所述大豆GmENOD93基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

本发明的第三个目的是提供一种重组载体的应用，所述重组载体含有大豆GmENOD93基因，所述大豆GmENOD93基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述应用是将重组载体用于提高大豆产量。

本发明的第四个目的是提供一种重组载体的应用，所述重组载体含有大豆GmENOD93基因，所述大豆GmENOD93基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述应用是利用重组载体培育产量提高的大豆品种。

本发明的第五个目的是提供一种含有上述大豆GmENOD93基因或上述重组载体的重组菌的应用，所述应用是将重组菌用于提高大豆产量。

本发明的第六个目的是提供一种含有上述大豆GmENOD93基因或上述重组载体的重组菌的应用，所述应用是利用重组菌培育产量提高的大豆品种。

在本发明的一种实施方式中，所述重组菌的宿主为农杆菌。

在本发明的一种实施方式中，所述提高大豆产量是指提高大豆单株粒数和单株粒重。

本发明的第七个目的是提供一种提高大豆产量的方法，所述方法包括如下步骤：克隆上述大豆GmENOD93基因；将大豆GmENOD93基因构建到表达载体中，获得重组载体；将重组载体导入农杆菌中，获得重组农杆菌；利用重组农杆菌侵染大豆，经筛选获得过表达大豆GmENOD93基因的阳性植株。

在本发明的一种实施方式中，所述表达载体为pCAMBIA3301。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体的的构建方法如下：以大豆基因组cDNA为模板，进行扩增克隆，得到大豆GmENOD93基因CDS序列，然后将CDS序列转入pCAMBIA3301载体，并且在GmENOD93基因的CDS序列后连接3×HA标签，最终获得pCAMBIA3301-GmENOD93-3×HA载体。

3×HA标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

SEQ ID NO.10：

ATGTACCCATACGATGTTCCTGACTATGCGGGCTATCCCTATGACGTCCCGGACTATGCAGGATCCTATCCATATGACGTTCCAGATTACGCTTAG。

本发明的有益效果：

本发明通过克隆大豆GmENOD93基因，构建含有该基因的重组表达载体及重组农杆菌，获得了过表达大豆GmENOD93基因的转基因大豆植株，并且通过对转基因大豆植株的结瘤表型和农业性状进行鉴定，发现GmENOD93基因通过调控大豆共生结瘤的数量来调控大豆共生固氮的作用；过表达GmENOD93基因能够促进大豆结瘤并提高大豆产量。本发明对过表达大豆GmENOD93基因的纯合阳性株系GmENOD93-OX1和GmENOD93-OX2的单株产量（单株粒重）进行测定，发现相比于野生型大豆，GmENOD93-OX1和GmENOD93-OX2的单株产量分别提高了13%和6%。本发明为高产大豆品种的辅助育种提供了新的思路，具有重要的理论意义和实践价值。

附图说明

图1为含有pCAMBIA3301-GmENOD93-3×HA载体的大肠杆菌菌落PCR鉴定结果图；

图2为重组载体pCAMBIA3301-GmENOD93-3×HA的结构示意图；

图3为获得纯合阳性株系GmENOD93-OX1和GmENOD93-OX2的稳定遗传转化过程图；其中，图3中的A为种子萌发过程图，图3中的B为大豆与EHA105共培养过程图，图3中的C为恢复培养过程图，图3中的D为筛选培养过程图，图3中的E为继代培养过程图，图3中的F为生根培养过程图，图3中的G为试纸条检测转基因苗结果图，左边试纸条结果表示阴性转基因苗，右边试纸条结果表示阳性转基因苗，图3中的H为移栽过程图，标尺=1 cm；

图4为荧光定量PCR检测野生型Williams 82大豆不同组织中GmENOD93基因相对表达水平的结果图；

图5为荧光定量PCR检测野生型Williams 82大豆和过表达大豆GmENOD93基因的纯合阳性株系中GmENOD93基因相对表达水平的结果图；

图6为野生型Williams 82大豆和过表达大豆GmENOD93基因的纯合阳性株系的结瘤表型鉴定结果图；其中，图6中的A为根瘤鲜重统计结果图，图6中的B为根瘤干重统计结果图，图6中的C为根瘤数统计结果图；数据统计采用mean±SEM（n=10），显著性分析为t-test；

图7为野生型Williams 82大豆和过表达大豆GmENOD93基因的纯合阳性株系的农业性状数据分析结果图；其中，图7中的A为单株粒数统计结果图，图7中的B为单株粒重统计结果图，图7中的C为大豆植株表型图；数据统计采用mean±SEM（n=10），显著性分析为t-test。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体的实施方式及说明书附图对本发明进行进一步详细说明。需要注意的是，下面提到的实施例只适用于解释本发明，但不用于限定本发明的范围。下面所提到的实施例只是本发明的一部分实施例而不是全部实施例。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现本发明的目的。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明当中。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。在本领域中，其他技术人员若没有作出创造性劳动，则其所获得的实施例均被本发明保护。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法，所用材料、试剂、培养基和仪器，未经特殊说明，均为本领域常规材料、试剂、培养基和仪器，本领域技术人员均可通过商业渠道获得。

本发明所用大豆品种Willam 82为中国农业科学院作物科学研究所提供。

本发明中大豆GmENOD93基因（Glycine max Wm82.a4.v1版本基因号：Glyma .06G216500）对应的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；其CDS编码序列长度为318 bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码蛋白对应的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

SEQ ID NO.1：

TCATCCAAAGCTACTCCAATTCCTTTATTGTTTATTGCCACCTTTCGCTTATAAGTTACTACTTTGAAGATGGCCAAAGGAAATAGTCCCCTCGAGAGGCCTAGCTTGGCTTCACTTGACCAAAAATTGGCCTTCGCTAAGCGCTGTTCTCATGGTACATATAAGCTTTTACTTCCAATTTTTATCCTAAAAGAGAATGTACATTGTATAGCAAATTCTGTGATTCCATTTTTCTTTTCTTTTACTGAGCAGAAATTATGTTCTCTTGAAATAATTGTTTGGCAAGAAACGCCATAACTAGAAACATAATATAGAATGAGAAAGCATTTATAGTGAATTTGGATATGATTTCTTTAAAATCAACGTACAAATGTATAAAATGAGAAAGTATTAATTCAAATAAAATATTCTGTAATTTTAAAGAATAAAAAGTGCATGTATTAAGGTTTTGTCAGATACCCACATCAACCAAATTAAGTATATAGCTAGGTGAAGGATAACTTCTATCTTGCAAAATAATTTTTGTTGAGAACCTCAAACCCACACAAGATAGATATTTTATTCTTAATACGATTTATTTCTTTCATAACTAAAGATCAATTAGAAATTGAATCTTGTATTACTCCATTAAAAAACACATACTACTATCATTTCTGTGAATAGTTGTTAGTCCCGTCCATGCCTTCGTCTTTATTCATTGATCGATATTTCAACTATTTCTGATATGATATGGACCGCTGAGGAGTGCATCAAAATTAAGATATATAATTGCTGAAAACTTTTGCCGATTTCCCAATCTGATATTATTACTAATTTGATTTGGGTTTGTTTACCTTTTCTAATTTTGTGTAAACAGAGGGTGTGTTAGCGGGAGCAAAGGCAGCAGTTGTTGCCAGTGTTGCCTCTGCCATTCCAACTGTAAGTATTTCTCCAACCTCTATATTCAGTTCATTTTCATTCACTCAATCCTAAAAGATCTTCTTAATAAGATCAATTTACAAATTTACATTTAAAATAACGACCAAGTAGGATTATTATTCTATTCAGAGAGAAATATTAACATCACACTCTTACACATTATTTTTATTATCAGTCAAATTTATTAGAAATTAAAAAAAATATTAGTCTTATATTTTATTTAACAAGGCGCATTAGTGAACTTTTAATGTCTAATAAATTTTAACTAATAATAAAAACATACCAGAGAATATCTTGATAACAATTCTGATTCTACTAAAGATTTTTTGCTGAAGAGATTTTTATTAGAATAGTTATGCTTGGTGTGCAGCTGGCTAGTGTAAGGATGCTGCCTTGGGCAAGAGCCAATCTCAATCACACAGCTCAAGCTCTCATAATTTCCACAGGTTTGAAAGCACTGTGATCTCTTAATAATTTGCTGGAATATATGAAAATACATAATTTGTTTTAGTTTTTATTGGAATTTATTCTTTTAGTATTCTGCGTTTAAGTAGAACAGTTCATTTTTATTCGTTCACCAAAAACTAAAAAAAATGTTTTTTTGTAAAACTTTTAAGACTAAAACAAAATAAATTTTAAGATTTATTTTAAATACTGAAAATTATTTCCACCATTCCTAACTTCACAATTTGATTGCAGCGACGGCAGCAGCATACTTCATAGTAGCTGACAAGACCGTTTTAGCAACAGCAAGGAAAAACTCCTTCAACCAACCCTCCAATTCTGAAGCATGAATCCGAATGGATAGCATGGACAATAGTCGATTATACCACAGTATCCAACCGTGAATCGGTGTTATTTATCCAAATAAATAATGTGTTCATAAGAATATTTATGTACAAATTATCTGAATTAATCATTTATTTCATTTCAGCATTAATCATTTACTTCCTAACAGTGCACTATCAAAACATGGTACAACCAAAAATTTGACAAACAGTGCACCCAATAGGGTGTTTAGAATCCAAATTAATCCCTAATTCAATCCGACCCAATTATATTAACTTGAATCTTTTAAATGTTTGGATCAAACTTTCAATTTAATTATACCATAGTATCCAACTGTAAATCGATGTTATTTAT；

SEQ ID NO.2：

ATGGCCAAAGGAAATAGTCCCCTCGAGAGGCCTAGCTTGGCTTCACTTGACCAAAAATTGGCCTTCGCTAAGCGCTGTTCTCATGAGGGTGTGTTAGCGGGAGCAAAGGCAGCAGTTGTTGCCAGTGTTGCCTCTGCCATTCCAACTCTGGCTAGTGTAAGGATGCTGCCTTGGGCAAGAGCCAATCTCAATCACACAGCTCAAGCTCTCATAATTTCCACAGCGACGGCAGCAGCATACTTCATAGTAGCTGACAAGACCGTTTTAGCAACAGCAAGGAAAAACTCCTTCAACCAACCCTCCAATTCTGAAGCATGA；

SEQ ID NO.3：

MAKGNSPLERPSLASLDQKLAFAKRCSHEGVLAGAKAAVVASVASAIPTLASVRMLPWARANLNHTAQALIISTATAAAYFIVADKTVLATARKNSFNQPSNSEA。

实施例1：大豆GmENOD93蛋白质的编码基因的克隆

取野生型大豆William82叶片组织，利用TransZol Up试剂（购自北京全式金生物）提取RNA，并利用反转录试剂盒TransScript^®Uni All-in-One First-Strand cDNASynthesis SuperMix for qPCR（购自北京全式金生物）进行反转录获得cDNA，以上实验操作均参考对应说明书进行；以获得的cDNA为模版，利用高保真酶KOD one（TOYOBO）和引物Gm06g216500-V64-EcoRⅠ-F及Gm06g216500-V64-PstⅠ-R进行PCR扩增；其中，引物Gm06g216500-V64-EcoRⅠ-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，引物Gm06g216500-V64-PstⅠ-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。所用PCR程序为98℃ 5 min；98℃ 30 s，56℃ 5 s，72℃ 30 s，34个循环；72℃ 5 min。

SEQ ID NO.4：TTGGAGAGGACCTCGAGAATTCATGGCCAAAGGAAATAGTCC；

SEQ ID NO.5：CCTACTAGTACGCGTCTGCAGTGCTTCAGAATTGGAGGGTT。

通过琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，然后利用胶回收试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）进行回收、纯化，操作参考说明书，得到的目的片段上游含有EcoRⅠ限制性内切酶的酶切位点序列以及用于与载体重组的同源臂序列，下游不含终止密码子，含有PstⅠ限制性内切酶的酶切位点序列以及用于与载体重组的同源臂序列。

实施例2：过表达大豆GmENOD93基因的重组载体的构建

过表达大豆GmENOD93基因的重组载体的构建方法是以大豆基因组cDNA为模板，进行扩增克隆，得到大豆GmENOD93基因CDS序列，然后将CDS序列转入pCAMBIA3301载体，并且在GmENOD93基因的CDS序列后连接3×HA标签，最终获得pCAMBIA3301-GmENOD93-3×HA载体。其中，3×HA标签的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

SEQ ID NO.10：

ATGTACCCATACGATGTTCCTGACTATGCGGGCTATCCCTATGACGTCCCGGACTATGCAGGATCCTATCCATATGACGTTCCAGATTACGCTTAG。

1、pCAMBIA3301载体的酶切

选择限制性内切酶EcoRⅠ和PstⅠ对pCAMBIA3301载体进行双酶切，以质粒作为对照进行电泳检测，将酶切产物进行胶回收。

2、线性化骨架与目的片段的连接及产物转化大肠杆菌

利用pEASY^®-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit（购自北京全式金生物）连接带有接头的目的基因片段（实施例1获得）和线性化载体，操作参考说明书。取连接产物转化大肠杆菌感受态Trans1-T1（100 μL，购自北京全式金生物），冰上静置30 min，42℃水浴30 s，冰上2 min，加入500 μL LB无抗液体培养基，37℃条件下200 rpm孵育1 h，吸取200 μL菌液均匀涂在含有50 mg/L氨苄霉素的LB固体培养基上，37℃恒温培养箱黑暗培养12 h；长出单克隆后挑取6个单克隆，利用引物pCAMBIA3301H-seq-F1和V64-35s-seq-R进行菌落PCR鉴定，预测扩增片段长度582 bp（图1）；其中，引物pCAMBIA3301H-seq-F1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示、引物V64-35s-seq-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。所用PCR程序为98℃ 5 min；98℃ 30 s，56℃ 5 s，72℃ 30 s，34个循环；72℃ 5 min。将未纯化的PCR产物送测序公司进行测序，测序结果与预测序列进行比对，获得pCAMBIA3301-GmENOD93-3×HA表达载体（图2）。

SEQ ID NO.6：CCTTCGCAAGACCCTTCCTC；

SEQ ID NO.7：GGAAATTCGAGCTGGTCACC。

实施例3：过表达大豆GmENOD93基因的重组菌的制备

向装有农杆菌EHA105感受态细胞（100 μL，唯地生物）的离心管中加入500 ng实施例2构建的pCAMBIA3301-GmENOD93-3×HA载体质粒，置于冰上5 min，液氮冷激5 min，凝结后置于37℃水浴锅5 min，置于冰上5 min，然后加入不含抗生素的0.5 mL YEP液体培养基，250 rpm 28℃振荡培养2 h，吸取200 μL菌液均匀涂在含有50 mg/L利福平和50 mg/L壮观霉素的YEP固体培养基上，28℃培养2天，获得携带pCAMBIA3301-GmENOD93-3×HA表达载体的农杆菌，命名为EHA105/pCAMBIA3301-GmENOD93-3×HA。

实施例4：过表达大豆GmENOD93基因的转基因大豆植株的获得

采用农杆菌介导的大豆子叶节遗传转化法，将实施例3获得的重组农杆菌转至大豆品种Williams 82中，获得转GmENOD93基因大豆。具体步骤如下：

（1）种子消毒：取饱满健康的Williams 82大豆种子平铺放入培养皿中，将培养皿及100 mL三角瓶放入通风橱中，向三角瓶中加入94 mL NaClO和6 mL浓HCL，密封后用反应产生的氯气进行灭菌16 h；放在无菌操作台中，将氯气吹净，约1 h。

（2）菌液活化：从-80℃冰箱取出保存的EHA105/pCAMBIA3301-GmENOD93-3×HA菌液，在对应的抗生素YEP固体培养基上进行划线培养，将单克隆挑至液体培养基中继续培养，最终将新鲜的菌液接种于固体培养基进行培养。

（3）种子萌发：配萌发培养基（GM），灭菌后用凉水冲至手心不烫手背烫时，在无菌工作台中加入6-BA，倒板。烧镊子，放置待凉，用镊子夹豆子，将种脐朝向培养基，封口，组培室23℃暗培养过夜；

GM培养基（1 L）：B5粉末3.1 g，蔗糖20 g，Phytagel 2.5 g，B5维生素（1000×）1mL，余量为ddH₂O，pH=5.8。

（4）侵染液配制：活化后的菌体用移液器冲洗至液体CCM培养基中，在28℃恒温摇床培养4-6 h，待OD₆₀₀=0.6-1.0侵染效果最佳；

液体CCM培养基（1 L）：B5粉末0.31 g，蔗糖30 g，MES 3.9 g，B5维生素（1000×）1mL，GA3 0.25 mL，6-BA 1.67 mL，DTT 1.8 mL，余量为ddH₂O，pH=5.4。

（5）侵染豆子：取出过夜培养的大豆种子，在无菌容器中倒入侵染液，无菌镊子将大豆种子放入容器中；用无菌手术刀沿种脐纵切大豆，切完大豆后每隔2 h更换侵染液。

（6）共培养：弃侵染液，用无菌滤纸吸走大豆上残留的菌液，放置在CCM固体培养基（液体CCM培养基中加琼脂）上，23℃恒温培养箱暗培养5天；

（7）恢复培养：大豆转移到SI-I培养基上，进行恢复培养7天；

SI-I培养基（1 L）：B5粉末3.1 g，蔗糖30 g，MES 0.59 g，Phytagel 2.75 g，B5维生素1 mL，6-BA 1.67 mL，Timentin 1 mL，Cefotaxime 1.5 mL，余量为水，pH=5.7。

（8）筛选培养：挑选长出丛生芽的的大豆，同时对未切除干净的胚芽再次进行切除，培养2周；

（9）继代培养：由于SI-II培养基含有basta抗性，挑选培养基上仍存活的芽，转入到SE培养基中，确保每个芽与培养基直接接触；

SI-II培养基（1 L）：B5粉末3.1 g，蔗糖30 g，MES 0.59 g，Phytagel 2.75 g，B5维生素1 mL，6-BA 1.67 mL，Timentin 1 mL，Cefotaxime 1.5 mL，Glufosinate 0.6 mL，余量为水，pH=5.7；

SE培养基（1 L）：MS 4.33 g，蔗糖30 g，MES 0.6 g，Phytagel 3 g，B5维生素1 mL，L-asparagine1 mL，L-pyroglutamic acid 1 mL，IAA 0.1 mL，GA3 0.5 mL，ZR 1 mL，Timentin 1 mL，Cefotaxime 1.5 mL，Glufosinate 0.6 mL，Hygromycin 0.2 mL，余量为水，pH=6.0。

（10）生根培养：从SE培养基上挑选出生长较好的大豆植株，转入到RM培养基中；

RM培养基（1 L）：MS 2.165 g，Fe-EDTA 5 mL，蔗糖20 g，MES 0.6 g，琼脂3 g，Phytagel 2.5 g，B5维生素1 mL，IBA 1 mL，Timentin 1 mL，Cefotaxime 1.5 mL，余量为水，pH=5.8。

（11）取大豆叶片放在1.5 mL加水的离心管中，使用Bar试纸条进行检测，若试纸条显示一条杠则说明为阴性苗，若试纸条显示两条杠则为阳性苗，将阳性苗移栽到混合基质（无菌蛭石与珍珠岩的体积比为2:1）中进行培养。

获得T0代阳性苗后种植并收获种子，再将其种下，记为T1代植株，采用上述方法对其进行鉴定，继代直到后代不再出现阴性植株，则认为已经获得了纯合阳性株系，具体流程如图3。选择纯合阳性株系GmENOD93-OX1、GmENOD93-OX2进行后续实验。

实施例5：过表达大豆GmENOD93基因的转基因大豆植株的表达模式及表达量分析

1、野生型Williams 82大豆GmENOD93基因的表达模式分析

选取野生型Williams 82大豆的不同组织：根、叶、根瘤（包括整个根瘤、根瘤固氮区及根瘤表皮），每个样品各3个重复，每个样品50 mg，分别进行总RNA的提取，然后反转录获得cDNA；以cDNA为模板，分别利用特异性引物GmENOD93-qPCR-F和GmENOD93-qPCR-R进行荧光定量PCR。其中引物GmENOD93-qPCR-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，引物GmENOD93-qPCR-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。以大豆的内参基因GmCONS4为对照，最后通过计算获得各样品中GmENOD93基因的相对表达量，结果如图4所示。

SEQ ID NO.8：TGCCATTCCAACTCTGGCTAGTG；

SEQ ID NO.9：CTGCCGTCGCTGTGGAAATTATG。

结果表明：大豆GmENOD93基因在野生型Williams 82大豆的叶和根中的表达水平无统计学差异，但在根瘤中的表达水平显著高于其在叶和根中的表达水平（p＜0.001）。

2、过表达大豆GmENOD93基因的阳性植株中GmENOD93基因表达量分析

选取过表达大豆GmENOD93基因的纯合阳性株系（GmENOD93-OX1、GmENOD93-OX2）和野生型大豆Williams 82，采用步骤1的方法通过荧光定量PCR检测根瘤中GmENOD93基因的相对表达量。结果如图5所示，目的基因在转基因材料的根瘤中有较高表达，初步判断符合后续实验的要求。

实施例6：大豆GmENOD93基因在促进大豆结瘤和提高大豆产量中的应用

1、过表达大豆GmENOD93基因的纯合阳性株系的结瘤表型鉴定

挑选颗粒饱满的Williams 82大豆种子及GmENOD93-OX1和GmENOD93-OX2的种子，放在密闭容器中用氯气（100 mL NaClO+4 mL浓盐酸）进行消毒15 h，于通风橱将残留氯气吹净。将种子置于潮湿的无菌滤纸上，于23℃黑暗环境下生长3 d，发芽后转入混合基质（无菌蛭石和珍珠岩的体积比为2:1），于28℃，光循环16 h/暗循环8 h条件下进行培养。每周浇灌2次无氮营养液，无氮营养液的组成为0.5 mmol/L MgSO₄，0.2 mmol/L CaCl₂，0.15 mmol/L K₂HPO₄，1 mmol/L K₂SO₄，0.02 mmol/L FeCl₃，0.5 µmol/L H₃BO₃，0.1 µmol/L MnSO₄，0.15µmol/L ZnSO₄，0.04 µmol/L CuSO₄，2.5 pmol/L NaMoO₄，2.5 pmol/L CoCl₂，2.5 pmol/LNiSO₄。

将根瘤菌USDA110在YMB固体培养基上进行划线培养，28℃条件下培养5~7 d，挑取USDA110单菌落接种于含有100 mg/L氯霉素的YMB液体培养基，在28℃摇床中培养大约7 d，待其OD₆₀₀在0.8~1.2之间（保证根瘤菌的活性），于5000 r/min离心5 min，使用无氮营养液将沉淀菌体进行悬浮，将OD₆₀₀值调整到0.1进行侵染，大豆苗龄7天时每株接种10 mL。

大豆侵染3周后进行表型鉴定，统计根瘤的数量、干重和鲜重。结果如图6所示，相比于野生型大豆，GmENOD93-OX1和GmENOD93-OX2的根瘤数量、干重和鲜重显著增加，说明过表达GmENOD93基因能够提高大豆结瘤能力。

2、过表达大豆GmENOD93基因的纯合阳性株系的农业性状鉴定

分别挑取籽粒饱满且表面光滑的野生型Williams 82、GmENOD93-OX1和GmENOD93-OX2大豆种子，在国家南繁研究院试验基地中进行种植。在3月份分别调查大豆不同株系的单株粒数和单株产量（单株粒重）。结果表明，与野生型大豆（WT）相比，GmENOD93-OX1和GmENOD93-OX2转基因大豆的单株粒数和产量均显著增加（图7）。

以上结果说明，过表达GmENOD93基因能够促进大豆结瘤并提高大豆产量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.大豆GmENOD93基因的应用，其特征在于，所述应用是将大豆GmENOD93基因用于提高大豆产量，所述大豆GmENOD93基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.大豆GmENOD93基因的应用，其特征在于，所述应用是利用大豆GmENOD93基因培育产量提高的大豆品种，所述大豆GmENOD93基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组载体的应用，其特征在于，含有大豆GmENOD93基因，所述大豆GmENOD93基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述应用是将重组载体用于提高大豆产量。

4.一种重组载体的应用，其特征在于，含有大豆GmENOD93基因，所述大豆GmENOD93基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述应用是利用重组载体培育产量提高的大豆品种。

5.一种含有权利要求1中所述大豆GmENOD93基因或权利要求3中所述重组载体的重组菌的应用，其特征在于，所述应用是将重组菌用于提高大豆产量。

6.一种含有权利要求1中所述大豆GmENOD93基因或权利要求3中所述重组载体的重组菌的应用，其特征在于，所述应用是利用重组菌培育产量提高的大豆品种。

7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述重组菌的宿主为农杆菌。

8.根据权利要求1、权利要求3或权利要求5所述的应用，其特征在于，所述提高大豆产量是指提高大豆单株粒数和单株粒重。

9.一种提高大豆产量的方法，其特征在于，包括如下步骤：克隆权利要求1中所述大豆GmENOD93基因；将大豆GmENOD93基因构建到表达载体中，获得重组载体；将重组载体导入农杆菌中，获得重组农杆菌；利用重组农杆菌侵染大豆，经筛选获得过表达大豆GmENOD93基因的阳性植株。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述表达载体为pCAMBIA3301。