CN121136915A - 富含蛋白酶体人胎盘源促血管干细胞外囊泡分离及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及富含蛋白酶体人胎盘源促血管干细胞外囊泡分离及其应用。本发明提供的细胞外囊泡来源于人胎盘源促血管干细胞，所述人胎盘源促血管干细胞呈标志物PAI‑1阳性、MECOM阳性、CD201阳性、CD44阳性、CD73阳性、HLA‑ABC阳性、CD34阴性、CD31阴性和CD326阴性。本发明提供的人胎盘源促血管干细胞外囊泡较人脐带间充质干细胞外囊泡高富含蛋白酶体和血管生成蛋白因子，其中的蛋白酶体具有高糜蛋白酶样活性。并且，体内外实验数据均显示，本发明提供的人胎盘源促血管干细胞外囊泡高富含蛋白酶体，能够降解HIF的累积，抑制细胞凋亡；对心肌梗死具有治疗作用。

Description

富含蛋白酶体人胎盘源促血管干细胞外囊泡分离及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及富含蛋白酶体人胎盘源促血管干细胞外囊泡分离及其应用。

背景技术

心血管疾病是一类慢性退行性疾病，也是全球主要死亡原因之一，每年导致超过1500万人死亡（Nat Rev Cardiol, 2017, 14(1): 39-55）。泛素-蛋白酶体功能障碍已被证实与心血管疾病的发生和发展密切相关（Nat Rev Mol Cell Biol, 2018, 19(11): 697-712）。在人类肥厚型心肌病、扩张型心肌病以及结蛋白相关心肌病中，均观察到蛋白质聚集体的存在和泛素-蛋白酶体系统的功能异常（Circulation, 2010, 121(8): 997-1004；Proc Natl Acad Sci U S A, 2004, 101(27): 10132-6）。特异性基因敲除心肌细胞蛋白酶体可加剧小鼠心肌缺血再灌注损伤（Circ Res, 2012, 111(5): 532-42）。硫酸盐酸四氢氧化物通过减少GPX4的泛素-蛋白酶体降解，在缺血/再灌注过程中抑制铁死亡和细胞凋亡（Molecules, 2023, 28(10)）。因此，通过移植具有活性的蛋白酶体以改善缺血性心脏病，有望成为一种新型的治疗策略。

泛素-蛋白酶体系统（UPS）是真核细胞内蛋白质降解的主要途径。该系统的核心组分是26S蛋白酶体，由一个催化核心颗粒20S和一个调控颗粒19S组成，其中20S核心在进化上高度保守（Biomolecules, 2021, 11(1), 60）。20S蛋白酶体是由四个异源七聚体环叠合而成的筒状结构：内层的两个β环具有多种蛋白酶样活性，负责蛋白质水解；外层的两个α环则调控底物进入（Frontiers in Molecular Biosciences, 2019, 6, 48）。19S调控复合体可进一步分为基座（base）和顶盖（lid）两部分：基座协助底物转运和解折叠，顶盖则参与识别多聚泛素化标记并对其进行去除（Cell Reports, 2025, 44(8), 116041）。作为细胞内蛋白质降解和稳态维持的关键调控因子，蛋白酶体功能紊乱与多种疾病的发生密切相关，包括心血管疾病、神经系统病变和肿瘤等。目前，大多数研究集中于细胞内的蛋白酶体过程。在低氧等应激条件下，细胞可引发一系列应答反应，导致内源性蛋白酶体组成发生显著变化。例如，在急性氧化应激中，26S蛋白酶体可逆性地解离为20S核心颗粒和19S调控复合体（Cell Rep, 2014, 7(5), 1371-1380）。

低氧诱导因子1（HIF-1）是细胞响应低氧环境的关键转录调控因子，通常由HIF-1α和HIF-1β两个亚基组成异源二聚体。在常氧条件下，HIF-1α的稳定性受到促脯氨酸羟化酶（PHDs）的精密调控：PHDs对HIF-1α特定脯氨酸残基进行羟基化修饰，使其能够被vonHippel-Lindau（VHL）蛋白识别，进而通过泛素-蛋白酶体途径降解（N Engl J Med, 2011,364(7): 656-665; Mol Cell, 2008, 30(4): 393-402）。而在缺氧状态下，PHD酶活性受到抑制，导致HIF-1α积累，与HIF-1β形成二聚体后转位至细胞核，启动一系列参与血管生成、能量代谢和氧感知等过程的靶基因表达（Nature, 2022, 610(7933): 783-790; EurUrol, 2016, 69(4): 646-657）。HIF-1α的精确调控对细胞应对低氧和过量活性氧（ROS）所致损伤、维持生存至关重要（Redox Biol, 2019, 25: 101109）。然而，HIF-1α水平异常升高也被证实可加剧多种疾病的病理进程（Redox Biol, 2024, 73: 103205）。如在系统性红斑狼疮和类风湿性关节炎等炎性自身免疫疾病患者体液中可检测到HIF-1α显著高表达，提示其可能促进疾病发展（Front Immunol, 2022, 13: 1073971）。相反，抑制HIF-1α活性被证明可缓解此类炎症性疾病的临床表现（JCI Insight, 2023, 8(16): e166076; ActaPharmacol Sin, 2025, 46(8): 2225-2236）。在缺血性心肌疾病中，抑制HIF-1α能够促进心肌梗死的再生修复作用。

细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）是由细胞分泌、并被脂质双层膜包裹的微小囊泡结构，广泛分布于细胞外基质中。根据其生物发生机制的不同，EVs主要可分为外泌体、微囊泡和凋亡小体三类（Life (Basel), 2022, 12(11): 1942）。外泌体起源于多泡体与细胞质膜融合后释放其内部囊泡的过程（Biology (Basel), 2021, 10(7): 606）；而微囊泡和凋亡小体则主要通过细胞膜直接向外芽生形成（Small GTPases, 2016, 8(4):220-232; Adv Sci (Weinh), 2022, 9(15): e2103222）。EVs内部包裹着高度异质性的生物分子货物，包括核酸、蛋白质、脂质及细胞器等（Int J Biol Sci, 2021, 17(1): 163-177）。这些囊泡在细胞间通信、免疫调节和组织发育等生理过程中扮演关键角色，同时也与多种疾病状态密切相关，如癌症和心血管疾病等（Theranostics, 2018, 8(1): 237-255）。

目前，大多数关于蛋白酶体的研究主要集中于其在细胞内的功能。然而，越来越多的证据表明，细胞外蛋白酶体同样存在于多种生理过程中并发挥重要作用。例如，血小板来源的胞外囊泡（EVs）被证实携带具有抗原呈递功能的蛋白酶体；此外，在凋亡过程中产生的外泌体样囊泡中也检测到了具有免疫调节活性的20S蛋白酶体（Sci Transl Med, 7(318),318）。值得注意的是，细胞在缺氧状态下可引发一系列应激反应，导致内源性蛋白酶体发生显著改变。在急性氧化应激条件下，26S蛋白酶体可逆性地解离为20S核心颗粒和19S调节复合物（Cell Rep, 7(5), 1371-1380）；而长期氧化应激则可能损害26S蛋白酶体的功能，进而引起泛素化蛋白的异常聚集（Sci Signal, 3(151)）。因此，通过EVs递送外源性蛋白酶体以调控缺氧细胞中HIF蛋白的降解，可能为缺血性疾病提供一种新的治疗策略。

发明内容

发明要解决的问题

申请号为202510757426.X，发明名称为“人胎盘源促血管干细胞hPASCs及其应用”的专利申请记载了本发明的发明人在之前的研究中发现的人胎盘源促血管干细胞（hPASCs），本发明在对其进行更深入的研究时，意外发现其可以产生富含蛋白酶体的细胞外囊泡。

基于此，本发明的首要目的在于提供富含蛋白酶体的人胎盘源促血管干细胞外囊泡（hPASCs-EVs）及其分离方法。同时，基于本发明发现的hPASCs-EVs在体内外的蛋白降解功能及抗调亡作用，本发明还提供了hPASCs-EVs在泛素-蛋白酶体功能障碍相关疾病如缺血性心脏疾病中的应用。

用于解决问题的方案

为了解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明第一方面提供了一种细胞外囊泡，所述细胞外囊泡来源于人胎盘源促血管干细胞，所述人胎盘源促血管干细胞呈标志物PAI-1阳性、MECOM阳性、CD201阳性、CD44阳性、CD73阳性、HLA-ABC阳性、CD34阴性、CD31阴性和CD326阴性。

在一些实施方案中，所述人胎盘源促血管干细胞呈标志物PAI-1阳性、MECOM阳性、CD201阳性、CD44阳性、CD73阳性、HLA-ABC阳性、CD34阴性、CD146阴性，CD31阴性和CD326阴性。

在一些实施方案中，所述人胎盘源促血管干细胞于2025年4月2日保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C202592。

在一些实施方案中，所述细胞外囊泡表达特异性标记物CD81、CD63和ALIX。

在一些实施方案中，所述细胞外囊泡较来源于人脐带间充质干细胞的细胞外囊泡高富含如下蛋白酶体亚基中的任意一种或多种：PSMA1，PSMA2，PSMA3，PSMA4，PSMA5，PSMA6，PSMA7，PSMB1，PSMB5/PSMB8，PSMB6/PSMB9，PSMB7/PSMB10，PSMD1，PSMD3，PSMD6，PSMD7，PSMD11，PSMD13。

在一些优选的实施方案中，所述细胞外囊泡较来源于人脐带间充质干细胞的细胞外囊泡高富含如下蛋白酶体亚基：PSMA1，PSMA2，PSMA3，PSMA4，PSMA5，PSMA6，PSMA7，PSMB1，PSMB5/PSMB8，PSMB6/PSMB9，PSMB7/PSMB10，PSMD1，PSMD3，PSMD6，PSMD7，PSMD11，PSMD13。

在一些实施方案中，所述细胞外囊泡较来源于人脐带间充质干细胞的细胞外囊泡高富含如下蛋白因子中的任意一种或多种：HGF、ANGP1、VCAM1、TIMP3、FGF2、CO6A1、CO6A2、ILRL1、IL6RB。

在一些优选的实施方案中，所述细胞外囊泡较来源于人脐带间充质干细胞的细胞外囊泡高富含如下蛋白因子：HGF、ANGP1、VCAM1、TIMP3、FGF2、CO6A1、CO6A2、ILRL1、IL6RB。

本发明第二方面提供了本发明第一方面所述的细胞外囊泡的分离方法，所述分离方法包括如下步骤：

（i）利用无血清培养基培养人胎盘源促血管干细胞，收集对数生长期的人胎盘源促血管干细胞培养上清，对所述人胎盘源促血管干细胞培养上清进行800×g-1200×g离心10-15min，获得上清液I，

（ii）对上清液I进行3000×g-3500×g离心10-15min，获得上清液II；

（iii）对上清液II进行10000×g-12000×g离心30-40min，获得上清液III；

（iv）对上清液III进行130000×g-150000×g离心70-90min，获得沉淀，即得。

在一些实施方案中，所述无血清培养基为无血清的周边细胞培养基。

在一些实施方那中，所述分离方法不包括使用滤膜进行过滤的步骤。

本发明第三方面提供了本发明第二方面所述的分离方法分离得到的细胞外囊泡。

本发明第四方面提供了本发明第一方面或第三方面所述的细胞外囊泡的用途：在制备用于预防和/或治疗泛素-蛋白酶体功能障碍相关疾病的药物中的用途。

在一些实施方案中，所述泛素-蛋白酶体功能障碍相关疾病包括心血管疾病、神经退行性疾病、癌症和自身免疫性疾病中的任意一种或多种。

在一些具体的实施方案中，所述心血管疾病包括高血压、中风、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、结蛋白相关心肌病、动脉粥样硬化、心肌缺血再灌注损伤、缺血性心肌梗死中的任意一种或多种。

在一些具体的实施方案中，所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症中的任意一种或多种。

在一些具体的实施方案中，所述癌症包括多发性骨髓瘤、恶病质中任意一种或多种。

在一些具体的实施方案中，所述自身免疫性疾病包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮中的任意一种或多种。

在一些实施方案中，所述泛素-蛋白酶体功能障碍相关疾病为心血管疾病。

在一些具体的实施方案中，所述泛素-蛋白酶体功能障碍相关疾病为缺血性心脏疾病。

在一些具体的实施方案中，所述泛素-蛋白酶体功能障碍相关疾病为缺血性心肌梗死。

本发明第五方面提供了本发明第一方面或第三方面所述的细胞外囊泡的用途：用于预防和/或治疗泛素-蛋白酶体功能障碍相关疾病。

本发明第六方面提供了一种预防和/或治疗泛素-蛋白酶体功能障碍相关疾病的方法，所述方法包括向对其有需要的个体施用有效量的本发明第一方面或第三方面所述的细胞外囊泡的步骤。

发明的效果

通过上述技术方案的实施，本发明取得了如下有益效果：

本发明提供了一种人胎盘源促血管干细胞外囊泡（hPASCs-EVs）。实验数据显示，hPASCs-EVs较人脐带间充质干细胞外囊泡（hUCMSCs-EVs）富含蛋白酶体和血管生成蛋白因子，hPASCs-EVs蛋白酶体较hUCMSCs-EVs蛋白酶体具有高糜蛋白酶样活性。并且，hPASCs-EVs相比hUCMSCs-EVs具有更好的体外促进血管内皮细胞成管的能力。

进一步，实验数据显示，hPASCs-EVs可以抑制CoCl₂诱导的细胞凋亡及HIF-1α表达，机理层面的研究显示，hPASCs-EVs通过泛素化降解HIF-1α改善CoCl₂诱导的缺氧，同时，hPASCs-EVs也可以抑制蛋白酶体抑制剂MG-132诱导的hUVECs凋亡及HIF-1α表达，机理层面的研究显示，hPASCs-EVs可以泛素化降解HIF-1α并抑制MG-132诱导的凋亡。更进一步的，实验数据显示，hPASCs-EVs可以抑制MG-132和CoCl₂协同作用诱导的hUVECs凋亡及HIF-1α表达，机理层面的研究显示，hPASCs-EVs可以泛素化降解HIF-1α并抑制MG-132和CoCl₂协同作用诱导的凋亡。

此外，在缺血性心肌梗死小鼠模型中移植hPASCs-EVs，可以通过hPASCs-EVs富含的蛋白酶体改善HIF的累积，从而抑制心肌细胞调亡。这为临床治疗缺血性疾病和hPASCs-EVs的规模化应用提供了理论支持。

附图说明

图1：hPASCs-EVs鉴定结果；其中，A为WB检测hUCMSC-EVs、hPASCs-EVs外囊泡标记蛋白结果，B为WB中蛋白表达定量分析结果；n=3，P<0.05为具有统计差异性。

图2：hPASCs-EVs富含血管生成蛋白因子及蛋白酶体亚基的检测结果；其中，A为hPASCs-EVs较hUCMSCs-EVs高富含血管生成蛋白因子蛋白组学定量分析结果，B为hPASCs-EVs较hUCMSCs-EVs高富含蛋白酶体亚基蛋白组学定量分析结果；n=3，P<0.05为具有统计差异性。

图3：hPASCs-EVs高表达具有糜蛋白酶样活性的20S Proteasome及亚基PSMB5和PSMD11的检测结果；其中，A为WB检测hPASCs-EVs和hUCMSCs-EVs的20S Proteasome、PSMB5和PSMD11的结果，B为WB中20S Proteasome蛋白定量分析结果，C为WB中PSMD11蛋白定量分析结果，D为WB中PSMB5蛋白定量分析结果，E为蛋白酶体糜蛋白酶样活性检测结果；n=3，P<0.05为具有统计差异性。

图4：激光共聚焦显微镜下观察CM-Dil标记的hPASCs-EVs和hUCMSCs-EVs进入eGFP-hUVECs的分布情况（标尺为50μm、25μm）。

图5：hPASCs-EVs促进血管内皮细胞体外形成血管的实验结果；其中，A为倒置荧光显微镜观察不同组别eGFP-hUVECs细胞成管情况（标尺为200μm），B为分支数统计结果，C为总分支长度统计结果（μm），D为节点数统计结果；n=4，P<0.05为具有统计差异性。

图6：hPASCs-EVs抑制细胞凋亡和HIF-1α的表达的检测结果；其中，A为光学显微镜下观察不同组别hUVECs细胞形态变化（标尺为50μm），B中的a为WB检测缺氧诱导因子HIF-1α、BAX、Bcl-2的结果，B中的b为WB中HIF-1α蛋白的定量分析结果，B中的c为WB中Bcl-2蛋白的定量分析结果，B中的d为WB中BAX蛋白的定量分析结果；n=3，P<0.05为具有统计差异性。

图7：hPASCs-EVs蛋白酶体降解泛素化蛋白的检测结果；其中，A为WB检测20S蛋白酶体、PSMD11、PSMB5及泛素化蛋白的结果，B为WB中20S蛋白酶体定量分析结果，C为WB中PSMD11蛋白定量分析结果，D为WB中PSMB5蛋白定量分析结果；n=3，P<0.05为具有统计差异性。

图8：hPASCs-EVs蛋白酶体可泛素化降解HIF-1α和抑制MG-132诱导的凋亡的检测结果；其中，A为光学显微镜观察MG-132及EVs共同处理的细胞形态变化（标尺为50μm），B中的a为WB检测HIF-1α、Bcl-2、BAX的结果，B中的b为WB中HIF-1α蛋白定量分析结果，B中的c为WB中Bcl-2蛋白定量分析结果，B中的d为WB中BAX蛋白定量分析结果；n=3，P<0.05为具有统计差异性。

图9：hPASCs-EVs蛋白酶体降解MG-132诱导的泛素化蛋白的检测结果；其中，A为WB检测20S蛋白酶体、PSMD11、PSMB5及泛素化蛋白的结果，B为WB中20S蛋白酶体定量分析结果，C为WB中PSMD11蛋白定量分析结果，D为WB中PSMB5蛋白定量分析结果；n=3，P<0.05为具有统计差异性。

图10：hPASCs-EVs蛋白酶体抑制MG-132和CoCl₂双重诱导的HIF-1α和凋亡的检测结果；其中，A为光学显微镜观察MG-132和CoCl₂联合和/或EVs共同处理细胞形态的变化，B中的a为WB检测HIF-1α、Bcl-2、BAX的结果，B中的b为WB中HIF-1α蛋白定量分析结果，B中的c为WB中Bcl-2蛋白定量分析结果，B中的d为WB中BAX蛋白定量分析结果；n=3，P<0.05为具有统计差异性。

图11：hPASCs-EVs蛋白酶体降解CoCl₂和MG-132诱导的泛素化蛋白的贱则结果；其中，A为WB检测20S蛋白酶体、PSMD11、PSMB5及泛素化蛋白的结果，B为WB中20S蛋白酶体定量分析结果，C为WB中PSMD11蛋白定量分析结果，D为WB中PSMB5蛋白定量分析结果；n=3，P<0.05为具有统计差异性。

图12：富含蛋白酶体hPASCs-EVs移植于缺血性小鼠心肌D3抑制心肌细胞调亡及泛素化降解作用的检测结果；其中，A为EVs移植后WB检测调亡及20S蛋白酶体、PSMD11、PSMB5及泛素化蛋白的结果，B为WB中蛋白表达定量分析结果；n=3，P<0.05为具有统计差异性。

图13：富含蛋白酶体hPASCs-EVs移植于缺血性小鼠心肌D14抑制心肌细胞调亡及泛素化降解作用的检测结果；其中，A为EVs移植后WB检测调亡及20S蛋白酶体、PSMD11、PSMB5及泛素化蛋白的结果，B为WB中蛋白表达定量分析结果；n=3，P<0.05为具有统计差异性。

图14：富含蛋白酶体hPASCs-EVs移植于缺血性小鼠心肌第7、14和28天心功能超声心动图检测结果；其中，A为EVs移植后LVEF分析结果，B为EVs移植后LVFS分析结果，C为EVs移植后LVIDs分析结果，D为EVs移植后LVIDd分析结果，E为EVs移植后分析LVAWs结果，F为EVs移植后LVAWd分析结果，G为EVs移植后LVPWd分析结果，H为EVs移植后LVPWs分析结果；P<0.05为具有统计差异性。

具体实施方式

以下对本发明的实施方式进行说明，但本发明不限定于此。本发明不限于以下说明的各构成，在发明请求保护的范围内可以进行各种变更，而适当组合不同实施方案、实施例中各自公开的技术手段而得到的实施方案、实施例也包含在本发明的技术范围中。

在本发明中，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”可以指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。与此同时，“包含”、“具有”、“包括”或“含有”也可以表示封闭式的，排除额外的、未引述的元件或方法步骤。

在本发明中，“可以”表示的含义包括了进行某种处理以及不进行某种处理两方面的含义。

在本发明中，“数值A~数值B”、“数值A-数值B”、“数值A以上/以下”表示的数值范围是指包含端点数值A、B的范围。

在本发明中，“约”用以界定本发明的数值范围与参数皆是约略的数值，此处已尽可能精确地呈现具体实施例中的相关数值。除非另有明确的说明，应当理解本发明所用的所有范围、数量、数值与百分比均经过“约”的修饰。在此处，“约”通常是指实际数值在某一特定数值或范围的±5%、±3%、±1%或±0.5%之内。并且本发明中出现的数值，数值范围，均应当理解为包含了工业生产中所不可避免的系统性误差。

在本发明中，“一些具体/优选的实施方案”、“另一些具体/优选的实施方案”、“实施方案”等是指所描述的与该实施方案有关的特定要素（例如，特征、结构、性质和/或特性）包括在此处所述的至少一种实施方案中，并且可存在于其它实施方案中或者可不存在于其它实施方案中。另外，应理解，所述要素可以任何合适的方式组合在各种实施方案中。

在本发明中，所使用的单位名称均为国际标准单位名称，并且如果没有特别声明，所使用的“%”均表示重量或质量百分含量。

在本发明中，“干细胞”是一类具有自我更新和多向分化潜能的原始细胞，其能够产生表现型与基因型和自己完全相同的子细胞，也能够分化成为多种特定功能的细胞类型。

在本发明中，“人胎盘源促血管干细胞（hPASCs）”是指从人胎盘中分离并培养而获得的干细胞。hPASCs具有自我更新和多向分化潜能，其具有向血管内皮细胞、平滑肌细胞分化的潜能；其具有体外成血管功能。本发明中使用的人胎盘源促血管干细胞（hPASCs）已于2025年4月2日保藏于中国典型培养物保藏中心（地址：中国，武汉，武汉大学），保藏编号为CCTCC NO:C202592。本发明分离的hPASCs来源于胎盘血管组织巨噬细胞和/或血管壁干细胞，呈标志物PAI-1阳性、MECOM阳性、CD201阳性、CD44阳性、CD73阳性、HLA-ABC阳性、造血干细胞及内皮祖细胞标志物CD34阴性、内皮细胞标志物CD31阴性和上皮细胞标志物CD326阴性。

在本发明中，“间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）”是一种来源于中胚层的多能基质干细胞，具有强大的自我更新能力和多向分化潜能，同时具有免疫调节功能。MSCs广泛存在于多种组织中，如骨髓、脂肪组织、脐带、牙髓、胎盘、外周血、滑膜等。MSCs主要应用于组织修复与再生和免疫系统疾病与抗炎治疗。

在本发明中，“人脐带间充质干细胞（Human Umbilical Cord Mesenchymal StemCells，hUCMSCs）”是从新生儿脐带组织中分离培养的一类多能间充质干细胞，具有间充质干细胞基本特性，具有多向分化潜能、免疫调节功能、旁分泌效应及归巢能力，在再生医学和细胞治疗领域应用广泛，可用于自身免疫性疾病、神经系统疾病、心血管疾病、生殖系统疾病的治疗，也可用于骨与软骨修复，抗衰老与美容等。hUCMSCs可分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞等。hUCMSCs呈间充质干细胞标志物（CD73、CD90、CD105）阳性、造血系标志物（CD34、CD45）及HLA-DR阴性。

在本发明中，“人脐静脉内皮细胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells，hUVECs）”是人脐带的静脉血管内壁上分离提取的一种内皮细胞，是一种已分化的、具有特定功能的体细胞。hUVECs具有典型的血管内皮特性，如培养时可形成单层屏障。hUVECs广泛用于血管生物学研究、心血管疾病模型构建、药物筛选与毒性测试、炎症与免疫学研究及组织工程中的血管化模型构建。

在本发明中，“个体”、“对象”、“患者”或“受试者”包括哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人、猴、猩猩、猫、狗、牛、羊、猪、马、驼、兔、小鼠、大鼠或豚鼠等。

在本发明中，“心血管疾病（Cardiovascular Diseases，CVD）”是心脏血管和脑血管疾病的统称，泛指由于高脂血症、血液黏稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出血性疾病。

在本发明中，“泛素-蛋白酶体功能障碍”是指机体内泛素-蛋白酶体系统出现功能障碍，其表现可以为细胞内蛋白质降解动态平衡紊乱。已知的与泛素-蛋白酶体功能障碍有关的疾病包括但不限于动脉粥样硬化、高血压、中风、心肌肥大、缺血再灌注损伤、心肌梗死、帕金森病、阿尔茨海默病、亨廷顿病等。

在本发明中，“缺血性疾病”是指由血液供应不足引起的疾病。常见的缺血性疾病包括但不限于缺血性心脏病、缺血性脑卒中、外周动脉疾病、缺血性肠病等、肾动脉狭窄、缺血性视神经病变等。

在本发明中，“心肌梗死”是指心肌的缺血性坏死，为在冠状动脉病变的基础上，冠状动脉的血流急剧减少或中断，使相应的心肌出现严重而持久地急性缺血，最终导致心肌的缺血性坏死。心肌梗死包括原发性急性心肌梗死，继发性急性心肌梗死，突发心源性死亡，与PCI相关的心肌梗死，以及与冠脉搭桥术相关的急性心肌梗死。

在本发明中，“治疗”是指在罹患疾病之后，使受试者接触（例如给药）本发明中所述的来源于人胎盘源促血管干细胞的细胞外囊泡，从而与不接触时相比使该疾病的症状减轻，并不意味着必需完全抑制疾病的症状。罹患疾病是指身体出现了疾病症状。

在本发明中，“预防”是指在罹患疾病之前，通过使受试者接触本发明中所述的来源于人胎盘源促血管干细胞的细胞外囊泡，从而与不接触时相比降低罹患疾病的概率和/或减轻罹患疾病后的症状，并不意味着必需完全抑制患病。

在本发明中，“D3”、“D7”、“D14”、“D28”等可以表示生物材料经过某项处理后的天数，例如小鼠经细胞外囊泡移植后第3天、第7天、第14天、第28天等。

在本发明中，“有效量”包含足以改善或预防生理症状或病症的量。用于特定对象的有效量可依据以下因素而变化：如待改善的症状、对象的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性等。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。

在本发明中，“预防或治疗有效量”指以需要的剂量并持续需要的时间段，有效实现所需预防或治疗结果的量。

在本发明中，“施用”、“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织或器官等时，是指外源性药物（例如本发明中所述的来源于人胎盘源促血管干细胞的细胞外囊泡）、治疗剂或组合物与动物、人、实验受试者、细胞、组织或器官的接触。

除非另有定义，否则本文中使用的其他所有技术和科学术语均具有与本领域一般技术人员通常所理解的含义相同的含义。

实施例

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用材料或仪器除非特别说明，均为可以使用通过市购获得的常规产品。

实施例1：富含蛋白酶体hPASCs-EVs的分离、鉴定

1.1 hPASCs分离培养

hPASCs的分离培养参照中国专利申请202510757426.X进行，其内容通过引用并入本申请中。具体如下：

hPASCs从人胎盘组织中分离，人胎盘组织消化，消化产物沉降获取上清，上清经一次性无菌滤网过滤后收集滤膜并反冲滤膜获得胎盘微血管组织（直径为40μm-100μm，优选40μm-70μm），胎盘微血管组织在专用培养基（hPASCs培养基）中培养获得原代细胞。hPASCs培养基以周边细胞培养基（ScienCell^TM，Cat.1201-b）作为基础培养基，并添加青霉素/链霉素双抗（ScienCell^TM，Cat.1201套件中的penicillin/streptomycin solution (P/S),Cat.0503）及细胞因子（ScienCell^TM，Cat.1201套件中的Pericyte Growth Supplement(PGS)，Cat.1252）。hPASCs传代至第5代进行相关分析鉴定。hPASCs接种于无菌培养皿（JetBiofil，TCD000100），37.5℃，置于5% CO₂恒温箱培养。每隔2天换液，每4-5天传代。

经鉴定，hPASCs是具有血管生成潜能的干细胞群体，且不同于已有干细胞类型，因此将其定义为一种新型干细胞：人胎盘源促血管干细胞（human placenta derivedangiogenic stem cells），简称hPASCs。获得的人胎盘源促血管干细胞（hPASCs）已于2025年4月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学；保藏编号：CCTCCNO:C202592。

hPASCs的特征性表面分子标志谱系：hPASCs阳性表达PAI-1，MECOM；同时经流式分析hPASCs阳性表达CD201，CD44，CD73及HLA-ABC）；不表达造血干细胞及内皮祖细胞标志物（CD34）、不表达周细胞标志物（CD146）、不表达内皮细胞标志物CD31及阴性表达上皮细胞标志物CD326。

1.2富含蛋白酶体hPASCs-EVs分离

1.2.1 hPASCs培养上清收集

取对数生长期、生长状态良好的hUCMSCs和hPASCs，接种于10cm培养皿中进行大规模体外扩增。培养期间每两日更换培养基一次，同时收集细胞培养上清液。

1.2.2富含蛋白酶体hPASCs-EVs分离

(1)使用提前预冷的低温高速离心机，4℃、1000×g对细胞培养上清液离心10min，目的是去掉细胞培养上清液中的细胞；

(2)离心后转移上清至另一离心管3000×g离心10min，目的是去除死细胞沉淀，收集上清至50mL离心管；

(3)使用低温高速离心机，4℃、12000×g离心30min，目的是去除细胞碎片；

(4)随后将浓缩液移至40mL体积超离管中，使用超速冷冻离心机，4℃、150000×g离心70min，获得囊泡沉淀；

(5)弃掉上清，100μl PBS重悬，hUCMSCs-EVs、hPASCs-EVs沉淀吹打混匀，分装于1.5mL无菌的EP管中；将hUCMSCs-EVs、hPASCs-EVs保存于-80℃备用。

1.3富含蛋白酶体hPASCs-EVs鉴定

1.3.1蛋白定量

(1)根据BCA蛋白定量试剂盒说明书配制工作液，A:B=50:1；

(2)配制标准品，按照说明书将标准品（BSA 2mg/mL）用PBS稀释至一定浓度，从A-I管，BSA（μg/μL）浓度分别为2000、1500、1000、750、500、250、125、25、0μg/μL；

(3)在96孔板每孔加100μL工作液和10μL标准品或待测样本；

(4)使用37℃恒温孵育器孵育30min；

(5)使用酶标仪在562nm波长处检测光密度值（OD）；

(6)绘制标准曲线，并根据曲线计算样本蛋白浓度。

1.3.2蛋白变性

(1)根据所得浓度，将样本蛋白浓度调整为等浓度等体积；

(2)按照5×Loading Buffer:样本=1:4的比例，加入Loading Buffer；

(3)使用99℃恒温孵育器变性10min，-20℃保存备用。

1.3.3配制SDS-PAGE凝胶

(1)根据蛋白分子量大小选择合适的分离胶（10%；12%）和浓缩胶（5%）浓度；分离胶配方如下表1所示，浓缩胶配方如下表2所示。

表1 分离胶配方

表2 浓缩胶配方

1.3.4 WB检测流程

(1)上样：将制好的胶板组装在电泳槽里，往两块胶板中间倒入提前配制的1×电泳液，检测是否漏液；随后，拔掉梳子，按蛋白Marker、待测样本、Marker的顺序加样，加样结束后按胶板数量添加电泳液至相应位置，合上电泳槽盖子；

(2)电泳：按正负极连接电泳仪，设置恒压80V，30min，待样本进入分离胶，更改电压为120V，电泳至溴酚蓝到胶板下缘处约1cm时停止电泳；

(3)转膜：转膜前提前将PVDF膜浸泡于甲醇中活化5min；将海绵垫、滤纸和转膜夹板浸泡在加有提前4℃预冷的1×转膜液的托盘中；从电泳槽取下胶板，使用翘板撬开厚板，将凝胶留在薄板上，再将凝胶转移至滤纸上，随后按照转膜夹板负极自上而下放置：海绵垫、两层滤纸、凝胶、PVDF膜、两层滤纸、海绵垫，夹紧转膜夹并置于槽内，同时槽内放置冰盒，倒满转膜液，连接电极。设置参数：300mA，90min；电泳槽外需覆盖冰以避免转膜产热导致温度上升；

(4)封闭：拆开转膜夹，将PVDF膜移至加有5%脱脂奶粉的封闭盒中，室温摇床封闭1h；

(5)洗膜：将封闭液弃去，用TBST洗3次，每次5min；

(6)孵育一抗：将PVDF膜置于保鲜膜中按照目的蛋白分子量大小进行裁剪，放入加有目的蛋白抗体的孵育盒，摇床4℃过夜；

(7)洗膜：回收一抗，用TBST洗4次，每次5min；

(8)孵育二抗：在孵育盒中加入相应种属的二抗，摇床室温1h；

(9)洗膜：回收二抗，用TBST洗4次，每次5min；

(10)曝光：按A:B=1:1比例配制显影液，将PVDF膜浸泡于显影液，使用BIO-RAD多功能凝胶成像分析系统曝光，保存图像；

(11)结果分析：使用Image J软件分析目的蛋白条带，蛋白表达量用相对灰度值表示。GAPDH为内参。

1.4富含蛋白酶体hPASCs-EVs蛋白酶体糜蛋白酶样活性检测

根据Proteasome-Glo™ Chymotrypsin-Like Cell-Based Assay试剂盒制备蛋白酶体-glo™试剂，100µL hUCMSCs-EVs（50µg），100µL hPASCs-EVs（50µg）样品中分别添加蛋白酶体-glo™试剂100µL于96孔板，室温下摇床以700rpm速度混合2min后继续孵育至10min，使用酶标仪化学发光模块进行检测，数据使用GraphPad Prism 8.0.1软件进行统计分析，n=3。

1.5蛋白组学

实验以Q Exactive Plus质谱仪进行定量蛋白质组学分析。使用ProtesomeDiscoverer软件进行数据库检索，根据FDR<0.01的标准对数据库进行筛选，获得高度可性的结果。

1.6结果

1.6.1 hPASCs-EVs与hUCMSCs-EVs分离与鉴定

我们使用免疫蛋白印迹技术对收集与分离的EVs检测外囊泡特异性标记物CD81、CD63和ALIX，结果表明hPASCs-EVs和hUCMSCs-EVs均表达（图1中的A），统计分析表明hPASCs-EVs较hUCMSCs-EVs高表达ALIX（P=0.0018）及CD81（P=0.0018），但CD63两者表达无差异（图1中的B）。该结果表明hPASCs-EVs与hUCMSCs-EVs符合外囊泡特征。

1.6.2 hPASCs-EVs较hUCMSCs-EVs高富含蛋白酶体亚基

蛋白组学定量分析表明，hPASCs-EVs较hUCMSCs-EVs高富含血管生成蛋白因子如HGF、ANGP1、VCAM1、TIMP3、FGF2、CO6A1、CO6A2、ILRL1及IL6RB（图2中的A）。进一步对蛋白酶体亚基分析表明，hPASCs-EVs较hUCMSCs-EVs高富含蛋白酶体亚基如PSMA1，PSMA2，PSMA3，PSMA4，PSMA5，PSMA6，PSMA7，PSMB1，PSMB5/PSMB8，PSMB6/PSMB9，PSMB7/PSMB10，PSMD1，PSMD3，PSMD6，PSMD7，PSMD11，PSMD13（图2中的B）。

1.6.3 hPASCs-EVs中富含具有糜蛋白酶样活性的20S蛋白酶体（20S Proteasome）及PSMB5，PSMD11

为进一步证明蛋白组学富集的蛋白酶体相关蛋白表达，我们对干细胞外囊泡进行免疫蛋白印迹分析蛋白酶体及相关亚基的表达，包括20S蛋白酶体和代表关键酶活性的糜蛋白酶样活性的β亚基PSMB5，以及帽子结构19S蛋白酶体的PSMD11。为保证上样量一致，对hPASCs-EVs与hUCMSCs-EVs进行蛋白定量。免疫蛋白印迹结果显示（图3中的A），hPASCs-EVs较hUCMSCs-EVs高表达20S Proteasome（P=0.0166）（图3中的B）、PSMD11（P<0.0001）（图3中的C）、PSMB5（P<0.0001）（图3中的D），并具有显著统计学差异。同时使用Proteasome-Glo™Chymotrypsin-Like Cell-Based Assay检测糜蛋白酶样活性，发现hPASCs-EVs蛋白酶体较hUCMSCs-EVs蛋白酶体具有高糜蛋白酶样活性并具有显著统计学差异（P=0.0001）（图3中的E）。这些结果进一步验证了hPASCs-EVs蛋白酶体相关蛋白表达与测序结果一致，同时也揭示了hPASCs-EVs与hUCMSCs-EVs在20S蛋白酶体表达及酶活性方面的差异。

实施例2：hPASCs-EVs对人脐静脉内皮细胞（human Umbilical Vein EndothelialCells，hUVECs）在3D Matrigel中的促血管生成作用

2.1 hUVECs细胞复苏及培养

2.1.1.1复苏前准备

(1)打开37℃水浴锅，FBS、DMEM、P/S、GlutaMax提前解冻；

(2)配制含10% FBS、1% P/S和1% GlutaMax的DMEM培养基；

(3)准备一15mL离心管加入3mL DMEM培养基备用。

2.1.1.2复苏

(1)从液氮罐取出冻存的细胞，卡在EP管卡套，快速放入水浴锅摇晃使其快速融化；

(2)使用75%乙醇对冻存管进行消毒后放入超净台，将细胞转移至提前准备含有DMEM培养基的15ml离心管中，室温1000rpm，离心5min;

(3)将离心管用75%乙醇消毒置于超净台，弃去培养基，用ECM培养基重悬，然后接种于10cm培养皿或者6孔板；

(4)将培养皿/板置于37℃、5% CO₂的细胞培养箱中培养，每两天更换一次培养基。

2.1.2 hUVECs细胞传代

(1)hUVECs培养在含5%的FBS、1%青霉素/链霉素和1%谷氨酰胺的ECM培养基中，待细胞密度达到70%-80%时，弃去培养基，PBS洗一次；

(2)10cm培养皿添加1ml含EDTA的胰酶进行消化，6孔板添加200μL胰酶，将培养皿/板转移至37℃细胞培养箱消化2min，期间准备一15mL离心管加入2mL DMEM培养基；

(3)取出培养皿/板，添加反应终止液，用枪头反复吹打，将其制成细胞悬液转移至含DMEM的离心管，离心机1000rpm离心5min；

(4)离心结束后，弃去消化液，用ECM重悬细胞，根据比例以及后续实验安排将细胞接种于培养皿或6孔板。

2.2 CM-Dil干细胞外囊泡标记及摄取

(1)将50μL CM-Dil外囊泡标记染料分别与1mL稀释的800μg/mL hUCMSC-EVs，800μg/mL hPASCs-EVs混匀在37℃细胞培养箱孵育30 min；

(2)随后移入锥底聚丙烯快封管，加入3mL PBS，使用超速离心机150000×g、4℃离心70min；

(3)弃去上清，使用PBS重悬混匀，分装至EP管，-80℃避光保存备用；

(4)复苏eGFP-hUVECs细胞，接种于10cm大皿，待细胞密度达70%-80%，胰酶消化eGFP-hUVECs细胞，细胞计数，调整细胞密度为2.5×10⁶cell/mL，每孔100μL接种于有细胞爬片的24孔板；

(5)待细胞贴壁且浓度达70%，将50μL Dil-hUCMSC-EVs和50μL Dil-hPASCs-EVs分别加入24孔板培养48h；

(6)弃去培养基，用PBS洗两次，4％多聚甲醛固定10min；

(7)弃去4%多聚甲醛，PBS清洗2次，将爬片取出，用DAPI染细胞核，封片，使用激光共聚焦显微镜进行观察拍照。

2.3内皮细胞成管实验

(1)提前解冻Matrigel，将96孔板，未开封的枪头置于4℃预冷；

(2)将50μL Matrigel加入预冷的96孔板中，置于37℃培养箱30min至基质胶充分凝固；

(3)取对数生长期的eGFP-hUVECs细胞，弃去培养基，PBS洗1次，添加适量胰酶进行消化，添加中止液，反复吹打制成细胞悬液，1000×g离心4min；

(4)离心结束后，弃去消化液，使用不含血清的ECM培养基重悬，细胞计数，调整密度为2.5×10⁵cell/mL，加或不加50μg/mL hUCMSC-EVs、50μg/mL hPASCs-EVs；

(5)每孔加入100μL的细胞悬液，转移至37℃细胞培养箱（5%CO₂）孵育48h后使用蔡司倒置荧光显微镜采集图像；

(6)使用ImageJ对形成管的分支数量及长度进行统计分析。

2.4结果

2.4.1 CM-Dil染料标记hPASCs-EVs细胞示踪

我们将分离的hPASCs-EVs及hUCMSCs-EVs与CM-Dil染料在37℃培养箱共孵育30min后，随后将其添加到铺有eGFP-hUVECs细胞的孔板中共孵育48h，使用激光共聚焦显微镜观察发现Dil-EVs呈红色，eGFP-hUVECs细胞呈绿色，细胞核DAPI着色呈蓝色。hPASCs-EVs、hUCMSCs-EVs均可以被血管内皮细胞摄入，并且围绕细胞核周围（图4）。

2.4.2 hPASCs-EVs具有促进血管内皮细胞成管能力

为检测hPASCs-EVs对内皮细胞成管能力的影响，我们采用体外血管形成实验。取对数生长期的eGFP-hUVECs细胞，消化后使用不含血清的ECM重悬并调整密度为2.5×10⁵cell/mL。加入或不加入50μg/mL的hUCMSC-EVs、50μg/mL的hPASCs-EVs。对不同处理的eGFP-hUVECs细胞进行种植在基质胶上，在37℃细胞培养箱（5% CO₂）中孵育48h。然后倒置荧光显微镜下观察成管现象，hPASCs-EVs较hUCMSCs-EVs在3D Matrigel上稳定血管内皮的成管能力更强（图5中的A）。经过统计分析，发现hPASCs-EVs组的分支数（P=0.012）（图5中的B）、总分支长度（P=0.001）（图5中的C）和分支节点数（P=0.047）（图5中的D）均多于hUCMSCs-EVs组并具有显著统计学差异。这些结果表明，hPASCs-EVs可以增强内皮细胞成管能力，相比之下hUCMSCs-EVs的影响较小。

实施例3：富含蛋白酶体hPASCs-EVs对缺氧诱导因子氯化钴处理hUVECs引起的细胞调亡的抑制作用及对蛋白的降解作用

CoCl₂作为一种常用的缺氧模拟剂，可通过抑制HIF-1α的降解导致其在细胞内积累[Stem Cells Int, 2022, 8775591；Cells, 9(3), 757]。本实施例利用CoCl₂诱导构建内皮细胞缺氧模型，评估PASCs-EVs递送的蛋白酶体对HIF-1α降解的影响。

3.1氯化钴（CoCl₂）处理

将hUVECs接种于6孔板随机分为control组、300μM CoCl₂组、300μM CoCl₂+100μghUCMSCs-EVs组和300μM CoCl₂+100μg hPASCs-EVs组，在37℃细胞培养箱培养72h后进收样进行WB检测。

3.2 hUVECs细胞总蛋白提取

(1)药物处理细胞结束后，弃去培养基，用PBS洗2遍；

(2)6孔板每孔加入120μL提前配制好的RIPA裂解液（蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物=1:50），裂解5min；

(3)使用提前消毒的细胞刮刀，刮下贴壁细胞，收集至EP管中；

(4)使用提前预冷的离心机，4℃、12000rpm离心15min；

(5)取上清，转移至新的EP管，-80℃保存备用。

(6)蛋白质免疫印迹（Western blotting，WB）同前。

3.3统计学分析

数据使用IBM SPSS统计软件（v25）和GraphPad Prism 8.0.1软件进行统计分析。实验数据均以均值±标准差表示。使用偏度值的绝对值/偏度的标准误和峰度值/峰度的标准误的标准评估数据正态性，当两个条件都小于1.96时符合正态性。使用Levene's检验评估方差齐性，若P>0.1，则满足方差齐性假设，对比两个独立组之间的差异使用t检验；当方差不齐时，应用Welch双样本t检验；评估三个或多组之间的统计差异，数据符合方差分析的正态性、独立性和方差齐性时，使用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合Tukey事后分析；当方差不齐时，采用Tamhane's T2事后检验。当P<0.05表示差异有统计学意义，并使用GraphPad Prism 8.0.1生成统计图表。

3.4 结果

3.4.1富含蛋白酶体hPASCs-EVs降解CoCl₂诱导的HIF-1α累积及抑制细胞调亡作用

为验证hPASCs-EVs对细胞缺氧的影响，我们采用300μM CoCl₂作用hUVECs 72h诱导缺氧。通过普通光学显微镜观察发现CoCl₂处理组细胞出现大量减少，形态由鹅卵石样变细长，细胞收缩和细胞质浓缩的特征。而给予hPASCs-EVs后的细胞形态接近于对照组且细胞数量较多（图6中的A），表明hPASCs-EVs对恢复细胞形态和数量具有一定的作用。本实验还从蛋白角度评估hPASCs-EVs对缺氧的作用，WB结果显示hPASCs-EVs较CoCl₂组蛋白HIF-1α（P=0.0253）（图6中的B中的b）、促凋亡蛋白BAX（P=0.0421）（图6中的B中的d）下调明显且具有显著统计学差异；但hUCMSCs-EVs处理组与CoCl₂组比较HIF-1α及BAX表达无统计学差异（图6中的B中的b和d）；与hUCMSCs-EVs组比较，hPASCs-EVs组HIF-1α（P=0.0087）（图6中的B中的b）、BAX（P=0.0024）（图6中的B中的d）表达下调具有显著统计学差异。同时hPASCs-EVs较CoCl₂组（P=0.0358）、hUCMSCs-EVs组（P=0.0290）高表达Bcl-2，并具有统计学差异（图6中的B中的c）。由此可见，hPASCs-EVs可能通过抑制HIF-1α的表达和抗凋亡来改善由CoCl₂诱导的缺氧状态。

3.4.2富含蛋白酶体hPASCs-EVs通过泛素化降解HIF-1α改善CoCl₂诱导的缺氧

HIF-1α在常氧情况下被氧依赖性脯氨酰羟化酶羟基化，从而被VHL-E3泛素连接酶复合物将其靶向泛素化，然后被蛋白酶体降解。结合前面发现hPASCs-EVs高表达蛋白酶体，因此为进一步验证hPASCs-EVs蛋白酶体降解HIF-1α，通过免疫蛋白印迹分析（图7中的A）发现hPASCs-EVs较CoCl₂组20S蛋白酶体（P<0.0001）（图7中的B）、蛋白酶体亚基PSMD11（P=0.0434）（图7中的C）、PSMB5（P=0.0268）（图7中的D）表达上调明显且具有显著统计学差异；但hUCMSCs-EVs与CoCl₂组比较20S蛋白酶体、PSMD11、PSMB5表达无统计学差异（图7中的B-D）；与hUCMSCs-EVs组比较，hPASCs-EVs组20S蛋白酶体（P<0.0001）（图7中的B）、蛋白酶体亚基PSMD11（P=0.0458）（图7中的C）、PSMB5（P=0.0478）（图7中的D）表达上调且具有显著统计学差异。hPASCs-EVs组泛素化蛋白累积较CoCl₂组，hUCMSCs-EVs组均减少（图7中的A）。这表明hPASCs-EVs源蛋白酶体可以泛素化降解HIF-1α。

实施例4：富含蛋白酶体hPASCs-EVs对蛋白酶体抑制剂MG-132抑制hUVECs的蛋白降解的作用

MG-132为一种可逆的、靶向蛋白酶体胰凝乳蛋白酶样活性位点的小分子抑制剂[Cancer Res, 66(12), 6379-6386；Int J Nanomedicine, 18, 6199-6212]。为进一步明确外源性蛋白酶体的作用，本实施例使用MG-132，以特异性验证hPASCs-EVs所递送蛋白酶体的功能。

4.1蛋白酶体抑制剂MG-132抑制hUVECs的作用

将hUVECs接种于6孔板随机分为control组、0.25μM MG-132组、0.25μM MG-132+100μg hUCMSCs-EVs组和0.25μM MG-132+100μg hPASCs-EVs组，在37℃细胞培养箱培养72h后进行蛋白调亡及泛素化检测。

4.2氯化钴（CoCl₂）及MG-132协同抑制hUVECs的作用

将hUVECs接种于6孔板随机分为control组、300μM CoCl₂+0.25μM MG-132组、300μM CoCl₂+0.25μM MG-132+100μg hUCMSCs-EVs组和300μM CoCl₂+0.25μM MG-132+100μghPASCs-EVs组，在37℃细胞培养箱培养72h后进行进行蛋白调亡及泛素化检测。

4.3蛋白质免疫印迹（Western blotting，WB）同前。

4.4结果

4.4.1富含蛋白酶体hPASCs-EVs对蛋白酶体抑制剂MG-132诱导hUVECs凋亡的抑制及对HIF-1α的降解作用

为进一步验证hPASCs-EVs蛋白酶体在常氧情况下是否可降解HIF-1α，我们使用0.25μM的蛋白酶体抑制剂MG-132进行干预72h，光学显微镜观察细胞稀疏且形态由鹅卵石样变成细长，细胞核皱缩，在同时给予hUCMSCs-EVs组的细胞数量略多于MG-132组，而hPASCs-EVs组细胞数量较多，形态变化较小，悬浮细胞较少，整体情况较好（图8中的A）。随后进行免疫蛋白印迹结果显示hPASCs-EVs较MG-132组HIF-1α（P=0.0010）（图8中的B中的b）、BAX（P=0.0366）（图8中的B中的d）下调明显且具有显著统计学差异；但hUCMSCs-EVs与MG-132组比较HIF-1α及BAX表达无统计学差异（图8中的B中的b和d）；与hUCMSCs-EVs组比较，hPASCs-EVs组HIF-1α（P=0.0091）（图8中的B中的b）、BAX（P=0.0333）（图8中的B中的d）表达下调具有显著统计学差异。同时hPASCs-EVs组较MG-132组（P=0.0010）、hUCMSCs-EVs组（P=0.0011）高表达Bcl-2，并具有统计学差异（图8中的B中的c）。这表明MG-132可以阻断常氧状态下HIF-1α蛋白泛素化降解，而给予hPASCs-EVs处理可以下调HIF-1α蛋白的表达。

4.4.2富含蛋白酶体hPASCs-EVs对蛋白酶体抑制剂MG-132抑制hUVECs泛素化蛋白降解的作用

在蛋白水平，还检测了20S蛋白酶体以及其亚基PSMD11、PSMB5和泛素化蛋白的表达（图9中的A）。结果显示hPASCs-EVs较MG-132组20S蛋白酶体、蛋白酶体亚基PSMD11（P=0.0361）（图9中的C）、PSMB5（P=0.0047）（图9中的D）表达上调明显且具有显著统计学差异；但hUCMSCs-EVs与MG-132组比较20S蛋白酶体、PSMD11、PSMB5表达无统计学差异（图9中的B-D）；与hUCMSCs-EVs组比较，hPASCs-EVs组20S蛋白酶体（P=0.0381）（图9中的B）、PSMD11（P=0.0360）（图9中的C）表达上调且具有显著统计学差异，但PSMB5无显著差异（图9中的D）。hPASCs-EVs组泛素化蛋白累积较MG-132组、hUCMSCs-EVs组均减少（图9中的A），表明hPASCs-EVs蛋白酶体可以降解泛素化蛋白。综上，hPASCs-EVs蛋白酶体可以泛素化降解HIF-1α及抑制MG-132诱导的凋亡。

4.4.3富含蛋白酶体hPASCs-EVs对MG-132和CoCl₂协同作用诱导hUVECs凋亡的抑制及对HIF-1α的降解作用

为进一步验证hPASCs-EVs蛋白酶体在缺氧状态的作用，使用MG-132来阻断hUVECs细胞蛋白酶体的作用。通过MG-132和CoCl₂的联合处理72h后，镜下观察细胞发现CoCl₂+MG-132联合处理组以及给予hUCMSCs-EVs组贴壁细胞减少，悬浮细胞居多，细胞皱缩，伸出长触角。而hPASCs-EVs组贴壁细胞数量多，悬浮细胞少（图10中的A）。在蛋白水平检测HIF-1α、Bcl-2和BAX（图10中的B中的a），结果表明hPASCs-EVs组HIF-1α（P=0.0038）、BAX（P=0.0014）较CoCl₂+MG-132组下调明显（图10中的B中的b和d）；但hUCMSCs-EVs与MG-132+CoCl₂组比较HIF-1α及BAX表达无统计学差异（图10中的B中的b和d）；与hUCMSCs-EVs组比较，hPASCs-EVs组HIF-1α（P=0.0002）（图10中的B中的b）、BAX（P=0.0001）（图10中的B中的d）表达下调具有显著统计学差异。同时hPASCs-EVs组较CoCl₂+MG-132组（P=0.0459），hUCMSCs-EVs组（P=0.0067）高表达Bcl-2，并具有统计学差异（图10中的B中的c）。

4.4.4富含蛋白酶体hPASCs-EVs对MG-132和CoCl₂协同作用抑制hUVECs泛素化蛋白降解的作用

此外，在蛋白水平还检测了20S蛋白酶体以及其亚基PSMD11、PSMB5和泛素化蛋白的表达（图11中的A）。结果显示hPASCs-EVs较CoCl₂+MG-132组蛋白酶体亚基PSMD11（P=0.0408）（图11中的C）、PSMB5（P=0.0002）（图11中的D）表达上调明显且具有显著统计学差异；但hUCMSCs-EVs与CoCl₂+MG-132组比较20S蛋白酶体以及其亚基PSMD11、PSMB5表达无统计学差异（图11中的B-D）；与hUCMSCs-EVs组比较，hPASCs-EVs组蛋白酶体亚基PSMB5（P=0.0007）（图11中的D）表达上调具有显著统计学差异，但PSMD11无显著差异（图11中的C）。hPASCs-EVs组泛素化蛋白累积较CoCl₂+MG-132组、hUCMSCs-EVs组均减少（图11中的A），表明hPASCs-EVs蛋白酶体可以降解泛素化蛋白。综上，hPASCs-EVs蛋白酶体可以泛素化降解HIF-1α及抑制CoCl₂和MG-132诱导的凋亡。

实施例5：富含蛋白酶体hPASCs-EVs对缺血性心肌梗死抑制调亡及泛素化降解作用

5.1小鼠缺血性心肌梗死模型制备

成年雄性C57BL/6J小鼠用于缺血性心肌梗死模型（AMI），C57BL/6J小鼠选自浙江维通利华获取体重在20-25g（8-10周）的小鼠。小鼠在12小时/日光-黑暗循环、温度24℃、相对湿度50%-60%的环境中饲养，给予标准鼠粮与自来水。AMI模型的构建，使用成年雄性C57BL/6J小鼠。采用3.0%异氟醚（RWD；R510-22-10）进行麻醉，暴露心脏并撕开心包。左前降支冠状动脉距左心耳2mm处以7-0粗线结扎。若左心室前壁变白，表明模型建立成功。

5.2富含蛋白酶体hPASCs-EVs移植于小鼠缺血性心肌梗死模型

小鼠分为假手术组（sham）、PBS组、hUCMSCs-EVs组和hPASCs-EVs组。对缺血性心肌梗死（AMI）模型，在梗死区周围的三个部位直接注射，分别注入40μL PBS、hUCMSCs-EVs（100μg）或40μL hPASCs-EVs（100μg）。

5.3 WB检测

治疗后取梗死区部分于结扎线下部取材，液氮冷冻后保存于-80℃冰箱，行WB检测。

5.4结果

5.4.1富含蛋白酶体hPASCs-EVs移植于缺血性小鼠心肌D3抑制心肌细胞调亡及泛素化降解作用

hPASCs-EVs移植于缺血性心肌梗死模型D3，WB检测发现HIF-1α，泛素化蛋白（ubiquitin）及BAX蛋白表达hPASCs-EVs移植后较hUCMSCs-EVs移植组显著降低；而20Sproteasome、PMSD11及Bcl-2蛋白表达hPASCs-EVs移植后较hUCMSCs-EVs移植组显著升高；泛素化蛋白Ubiquitin表达hPASCs-EVs移植组与正常组表达相似（图12中的A）。统计分析表明hPASCs-EVs移植后较PBS组及hUCMSCs-EVs组20S proteasome（P=0.0471、P=0.0259）、PMSD11（P=0.0383、P=0.0452）和Bcl-2（P=0.0099、P=0.0261）均高表达；而HIF-1α（P=0.0005、P=0.0099）表达水平降低（图12中的B）。该结果表明hPASCs-EVs移植于缺血性心肌梗死模型D3通过蛋白酶体降解HIF-1α的累积，从而抑制调亡，修复损伤心肌组织。

5.4.2富含蛋白酶体hPASCs-EVs移植于缺血性小鼠心肌D14抑制心肌细胞调亡及泛素化降解作用

hPASCs-EVs移植于缺血性心肌梗死模型D14，WB检测发现hPASCs-EVs移植后较PBS及hUCMSCs-EVs组，20S proteasome及Bcl-2表达上调，BAX表达下调，泛素化蛋白Ubiquitin表达hPASCs-EVs移植组与正常组表达相似（图13中的A）。蛋白统计分析表明hPASCs-EVs移植后较PBS及hUCMSCs-EVs组20S proteasome（P=0.0031、P=0.0432），Bcl-2（P=0.0002、P=0.0042）显著上调，hPASCs-EVs移植后较PBS及hUCMSCs-EVs组BAX（P=0.0489、P=0.0466）显著上调，而HIF-1α表达无差异性（图13中的B）。

实施例6：富含蛋白酶体hPASCs-EVs对缺血性心肌梗死治疗作用

6.1小鼠缺血性心肌梗死模型制备及富含蛋白酶体hPASCs-EVs移植

方法同5.1及5.2。

6.2心功能超声心动图检测分析

在缺血性心肌梗死小鼠模型中移植富含蛋白酶体hPASCs-EVs后第7、14、28天，C57BL/6J小鼠接受高分辨率超声成像系统（VisualSonics Vevo 3100）检测以评估心功能。关键参数包括左心室射血分数（LVEF）、左心室短轴缩短率（LVFS）、左心室内部直径（LVIDs、LVIDd）、左心室前壁厚度（LVAWd、LVAWs）以及左心室后壁厚度（LVPWd、LVPWs），均通过左心室短轴M模式Vevo LAB系统（VisualSonics v3.1）计算得到。

6.3结果

6.3.1富含蛋白酶体hPASCs-EVs对缺血性心肌梗死治疗作用

在给缺血性心肌梗死小鼠模型中移植富含蛋白酶体外囊泡后第7、14和28天，心功能超声心动图检测分析显示hPASCs-EVs组的左心室射血分数（LVEF）增幅均显著优于对照PBS组（第7天：P<0.0001，n=12；第14天：P<0.0001，n=12；第28天：P=0.04，n=12）；此外，与hUCMSCs-EVs组相比，第7天（P=0.017，n=12）和第14天（P=0.013，n=12）的LVEF也更高；对照组在接受hUCMSCs-EVs转移后无显著差异（图14中的A）。在hPASCs-EVs移植后，左心室容量性指标LVFS在第7、14和28天均显著高于对照组（P<0.0001、P<0.0001、P=0.031），且在第7天（P=0.005）和第14天（P<0.0001）也优于hUCMSCs-EVs（图14中的B）。第14天时，hPASCs-EVs组的左心室收缩内径（LVIDs）较对照PBS组（P<0.0001）和hUCMSCs-EVs组（P=0.001）均缩短（图14中的C）；在对照PBS组、hPASCs-EVs与hUCMSCs-EVs三组之间，左心室舒张内径（LVIDd）无显著差异（图14中的D）。左心室前壁收缩期厚度（LVAWs）在hPASCs-EVs移植后始终显著高于对照PBS组（第7天：P<0.0001；第14天：P<0.0001；第28天：P<0.0001），且也显著高于hUCMSCs-EVs组（第7天：P=0.018；第14天：P<0.0001；第28天：P=0.012），但对照PBS组与hUCMSCs-EVs组之间无显著差异（图14中的E）。与hUCMSCs-EVs组相比，hPASCs-EVs组在第14天的左心室前壁舒张期厚度（LVAWd）更厚（P=0.019），在第28天对照PBS组LVAWd也更厚（P=0.038）（图14中的F）。第14天，hUCMSCs-EVs组的左心室后壁舒张期厚度（LVPWd）相较对照组更厚（P=0.031），第28天亦如此（P=0.041）（图14中的G）。尽管第14天hPASCs-EVs组的左心室后壁收缩期厚度（LVPWs）相较对照组更厚（P=0.013），但hUCMSCs-EVs组同样显示对照组增厚的趋势（P=0.019）（图14中的H）。在小鼠AMI模型中，hPASCs-EVs在促进心肌修复与再生方面显著优于hUCMSCs-EVs及对照PBS组，具有显著的治疗作用。

Claims (10)

1.一种细胞外囊泡，其特征在于，所述细胞外囊泡来源于人胎盘源促血管干细胞，所述人胎盘源促血管干细胞呈标志物PAI-1阳性、MECOM阳性、CD201阳性、CD44阳性、CD73阳性、HLA-ABC阳性、CD34阴性、CD31阴性和CD326阴性。

2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述人胎盘源促血管干细胞于2025年4月2日保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C202592。

3.根据权利要求1或2所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述细胞外囊泡表达特异性标记物CD81、CD63和ALIX。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的细胞外囊泡，其特征在于，所述细胞外囊泡较来源于人脐带间充质干细胞的细胞外囊泡高富含如下蛋白酶体亚基中的任意一种或多种：PSMA1，PSMA2，PSMA3，PSMA4，PSMA5，PSMA6，PSMA7，PSMB1，PSMB5/PSMB8，PSMB6/PSMB9，PSMB7/PSMB10，PSMD1，PSMD3，PSMD6，PSMD7，PSMD11，PSMD13；

优选地，所述细胞外囊泡较来源于人脐带间充质干细胞的细胞外囊泡高富含如下蛋白因子中的任意一种或多种：HGF、ANGP1、VCAM1、TIMP3、FGF2、CO6A1、CO6A2、ILRL1、IL6RB。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的细胞外囊泡的分离方法，其特征在于，所述分离方法包括如下步骤：

（i）利用无血清培养基培养人胎盘源促血管干细胞，收集对数生长期的人胎盘源促血管干细胞培养上清，对所述人胎盘源促血管干细胞培养上清进行800×g-1200×g离心10-15min，获得上清液I，

（ii）对上清液I进行3000×g-3500×g离心10-15min，获得上清液II；

（iii）对上清液II进行10000×g-12000×g离心30-40min，获得上清液III；

（iv）对上清液III进行130000×g-150000×g离心70-90min，获得沉淀，即得。

6.根据权利要求5所述的分离方法，其特征在于，所述无血清培养基为无血清的周边细胞培养基。

7.根据权利要求5或6所述的分离方法分离得到的细胞外囊泡。

8.根据权利要求1-4中任一项或权利要求7所述的细胞外囊泡在制备用于预防和/或治疗泛素-蛋白酶体功能障碍相关疾病的药物中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在在于，所述泛素-蛋白酶体功能障碍相关疾病包括心血管疾病、神经退行性疾病、癌症和自身免疫性疾病中的任意一种或多种；

优选地，所述心血管疾病包括高血压、中风、肥厚型心肌病、扩张型心肌病、结蛋白相关心肌病、动脉粥样硬化、心肌缺血再灌注损伤、缺血性心肌梗死中的任意一种或多种；

优选地，所述神经退行性疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症中的任意一种或多种；

优选地，所述癌症包括多发性骨髓瘤、恶病质中任意一种或多种；

优选地，所述自身免疫性疾病包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮中的任意一种或多种。

10.根据权利要求8或9所述的用途，其特征在在于，所述泛素-蛋白酶体功能障碍相关疾病为心血管疾病；

优选地，所述泛素-蛋白酶体功能障碍相关疾病为缺血性心脏疾病；

优选地，所述泛素-蛋白酶体功能障碍相关疾病为缺血性心肌梗死。