CN121127596A

CN121127596A - 耐免疫排斥的工程化细胞

Info

Publication number: CN121127596A
Application number: CN202480020037.2A
Authority: CN
Inventors: 周亚丽; 陈功; 曾久琴; 任江涛
Original assignee: Hong Kong Beiheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Beiheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2023-03-02
Filing date: 2024-04-30
Publication date: 2025-12-12
Also published as: EP4663762A2; WO2024179620A2; WO2024179620A3

Abstract

一种免疫抑制分子，其包含免疫抑制蛋白结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域并且不包含初级信号传导结构域，其中所述免疫抑制蛋白选自NKG2A、TIM3、LAG3、TIGIT、CTLA4、PD1和FasL中的两种或两种以上。表达所述免疫抑制分子的工程化细胞以及包含该工程化细胞的组合物。用所述免疫抑制分子来降低免疫排斥的方法。

Description

耐免疫排斥的工程化细胞

相关申请的交叉引用

本公开要求于2023年3月2日提交的国际申请号为PCT/CN2023/079408、名称为“耐免疫排斥的工程化细胞”的PCT国际申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本公开中。

技术领域

本发明属于免疫治疗领域。更具体地，本发明涉及一种免疫抑制分子。本发明还涉及表达所述免疫抑制分子的工程化细胞，以及抑制受试者细胞的免疫排斥的方法。

背景技术

免疫排斥是指机体通过特异性免疫应答破坏移植物(异体细胞、组织或器官)的过程。一般是指移植术后，宿主可识别移植物抗原并产生应答，移植物中免疫细胞也可识别宿主抗原组织并产生免疫应答。在同种异体移植中，免疫排斥反应有两种基本类型：宿主抗移植物反应(HVGR)和移植物抗宿主反应(GVHR)，临床上HVGR更为常见。

过继性细胞疗法(ACT)在肿瘤等疾病治疗中发挥着越来越重要的作用。ACT是指将治疗细胞(如免疫细胞)转移到受试者体内以改善受试者免疫系统的功能和特征的一种疗法，最常应用的治疗细胞类型为T细胞，但其他细胞类型，如NK细胞、B细胞、树突状细胞等也已被应用。治疗细胞可以来源于受试者自身(即自体疗法)或来自相同物种的另一个体(即同种异体疗法)，同种异体疗法与自体疗法相比具有明显的优势，如生产成本更低、受试者等待时间短、适用范围更广等，然而由于受试者与外源的治疗细胞之间存在免疫排斥反应等原因，同种异体疗法尚未得到广泛应用。

临床上应用ACT时，常在施用治疗细胞之前对患者进行清除淋巴细胞或骨髓细胞预处理(例如，应用大剂量的全身化学治疗或联合全身放射)，以减少患者体内的内源免疫细胞，使植入的外源治疗细胞免遭攻击，从而降低免疫排斥反应，为治疗细胞在患者体内的存活和扩增营造一个更有利的环境。然而，清除淋巴细胞或骨髓细胞往往会导致严重的副作用。因此，有必要减少或消除宿主对治疗细胞的免疫排斥反应，以增加治疗细胞在体内的持久性并增强ACT的治疗效果，同时减少清除淋巴细胞或骨髓细胞的需求，避免产生其相关副作用。

为了减少或消除宿主对治疗细胞的免疫排斥反应，目前已有研究利用基因编辑技术在治疗细胞中敲除TCR基因或HLA-I类分子以减少由治疗细胞引起的移植物排斥。然而，经过基因编辑的细胞仍具有免疫原性，会引起宿主体内其他类型免疫细胞的应答，例如，研究表明，在供体T细胞中将B2M敲除，会增加宿主NK细胞介导的移植物排斥的风险。因此，仍然需要对现有的细胞疗法进行改进，尤其是降低患者的免疫排斥反应。

发明内容

除非另有说明，否则本文中所使用的所有科学技术术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解的相同。

I.免疫抑制分子

在第一个方面，本发明提供一种免疫抑制分子，其包含免疫抑制蛋白结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域并且不包含初级信号传导结构域。

术语“免疫抑制分子”是指能够与免疫抑制蛋白(如NKG2A、TIM3、LAG3、TIGIT、CTLA4、PD1、FasL)结合进而抑制受试者对外源细胞的免疫排斥，例如降低受试者体内的免疫细胞(如T细胞、NK细胞等)的杀伤功能或者抑制免疫细胞的过度增殖的分子。术语“免疫抑制蛋白”是对免疫反应发挥抑制作用的配体或受体，其对于维持自身免疫耐受、调节免疫应答的持续时间和幅度起重要作用，从而避免免疫系统对正常组织造成损伤和破坏。本发明中的免疫抑制分子与免疫抑制蛋白NKG2A、TIM3、LAG3、TIGIT、CTLA4、PD1、FasL中的两种或两种以上结合。优选地，本发明中的免疫抑制分子结合以下任一种免疫抑制蛋白组合：NKG2A和TIM3、NKG2A和LAG3、NKG2A和TIGIT、NKG2A和CTLA4、CTLA4和TIM3、CTLA4和LAG3、CTLA4和TIGIT、PD1和TIM3、PD1和LAG3、PD1和TIGIT、PD1和CTLA4、TIM3和LAG3、TIM3和TIGIT、LAG3和TIGIT、PD1和NKG2A、FasL和NKG2A、FasL和LAG3、FasL和TIGIT、FasL和CTLA4、或FasL和PD1。更为优选地，本发明中的免疫抑制分子结合以下任一种免疫抑制蛋白组合：NKG2A和TIM3、NKG2A和LAG3、NKG2A和TIGIT、NKG2A和CTLA4、CTLA4和TIM3、CTLA4和LAG3、CTLA4和TIGIT、PD1和TIM3、PD1和LAG3、PD1和TIGIT、PD1和CTLA4、PD1和NKG2A、FasL和PD1。

术语“免疫抑制蛋白结合结构域”是指可以与免疫抑制蛋白结合的任何结构(如抗体、配体或受体等)或其功能性变体。

在一些实施方案中，本发明中的免疫抑制蛋白结合结构域选自抗体。术语“抗体”具有本领域技术人员所理解的最广泛的含义，并且包括单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)等完整抗体，和能够表现期望的生物活性的携带一个或多个CDR序列的抗体片段或合成多肽，可为任何种类(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA等)或亚类(例如IgG1、IgG2、IgG2a、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等)。术语“抗体片段”是指完整抗体或其变体的至少一部分，并且是指足以赋予抗体片段识别和特异性结合靶标(如抗原)的结合结构域(例如完整抗体的抗原可变区)。抗体片段的实例包括但不限于：Fab、Fab'、F(ab')2、Fd片段、Fd′、Fv片段、scFv、二硫键-连接的Fv(sdFv)、线性抗体、具有两个抗原结合位点的“双体”、单域抗体(sdAb)(例如抗体的重链可变区VH、轻链可变区VL、纳米抗体VHH等)。

在一些实施方案中，本发明中的免疫抑制蛋白结合结构域选自配体、受体及其功能性片段(即具有免疫抑制蛋白结合能力的功能性片段，如胞外区)。在一个实施方案中，所述免疫抑制分子包含的免疫抑制蛋白结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域这三个结构域不同时来自同一分子。例如，其中两个结构域来自同一分子，而另一个结构域来自不同分子，或者三个结构域均来自不同分子。换言之，本发明的免疫抑制分子不是天然存在的全长配体或受体本身。术语“配体或受体”是指能够与免疫抑制蛋白结合后产生相互作用的任何分子或原子。配体或受体可以是天然存在的分子，如有机或无机分子，也可以是合成的分子。例如，NKG2A的已知配体包括HLA-E，TIM3的已知配体包括Galectin9、HMGB1和CEACAM1，LAG的已知配体包括Galectin3、LSECtin、FGL1及一些MHC II类分子，TIM的已知配体包括CD112、CD113、CD155以及Nectin4，CTLA4的配体包括CD80和CD86，PD1的已知配体包括PDL1和PDL2，FasL的已知受体包括Fas。

除非上下文明确指出，否则本发明的“免疫抑制蛋白结合结构域”涵盖如上所述的抗体、配体及其功能性片段。因此，本发明中所述的免疫抑制蛋白结合结构域选自完整抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd片段、Fd′、Fv片段、scFv、sdFv、线性抗体、双体、sdAb、配体或受体的功能性片段。

术语“功能性变体”或“功能性片段”是指与亲本氨基酸序列相比，含有至少一个氨基酸修饰(即取代、缺失或插入)但保留亲本氨基酸的生物活性的变体或片段。例如，本发明中配体或受体的功能性片段一般是指配体或受体中能够与相应的免疫抑制蛋白结合的片段，如胞外区。

术语“重链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较大的一种，并且通常决定抗体所属的类别。术语“轻链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较小的一种。Kappa(κ)和lambda(λ)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。

术语“互补决定区”或“CDR”是指赋予抗原特异性和结合亲和力的抗体可变区内的氨基酸序列。例如，一般来说，每个重链可变区中存在三个CDR(例如CDR1-H、CDR2-H、和CDR3-H)，并且每个轻链可变区中存在三个CDR(CDR1-L、CDR2-L、和CDR3-L)。CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任一种来确定，包括：Kabat编号方案、Chothia编号方案、IMGT编号方案、AHo编号方案、AbM编号方案。给定CDR或FR的精确氨基酸序列可能由于选择的编号方案不同而不同，应理解，给定抗体或其区域(如其可变区)的“CDR”或“FR”涵盖由任何上述方案或其他已知方案所定义的CDR或FR，在指定的CDR或FR含有给定氨基酸序列的情况下，应理解，这样的CDR或FR还可以具有由任何上述方案或其他已知方案所定义的相应CDR或FR的序列。在本文中用于界定CDR和FR的边界的编号方案为Chothia方案。

术语“单链抗体”或“scFv”是指包含至少一个轻链可变区(VL)和至少一个重链可变区(VH)的融合蛋白，其中所述轻链可变区和重链可变区是邻接的(例如经由接头连接)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其来源的完整抗体的特异性。除非另有说明，否则本文中的scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N-末端和C末端)具有所述的VL和VH，scFv从N端到C端可以包含VL-接头-VH，也可以包含VH-接头-VL。术语“接头”是指连接两个分子或同一分子上的两个序列的分子序列。在一些实施方案中，接头是肽接头。优选地，接头不会不利地影响多肽的表达、分泌或生物活性。此外，接头优选地不是抗原性的并且不引发免疫应答。在一些实施方案中，接头可以是内源氨基酸序列、外源氨基酸序列(例如，富含GS的序列)或非肽化学接头。在一种实施方案中，本发明所述的接头与SEQ ID NO:111或112所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

术语“单域抗体”或“sdAb”是指具有三个互补决定区(CDR)的单一抗原结合多肽，其包括全长抗体(例如HCAb)以及其抗原结合片段(例如VH、VL、VHH)。在一些情况下，单域抗体选自骆驼源或鲨鱼源的HCAb或由其工程改造而成，并且其重链可变结构域在本文中称为“VHH”。VHH从N端至C端具有以下基本结构：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，其中FR1至FR4分别指框架区1至4，CDR1至CDR3是指互补决定区1至3。

在一些实施方案中，所述免疫抑制分子包含：(1)免疫抑制蛋白结合区，包含第一免疫抑制蛋白结合结构域和第二免疫抑制蛋白结合结构域；(2)跨膜结构域；和(3)共刺激结构域。在该实施方案中，第一免疫抑制蛋白结合结构域和第二免疫抑制蛋白结合结构域优选通过如上所述的接头连接。在另一些实施方案中，所述免疫抑制分子包含：(1)靶向第一免疫抑制蛋白的第一单元结构，包含靶向第一免疫抑制蛋白结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域；和(2)靶向第二免疫抑制蛋白的第二单元结构，包含靶向第二免疫抑制蛋白结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域。在该实施方案中，靶向第一免疫抑制蛋白的第一单元结构和靶向第二免疫抑制蛋白的第二单元结构优选通过自切割肽连接，如P2A、T2A、E2A、F2A等。优选地，本发明中的第一免疫抑制蛋白和第二免疫抑制蛋白选自以下的组合：NKG2A和TIM3、NKG2A和LAG3、NKG2A和TIGIT、NKG2A和CTLA4、CTLA4和TIM3、CTLA4和LAG3、CTLA4和TIGIT、PD1和TIM3、PD1和LAG3、PD1和TIGIT、PD1和CTLA4、TIM3和LAG3、TIM3和TIGIT、LAG3和TIGIT、PD1和NKG2A、FasL和NKG2A、FasL和LAG3、FasL和TIGIT、FasL和CTLA4、或FasL和PD1。更为优选地，本发明中的第一免疫抑制蛋白和第二免疫抑制蛋白选自以下的组合：NKG2A和TIM3、NKG2A和LAG3、NKG2A和TIGIT、NKG2A和CTLA4、CTLA4和TIM3、CTLA4和LAG3、CTLA4和TIGIT、PD1和TIM3、PD1和LAG3、PD1和TIGIT、PD1和CTLA4、PD1和NKG2A、或FasL和PD1。

NKG2A

在一些实施方案中，本发明的免疫抑制分子包含NKG2A结合结构域，所述NKG2A结合结构域是靶向NKG2A的抗体、配体或其功能性片段。NKG2A又称为KLRC1或CD159A，属于C型凝集素超家族成员，是一种主要在细胞毒性淋巴细胞(如CD8+T细胞和NK细胞)中表达的II型跨膜蛋白，包含胞质结构域、跨膜结构域以及细胞外凝集素样结构域，其细胞内部分有两个免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)，它们参与抑制性信号转导。NKG2A能够与CD94形成异源二聚体受体，NKG2A/CD94为NK细胞和CD8+T细胞等传递抑制性信号。NKG2A的天然配体是HLA-E，NKG2A和HLA-E之间的相互作用有助于肿瘤免疫逃逸，破坏NKG2A与HLA-E之间的相互作用被证明能有效增强抗肿瘤免疫反应。另外，越来越多的研究结果显示，NKG2A在其他免疫相关疾病中也发挥着重要作用，包括病毒感染、自身免疫性疾病、炎症性疾病、寄生虫感染等。

在一些实施方案中，所述NKG2A结合结构域是靶向NKG2A的抗体。本领域已知的抗NKG2A抗体均可用于本发明。在一些实施方案中，靶向NKG2A的抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H与SEQ ID NO:7所包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H相同，所述轻链可变区包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L与SEQ ID NO:8所包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L相同。在一些实施方案中，所述重链可变区包含的CDR1-H如SEQ ID NO:1所示，CDR2-H如SEQ ID NO:2所示，CDR3-H如SEQ ID NO:3所示，所述轻链可变区包含的CDR1-L如SEQ ID NO:4所示，CDR2-L如SEQ ID NO:5所示，CDR3-L如SEQ ID NO:6所示。

在一些实施方案中，所述靶向NKG2A的抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区与SEQ ID NO:7具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性，所述轻链可变区与SEQ ID NO:8具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。优选地，本发明中靶向NKG2A的抗体包含如SEQ ID NO:7所示的重链可变区和如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区。

在一些实施方案中，所述靶向NKG2A的抗体与SEQ ID NO:9具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。优选地，所述靶向NKG2A的抗体如SEQ ID NO:9所示。

在另一些实施方案中，本发明的免疫抑制分子包含的NKG2A结合结构域是结合NKG2A的配体，例如HLA-E或其功能性片段(即，具有NKG2A结合功能的片段，例如HLA-E的胞外区)。优选地，所述结合NKG2A的配体包含与SEQ ID NO:10或11具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸。更为优选地，所述结合NKG2A的配体包含SEQ ID NO:10或11所示的氨基酸序列。在该实施方案中，所述免疫抑制分子的跨膜区可以是HLA-E的跨膜区。但通常，该实施方案中的免疫抑制分子不包含HLA-E胞内区。换言之，免疫抑制分子不是全长HLA-E。

TIM3

在一些实施方案中，本发明的免疫抑制分子包含TIM3结合结构域，所述TIM3结合结构域是靶向TIM3的抗体、配体或其功能性片段。TIM3又称为HAVCR2或CD366，属于TIM家族成员，是一种能在多种免疫细胞(如Th1细胞、Th17细胞、单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞等)中表达的I型跨膜蛋白，包含细胞外免疫球蛋白可变结构域(IgV)、粘蛋白结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。研究发现，TIM3与不同配体(例如Galectin9、HMGB1、CEACAM1)结合，引起免疫细胞的信号转导。Galectin9与TIM3 IgV结构域具有高亲和力，研究表明TIM3/Galectin9信号通路能够介导T细胞耗竭。此外，Galectin9可促进TIM3+抗原呈递细胞的成熟，从而增强适应性免疫。因此，TIM3/Galectin9信号通路在机体免疫调节中发挥着重要作用。HMGB1是一种DNA结合蛋白，可作为染色质因子，还在炎症、免疫反应、DC分化、维持基因组稳定性和核转录调控中发挥重要作用。HMGB1作为TIM3的配体，在肿瘤微环境中，高度表达TIM3蛋白的肿瘤浸润DC，与肿瘤细胞释放的核酸竞争性结合HMGB1，阻止核酸进入内体，从而抑制核酸刺激先天免疫反应。因此，先天免疫细胞的激活和功能受到破坏，阻断由TIM3介导的核酸信号可能有助于DNA疫苗的研究。CEACAM1作为TIM3的配体，通过其N端结构域与TIM3结合，形成顺式异二聚体，促进TIM3在免疫细胞表面的稳定表达。然而，CEACAM1与TIM3的反式相互作用能够抑制免疫细胞的功能。CEACAM1和TIM3之间的顺式和反式相互作用都能维持免疫细胞的耐受性。已有研究结果显示，在结直肠癌患者中，联合阻断CEACAM1和TIM3途径可以增强抗肿瘤免疫应答，提高肿瘤清除率。因此，CEACAM1与TIM3的相互作用在调节自身免疫和抗肿瘤免疫方面具有关键作用。

在一些实施方案中，所述TIM3结合结构域是靶向TIM3的抗体。本领域已知的抗TIM3抗体均可用于本发明。在一些实施方案中，靶向TIM3的抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H与SEQ ID NO:19所包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H相同，所述轻链可变区包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L与SEQ ID NO:20所包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L相同。在一些实施方案中，所述重链可变区包含的CDR1-H如SEQ ID NO:13所示，CDR2-H如SEQ ID NO:14所示，CDR3-H如SEQ ID NO:15所示，所述轻链可变区包含的CDR1-L如SEQ ID NO:16所示，CDR2-L如SEQ ID NO:17所示，CDR3-L如SEQ ID NO:18所示。

在一些实施方案中，所述靶向TIM3的抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区与SEQ ID NO:19具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性，所述轻链可变区与SEQ ID NO:20具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。优选地，本发明中靶向TIM3的抗体包含如SEQ ID NO:19所示的重链可变区和如SEQ ID NO:20所示的轻链可变区。

在一些实施方案中，所述靶向TIM3的抗体与SEQ ID NO:21具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。优选地，所述靶向TIM3的抗体如SEQ ID NO:21所示。

在另一些实施方案中，本发明的免疫抑制分子包含的TIM3结合结构域是结合TIM3的配体，例如Galectin9、HMGB1、CEACAM1或其功能性片段(即，具有TIM3结合功能的片段，例如CEACAM1的胞外区)。优选地，所述结合TIM3的配体包含与SEQ ID NO:22-24任一所示的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。更为优选地，所述结合TIM3的配体包含SEQ ID NO:22-24任一所示的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，所述结合TIM3的配体包含SEQ ID NO:24所示的CEACAM1胞外区，在该实施方案中，所述免疫抑制分子的跨膜区优选是CEACAM1的跨膜区。但通常，该实施方案中的免疫抑制分子不包含CEACAM1的胞内区。换言之，免疫抑制分子不是全长CEACAM1。

LAG3

在一些实施方案中，本发明的免疫抑制分子包含LAG3结合结构域，所述LAG3结合结构域是靶向LAG3的抗体、配体或其功能性片段。LAG3，又称为CD223，是一种I型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族(IgSF)。它在活化的CD4+和CD8+T细胞、调节性T细胞、Tr1细胞、NK细胞和浆细胞样树突状细胞(pDC)表面上以二聚体或寡聚体的形式表达。LAG3蛋白与CD4有同源结构，两者的胞外区均具有四个Ig样结构域，但LAG3在膜远端的Ig样结构域内还含有一种额外的环状结构，而CD4没有这种结构。这个额外的环状结构可以使LAG3蛋白与在抗原呈递细胞(APC)或肿瘤细胞上表达的MHC II类分子(如HLA-DR、HLA-DP、HLA-DQ抗原等)结合，且亲和力显著高于CD4，并可负向调节T细胞受体(TCR)信号传导。除了MHC II类分子外，Galectin3、LSECtin和FGL1也是LAG3的配体，这三种蛋白均在各类肿瘤细胞上表达，并且抑制T细胞应答。已有研究表明，LAG3可负向调节T细胞活化、增殖和细胞因子生成，抑制pDC活化，以及增强调节性T细胞的抑制活性等。

在一些实施方案中，所述LAG3结合结构域是靶向LAG3的抗体。本领域已知的抗LAG3抗体均可用于本发明。在一些实施方案中，靶向LAG3的抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H与SEQ ID NO:32所包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H相同，所述轻链可变区包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L与SEQ ID NO:33所包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L相同。在一些实施方案中，所述重链可变区包含的CDR1-H如SEQ ID NO:26所示，CDR2-H如SEQ ID NO:27所示，CDR3-H如SEQ ID NO:28所示，所述轻链可变区包含的CDR1-L如SEQ ID NO:29所示，CDR2-L如SEQ ID NO:30所示，CDR3-L如SEQ ID NO:31所示。

在一些实施方案中，所述靶向LAG3的抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区与SEQ ID NO:32具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性，所述轻链可变区与SEQ ID NO:33具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。优选地，本发明中靶向LAG3的抗体包含如SEQ ID NO:32所示的重链可变区和如SEQ ID NO:33所示的轻链可变区。

在一些实施方案中，所述靶向LAG3的抗体与SEQ ID NO:34具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。优选地，所述靶向LAG3的抗体如SEQ ID NO:34所示。

在另一些实施方案中，本发明的免疫抑制分子包含的LAG3结合结构域是结合LAG3的配体，例如MHC II类分子、Galectin3、LSECtin、FGL1或其功能性片段(即，具有LAG3结合功能的片段，例如LSECtin的胞外区)。优选地，所述结合LAG3的配体包含与SEQ ID NO:35-37任一所示的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。更为优选地，所述结合LAG3的配体包含SEQ ID NO:35-37任一所示的氨基酸序列。在一个具体的实施方案中，所述结合LAG3的配体包含SEQ ID NO:37所示的LSECtin胞外区，在该实施方案中，所述免疫抑制分子的跨膜区优选是LSECtin的跨膜区。但通常，该实施方案中的免疫抑制分子不包含LSECtin的胞内区。换言之，免疫抑制分子不是全长LSECtin。

TIGIT

在一些实施方案中，本发明的免疫抑制分子包含TIGIT结合结构域，所述TIGIT结合结构域是靶向TIGIT的抗体、配体或其功能性片段。TIGIT又称为VSTM3、VSIG9或WUCAM，属于PVR样蛋白家族成员，是一种主要在NK细胞和T细胞(如CD4+T细胞、CD8+T细胞和Treg细胞等)中表达的I型跨膜蛋白，包含细胞外免疫球蛋白可变结构域、跨膜结构域以及短的细胞内结构域，具有一个免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)和一个免疫球蛋白酪氨酸尾巴(ITT)样基序。TIGIT有四个配体，CD112、CD113、CD155以及Nectin4，它们都属于Nectin/NECL家族，该家族参与介导细胞粘附、细胞极化等过程。TIGIT与CD155和Nectin4的结合亲和力远高于CD112和CD113。CD155同时也可以作为激活受体CD226的配体，当CD155与CD226结合时，它将激活信号传递到免疫细胞中。当CD155与TIGIT结合时，通过其ITIM基序将SHP1磷酸酶募集到膜上来传递抑制信号，随后使许多参与T细胞效应功能的蛋白质失活。Nectin4是Nectin/NECL家族蛋白中唯一能与TIGIT特异性结合而不与CD226、CD96或CD112R相互作用的成员。

在一些实施方案中，所述TIGIT结合结构域是靶向TIGIT的抗体。本领域已知的抗TIGIT抗体均可用于本发明。在一些实施方案中，靶向TIGIT的抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H与SEQ ID NO:45所包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H相同，所述轻链可变区包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L与SEQ ID NO:46所包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L相同。在一些实施方案中，所述轻链可变区包含的CDR1-L如SEQ ID NO:39所示，CDR2-L如SEQ ID NO:40所示，CDR3-L如SEQ ID NO:41所示；重链可变区包含的CDR1-H如SEQ ID NO:42所示，CDR2-H如SEQ ID NO:43所示，CDR3-H如SEQ ID NO:44所示。

在一些实施方案中，所述靶向TIGIT的抗体包含轻链可变区和重链可变区，其中所述重链可变区与SEQ ID NO:45具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性，所述轻链可变区与SEQ ID NO:46具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。优选地，本发明中靶向TIGIT的抗体包含如SEQ ID NO:45所示的重链可变区和如SEQ ID NO:46所示的轻链可变区。

在一些实施方案中，所述靶向TIGIT的抗体与SEQ ID NO:47具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。优选地，所述靶向TIGIT的抗体如SEQ ID NO:47所示。

在另一些实施方案中，本发明的免疫抑制分子包含的TIGIT结合结构域是结合TIGIT的配体，例如CD155、CD112、CD113、Nectin4或其功能性片段(即，具有TIGIT结合功能的片段，例如CD155、CD112、CD113或Nectin4的胞外区)。优选地，所述结合TIGIT的配体包含与SEQ ID NO:48-51任一所示的氨基酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸。更为优选地，所述结合TIGIT的配体包含SEQ ID NO:48-51任一所示的氨基酸序列。在该实施方案中，所述免疫抑制分子的跨膜区可以是CD155、CD112、CD113或Nectin4相应的跨膜区。但通常，该实施方案中的免疫抑制分子不包含CD155、CD112、CD113或Nectin4相应的胞内区。换言之，免疫抑制分子不是全长CD155、 CD112、CD113或Nectin4。

CTLA4

在一些实施方案中，本发明的免疫抑制分子包含CTLA4结合结构域，所述CTLA4结合结构域是靶向CTLA4的抗体、配体或其功能性片段。CTLA4，又称为CD152、CELIAC3，属于CD28免疫球蛋白亚家族成员，是一种主要在T细胞上表达的I型跨膜蛋白，包含一个细胞外免疫球蛋白可变结构域、跨膜结构域和一个保守的胞质尾区。CD28免疫球蛋白亚家族的细胞外结构域上有一个非常保守的基序(MYPPPY)，对于其结合配体CD80和CD86至关重要。CTLA4的配体CD80和CD86通常发现于抗原呈递细胞表面，可结合CD28或CTLA4，分别产生共刺激或共抑制反应，但CD80和CD86与CTLA4的结合亲和力更高。由于该抑制作用，CTLA4是调节T细胞稳态和自我耐受的关键调节器。

在一些实施方案中，所述CTLA4结合结构域是靶向CTLA4的抗体。本领域已知的抗CTLA4抗体均可用于本发明。在一些实施方案中，靶向CTLA4的抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H与SEQ ID NO:62所包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H相同，所述轻链可变区包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L与SEQ ID NO:63所包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L相同。在一些实施方案中，所述重链可变区包含的CDR1-H如SEQ ID NO:56所示，CDR2-H如SEQ ID NO:57所示，CDR3-H如SEQ ID NO:58所示，所述轻链可变区包含的CDR1-L如SEQ ID NO:59所示，CDR2-L如SEQ ID NO:60所示，CDR3-L如SEQ ID NO:61所示。

在一些实施方案中，所述靶向CTLA4的抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区与SEQ ID NO:62具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性，所述轻链可变区与SEQ ID NO:63具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。优选地，本发明中靶向CTLA4的抗体包含如SEQ ID NO:62所示的重链可变区和如SEQ ID NO:63所示的轻链可变区。

在一些实施方案中，所述靶向CTLA4的抗体与SEQ ID NO:64具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。优选地，所述靶向CTLA4的抗体如SEQ ID NO:64所示。

在另一些实施方案中，本发明的免疫抑制分子包含的CTLA4结合结构域是结合CTLA4的配体，例如CD80、CD86或其功能性片段(即，具有CTLA4结合功能的片段，例如CD80或CD86的胞外区)。优选地，所述结合CTLA4的配体包含与SEQ ID NO:65或66具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。更为优选地，所述结合CTLA4的配体包含SEQ ID NO:65或66所示的氨基酸序列。在该实施方案中，所述免疫抑制分子的跨膜区优选是CD80或CD86的跨膜区。但通常，该实施方案中的免疫抑制分子不包含CD80或CD86的胞内区。换言之，免疫抑制分子不是全长CD80或CD86。

PD1

在一些实施方案中，本发明的免疫抑制分子包含PD1结合结构域，所述PD1结合结构域是靶向PD1的抗体、配体或其功能性片段。PD1又称为CD279，属于免疫球蛋白超家族成员，是一种主要在活化的T细胞、NK细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞和单核细胞上表达的I型跨膜蛋白，包含一个细胞外免疫球蛋白可变结构域、跨膜结构域以及细胞质尾部结构域，其细胞质尾部结构域含有两个酪氨酸基序：一个基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)和一个免疫受体抑制性酪氨酸转换基序(ITSM)。研究表明，ITSM是发挥PD1对活性T细胞免疫抑制功能所必需的。PD1的配体包括PDL1(B7-H1，CD274)和PDL2(B7-DC，CD273)，它们都属于蛋白质B7家族。PD1通过与其配体PDL1、PDL2相互作用发挥免疫负调控作用。当PD1与配体相互作用时，其胞内ITSM发生磷酸化并且招募相应的磷酸化酶SHP-1和SHP-2，导致下游信号分子去磷酸化从而下调免疫细胞应答水平。免疫系统的这一负性调控机制是维持机体免疫耐受的关键分子基础。大量研究表明，PD1等免疫负性调控分子过度表达及其与受体PD-L1/PD-L2相互作用所诱导的机体免疫抑制状态在癌症以及HIV、HCV、HBV等慢性感染性疾病发病过程中发挥重要作用。

在一些实施方案中，所述PD1结合结构域是靶向PD1的抗体。本领域已知的抗PD1抗体均可用于本发明。在一些实施方案中，靶向PD1的抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H与SEQ ID NO:75所包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H相同，所述轻链可变区包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L与SEQ ID NO:76所包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L相同。在一些实施方案中，所述重链可变区包含的CDR1-H如SEQ ID NO:69所示，CDR2-H如SEQ ID NO:70所示，CDR3-H如SEQ ID NO:71所示，所述轻链可变区包含的CDR1-L如SEQ ID NO:72所示，CDR2-L如SEQ ID NO:73所示，CDR3-L如SEQ ID NO:74所示。

在一些实施方案中，所述靶向PD1的抗体包含轻链可变区和重链可变区，其中所述重链可变区与SEQ ID NO:75具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性，所述轻链可变区与SEQ ID NO:76具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。优选地，本发明中靶向PD1的抗体包含如SEQ ID NO:75所示的重链可变区和如SEQ ID NO:76所示的轻链可变区。

在一些实施方案中，所述靶向PD1的抗体与SEQ ID NO:77具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。优选地，所述靶向PD1的抗体如SEQ ID NO:77所示。

在另一些实施方案中，本发明的免疫抑制分子包含的PD1结合结构域是结合PD1的配体，例如PDL1、PDL2或其功能性片段(即，具有PD1结合功能的片段，例如PDL1或PDL2的胞外区)。优选地，所述结合PD1的配体包含与SEQ ID NO:78或79具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。更为优选地，所述结合PD1的配体包含SEQ ID NO:78 或79所示的氨基酸序列。在该实施方案中，所述免疫抑制分子的跨膜区优选是PDL1或PDL2的跨膜区。但通常，该实施方案中的免疫抑制分子不包含PDL1或PDL2的胞内区。换言之，免疫抑制分子不是全长PDL1或PDL2。

FasL

在一些实施方案中，本发明的免疫抑制分子包含FasL结合结构域，所述FasL结合结构域是靶向FasL的抗体、受体或其功能性片段。FasL是一种II型细胞膜表面糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体超家族(TNFRSF)的成员。FasL分布于活化的T细胞、NK细胞、单核巨噬细胞等表面，其受体是Fas。已经发现Fas/FasL系统是细胞凋亡的重要途径之一。具体地，FasL与Fas的结合会形成诱导死亡的复合体，进而激活caspase信号通路，通过其胞内酪氨酸和丝氨酸的磷酸化最终导致细胞凋亡。据报道，Fas/FasL的功能异常与各种临床疾病密切相关，例如自身免疫性疾病(类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等)、急性免疫过度活跃(器官移植、多创伤等引起)、慢性免疫过度活跃(川崎病、特发性肺纤维化等)、慢性感染(EBV感染、病毒引起的炎症等)、淋巴肿瘤等(T-ALL、T细胞淋巴瘤等)。

在一些实施方案中，所述FasL结合结构域是靶向FasL的抗体。本领域已知的抗FasL抗体均可用于本发明。在一些实施方案中，靶向FasL的抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H与SEQ ID NO:119或125所包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H相同，所述轻链可变区包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L与SEQ ID NO:120所包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L相同。在一些实施方案中，所述重链可变区包含的CDR1-H如SEQ ID NO:113或122所示，CDR2-H如SEQ ID NO:114或123所示，CDR3-H如SEQ ID NO:115或124所示，所述轻链可变区包含的CDR1-L如SEQ ID NO:116所示，CDR2-L如SEQ ID NO:117所示，CDR3-L如SEQ ID NO:118所示。

在一些实施方案中，所述靶向FasL的抗体包含轻链可变区和重链可变区，其中所述重链可变区与SEQ ID NO:119或125具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性，所述轻链可变区与SEQ ID NO:120具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。优选地，本发明中靶向PD1的抗体包含如SEQ ID NO:119或125所示的重链可变区和如SEQ ID NO:120所示的轻链可变区。

在一些实施方案中，所述靶向FasL的抗体与SEQ ID NO:121或126具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。优选地，所述靶向FasL的抗体如SEQ ID NO:121或126所示。

在另一些实施方案中，本发明的免疫抑制分子包含的FasL结合结构域是结合FasL的受体，例如Fas或其功能性片段(即，具有Fas结合功能的片段，例如Fas的胞外区)。优选地，所述结合FasL的受体包含与SEQ ID NO:127具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。更为优选地，所述结合FasL的受体包含SEQ ID NO:127所示的氨基酸序列。在该实施方案中，所述免疫抑制分子的跨膜区优选是Fas的跨膜区。但通常，该实施方案中的免疫抑制分子不包含Fas的胞内区。换言之，免疫抑制分子不是全长Fas。

术语序列“同一性”表示两个(核苷酸或氨基酸)序列在比对中在相同位置处具有相同残基的程度，并且通常表示为百分数。优选地，同一性在被比较的序列的整体长度上确定。因此，具有完全相同序列的两个拷贝具有100％同一性。本领域技术人员知晓，可以使用一些算法来确定序列同一性，例如Blast(Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402)、Blast2(Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)、Smith-Waterman(Smith等(1981)J.Mol.Biol.147：195-197)和ClustalW。

术语“跨膜结构域”是指能够使免疫抑制分子在细胞表面上表达，并将免疫抑制蛋白结合结构域锚定在细胞膜上的多肽结构。跨膜结构域可以是天然或合成的，也可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。当靶标结合结构域与靶标结合时，跨膜结构域能够进行信号传导。特别适用于本发明中的跨膜结构域可以源自例如TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基、CD28、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD47、CD64、CD80、CD86、CD94、CD112、CD113、CD134、CD137、CD154、CD155、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、CD18、ICOS、4-1BB、GITR、CD40、BAFFR、HVEM、SLAMF7、NKp80、CD160、BCMA、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7R a、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1、SLAMF4、CD84、CD96、HLA-E、LSECtin、PDL1、PDL2、CEACAM1、Fas、MHC II类分子、CRT AM、Ly9、CD160、PSGL1、CDIOO、SLAMF6、SLAMF1、SLAMF8、CD162、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和NKG2C。在一些实施方案中，所述跨膜结构域源自以下分子：CD8α、CD4、CD28或4-1BB，或者，跨膜结构域可以是合成的并且可以主要地包含疏水性残基如亮氨酸和缬氨酸。优选地，所述跨膜结构域源自CD28，其与SEQ ID NO:82所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性，或所述跨膜结构域源自CD8α，其与SEQ ID NO:83或84所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。在另一些实施方案中，本发明中的免疫抑制分子包含的跨膜结构域源自靶向免疫抑制蛋白的配体或受体，例如HLA-E、CEACAM1、LSECtin、CD112、CD113、CD155、Nectin4、CD80、CD86、PDL1、PDL2、Fas以及一些MHC II类分子等。优选地，所述跨膜结构域与SEQ ID NO:12、25、38、52、53、54、55、67、68、80、81、128任一所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。更为优选地，所述跨膜结构域与相应配体或受体的胞外域相连接，优选直接相连。

在一些实施方案中，所述免疫抑制分子在免疫抑制蛋白结合结构域和跨膜结构域之间还包含铰链区。术语“铰链区”一般是指作用为连接跨膜结构域至抗体的任何寡肽或多肽。具体地，铰链区用来为抗体提供更大的灵活性和可及性。铰链区可以包含最多达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸并且最优选25至50个氨基酸。铰链区可以全部或部分源自天然分子，如全部或部分源自CD8、CD4或CD28的胞外区，或全部或部分源自抗体恒定区。或者，铰链区可以是对应于天然存在的铰链序列的合成序列，或可以是完全合成的铰链序列。优选地，所述铰链区包含CD8α、CD28、FcγRIIIα受体、IgG4或IgG1的铰链区部分，更优选CD8α、CD28或IgG4铰链。在一些实施方案中，铰链区来自CD28，其与SEQ ID NO:85所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，铰链区来自CD8α，其与SEQ ID NO:86或87所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，铰链区来自IgG4，其与SEQ ID NO:88所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

术语“共刺激结构域”是指介导细胞内的信号转导以诱导如效应功能的免疫反应的蛋白质的至少一部分，其是来自共刺激分子的细胞内功能性信号传导结构域，包含所述共刺激分子的整个胞内区，或其功能片段。“共刺激分子”是指在与共刺激配体特异性结合，由此介导共刺激反应(例如增殖和生存)的同源结合配偶体。任何共刺激分子的共刺激信号传导结构域适用于本文所述的免疫抑制分子中。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。本发明的共刺激结构域包括但不限于源自以下蛋白质的胞内区：LTB、CD94、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD8、CD18、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54、CD83、CD134、4-1BB、CD270、CD272、B7-H3、ICOS、CD357、DAP10、DAP12、LAT、NKG2C、SLP76、PD1、LIGHT、TRIM、ZAP70以及它们的组合。优选地，本发明CAR的共刺激结构域是4-1BB和/或CD28。在一些实施方案中，所述共刺激结构域来自CD28，其与SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，所述共刺激结构域来自4-1BB，其与SEQ ID NO:90或91所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

本发明的免疫抑制分子不包含初级信号传导结构域。术语“初级信号传导结构域”是指在抗原-受体结合以后一同起作用以引发初级信号传导的蛋白结构，其一般是T细胞受体和共受体的胞内序列。初级信号传导结构域一般包含一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序(Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motifs,ITAM)。本发明中的初级信号传导结构域的包括但不限于源自以下蛋白的胞内区：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79b、NFAM1、STAM1、STAM2和CD66d。在一些实施方案中，本发明的免疫抑制分子不包含CD3ζ胞内区，例如，与SEQ ID NO:92或93所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性的CD3ζ胞内区。

在一些实施方案中，本发明的免疫抑制分子还包含信号肽，使得当其在细胞例如T细胞中表达时，新生蛋白质被引导至内质网并随后引导至细胞表面。信号肽的核心可以含有长的疏水性氨基酸区段，其具有形成单个α-螺旋的倾向。在信号肽的末端，通常有被信号肽酶识别和切割的氨基酸区段。信号肽酶可以在移位期间或完成后切割，以产生游离信号肽和成熟蛋白。然后，游离信号肽被特定蛋白酶消化。可用于本发明的信号肽是本领域技术人员熟知的，例如衍生自B2M、CD8α、IgG1、GM-CSFRα等的信号肽。在一些实施方案中，可用于本发明的信号肽来自B2M，其与SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，可用于本发明的信号肽来自CD8α，其与SEQ ID NO:95或96所示的氨基酸序列具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％、95％、97％或99％或100％的序列同一性。

II.核酸和载体

本发明还提供一种核酸分子，其包含编码本发明的免疫抑制分子的核酸序列。任选地，所述核酸分子还可以包含编码功能性外源受体(例如嵌合抗原受体、T细胞受体等)的核酸序列。

如本文所用，术语“核酸分子”包括核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的序列，如经修饰的或未经修饰的RNA或DNA，各自为单链和/或双链形式的线性或环状，或它们的混合物(包括杂合分子)。因此，根据本发明的核酸包括DNA(比如dsDNA、ssDNA、cDNA)、RNA(比如dsRNA、ssRNA、mRNA、ivtRNA)，它们的组合或衍生物(比如PNA)。优选地，所述核酸是DNA或RNA。

核酸可以包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(如酰胺键，比如在肽核酸(PNA)中发现的)。本发明的核酸还可含有一种或多种经修饰的碱基，比如，例如三苯甲基化的碱基和不常见的碱基(比如肌苷)。也可以想到其它修饰，包括化学、酶促或代谢修饰，只要本发明的多链CAR可以从多核苷酸表达即可。核酸可以以分离的形式提供。在一些实施方案中，核酸也可以包括调节序列，比如转录控制元件(包括启动子、增强子、操纵子、抑制子和转录终止信号)、核糖体结合位点、内含子等。

可以对本发明的核酸序列进行密码子优化以在所需的细胞(如免疫细胞)中进行最佳表达；或者用于在细菌、酵母菌或昆虫细胞中表达。密码子优化是指将目标序列中存在的在给定物种的高度表达的基因中一般罕见的密码子替换为在这类物种的高度表达的基因中一般常见的密码子，而替换前后的密码子编码相同的氨基酸。因此，最佳密码子的选择取决于宿主基因组的密码子使用偏好。

本发明还提供一种载体，其包含本发明所述的核酸分子。任选地，编码免疫抑制分子的核酸序列和编码功能性外源受体(例如嵌合抗原受体、嵌合T细胞受体等)的核酸序列可以位于相同载体或不同载体。

如本文所用，术语“载体”是用作将(外源)遗传材料转移到宿主细胞中的媒介核酸分子，在该宿主细胞中所述核酸分子可以例如复制和/或表达。可用于本发明的合适载体是本领域已知的，并且许多可商购获得。在一些实施方案中，本发明的载体包括但不限于质粒、病毒(例如逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、牛痘病毒、水泡性口炎病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、正粘液病毒、小病毒、马拉巴病毒、柯萨奇病毒、疱疹病毒和慢病毒等)、噬菌体、噬菌粒、粘粒和人工染色体(包括BAC和YAC)。载体一般还包含在细胞中自主复制的起点(如果需要多核苷酸的稳定表达)、选择标记和限制酶切割位点(如多克隆位点，MCS)。载体可另外包含启动子、多聚腺苷酸尾(polyA)、3’UTR、增强子、终止子、绝缘子、操纵子、选择标记、报告基因、靶向序列和/或蛋白质纯化标签等元件。在一个具体的实施方案中，所述载体是体外转录的载体。

III.工程化细胞

本发明还提供一种工程化细胞，其表达本发明的免疫抑制分子、编码所述免疫抑制分子的核酸，或包含所述核酸的载体。在一些实施方案中，本发明的工程化细胞还表达功能性外源受体(如下文所定义)。

细胞

在一些实施方案中，本发明的工程化细胞是工程化的免疫细胞。

术语“免疫细胞”是指免疫系统的具有一种或多种效应子功能(例如，细胞毒性细胞杀伤活性、分泌细胞因子、诱导ADCC和/或CDC)的任何细胞。例如，免疫细胞可以是B细胞、T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞或NKT细胞。免疫细胞可以从多种来源获得，例如可以来自受试者(例如，从受试者的外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织、肿瘤等分离而获得)，或来自体外培养的细胞系(例如Jurkat、SupT1、NK92等)，或从干细胞分化而来(例如，源自脐带血干细胞、祖细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、成体干细胞、胚胎干细胞、多能干细胞、iPSC等)。优选地，免疫细胞是T细胞或NK细胞，更优选T细胞。T细胞也可以被浓缩或纯化。T细胞可以处于任何发育阶段，包括但不限于，CD4+CD8+T细胞、CD4+T细胞(例如Th1和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、CD4-CD8-T细胞、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、γδ-T细胞、αβ-T细胞等。优选地，免疫细胞是人T细胞，可以使用本领域技术人员已知的多种技术获得T细胞，如利用Ficoll从受试者的血液分离T细胞。

在另一些实施方案中，所述细胞是干细胞。

术语“干细胞”是具有自我复制、多向分化和归巢潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织、器官的始祖细胞。在细胞分化的过程中，由于细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分配，使得一个子细胞不可逆地走向分化的终端成为功能专一的分化细胞，直至完全失去了再分裂的能力，最终衰老死亡。机体为了弥补这一不足，保留了一部分未分化的原始细胞，其保留了亲代的特性。这部分被保留下来的未分化的原始细胞，称为干细胞，一旦需要，这些干细胞可按照发育途径通过分裂而产生分化的细胞。本发明中所述的干细胞可以是胚胎干细胞、成体干细胞(例如脐带血干细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、间充质干细胞等)以及多能干细胞(例如诱导多能干细胞iPSC等)。

在一些实施方案中，本发明的工程化细胞的内源性HLA-I类基因和/或HLA-II类基因的表达未被修饰。即，没有通过任何人工干预的方法(基因编辑或非基因编辑)来改变任何一种内源性HLA-I类基因和/或HLA-II类基因的表达水平。

在一些实施方案中，本发明的工程化细胞的至少一种内源性HLA-I类基因的表达被抑制或沉默。在一些实施方案中，本发明的工程化细胞的至少一种内源性HLA-II类基因的表达被抑制或沉默。在一些实施方案中，本发明的工程化细胞的至少一种内源性TCR/CD3基因的表达被抑制或沉默。在一些实施方案中，本发明的工程化细胞的至少一种内源性TCR/CD3基因和至少一种内源性HLA-I类基因的表达被抑制或沉默。在一些实施方案中，本发明的工程化细胞的至少一种内源性HLA-I类和HLA-II类基因的表达被抑制或沉默。在一些实施方案中，本发明的工程化细胞的至少一种内源性TCR/CD3基因，至少一种内源性HLA-I类基因和至少一种内源性HLA-II类基因的表达被抑制或沉默。优选地，所述HLA-I类基因选自HLA-A、HLA-B、HLA-C和B2M。优选地，所述HLA-II类基因选自HLA-DPA、HLA-DQ、HLA-DRA、TAP1、TAP2、LMP2、LMP7、RFX5、RFXAP、RFXANK和CIITA，优选选自RFX5、RFXAP、RFXANK和CIITA。优选地，所述TCR/CD3基因选自TRAC、TRBC、CD3γ、CD3δ、CD3ε和CD3ζ。

在一些实施方案中，本发明的工程化细胞的一个或多个选自以下内源性基因的表达被抑制或沉默：CD52、GR、dCK和免疫检查点基因，如PD1、LAG3、TIM3、CTLA4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、HAVCR2、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。

抑制基因表达或使基因沉默的方法是本领域技术人员熟知的，包括但不限于例如通过大范围核酸酶、锌指核酸酶、TALEN、CRISPR/Cas系统、碱基编辑器介导DNA或RNA断裂，或通过反义寡核苷酸、RNAi、shRNA、转座子、突变等技术使基因失活。

在一些实施方案中，本发明的工程化细胞是同种异体的细胞。如本文所用，术语“同种异体”是指任何材料来源于与引入该材料的个体相同物种的不同动物或不同患者。当在一个或多个基因座处的基因不同时，认为两个或更多个体彼此为同种异体的。在一些情况下，来自同一物种的各个体的同种异体材料在基因上的不同可能足以发生抗原相互作用。

功能性外源受体

在一些实施方案中，本发明的表达免疫抑制分子的工程化细胞还可以表达功能性外源受体。本发明中所述的功能性外源受体包括嵌合抗原受体(CAR)、T细胞受体(TCR)、T细胞受体融合蛋白(TFP)、T细胞抗原耦合器(TAC)或免疫动员单克隆T细胞受体(ImmTAC)等，优选是嵌合抗原受体或T细胞受体，更优选是嵌合抗原受体。

术语“T细胞受体”或“TCR”是指响应于抗原呈递并参与T细胞活化的膜蛋白复合体。TCR的刺激由抗原呈递细胞上的主要组织相容性复合体分子(MHC)触发，所述抗原呈递细胞将抗原肽呈递至T细胞并且结合至TCR复合体以诱发一系列胞内信号传导。TCR由分别形成异二聚体的六条肽链组成，其一般分为αβ型和γδ型。每条肽链包括恒定区和可变区，其中可变区负责结合特异性的特定的抗原和MHC分子。TCR的可变区可以包含配体结合结构域或与配体结合结构域可操作连接，其中配体结合结构域的定义如下所述。

术语“嵌合抗原受体”或“CAR”是指人工构建的杂合多肽，该杂合多肽一般包括抗原(例如肿瘤抗原)结合结构域(例如抗体或抗原的配体)、跨膜结构域、任选的共刺激结构域和初级信号传导结构域，各个结构域之间通过接头连接。CAR能够以非MHC限制性的方式将T细胞和其它免疫细胞的特异性和反应性重定向至所选择的靶标。在一些实施方案中，本发明的功能性外源受体是嵌合抗原受体，其包含肿瘤抗原结合结构域、跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域和初级信号传导结构域。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体还包含以下结构中的一个或多个：信号肽、铰链区、自杀基因、开关结构等。

术语“T细胞抗原耦合器”或“TAC”包括三个功能结构域：(1)肿瘤靶向结构域，包括单链抗体、设计的锚蛋白重复蛋白(designed ankyrin repeat protein，DARPin)或其他靶向基团；(2)细胞外结构域，与CD3结合的单链抗体，从而使得TAC受体与TCR受体靠近；(3)跨膜结构域和CD4共受体的细胞内结构域，其中，细胞内结构域连接蛋白激酶LCK，催化TCR复合物的免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)磷酸化作为T细胞活化的初始步骤。

术语“T细胞受体融合蛋白”或“TFP”是指由TCR各组分衍生的重组多肽，通常由TCR亚基和与其连接的抗原结合区组成并在细胞表面表达。其中，TCR亚基包括至少部分TCR胞外结构域、跨膜结构域、TCR胞内信号结构域。

术语“免疫动员单克隆T细胞受体”或“ImmTAC”是由工程化改造的T细胞受体(TCR)以及抗CD3的scFv组成，其中：改造后的TCR能以显著提高的亲和力特异性识别并结合肿瘤细胞表面的HLA-肽复合物，并通过scFv抗体片段与CD3的相互作用促进T细胞介导的效应器功能。

在一些实施方案中，功能性外源受体包含特异性识别抗原(例如肿瘤抗原)的胞外域。在一些实施方案中，所述胞外域包含特异性结合抗原的抗体或所述抗原的配体。在一些实施方案中，所述抗原选自：ALK、ADRB3、AKAP-4、APRIL、ASGPR1、BCMA、B7H3、B7H4、B7H6、bcr-abl、BORIS、BST2、BAFF-R、BTLA、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD70、CD72、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD86、CD97、CD123、CD133、CD137、CD 138、CD151、CD171、CD179a、CD300LF、CDH16、CSPG4、CS1、Claudin6、Claudin18.1、Claudin 18.2、CEA、CEACAM6、CLL1、c-Met、CAIX、CXORF61、CA125、CYP1B1、CS1、ELF2M、EGFR、EPCAM、EGFRvIII、EphA2、ERG/TMPRSS2ETS融合基因、ETV6-AML、EMR2、EGP2，EGP40、FAP、FAR、FBP、FLT3、FOSL1、FCRL5、FCAR、Flt3、Flt4、Frizzled、GD2、GD3、gp100、gp130、GM3、GPC2、GPC3、GPRC5D、GPR20、GloboH、GHRHR、GHR、GITR、Her2、HER3、HER-4、HMWMAA、HAVCR1、HPV E6,E7、HVEM、HIV-1Gag、HLA-A1、HLA-A2、IL6R、IL-11Ra、IL-13Ra、IGF-I受体、LTPR、LIFRP、LRP5、IGLL1、IGF1R、KIT、Kappa Light Chain、KDR、LewisY、LMP2、LY6K、LAGE-1a、legumain、LCK、LAIR1、LILRA2、LY75、MSLN、MUC1、MUC16、MAGE-A1、MAGE3、MAD-CT-1、MelanA/MART1、ML-IAP、MYCN、mut hsp70-2、NCAM、NY-BR-1、NY-ESO-1、NA17、Notch-1-4、nAchR、NKG2D、NKG2D配体、OY-TES1、OR51E2、OX40、PRSS21、PSCA、PD1、PD-L1、PD-L2、PSMA、Prostase、PAP、PDGFR-β、PCTA-1/半乳凝集素8、p53、p53突变体、prostein、PLAC1、PANX3、PAX3、PAX5、PTCH1、RANK、RAGE-1、ROR1、Ras突变体、RhoC、RU1、RU2、Robol、SSEA-4、SSX2、SART3、Sp17、TSHR、Tn Ag、TGS5、TEM1/CD248、TEM7R、TARP、TCRα、TCRβ、TGFBR1、TGFBR2、TNFRSF4、TWEAK-R、TLR7、TLR9、TAG72、TROP-2、Tie 2、TRP-2、TNFR1、TNFR2、TEM1、UPK2VEGFR、WT1、XAGE1、5T4、8H9、αvβ6整合素、CA9、叶酸受体α、肝配蛋白B2、酪氨酸酶、岩藻糖基GM1、邻-乙酰-GD2、叶酸受体β、多聚唾液酸、精子蛋白17、存活蛋白和端粒酶、肉瘤易位断点、人端粒末端逆转录酶/hTERT、雄激素受体、肠羧基酯酶、细胞周期蛋白B1、纤连蛋白、腱生蛋白、肿瘤坏死区的癌胚变体及其任意组合。优选地，所述抗原选自CD7、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD123、CD138、CD171、MUC1、MSLN、AFP、叶酸受体α、CEA、PSCA、PSMA、Her2、EGFR、IL-13Ra、GD2、NKG2D、Claudin 18.2、ROR1、EGFRvIII、CS1、BCMA和GPRC5D，更优选选自CD19、Claudin 18.2、MSLN、GPRC5D、ROR1、CD7和BCMA。

在一些实施方案中，所述功能性外源受体包含特异性识别CD19的胞外域，例如靶向CD19的抗体。本领域中已知的靶向CD19的抗体均可用于本发明。在一些实施方案中，所述靶向CD19的抗体包含轻链可变区和重链可变区，其中所述重链可变区包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H与SEQ ID NO:103所包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H相同；其中所述轻链可变区包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L与SEQ ID NO:104所包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L相同。在一些实施方案中，所述重链可变区包含的CDR1-H如SEQ ID NO:97所示，CDR2-H如SEQ ID NO:98所示，CDR3-H如SEQ ID NO:99所示，所述轻链可变区包含的CDR1-L如SEQ ID NO:100所示，CDR2-L如SEQ ID NO:101所示，CDR3-L如SEQ ID NO:102所示。

在一些实施方案中，所述靶向CD19的抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区与SEQ ID NO:103具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性，所述轻链可变区与SEQ ID NO:104具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。优选地，本发明中靶向CD19的抗体包含如SEQ ID NO:103所示的重链可变区和如SEQ ID NO:104所示的轻链可变区。

在一些实施方案中，所述靶向CD19的抗体与SEQ ID NO:105具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性。优选地，所述靶向CD19的抗体如SEQ ID NO:105所示。

在一些实施方案中，所述功能性外源受体包含特异性识别Claudin 18.2的胞外域，例如靶向Claudin 18.2的抗体。本领域中已知的靶向Claudin 18.2的抗体均可用于本发明。在一些实施方案中，所述靶向Claudin 18.2的抗体包含VHH，其中所述VHH包含的CDR1、CDR2和CDR3与SEQ ID NO:109所包含的CDR1、CDR2和CDR3相同。在一些实施方案中，所述VHH包含的CDR1如SEQ ID NO:106所示，CDR2如SEQ ID NO:107所示，CDR3如SEQ ID NO:108所示。

在一些实施方案中，所述靶向Claudin 18.2的抗体包含与SEQ ID NO:109具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列。优选地，本发明中靶向Claudin 18.2的抗体包含如SEQ ID NO:109所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本发明的功能性外源受体是嵌合抗原受体，其包含抗原结合结构域、跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域和初级信号传导结构域。在一些实施方案中，本发明的功能性外源受体是嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体靶向CD7、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、CD123、CD138、CD171、MUC1、MSLN、AFP、叶酸受体α、CEA、PSCA、PSMA、Her2、EGFR、IL-13Ra、GD2、NKG2D、Claudin 18.2、ROR1、EGFRvIII、CS1、BCMA、GPRC5D或其任意组合，更优选靶向CD19、Claudin 18.2、MSLN、ROR1、GPRC5D、CD7、BCMA或其任意组合。在一些实施方案中，所述嵌合抗原受体还包含信号肽、铰链区，或两者。可用于本发明的CAR的跨膜结构域、共刺激结构域、初级信号传导结构域以及任选的铰链区、信号肽等结构的定义参见上文“免疫抑制分子”章节。

在一些实施方案中，本发明的CAR还可以包含开关结构，以调控CAR的表达时间。例如，开关结构可以是二聚化结构域的形式，通过与其相应配体的结合引起构象变化，暴露胞外结合结构域，使其与被靶向抗原结合，从而激活信号传导通路。或者，也可以使用开关结构域分别连接结合结构域和信号传导结构域，仅当开关结构域互相结合(例如在诱导化合物的存在下)时，结合结构域和信号传导结构域才能通过二聚体连接在一起，从而激活信号通路。开关结构还可以是掩蔽肽的形式。掩蔽肽可以遮蔽胞外结合结构域，阻止其与被靶向抗原的结合，当通过例如蛋白酶切割掩蔽肽后，就可以暴露胞外结合结构域，使其成为一个“普通”的CAR结构。本领域技术人员知晓的各种开关结构均可用于本发明。

在一些实施方案中，本发明的CAR还可以包含自杀基因，即，使其表达一个可通过外源物质诱导的细胞死亡信号，以在需要时(例如产生严重的毒副作用时)清除CAR细胞。例如，自杀基因可以是插入的表位的形式，例如CD20表位、RQR8等，当需要时，可以通过加入靶向这些表位的抗体或试剂来消除CAR细胞。自杀基因也可以是单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)，该基因可使细胞在接受更昔洛韦治疗诱导下死亡。自杀基因还可以是iCaspase-9，可以通过化学诱导药物如AP1903、AP20187等诱导iCaspase-9发生二聚化，从而激活下游的Caspase3分子，导致细胞凋亡。本领域技术人员知晓的各种自杀基因均可用于本发明。

IV.抑制外源细胞被受试者的免疫细胞免疫排斥的方法

在一个方面，本发明还提供一种降低受试者细胞对外源细胞的免疫排斥的方法，包括以下步骤：在所述外源细胞中表达本发明的免疫抑制分子，编码所述免疫抑制分子的核酸分子或包含所述核酸分子的载体。

在另一个方面，本发明还提供一种降低受试者细胞对外源细胞的免疫排斥的方法，包括以下步骤：向所述受试者施用本发明所述的免疫抑制分子或表达所述免疫抑制分子的工程化细胞。在一些实施方案中，本发明所述的免疫抑制分子或工程化细胞与所述外源细胞同时或顺次施用。例如，本发明所述的免疫抑制分子或工程化细胞可以在所述外源细胞之后施用。

术语“受试者”是哺乳动物。哺乳动物可以是人、非人灵长类动物、小鼠、大鼠、狗、猫、猪、马或牛，但不限于这些实例。除人以外的哺乳动物可以有利地用作代表癌症动物模型的受试者。优选地，所述受试者是人。

V.药物组合物

本发明还提供一种药物组合物，其包含本发明所述的免疫抑制分子、工程化细胞、核酸分子或载体作为活性剂，和一种或多种药学上可接受的赋型剂。因此，本发明还涵盖所述免疫抑制分子、核酸分子、载体或工程化细胞在制备药物组合物或药物中的用途。

术语“药学上可接受的赋型剂”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容(即，能够引发所需的治疗效果而不会引起任何不希望的局部或全身作用)的载体和/或赋型剂，其是本领域公知的(参见例如Remington'sPharmaceutical Sciences.Edited by Gennaro AR,19th ed.Pennsylvania:Mack Publishing Company,1995)。药学上可接受的赋型剂的实例包括但不限于填充剂、粘合剂、崩解剂、包衣剂、吸附剂、抗粘附剂、助流剂、抗氧化剂、调味剂、着色剂、甜味剂、溶剂、共溶剂、缓冲剂、螯合剂、表面活性剂、稀释剂、润湿剂、防腐剂、乳化剂、包覆剂、等渗剂、吸收延迟剂、稳定剂和张力调节剂。本领域技术人员已知选择合适的赋型剂以制备本发明期望的药物组合物。用于本发明的药物组合物中的示例性赋型剂包括盐水、缓冲盐水、葡萄糖和水。通常，合适的赋型剂的选择尤其取决于所使用的活性剂、待治疗的疾病和药物组合物的期望剂型。

根据本发明的药物组合物可适用于多种途径施用。通常，通过胃肠外完成施用。胃肠外递送方法包括局部、动脉内、肌内、皮下、髓内、鞘内、心室内、静脉内、腹膜内、子宫内、阴道内、舌下或鼻内施用。

根据本发明的药物组合物也可以制备成各种形式，如固态、液态、气态或冻干形式，特别可以是软膏、乳膏、透皮贴剂、凝胶、粉末、片剂、溶液、气雾剂、颗粒、丸剂、混悬剂、乳剂、胶囊、糖浆、酏剂、浸膏剂、酊剂或流浸膏提取物的形式，或者是特别适用于所需施用方法的形式。本发明已知的用于生产药物的过程可包括例如常规混合、溶解、制粒、制糖衣、研磨、乳化、包封、包埋或冻干过程。包含例如本文所述的免疫细胞的药物组合物通常以溶液形式提供，并且优选包含药学上可接受的缓冲剂。

根据本发明的药物组合物还可以与一种或多种适用于治疗和/或预防待治疗疾病的其它药剂(生物制剂如抗体试剂，和/或小分子)或治疗方法(例如手术、化疗或放疗)组合施用。适用于组合的药剂的优选实例包括已知的抗癌药物，比如顺铂、美登素衍生物、雷查霉素(rachelmycin)、卡里奇霉素(calicheamicin)、多西紫杉醇、依托泊苷、吉西他滨、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、米托蒽醌、sorfimer卟啉钠II(sorfimer sodiumphotofrin II)、替莫唑胺、拓扑替康、葡萄糖醛酸曲美沙特(trimetreate glucuronate)、奥利斯他汀E(auristatin E)、长春新碱和阿霉素；肽细胞毒素，比如蓖麻毒素、白喉毒素、假单胞菌细菌外毒素A、DNA酶和RNA酶；放射性核素，比如碘131、铼186、铟111、铱90、铋210和213、锕225和砹213；前药，比如抗体定向的酶前药；免疫刺激剂，比如血小板因子4、黑色素瘤生长刺激蛋白等；抗体或其片段，比如抗CD3抗体或其片段，补体活化剂，异种蛋白结构域，同种蛋白结构域，病毒/细菌蛋白结构域和病毒/细菌肽。此外，本发明的药物组合物也可以与其他一种或多种治疗方法，例如化疗、放疗组合使用。

VI.用途、治疗方法

本发明还提供如上所述的药物组合物或工程化细胞在制备癌症、感染或自身免疫性等疾病药物中的用途以及用于治疗患有癌症、感染或自身免疫性疾病的方法。

在一些实施方案中，所述癌症是与功能性外源受体结合的靶标表达有关的癌症。例如，所述癌症包括但不限于：脑神经胶质瘤、胚细胞瘤、肉瘤、白血病、基底细胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脑和CNS癌症、乳腺癌、腹膜癌、宫颈癌、绒毛膜癌、结肠和直肠癌、结缔组织癌症、消化系统的癌症、子宫内膜癌、食管癌、眼癌、头颈癌、胃癌(包括胃肠癌)、胶质母细胞瘤(GBM)、肝癌、肝细胞瘤、上皮内肿瘤、肾癌、喉癌、肝肿瘤、肺癌(例如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、腺状肺癌和鳞状肺癌)、淋巴瘤(包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、黑色素瘤、骨髓瘤、神经母细胞瘤、口腔癌(例如唇、舌、口和咽)、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、直肠癌、呼吸系统的癌症、唾液腺癌、皮肤癌、鳞状细胞癌、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、子宫或子宫内膜癌、泌尿系统的恶性肿瘤、外阴癌以及其它癌和肉瘤、以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中间级/滤泡性NHL、中间级扩散性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小型非裂化细胞性NHL、大肿块病NHL)、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、以及Waldenstrom巨球蛋白血症、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)、T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥散性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、慢性骨髓性白血病(CML)、恶性淋巴组织增生疾病、MALT淋巴瘤、毛细胞白血病、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、骨髓发育不良、浆母细胞性淋巴瘤、白血病前期、浆细胞样树突状细胞瘤、以及移植后淋巴细胞增生性紊乱(PTLD)；以及其他与靶标表达有关的疾病。优选地，可以用本发明的工程化细胞或药物组合物治疗的疾病选自：白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脑神经胶质瘤、胰腺癌、胃癌等。

在一些实施方案中，所述感染包括但不限于由病毒、细菌、真菌和寄生虫引起的感染。

在一些实施方案中，所述自身免疫性疾病包括但不限于I型糖尿病、腹腔疾病、格雷夫斯病、炎症性肠病、多发性硬化症、银屑病、类风湿性关节炎、艾迪生病、干燥综合征、桥本甲状腺炎、重症肌无力、血管炎、恶性贫血与系统性红斑狼疮等。

下面将参考附图并结合实例来详细说明本发明。需要说明的是，本领域的技术人员应该理解本发明的附图及其实施例仅仅是为了例举的目的，并不能对本发明构成任何限制。在不矛盾的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

附图说明

图1：CAR19-AT3 T、CAR19-AL3 T、CAR19-ATT T及CAR19-A T细胞中的CAR表达水平。

图2：CAR19-AL3 T和CAR19-ATT T细胞中的抗LAG3 scFv及抗TIGIT scFv表达水平。

图3：CAR19-AT3 T、CAR19-AL3 T、CAR19-ATT T及CAR19-A T细胞与靶细胞Nalm6共孵育后的细胞因子释放水平。

图4：CAR19-AT3 T、CAR19-AL3 T、CAR19-ATT T及CAR19-A T细胞对同种异体PBMC增殖的抑制效果。

图5：CAR19-AC4 T及CAR19-A T细胞中的CAR表达水平。

图6：CAR19-AC4 T及CAR19-A T细胞中的抗NKG2A scFv或抗CTLA4 scFv表达水平。

图7：CAR19-AC4 T及CAR19-A T细胞与靶细胞Nalm6共孵育后的细胞因子释放水平。

图8：CAR19-AC4 T及CAR19-A T细胞对同种异体PBMC增殖的抑制效果。

图9：CAR19-C4T3 T、CAR19-C4L3 T、CAR19-C4TT T及CAR19-C4 T细胞中的CAR表达水平。

图10：CAR19-C4T3 T、CAR19-C4L3 T、CAR19-C4TT T及CAR19-C4 T细胞中的抗CTLA4 scFv、抗LAG3 scFv或抗TIGIT scFv表达水平。

图11：CAR19-C4T3 T、CAR19-C4L3 T、CAR19-C4TT T及CAR19-C4 T细胞与靶细胞Nalm6共孵育后的细胞因子释放水平。

图12：CAR19-C4T3 T、CAR19-C4L3 T、CAR19-C4TT T及CAR19-C4 T细胞对同种异体PBMC增殖的抑制效果。

图13：CAR19-PT3 T、CAR19-PL3 T、CAR19-PC4 T及CAR19-P T细胞中的CAR表达水平。

图14：CAR19-PT3 T、CAR19-PL3 T、CAR19-PC4 T及CAR19-P T细胞中的抗LAG3 scFv、抗TIGIT scFv或抗CTLA4 scFv表达水平。

图15：CAR19-PT3 T、CAR19-PL3 T、CAR19-PC4 T及CAR19-P T细胞与靶细胞Nalm6共孵育后的细胞因子释放水平。

图16：CAR19-PT3 T、CAR19-PL3 T、CAR19-PC4 T及CAR19-P T细胞对同种异体PBMC增殖的抑制效果。

图17：CAR18.2-PA T、CAR18.2-PE T及CAR18.2-P T细胞中的CAR表达水平。

图18：CAR18.2-PA T和CAR18.2-PE T及CAR18.2-P T细胞中的抗NKG2A scFv或抗PD1 scFv表达水平。

图19：CAR18.2-PA T、CAR18.2-PE T及CAR18.2-P T细胞对靶细胞Claudin 18.2/NUGC4的杀伤效果。

图20：CAR18.2-PA T、CAR18.2-PE T及CAR18.2-P T细胞在体内的肿瘤抑制。

图21：CAR18.2 T、CAR18.2-PC T、CAR18.2-CA T、CAR18.2PTT T、CAR18.2-PL3 T、CAR18.2-PT3 T细胞中的CAR表达水平。

图22：CAR18.2-PTT T和CAR18.2-PL3 T及CAR18.2-PT3 T细胞中的PDL1、抗TIGIT scFv或抗LAG3 scFv表达水平。

图23：CAR18.2 T、CAR18.2-PC T、CAR18.2-CA T、CAR18.2PTT T、CAR18.2-PL3 T、CAR18.2-PT3 T细胞对靶细胞Claudin 18.2/NUGC4的杀伤效果；

图24：同种异体PBMC和CAR18.2 T、CAR18.2-PC T、CAR18.2-CA T、CAR18.2PTT T、CAR18.2-PL3 T或CAR18.2-PT3共培养后10天后PBMC的扩增情况。

具体实施方式

实施例1：构建表达包含NKG2A结合结构域的免疫抑制分子的抗CD19 CAR-T细胞并验证其功能

合成以下的编码序列，并将其依次克隆至pGEM-T Easy载体(Promega)：抗CD19 scFv(SEQ ID NO:105)、CD8α铰链区(SEQ ID NO:86)、CD8α跨膜区(SEQ ID NO:83)、4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO:90)、CD3ζ胞内区(SEQ ID NO:92)，获得CAR19质粒，并通过测序确认目标序列在质粒中的正确插入。

在上述CAR19质粒中进一步表达通过T2A(SEQ ID NO:110)连接的免疫抑制分子，其结构如下：B2M信号肽(SEQ ID NO:94)、免疫抑制蛋白结合结构域(表1)、IgG4铰链区(SEQ ID NO:88)、CD28跨膜区(SEQ ID NO:82)、CD28共刺激结构域(SEQ ID NO:89)，获得质粒CAR19-A、CAR19-AT3、CAR19-AL3、CAR19-ATT、CAR19-AC4，并通过测序确认目标序列在质粒中的正确插入。

表1表达包含NKG2A结合结构域的免疫抑制分子的质粒

1.1构建CAR19-AT3 T、CAR19-AL3 T、CAR19-ATT T细胞并验证其功能

1.1.1构建CAR19-AT3 T、CAR19-AL3 T、CAR19-ATT T细胞

在无菌管中加入3ml Opti-MEM(Gibco)分别稀释CAR19-A、CAR19-AT3、CAR19-AL3和CAR19-ATT质粒后，再根据质粒：病毒包装载体：病毒包膜载体＝4:2:1的比例加入包装载体psPAX2(Addgene)和包膜载体pMD2.G(Addgene)。然后，加入120μl X-treme GENE HP DNA转染试剂(Roche)，立即混匀，于室温下孵育15min，然后将质粒/载体/转染试剂混合物逐滴加入到293T细胞的培养瓶中。在24小时和48小时收集病毒，将其合并后，超速离心(25000g，4℃，2.5小时)获得浓缩的慢病毒。

用DynaBeads CD3/CD28 CTSTM(Gibco)激活T细胞，并在37℃和5％CO₂下培养1天。第二天，加入浓缩的慢病毒，持续培养3天后，获得表达CAR19和免疫抑制分子的T细胞(CAR19-A T、CAR19-AT3 T、CAR19-AL3 T和CAR19-ATT T细胞)。

1.1.2检测各CAR-T细胞中CAR的表达水平和免疫抑制蛋白结合结构域表达水平

使用流式细胞仪，用FITC goat anti-human Fab(Thermo Fisher)检测CAR19-A T、CAR19-AT3 T、CAR19-AL3 T、CAR19-ATT T细胞中的anti-CD19 scFv的表达。可以看出，本实施例制备的CAR-T细胞中的CAR均能够有效表达(图1)。

使用流式细胞仪，用Human LAG-3/CD223 Protein,His Tag(ACRO)检测CAR19-AL3 T细胞中的抗LAG3 scFv的表达，用Human TIGIT Protein,Fc TagTIGIT(ACRO)检测CAR19-ATT T细胞中的抗TIGIT scFv的表达。可以看出，CAR19-AL3 T细胞中的抗LAG3 scFv、CAR19-ATT T细胞中的抗TIGIT scFv均能够有效表达(图2)。

1.1.3检测各CAR-T细胞的细胞因子释放水平

以1×10⁵个细胞/孔的浓度将靶细胞Nalm6铺于96孔板中，按1:1的比例分别加CAR19-A T细胞、CAR19-AT3 T、CAR19-AL3 T、CAR19-ATT T以及NT细胞，共培养18-24小时后收集细胞共培养上清液。

分别使用Human IL-2DuoSet ELISA Kit(R&D systems)、Human IFN-gamma DuoSet ELISA Kit(R&D systems)检测共培养上清液中IL2和IFN-γ的含量，结果如图3所示。

可以看出，与NT细胞相比，CAR19-A T细胞、CAR19-AT3 T、CAR19-AL3 T、CAR19-ATT T细胞与靶细胞共培养后，细胞因子IL2和IFN-γ的释放水平均显著升高，表明这种细胞因子释放是特异性的。更关键地，与表达仅靶向NKG2A的免疫抑制分子的CAR19-A T细胞相比，表达靶向NKG2A和其他免疫抑制蛋白的组合的免疫抑制分子的CAR19-AT3 T、CAR19-AL3 T、CAR19-ATT T细胞对CAR T细胞的IL2释放具有更强的促进作用。

1.1.4检测各CAR-T细胞体外对HvGD的抑制作用

通过单向混合淋巴细胞反应(MLR)测定评估1.1.1制备的各CAR-T细胞在体外对HvGD的抑制作用。具体地，在37℃和5％CO₂下，将NT细胞、CAR19-A T细胞、CAR19-AT3 T、CAR19-AL3 T和CAR19-ATT T细胞与同种异体的PBMC共孵育7天，然后通过流式细胞术检测PBMC的增殖情况，结果如图4所示。

可以看出，与NT细胞相比，额外表达本发明中的免疫抑制分子的CAR T细胞均能够显著抑制同种异体PBMC的增殖。尤其值得注意的是，与仅靶向NKG2A的免疫抑制分子的CAR T细胞(CAR19-A T)相比，表达靶向NKG2A和TIM3、NKG2A和LAG3、或NKG2A和TIGIT的免疫抑制分子的CAR T细胞(CAR19-AT3 T、CAR19-AL3 T、CAR19-ATT T)进一步显著抑制了同种异体PBMC的增殖。

1.2构建CAR19-AC4 T细胞并验证其功能

1.2.1构建CAR19-AC4 T细胞

按照1.1.1中的方法将质粒CAR19-A、CAR19-AC4分别转入另一供体来源的T细胞，获得表达CAR19和免疫抑制分子的T细胞(CAR19-A T、CAR19-AC4 T细胞)。

1.2.2检测CAR19-AC4 T中CAR的表达水平和免疫抑制蛋白结合结构域表达水平

使用流式细胞仪，用FITC goat anti-human Fab(Thermo Fisher)检测CAR19-A T和CAR19-AC4 T细胞中的anti-CD19 scFv的表达。可以看出，本CAR19-A T和CAR19-AC4 T细胞中的CAR均能够有效表达(图5)。

使用流式细胞仪，用Human NKG2A&CD94 Protein,Fc Tag(ACRO)检测CAR19-A T、CAR19-AC4 T细胞中的抗NKG2A scFv的表达，用Human CTLA-4/CD152 Protein,Fc Tag(ACRO)检测CAR19-AC4 T细胞中的抗CTLA4 scFv的表达。可以看出，CAR19-AC4 T细胞中的抗NKG2A scFv、抗CTLA4 scFv均能够有效表达(图6)。

1.2.3检测CAR19-AC4 T细胞的细胞因子释放水平

按照1.1.3中的检测方法，检测NT、CAR19-A T和CAR19-AC4细胞的细胞因子释放水平，结果如图7所示。

可以看出，与NT细胞相比，CAR19-A T、CAR19-AC4 T细胞与靶细胞共培养后，细胞因子IL2和IFN-γ的释放水平均显著升高，表明这种细胞因子释放是特异性的；与CAR19-A T细胞相比，CAR19-AC4细胞的细胞因子IL2和IFN-γ的释放水平均显著升高，表明与仅靶向NKG2A的免疫抑制分子相比，靶向NKG2A和CTLA4的免疫抑制分子对CAR T细胞的IL2和IFN-γ释放均具有更强的促进作用。

1.2.4检测CAR19-AC4 T体外对HvGD的抑制作用

按照1.1.4中的检测方法，检测通过单向混合淋巴细胞反应(MLR)测定评估CAR19-A T、CAR19-AC4 T细胞在体外对HvGD的抑制作用，结果如图8所示。

可以看出，与NT细胞相比，CAR19-A T、CAR19-AC4 T能够显著抑制同种异体PBMC的增殖；与CAR19-A T细胞相比，表达靶向NKG2A和CTLA4的免疫抑制分子的CAR T细胞(CAR19-AC4 T)进一步显著抑制了同种异体PBMC的增殖。

以上结果表明，相比于仅靶向NKG2A的免疫抑制分子，靶向NKG2A及其他免疫抑制蛋白(如TIM3、LAG3、TIGIT或CTLA4)的免疫抑制分子能够显著抑制同种异体PBMC的体外增殖，进而显著降低HvGD，且对CAR T细胞与靶细胞共培养后细胞因子(尤其是IL2)的释放具有更强的促进作用。

实施例2：构建表达包含CTLA4结合结构域的免疫抑制分子的抗CD19 CAR-T细胞并验证其功能

2.1构建表达包含CTLA4结合结构域的免疫抑制分子的抗CD19 CAR-T细胞

在实施例1制备的CAR19质粒中进一步表达通过T2A(SEQ ID NO:110)连接的免疫抑制分子，其结构如下：B2M信号肽(SEQ ID NO:94)、免疫抑制蛋白结合结构域(表2)、IgG4铰链区(SEQ ID NO:88)、CD28跨膜区(SEQ ID NO:82)、CD28共刺激结构域(SEQ ID NO:89)，获得质粒CAR19-C4、CAR19-C4T3、CAR19-C4L3和CAR19-C4TT，并通过测序确认目标序列在质粒中的正确插入。

表2表达包含CTLA4结合结构域的免疫抑制分子的质粒

按照1.1.1中的方法将质粒CAR19-C4、CAR19-C4T3、CAR19-C4L3和CAR19-C4TT分别转入T细胞，获得CAR19-C4 T、CAR19-C4T3 T、CAR19-C4L3 T和CAR19-C4TT T细胞。

2.2检测各CAR-T细胞中CAR的表达水平和免疫抑制蛋白结合结构域表达水平

使用流式细胞仪，用FITC goat anti-human Fab(Thermo Fisher)检测CAR19-C4 T、CAR19-C4T3 T、CAR19-C4L3 T及CAR19-C4TT T细胞中的anti-CD19 scFv的表达。可以看出，本实施例制备的CAR-T细胞中的CAR均能够有效表达(图9)。

使用流式细胞仪，用Human CTLA-4/CD152 Protein,Fc Tag(ACRO)检测CAR19-C4 T、CAR19-C4T3 T、CAR19-C4L3 T及CAR19-C4TT T细胞中的抗CTLA4 scFv的表达，用Human LAG-3/CD223 Protein,His Tag(ACRO)检测CAR19-C4L3 T中的抗LAG3 scFv的表达，用Human TIGIT Protein,Fc Tag(ACRO)检测CAR19-C4TT T中的抗TIGIT scFv的表达。可以看出，CAR19-C4 T、CAR19-C4T3 T、CAR19-C4L3 T和CAR19-C4TT T细胞中的抗CTLA4 scFv、CAR19-C4L3 T中的抗LAG3 scFv、CAR19-C4TT T细胞中的抗TIGIT scFv均能够有效表达(图10)。

2.3检测各CAR-T细胞的细胞因子释放水平

按照实施例1.1.3中的方法，检测CAR-T细胞与靶细胞共培养上清液中IL2和IFN-γ的含量，结果如图11所示。

可以看出，与NT细胞相比，CAR19-C4 T、CAR19-C4T3 T、CAR19-C4L3 T及CAR19-C4TT T细胞与靶细胞共培养后，细胞因子IL2和IFN-γ的释放水平均显著升高，表明这种细胞因子释放是特异性的；而与CAR19-C4 T细胞相比，CAR19-C4T3 T、CAR19-C4L3 T及CAR19-C4TT T细胞的释放水平相差不大，表明与仅靶向CTLA4的免疫抑制分子相比，靶向CTLA4及其他免疫抑制蛋白(如TIM3、LAG3或TIGIT)的组合的免疫抑制分子对CAR T细胞的细胞因子释放不会产生明显的不利影响。

2.4体外对HvGD的抑制作用

按照1.1.4中的检测方法，检测通过单向混合淋巴细胞反应(MLR)测定评估CAR19-C4 T、CAR19-C4T3 T、CAR19-C4L3 T及CAR19-C4TT T细胞在体外对HvGD的抑制作用，结果如图12所示。

可以看出，与NT细胞相比，表达靶向CTLA4的免疫抑制分子的CAR T细胞(CAR19-C4 T)显著降低了同种异体PBMC的扩增倍数，而表达靶向CTLA4和TIM3、CTLA4和LAG3、或CTLA4和TIGIT的免疫抑制分子的CAR T细胞(CAR19-C4T3 T、CAR19-C4L3 T或CAR19-C4TT T细胞)在CAR19-C4 T细胞的基础上进一步显著降低了同种异体PBMC的扩增倍数。

以上结果表明，相比于仅靶向CTLA4的免疫抑制分子，靶向CTLA4及其他免疫抑制蛋白(如TIM3、LAG3或TIGIT)的免疫抑制分子能够显著抑制同种异体PBMC的体外增殖，进而显著降低HvGD，且对CAR T细胞与靶细胞共培养后细胞因子(如IL2和IFN-γ)的释放不会产生明显的不利影响。

实施例3：构建表达包含PD1结合结构域的免疫抑制分子的抗CD19 CAR-T细胞并验证其功能

3.1构建表达包含PD1结合结构域的免疫抑制分子的抗CD19 CAR-T细胞

在实施例1制备的CAR19质粒中进一步表达通过T2A(SEQ ID NO:110)连接的免疫抑制分子，其结构如下：B2M信号肽(SEQ ID NO:94)、免疫抑制蛋白结合结构域(表3)、IgG4铰链区(SEQ ID NO:88)、CD28跨膜区(SEQ ID NO:82)、CD28共刺激结构域(SEQ ID NO:89)，获得质粒CAR19-P、CAR19-PT3、CAR19-PL3和CAR19-PC4，并通过测序确认目标序列在质粒中的正确插入。

表3表达包含PD1结合结构域的免疫抑制分子的CAR19质粒

按照1.1.1中的方法将质粒CAR19-P、CAR19-PT3、CAR19-PL3、CAR19-PC4分别转入T细胞，获得CAR19-P T、CAR19-PT3 T、CAR19-PL3 T和CAR19-PC4 T细胞。

3.2检测各CAR-T细胞中CAR的表达水平和免疫抑制蛋白结合结构域表达水平

使用流式细胞仪，用FITC goat anti-human Fab(Thermo Fisher)检测CAR19-P T、CAR19-PT3 T、CAR19-PL3 T及CAR19-PC4 T细胞中的抗CD19 scFv的表达。可以看出，本实施例制备的CAR-T细胞中的CAR均能够有效表达(图13)。

使用流式细胞仪，用Human PD-1/PDCD1 Protein,His Tag(ACRO)检测CAR19-P T、CAR19-PT3 T、CAR19-PL3 T及CAR19-PC4 T细胞中的抗PD1 scFv的表达，用Human LAG-3/CD223 Protein,His Tag(ACRO)检测CAR19-PL3 T细胞中的抗LAG3 scFv的表达，用Human TIGIT Protein,Fc Tag(ACRO)检测CAR19-PTT T细胞中的抗TIGIT scFv的表达，用Human CTLA-4/CD152 Protein,Fc Tag(ACRO)检测CAR19-PC4 T细胞中的抗CTLA4 scFv的表达。可以看出，CAR19-P T、CAR19-PT3 T、CAR19-PL3 T和CAR19-PC4 T细胞中的抗PD1 scFv、CAR19-PL3 T细胞中的抗LAG3 scFv、CAR19-PTT T细胞中的抗TIGIT scFv及CAR19-PC4 T细胞中的抗CTLA4 scFv均能够有效表达(图14)。

3.3检测各CAR-T细胞的细胞因子释放水平

按照1.1.3中的方法，检测CAR-T细胞与靶细胞共培养上清液中IL2和IFN-γ的含量，结果如图15所示。

可以看出，与NT细胞相比，表达本发明中的免疫抑制分子的CAR T细胞(CAR19-P T、CAR19-PT3 T、CAR19-PL3 T和CAR19-PC4 T细胞)均能够显著提高细胞因子IL2和IFN-γ的释放水平，表明这种细胞因子释放是特异性的。此外，CAR19-P T、CAR19-PT3 T、CAR19-PL3 T和CAR19-PC4 T细胞之间的细胞因子释放水平相差不大，表明与仅靶向PD1的免疫抑制分子相比，靶向PD1及其他免疫抑制蛋白(TIM3、LAG3或CTLA4)的组合的免疫抑制分子对CAR T细胞的细胞因子的释放不会产生明显的不利影响。

3.4检测各CAR-T细胞体外对HvGD的抑制作用

按照1.1.4中的检测方法，检测通过单向混合淋巴细胞反应(MLR)测定评估CAR19-P T、CAR19-PT3 T、CAR19-PL3 T和CAR19-PC4 T细胞在体外对HvGD的抑制作用，结果如图16所示。

可以看出，与NT细胞相比，表达本发明中的免疫抑制分子的CAR T细胞(CAR19-P T、CAR19-PT3 T、CAR19-PL3 T或CAR19-PC4 T细胞)均能够显著抑制同种异体PBMC的增殖。更重要的是，相比于CAR19-P T细胞，表达靶向PD1和TIM3、PD1和LAG3、或PD1和CTLA4的免疫抑制分子的CAR T细胞进一步显著抑制了同种异体PBMC的体外增殖。

以上结果表明，相比于仅靶向PD1的免疫抑制分子，靶向PD1及其他免疫抑制蛋白(如TIM3、LAG3或CTLA4)的免疫抑制分子能够显著抑制同种异体PBMC的体外增殖，进而显著降低HvGD，且对CAR T细胞与靶细胞共培养后细胞因子(如IL2和IFN-γ)的释放不会产生明显的不利影响。

实施例4：构建表达包含PD1结合结构域的免疫抑制分子的抗Claudin 18.2CAR-T细胞并验证其功能

4.1构建表达包含PD1结合结构域的免疫抑制分子的抗Claudin 18.2CAR-T细胞

合成以下的编码序列，并将其依次克隆至pGEM-T Easy载体(Promega)：抗Claudin 18.2VHH(SEQ ID NO:112)、CD8α铰链区(SEQ ID NO:86)、CD8α跨膜区(SEQ ID NO:83)、4-1BB共刺激结构域(SEQ ID NO:93)、CD3ζ胞内区(SEQ ID NO:92)，获得CAR18.2质粒，并通过测序确认目标序列在质粒中的正确插入。

在上述CAR18.2质粒中进一步表达通过T2A(SEQ ID NO:110)连接的免疫抑制分子，其结构如下：B2M信号肽(SEQ ID NO:94)、免疫抑制蛋白结合结构域(表4)、IgG4铰链区(SEQ ID NO:88)、CD28跨膜区(SEQ ID NO:82)、CD28共刺激结构域(SEQ ID NO:89)，获得质粒CAR18.2-P、CAR18.2-PA和CAR18.2-PE，并通过测序确认目标序列在质粒中的正确插入。

表4表达包含PD1结合结构域的免疫抑制分子的CAR18.2质粒

按照1.1.1中的方法将质粒Claudin 18.2、CAR18.2-P、CAR18.2-PA和CAR18.2-PE分别转入T细胞，获得CAR18.2 T、CAR18.2-P T、CAR18.2-PA T和CAR18.2-PE T细胞。

4.2检测各CAR-T细胞中CAR的表达水平和免疫抑制蛋白结合结构域的表达水平

使用流式细胞仪，用anti-VHH antibody(Genscript)检测CAR18.2-P T、CAR18.2-PA T和CAR18.2-PE T细胞中的anti-Claudin 18.2VHH的表达。可以看出，CAR18.2-P T、CAR18.2-PA T和CAR18.2-PE T细胞中的CAR均能够有效表达(图17)。

使用流式细胞仪，用Human NKG2A&CD94 Protein,Fc Tag(ACRO)检测CAR18.2-PA T和CAR18.2-PE T细胞中的抗NKG2A scFv或HLA-E的表达，用Human PD-1/PDCD1 Protein,His Tag(ACRO)检测CAR18.2-PA T和CAR18.2-PE T细胞中的抗PD1 scFv的表达。可以看出，CAR18.2-PA T和CAR18.2-PE T细胞中的抗NKG2A scFv、HLA-E、抗PD1 scFv均能够有效表达(图18)。

4.3检测各CAR-T细胞中对靶细胞的杀伤效果

以1×10⁴个细胞/孔的浓度将靶细胞Claudin 18.2/NUGC4铺入96孔板中，然后以4:1、2:1或1:1的效靶比将NT、CAR18.2 T、CAR18.2-PA T和CAR18.2-PE T细胞铺入到96孔板进行共培养，18小时后利用酶标仪测定荧光值。根据计算公式：(靶细胞荧光均值-样品荧光均值)/靶细胞荧光均值×100％，计算得到杀伤效率，结果如图19所示。

可以看出，CAR18.2 T、CAR18.2-PA T和CAR18.2-PE T细胞在不同的效靶比下对靶细胞均呈现有效的特异性杀伤作用，且杀伤作用相当，表明额外表达靶向PD1和NKG2A的免疫抑制分子后，对于CAR18.2 T的杀伤活性无明显影响。

4.4检测各CAR T细胞对肿瘤的体内抑制效果

将25只6-8周龄的健康雌性NPI小鼠分成4组，每组5只小鼠：NT组、CAR18.2 T组、CAR18.2-PA T组和CAR18.2-PE T组。在第0天向每只小鼠尾静脉注射5×10⁵个Claudin 18.2/NUGC4细胞。6天后，根据分组情况向每只小鼠尾静脉注射2×10⁶个NT细胞或相应的CAR-T细胞。每周评估小鼠状态。小鼠肿瘤体积变化如图20所示。

可以看出，CAR18.2-PA T组和CAR18.2-PE T组的肿瘤抑制效果显著高于CAR18.2 T和NT组，表明靶向PD1和NKG2A的免疫抑制分子在体内能够非常有效地抑制免疫排斥，进而增强CAR-T细胞的肿瘤抑制效果。另外，CAR18.2-PA T组和CAR18.2-PE T组的肿瘤抑制效果相当，提示本发明中的免疫抑制分子中的免疫抑制蛋白(如NKG2A)结合结构域使用不同的结构形式(如抗体或配体)，都能够发挥显著的抑制免疫排斥及抗肿瘤作用。

实施例5：构建表达免疫抑制分子的抗Claudin 18.2CAR-T细胞并验证其功能

5.1构建表达免疫抑制分子的抗Claudin 18.2CAR-T细胞

在上述CAR18.2质粒中进一步表达通过T2A(SEQ ID NO:110)连接的免疫抑制分子，其结构如下：B2M信号肽(SEQ ID NO:94)、免疫抑制蛋白结合结构域(表5)、IgG4铰链区(SEQ ID NO:88)、CD28跨膜区(SEQ ID NO:82)、CD28共刺激结构域(SEQ ID NO:89)，获得质粒CAR18.2-PC、CAR18.2-CA、CAR18.2PTT、CAR18.2-PL3、CAR18.2-PT3，并通过测序确认目标序列在质粒中的正确插入。

表5表达免疫抑制分子的CAR18.2质粒

按照1.1.1中的方法将质粒Claudin 18.2、CAR18.2-PC、CAR18.2-CA、CAR18.2PTT、CAR18.2-PL3和CAR18.2-PT3分别转入T细胞，获得CAR18.2 T、CAR18.2-PC T、CAR18.2-CA T、CAR18.2PTT T、CAR18.2-PL3 T、CAR18.2-PT3 T细胞。

5.2检测各CAR-T细胞中CAR的表达水平和免疫抑制蛋白结合结构域的表达水平

使用流式细胞仪，用anti-VHH antibody(Genscript)检测CAR18.2 T、CAR18.2-PC T、CAR18.2-CA T、 CAR18.2PTT T、CAR18.2-PL3 T、CAR18.2-PT3 T细胞中的anti-Claudin 18.2VHH的表达。可以看出，各CAR-T细胞中的CAR均能够有效表达(图21)。

使用流式细胞仪，用Human PD-1/PDCD1 Protein,His Tag(ACRO)检测CAR18.2-PC T、CAR18.2-CA T、CAR18.2PTT T、CAR18.2-PL3 T、CAR18.2-PT3 T细胞中的PDL1的表达，可以看出，CAR18.2-PC T、CAR18.2-CA T、CAR18.2PTT T、CAR18.2-PL3 T、CAR18.2-PT3 T细胞中的PDL1能够正常表达(图22)。用Human LAG-3/CD223 Protein,His Tag(ACRO)检测CAR18.2-PL3 T细胞中的抗LAG3 scFv的表达，用Human TIGIT Protein,Fc Tag(ACRO)检测CAR18.2-PTT T细胞中的抗TIGIT scFv的表达，可以看出，CAR18.2-PL3 T细胞中的抗LAG3 scFv和CAR18.2-PTT T细胞中的抗TIGIT scFv均能够有效表达(图22)。

5.3检测各CAR-T细胞中对靶细胞的杀伤效果

以1×10⁴个细胞/孔的浓度将靶细胞Claudin 18.2/NUGC4铺入96孔板中，然后以0.625:1、1.25:1、2.5:1或5:1的效靶比将NT、CAR18.2-PC T、CAR18.2-CA T、CAR18.2PTT T、CAR18.2-PL3 T、CAR18.2-PT3 T细胞铺入到96孔板进行共培养，18小时后利用酶标仪测定荧光值。根据计算公式：(靶细胞荧光均值-样品荧光均值)/靶细胞荧光均值×100％，计算得到杀伤效率，结果如图23所示。

可以看出，各CAR-T细胞在不同的效靶比下对靶细胞均呈现有效的特异性杀伤作用，且杀伤作用相当，表明额外表达本发明中的免疫抑制分子后，对于CAR18.2 T的杀伤活性无明显影响。

5.4检测CAR-T体外对HvGD的抑制作用

通过单向混合淋巴细胞反应(MLR)测定评估5.1制备的各CAR-T细胞在体外对HvGD的抑制作用。具体地，在37℃和5％CO₂下，将CAR18.2 T、CAR18.2-PC T、CAR18.2-CA T、CAR18.2PTT T、CAR18.2-PL3 T、CAR18.2-PT3 T细胞与同种异体的PBMC共孵育10天，然后通过流式细胞术检测PBMC的增殖情况，结果如图24所示。

可以看出，与CAR18.2 T细胞相比，CAR18.2-PC T、CAR18.2-CA T、CAR18.2PTT T、CAR18.2-PL3 T、CAR18.2-PT3 T能够显著抑制同种异体PBMC的增殖。

综上所述，在测试的免疫抑制蛋白NKG2A、TIM3、LAG3、TIGIT、CTLA4、PD1中，与表达仅靶向一个免疫抑制蛋白的免疫抑制分子或不表达免疫抑制分子相比，表达靶向多个(例如两个)免疫抑制蛋白组合的免疫抑制分子(例如靶向NKG2A和TIM3、NKG2A和LAG3、NKG2A和TIGIT、NKG2A和CTLA4、CTLA4和TIM3、CTLA4和LAG3、CTLA4和TIGIT、PD1和TIM3、PD1和LAG3、PD1和TIGIT、PD1和CTLA4、或PD1和NKG2A)一方面不会对CAR-T细胞的杀伤活性或细胞因子释放特性产生明显的不利影响，另一方面能够大幅增强对同种异体NK细胞的杀伤活性或同种异体PBMC在被激活后的过度增殖的抑制效果，从而有效降低免疫细胞的排斥反应。

需要说明的是，以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。本领域技术人员理解的是，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

一种免疫抑制分子，其包含免疫抑制蛋白结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域并且不包含初级信号传导结构域，其中所述免疫抑制蛋白选自NKG2A、TIM3、LAG3、TIGIT、CTLA4、PD1和FasL中的两种或两种以上。
根据权利要求1所述的免疫抑制分子，其中所述免疫抑制蛋白结合结构域选自完整抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd片段、Fd′、Fv片段、scFv、sdFv、线性抗体、双体、sdAb以及配体或受体的功能性片段。
根据权利要求1-2任一项所述的免疫抑制分子，其中所述免疫抑制分子结合以下任一免疫抑制蛋白的组合：NKG2A和TIM3、NKG2A和LAG3、NKG2A和TIGIT、NKG2A和CTLA4、CTLA4和TIM3、CTLA4和LAG3、CTLA4和TIGIT、PD1和TIM3、PD1和LAG3、PD1和TIGIT、PD1和CTLA4、TIM3和LAG3、TIM3和TIGIT、LAG3和TIGIT、PD1和NKG2A、FasL和NKG2A、FasL和LAG3、FasL和TIGIT、FasL和CTLA4、或FasL和PD1。
根据权利要求1-3任一项所述的免疫抑制分子，其中所述免疫抑制分子包含：(1)免疫抑制蛋白结合区，包含第一免疫抑制蛋白结合结构域和第二免疫抑制蛋白结合结构域；(2)跨膜结构域；和(3)共刺激结构域。
根据权利要求1-3任一项所述的免疫抑制分子，其中所述免疫抑制分子包含：(1)靶向第一免疫抑制蛋白的第一单元结构，包含靶向第一免疫抑制蛋白结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域；和(2)靶向第二免疫抑制蛋白的第二单元结构，包含靶向第二免疫抑制蛋白结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域。
根据权利要求1-5任一项所述的免疫抑制分子，其中所述免疫抑制分子包含NKG2A结合结构域、TIM3结合结构域、LAG3结合结构域、TIGIT结合结构域、PD1结合结构域、CTLA4结合结构域、FasL结合结构域中的两种或两种以上；其中，

(1)所述NKG2A结合结构域是靶向NKG2A的抗体、配体或其功能性片段；

(2)所述TIM3结合结构域是靶向TIM3的抗体、配体或其功能性片段；

(3)所述LAG3结合结构域是靶向LAG3的抗体、配体或其功能性片段；

(4)所述TIGIT结合结构域是靶向TIGIT的抗体、配体或其功能性片段；

(5)所述CTLA4结合结构域是靶向CTLA4的抗体、配体或其功能性片段；或

(6)所述PD1结合结构域是靶向PD1的抗体、配体或其功能性片段；

(7)所述FasL结合结构域是靶向FasL的抗体、受体或其功能性片段。
根据权利要求6所述的免疫抑制分子，其中：

(1)所述靶向NKG2A的抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H与SEQ ID NO:7所包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H相同，所述轻链可变区包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L与SEQ ID NO:8所包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L相同；优选地，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:7具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:8具有至少90％同一性的氨基酸序列；

(2)所述靶向TIM3的抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H与SEQ ID NO:19所包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H相同，所述轻链可变区包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L与SEQ ID NO:20所包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L相同；优选地，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:19具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:20具有至少90％同一性的氨基酸序列；

(3)所述靶向LAG3的抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H与SEQ ID NO:32所包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H相同，所述轻链可变区包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L与SEQ ID NO:33所包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L相同；优选地，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:32具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:33具有至少90％同一性的氨基酸序列；

(4)所述靶向TIGIT的抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H与SEQ ID NO:45所包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H相同，所述轻链可变区包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L与SEQ ID NO:46所包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L相同；优选地，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:45具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:46具有至少90％同一性的氨基酸序列；

(5)所述靶向CTLA4的抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H与SEQ ID NO:62所包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H相同，所述轻链可变区包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L与SEQ ID NO:63所包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L相同；优选地，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:62具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:63具有至少90％同一性的氨基酸序列；或

(6)所述靶向PD1的抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H与SEQ ID NO:75所包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H相同，所述轻链可变区包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L与SEQ ID NO:76所包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L相同；优选地，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:75具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:76具有至少90％同一性的氨基酸序列；

(7)所述靶向FasL的抗体包含轻链可变区和重链可变区，所述重链可变区包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H与SEQ ID NO:119或125所包含的CDR1-H、CDR2-H和CDR3-H相同，所述轻链可变区包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L与SEQ ID NO:120所包含的CDR1-L、CDR2-L和CDR3-L相同；优选地，所述重链可变区包含与SEQ ID NO:119或125具有至少90％同一性的氨基酸序列，所述轻链可变区包含与SEQ ID NO:120具有至少90％同一性的氨基酸序列。
根据权利要求6所述的免疫抑制分子，其中：

(1)所述靶向NKG2A的配体包含与SEQ ID NO:10或11具有至少90％同一性的氨基酸序列；

(2)所述靶向TIM3的配体包含与SEQ ID NO:22、23或24具有至少90％同一性的氨基酸序列；

(3)所述靶向LAG3的配体包含与SEQ ID NO:35、36或37具有至少90％同一性的氨基酸序列；

(4)所述靶向TIGIT的配体包含与SEQ ID NO:48、49、50或51具有至少90％同一性的氨基酸序列；

(5)所述靶向CTLA4的配体包含与SEQ ID NO:65或66具有至少90％同一性的氨基酸序列；或

(6)所述靶向PD1的配体包含与SEQ ID NO:78或79具有至少90％同一性的氨基酸序列；

(7)所述靶向FasL的受体包含与SEQ ID NO:127具有至少90％同一性的氨基酸序列。
根据权利要求1-8任一项所述的免疫抑制分子，其中所述跨膜结构域选自以下蛋白质的跨膜结构域：TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ζ亚基、CD3ε亚基、CD3γ亚基、CD3δ亚基、CD28、CD45、CD4、CD5、CD8α、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD47、CD64、CD80、CD86、CD94、CD112、CD113、CD134、CD137、CD154、CD155、Nectin4、KIRDS2、OX40、CD2、CD27、CD18、ICOS、4-1BB、GITR、CD40、BAFFR、HVEM、SLAMF7、NKp80、CD160、BCMA、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Ra、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CDl ld、ITGAE、CD103、ITGAL、CDl la、ITGAM、CDl lb、ITGAX、CDl lc、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1、SLAMF4、CD84、CD96、HLA-E、LSECtin、PDL1、PDL2、CEACAM1、Fas、MHCII类分子、CRT AM、Ly9、CD160、PSGL1、CDIOO、SLAMF6、SLAMF1、SLAMF8、CD162、LTBR、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、NKG2D和NKG2C。
根据权利要求1-9任一项所述的免疫抑制分子，其中所述共刺激结构域选自以下蛋白质的胞内区：LTB、CD94、TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR7、TLR8、TLR9、TLR10、CARD11、CD2、CD7、CD8、CD18、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54、CD83、CD134、4-1BB、CD270、CD272、B7-H3、ICOS、CD357、DAP10、DAP12、LAT、NKG2C、SLP76、PD1、LIGHT、TRIM、ZAP70及其任意组合。
根据权利要求1-10任一项所述的免疫抑制分子，其中所述初级信号传导结构域选自以下蛋白的胞内区：FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ、CD5、CD22、CD79a、CD79b、NFAM1、STAM1、STAM2和CD66d。
权利要求1-11任一项所述的免疫抑制分子，其还包含信号肽。
权利要求1-12任一项所述的免疫抑制分子，其在免疫抑制蛋白结合结构域和跨膜结构域之间还包含源自以下蛋白的铰链区：CD8α、CD28、FcγRIIIα受体、IgG4或IgG1。
一种核酸分子，其编码权利要求1-13任一项所述的免疫抑制分子。
一种载体，其包含权利要求14所述的核酸分子。
一种工程化细胞，其表达权利要求1-13任一项所述的免疫抑制分子，或权利要求14所述的核酸分子，或权利要求15所述的载体。
根据权利要求16所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞还表达特异性识别抗原的功能性外源受体。
根据权利要求17所述的工程化细胞，其中所述功能性外源受体选自嵌合抗原受体、T细胞受体、T细胞受体融合蛋白、T细胞抗原耦合器和免疫动员单克隆T细胞受体，优选嵌合抗原受体或T细胞受体。
根据权利要求18所述的工程化细胞，其中所述功能性外源受体特异性识别的抗原选自：ALK、ADRB3、AKAP-4、APRIL、ASGPR1、BCMA、B7H3、B7H4、B7H6、bcr-abl、BORIS、BST2、BAFF-R、BTLA、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD19、CD20、CD22、CD24、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD70、CD72、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD86、CD97、CD123、CD133、CD137、CD 138、CD151、CD171、CD179a、CD300LF、CDH16、CSPG4、CS1、Claudin 6、Claudin18.1、Claudin 18.2、CEA、CEACAM6、CLL1、c-Met、CAIX、CXORF61、CA125、CYP1B1、CS1、ELF2M、EGFR、EPCAM、EGFRvIII、EphA2、ERG/TMPRSS2ETS融合基因、ETV6-AML、EMR2、EGP2，EGP40、FAP、FAR、FBP、FLT3、FOSL1、FCRL5、FCAR、Flt3、Flt4、Frizzled、GD2、GD3、gp100、gp130、GM3、GPC2、GPC3、GPRC5D、GPR20、GloboH、GHRHR、GHR、GITR、Her2、HER3、HER-4、HMWMAA、HAVCR1、HPV E6,E7、HVEM、HIV-1Gag、HLA-A1、HLA-A2、IL6R、IL-11Ra、IL-13Ra、IGF-I受体、LTPR、LIFRP、LRP5、IGLL1、IGF1R、KIT、Kappa Light Chain、KDR、LewisY、LMP2、LY6K、LAGE-1a、legumain、LCK、LAIR1、LILRA2、LY75、MSLN、MUC1、MUC16、MAGE-A1、MAGE3、MAD-CT-1、MelanA/MART1、ML-IAP、MYCN、mut hsp70-2、NCAM、NY-BR-1、NY-ESO-1、NA17、Notch-1-4、nAchR、NKG2D、NKG2D配体、OY-TES1、OR51E2、OX40、PRSS21、PSCA、PD1、PD-L1、PD-L2、PSMA、Prostase、PAP、PDGFR-β、PCTA-1/半乳凝集素8、p53、p53突变体、prostein、PLAC1、PANX3、PAX3、PAX5、PTCH1、RANK、RAGE-1、ROR1、Ras突变体、RhoC、RU1、RU2、Robol、SSEA-4、SSX2、SART3、Sp17、TSHR、Tn Ag、TGS5、TEM1/CD248、TEM7R、TARP、TCRα、TCRβ、TGFBR1、TGFBR2、TNFRSF4、TWEAK-R、TLR7、TLR9、TAG72、TROP-2、Tie 2、TRP-2、TNFR1、TNFR2、TEM1、UPK2VEGFR、WT1、XAGE1、5T4、8H9、αvβ6整合素、CA9、叶酸受体α、肝配蛋白B2、酪氨酸酶、岩藻糖基GM1、邻-乙酰-GD2、叶酸受体β、多聚唾液酸、精子蛋白17、存活蛋白和端粒酶、肉瘤易位断点、人端粒末端逆转录酶/hTERT、雄激素受体、肠羧基酯酶、细胞周期蛋白B1、纤连蛋白、腱生蛋白、肿瘤坏死区的癌胚变体及其任意组合。
根据权利要求16-19任一项所述的工程化细胞，其中所述工程化细胞中，内源性HLA-I类基因、HLA-II类基因、TCR/CD3基因中的一种或多种基因的表达被抑制或沉默。
根据权利要求20所述的工程化细胞，其中所述HLA-I类基因选自HLA-A、HLA-B、HLA-C、B2M及其任意组合；所述HLA-II类基因选自HLA-DPA、HLA-DQ、HLA-DRA、TAP1、TAP2、LMP2、LMP7、RFX5、 RFXAP、RFXANK、CIITA及其任意组合；所述TCR/CD3基因选自TRAC、TRBC、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD3ζ及其任意组合。
根据权利要求16-21任一项所述的工程化细胞，其中选自以下的一个或多个内源性基因的表达被抑制或沉默：CD52、GR、dCK、PD1、LAG3、TIM3、CTLA4、PPP2CA、PPP2CB、PTPN6、PTPN22、PDCD1、HAVCR2、BTLA、CD160、TIGIT、CD96、CRTAM、TNFRSF10B、TNFRSF10A、CASP8、CASP10、CASP3、CASP6、CASP7、FADD、FAS、TGFBRII、TGFRBRI、SMAD2、SMAD3、SMAD4、SMAD10、SKI、SKIL、TGIF1、IL10RA、IL10RB、HMOX2、IL6R、IL6ST、EIF2AK4、CSK、PAG1、SIT、FOXP3、PRDM1、BATF、GUCY1A2、GUCY1A3、GUCY1B2和GUCY1B3。
根据权利要求16-22任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞是免疫细胞，所述细胞选自B细胞、T细胞、巨噬细胞、树突状细胞、单核细胞、NK细胞和NKT细胞。
根据权利要求23所述的工程化细胞，其中所述细胞选自CD4+CD8+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4-CD8-T细胞、肿瘤浸润细胞、记忆T细胞、幼稚T细胞、γδ-T细胞和αβ-T细胞。
根据权利要求16-22任一项所述的工程化细胞，其中所述细胞是干细胞，所述干细胞选自胚胎干细胞、脐带血干细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、间充质干细胞和诱导多能干细胞。
一种降低受试者细胞对外源细胞的免疫排斥的方法，其特征在于，在所述外源细胞中表达权利要求1-13任一项所述的免疫抑制分子、权利要求14所述的核酸分子或权利要求15所述的载体。
一种降低受试者细胞对外源细胞的免疫排斥的方法，其特征在于，向所述受试者施用1-13任一项所述的免疫抑制分子或权利要求16-25任一项所述的工程化细胞。
一种药物组合物，其包含权利要求1-13任一项所述的免疫抑制分子、权利要求14所述的核酸分子、权利要求15所述的载体或权利要求16-25任一项所述的工程化细胞，和一种或多种药学上可接受的赋型剂。
权利要求16-25任一项所述的工程化细胞或权利要求28所述的药物组合物在制备预防或治疗癌症、感染或自身免疫性疾病药物中的用途。