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CN121127273A - α-突触核蛋白结合剂及其使用方法 - Google Patents

α-突触核蛋白结合剂及其使用方法

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CN121127273A
CN121127273A CN202480030819.4A CN202480030819A CN121127273A CN 121127273 A CN121127273 A CN 121127273A CN 202480030819 A CN202480030819 A CN 202480030819A CN 121127273 A CN121127273 A CN 121127273A
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mmol
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compound
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CN202480030819.4A
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I·贝纳西夫
M·V·法瓦兹
E·D·霍斯特勒
H·米切尔
A·J·洛克
A·W·肖
C·A·斯图普
童凌
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Merck Sharp and Dohme BV
Original Assignee
Merck Sharp and Dohme BV
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Abstract

本发明涉及式I的化合物或其药学上可接受的盐，其可适用于成像α‑突触核蛋白病理，并因此可用于在帕金森病患者中结合并成像α‑突触核蛋白聚集体。更具体地，本发明涉及在正电子发射断层扫描（PET）成像中使用本发明化合物作为示踪剂以体内研究脑中α‑突触核蛋白，从而诊断帕金森病和以α‑突触核蛋白病理为特征的其他神经退行性疾病的方法。本发明还涉及测量用于帕金森病和以α‑突触核蛋白病理为特征的其他神经退行性疾病的治疗剂的临床疗效的方法。

Description

α-突触核蛋白结合剂及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2023年3月6日提交的美国临时申请第63/488,652号的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。
背景技术
如阿尔茨海默病、帕金森病（PD）、亨廷顿病、肌萎缩侧索硬化症和朊病毒病的神经退行性疾病是影响认知和/或肌肉控制的致衰弱性疾病。这些疾病是蛋白质错误折叠疾病的一个子集。蛋白质折叠是所有生物体中蛋白质功能的基本过程，并且破坏蛋白质折叠的条件对细胞存活性构成威胁。在某些情况下，疾病的发生是因为特定的蛋白质在采取错误折叠状态时不再具有功能。在其他疾病中，病理状态的发生是因为错误折叠伴随聚集，并且潜在的聚集是有害的。尽管如阿尔茨海默病和帕金森病的神经退行性疾病是由不同的蛋白质引起的，但两者都涉及称为淀粉样蛋白的不溶性纤维状蛋白质沉积物的累积。例如，已知统称为“突触核蛋白病”（synucleinopathy）的帕金森病（PD）、路易体痴呆（DLB）和多系统萎缩（MSA)与脑中神经元中α-突触核蛋白的聚集形式的累积有关（见Nat. Rev. Neuro.2013,9, 13-24 和J. Parkinson’s Disease2013, 3, 565-567）。多巴胺能神经元变性是帕金森病的主要病理改变，发生在黑质以及路易小体（LB）和路易神经突（LN）中。迄今为止，帕金森病的发病机制尚未被完全阐明。
α-突触核蛋白是一种突触前末端蛋白，由140个氨基酸组成，在中枢神经系统中起重要作用，包括突触小泡的循环再利用和合成、囊泡储存和神经递质释放。在习得相关突触重排（acquisition related synaptic rearrangement）过程中，其在脑的突触前末端的离散群体中被特异性上调。α-突触核蛋白天然状态下以高度可溶的未折叠形式存在。有证据表明，在突触核蛋白病中，α-突触核蛋白的丝状聚集体在突触前膜处累积并引发突触功能障碍和神经元细胞死亡，并且可能是造成帕金森病和DLB的原因。通过抗体免疫组织学研究，α-突触核蛋白聚集体被鉴定为路易小体的主要成分，其为退化性神经细胞中的微观蛋白质沉积。错误折叠的纤维状α-突触核蛋白在路易小体（LB）和路易神经突（LN）中的积聚被认为是PD的标志。
PD的诊断主要基于临床症状，如静止性震颤、运动迟缓和强直，但这些方法有其局限性（见J. Neurology2019,266, 1927-1936）。目前理想的对PD的治疗是减缓疾病的进展并使患者的疾病症状最小化。因此，在极早期诊断PD的方法可以极大地帮助医生制定相应的治疗方案，并减缓疾病的进展。仍然需要改进的诊断方法，以鉴别错误折叠的蛋白质（包括α-突触核蛋白）的聚集，用于受试者中PD的早期检测和持续监测（见J. Parkinson’s Disease2013,3, 565-567）。
α-突触核蛋白正电子发射断层扫描（PET）示踪剂将是一种有价值的非侵入性诊断生物标志物，用于对人脑中作为帕金森病的生物标志物的聚集的病理性α-突触核蛋白进行时空定量。此外，α-突触核蛋白PET示踪剂可用于帕金森病临床试验的患者筛选。在这种模式中，α-突触核蛋白示踪剂可被开发为治疗剂的配准（co-registration of atherapeutic agent）的伴随诊断工具。此外，α-突触核蛋白PET示踪剂可作为量化疾病改善型帕金森病疗法中α-突触核蛋白形成的稳定化或减少的关键疾病相关工具。
因此，对允许体内成像α-突触核蛋白病理从而提供对人脑中α-突触核蛋白聚集体的沉积的洞察的神经影像放射性示踪剂存在需求。成功的神经影像放射性示踪剂必须穿过血脑屏障；从组织和血浆快速清除；并且由于在许多PD患者群体中的共表达而对α-突触核蛋白聚集体具有高亲和力和特异性，相比于与β-淀粉样蛋白和tau聚集蛋白的结合具有高选择性。（见Biol Psychiatry2015,78, 672-683和J Neuropath Exper Neurol2003,62,389-397）。尽管已经报道了α突触核蛋白结合配体对聚集的β-淀粉样蛋白具有降低的选择性（WO 2019/121661），但是仍然存在对相比于在PD中共表达的聚集蛋白具有高选择性的化合物的需求，以便在PD患者的体内成像研究中量化α突触核蛋白特异性信号。
本发明通过提供式I的化合物作为聚集的α-突触核蛋白的结合配体而促进了该领域的发展，其相比于与聚集的β-淀粉样蛋白病理的结合具有高选择性。本发明还涉及在PET成像中使用式I的化合物作为示踪剂以体内研究脑中α-突触核蛋白沉积从而允许诊断以α-突触核蛋白病理为特征的神经变性疾病的方法。本发明还涉及用于测量靶向α-突触核蛋白病理的治疗剂的临床疗效的方法。
发明内容
本发明涉及式I的化合物，其药学上可接受的盐，包含它们的药物组合物，这些化合物的诊断和治疗用途以及制备这些化合物的方法。本发明的一个实施方案提供了式I的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
--------可不存在或可代表键；
R独立地选自H或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
Ra独立地选自H、-C1-6烷基、-(CH2)pOR、-(CH2)p卤代或-(CH2)pO(CH2)p卤代；
Rb独立地选自H、-C1-6烷基、杂环基、杂芳基、-(CH2)sOR、-CN、-(CH2)t卤代、-(CH2)sNR2或-O(CH2)p卤代；
Rc独立地选自H、卤素、OR或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
R1选自-(CH2)sOR、-(CH2)sNR2、-(CH2)s[O(Rc 2)p]x-Rc或-(CH2)s卤代；
R2独立地选自H、OR、CN、卤素或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
R3独立地选自-C1-6烷基、杂芳基或杂环基，其中所述烷基、杂芳基或杂环基任选地被选自ORa或Rb的一至三个基团取代；
环A1选自吡啶基、咪唑并嘧啶基、三嗪基、嘧啶基、咪唑并吡啶基、吡嗪基或哒嗪基；
环A2选自嘧啶基、吡啶基、吡嗪基或苯基，其中所述嘧啶基、吡啶基、吡嗪基或苯基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
环A3选自吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯并吡嗪基、三嗪基、吲哚基、咪唑基、噁二唑基、三唑基、噻唑基、异噁唑基、噁唑基、3,4-二氢-2H-吡啶并[3,2,b][1,4]噁嗪或苯基；
m选自0、1或2；
n选自1、2或3；
p独立地选自1、2或3；
r选自1、2或3；
s独立地选自0、1、2、3、4、5或6；
t独立地选自0、1、2、3、4、5或6；以及
x独立地选自1、2、3、4、5或6。
本发明还涉及同位素标记的式I的化合物。另外，本发明提供包含式I的化合物和至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。
本发明涉及式I的化合物，其可用于结合α-突触核蛋白聚集蛋白和/或tau聚集蛋白，并因此可用于通过本领域通常已知的PET成像技术（见J. Nucl. Med.2019,60, 93-99and 107-114）结合和成像PD和非PD突触核蛋白病患者的α-突触核蛋白聚集蛋白病理以及阿尔茨海默病（AD）和非AD tau病患者的聚集Tau蛋白病理。本发明还涉及使用式I的化合物鉴定在脑中具有异常水平的聚集的α-突触核蛋白病理的患者的方法。本发明还涉及在可改善帕金森病进展的潜在治疗剂的临床评估中，使用式I的化合物测量作为生物标志物的α-突触核蛋白病理随时间的进展的方法。
本发明的化合物还可用于成像和检测以α-突触核蛋白聚集体的沉积为特征的其他神经退行性疾病，例如多系统萎缩（MSA）和路易体痴呆（DLB）。
附图说明
图1：[3H]-105在富含聚集的β-淀粉样蛋白的AD组织匀浆中的饱和结合实验。
图2：[3H]-2与PD脑杏仁核切片的α-突触核蛋白病理的特异性结合。
图3：恒河猴脑中[11C]-2的PET影像的冠状切片（注射后30-90分钟内取平均值，与MRI融合）。
具体实施方案
本发明提供了新颖化合物、制备这些化合物的合成方法、包含它们的药物组合物、同位素标记的化合物以及使用这些化合物作为显像剂的方法。
在一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
--------可不存在或可代表键；
R独立地选自H或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
Ra独立地选自H、-C1-6烷基、-(CH2)pOR、-(CH2)p卤代或-O(CH2)p卤代；
Rb独立地选自H、-C1-6烷基、杂环基、杂芳基、-(CH2)pOR、-CN、-(CH2)t卤代、-(CH2)sNR2或-O(CH2)p卤代；
Rc独立地选自H、卤素、OR或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
R1选自-(CH2)sOR、-(CH2)sNR2、-(CH2)s[O(Rc 2)p]x-Rc或-(CH2)s卤代；
R2独立地选自H、OR、CN、卤素或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
R3独立地选自-C1-6烷基、杂芳基或杂环基，其中所述烷基、杂芳基或杂环基任选地被选自ORa或Rb的一至三个基团取代；
环A1选自吡啶基、咪唑并嘧啶基、三嗪基、嘧啶基、咪唑并吡啶基、吡嗪基或哒嗪基；
环A2选自嘧啶基、吡啶基、吡嗪基或苯基，其中所述嘧啶基、吡啶基、吡嗪基或苯基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
环A3选自吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯并吡嗪基、三嗪基、吲哚基、咪唑基、噁二唑基、三唑基、噻唑基、异噁唑基、噁唑基、3,4-二氢-2H-吡啶并[3,2,b][1,4]噁嗪或苯基；
m选自0、1或2；
n选自1、2或3；
p独立地选自1、2或3；
r选自1、2或3；
s独立地选自0、1、2、3、4、5或6；
t独立地选自0、1、2、3、4、5或6；以及
x独立地选自1、2、3、4、5或6。
在进一步实施方案中，本发明提供了式IA的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
--------可不存在或可代表键；
R独立地选自H或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
Ra独立地选自H、-C1-6烷基、-(CH2)pOR、-(CH2)p卤代或-(CH2)pO(CH2)p卤代；
Rb独立地选自H、-C1-6烷基、杂环基、杂芳基、-(CH2)pOR、-CN、-(CH2)t卤代、-(CH2)sNR2或-O (CH2)p卤代；
Rc独立地选自H、卤素、OR或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
R1选自-(CH2)sOR、-(CH2)sNR2、-(CH2)s[O(Rc 2)p]x-Rc或-(CH2)s卤代；
R2独立地选自H、OR、CN、卤素或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
R3独立地选自-C1-6烷基、杂芳基或杂环基，其中所述烷基、杂芳基或杂环基任选地被选自ORa或Rb的一至三个基团取代；
X1是N或CH；
X2是N或CH；
环A1选自吡啶基、咪唑并嘧啶基、三嗪基、嘧啶基、咪唑并吡啶基、吡嗪基或哒嗪基；
环A3选自吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯并吡嗪基、三嗪基、吲哚基、咪唑基、噁二唑基、三唑基、噻唑基、异噁唑基、噁唑基、3,4-二氢-2H-吡啶并[3,2,b][1,4]噁嗪或苯基；
m选自0、1或2；
n选自1、2或3；
p独立地选自1、2或3；
r选自1、2或3；
s独立地选自0、1、2、3、4、5或6；
t独立地选自0、1、2、3、4、5或6；以及
x独立地选自1、2、3、4、5或6。
在进一步实施方案中，本发明涉及式IB的化合物：
或其药学上可接受的盐，其中：
--------可不存在或可代表键；
R独立地选自H或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
Ra独立地选自H、-C1-6烷基、-(CH2)pOR、-(CH2)p卤代、卤素或-(CH2)pO(CH2)p卤代；
Rb独立地选自H、-C1-6烷基、杂环基、杂芳基、-(CH2)pOR、-CN、-(CH2)t卤代、-(CH2)sNR2或-O(CH2)p卤代；
Rc独立地选自H、卤素、OR或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
R1b选自-[O(Rc 2)p]x-Rc、OR、NR2或卤素；
R2独立地选自H、OR、CN、卤素或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
R3独立地选自-C1-6烷基、咪唑基、吗啉基、三唑基、噁唑基、三嗪基、吡唑基、噻唑基、吡嗪基、异噁唑基、氮杂环丁基、吡咯烷基、四氢三唑并吡嗪基、哌啶基或嘧啶基，其中所述烷基、咪唑基、吗啉基、三唑基、噁唑基、三嗪基、吡唑基、噻唑基、吡嗪基、异噁唑基、氮杂环丁基、吡咯烷基、四氢三唑并吡嗪基、哌啶基或嘧啶基任选地被选自ORa或Rb的一至三个基团取代；
环A1选自吡啶基、咪唑并嘧啶基、三嗪基、嘧啶基、咪唑并吡啶基、吡嗪基或哒嗪基；
环A3选自吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯并吡嗪基、三嗪基、吲哚基、咪唑基、噁二唑基、三唑基、噻唑基、异噁唑基、噁唑基、3,4-二氢-2H-吡啶并[3,2,b][1,4]噁嗪或苯基；
m选自0、1或2；
n选自1、2或3；
p独立地选自1、2或3；
s独立地选自0、1、2、3或4；
t独立地选自0、1、2、3、4、5或6；以及
x独立地选自1、2、3、4、5或6。
在另一实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其具有式IC的结构：
或其药学上可接受的盐，其中：
--------可不存在或可代表键；
R独立地选自H或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
Ra独立地选自H、-C1-6烷基、-(CH2)pOR、-(CH2)p卤代、或-(CH2)pO(CH2)p卤代；
Rb独立地选自H、-C1-6烷基、杂环基、杂芳基、-(CH2)pOR、-CN、-(CH2)t卤代、-(CH2)sNR2或-O(CH2)p卤代；
Rc独立地选自H、卤素、OR或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
R1b选自-[O(Rc 2)p]x-Rc、OR、NR2或卤素；
R2独立地选自H、OR、CN、卤素或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
R3独立地选自-C1-6烷基、咪唑基、吗啉基、三唑基、噁唑基、三嗪基、吡唑基、噻唑基、吡嗪基、异噁唑基、氮杂环丁基、吡咯烷基、四氢三唑并吡嗪基、哌啶基或嘧啶基，其中所述烷基、咪唑基、吗啉基、三唑基、噁唑基、三嗪基、吡唑基、噻唑基、吡嗪基、异噁唑基、氮杂环丁基、吡咯烷基、四氢三唑并吡嗪基、哌啶基或嘧啶基任选地被选自ORa或Rb的一至三个基团取代；
环A1选自吡啶基、咪唑并嘧啶基、三嗪基、嘧啶基、咪唑并吡啶基、吡嗪基或哒嗪基；
环A3选自吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯并吡嗪基、三嗪基、吲哚基、咪唑基、噁二唑基、三唑基、噻唑基、异噁唑基、噁唑基、3,4-二氢-2H-吡啶并[3,2,b][1,4]噁嗪或苯基；
m选自0、1或2；
n选自1、2或3；
p独立地选自1、2或3；
s独立地选自0、1、2、3或4；
t独立地选自0、1、2、3、4、5或6；以及
x独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在另一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其具有式ID的结构：
或其药学上可接受的盐，其中：
--------可不存在或可代表键；
R独立地选自H或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
Ra独立地选自H、-C1-6烷基、-(CH2)pOR、-(CH2)p卤代、或-(CH2)pO(CH2)p卤代；
Rb独立地选自H、-C1-6烷基、-(CH2)pOR、-CN、-(CH2)t卤代、-(CH2)sNR2或-O(CH2)p卤代；
Rc独立地选自H、卤素、OR或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
R1b选自-[O(Rc 2)p]x-Rc、OR、NR2或卤素；
R2独立地选自H、OR、卤素或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
R3独立地选自-C1-6烷基、咪唑基、吗啉基、三唑基、噁唑基、三嗪基、吡唑基、噻唑基、吡嗪基、异噁唑基、氮杂环丁基、吡咯烷基、四氢三唑并吡嗪基、哌啶基或嘧啶基，其中所述烷基、咪唑基、吗啉基、三唑基、噁唑基、三嗪基、吡唑基、噻唑基、吡嗪基、异噁唑基、氮杂环丁基、吡咯烷基、四氢三唑并吡嗪基、哌啶基或嘧啶基任选地被选自ORa或Rb的一至三个基团取代；
环A1选自吡啶基、咪唑并嘧啶基、三嗪基、嘧啶基、咪唑并吡啶基、吡嗪基或哒嗪基；
环A3选自吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯并吡嗪基、三嗪基、吲哚基、咪唑基、噁二唑基、三唑基、噻唑基、异噁唑基、噁唑基、3,4-二氢-2H-吡啶并[3,2,b][1,4]噁嗪或苯基；
m选自0、1或2；
n选自1、2或3；
p独立地选自1、2或3；
s独立地选自0、1、2、3或4；
t独立地选自0、1、2、3、4、5或6；以及
x独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在另一个实施方案中，本发明涉及式I的化合物，其具有式IE的结构：
或其药学上可接受的盐，其中：
--------可不存在或可代表键；
R独立地选自H或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
Ra独立地选自H、-C1-6烷基、-(CH2)pOR、-(CH2)p卤代、或-(CH2)pO (CH2)p卤代；
Rb独立地选自H、-C1-6烷基、-(CH2)pOR、-CN、-(CH2)t卤代、-(CH2)sNR2或-O(CH2)p卤代；
Rc独立地选自H、卤素、OR或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
R1b选自-[O(Rc 2)p]x-Rc、OR、NR2或卤素；
R2独立地选自H、OR、卤素或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
R3独立地选自-C1-6烷基、咪唑基、吗啉基、三唑基、噁唑基、三嗪基、吡唑基、噻唑基、吡嗪基、异噁唑基、氮杂环丁基、吡咯烷基、四氢三唑并吡嗪基、哌啶基或嘧啶基，其中所述烷基、咪唑基、吗啉基、三唑基、噁唑基、三嗪基、吡唑基、噻唑基、吡嗪基、异噁唑基、氮杂环丁基、吡咯烷基、四氢三唑并吡嗪基、哌啶基或嘧啶基任选地被选自ORa或Rb的一至三个基团取代；
环A1选自吡啶基、咪唑并嘧啶基、三嗪基、嘧啶基、咪唑并吡啶基、吡嗪基或哒嗪基；
环A3选自吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯并吡嗪基、三嗪基、吲哚基、咪唑基、噁二唑基、三唑基、噻唑基、异噁唑基、噁唑基、3,4-二氢-2H-吡啶并[3,2,b][1,4]噁嗪或苯基；
m选自0、1或2；
n选自1、2或3；
p独立地选自1、2或3；
s独立地选自0、1、2、3或4；
t独立地选自0、1、2、3、4、5或6；以及
x独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
在一个实施方案中，本发明涉及式IF的化合物：
或其药学上可接受的盐，并且全部取代基和变量如上文在式I中定义的。
在一个实施方案中，本发明涉及式IG的化合物：
或其药学上可接受的盐，并且全部取代基和变量如上文在式I中定义的。
在进一步的实施方案中，本发明涉及式I的化合物或其药学上可接受的盐，其中：
环A1选自嘧啶基或吡啶基；
环A3选自吡啶基、吡嗪基、嘧啶基或三嗪基；
m选自0或1；
n选自1或2；
并且所有其他取代基和变量如上文在式I中定义的。
在一个实施方案中，本发明提供式I、IA、IB、IC、ID、IE、IF或IG的化合物，其中环A1选自吡啶基、三嗪基或嘧啶基。在另一个实施方案中，环A1是吡啶基或嘧啶基。在另一个实施方案中，环A1是吡啶基。在另一个实施方案中，环A1是三嗪基。在另一个实施方案中，环A1是嘧啶基。
在一个实施方案中，本发明提供式I、IF或IG的化合物，其中环A2为嘧啶基。在另一个实施方案中，环A2为苯基。在另一个实施方案中，环A2为吡啶基。
在一个实施方案中，本发明提供式I、IA、IB、IC、ID、IE、IF或IG的化合物，其中环A3选自吡啶基、嘧啶基、吡嗪基或三嗪基。在另一个实施方案中，环A3选自吡啶基或嘧啶基。在另一个实施方案中，环A3为吡啶基。在另一个实施方案中，环A3为嘧啶基。在另一个实施方案中，环A3为三嗪基。
在一个实施方案中，本发明提供式I、IA、IF或IG的化合物，其中R1为-(CH2)sOR。在一个实施方案中，本发明提供式I、IA、IF或IG的化合物，其中R1为-(CH2)s[O(Rc 2)p]x-Rc。
在一个实施方案中，本发明提供式I、IA、IB、IC、ID、IE、IF或IG的化合物，其中R3独立地选自-C1-6烷基、咪唑基、吗啉基、三唑基、噁唑基、三嗪基、吡唑基或异噁唑基，其中所述烷基、咪唑基、吗啉基、三唑基、噁唑基、三嗪基、吡唑基或异噁唑基任选地被选自ORa或Rb的一至三个基团取代。在另一个实施方案中，R3独立地选自-C1-6烷基、三嗪基或咪唑基，其中所述烷基、三嗪基和咪唑基任选地被选自ORa或Rb的一至三个基团取代。在进一步的实施方案中，R3独立地选自-C1-6烷基或咪唑基，其中所述烷基、吡唑基或咪唑基任选地被选自ORa或Rb的一至三个基团取代。在进一步的实施方案中，R3独立地选自吡唑基或咪唑基，其中所述吡唑基或咪唑基任选地被选自ORa或Rb的一至三个基团取代。在进一步的实施方案中，R3是吡唑基，其中所述吡唑基任选地被选自ORa或Rb的一至三个基团取代。在进一步的实施方案中，R3是咪唑基，其中所述咪唑基任选地被选自ORa或Rb的一至三个基团取代。
本发明的代表性化合物包括选自以下的化合物：
或其药学上可接受的盐。
本发明涉及用作显像剂的式I的化合物。
本发明的一个实施方案包括选自实施例编号1、2、3、4、12、13、17、29、31、32、34、38、43、44、46、48、49、51或52的化合物或其药学上可接受的盐。本发明的一个实施方案包括选自实施例编号1、2、3、4、12、13、17、29、31、32或34的化合物或其药学上可接受的盐。本发明的一个进一步实施方案包括选自实施例编号38、43、44、46、48、49、51或52的化合物或其药学上可接受的盐。本发明的一个进一步实施方案包括选自实施例编号1、2、3、12、13、29或32的化合物或其药学上可接受的盐。本发明的一个进一步实施方案包括选自实施例编号1、2、3、12、13、29、32、38、44、46或52的化合物或其药学上可接受的盐。本发明的一个进一步实施方案包括选自实施例编号2、44或52的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明的另一方面涉及用同位素标记的式I化合物或其药学上可接受的盐，所述同位素选自2H、3H、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、18F、35S、36CL、82Br、76Br、77Br、123I、124I或131I。在本发明的另一方面，式I化合物用3H、11C或18F同位素标记。同位素标记的式I化合物或其药学上可接受的盐的实例包括但不限于3H-2、3H-29、11C-2、18F-3、18F-12、18F-13、18F-29、18F-38、18F-44、18F-46和18F-52等。
本发明的另一方面涉及式I化合物或其药学上可接受的盐，其被选自2H、3H、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、18F、35S、36CL、82Br、76Br、77Br、123I、124I或131I的同位素标记，用作显像剂。
应理解，除非另有说明，凡提及“式I”时，亦包括式I’、式IA、式IB、式IC、式ID、式IE、式IF和式IG的化合物。
本发明的化合物可以含有一个或多个不对称中心，因此可以外消旋体和外消旋混合物、单一对映体、非对映体混合物和单独的非对映体的形式存在。取决于分子中各种取代基的性质，可以存在另外的不对称中心。每个这样的不对称中心将独立地产生两种光学异构体，并旨在所有可能的光学异构体和非对映体以混合物形式和纯化或部分纯化的化合物形式包括在本发明的范围内。本发明旨在包括这些化合物的所有这样的异构体形式。同样，本发明包括本文公开的化合物的互变异构体形式。式I显示了这类化合物的结构，未限定特定立体化学。在本申请中提出的本发明化合物的至少一些化学名称可以通过使用市售的化学命名软件程序自动生成，且未经独立验证。
这些非对映体的独立合成或它们的色谱分离可以按本领域已知的方法，通过适当修改本文中公开的方法来实现。它们的绝对立体化学可以通过结晶产物或结晶中间体的X-射线晶体学确定，必要时可用含有已知绝对构型的不对称中心的试剂对该结晶产物或结晶中间体进行衍生化。绝对立体化学也可通过本领域已知的其他技术如低温电子显微术来阐明。相对立体化学可通过本领域已知的方法使用核磁共振来测定。根据一组异构体的相对生物活性，参照与类似立体化学确定的异构体组相同的趋势进行类比，可以对该组异构体的立体化学进行归属。如果需要，可将化合物的外消旋混合物分离从而分离出单个对映体。分离可通过本领域熟知的方法进行，例如将化合物的外消旋混合物与对映体纯的化合物偶联以形成非对映体混合物，然后通过标准方法，例如分级结晶或色谱法分离单个非对映体。偶联反应通常是使用对映异构体纯的酸或碱形成盐。然后通过切割添加的手性残基，非对映异构体衍生物可转化为纯的对映体。化合物的外消旋混合物也可使用手性固定相通过本领域公知的色谱方法直接分离。本发明的化合物也可以通过超临界流体色谱(SFC)或反相HPLC或硅胶色谱法分离。异构体根据它们离开柱的顺序命名（第一、第二等洗脱，或者用“A”和“B”或“1”和“2”表示第一、第二等洗脱异构体），根据从纯化系统洗脱的顺序将实施例命名为实施例#A和实施例#B等。本领域技术人员将理解，有时洗脱峰可包含多于一个的单个异构体，并且当被切成两半或分馏时，进一步导致一个峰的多个级分，并且可能不代表单个异构体。此外，一些分离需要通过相同的纯化方法和/或替代的纯化系统进行多轮纯化。另外，混合物可以是2至8种立体异构体的混合物。可替代地，化合物的任何对映体可以通过本领域公知的方法，使用已知构型的光学纯原料或试剂，通过立体选择性合成而获得。
在一个实施方案中，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的化合物，例如式I化合物，和至少一种药物赋形剂。
式I化合物是聚集的α-突触核蛋白或tau蛋白的抑制剂和/或结合剂。式I化合物及其同位素标记的变体可用于帕金森病和/或阿尔茨海默病的诊断和/或治疗。检测标记的方法是本领域技术人员公知的。例如，可使用成像技术、照相胶片或闪烁计数器来检测同位素标记。在优选的实施方案中，通过成像技术，例如正电子发射断层扫描（PET），在受试者脑中体内检测标记。
式(I)化合物也可以形成双功能化合物的组分，所述双功能化合物是结合聚集的α-突触核蛋白的靶向蛋白降解剂化合物。这样的靶向α-突触核蛋白的蛋白降解剂化合物含有由式(I)化合物形成的靶向蛋白结合部分和E3泛素连接酶结合部分。靶向α-突触核蛋白的蛋白降解剂化合物通常含有连接α-突触核蛋白蛋白结合部分和E3泛素连接酶结合部分的接头基团。靶向α-突触核蛋白的蛋白降解剂化合物中的E3泛素连接酶结合部分可以是，但不限于，E3连接酶von Hippel-Lindau蛋白的结合子、E3连接酶cereblon蛋白的结合子或MDM2蛋白的结合子。此类化合物可以药物组合物施用以治疗疾病病况，包括但不限于本文公开的病况。
在下面的描述中，采用了常规结构表示，并且包括对某些不对称碳中心的常规立体化学标记。
因此，本发明化合物的结构表示包括示于实施例化合物中的一些不对称碳中心的常规立体化学标记。因此，在这种情况下，实心黑色“楔形”键表示从重现介质的平面突出的键，“虚线楔形”键表示向下伸入重现介质的平面的键，并且连接到带有双键的碳上的“波状”线指示包括可能的顺式和反式取向。按照常规做法，普通实线表示所绘化学键的所有空间构型。因此，在未指定具体立体化学标记的情况下，该表示涵盖结构特征的所有立体化学和空间取向。
如本发明的实施例所示以及上文所述，使用常规“实心楔形”和“虚线楔形”键合表示来在结构上表示特定的不对称碳中心。在大多数情况下，尚未确定实施例化合物的绝对构型，但已通过类比使用相同或类似的反应条件和起始试剂制备并在相同色谱条件下分离的已知立体化学构型（通过X-射线晶体学确定）的具体实施例化合物来指定。因此，本文所示结构构型的具体指定意在表明所制备的化合物具有某种特定立体异构体过量，除非在所列数据中另行注明，否则本文提出的构型并非必然代表所述化合物立体化学结构的绝对确定。
需要说明的是，若获得异构体混合物，如果需要制备具有显著对映体过量百分比的单一立体异构体，可以通过使用常规方法分离混合物，例如通过色谱或结晶，或通过立体化学上均一的起始原料进行所述合成，或通过立体选择性合成。任选地，衍生化可以在分离立体异构体之前进行。立体异构体混合物的分离可以在式I化合物合成过程中的中间步骤进行，或者可以对最终外消旋产物进行分离。
当在本说明书中指出时，绝对立体化学是通过晶体产物或晶体中间体的X-射线晶体学确定，必要时，该晶体产物或晶体中间体是用含有已知构型的立体对称中心的试剂衍生的。除非已指明此类外消旋体、对映体或非对映体的特定异构体、盐、溶剂化物（包括水合物）或溶剂化盐，否则本发明包括所有此类异构体以及此类外消旋体、对映体、非对映体的盐、溶剂化物（包括水合物）或溶剂化盐，及其混合物。
在波形线终止于常规键的情况下（相对于在结构内连接两个原子），其指示与结构的键合点，例如：
表示仲丁基部分是通过亚甲基和以波形线终止的键来键合的。在取代基部分用字母表示时，连接号表示与所示底物的键合点，如：-CH2-C(O)-CH2Cl表示乙酰氯部分是通过该部分的亚甲基部分来键合的。
当式I化合物能够互变异构化时，所有单独的互变异构体及其混合物都包括在本发明的范围内。
除非在定义时另有说明，否则当任何变量（如R、R1、n、杂芳基、烷基等）在任何成分或式I中多次出现时，其在每次出现时的定义独立于在其他每次出现时的定义。本领域普通技术人员将认识到，对结构表示中所定义的各种取代基（即R1、R2等）的组合的选择应符合众所周知的化学结构连接性和稳定性原则，且取代基和/或变量的组合只有在产生稳定的化合物时才是允许的。
“稳定的”化合物是指可进行制备和分离的化合物，其结构和性质在足够长的时间内保持或可基本保持不变，从而可将该化合物用于本说明书所述的目的（例如，向受试者治疗性给药）。本发明的化合物限于式I所包含的稳定化合物。
如果任何变量或部分以范围的形式表示，如(-CH2-)1-4，则既包括规定范围的极值（即本例中的1和4)，也包括介于两者之间的所有整数值（即本例中的2和3）。
应理解，除非另行指出，“式I”还包括式IA、式IB和式IC的化合物。
如本说明书中使用的，“烷基”旨在包括具有特定碳原子数的支链和直链饱和脂肪族烃基。
如本说明书中使用的，“卤素”或“卤代”指氟、氯、溴和碘。
如本说明书中使用的，“环烷基”旨在涵盖具有特定碳原子数的环状饱和脂肪烃基。优选地，环烷基为C3-C10环烷基。该等环烷基基团的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基和环庚基。
如本说明书中使用的，“芳基”意指每个环至多7元的任何稳定的单环或双环碳环，其中至少一个环是芳香族的。此等芳基基团的实例包括苯基、萘基、四氢萘、茚满基、联苯基、菲基、蒽基或苊基。在本发明的一个实施方案中，芳基是苯基或萘基。在进一步的实施方案中，芳基是苯基。
如本说明中使用的，术语杂环基、杂环或杂环的代表稳定的5-至7-元单环或稳定的8-至11-元二环杂环，该杂环是饱和的或不饱和的，由碳原子和一至四个选自N、O和S的杂原子组成，并且包括任何上述定义的杂环与苯环稠合的任何二环基。杂环可以连接在产生稳定结构的任何杂原子或碳原子上。当两个环稠合在一起时，术语杂环基、杂环或杂环的可包括杂芳基部分。杂环基团的实例包括但不限于氮杂二环[2.2.1]庚基、氮杂环庚基、氮杂环丁基、苯并二恶茂基、色满基、二氢苯并呋喃基、二氢苯并噻吩基、二氢苯并噻喃基、二氢苯并噻喃基砜、二氢吡咯并[1,2-b]吡唑基、1,3-二氧杂环戊基、咪唑烷基、吲哚啉基、异色满基、异吲哚啉基、吗啉基、氧杂-5-氮杂二环[2.2.1]庚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、哌啶基、哌嗪基、吡唑烷基、吡咯烷基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基和硫代吗啉基。
在一个实施方案中，杂环基选自氮杂双环[2.2.1]庚基、氮杂环庚基、氮杂环丁基、二氢吡咯并[1,2-b]吡唑基、吗啉基、氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚基、哌啶基、哌嗪基、吡唑烷基、吡咯烷基、吡咯基和四氢呋喃基。在另一个实施方案中，杂环基选自氮杂双环[2.2.1]庚基、氮杂环庚基、氮杂环丁基、二氢吡咯并[1,2-b]吡唑基、氧杂-5-氮杂双环[2.2.1]庚基、哌嗪基和吡咯烷基。
“杂芳基”系指每个环最多包含7元的任何稳定的单环或二环碳环，其中至少一个环是香族的，并且其中一到四个碳原子被选自N、O和S的杂原子取代。该等杂环基团的实例包括但不限于氮杂环庚三烯基、呋喃、呋喃基、咪唑基、吲哚啉基、吲哚基、异色满基、异吲哚啉基、异噁唑基、异喹啉基、异噻唑基、萘啶基、噁唑基、噁二唑基、吡啶基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、嘧啶基、5H-吡咯并[2,3-b]吡嗪基、吡咯基、喹唑啉基、喹啉基、四氢异喹啉基、四氢喹啉基、四唑基、噻唑基、噻吩并呋喃基、噻吩并噻吩基、噻吩基、三嗪基、三唑基等。在一个实施方案中，杂芳基选自呋喃基、咪唑基、吲哚基、异噁唑基、噁唑基、噁二唑基、吡啶基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、嘧啶基、5H-吡咯并[2,3-b]吡嗪基、四唑基、噻唑基、噻吩基、三嗪基、三唑基等。
对于医药用途，式I化合物的盐是药学上可接受的盐。然而，其他盐也可用于制备本发明化合物或其药学上可接受的盐。当本发明化合物为酸性时，合适的“药学上可接受的盐”是指由药学上可接受的无毒碱（包括无机碱和有机碱）制备的盐。由无机碱衍生的盐包括铝、铵、钙、铜、铁、亚铁、锂、镁、锰盐、亚锰、钾、钠、锌等。特别优选的是铵、钙、镁、钾和钠盐。由药学上可接受的有机无毒碱衍生的盐包括伯胺、仲胺、叔胺，取代胺（包括天然存在的取代胺），环状胺和碱性离子交换树脂的盐，例如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、N,N1-二苄基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、N-乙基吗啉、N-乙基哌啶、葡糖胺、氨基葡萄糖、组氨酸、海巴明(hydrabamine)、异丙胺、赖氨酸、甲基葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、多胺树脂、普鲁卡因、嘌呤、可可碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、氨丁三醇等的盐。当本发明的化合物为碱性时，其盐可由药学上可接受的无毒酸制备，包括无机酸和有机酸。这样的酸包括乙酸、苯磺酸、苯甲酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙磺酸、富马酸、葡糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘液酸、硝酸、帕莫酸、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对-甲苯磺酸等。特别优选的是柠檬酸、氢溴酸、盐酸、马来酸、磷酸、硫酸和酒石酸。
上述药学上可接受的盐及其他典型的药学上可接受的盐的制备更详细描述于Berg等人, “Pharmaceutical Salts,” J. Pharm. Sci., 1977:66:1-19中。
如果式I化合物分子中同时含有酸性和碱性基团，则除了上述盐形式外，本发明还包括两性离子。
本发明还包括同位素标记的本发明化合物，其结构与本文中描述的那些相同，但事实上该形式化合物中统计学显著百分比的一种或多种原子被具有不同于在自然界中通常发现的最丰富同位素的原子质量或质量数的原子质量或质量数的原子置换，因此改变了本发明化合物中存在的该同位素的天然丰度。本发明的另一方面涉及该同位素标记的化合物用作神经影像放射性示踪剂，用于在帕金森病（PD）的诊断、监测和/或治疗中对脑的α-突触核蛋白聚集体进行体内成像。本发明的另一个方面是同位素标记的化合物在PET中的应用，PET是PD的诊断、监测和/或治疗中的体内分析技术。3H、11C或18F标记的化合物可以在体外和体内方法中用于确定结合、受体占有和代谢研究，包括共价标记。
本发明的另一方面涉及同位素标记的化合物在筛选新的化学物质中的用途。特别地，各种同位素标记的化合物在磁共振成像、放射自显影和其他类似的分析工具中发现有用性。本发明意在包括式I化合物的所有适合的同位素变体。可优选并入本发明化合物中的同位素实例包括氢、碳、氮、氧、磷、碘、氟和氯的同位素，例如但不限于：2H、3H、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、18F、35S、36Cl、82Br、76Br、77Br、123I、124I、125I或131I同位素标记的取代的式I杂环衍生化合物。应理解，也可以通过已知的方法掺入其他同位素。特别地，本发明涉及11C、13C、14C、18F、15O、13N、35S、2H和3H同位素标记的式I化合物、组合物及其制备方法以及作为放射性示踪剂或PET示踪剂在诊断和测量化合物在PD治疗中的作用的用途。在进一步的实施方案中，本发明涉及被3H、11C或18F同位素标记的式I化合物，连同组合物和其制备方法以及作为PET示踪剂在诊断和测量化合物在PD治疗中的作用的用途。本发明还涉及无毒的α-突触核蛋白结合化合物，其可以快速穿过血脑屏障，具有低的非特异性结合性质，并可从系统中快速清除。本发明的这些和其他方面可在完整地阅读说明书后实施。
同位素富集的式I化合物可在无需过度实验的情况下，通过本领域技术人员熟知的常规技术或通过与本文的方案和实施例描述的类似的方法，使用适当的同位素富集试剂和/或中间体制备。
如本文所述，本发明包括本发明的同位素标记的化合物。“同位素标记的”、“放射性标记的”、“示踪剂”、“放射性示踪剂”、“标记示踪剂”或“放射性配体”化合物是指其中一个或多个原子被具有原子质量或质量数不同于自然界（即天然存在的）中通常发现的原子质量或质量数的另外的原子所替代或取代的化合物。可掺入本发明化合物中的合适放射性核素（即“可检测同位素”）包括但不限于2H、3H、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、18F、35S、36Cl、82Br、76Br、77Br、123I、124I和131I。本发明的同位素标记的化合物仅需要用可检测的同位素富集到允许用适合于特定应用的技术检测的程度或高于其的程度。掺入本发明放射性标记的化合物中的放射性核素取决于该放射性标记的化合物的特定应用。在本发明的另一个实施方案中，放射性核素由11C、13C、14C、18F、15O、13N、35S、2H和3H表示，优选11C、3H和18F。
本发明的同位素标记化合物通过将选定的同位素掺入到基质分子中来制备。这是通过使用试剂来实现的，所述试剂通过将它们放置在放射源例如核反应堆、回旋加速器等中而使其中所含的一个或多个原子具有放射性。另外，许多同位素标记的试剂，例如2H2O、3H3CI、14C6H5Br、ClCH2 14COCl等可商购获得。如下文描述的，同位素标记的试剂而后被用于标准有机化学合成技术中以将一个或多个同位素原子掺入到式I化合物中。以下方案示例如何制备式I化合物。
本发明进一步涉及药物组合物，其包含有效量的至少一种式I化合物和药学上可接受的载体。所述组合物可包含（但不限于）一种或多种缓冲剂、润湿剂、乳化剂、悬浮剂、润滑剂、吸附剂、表面活性剂、防腐剂等。组合物可配制为固体、液体、凝胶或混悬剂，用于口服给药（如灌剂、丸剂、片剂、粉剂、胶囊、口腔喷雾剂、乳剂）；非肠道给药（如皮下、肌肉内、静脉内、硬膜外注射）；局部应用（如乳膏、软膏、控释贴剂、喷雾剂）；阴道内、直肠内、透皮、眼部或鼻腔给药。在进一步的实施方案中，本发明的药物组合物可配制用于非肠道给药，如静脉内制剂。
本发明提供用作α-突触核蛋白显像剂的放射性标记的式I化合物，及制备其的合成前体化合物。式I化合物结合聚集的α-突触核蛋白以潜在地追踪年龄相关疾病（如PD）以及其他突触核蛋白病和神经退行性疾病（如多系统萎缩（MSA）、路易体痴呆（DLB）等）的进展。本发明化合物还可与广泛范围的认知缺陷增强剂组合使用。因此，在本发明的另一个实施方案中，将式(I)化合物或其药学上可接受的盐、或包含式(I)化合物的药物组合物或制剂与用于AD/PD治疗的另外一种或多种药学活性化合物（包括例如多奈哌齐、美金刚、他克林、卡维多巴、左旋多巴、MOA-B抑制剂、邻苯二酚O-甲基转移酶（COMT）抑制剂等）及其等同物及其药学活性的异构体和代谢物同时、同步、顺序或单独施用。
本发明的目的是提供一种放射性药剂，例如式I的同位素标记化合物，其可用于α-突触核蛋白成像，并且由于其对α-突触核蛋白聚集体的高亲和力而具有高比放射性（specific radioactivity）和高靶组织选择性。
根据本发明，一种对患者体内α-突触核蛋白聚集进行成像的方法，其中使用同位素标记的式I化合物作为显像剂，该方法包括以下步骤：a)使人类患者以仰卧姿势处于PET扫描仪中；b)静脉给予患者约0.1至约10 mCi的同位素标记的式I化合物；以及c)对患者头部的脑区域进行发射扫描以鉴定患者脑组织中α-突触核蛋白的聚集。对头部进行发射扫描的技术是本领域技术人员熟知的，PET技术描述于Freeman等人, Freeman and Johnson'sClinical Radionuclide Imaging, 3rd. Ed. Vol. 1 (1984); Grune&Stratton, NewYork; Ennis et Q. Vascular Radionuclide Imaging: A Clinical Atlas, JohnWiley&Sons, New York (1983)中。
术语“标记示踪剂”是指可用于在体内跟踪或检测定义的活性的任何分子，例如，优选的示踪剂是在可发现α-突触核蛋白聚集的区域内累积的示踪剂。优选地，标记示踪剂是能在活体实验动物、健康人类或患者（称为受试者）中观察到的，例如，通过正电子发射断层扫描（PET）扫描的那些。合适的标记包括，但不限于放射性同位素、荧光染料、化学发光化合物、染料和蛋白质，包括酶。
本发明还提供了测定酶或其他分子的体内活性的方法。在一个实施方案中，同位素标记的式I化合物用作示踪剂以追踪聚集的α-突触核蛋白在脑和中枢神经系统中的结合活性。
帕金森病疾病状态、预后和进展的生物标志物对于帕金森病的通用诊断应用以及帕金森病治疗剂的临床开发规划都是有用的。可以使用式I化合物在针对新有症状的和疾病改善型帕金森病治疗的临床试验中为患者提供生物标志物信息，并有助于患者筛选和队列分配。本发明可用作疾病状态的生物标志物之一，以使合适的患者进入适当的PhIIb试验队列。此外，本发明可用作作为纳入标准的疾病预后的一种标志物，以提高疾病在安慰剂治疗组中进展的概率，解决长期困扰帕金森病临床试验的难题。最后，本发明可用作疾病进展的一种生物标志物，以监测患者治疗的临床病程，并可为治疗性药物的治疗应答提供独立的生物标志物度量。可根据所选检测方法选择示踪剂。在实施本发明的方法之前，将诊断有效量的本发明的标记或未标记的化合物施用于活体，包括人。
本发明还提供一种测量用于治疗帕金森病（PD）的治疗剂的临床疗效的方法，该方法包括以下步骤：a)在用所述治疗剂治疗之前，将同位素标记的式I化合物施用于诊断为PD的患者，b)测量患者脑组织中α-突触核蛋白聚集体形成的量，c)在用所述治疗剂治疗之后，将同位素标记的式I化合物施用于患者，d)测量治疗之后患者脑组织中α-突触核蛋白聚集体形成的量，和e)分析所述治疗剂是否停止或减缓了患者脑组织中α-突触核蛋白聚集体形成的进展。
在实施本发明的体内方法之前，标记或未标记的本发明化合物的诊断有效量为每千克体重0.1 ng至100 mg，优选为每千克体重1 ng至10 mg。
本发明的化合物在诊断、监测和测量帕金森病和其他非PD突触核蛋白病如多系统萎缩（MSA）、路易体痴呆（DLB）等中具有效用。
在优选的实施方案中，本发明的化合物可用于诊断、监测或测量帕金森病、非PD突触核蛋白病、神经变性疾病、认知障碍、精神分裂症、疼痛障碍和睡眠障碍。
如本说明书中使用的，术语“组合物”意在包括以预定数量或比例包含特定成分的产品，以及由特定数量的特定成分组合而直接或间接产生的任何产品。就药物组合物而言，本术语意在包括含有一种或多种活性成分和任选载体（包括惰性成分）的产品，以及由任何两种或更多种成分的组合、络合或聚集，或由一种或多种成分的解离，或由一种或多种成分的其他类型的反应或相互作用而直接或间接产生的任何产品。
通常，通过使活性成分与液体载体或细分散固体载体或两者均匀和紧密结合，然后视需要将产物成形为所需制剂来制备药物组合物。在药物组合物中，活性化合物是式I化合物，其量足以对疾病的过程或病状产生所需效果。因此，本发明的药物组合物包括通过混合本发明化合物和药学上可接受的载体制备的任何组合物。
如本说明书中使用的，“患者”（或称“受试者”）是指需要通过影像研究评估的动物，优选哺乳动物，特别是人。如本说明书中所用的，“施用”及其变体（例如，“施用”一种化合物）是指向需要治疗的受试者提供该化合物或其药学上可接受的盐。
本发明还提供了合成可用作制备本发明化合物的中间体的化合物的方法。
本说明书中描述的化合物可根据下文方案和实施例的方法，使用合适的原料制备，并由下文具体实施例进一步举例说明。本发明化合物的氘代形式可通过用合适的同位素标记试剂代替非同位素标记试剂来制备。然而，实施例中示例的化合物不应被解释为是构成本发明的唯一类别。实施例进一步示例了制备本发明化合物的细节。本领域技术人员容易理解，以下制备方法的条件和过程的已知变化可用于制备这些化合物。除非另有说明，用于制备中间体和实施例化合物的试剂和起始材料可商购获得。除非另有说明，所有温度均为摄氏度。质谱（MS）通过电喷雾离子质谱法（ESI）测量。1H NMR谱是在300-500 MHz记录的。
缩略语清单
除非在实验方法中另有说明，本文所述的化合物是作为外消旋混合物合成的。在一些情况下，最终产物可以例如，通过操作取代基来进一步修饰。这些操作可以包括，但不限于，本领域技术人员公知的还原、氧化、烷基化、酰化和水解反应。在一些情况下，可以改变进行上述反应方案的顺序以促进反应或避免不想要的反应产物。提供以下方案和实施例以便可以更充分地理解本发明。这些实施例仅是示例性的，不应被理解为以任何方式限制本发明。
通用方案A
取代的哌嗪（A-1）可经SNAr或Pd介导的C-N偶联反应转化为杂芳基-或芳基哌嗪A-2。脱保护后与杂芳基-或芳基卤化物经SNAr或Pd介导的C-N偶联提供中间体A-3。利用乙烯基等同物进行Suzuki偶联可提供中间体A-4，且随后与杂芳基-或芳基卤化物的Heck偶联可得到目标分子A-5。
通用方案B
取代的哌嗪（B-1）可经SNAr或Pd介导的C-N偶联反应转化为杂芳基-或芳基哌嗪B-2。脱保护后与杂芳基-或芳基卤化物经SNAr或Pd介导的C-N偶联提供中间体B-3。与乙烯基化的芳香结构的Heck或Suzuki偶联可得到目标分子B-4。
通用方案C
取代的哌嗪（C-1）可经SNAr或Pd介导的C-N偶联反应转化为杂芳基或芳基哌嗪C-2。与乙烯基化的芳香结构的Heck偶联得到中间体C-3。脱保护后经SNAr或Pd介导的C-N偶联反应可得到目标分子C-4。
通用方案D
取代的哌嗪（D-1）可经SNAr或Pd介导的C-N偶联反应转化为杂芳基或芳基哌嗪D-2。脱保护后与杂芳基或芳基卤化物的SNAr或Pd介导的C-N偶联反应提供中间体D-3。醛至炔的转化可得到中间体D-4，且随后与杂芳基或芳基卤化物的Sonogoshira偶联反应可得到目标分子D-5。
通用方案E
取代的哌嗪（E-1）可经SNAr或Pd介导的C-N偶联反应转化为杂芳基-或芳基哌嗪E-2。醛到炔的转化可提供中间体E-3。与杂芳基-或芳基卤化物的Sonogoshira偶联可以产生中间体E-4。脱保护后经SNAr或Pd介导的C-N偶联反应可得到目标分子E-5。
通用方案F
取代的哌嗪（F-1）可经SNAr或Pd介导的C-N偶联反应转化为杂芳基或芳基哌嗪F-2。与乙酰化取代的芳香结构的Sonogoshira偶联提供中间体F-3。脱保护后经SNAr或Pd介导的C-N偶联反应可得到目标分子F-4。
通用方案G
取代的哌嗪（G-1）可经SNAr或Pd介导的C-N偶联反应转化为杂芳基-或芳基哌嗪G-2。脱保护后与杂芳基-或芳基卤化物的SNAr或Pd介导的C-N偶联反应提供中间体B-3。与乙酰化取代的芳香结构的Sonogoshira偶联反应可得到目标分子B-4。
中间体的制备
中间体A的合成：2-(1H-咪唑-1-基)-5-乙烯基吡啶
在室温下，向1-1(40 g, 179 mmol)在1,4-二噁烷(300 mL)、水(300 mL)中的搅拌溶液中加入碳酸铯(174 g, 536 mmol)，并用氩气脱气20分钟。然后在室温下，向反应混合物中加入乙烯基三氟硼酸钾(35.9 g, 268 mmol)和二氯二(三苯基膦)钯(II) (6.27 g,8.93 mmol）。将得到的反应混合物在100℃下搅拌16 h。用水(500 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 500 mL)萃取。将合并的有机层用盐水(500 mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并将滤液减压浓缩得到粗产物。粗化合物通过(100-200目)硅胶柱色谱纯化并用60%乙酸乙酯/石油醚梯度洗脱化合物。减压浓缩纯馏分得到Int A。M/Z (ESI): 171.96 [M+H]+。
中间体B的合成：(R)-(4-(5-溴嘧啶-2-基)-1-(嘧啶-2-基)哌嗪-2-基)甲醇
2-2的合成：叔丁基(R)-3-(羟甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酸酯
在室温下，向2-1(15 g, 69.4 mmol)在NMP (150 mL)中的搅拌溶液中加入K2CO3(19.17 g, 139 mmol)和2-氯嘧啶(7.94 g, 69.4 mmol)。将反应混合物在氮气氛围下于80℃搅拌24 h。用冰水(200 mL)淬灭反应混合物，并用EtOAc (3 x 200 mL)萃取。将合并的有机层用冰水(100 mL)、盐水(100 mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。将粗化合物通过(100-200目)硅胶柱色谱纯化，并用50% EtOAc/石油醚梯度洗脱化合物。减压浓缩纯馏分得到2-2。M/Z (ESI): 295.16 [M+H]+。
2-3的合成：(R)-(1-(嘧啶-2-基)哌嗪-2-基)甲醇
在0℃下，向2-2(9 g, 30.6 mmol)在DCM (45 mL)中的搅拌溶液中加入4N HCl的1,4-二噁烷(38.2 mL, 153 mmol)溶液。将反应混合物在氮气氛围下于25℃搅拌16 h。减压浓缩反应混合物。用乙醚(20 mL)研磨粗化合物。过滤得到固体，并减压干燥以得到2-3。M/Z(ESI): 195.06 [M+H]+。
Int B的合成：(R)-(4-(5-溴嘧啶-2-基)-1-(嘧啶-2-基)哌嗪-2-基)甲醇
在室温下，向2-3(3 g, 13.00 mmol)在NMP (30 mL)中的搅拌溶液中加入K2CO3(7.19 g, 52.0 mmol)和5-溴-2-氯嘧啶(2.52 g, 13.00 mmol)。将反应混合物在氮气氛围下于80℃搅拌16 h。用冰水（100 mL）淬灭反应混合物，并用EtOAc (3 x 100 mL)萃取。将合并的有机层用冰水(100 mL)、盐水(100 mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。将粗化合物通过(100-200目)硅胶柱色谱纯化，将化合物用50% EtOAc/石油醚梯度洗脱。将纯馏分减压浓缩，并将得到的化合物通过制备型HPLC纯化进一步再纯化(条件：流动相-10 mM碳酸氢铵水溶液：MeCN柱-X-Bridge C18 (19X250)mm 5um流速-18ml/min梯度方法-0/45, 4/50, 10.5/50, 10.6/100, 11.9/100, 12/45, 15/45)。减压浓缩纯馏分，冻干得到Int B。M/Z (ESI): 351.23 [M+H]+。
中间体C的合成: (R)-5-溴-2-(3-(甲氧基甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶
3-2的合成：(R)-3-(羟甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-酸甲叔丁酯
在室温下，向3-1(1g, 4.62 mmol)在二噁烷(16 mL)中的经氩气脱气的搅拌溶液中加入叔丁醇钠(1.333 g, 13.87 mmol)、甲磺酸[(2-二-环己基膦基-3,6-二甲氧基-2′,4′,6′-三异丙基-1,1′-联苯基)-2-(2′-氨基-1,1′-联苯基)]钯(II)(BrettPhos Pd G3)(0.210 g, 0.231 mmol)和2-溴嘧啶(0.882 g, 5.55 mmol)。将反应混合物在100℃搅拌12h。用冰水淬灭反应混合物并用EtOAc (50 mL x 2)萃取。将合并的有机层用盐水溶液洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并减压浓缩。将粗化合物通过100 x 200硅胶Biotage快速柱色谱纯化，其中用50% EtOAc/石油醚作为洗脱剂。减压浓缩纯馏分得到化合物3-2。M/Z (ESI):295.19 [M+H]+。
3-3的合成：(R)-3-(甲氧基甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在室温下，向化合物3-2(800 mg, 2.72 mmol)在DMF (10 mL)中的搅拌溶液中加入碘甲烷(1929 mg, 13.59 mmol)和氢化钠(98 mg, 4.08 mmol)。在0℃下搅拌反应混合物2 h。用冰水淬灭反应混合物并用EtOAc (10 mL x 2)萃取。将合并的有机层用盐水溶液洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并减压蒸发以得到化合物3-3。M/Z (ESI): 309.19 [M+H]+。
3-4的合成：(R)-2-(2-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)嘧啶
在0℃下，向化合物3-3(800 mg, 2.59 mmol)在DCM (9 mL)中的搅拌溶液中加入4M HCl的1,4-二噁烷(646 mg, 5.19 mmol)溶液并在25℃下搅拌2 h。减压蒸发反应混合物，与甲苯共蒸馏，用戊烷洗涤并干燥以得到化合物3-4。M/Z (ESI): 209.19 [M+H]+。
Int C的合成：(R)-5-溴-2-(3-(甲氧基甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶
在0℃下，向化合物3-4(700 mg, 2.86 mmol)在DMF (10 mL)中的搅拌溶液中加入碳酸钾(0.813 ml, 14.30 mmol)，而后加入5-溴-2-氟嘧啶(607 mg, 3.43 mmol)。在80℃搅拌反应混合物12 h。用冰水淬灭反应混合物，过滤得到的固体并减压干燥以得到化合物Int C。M/Z (ESI): 365.06 [M+H]+。
中间体D的合成：(R)-2-(3-(甲氧基甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)-5-乙烯嘧啶
在室温下向Int C(10 g, 27.4 mmol)在1,4-二噁烷(80 mL)和水(14 mL)中的搅拌溶液中加入Cs2CO3(17.84 g, 54.8 mmol)和乙烯基三氟硼酸钾(7.33 g, 54.8 mmol)，并用氩气脱气15分钟。然后在室温下向反应混合物中加入PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(2.236g, 2.74 mmol)，并在氮气氛围下于100℃在密封管中搅拌所得的反应混合物16 h。用水(50mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 200 mL)萃取。将合并的有机层用盐水(50 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并将滤液减压浓缩以提供粗产物。通过(100-200目)硅胶柱色谱纯化粗化合物，并用30% EtOAc/石油醚梯度洗脱化合物。将纯馏分减压浓缩以得到Int D。M/Z(ESI): 313.63 [M+H]+。
中间体E的合成：(R,E)-5-(2-(6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)-2-(3-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)嘧啶
4-2的合成：(R)-4-(5-溴嘧啶-2-基)-2-(羟甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在室温下，向叔丁基4-1(25 g, 116 mmol)和5-溴-2-氯嘧啶(26.8 g, 139 mmol)在DMF (250 mL)中的搅拌溶液中加入K2CO3(39.9 g, 289 mmol)。将反应混合物在80℃搅拌2 h。将反应混合物用冰水(100 mL)稀释，用EtOAc (2 x 200 mL)萃取。合并有机层，用盐水溶液(50 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，干燥，并减压浓缩以得到粗化合物。粗化合物通过硅胶柱纯化，用20% EtOAc/石油醚溶液梯度洗脱。减压浓缩纯馏分以得到化合物4-2。M/Z(ESI): 373.19 [M+H]+。
4-3的合成：(R)-4-(5-溴嘧啶-2-基)-2-(甲氧基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在0℃下，向化合物4-2(25 g, 67.0 mmol)在DMF (250 mL)的搅拌溶液中加入MeI(20.94 mL, 335 mmol)和NaH (5.36 g, 134 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2 h。将反应混合物用冰水(100 mL)稀释，用EtOAc (2 x 200 mL)萃取。合并有机层，用盐水溶液(50mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，干燥，并减压浓缩以得到粗化合物。粗化合物通过硅胶柱纯化，用15% EtOAc/石油醚溶液梯度洗脱。减压浓缩纯馏分以得到化合物4-3。M/Z (ESI):387.14 [M+H]+。
4-4的合成：(R,E)-4-(5-(2-(6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)嘧啶-2-基)- 2-(甲氧基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在室温下，向化合物4-3(1g, 2.58 mmol)在甲苯(10 mL)中的搅拌溶液中加入化合物Int A(0.442 g, 2.58 mmol)、DIPEA (1.353 mL, 7.75 mmol)，并用氩气脱气10 min，接着在氮气氛围下加入Pd2(dba)3(0.118 g, 0.129 mmol)和四氟硼酸三叔丁基膦(0.075g, 0.258 mmol)。将所得反应混合物在120℃搅拌16 h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用水(5 mL)稀释，用EtOAc (2 x 10 mL)萃取。合并有机层，用盐水(5 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，减压浓缩以得到粗化合物。粗化合物通过硅胶柱纯化，用5% MeOH/DCM梯度洗脱。减压浓缩纯馏分以得到化合物4-4。M/Z (ESI): 478.35 [M+H]+。
Int E的合成：(R,E)-5-(2-(6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)-2-(3-(甲氧 基甲基)哌嗪-1-基)嘧啶
在0℃下，向化合物4-4(400 mg, 0.838 mmol)在DMF (5 mL)中的搅拌溶液中加入4M HCl的1,4-二噁烷(0.419 mL, 1.675 mmol)溶液。将反应混合物在室温下搅拌16 h。将反应混合物减压浓缩以得到化合物Int E。M/Z (ESI): 378.23 [M+H]+。
中间体F的合成：(R)-2-(2-(甲氧基甲基)-4-(吡啶-2-基)哌嗪-1-基)-5-乙烯嘧啶
5-2的合成：(R)-2-(甲氧基甲基)-4-(吡啶-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
向5-1(1.50 g, 6.51 mmol)在甲苯(60 mL)中的搅拌溶液里通入氮气鼓泡10min。加入2-溴吡啶(0.932 mL, 9.77 mmol)、叔丁醇钠(1.565 g, 16.28 mmol)和氯(2-二环己基膦基-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯基)[2-(2'-氨基-1,1'-联苯基)]钯(II)(RuPhos Pd G2) (0.506 g, 0.651 mmol)并将混合物在110℃在搅拌下加热18 h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用EtOAc (3 x 20 ml)洗涤。将滤液浓缩并用快速柱色谱法(120 g Isco Gold柱)纯化，用己烷:EtOAc 100:0至50:50洗脱。将所需馏分浓缩以得到化合物5-2。M/Z (ESI): 308.0 [M+H]+。
5-3的合成：(R)-3-(甲氧基甲基)-1-(吡啶-2-基)哌嗪盐酸盐
向5-2(1.97 g, 6.41 mmol))在二氯甲烷(5 mL)和MeOH (1 mL)中的溶液中加入4M HCl的二噁烷(4.81 mL, 19.23 mmol)溶液，并将反应在环境温度下熟化2 h。减压蒸发反应混合物，并在高真空下以干燥得到化合物5-3。M/Z (ESI): 208.0 [M+H]+。
5-4的合成：(R)-5-溴-2-(2-(甲氧基甲基)-4-(吡啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶
将5-3(1.86 g, 6.64 mmol)、5-溴-2-氟嘧啶(2.350 g, 13.28 mmol)和碳酸钾(2.75 g, 19.91 mmol)在DMF (25 mL)中的溶液在70℃下加热18 h。将混合物用水(75 mL)稀释，然后用Et2O (3 x 30 mL)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥、过滤并浓缩。将粗产物通过快速柱色谱(120 g Isco Gold柱)纯化，用己烷:EtOAc 100:0至40:60洗脱，得到化合物5-4。M/Z (ESI): 364.2, 366.2 [M+H]+。
将5-4(1.30 g, 3.57 mmol)、乙烯基三氟硼酸钾(0.717 g, 5.35 mmol)、碳酸铯(3.49 g, 10.71 mmol)和二氯二(三苯基膦)钯(II) (0.125 g, 0.178 mmol)在二噁烷(13.38 ml)中的经氮气鼓泡的溶液在100℃下加热21 h。将混合物用水(30 mL)稀释，然后用EtOAc (3 x 30 mL)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过快速柱色谱(120 g Isco Gold柱)纯化，用己烷:EtOAc 100:0至50:50洗脱，得到化合物Int F。M/Z (ESI): 312.2 [M+H]+。
中间体G的合成：((E)-(2-(6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)硼酸
向5-溴-2-(1H-咪唑-1-基)吡啶(1-1, 1.00 g, 4.46 mmol)和TEA (1.24 mL,8.93 mmol)在甲苯(44.6 mL)中的溶液中通入氮气鼓泡15分钟。加入乙烯基硼酸频哪醇酯(1.14 mL, 6.69 mmol)和双(三叔丁基膦)钯(0) (0.114 g, 0.223 mmol)并在110℃下加热混合物16 h。用硅藻土垫过滤该混合物，浓缩，用快速柱色谱(40 g Isco Gold柱)纯化，用己烷:EtOAc/EtOH(3:1) 100:0至0:100洗脱以得到化合物Int G。M/Z (ESI): 216.1 [M+H]+
中间体H的合成：(R,E)-5-(2-(6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)-2-(2-((2-甲氧基乙氧基)甲基)哌嗪-1-基)嘧啶二盐酸盐
6-2的合成：(R)-4-(5-溴嘧啶-2-基)-3-(羟甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
将6-1(2.74 g, 12.66 mmol)、5-溴-2-氟嘧啶(2.00 g, 11.30 mmol)和DIEA(19.7 mL, 113 mmol)在DMF (40 mL)中的溶液在100℃下加热16 h。将该溶液倾入水(100mL)中并用Et2O (3 x 30 mL)萃取。将合并的有机物经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过快速柱色谱(120 g Isco Gold柱)纯化，用己烷:EtOAc 100:0至0:100洗脱，得到化合物6-2。M/Z (ESI): 373.0, 375.0 [M+H]+。
6-3的合成：(R)-4-(5-溴嘧啶-2-基)-3-((2-甲氧基乙氧基)甲基)哌嗪-1-甲酸叔 丁酯
在环境温度下，将氢化钠(0.219 g, 5.47 mmol, 60 wt%)加入到6-2(1.02 g,2.73 mmol)的THF (13.66 ml)溶液中，并将该溶液搅拌0.5 h。然后加入1-溴-2-甲氧基乙烷(0.514 ml, 5.47 mmol)并将该溶液在50℃下搅拌20 h。将该溶液倾入水(30 mL)中并用EtOAc (3 x 30 mL)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过快速柱色谱(80 g Isco Gold柱)纯化，用己烷:EtOAc 100:0至0:100洗脱，得到化合物6-3。M/Z(ESI): 431.3, 433.3 [M+H]+。
6-4的合成：(R,E)-4-(5-(2-(6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)嘧啶-2-基)- 3-((2-甲氧基乙氧基)甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
向6-3(200 mg, 0.464 mmol)、Int G(150 mg, 0.696 mmol)和1M磷酸三钾(1391µl, 1.391 mmol)在二噁烷(4637 µl)中的溶液中通入氮气鼓泡。加入氯(2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯基)[2-(2'-氨基-1,1'-联苯基)]钯(II) (36.5 mg, 0.046mmol)并在80℃下搅拌该溶液1.5 h。用硅藻土垫过滤该混合物，浓缩，并用快速柱色谱(40g Isco Gold柱)纯化，用己烷:EtOAc 100:0至0:100洗脱，以得到化合物6-4。M/Z (ESI):522.4 [M+H]+。
Int H的合成：(R,E)-5-(2-(6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)-2-(2-((2-甲 氧基乙氧基)甲基)哌嗪-1-基)嘧啶二盐酸盐
将4M HCl的二噁烷(1069 µl, 4.28 mmol) 溶液加入到6-4(223 mg, 0.428mmol)在DCM (4275 µl)中的溶液中，并将该溶液在环境温度下熟化2 h。浓缩该混合物并在高真空下干燥以得到化合物Int H。M/Z (ESI): 422.3 [M+H]+。
中间体I的合成：(R)-(4-(5-乙炔基嘧啶-2-基)-1-(嘧啶-2-基)哌嗪-2-基)甲醇
9-1的合成；(R)-2-(3-(羟甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶-5-甲醛
在室温下向化合物2-3(3 g, 13.0 mmol)在DMF (45 mL)中的搅拌溶液中加入碳酸钾(8.99 g, 65.0 mmol)，然后在室温下加入2-氯嘧啶-5-甲醛(1.854 g, 13.00 mmol)。将得到的反应混合物在80℃下搅拌2 h。用冰冷的水淬灭反应混合物，用EtOAc (30 mL)萃取。分离合并的有机层，水层用EtOAc (60 mL)再萃取，然后用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸发，以得到粗化合物(4.5 g)，为棕色固体。粗化合物通过100-200硅胶Biotage快速柱色谱纯化，用50% EtOAc/石油醚梯度洗脱。减压浓缩纯馏分，得到化合物9-1。M/Z (LCMS) (M+H): 301.20。
Int I的合成：(R)-(4-(5-乙炔基嘧啶-2-基)-1-(嘧啶-2-基)哌嗪-2-基)甲醇
在0℃下向化合物9-1(1.8 g, 5.99 mmol)在MeOH (20 mL)中的搅拌溶液中加入碳酸钾(1.657 g, 11.99 mmol)和(1-重氮基-2-氧代丙基)膦酸二甲酯(Bestmann-Ohira试剂, 1.626 mL, 7.19 mmol)，然后将反应混合物在室温下搅拌16 h。将反应混合物用水(20mL)稀释，用EtOAc (2 x 30 mL)萃取。将合并的有机层用盐水(10 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩以得到粗化合物。粗化合物经硅胶柱纯化，并将产物用40% EtOAc/石油醚梯度洗脱。减压浓缩纯馏分以得到化合物Int I。M/Z (LCMS) (M+H): 297.25。
中间体J的合成：(R)-5-((6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙炔基)-2-(3-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)嘧啶盐酸盐
10-1的合成：(R)-4-(5-甲酰基嘧啶-2-基)-2-(羟甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在室温下，向4-1(5 g, 23.12 mmol)在DMF (80 mL)的搅拌溶液中加入碳酸钾(3.94 ml, 69.4 mmol)，而后在室温下加入2-氯嘧啶-5-甲醛(4.28 g, 30.1 mmol)。在80℃下搅拌得到的反应混合物12 h。用冰水淬灭反应混合物，用EtOAc (50 mL x 2)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压蒸发以得到粗化合物。粗化合物经100-200硅胶Biotage快速柱色谱纯化，用20% EtOAc/石油醚梯度洗脱。减压浓缩纯馏分以得到化合物10-1。M/Z (LCMS) (M+H): 323.17。
10-2的合成：(R)-4-(5-乙炔基嘧啶-2-基)-2-(羟甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在室温下，向化合物10-1(6 g, 18.61 mmol)在MeOH (75 mL)的搅拌溶液中加入碳酸钾(5.14 g, 37.2 mmol)，而后加入(1-重氮基-2-氧代丙基)膦酸二甲酯(Bestmann-Ohira试剂; 5.36 ml, 22.33 mmol)。在25℃下搅拌反应混合物4 h。用饱和NH4Cl溶液淬灭反应混合物，用DCM (10 mL x 3)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压蒸发以得到粗化合物。粗化合物经100-200硅胶Biotage快速柱色谱纯化，用30%EtOAc/石油醚梯度洗脱。减压浓缩纯馏分以得到化合物10-2。M/Z (LCMS) (M+H): 319.22。
10-3的合成：(R)-4-(5-((6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙炔基)嘧啶-2-基)-2- (羟甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在室温下，向化合物10-2(3.5 g, 10.99 mmol)在ACN (40 mL) (经氩气脱气)中的搅拌溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(4.26 g, 33.0 mmol)，而后加入氯(2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯基)[2-(2'-氨基-1,1'-联苯基)]钯(II) (0.865 g,1.099 mmol)、5-溴-2-(1H-咪唑-1-基)吡啶(3.69 g, 16.49 mmol)。在80℃下搅拌反应混合物1 h。用冰水淬灭反应混合物，用EtOAc (50 mL)萃取。合并的有机层用盐水溶液洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压蒸发以得到粗化合物，为棕色固体。粗化合物经100-200硅胶Biotage快速柱色谱纯化，用EtOAc梯度洗脱。减压浓缩纯馏分以得到化合物10-3。M/Z(LCMS) (M+H): 462.37。
10-4的合成：(R)-4-(5-((6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙炔基)嘧啶-2-基)-2- (甲氧基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在0 ℃下，向化合物10-3(2 g, 4.33 mmol)在DMF (15 mL)中的搅拌溶液中加入碘甲烷(1.230 g, 8.67 mmol)，并在0℃下搅拌5 min，而后在0℃下加入氢化钠(0.416 g,17.33 mmol)。在25℃下搅拌反应混合物2 h。用冰水淬灭反应混合物，用EtOAc (15 mL x3)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压蒸发以得到粗化合物。该粗化合物经100-200硅胶Biotage快速柱色谱纯化，使用20% EtOAc/石油醚作为洗脱剂。合并所有期望的馏分(通过TLC监测)并减压浓缩以得到化合物10-4。M/Z (LCMS) (M+H):476.30。
Int J的合成：(R)-5-((6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙炔基)-2-(3-(甲氧基甲 基)哌嗪-1-基)嘧啶盐酸盐
在0℃下，向化合物10-4(2 g, 4.21 mmol)在DCM (15 mL)中的搅拌溶液中加入4MHCl的1,4-二噁烷(1.048 g, 8.41 mmol)溶液。在25℃下搅拌得到的反应混合物2 h。减压蒸发反应混合物，并用DCM冷蒸馏。用戊烷洗涤得到的化合物，减压干燥以得到化合物IntJ。M/Z (LCMS) (M+H): 376.30。
实施例
实施例1
(R,E)-(4-(5-(2-(6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)嘧啶-2-基)-1-(嘧啶-2-基)哌嗪-2-基)甲醇
向Int B(1 g, 2.85 mmol)在甲苯(10 mL)中的搅拌溶液里通入氩气鼓泡10 min。室温下向该反应混合物中加入Int A(0.487 g, 2.85 mmol)、DIPEA (1.492 mL, 8.54mmol)、Pd2(dba)3(0.261 g, 0.285 mmol)与四氟硼酸三叔丁基膦(0.165 g, 0.569 mmol)，再次通入氩气鼓泡10 min。将反应混合物于100 ℃下搅拌16 h。用水（50 mL）淬灭反应混合物，用10% MeOH/DCM (2 x 100 mL)萃取。将合并的有机层用盐水(2 x 50 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。粗化合物通过(100-200目)硅胶柱色谱纯化，并用10% MeOH/DCM梯度洗脱化合物。纯馏分经减压浓缩以得到1。M/Z (ESI): 442.33 [M+H]+;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz): δ (ppm) 8.67 (s, 2H), 8.59 (d,J= 2.0 Hz, 1H), 8.55 (s,1H), 8.39 (d,J= 4.4 Hz, 2H), 8.22 (dd,J= 8.6 Hz, 2.2 Hz, 1H), 7.96-8.0 (m,1H), 7.84 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.20-7.34 (m, 2H), 7.13 (s, 1H), 6.65 (t,J= 4.8Hz, 1H), 4.71-4.84 (m, 3H), 4.41-4.55 (m, 2H), 3.40-3.53 (m, 2H), 3.18-3.30(m, 3H)。
实施例2
(R,E)-5-(2-(6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)-2-(3-(甲氧基甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶
在室温下，向化合物Int C(300 mg, 0.821 mmol) 和Int A(211 mg, 1.232mmol)在1,4-二噁烷(5 mL)中的搅拌溶液中加入DIPEA (0.430 mL, 2.464 mmol)。反应混合物通入氩气鼓泡5 min，随后加入氯[(三叔丁基膦)-2-(2-氨基联苯)]钯(II) (42.1 mg,0.082 mmol)，并再次通入氩气鼓泡5 min。将反应混合物于120℃下搅拌16 h。用水（20 mL）淬灭反应混合物，并用EtOAc (2 x 30 mL)萃取。将合并的有机层用盐水(10 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，干燥并减压浓缩得到粗化合物。该粗化合物经硅胶柱纯化，用5% MeOH/DCM梯度洗脱。减压浓缩纯馏分以得到化合物2。M/Z (ESI): 456.39 [M+H]+。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ (ppm) 8.69 (s, 2H), 8.60 (d,J= 2.4 Hz,1H), 8.55 (s, 1H), 8.41 (d,J= 4.4 Hz, 2H), 8.23 (dd,J= 8.8 Hz, 2.4 Hz, 1H),7.98 (s, 1H), 7.85 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 7.29 (d,J= 16.8 Hz, 1H), 7.24 (d,J=16.4 Hz, 1H), 7.14 (s, 1H), 6.68 (t,J= 4.8 Hz, 1H), 4.89-4.96 (m, 1H), 4.79(d,J= 13.2 Hz, 1H), 4.50-4.60 (m, 2H), 3.35-3.46 (m, 2H), 3.22-3.30 (m, 2H),3.12-3.22 (m, 4H)。
实施例3
(R,E)-5-(2-(6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)-2-(3-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶
在0℃下，向1(100 mg, 0.227 mmol)在DMF (1 mL)中的搅拌溶液中加入1-氟-2-碘乙烷(79 mg, 0.453 mmol)，而后加入60% NaH (18.12 mg, 0.453 mmol)。在室温下搅拌反应混合物3 h。用水(50 mL)稀释反应混合物，并用EtOAc (3 x 50 mL)萃取。合并的有机层经无水硫酸钠干燥并减压浓缩以得到粗化合物。粗化合物经制备型HPLC纯化（流动相-10mM碳酸氢铵水溶液：MeCN，柱-YMC Triart C18 (25X250) mm 5u流速-7.0 ml/min,梯度方法-0/35, 2/35, 11/68, 11.05/100, 13/100, 13.05/35, 16/35）得到3。M/Z (ELSD) (M+H): 488.35。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ (ppm) 8.68 (s, 2H), 8.60 (d,J= 2.0 Hz,1H), 8.55 (s, 1H), 8.41 (d,J= 4.8 Hz, 2H), 8.23 (dd,J= 8.6, 2.4 Hz, 1H), 7.98(t,J= 1.4 Hz, 1H), 7.85 (d,J= 8.5 Hz, 1H), 7.20-7.33 (m, 2H), 7.14 (s, 1H),6.68 (t,J= 4.8 Hz, 1H), 4.87-4.94 (m, 1H), 4.83 (br d,J= 13.3 Hz, 1H), 4.46-4.62 (m, 3H), 4.39 (ddd,J= 4.8, 3.3, 1.5 Hz, 1H), 3.65 (td,J= 4.1, 2.4 Hz,1H), 3.44-3.61 (m, 3H), 3.32-3.35 (m, 1H), 3.13-3.29 (m, 2H)。
实施例4
(R,E)-5-(2-(6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)-2-(3-((氟甲氧基)甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶
在0℃下，向1(100 mg, 0.227 mmol)在THF (2 mL)中的搅拌溶液中加入氟碘甲烷(72.4 mg, 0.453 mmol)和叔丁醇钾(50.8 mg, 0.453 mmol)。在室温下搅拌得到的反应混合物4 h。用冰水淬灭反应混合物，并用EtOAc (50 mL x 2)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压蒸发以得到粗化合物。粗化合物经制备型HPLC纯化（方法：流动相-10 mM碳酸氢铵水溶液：MeCN,柱-X-Select C18 (19X250) mm 5u流速-16ml/min，梯度方法0/45, 2/45, 12/80, 12.05/99, 15/99, 15.05/45, 18/45）得到4。M/Z(ELSD) (M+H): 473.44。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ (ppm) 8.69 (s, 2H), 8.60 (d,J= 2.0 Hz,1H), 8.55 (s, 1H), 8.42 (d,J= 4.5 Hz, 2H), 8.23 (dd,J= 8.8, 2.3 Hz, 1H), 7.98(t,J= 1.3 Hz, 1H), 7.80-7.90 (m, 1H), 7.27 (d,J= 3.3 Hz, 2H), 7.14 (s, 1H),6.70 (t,J= 4.6 Hz, 1H), 5.30-5.39 (m, 1H), 5.16-5.26 (m, 1H), 4.95-5.02 (m,1H), 4.77-4.84 (m, 1H), 4.48-4.61 (m, 2H), 3.78-3.85 (m, 1H), 3.68-3.75 (m,1H), 3.36 (br d,J= 4.3 Hz, 1H), 3.14-3.29 (m, 2H)。
实施例5
(R,E)-5-(2-(6-(4H-1,2,4-三唑-4-基)吡啶-3-基)乙烯基)-2-(2-(甲氧基甲基)-4-(吡啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶
将Int F(10.0 mg, 0.032 mmol)、5-溴-2-(4H-1,2,4-三唑-4-基)吡啶(14.6 mg,0.065 mmol)、N,N-二环己基甲胺(19.0 mg, 0.097 mmol)和二氯二(三苯基膦)钯(II)(1.66 mg, 0.003 mmol)在二噁烷(0.5 ml)中的氮气鼓泡溶液在120℃下加热18 h。用DMF(0.8 mL)稀释该混合物，过滤并经Gilson HPLC（10-100% ACN/H2O w / 0.1% NH4OHGemini-NX柱）纯化以得到化合物5。M/Z (ESI): 456.21 [M+H]+。
1H NMR (DMSO-d6, 500 MHz): δ (ppm) 9.31-9.26 (m, 2H), 8.78-8.58 (m,3H), 8.31-8.24 (m, 1H), 8.14-8.08 (m, 1H), 7.88 (t,J= 9.0 Hz, 1H), 7.63-7.46(m, 1H), 7.39-7.18 (m, 2H), 6.82 (t,J= 7.7 Hz, 1H), 6.71-6.55 (m, 1H), 4.97-4.89 (m, 1H), 4.73-4.45 (m, 1H), 4.39-4.30 (m, 1H), 4.27-4.17 (m, 1H), 3.47(s, 3H), 3.35-3.26 (m, 1H), 3.25-3.18 (m, 2H), 3.17-3.09 (m, 1H), 3.01-2.91(m, 1H)。
实施例6
(R,E)-5-(2-(6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)-2-(2-((2-甲氧基乙氧基)甲基)-4-(吡啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶
向Int H(211 mg, 0.427 mmol)、2-溴吡啶(52.9 µl, 0.555 mmol)和叔丁醇钠(205 mg, 2.134 mmol)在甲苯(4268 µl)中的搅拌溶液中通入氮气鼓泡10分钟。加入氯(2-二环己基膦基-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯基)[2-(2'-氨基-1,1'-联苯基)]钯(II)(RuPhos Pd G2) (33.1 mg, 0.043 mmol)并将混合物在110℃在搅拌下加热20 h。将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用EtOAc (3 x 20 ml)洗涤。将滤液浓缩并用快速柱色谱法（40g Isco Gold柱）纯化，用己烷:EtOAc 100:0至50:50洗脱以得到化合物6。M/Z (ESI):499.4[M+H]+。
1H NMR (CDCl3, 500 MHz): δ (ppm) 8.54-8.52 (m, 1H), 8.53 (s, 2H), 8.35(s, 1H), 8.19 (d,J= 3.6 Hz, 1H), 7.94 (dd,J= 8.5 Hz, 2.2 Hz, 1H), 7.65 (s,1H), 7.50 (t,J= 7.8 Hz, 1H), 7.35 (d,J= 8.5 Hz, 1H), 7.23 (d,J= 11.0 Hz, 1H),6.95 (s, 2H), 6.76 (d,J= 8.5 Hz, 1H), 6.69-6.0 (m, 1H), 5.08-5.02 (m, 1H),4.71-4.52 (m, 1H), 4.50-4.28 (m, 2H), 3.78-3.45 (m, 6H), 3.45-3.29 (m, 1H),3.36 (s, 3H), 3.25 (dd,J= 13.1 Hz, 3.7 Hz, 1H), 3.16-2.96 (m, 1H)。
实施例7和8
(R,E)-(2-(4-(5-(2-(6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)嘧啶-2-基)-2-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)嘧啶-5-基)甲醇和(R,E)-5-(2-(6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)-2-(4-(5-(氟甲基)嘧啶-2-基)-3-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)嘧啶
7-1的合成：(R,E)-2-(4-(5-(2-(6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)嘧啶-2- 基)-2-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)嘧啶-5-甲醛
在室温下，向Int E(2 g, 4.83 mmol)在DMF (20 mL)中的溶液中加入K2CO3(4.01g, 29.0 mmol)、2-氯嘧啶-5-甲醛(0.827 g, 5.80 mmol)并在氩氛围中在80℃下搅拌1小时。用水(10 mL)稀释反应混合物并搅拌10 min，过滤得到的固体沉淀物并干燥以得到粗化合物。粗化合物经biotage(48 g cartridge, 230-400硅胶)纯化，用3% MeOH/DCM梯度洗脱。在真空下浓缩纯馏分以得到化合物7-1。M/Z (ESI): 484.49 [M+H]+。
实施例7的合成：(R,E)-(2-(4-(5-(2-(6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)嘧 啶-2-基)-2-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)嘧啶-5-基)甲醇
在0℃下，向化合物7-1(750 mg, 1.551 mmol)在MeOH (10 mL)的搅拌溶液中加入NaBH4(117 mg, 3.10 mmol)并在相同温度下搅拌30 min。用水淬灭反应混合物并用EtOAc(3 x 50 mL)萃取。将合并的有机层用盐水(50 mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，用ACN (3 x 10 mL)、丙酮(10 mL)和乙醚(10 mL)研制，并用戊烷(10 mL)洗涤得到7。M/Z(ESI): 486.37 [M+H]+。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 8.68 (s, 2H), 8,59 (d,J= 2.0 Hz,1H), 8.55 (s, 1H), 8.35 (s, 2H), 8.22 (dd,J= 2.4 Hz, 8.8 Hz, 1H), 7.97 (s,1H), 7.84 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 7.21-7.32 (m, 2H), 7.13 (s, 1H), 5.08 (t,J= 5.6Hz, 1H), 4.89-4.98 (m, 1H), 4.79 (d,J= 13.6 Hz, 1H), 4.50-4.61 (m, 2H), 4.34(d,J= 5.6 Hz, 2H), 3.36-3.46 (m, 2H), 3.10-3.30 (m, 6H)。
实施例8的合成：(R,E)-5-(2-(6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)-2-(4-(5- (氟甲基)嘧啶-2-基)-3-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)嘧啶
在0℃下，在氩气氛围下，向7(500 mg, 1.030 mmol)在DCM (10 mL)中的搅拌的溶液中加入DAST (0.816 mL, 6.18 mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌30 min。用水(10 mL)淬灭反应混合物，用饱和NaHCO3溶液中和（pH调至中性），并用DCM (3 x 50 mL)萃取。将合并的有机层用盐水(30 mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩以得到粗产物(500 mg)。粗化合物(150 mg)通过制备型HPLC纯化，剩余的量用于另外的步骤。
制备型HPLC条件：流动相-10 mM碳酸氢铵的水溶液：MeCN柱-YMC ODS C18 (20 x100), 3µm流速-18.0 mL/min T/% B-0/55, 10.50/81.2, 10.55/100, 12.50/100,12.55/55, 15.50/55）。在冷冻下收集纯馏分并直接冻干以得到8。M/Z (SFC-MS): 488.32[M+H]+。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ (ppm) 8.68 (s, 2H), 8.60 (d,J= 2.0 Hz,1H), 8.55 (s, 1H), 8.52 (d,J= 2.0 Hz, 2H), 8.21-8.25 (m, 1H), 7.97 (s, 1H),7.84 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 7.29 (d,J= 16.8 Hz, 1H), 7.24 (d,J= 16.4 Hz, 1H),7.13 (s, 1H), 5.29 (d,J= 48.8 Hz, 2H), 4.55-5.01 (m, 1H), 4.79 (d,J= 13.2 Hz,1H), 4.57 (d,J= 10.4 Hz, 2H), 3.36-3.48 (m, 2H), 3.12-3.28 (m, 6H)。
实施例9
(R,E)-5-(2-(6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)-2-(2-(甲氧基甲基)-4-(5-(甲氧基甲基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶
实施例9的合成：(R,E)-5-(2-(6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)-2-(2-(甲氧基甲基)-4-(5-(甲氧基甲基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶
在0℃下，向8-1[类似于合成实施例7] (300 mg, 0.618 mmol)在DCM (4 mL)中的搅拌溶液中滴加DAST (0.163 ml, 1.236 mmol)。将反应混合物在氮气氛围中，于25℃下搅拌2 h。用碳酸氢钠溶液(10 mL)淬灭反应混合物，用10% MeOH/DCM (3 x 25 mL)萃取。合并的有机层用盐水(2 x 40 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥并过滤，并减压浓缩以得到中间体苄基氟，其为黄色固体。将上述粗化合物(280 mg)通过biotage用80g cartridge硅胶(230-400目)柱纯化并用5% MeOH/DCM梯度洗脱。减压浓缩纯馏分，再次用制备型HPLC（方法：流动相-10 mM碳酸氢铵水溶液：MeCN，柱-X-Bridge C18 (19X250)，流速-12.0 ml/min，梯度方法0/40, 2/40, 12/65, 14/65, 14.1/95, 17/95, 17.01/40, 20/40）再纯化以得到9。M/Z(LCMS) (M+H): 500.41。
1H NMR (三氯甲烷-d, 400 MHz): δ (ppm) 8.69 (s, 2H), 8.55-8.60 (m,2H), 8.37 (s, 2H), 8.23 (dd, J = 2, 8.4 Hz, 1H), 7.97 (s, 1H), 7.85 (d,J= 8.8Hz, 1H), 7.22-7.31 (m, 2H), 7.13 (s, 1H), 4.97-4.98 (m, 1H), 4.76 (d,J= 13.2Hz, 1H), 4.54-4.59 (m, 2H), 4.25 (s, 1H), 3.36-3.45 (m, 2H), 3.15-3.26 (m,8H), 3.08-3.14 (m, 1H)。
实施例10
(R)-(4-(5-((6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙炔基)嘧啶-2-基)-1-(嘧啶-2-基)哌嗪-2-基)甲醇
向化合物Int I(1.1 g, 3.71 mmol)在ACN (30 mL)中的溶液中加入化合物5-溴-2-(1H-咪唑-1-基)吡啶(0.749 g, 3.34 mmol)、DIPEA (1.945 mL, 11.14 mmol)并用氩气脱气5 min，而后加入氯(2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯基)[2-(2'-氨基-1,1'-联苯基)]钯(II) (0.292 g, 0.371 mmol)并在密封的试管中于80℃下搅拌1 h。减压蒸发反应混合物，过滤得到的沉淀溶液并干燥，并通过制备型HPLC（方法：流动相-10mM碳酸氢铵水溶液：MeCN,柱-X-Bridge C18 (19X250),流速-15.0 ml/min,梯度方法0/40,9.50/55, 9.55/98, 11.55/98, 11.60/40, 15.60/40）纯化并冻干以得到10。M/Z (LCMS)(M+H): 440.33。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ (ppm) 8.60-8.74 (m, 3H), 8.59 (s, 1H),8.39 (d,J= 4.8 Hz, 2H), 8.16 (dd,J= 8.5, 2.3 Hz, 1H), 8.00 (t,J= 1.3 Hz, 1H),7.91 (d,J= 8.5 Hz, 1H), 7.15 (s, 1H), 6.60-6.73 (m, 1H), 4.68-4.87 (m, 3H),4.38-4.54 (m, 2H), 3.42-3.53 (m, 2H), 3.32-3.41 (m, 3H)。
实施例11
(R)-5-((6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙炔基)-2-(3-(甲氧基甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶
在0℃下，向10(70 mg, 0.088 mmol)在DMF (0.7 mL)中的溶液中加入碘甲烷(7.05 µl, 0.113 mmol)和NaH (7 mg, 0.175 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1 h。用冷水(10 mL)淬灭反应混合物，用EtOAc (3 x 10 mL)萃取。将合并的有机层用盐水(10 mL)洗涤，经Na2SO4干燥并在真空下浓缩以得到粗化合物。粗化合物通过制备型HPLC（方法：流动相-10 mM碳酸氢铵水溶液：MeCN,柱- Kromosil C18(10X250) mm 5u流速-8ml/min,梯度方法-0/50, 10/85, 10.10/98, 12/98, 12.10/50, 15/50）纯化并冻干以得到11。M/Z(LCMS) (M+H): 454.36。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ (ppm) 8.66 (dd,J= 2.3, 0.8 Hz, 1H), 8.64(s, 2H), 8.59 (s, 1H), 8.41 (d,J= 4.8 Hz, 2H), 8.16 (dd,J= 8.5, 2.3 Hz, 1H),8.00 (t,J= 1.4 Hz, 1H), 7.88-7.93 (m, 1H), 7.16 (s, 1H), 6.68 (t,J= 4.8 Hz,1H), 4.87-4.98 (m, 1H), 4.72-4.82 (m, 1H), 4.48-4.60 (m, 2H), 3.33-3.41 (m,3H), 3.14-3.27 (m, 5H)。
实施例12
(R)-5-((6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙炔基)-2-(4-(6-氟嘧啶-4-基)-3-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)嘧啶
在室温下，向化合物Int J(100 mg, 0.266 mmol)在DMF (1mL)中的搅拌溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(172 mg, 1.332 mmol)，而后加入4,6-二氟嘧啶(30.9 mg, 0.266mmol)。在50℃下搅拌反应混合物1 h。用冰水淬灭反应混合物，用EtOAc (10 mL x 2)萃取。合并的有机层用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压蒸发以得到粗化合物。粗化合物通过制备型HPLC（方法：流动相-10 mM碳酸氢铵水溶液：MeCN,柱-X-Select C18 (19X250)流速-18.0 ml/min,梯度方法：0/50, 4/63, 9/63, 9.05/98, 11/98, 11.05/50, 15/50）纯化并冻干以得到12。M/Z (LCMS) (M+H): 472.43。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ (ppm) 8.64-8.65(m, 3H), 8.58(s, 1H), 8.35(d, J = 2.8 Hz, 1H), 8.16(dd, J = 2.4, 8.4 Hz, 1H), 8.00(s, 1H), 7.89(d, J =8.4 Hz, 1H), 7.155(s, 1H), 6.58(s, 1H), 4.70-4.78(m, 2H), 4.50-4.52(m, 1H),4.30(br s, 1H), 3.37-3.44(m, 3H), 3.24-3.29(m, 2H), 3.21(s, 3H)。
表1中包含的化合物由表1中最后一列所示的、上文描述的合成步骤通过类似的方法合成。在必要时用市售试剂代替以产生下面的实施例。
表1
实施例36
(R,E)-5-(5-(2-(2-(3-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶-5-基)乙烯基)吡啶-2-基)噁唑
36-1的合成：(R)-5-溴-2-(3-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧 啶
在0℃下，向Int B (250 mg, 0.712 mmol)在DMF (3 mL)里的搅拌溶液中加入1-氟-2-碘乙烷(0.115 mL, 1.424 mmol)和NaH (56.9 mg, 1.424 mmol)。在氮气氛围下于25℃搅拌反应混合物16 h。用水(40 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 30 mL)萃取。合并的有机层用盐水(2 x 30 mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage经80 g硅胶(230-400目)纯化，并用30% EtOAc/石油醚梯度洗脱化合物。减压浓缩纯馏分以得到36-1。M/Z (ESI): 397.32 [M+H]+。
36-4的合成：5-(5-溴吡啶-2-基)噁唑
在室温下，向甲苯磺酰甲基异氰化物(2 g, 10.24 mmol)在MeOH (35 mL)中的搅拌溶液中加入碳酸钾(4.25 g, 30.7 mmol)。然后在室温下向反应混合物中加入5-溴吡啶甲醛(2.096 g, 11.27 mmol)。在80℃下搅拌反应混合物16 h。用水(100 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 100 mL)萃取。合并的有机层用盐水(100 mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。
粗化合物通过Biotage快速柱色谱经(100-200目)硅胶纯化，并用50% EtOAc/石油醚梯度洗脱化合物。减压浓缩纯馏分以得到36-4。M/Z (ESI): 225.10 [M+2H]+。
36-2的合成：5-(5-乙烯基吡啶-2-基)噁唑
在室温下，向36-4(1 g, 4.44 mmol)在1,4-二噁烷(10 mL)中的氩气脱气的搅拌溶液中加入水(5 mL)和磷酸三钾(2.83 g, 13.33 mmol)。然后在室温下，向反应混合物中加入1,1'-双(二苯基膦)二茂铁二氯化钯(II)二氯甲烷络合物(0.363 g, 0.444 mmol)和乙烯基三氟硼酸钾(1.190 g, 8.89 mmol)。在100℃下搅拌反应混合物12 h。反应混合物在布氏漏斗上通过硅藻土床过滤，用EtOAc (100 mL)洗涤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage快速柱色谱经(100-200目)硅胶纯化，并用50% EtOAc/石油醚梯度洗脱化合物。减压浓缩纯馏分以得到36-2。M/Z (ESI): 173.02 [M+H]+。
36的合成：(R,E)-5-(5-(2-(2-(3-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1- 基)嘧啶-5-基)乙烯基)吡啶-2-基)噁唑
在室温下，向36-1(120 mg, 0.302 mmol)在1,4-二噁烷(2 mL)中的搅拌溶液中加入DIPEA (0.158 mL, 0.906 mmol)和36-2(62.4 mg, 0.362 mmol)。用氩气对反应混合物脱气20 min。然后在室温下，向反应混合物中加入氯[(三叔丁膦)-2-(2-氨基联苯基)]钯(II) (15.48 mg, 0.030 mmol)。将反应混合物在氮气氛围下于100℃在密封管中搅拌4 h。用水(20 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 20 mL)萃取。合并的有机层用盐水(20 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过biotage经40 g硅胶(230-400目)柱纯化，并用3% MeOH / DCM梯度洗脱化合物。减压浓缩纯馏分以得到36。M/Z (ESI):489.36 [M+H]+。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ (ppm) 8.76 (d,J= 1.6 Hz, 1H), 8.69 (s,2H), 8.54 (s, 1H), 8.41 (d,J= 4.4 Hz, 2H), 8.11 (dd,J= 8.4 Hz, 2.0 Hz, 1H),7.74-7.82 (m, 2H), 7.28 (q,J= 14.8 Hz, 2H), 6.68 (t,J= 4.8 Hz, 1H), 4.88-4.93(m, 1H), 4.82 (d,J= 13.6 Hz, 1H), 4.49-4.60 (m, 3H), 4.37-4.41 (m, 1H), 3.62-3.68 (m, 1H), 3.45-3.60 (m, 3H), 3.13-3.30 (m, 3H)。
实施例37
(R,E)-5-(2-(6-(1-(2-氟乙基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)乙烯基)-2-(3-(甲氧基甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶
37-1的合成：(R)-2-(3-(甲氧基甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)-5-乙烯基嘧啶
在室温下，向Int C(10 g, 27.4 mmol)在1,4-二噁烷(100 mL)中的搅拌溶液中加入水(20 mL)、Cs2CO3(17.84 g, 54.8 mmol)和乙烯基三氟硼酸钾(7.33 g, 54.8 mmol)并用氩气对反应混合物脱气15 min。然后在室温下，向反应混合物中加入PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(2.236 g, 2.74 mmol)。将反应混合物在氮气氛围下于100℃在密封管中搅拌16 h。用水(200 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 200 mL)萃取。合并的有机层用盐水(200mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物经硅胶柱纯化，并用30% EtOAc /石油醚梯度洗脱化合物。减压浓缩纯馏分以得到37-1。M/Z (ESI): 313.38 [M+H]+。
37-2的合成：(R,E)-5-(2-(6-溴吡啶-3-基)乙烯基)-2-(3-(甲氧基甲基)-4-(嘧 啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶
在室温下，向37-1(4 g, 12.81 mmol)在1,4-二噁烷(50 mL)中的搅拌溶液中加入DIPEA (6.71 mL, 38.4 mmol)和2-溴-5-碘吡啶(18.18 g, 64.0 mmol)并用氩气对反应混合物脱气15 min。然后在室温下添加tBu X-phos Pd G3 (1.017 g, 1.281 mmol)。将反应混合物在氮气氛围下于120℃在密封管中搅拌16 h。用水(50 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 200 mL)萃取。合并的有机层用盐水(50 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物经硅胶柱纯化，并用30% EtOAc /石油醚梯度洗脱化合物。减压浓缩纯馏分并通过Prep-HPLC纯化进一步再纯化得到的化合物。减压浓缩纯馏分并冻干以得到37-2。M/Z (ESI): 516.30 [M+H]+。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ (ppm) 8.67 (s, 2H), 8.48 (d,J= 2.4 Hz,1H), 8.40 (d,J= 4.8 Hz, 2H), 7.83 (d,J= 8.0 Hz, 1H), 7.71 (dd,J= 8.4 Hz, 2.4Hz, 1H), 7.28 (d,J= 16.4 Hz, 1H), 7.14 (d,J= 16.4 Hz, 1H), 6.67 (t,J= 4.8 Hz,1H), 4.89-4.96 (m, 1H), 4.78 (d,J= 13.2 Hz, 1H), 4.49-4.60 (m, 2H), 3.35-3.45(m, 2H), 3.26 (d,J= 4.0 Hz, 1H), 3.11-3.25 (m, 5H)。
37的合成：(R,E)-5-(2-(6-(1-(2-氟乙基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)乙烯基)- 2-(3-(甲氧基甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶
在室温下，向37-2(100 mg, 0.214 mmol)和1-(2-氟乙基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(61.5 mg, 0.256 mmol)在1,4-二噁烷(1 mL)和H2O (0.2 mL)中的搅拌溶液中加入磷酸三钾(136 mg, 0.641 mmol)。将反应混合物脱气并用氩气鼓泡5 min。然后在室温下，向反应混合物中加入PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(17.44mg, 0.021 mmol)。将反应混合物在氮气氛围下于80℃在密封管中搅拌2 h。用水(10 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 20 mL)萃取。合并的有机层用盐水(10 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过制备型HPLC纯化。合并纯馏分并冻干以得到37。M/Z (ESI): 502.41 [M+H]+。
制备型HPLC纯化条件:
流动相-10mM碳酸氢铵水溶液：MeCN柱-X-Bridge C18 (19X150), 5µ 流速-15.0ml/min 梯度方法0/40, 7/50, 9/56, 9.1/100, 11.9/100, 12/40, 15/40。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8.68 (s, 2H), 8.62 (d,J= 1.6 Hz, 1H),8.41 (d,J= 4.6 Hz, 2H), 8.38 - 8.36 (m, 1H), 8.08 (s, 1H), 7.99 (dd,J= 8.4Hz, 2.3 Hz, 1H), 7.68 (d,J= 8.1 Hz, 1H), 7.20 (s, 2H), 6.67 (t,J= 4.7 Hz,1H), 4.95 - 4.85 (m, 2H), 4.82 - 4.73 (m, 2H), 4.58 - 4.50 (m, 3H), 4.45 (t,J= 4.7 Hz, 1H), 3.45 - 3.35 (m, 2H), 3.30 - 3.23 (m, 2H), 3.23 - 3.20 (m, 3H),3.19 - 3.15 (m, 1H)。
实施例38
(R,E)-5-(5-(2-(2-(3-((2-(2-氟乙氧基)乙氧基)甲基)-4-(1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶-5-基)乙烯基)吡啶-2-基)噁唑
38-3的合成：(R)-4-(4,6-二氯-1,3,5-三嗪-2-基)-3-(羟甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁 酯
在-45℃下，向(R)-3-(羟甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(38-1) (30 g, 139 mmol)在DCM (800 mL)中的搅拌溶液中加入DIPEA (72.7 mL, 416 mmol)并持续搅拌15 min。然后在-45℃下，向该反应混合物中加入2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪(38-2) (38.4 g, 208 mmol)。该反应混合物在-45℃下搅拌20 min。反应混合物用水(500 mL)稀释并用EtOAc (3 x 200mL)。合并的有机层用水(2 x 200 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩以得到38-3。M/Z(ESI): 364.19 [M+H]+。
38-4的合成：(R)-3-(羟甲基)-4-(1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在室温下，向38-3(20 g, 54.9 mmol)在EtOH (500 mL)中的搅拌溶液中加入醋酸钠(4.50 g, 54.9 mmol)和10% Pd-C (5.84 g, 27.5 mmol)。将反应混合物脱气并通入氮气鼓泡3次。将反应混合物在60 psi H2气压下于25℃下搅拌16 h。反应混合物通过硅藻土垫过滤，用EtOAc (500 mL)洗涤并减压浓缩以得到38-4。M/Z (ESI): 296.34 [M+H]+。
38-5的合成：(R)-(1-(1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-2-基)甲醇盐酸盐
在0 ℃下，向38-4(15 g, 50.8 mmol)在DCM (200 mL)中的搅拌溶液中加入HCl的1,4-二噁烷(6.03 mL, 50.8 mmol)溶液。将反应混合物在25℃下搅拌16 h。减压浓缩该反应混合物。将粗化合物用乙醚(2 x 50 mL)研制并减压干燥以得到38-5。M/Z (ESI):196.13 [M+H]+。
38-6的合成：(R)-(4-(5-碘嘧啶-2-基)-1-(1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-2-基)甲醇
在室温下，向38-5(9.5 g, 41.0 mmol)在DMF (200 mL)中的搅拌溶液中加入2-氯-5-碘嘧啶(11.83 g, 49.2 mmol)和K2CO3(17.00 g, 123 mmol)。将反应混合物在80℃下搅拌16 h。用水(200 mL)并用EtOAc (3 x 150 mL) 淬灭反应混合物。合并的有机层经Na2SO4干燥并减压浓缩。粗化合物经300 g (100-200目)硅胶柱纯化，并用50% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩以得到38-6。M/Z (ESI): 400.22 [M+H]+。
38-7的合成：(R)-2-(2-((2,2-二甲氧基乙氧基)甲基)-4-(5-碘嘧啶-2-基)哌嗪- 1-基)-1,3,5-三嗪
在0 ℃下，向38-6(2 g, 5.01 mmol)在DMF (30 mL)中的搅拌溶液中加入油中60%NaH (0.401 g, 10.02 mmol)。将反应混合物在0 ℃下搅拌30 min。然后在0℃下，向该反应混合物中加入2-溴-1,1-二甲氧基乙烷(3.39 g, 20.04 mmol)。将反应混合物在50℃下搅拌12 h。用水(100 mL)稀释反应混合物并用EtOAc (3 x 100 mL)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并减压浓缩。粗化合物经100 g (100-200目)硅胶纯化，并用25% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩以得到38-7。M/Z (ESI): 488.29 [M+H]+。
38-8的合成：(R)-2-((4-(5-碘嘧啶-2-基)-1-(1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-2-基)甲 氧基)乙醛
在0℃下，向38-7(1.9 g, 3.90 mmol)在1,4二噁烷(30 mL)中的搅拌溶液中加入50% HCl水溶液(1.281 mL, 15.60 mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌2 h。用饱和NaHCO3水溶液(100 mL)稀释反应混合物并用EtOAc (3 x 100 mL)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并减压浓缩以得到38-8。M/Z (ESI): 442.22 [M+H]+。
38-9的合成：(R)-2-((4-(5-碘嘧啶-2-基)-1-(1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-2-基)甲 氧基)乙-1-醇
在0℃下，向38-8(1.2 g, 2.72 mmol)在MeOH (20 mL)中的搅拌溶液中加入NaBH4(0.206 g, 5.44 mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌1 h。减压浓缩反应混合物并用水(100mL)稀释。水层用EtOAc (3 x 150 mL)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并减压浓缩以得到38-9。M/Z (ESI): 444.29 [M+H]+。
38-10的合成：(R,E)-2-((4-(5-(2-(6-(噁唑-5-基)吡啶-3-基)乙烯基)嘧啶-2- 基)-1-(1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-2-基)甲氧基)乙-1-醇
向38-9(500 mg, 1.128 mmol)在DMF (8 mL)中的搅拌溶液中通入氩气鼓泡10min。然后在室温下，向该反应混合物中加入36-2(233 mg, 1.354 mmol)、DIPEA (0.591mL, 3.38 mmol)和氯[(三叔丁基膦)-2-(2-氨基联苯基)]钯(II) (57.8 mg, 0.113mmol)。将反应混合物再次通入氩气再鼓泡10 min。将反应混合物在80℃下搅拌12 h。用水(300 mL)稀释反应混合物并用EtOAc (3 x 150 mL)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并减压浓缩。粗化合物经100 g (100-200目)硅胶柱纯化，并用8% MeOH/DCM洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩以得到38-10。M/Z (ESI): 488.36 [M+H]+。
38的合成：(R,E)-5-(5-(2-(2-(3-((2-(2-氟乙氧基)乙氧基)甲基)-4-(1,3,5-三 嗪-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶-5-基)乙烯基)吡啶-2-基)噁唑
在0℃下，向38-10(350 mg, 0.718 mmol)在DMF (4 mL)中的搅拌溶液中加入油中60% NaH (57.4 mg, 1.436 mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌30 min。然后在0℃下，向该反应混合物中加入1-氟-2-碘乙烷(500 mg, 2.87 mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌12h。用水(200 mL)稀释反应混合物并用EtOAc (3 x 180 mL)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并减压浓缩。粗化合物经制备型HPLC纯化。合并纯馏分并冻干以得到38。M/Z (ESI):534.31 [M+H]+。
纯化:制备型HPLC方法。
流动相-10mM碳酸氢铵水溶液:MeCN
柱-Princetonsphere (21.2x250) mm, 5µ 流速-19.0 ml/min/
梯度方法-0/40, 8/45, 14/45, 14.05/100, 17/100, 17.05/40, 20/40.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8.76 (d,J= 1.8 Hz, 1H), 8.70 (s, 2H),8.64 (s, 2H), 8.54 (s, 1H), 8.11 (dd,J= 2.1, 8.4 Hz, 1H), 7.83 - 7.76 (m,2H), 7.35 - 7.22 (m, 2H), 5.02 - 4.96 (m, 1H), 4.83 - 4.77 (m, 1H), 4.65 -4.38 (m, 4H), 3.63 - 3.44 (m, 8H), 3.35 - 3.33 (m, 1H), 3.30 (br s, 1H), 3.21- 3.14 (m, 1H)。
实施例39-A和39-B
1-((2-((R)-4-(5-((E)-2-(6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)嘧啶-2-基)-2-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)嘧啶-5-基)氧基)-3-氟丙-2-醇
39-2的合成：(R)-2-氯-5-(环氧丙烷-2-基甲氧基)嘧啶
在室温下，向2-氯嘧啶-5-醇(2.0 g, 15.32 mmol)在DMF (20 mL)中的搅拌溶液中在氮气氛围中加入碳酸铯(7.49 g, 22.98 mmol)和(R)-2-(氯甲基)环氧乙烷(7.09 g,77 mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌18 h。减压浓缩反应混合物并用10% MeOH: DCM (20mL)稀释并过滤。减压浓缩反应混合物。粗化合物通过biotage柱色谱经25 g硅胶柱纯化，并用10% MeOH/DCM梯度洗脱化合物。减压浓缩纯馏分以得到39-2。M/Z (ESI): 186.96 [M+H]+。
39-3的合成：1-((2-氯嘧啶-5-基)氧基)-3-氟丙-2-醇
在室温下，向39-2(900 mg, 4.82 mmol)中加入三乙胺三氢氟酸盐(3 mL, 4.82mmol)。将反应混合物在80℃下搅拌18 h。将反应混合物冷却至室温。将反应混合物用饱和NaHCO3溶液(PH~8)碱化，并用EtOAc (100 mL)萃取。合并的有机层用水(100 mL)洗涤并经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过biotage柱色谱经25 g硅胶(230-400目)柱纯化并用40% EtOAc/石油醚梯度洗脱化合物。减压浓缩纯馏分以得到39-3。M/Z (ESI): 207.02[M+H]+。
39-4的合成：2-氯-5-(3-氟-2-(甲氧基甲氧基)丙氧基)嘧啶
在0℃下，向39-3(0.3 g, 1.452 mmol)在THF (15 mL)中的搅拌溶液在氮气氛围中加入氢化钠(0.116 g, 2.90 mmol)。然后在0℃下，向该反应混合物中滴加MOM-Cl(0.165 mL, 2.178 mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌1 h。用冰水(20 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (20 mL)萃取。合并的有机层用水(20 mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过biotage柱色谱经25 g硅胶柱(100-200目)柱纯化并用40% EtOAc/石油醚梯度洗脱化合物。减压浓缩纯馏分得到39-4。M/Z (ESI): 251.03 [M+H]+。
39-5的合成：5-((E)-2-(6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)-2-((3R)-4-(5- (3-氟-2-(甲氧基甲氧基)丙氧基)嘧啶-2-基)-3-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)嘧啶
在室温下，向(R,E)-5-(2-(6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)-2-(3-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)嘧啶(Int E) (140 mg, 0.371 mmol)和39-4(307 mg, 1.224 mmol)在1,4-二噁烷(10 mL)中的搅拌溶液中加入叔丁醇钠(143 mg, 1.484 mmol)并用氮气脱气2min。然后在室温下，在氮气氛围中向该反应混合物中加入氯(2-环己基膦-2',6'-二异丙氧基-1,1'-联苯基)[2-(2'-氨基-1,1'-联苯基)]钯(II) (28.8 mg, 0.037 mmol)。将反应混合物在微波辐射下于150℃搅拌3 h。用水(10 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 10 mL)萃取。合并的有机层用水(20 mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过biotage柱色谱经12 g硅胶(100-200目)柱纯化并用10% MeOH/DCM梯度洗脱化合物。减压浓缩纯馏分并用乙醚(10 mL)洗涤得到的化合物以得到39-5。M/Z (ESI): 592.45 [M+H]+。
39-A和39-B的合成：1-((2-((R)-4-(5-((E)-2-(6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙 烯基)嘧啶-2-基)-2-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)嘧啶-5-基)氧基)-3-氟丙-2-醇
在0℃下，向39-5(40 mg, 0.068 mmol)在DCM (10 mL)中的搅拌溶液里在氮气氛围中加入1,4-二噁烷盐酸盐(0.017 mL, 0.068 mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌3 h。减压浓缩反应混合物。粗化合物通过SFC纯化。减压浓缩纯馏分并分别冻干以得到39-A峰-1和39-B峰-2。M/Z (ESI): 548.37 [M+H]+。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ (ppm) 8.68 (s, 2H), 8.54-8.63 (m, 2H),8.26 (s, 2H), 8.20-8.25 (m, 1H), 8.01-8.13 (m, 1H), 7.98 (s, 1H), 7.84 (d,J=8.8 Hz, 1H), 7.21-7.33 (m, 2H), 7.13 (s, 1H), 6.52 (s, 5H), 5.45 (d,J= 4.8Hz, 1H), 4.79 (d,J= 11.2 Hz, 2H), 4.35-4.60 (m, 4H), 3.92-4.08 (m, 2H), 3.38-3.42 (m, 2H), 3.21-3.28 (m, 1H), 3.10-3.21 (m, 3H)。
分析型NP-HPLC条件:
柱/尺寸: Chiralpak IA (250X4.6X5µ)
流动相: 甲醇:DCM:DIPA(80:20:0.2%)
流速: 0.5 mL/min
温度: 环境
波长: 340 nm
制备NP-HPLC条件
柱/尺寸: Chiralpak IA (250X10X5µ)
流动相: 甲醇: DCM: DIPA(80:20:0.2%)
流速: 3.0 mL/min
实施例40
(R,E)-2-(3-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)-5-(2-(6-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)嘧啶
40-1的合成：5-溴-2-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)吡啶
在室温下，向5-溴-2-氟吡啶(1 g, 5.68 mmol)在DMF (20 mL)中的搅拌溶液中加入碳酸钾(2.356 g, 17.05 mmol)和4-甲基-1H-咪唑。将反应混合物在80℃下搅拌16 h。反应混合物用冰水(50 mL)淬灭，通过布氏漏斗过滤固体并减压干燥得到40-1。M/Z (ESI):237.98 [M+H]+。
40-2的合成：2-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)-5-乙烯基吡啶
将40-1(1 g, 4.20 mmol)在1,4-二噁烷(10 mL)和水(10 mL)中的搅拌溶液脱气并通入氩气鼓泡。然后在室温下，向该脱气的搅拌溶液中加入磷酸三钾(2.67 g, 12.60mmol)、乙烯基三氟硼酸钾(1.125 g, 8.40 mmol)和[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(II) (0.154 g, 0.210 mmol)。将反应混合物在100℃下搅拌16 h。用冰水(10 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 10 mL)萃取。合并的有机层用盐水(10 mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过(100-200目)硅胶柱纯化并用100% EtOAc洗脱化合物。减压浓缩纯馏分得到40-2。M/Z (ESI): 186.02 [M+H]+。
40-3的合成：(R)-5-溴-2-(3-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧 啶
在室温下，向int B(1 g, 2.85 mmol)在THF (10 mL)中的搅拌溶液中加入1-氟-2-碘乙烷(0.381 mL, 5.69 mmol)和氢化钠(0.273 g, 11.39 mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌16 h。用冰水(10 mL)淬灭反应混合物并将水层用EtOAc (3 x 20 mL)萃取。合并的有机层用盐水(10 mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过(100-200目)硅胶柱纯化并用50% EtOAc/石油醚洗脱化合物。减压浓缩纯馏分得到40-3。M/Z (ESI):399.13 [(M+2)+H]+。
40的合成：(R,E)-2-(3-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)-5-(2- (6-(4-甲基-1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)嘧啶
将40-2(200 mg, 1.080 mmol)在1,4-二噁烷(5 mL)中的搅拌溶液脱气并用氩气鼓泡。然后在室温下，向该反应混合物中加入N,N-二异丙基乙胺(0.581 mL, 3.24 mmol)、40-3(214 mg, 0.540 mmol)和氯[(三叔丁基膦)-2-(2-氨基联苯基)]钯(II) (27.7 mg,0.054 mmol)。将反应混合物在微波炉中于150℃搅拌16 h。用冰水(10 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (3 x 5 mL)萃取。合并的有机层用盐水(10 mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过制备型HPLC纯化。减压浓缩纯馏分并冻干得到40。M/Z (ESI):502.39 [M+H]+。
制备型HPLC条件
仪器ID ANL-MCL-5-PREP-021
柱名称 X-SELECT C18 (19250)mm 5μ
柱编号 X-SELECT C18 (19250)mm 5μ
流动相A 10mM 碳酸氢铵水溶液
流动相B 乙腈
梯度程序(T/%B) 0/50, 2/50, 11/74, 11.1/100, 13/100, 13.,/50, 16/50
流速(mL/分钟) 19
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8.67 (s, 2H), 8.57 - 8.56 (m, 1H), 8.45- 8.38 (m, 3H), 8.19 (dd,J= 8.8 Hz, 2.3 Hz, 1H), 7.77 (d,J= 8.6 Hz, 1H), 7.67(s, 1H), 7.25 (d,J= 2.4 Hz, 2H), 6.68 (t,J= 4.7 Hz, 1H), 4.94 - 4.87 (m, 1H),4.86 - 4.79 (m, 1H), 4.59 - 4.39 (m, 4H), 3.67 - 3.47 (m, 4H), 3.30 - 3.12(m, 3H), 2.20 - 2.15 (m, 3H)。
实施例41
(R,E)-5-(5-(2-(2-(3-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶-5-基)乙烯基)吡啶-2-基)噁唑
41-1的合成：(R)-2-(2-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(5-碘嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)-1, 3,5-三嗪
在0℃下，向38-6(1.00 g, 2.51 mmol)在DMF (10 mL)中的搅拌溶液中加入油中60% NaH (301 mg, 7.52 mmol)和1-氟-2-碘乙烷(872 mg, 2 Eq, 5.01 mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌16 h。用水(20 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 50 mL)萃取。合并的有机层用盐水(20 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤，并减压浓缩。粗化合物通过Biotage经硅胶柱纯化并用40% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到41-1。M/Z(ESI): 446.19 [M+H]+。
41的合成：(R,E)-5-(5-(2-(2-(3-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(1,3,5-三嗪-2-基)哌 嗪-1-基)嘧啶-5-基)乙烯基)吡啶-2-基)噁唑
向41-1(80 mg, 0.151 mmol)在ACN (1 mL)中的搅拌溶液中通入氩气鼓泡10min。然后在室温下，向该搅拌溶液中加入36-2(51.9 mg, 0.301 mmol)、DIPEA (0.105 mL,0.603 mmol)和氯(2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯基)[2-(2'-氨基-1,1'-联苯基)]钯(II) (15.81 mg, 0.02 mmol)并再次通入氩气再鼓泡10 min。将反应混合物在100℃搅拌12 h。用水(80 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (3 x 80 mL)萃取。合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过制备型HPLC(条件:流动相-10mM碳酸氢铵水溶液: MeCN 柱-X-Bridge C18 (19X250) 流速-18.0 ml/min 梯度方法-0/30,7/42, 12.44.5, 12.05/100, 14/100, 14.05/30, 17/30)纯化。减压浓缩纯馏分并冻干得到41。M/Z (ESI): 490.42 [M+H]+。
1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz): δ (ppm) 8.76-8.75 (m, 1H), 8.70 (s, 2H),8.64 (m, 2H), 8.54 (s, 1H), 8.11 (dd,J= 8.4Hz, 2.4Hz, 1H), 7.80-7.77 (m, 2H),7.34-7.23 (m, 2H), 4.99-4.98 (m, 1H), 4.81 (d,J= 13.6 Hz, 1H), 4.62-4.56 (m,2H), 4.50-4.36 (m, 2H), 3.66-3.64 (m, 1H), 3.58-3.56 (m, 3H), 3.34 (m, 1H),3.27-3.26 (m, 1H), 3.20-3.17 (m, 1H)。
实施例42
(R,E)-5-(5-(2-(2-(3-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)嘧啶-5-基)乙烯基)吡啶-2-基)噁唑
42-2的合成：(R)-3-(羟甲基)-4-(嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在室温下，向42-1(2 g, 6.08 mmol)在MeOH (11 mL)和THF (11 mL)中的搅拌溶液中加入醋酸钠(0.998 g, 12.17 mmol)。然后在室温下向该反应混合物中加入10% Pd/C(0.647 g, 6.08 mmol)。将反应混合物在氢氛围下于25℃搅拌16 h。用冰水(10 mL)淬灭反应混合物并通过布氏漏斗过滤固体。在真空下干燥过滤的固体。粗化合物通过Biotage快速柱色谱经(100-200目)硅胶柱纯化并用10% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到42-2。M/Z (ESI): 295.11 [M+H]+。
42-3的合成：(R)-(1-(嘧啶-4-基)哌嗪-2-基)甲醇
在室温下，向42-2(1.5 g, 5.10 mmol)在DCM (20 mL)中的搅拌溶液中加入4MHCl的1,4-二噁烷(1.209 mL, 10.19 mmol)溶液。将反应混合物在25℃下搅拌4 h。减压浓缩反应混合物并用甲苯冷蒸馏。用戊烷(5 mL)研制粗化合物并减压干燥得到42-3。M/Z(ESI): 195.10 [M+H]+。
42-5的合成：(R)-(4-(5-碘嘧啶-2-基)-1-(嘧啶-4-基)哌嗪-2-基)甲醇
在室温下，向42-3(1 g, 5.15 mmol)在DMF (25 mL)中的搅拌溶液中加入碳酸钾(3.56 g, 25.7 mmol)和2-氯-5-碘嘧啶(42-4) (1.238 g, 5.15 mmol)。将反应混合物在80℃下搅拌16 h。用冰水(20 mL)淬灭反应混合物并通过乙酸乙酯(3 x 20 mL)萃取。合并的有机层用盐水(10 mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage快速柱色谱用(100-200目)硅胶柱纯化并用50% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到42-5。M/Z (ESI): 399.13 [M+H]+。
42-6的合成：(R)-2-(3-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-5-碘嘧 啶
在室温下，向42-5(5060079-0374-002) (500 mg, 1.256 mmol)在THF (5 mL)中的搅拌溶液中加入1-氟-2-碘乙烷(0.126 mL, 1.883 mmol) 和氢化钠(90 mg, 3.77mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌16 h。用冰水(10 mL)淬灭反应混合物并通过乙酸乙酯(3 x 20 mL)萃取。合并的有机层用盐水(10 mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用(100-200目)硅胶柱纯化并用50% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到42-6。M/Z (ESI): 445.12 [M+H]+。
42的合成：(R,E)-5-(5-(2-(2-(3-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(嘧啶-4-基)哌嗪-1- 基)嘧啶-5-基)乙烯基)吡啶-2-基)噁唑
将42-6(100 mg, 0.225 mmol)在1,4-二噁烷(1 mL)中的搅拌溶液脱气并通入氩气鼓泡。然后在室温下，向该反应混合物中加入N,N-二异丙基乙胺(0.121 mL, 0.675mmol)、5-(5-乙烯基吡啶-2-基)噁唑(36-2) (46.5 mg, 0.270 mmol)和氯[(三叔丁基膦)-2-(2-氨基联苯基)]钯(II) (11.53 mg, 0.023 mmol)。将反应混合物在100℃下搅拌16 h。用冰水(10 mL)淬灭反应混合物并用乙酸乙酯(3 x 10 mL)萃取。合并的有机层用盐水(5mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过制备型HPLC纯化。合并纯馏分并冻干得到42。M/Z (ESI): 489.34 [M+H]+。
制备型HPLC纯化条件:
流动相-10mM碳酸氢铵水溶液:MeCN
柱-LUNA C18 (21.2X250) mm 5um 流速-18ml/min.
梯度:_0/38,2/38,15/40,16/40.3,16.05/100,18.0/100,18.05/38,21.0/38。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8.76 (d,J= 1.8 Hz, 1H), 8.70 (s, 2H),8.54 (s, 2H), 8.22 (d,J= 6.3 Hz, 1H), 8.11 (dd,J= 8.4 Hz, 2.1 Hz, 1H), 7.82 -7.77 (m, 2H), 7.34 - 7.22 (m, 2H), 6.88 - 6.86 (m, 1H), 4.79 - 4.48 (m, 4H),4.37 (br d,J= 4.1 Hz, 2H), 3.67 - 3.51 (m, 4H), 3.40 - 3.36 (m, 1H), 3.29 -3.22 (m, 2H)。
实施例43
(R,E)-2-(2-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(5-(2-(2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-5-基)乙烯基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪
43-2的合成：5-溴-2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)嘧啶
在室温下，向2,5-二溴嘧啶(43-1) (5 g, 21.02 mmol)在1,4-二噁烷(50 mL)和水(10 mL)中的搅拌溶液中加入1-甲基-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(5.25 g, 25.2 mmol)和碳酸钾(8.71 g, 63.1 mmol)。将反应混合物脱气并通入氩气鼓泡10 min。然后在室温下，向该反应混合物中加入四(三苯基膦)钯(0) (2.429g, 2.102 mmol)。将反应混合物在110℃下搅拌12 h。用水(50 mL)稀释反应混合物并用EtOAc (2 x 50 mL)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，减压浓缩。粗化合物通过硅胶柱色谱纯化并用20% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到43-2。M/Z (ESI):239.01 [M+H]+。
43-3的合成：2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-乙烯基嘧啶
在室温下，向43-2(1.00 g, 4.18 mmol)在1,4-二噁烷(10 mL)和水(10 mL)中的搅拌溶液中加入三氟(乙烯基)-4-硼烷、钾盐(1.12 g, 8.37 mmol)和三磷酸钾(2.66 g,12.5 mmol)并在室温下用氩气脱气5 min。然后在室温下，向该反应混合物中加入PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(342 mg, 418 μmol)。将反应混合物在100℃下搅拌16 h。用水(20mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 30 mL)萃取。合并的有机层用盐水(10 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用硅胶柱纯化并用30% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到43-3。M/Z (ESI): 187.00 [M+H]+。
43的合成：(R,E)-2-(2-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(5-(2-(2-(1-甲基-1H-吡唑-4- 基)嘧啶-5-基)乙烯基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪
在室温下，向41-1(100 mg, 225 μmol)和43-3(50.2 mg, 270 μmol)在1,4-二噁烷(2 mL)中的搅拌溶液中加入DIPEA (117 μL, 674 μmol)并在室温下用氩气脱气5 min。然后在室温下，向该反应混合物中加入氯(三叔丁基膦)(2'-氨基-1,1'-联苯基-2-基)钯(II) (11.5 mg, 22.5 μmol)并再次在室温下用氩气脱气5 min。将反应混合物在100℃下搅拌16 h。用水(10 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 20 mL)萃取。合并的有机层用盐水(10 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过制备型HPLC纯化(条件:流动相–10mM碳酸氢铵水溶液:MeCN 柱–X-Bridge C18 (19X250) mm, 5µ 流速-15.0 ml/min 梯度方法:-0/28,2/28,11/59.4,11.05/100,13/100,13.05/28,16/28)。合并纯馏分，减压浓缩并冻干得到43。M/Z (ESI): 504.39 [M+H]+。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 8.91 (s, 2H), 8.68 (s, 2H), 8.64(s, 2H), 8.38 (s, 1H), 8.03 (d,J= 0.4 Hz, 1H), 7.32 (d,J= 16.8 Hz, 1H), 7.16(d,J= 16.4 Hz, 1H), 4.95-5.04 (m, 1H), 4.81 (d,J= 13.6 Hz, 1H), 4.55-4.67 (m,2H), 4.33-4.52 (m, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.63-3.69 (m, 1H), 3.58 (dd,J= 6.6 Hz,3.0 Hz ,3H), 3.33-3.36 (m, 1H), 3.25-3.30 (m, 1H), 3.14-3.23 (m, 1H)。
实施例44
(R)-2-(2-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(5-((2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-5-基)乙炔基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪
44-1的合成：2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)-5-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)嘧啶
在室温下，向43-2(2 g, 8.37 mmol)在ACN (24 mL)中的搅拌溶液中加入DIPEA(4.38 mL, 25.10 mmol)。将该反应混合物脱气并通入氩气鼓泡15 min。然后在室温下，向该反应混合物中加入乙炔基三甲基硅烷(1.786 mL, 12.55 mmol)和XPhos Pd G2 (0.658g, 0.837 mmol)。将反应混合物在密封管中在氮气氛围下于80℃搅拌16 h。用水(10 mL)稀释反应混合物并用EtOAc (2 x 30 mL)萃取。合并的有机层用盐水(10 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过biotage用40 g (230-400目)硅胶柱纯化并用30% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到44-1。M/Z (ESI): 257.23 [M+H]+。
44的合成：(R)-2-(2-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(5-((2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)嘧 啶-5-基)乙炔基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪
在室温下，向41-1(100 mg, 0.225 mmol)在DMF (1 mL)中的搅拌溶液中加入44-1(63.3 mg, 0.247 mmol)和碳酸钾(93 mg, 0.674 mmol)。将该反应混合物脱气并通入氩气鼓泡15 min。然后在室温下，向该反应混合物中加入X-Phos Pd G2 (17.67 mg, 0.022mmol)。将反应混合物在密封管中在氮气氛围下于80℃搅拌16 h。用水(10 mL)稀释反应混合物并用EtOAc (2 x 30 mL)萃取。合并的有机层用盐水(10 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过制备型HPLC纯化(方法:流动相-10mM碳酸氢铵水溶液:MeCN柱-YMC HYDROSPHER C18(20250)mm, 5µ 流速-18.0 ml/min 梯度方法0/45,10.5/66,10.51/100,13/100,13.1/45,16/45)。合并纯馏分并冻干得到44。M/Z (ESI): 502.35 [M+H]+。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8.89 (s, 2H), 8.63 (d,J= 4.4 Hz, 4H),8.42 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 4.98-4.96 (m, 1H), 4.80 (d,J= 13.6 Hz, 1H), 4.59-4.55 (m, 2H), 4.44 (dt,J= 4, 8.0 Hz, 2H), 3.92 (s, 3H), 3.65-3.55 (m, 4H),3.40-3.36 (m, 1H), 3.29-3.20 (m, 2H)。
实施例45
(R)-5-((6-(4H-1,2,4-三唑-4-基)吡啶-3-基)乙炔基)-2-(4-(6-氟嘧啶-4-基)-3-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)嘧啶
45-2的合成：(R)-4-(6-氟嘧啶-4-基)-3-(羟甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在室温下，向(R)-3-(羟甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(5 g, 23.12 mmol)在DMF (80mL)中的搅拌溶液中加入4,6-二氟嘧啶(3.22 g, 27.7 mmol)和DIPEA (12.11 mL, 69.4mmol)。将反应混合物在氩气氛围下于70℃搅拌16 h。用水(70 mL)稀释反应混合物并用EtOAc (3 x 70 mL)萃取。合并的有机层用盐水(70 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩。粗化合物通过biotage用120 g (230-400目)硅胶柱纯化并用35% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到45-2。M/Z (ESI): 313.31 [M+H]+。
45-3的合成：(R)-4-(6-氟嘧啶-4-基)-3-(甲氧基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在0℃下，向45-2(5.5 g, 17.61 mmol)在DMF (70 mL)中的搅拌溶液中加入碘甲烷(2.202 mL, 35.2 mmol)。然后在0℃下，向该反应混合物中分批加入NaH (1.056 g,26.4 mmol)。将反应混合物在氩气氛围下于25℃搅拌3 h。用水(100 mL)稀释反应混合物并用EtOAc (2 x 100 mL)萃取。合并的有机层用盐水(100 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过硅胶柱色谱纯化并用15% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到45-3。M/Z (ESI): 327.34 [M+H]+。
45-4的合成：(R)-4-氟-6-(2-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)嘧啶
在室温下，向45-3(4.5 g, 13.79 mmol)在DCM (60 mL)中的搅拌溶液中加入4MHCl (17.23 mL, 68.9 mmol)的1,4-二噁烷溶液。将反应混合物在氩气氛围下于25℃搅拌16 h。减压浓缩反应混合物得到45-4。M/Z (ESI): 227.13 [M+H]+。
45-5的合成：(R)-2-(4-(6-氟嘧啶-4-基)-3-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)-5-碘嘧啶
在室温下，向45-4(4.5 g, 17.13 mmol)在DMF (70 mL)中的搅拌溶液中加入2-氯-5-碘嘧啶(4.53 g, 18.84 mmol)和DIPEA (14.96 mL, 86 mmol)。将反应混合物在氩气氛围下于50℃搅拌16 h。用水(200 mL)稀释反应混合物。在室温下搅拌10 min，出现沉淀。然后将固体过滤，真空干燥。粗化合物通过biotage用120 g (230-400目)硅胶纯化并用35%EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到45-5。M/Z (ESI): 431.14 [M+H]+。
45的合成：(R)-5-((6-(4H-1,2,4-三唑-4-基)吡啶-3-基)乙炔基)-2-(4-(6-氟嘧 啶-4-基)-3-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)嘧啶
在室温下，向45-5(200 mg, 0.465 mmol)在DMF (2 mL)中的搅拌溶液中加入45-6(135 mg, 0.558 mmol)、K2CO3(193 mg, 1.395 mmol)和碘化铜(i) (9 mg, 0.047 mmol)。将反应混合物脱气并通入氩气鼓泡10 min。然后在室温向该反应混合物中加入davephosG2 palladacycle (33 mg, 0.047 mmol)。将反应混合物在密封管中于80℃搅拌2 h。用冷水(10 mL)稀释反应混合物，通过硅藻土垫过滤，用DCM (20 mL)洗涤，并将有机层放置一旁。然后用DCM (2 x 20 mL)萃取水层。合并的有机层用盐水(20 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥并减压浓缩。粗化合物用乙醚(10 mL)研制并通过制备型HPLC纯化化合物。合并纯馏分并冻干得到45。M/Z (ESI): 437.38 [M+H]+。
制备型HPLC纯化:
X-Bridge C18 PACK：流动相-10mM碳酸氢铵水溶液:MeCN 柱-X-Bridge PACK,C18 (25X250) mm, 5µ 流速-20.0 ml/min 梯度方法-0/35,4/35,10.5/60,10.51/100,13/100,13.05/35,16/35
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 9.34 (s, 2H), 8.71 (d,J= 1.6 Hz, 1H),8.65 (s, 2H), 8.36 (d,J= 2.6 Hz, 1H), 8.25 (dd,J= 2.1, 8.5 Hz, 1H), 7.97 (d,J= 8.5 Hz, 1H), 6.58 (s, 1H), 5.04 - 4.67 (m, 2H), 4.60 - 4.45 (m, 1H), 4.42 -4.11 (m, 1H), 3.36 (br s, 4H), 3.30 - 3.28 (m, 1H), 3.20 (s, 3H)。
实施例46
(R)-2-(4-(5-((2-(1-(2-氟乙基)-1H-吡唑-4-基)嘧啶-5-基)乙炔基)嘧啶-2-基)-2-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三唑
46-2的合成：1-(2-氟乙基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2- 基)-1H-吡唑
在氩气下，在0℃下，向4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(46-1) (5 g, 25.8 mmol)和1-氟-2-碘乙烷(8.96 g, 51.5 mmol)在THF (100 mL)中的搅拌溶液中分批加入NaH (2.061 g, 51.5 mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌24 h。向反应混合物中倾入碎冰水(50 mL)并用EtOAc (2 x 50 mL)萃取。合并的有机层用盐水(100mL)洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过乙醚(10 mL)洗涤并真空干燥得到46-2。M/z (ESI): 241.06 [M+H]+。
46-4的合成：5-溴-2-(1-(2-氟乙基)-1H-吡唑-4-基)嘧啶
在25℃下，向46-2(600 mg, 2.499 mmol)在1,4-二噁烷(15 mL)和水(3 mL)中的搅拌溶液中加入5-溴-2-碘嘧啶(783 mg, 2.75 mmol)。将反应混合物脱气并通入氩气鼓泡10 min。然后在25℃下，向该反应混合物中加入Cs2CO3(2443 mg, 7.50 mmol)和Pd(dppf)Cl2(201 mg, 0.275 mmol)。将反应混合物在130℃下搅拌2 h。用水(20 mL)和EtOAc (20mL)分配反应混合物。有机层经硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用12 g硅胶柱纯化并用50% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到46-4。M/z(ESI): 271.18 [M+H]+。
46-5的合成：2-(1-(2-氟乙基)-1H-吡唑-4-基)-5-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)嘧 啶
将46-4(180 mg, 0.664 mmol)在THF (6 mL)中的搅拌溶液脱气并通入氩气鼓泡5min。然后在25℃下，向该反应混合物中加入XPhos Pd G2 (52.2 mg, 0.066 mmol)、DIPEA(0.348 mL, 1.992 mmol)、碘化铜(i) (12.65 mg, 0.066 mmol)和三甲基硅乙炔(100 mg,1.018 mmol)。将反应混合物在80℃下搅拌12 h。用EtOAc (20 mL)稀释反应混合物并用水(20 mL)洗涤。有机层经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用4 g硅胶柱纯化并用30% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到46-5。M/z(ESI): 289.28 [M+H]+。
46-6的合成：(R)-2-(4-(5-碘嘧啶-2-基)-2-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三 嗪
在0℃下，向38-6(1.00 g, 2.51 mmol)在DMF (20 mL)中的搅拌溶液中加入NaH(90.2 mg, 3.76 mmol)并在0℃下搅拌30 min。然后在0℃下，向该反应混合物中滴加碘甲烷(470 μL, 7.52 mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌16 h。用冷水(50 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 50 mL)萃取。合并的有机层用盐水(100 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用120 g硅胶柱纯化并用15% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到46-6。M/Z (ESI): 414.10 [M+H]+。
46的合成：(R)-2-(4-(5-((2-(1-(2-氟乙基)-1H-吡唑-4-基)嘧啶-5-基)乙炔基) 嘧啶-2-基)-2-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪
在25℃下，向46-6(200 mg, 0.484 mmol)在DMF (4 mL)中的搅拌溶液中加入46-5(100 mg, 0.347 mmol)。将反应混合物脱气并通入氩气鼓泡10 min。然后在25℃下，向该反应混合物中加入K2CO3(201 mg, 1.452 mmol)和davephos g2 palladacycle (34.1 mg,0.048 mmol)。将反应混合物在80℃下搅拌3 h。用EtOAc (10 mL)和水(10 mL)稀释反应混合物并通过硅藻土床过滤。有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用4 g硅胶柱纯化并用70% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩。得到的化合物再次经制备型HPLC纯化。合并纯馏分并冻干得到46。M/z (ESI): 502.29 [M+H]+。
制备型HPLC纯化:
X-Bridge:流动相-10mM碳酸氢铵水溶液:MeCN
柱-X-Bridge, C18 (10X250) mm, 5µ 流速-19.0 ml/min
梯度方法-0/35,2/35,7.0,40,13.0/51,1.1/100,15.9/100,16/35,21/35
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8.91 (s, 2H), 8.74-8.68 (m, 4H), 8.50(s, 1H), 8.13 (s, 1H), 5.02 – 4.97 (m, 1H), 4.89-4.85 (m, 1H), 4.79-4.73 (m,2H), 4.61-4.46 (m, 4H), 3.44 (d,J= 6.8 Hz, 2H), 3.38-3.34 (m, 1H), 3.30-3.18(m, 5H)。
实施例47
(R)-2-(4-(5-((6-(1-(2-氟乙基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)乙炔基)嘧啶-2-基)-2-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪
47-2的合成：2-溴-5-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)吡啶
向2-溴-5-碘吡啶(47-1) (5 g, 17.61 mmol)在THF (75 mL)中的搅拌溶液中通入氩气鼓泡10 min。然后在室温下，向该反应混合物中加入TEA (7.36 mL, 52.8 mmol)、碘化铜(i) (0.168 g, 0.881 mmol)、二氯二(三苯基膦)钯(ii) (1.236 g, 1.761 mmol)和三甲基硅乙炔(1.903 g, 19.37 mmol)并再次通入氩气鼓泡10 min。将反应混合物在80℃下搅拌3 h。用水(200 mL)稀释反应混合物并用EtOAc (3 x 180 mL)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并减压浓缩。粗化合物通过100 g(100-200目)硅胶柱纯化并用20% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到47-2。M/Z (ESI): 254.12 [M+H]+。
47-3的合成：5-乙炔基-2-(1-(2-氟乙基)-1H-吡唑-4-基)吡啶
向47-2(1.2 g, 4.72 mmol)在1,4-二噁烷(12 mL)和水(5 mL)中的搅拌溶液中通入氩气鼓泡10 min。然后在室温下，向该反应混合物中加入1-(2-氟乙基)-4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(0.680 g, 2.83 mmol)、磷酸三钾(3.01g, 14.16 mmol)和[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(II)](0.345 g, 0.472 mmol)并再次通入氩气鼓泡10 min。将反应混合物在100℃下搅拌12 h。用水(100 mL)稀释反应混合物并用EtOAc (3 x 100 mL)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，并减压浓缩。粗化合物通过100 g(100-200目)硅胶柱纯化并用20% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到47-3。M/Z (ESI): 216.23 [M+H]+。
47的合成：(R)-2-(4-(5-((6-(1-(2-氟乙基)-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)乙炔基) 嘧啶-2-基)-2-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪
向46-6(600 mg, 1.452 mmol)在DMF (5 mL)中的搅拌溶液中通入氩气鼓泡10min。然后在室温下，向该反应混合物中加入47-3(344 mg, 1.597 mmol)、K2CO3(602 mg,4.36 mmol)、碘化铜(1) (27.7 mg, 0.145 mmol)和davephos g2 palladacycle (102 mg,0.145 mmol)并再次通入氩气鼓泡10 min。将反应混合物在80℃下搅拌12 h。用水(100 mL)稀释反应混合物并用EtOAc (3 x 100 mL)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并减压浓缩。粗化合物通过100 g (100-200目)硅胶柱纯化并用60% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩。得到的化合物再次经制备型HPLC纯化。合并纯馏分并冻干得到47。M/Z(ESI): 501.35 [M+H]+。
制备型HPLC方法。
流动相-10mM碳酸氢铵水溶液:MeCN
柱-X-Bridge C18 (19X250) 流速-18.0 ml/min
梯度方法-0/30,7/42,12.44.5,12.05/100,14/100,14.05/30,17/30
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) = 8.88 - 8.57 (m, 5H), 8.42 (s, 1H),8.12 (s, 1H), 7.91 (dd,J= 2.1, 8.3 Hz, 1H), 7.73 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 5.03 -4.95 (m, 1H), 4.89 - 4.73 (m, 3H), 4.64 - 4.54 (m, 2H), 4.54 - 4.43 (m, 2H),3.44 (d,J= 7.0 Hz, 2H), 3.36 (br d,J= 4.4 Hz, 2H), 3.28 - 3.14 (m, 5H)。
实施例48
(R)-5-(5-((2-(3-((2-(2-氟乙氧基)乙氧基)甲基)-4-(1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶-5-基)乙炔基)吡啶-2-基)噁唑
48-2的合成：5-(5-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)吡啶-2-基)噁唑
将48-1(1.0 g, 4.44 mmol)在ACN (20 mL)中的搅拌溶液脱气并通入氩气鼓泡10min。然后在室温下，向该反应混合物中加入DIPEA (2.328 mL, 13.33 mmol)、氯(2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯基)[2-(2'-氨基-1,1'-联苯基)]钯(II) (0.350g, 0.444 mmol)和乙炔基三甲基硅烷(1.309 g, 13.33 mmol)并再次通入氩气鼓泡10min。将反应混合物在80℃下搅拌3 h。用水(200 mL)稀释反应混合物并用EtOAc (3 x 180mL)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，并减压浓缩。粗化合物通过100 g(100-200目)硅胶柱纯化并用20% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到48-2。M/Z (ESI):243.46 [M+H]+。
48-3的合成：(R)-2-((4-(5-((6-(噁唑-5-基)吡啶-3-基)乙炔基)嘧啶-2-基)-1- (1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-2-基)甲氧基)乙-1-醇
向38-9(500 mg, 1.128 mmol)在DMF (10 mL)中的搅拌溶液中通入氩气鼓泡10min。然后在室温下，向该反应混合物中加入48-2(328 mg, 1.354 mmol)、K2CO3(468 mg,3.38 mmol)、碘化铜(i) (21.48 mg, 0.113 mmol)和氯(2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯基)[2-(2'-氨基-1,1'-联苯基)]钯(II) (89 mg, 0.113 mmol)。向反应混合物再次通入氩气鼓泡10 min并在80℃下搅拌12 h。用水(200 mL)稀释反应混合物并用EtOAc (3 x 150 mL)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并减压浓缩。粗化合物通过乙醚(2 x50 mL)研制并减压浓缩得到48-3。M/Z (ESI): 486.35 [M+H]+。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) = 8.78 - 8.76 (m, 1H), 8.64 (s, 4H),8.61 - 8.57 (m, 1H), 8.06 (dd,J= 2.1, 8.3 Hz, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.82 (d,J=8.1 Hz, 1H), 4.98 - 4.92 (m, 1H), 4.81 - 4.76 (m, 1H), 4.62 - 4.48 (m, 3H),3.52 (d,J= 7.0 Hz, 2H), 3.42 - 3.36 (m, 5H), 3.30 - 3.15 (m, 2H)。
48的合成：(R)-5-(5-((2-(3-((2-(2-氟乙氧基)乙氧基)甲基)-4-(1,3,5-三嗪- 2-基)哌嗪-1-基)嘧啶-5-基)乙炔基)吡啶-2-基)噁唑
在0℃下，向48-3(50 mg, 0.103 mmol)在DMF (1 mL)中的搅拌溶液中加入60%在油中的NaH (6.18 mg, 0.154 mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌30 min，然后在0℃下加入1-氟-2-碘乙烷(35.8 mg, 0.206 mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌24 h。用水(50 mL)稀释反应混合物并用EtOAc (3 x 80 mL)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，并减压浓缩。粗化合物通过制备型HPLC纯化。合并纯馏分并冻干得到48。M/Z (ESI): 532.38 [M+H]+。
制备型HPLC方法
流动相-10mM碳酸氢铵水溶液:MeCN
柱-X-Bridge C18 (19X250) 流速-18.0 ml/min
梯度方法-0/30,7/42,12.44.5,12.05/100,14/100,14.05/30,17/30
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) = 8.78 (s, 1H), 8.64 (s, 4H), 8.59(s, 1H), 8.06 (dd,J= 1.8, 8.2 Hz, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.83 (d,J= 8.3 Hz, 1H),5.01 - 4.93 (m, 1H), 4.79 (br d,J= 13.4 Hz, 1H), 4.65 - 4.48 (m, 4H), 3.65 -3.49 (m, 9H), 3.22 (br s, 2H)。
实施例49
(R)-2-(2-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(5-((2-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)嘧啶-5-基)乙炔基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪
49-2的合成：5-溴-2-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)嘧啶
在室温下，向5-溴-2-碘嘧啶(500 mg, 1.755 mmol)在1,4-二噁烷(10 mL)和水(2mL)中的搅拌溶液中加入1-甲基-3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑(548 mg, 2.63 mmol)和K2CO3(728 mg, 5.27 mmol)。将反应混合物脱气并通入氩气鼓泡15 min。然后在室温下，向该反应混合物中加入四(三苯基膦)钯(203 mg, 0.176mmol)。在氮气氛围下于80 ℃在密封管中搅拌反应混合物2 h。用水(10 mL)稀释反应混合物并用EtOAc (2 x 20 mL)萃取。合并的有机层用盐水(10 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用硅胶柱纯化并用40% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到49-2。M/Z (ESI): 238.92 [M+H]+。
49-3的合成：2-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)-5-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)嘧啶
在室温下，向49-2(350 mg, 1.464 mmol)在乙腈(5 mL)中的搅拌溶液中加入DIPEA (0.767 mL, 4.39 mmol)。将反应混合物脱气并通入氩气鼓泡15 min。然后在室温下，向该反应混合物中加入三甲基硅乙炔(431 mg, 4.39 mmol)和氯(2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯基)[2-(2'-氨基-1,1'-联苯基)]钯(II) (115 mg, 0.146mmol)。在氮气氛围下于80℃在密封管中搅拌反应混合物2 h。用水(10 mL)稀释反应混合物并用EtOAc (2 x 20 mL)萃取。合并的有机层用盐水(10 mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用硅胶柱纯化并用50% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到49-3。M/Z (ESI): 257.35 [M+H]+。
49的合成：(R)-2-(2-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(5-((2-(1-甲基-1H-吡唑-3-基)嘧 啶-5-基)乙炔基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪
在室温下，向41-1(130 mg, 0.292 mmol)在DMF (2 mL)中的搅拌溶液中加入49-3(112 mg, 0.438 mmol)、K2CO3(121 mg, 0.876 mmol)和碘化铜(I) (5.56 mg, 0.029mmol)。将反应混合物脱气并通入氩气鼓泡10 min。然后在室温下，向该反应混合物中加入davephos G2 palladacycle (20.54 mg, 0.029 mmol)。于80 ℃在密封管中搅拌反应混合物2 h。用水(20 mL)稀释反应混合物并用EtOAc (2 x 30 mL)萃取。合并的有机层用盐水(10 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过制备型HPLC纯化(条件:流动相-10mM 碳酸氢铵水溶液: MeCN 柱-Betasil Phenyl hexyl C18 (20X250), 5µ 流速-18.0 ml/min。梯度方法:-0/38, 2/38, 15.50/42, 15.60/100, 19.90/100, 20.0/38,24.0/38)。合并纯馏分并冻干得到49。M/Z (ESI): 502.22 [M+H]+。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm)= 8.96 (s, 2H), 8.67 - 8.63 (m, 4H),7.84 (d,J= 2.1 Hz, 1H), 6.94 (d,J= 2.3 Hz, 1H), 5.01 - 4.93 (m, 1H), 4.80 (brd,J= 13.6 Hz, 1H), 4.64 - 4.52 (m, 2H), 4.51 - 4.34 (m, 2H), 3.95 (s, 3H),3.68 - 3.54 (m, 4H), 3.44 - 3.34 (m, 2H), 3.28 - 3.22 (m, 1H)。
实施例50
(R)-2-(2-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(5-((6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)乙炔基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪
50-2的合成：(R)-(4-(5-((6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)乙炔基)嘧啶- 2-基)-1-(1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-2-基)甲醇
将38-6(150 mg, 0.376 mmol)在DMF (3 mL)中的搅拌溶液脱气并通入氩气鼓泡10 min。然后在室温下，向该反应混合物中加入50-1(与44-3类似的方法制备) (115 mg,0.451 mmol)、K2CO3(156 mg, 1.127 mmol)、碘化铜(I) (71.6 mg, 0.376 mmol)和氯(2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯基)[2-(2'-氨基-1,1'-联苯基)]钯(II)(29.6 mg, 0.038 mmol)并再次通入氩气鼓泡10 min。将反应混合物在80℃下搅拌12 h。用水(40 mL)稀释反应混合物并用EtOAc (3 x 30 mL)萃取。合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗产物用乙醚洗涤（2 × 30 mL），经Na2SO4干燥，并减压浓缩。得到的化合物通过制备型HPLC进一步再纯化(条件:流动相-10mM碳酸氢铵水溶液:MeCN 柱-X-BridgeC18 (19X250) mm, 5µ 流速-14.0 ml/min 梯度方法-0/25,2/25,11/60.9,11.05/100,17/100,17.05/25,20/25)。合并纯馏分并减压浓缩得到50-2。M/Z (ESI): 455.19 [M+H]+。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) = 8.58 - 8.68 (m, 5H), 8.34 (s, 1H),8.04 (s, 1H), 7.90 (dd,J= 8.2 Hz, 2.2 Hz, 1H), 7.69 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 4.89(t,J= 5.0 Hz, 1H), 4.72 - 4.85 (m, 2H), 4.46 - 4.61 (m, 2H), 3.89 (s, 3H),3.45 - 3.57 (m, 2H), 3.36 - 3.42 (m, 2H), 3.22 - 3.28 (m, 1H)。
50的合成：(R)-2-(2-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(5-((6-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)吡 啶-3-基)乙炔基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪
在0℃下，向50-2(70 mg, 0.154 mmol)在DMF (1 mL)中的搅拌溶液中加入油中60% NaH (9.24 mg, 0.231 mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌30 min。然后在0℃下加入1-氟-2-碘乙烷(53.6 mg, 0.308 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌24 h。用水(30 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (3 x 40 mL)萃取。合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过制备型HPLC纯化(条件:流动相-10mM 碳酸氢铵水溶液:MeCN 柱-X-Bridge C18 (10X250mm), 5µ 流速-7 ml/min 梯度方法-0/52,2/52,7.5/55.5,10/55.5,10.05/100,12/100,12.05/52,16/52)。合并纯馏分并减压浓缩得到50。M/Z (ESI): 501.21[M+H]+。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) = 8.63 (d,J= 10.8 Hz, 5H), 8.34 (s,1H), 8.04 (s, 1H), 7.89 (dd,J= 8.2 Hz, 2.2 Hz, 1H), 7.69 (d,J= 8.0 Hz, 1H),4.43 - 5.04 (m, 1H), 4.79 (d,J= 13.6 Hz, 1H), 4.54 - 4.67 (m, 2H), 4.43 (dt,J= 48.0 Hz, 4.0 Hz, 2H), 3.89 (s, 3H), 3.51 -3.60 (m, 4H), 3.35 - 3.43 (m,2H), 3.18 - 3.26 (m, 1H)。
实施例51
(R)-2-(3-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)-5-((2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-5-基)乙炔基)嘧啶
51的合成：(R)-2-(3-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)-5-((2- (1-甲基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-5-基)乙炔基)嘧啶
在室温下，向40-3(100 mg, 0.301 mmol)在DMF (2 mL)中的搅拌溶液中加入44-1(93 mg, 0.361 mmol)和磷酸三钾(383 mg, 1.805 mmol)。将该反应混合物脱气并通入氩气鼓泡10 min。然后在室温下，向该反应混合物中加入氯(2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯基)[2-(2'-氨基-1,1'-联苯基)]钯(II) (24 mg, 0.031 mmol)。将反应混合物在密封管中于80℃搅拌2 h。用水(20 mL)淬灭反应混合物，通过硅藻土垫过滤并用DCM(2 x 20 mL)洗涤。合并的有机层用盐水(20 mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。用乙醚(2 x 10 mL)研制得到的化合物并减压浓缩。得到的化合物通过制备型HPLC纯化(条件:流动相-10mM碳酸氢铵水溶液:MeCN 柱-X-Bridge C18 (19X250) mm, 5µ 流速-15.0 ml/min 梯度方法:0/45, 2/45, 7/58, 12/58, 12.1/100, 15/100, 15.1/45, 18/45)。合并纯馏分并减压浓缩得到51。M/Z (ESI): 501.21 [M+H]+。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8.89 (s, 2H), 8.63 (d,J= 4.4 Hz, 4H),8.42 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 4.98-4.96 (m, 1H), 4.80 (d,J= 13.6 Hz, 1H), 4.59-4.55 (m, 2H), 4.44 (dt,J= 4, 8.0 Hz, 2H), 3.92 (s, 3H), 3.65-3.55 (m, 4H),3.40-3.36 (m, 1H), 3.29-3.20 (m, 2H)。
实施例52
(R)-2-(3-((2-(2-氟乙氧基)乙氧基)甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)-5-((2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-5-基)乙炔基)嘧啶
52-2的合成：5-溴-2-((3R)-4-(嘧啶-2-基)-3-((2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧基) 乙氧基)甲基)哌嗪-1-基)嘧啶
在0℃下，向(R)-(4-(5-溴嘧啶-2-基)-1-(嘧啶-2-基)哌嗪-2-基)甲醇(Int B)(3 g, 8.54 mmol)在DMF (80 mL)中的搅拌溶液中加入油中60% NaH (0.376 g, 9.40mmol)并在0℃下搅拌30 min。然后在0℃下向反应混合物中加入2-(2-溴乙氧基)四氢-2h-吡喃(2.322 g, 11.10 mmol)。将反应混合物在80℃下搅拌16 h。用水(100 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (3 x 100 mL)萃取。合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用25 g硅胶柱纯化并用30% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到52-2。M/Z (ESI): 479.13 [M+H]+。
52-1的合成：(R)-2-((4-(5-溴嘧啶-2-基)-1-(嘧啶-2-基)哌嗪-2-基)甲氧基) 乙-1-醇
在0℃下，向52-2(2.5 g, 4.75 mmol)在DCM (30 mL)中的搅拌溶液中加入4M 1,4-二噁烷盐酸盐(4.75 mL, 19.00 mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌12 h。减压浓缩反应混合物。用碳酸氢钠水溶液(100 mL)稀释残留物并用EtOAc (3 x 100 mL)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用25 g硅胶柱纯化并用40%EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到52-1。M/Z (ESI): 395.24 [M+H]+。
52-3的合成：(R)-2-((4-(5-((2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-5-基)乙炔基)嘧 啶-2-基)-1-(嘧啶-2-基)哌嗪-2-基)甲氧基)乙-1-醇
在室温下，向52-1(与38-9类似的方法制备) (200 mg, 0.506 mmol)在DMF (2mL)中的搅拌溶液中加入44-1(130 mg, 0.506 mmol)和磷酸三钾(644 mg, 3.04 mmol)。将反应混合物脱气并通入氩气鼓泡10 min。然后向该反应混合物中加入氯(2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯基)[2-(2'-氨基-1,1'-联苯基)]钯(II) (39.8 mg, 0.051mmol)并在密封管中于80℃搅拌2 h。用水(20 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 30 mL)萃取。合并的有机层用盐水(10 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过制备型HPLC纯化(条件:流动相-10mM碳酸氢铵水溶液:MeCN 柱-X-Bridge C18(19X250), 5µ 流速-15.0 ml/min 梯度方法:0/35, 2/35, 7/40, 11.7/40, 11.75/100,14.95/100, 15/35, 18/35)。合并纯馏分并减压浓缩并冻干得到52-3。M/Z (ESI): 499.16[M+H]+。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8.89 (s, 2H), 8.62 (s, 2H), 8.37 - 8.44(m, 3H), 8.05 (s, 1H), 6.91 (br s, 1H), 6.68 (t,J= 4.8 Hz, 1H), 4.78 - 4.96(m, 2H), 4.48 - 4.59 (m, 2H), 3.92 (s, 3H), 3.35 - 3.53 (m, 7H), 3.20 - 3.30(m, 2H)。
52的合成：(R)-2-(3-((2-(2-氟乙氧基)乙氧基)甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1- 基)-5-((2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-5-基)乙炔基)嘧啶
在0℃下，向52-3(70 mg, 0.140 mmol)在DMF (1 mL)中的搅拌溶液中加入1-氟-2-碘乙烷(73.3 mg, 0.421 mmol)和NaH (11.23 mg, 0.281 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌48 h。用水(20 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 30 mL)萃取。合并的有机层用盐水(10 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过制备型HPLC纯化(条件:流动相-10mM碳酸氢铵水溶液:MeCN柱名称Betasil Phenyl Hexyl (21.2X250)MM, 5µ梯度方法:0/45, 5/50, 15/50, 15.05/100, 18.05/100, 18.10/45, 21/45)。合并纯馏分并冻干得到52。M/Z (ESI): 545.26 [M+H]+。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8.89 (s, 2H), 8.63 (s, 2H), 8.38 - 8.44(m, 3H), 8.05 (s, 1H), 6.68 (t,J= 4.8 Hz, 1H), 4.85 (br s, 1H), 4.77 - 4.85(m, 1H), 4.38 - 4.60 (m, 4H), 3.92 (s, 3H), 3.61 -3.67 (m, 1H), 3.53 - 3.59(m, 1H), 3.44 - 3.56 (m, 6H), 3.36-3.39 (m, 1H), 3.22 - 3.29 (m, 2H)。
实施例53
(R)-2-(3-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-5-((2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-5-基)乙炔基)嘧啶
53-1的合成：(R)-2-(3-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-5-碘嘧 啶
在室温下，向42-5(2 g, 5.02 mmol)在DMF (30 mL)中的搅拌溶液中加入NaH(241 mg, 10 mmol)和1-氟-2-碘乙烷(2.62 g, 15.1 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌24 h。用水(50 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 75 mL)萃取。合并的有机层用盐水(2x 30 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用80 g硅胶(230-400目)柱纯化并用50% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到53-1。M/Z (ESI): 445.18 [M+H]+。
53的合成：(R)-2-(3-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-5-((2- (1-甲基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-5-基)乙炔基)嘧啶
在室温下，向53-1(60 mg, 135 μmol)在DMF (1 mL)中的搅拌溶液中加入44-1(34.6 mg, 135 μmol)、K2CO3(56.0 mg, 405 μmol)和CuI (2.57 mg, 13.5 μmol)。将反应混合物脱气并通入氩气鼓泡15 min。然后在室温下向该反应混合物中加入XPhosPalladacycle (10.6 mg, 13.5 μmol)。将反应混合物在密封管中于100℃搅拌16 h。用饱和Na2CO3水溶液(20 mL)淬灭反应混合物并用10% MeOH/DCM (2 x 35 mL)萃取。合并的有机层用盐水(2 x 20 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过制备型HPLC纯化(条件:流动相-10mM碳酸氢铵水溶液:MeCN, 柱-X-Bridge C18 (19X250) mm 5u, 流速-16 ml/min, 梯度方法: 0/35,4/45,8.6/45,8.65/100,11/100,11.05/45,14/45)。合并纯馏分并减压浓缩得到53。M/Z (ESI): 501.33 [M+H]+。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) = 7.30-10.60 (m, 8H), 6.99 (br s,1H), 4.55-4.87 (m, 2H), 4.19-4.56 (m, 4H), 3.92 (s, 3H), 3.49-3.71 (m, 4H),3.42 (dd,J= 13.4 Hz, 3.8 Hz, 1H), 3.32 (s, 2H)。
实施例54
(R)-2-(1-(2-氟乙基)-1H-吡唑-4-基)-5-((2-(3-(甲氧基甲基)-4-(嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)嘧啶-5-基)乙炔基)嘧啶
54-2的合成：5-溴-2-(1-(2-氟乙基)-1H-吡唑-4-基)嘧啶
在室温下，向5-溴-2-(1H-吡唑-4-基)嘧啶(54-1) (1 g, 3.82 mmol)在DMF (15mL)中的搅拌溶液中加入1-氟-2-碘乙烷(2.66 g, 15.3 mmol)和Cs2CO3(3.74 g, 11.5mmol)。在50℃下，将反应混合物在氮气氛围下于密封管中搅拌4 h。用水(20 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 25 mL)萃取。合并的有机层用盐水(2 x 20 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用24 g硅胶(230-400目)柱纯化并用50%EtOAc/己烷洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到54-2。M/Z (ESI): 273.00 [M+H]+。
54-3的合成：2-(1-(2-氟乙基)-1H-吡唑-4-基)-5-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)嘧 啶
在室温下，向54-2(1 g, 3.69 mmol)在ACN (50 mL)中的搅拌溶液中加入乙炔基-三甲基-硅烷(773 μL, 5.53 mmol)和DIPEA (1.29 mL, 7.38 mmol)。将反应混合物脱气并通入氩气鼓泡15 min。在室温下，向反应混合物中加入XPhos Palladacycle (290 mg, 369μmol)。在80℃下，将反应混合物在氮气氛围下于密封管中搅拌16 h。减压浓缩反应混合物。粗化合物通过Biotage用40 g硅胶(230-400目)柱纯化并用50% EtOAc/己烷洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到54-3。M/Z (ESI): 289.14 [M+H]+。
54-4的合成：(R)-5-碘-2-(3-(甲氧基甲基)-4-(嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)嘧啶
在0℃下，向42-5(5 g. 12.6 mmol)在DMF (50 mL)中的搅拌溶液中加入NaH (603mg, 25.1 mmol)和碘甲烷 (1.62 mL, 25.1 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1 h。用水(50 mL)淬灭反应混合物，过滤析出的固体，用水洗涤并减压干燥得到54-4。M/Z (ESI):413.18 [M+H]+。
54的合成：(R,E)-2-(2-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(5-(2-(2-(1-甲基-1H-吡唑-4- 基)嘧啶-5-基)乙烯基)嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪
在室温下，向54-3(50 mg, 121 μmol)在DMF (1 mL)中的搅拌溶液中加入K2CO3(50.3 mg, 364 μmol)、54-4(42 mg, 146 μmol)和CuI (2.31 mg, 12.1 μmol)。将反应混合物脱气并通入氩气鼓泡15 min。然后在室温下，向其中加入XPhos Palladacycle (9.54mg, 12.1 μmol)。在100℃下，将反应混合物在密封管中搅拌16 h。用水(20 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 40 mL)萃取。合并的有机层用盐水(2 x 20 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过制备型HPLC纯化(条件:流动相-10mM碳酸氢铵水溶液:MeCN,柱-X-Bridge C18 (19X250) mm 5u, 流速-16ml/min, 梯度方法: 0/35,4/45,8.6/45,8.65/100,11/100,11.05/45,14/45)。合并纯馏分并减压浓缩得到54。M/Z (ESI):501.34 [M+H]+。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) = 8.91 (s, 2H), 8.65 (s, 2H), 8.54(br s, 1H), 8.50 (s, 1H), 8.26 (br s, 1H), 8.13 (s, 1H), 6.87 (s, 1H), 4.55-4.94 (m, 5H), 4.50 (t,J= 4.6 Hz, 2H), 4.30 (br s, 1H), 3.37-3.45 (m, 3H),3.27-3.30 (m, 2H), 3.21 (s, 3H)。
实施例55
(R)-5-(5-((2-(3-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶-5-基)乙炔基)嘧啶-2-基)噁唑
55的合成：(R)-5-(5-((2-(3-((2-氟乙氧基)甲基)-4-(1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪- 1-基)嘧啶-5-基)乙炔基)嘧啶-2-基)噁唑
在室温下，向41-1(150.0 mg, 336.9 μmol)和55-1(与48-2类似的方法制备)(81.98 mg, 336.9 μmol)在DMF (3 mL)中的搅拌溶液中加入K2CO3(139.7 mg, 1.011mmol)并在室温下用N2脱气5 min。然后在室温下向该反应混合物中加入碘化铜(I) (6.416mg, 33.69 μmol)和2-二环己基膦-2-(N,N-二甲氨基)联苯基(2’-氨基-1,1’-联苯基-2-基)钯(II) (23.74 mg, 33.69 μmol)。将反应混合物在80℃下搅拌3 h。用水(10 mL)淬灭反应混合物并用DCM (2 x 10 mL)萃取。合并的有机层用盐水(20 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用24 g硅胶柱纯化并用40% EtOAc/己烷洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩。得到的化合物通过制备型HPLC再纯化(条件:流动相-10mM碳酸氢铵水溶液:MeCN 柱-X-Bridge C18 (19X250), 5µ 流速-15.0 ml/min 梯度方法–0/40, 2/40, 7/53, 10/53, 10.05/100, 12/100, 12.05/40, 15/40)。合并纯馏分，减压浓缩并冻干得到55。M/Z (ESI): 489.26 [M+H]+。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 9.04 (s, 2H), 8.58-8.75 (m, 5H),8.04 (s, 1H), 4.91-5.02 (m, 1H), 4.80 (d,J= 13.6 Hz, 1H), 4.54-4.64 (m, 2H),4.30-4.52 (m, 2H), 3.54-3.69 (m, 4H), 3.40-3.45 (m, 1H), 3.22-3.30 (m, 2H)。
实施例56
(R)-2-(4-(5-((2-(1-(氟乙基)-1H-吡唑-4-基)嘧啶-5-基)乙炔基)嘧啶-2-基)-2-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪
56-2的合成：5-溴-2-(1-(氟甲基)-1H-吡唑-4-基)嘧啶
在0℃下，向5-溴-2-(1H-吡唑-4-基)嘧啶(54-1)(1.00 g. 4.44 mmol)在无水THF(20 mL)中的溶液中加入NaH (160 mg, 6.67 mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌30 min。然后在0℃下向该反应混合物中滴加氟碘甲烷(330 μL, 4.89 mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌3 h。用水(50 mL)淬灭反应混合物并用乙酸乙酯(2 x 50 mL)萃取。合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用硅胶柱纯化并用20%乙酸乙酯/己烷洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到56-2。M/Z (ESI): 257.04 [M+H]+。
56-3的合成：2-(1-(氟甲基)-1H-吡唑-4-基)-5-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)嘧啶
在室温下，向56-2(400 mg, 1.56 mmol)在乙腈(8 mL)中的搅拌溶液中加入DIPEA(542 μL, 3.11 mmol)。在室温下搅拌反应混合物并在室温下用N2脱气。然后在室温下向该反应混合物中加入XPhos Palladacycle (122 mg, 156 μmol)和乙炔基-三甲基-硅烷(326μL, 2.33 mmol)。将反应混合物在80℃下搅拌16 h。通过硅藻土垫过滤反应混合物，用EtOAc洗涤并减压浓缩。用水(50 mL)稀释残留物并用乙酸乙酯(2 x 50 mL)萃取。合并的有机层用盐水(50 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用120g硅胶柱纯化并用15% EtOAc/己烷洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到56-3。M/Z(ESI): 275.02 [M+H]+。
56的合成：(R)-2-(4-(5-((2-(1-(氟甲基)-1H-吡唑-4-基)嘧啶-5-基)乙炔基)嘧 啶-2-基)-2-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪
在室温下，向46-6(150.0 mg, 363.0 μmol)和56-3(99.60 mg, 363.0 μmol)在DMF (4 mL)中的搅拌溶液中加入K2CO3(150.5 mg, 1.089 mmol)并在室温下用N2脱气5min。然后在室温下向该反应混合物中加入碘化铜(I) (6.913 mg, 36.30 μmol)和2-二环己基膦-2-(N,N-二甲氨基)联苯基(2’-氨基-1,1’-联苯基-2-基)钯(II) (25.58 mg,36.30 μmol)。将反应混合物在100℃下搅拌5 h。通过硅藻土垫过滤反应混合物，用DCM洗涤并减压浓缩。用水(50 mL)稀释残留物并用EtOAc (2 x 50 mL)萃取。合并的有机层用盐水(50 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用80 g硅胶柱纯化并用8% MeOH/DCM洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩并将得到的化合物通过制备型HPLC进一步再纯化(条件:流动相-10mM碳酸氢铵水溶液:MeCN 柱- X-Bridge C18(19X250) mm, 5µ 流速-15.0 ml/min 梯度方法–0/42,6/50,10.45/50,10.5/100,14.5/100,14.55/42,17/42. APMS-008)。合并纯馏分，减压浓缩并冻干得到56。M/Z (ESI):488.17 [M+H]+。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ (ppm) 8.96 (s, 2H), 8.82 (s, 1H), 8.65(d,J= 4.4 Hz, 4H), 8.28 (s, 1H), 6.23 (d,J= 52.4 Hz, 2H), 4.97-5.03 (m, 1H),4.77 (d,J= 13.6 Hz, 1H), 4.55-4.63 (m, 2H), 3.45 (d,J= 7.2 Hz, 2H), 3.33-3.40(m, 2H), 3.16-3.26 (m, 4H)。
实施例57
(R)-2-(4-(5-((6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙炔基)-6-氟吡嗪-2-基)-2-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)嘧啶
57-2的合成：4-苄基1-(叔丁基) (R)-2-(羟甲基)哌嗪-1,4-二甲酸酯
在0℃下，向(R)-2-(羟甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(57-1) (50 g, 231 mmol)在DMF(700 mL)中的搅拌溶液中加入TEA (64.4 mL, 462 mmol)和Cbz-Cl (49.5 mL, 347mmol)。在室温下，将反应混合物在氮气氛围下搅拌16 h。用水(250 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 500 mL)萃取。合并的有机层用饱和NaHCO3水溶液 (2 x 100 mL) 和盐水(2x 100 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用330 g硅胶(230-400目)柱纯化并用20% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩以得到57-2。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) = 7.28-7.42 (m, 5H), 5.09 (s, 2H),4.81 (br s, 1H), 3.90-4.17 (m, 2H), 3.85 (d,J= 10.0 Hz, 1H), 3.73 (d,J= 10.8Hz, 1H), 3.34-3.48 (m, 2H), 2.76-3.15 (m, 3H), 1.40 (s, 9H)。
57-3的合成：4-苄基1-(叔丁基) (R)-2-(甲氧基甲基)哌嗪-1,4-二甲酸酯
在0℃下，向57-2(40 g, 114 mmol)在DMF (300 mL)中的搅拌溶液中加入NaH(9.13 g, 228 mmol)和MeI (21.41 mL, 342 mmol)。在0℃下，将反应混合物在氮气氛围下搅拌2 h。用冰水(250 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 650 mL)萃取。合并的有机层用盐水(2 x 150 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用330g硅胶(230-400目)柱纯化并用20% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩以得到57-3。M/Z (ESI): 309.17 [M+H]+。(叔丁基断裂质量)
57-4的合成：(R)-2-(甲氧基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在室温下，向57-3(20 g, 54.9 mmol)在EtOH (200 mL)中的搅拌溶液中加入Pd-C(5.84 g, 5.49 mmol)。在室温下，将反应混合物在氢气氛围下搅拌18 h。反应混合物通过硅藻土垫过滤，残留物用乙酸乙酯(2 x 200 mL)洗涤。滤液经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩得到57-4。M/Z (ESI): 231.16 [M+H]+。
57-5的合成：(R)-4-(6-氟吡嗪-2-基)-2-(甲氧基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在室温下，向57-4(2 g, 8.68 mmol)在DMF (35 mL)中的搅拌溶液中加入K2CO3(3.60 g, 26.1 mmol)和2,6-二氟吡嗪(0.889 mL, 10.42 mmol)。在80℃下，将反应混合物在氮气氛围下搅拌12 h。用水(100 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 200 mL)萃取。合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用120 g硅胶(230-400目)柱纯化并用30% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到57-5。M/Z(ESI): 327.25 [M+H]+。
57-6的合成：(R)-4-(5-溴-6-氟吡嗪-2-基)-2-(甲氧基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在0℃下，向57-5(1.5 g, 4.60 mmol)在ACN (45 mL)中的搅拌溶液中加入NBS(0.818 g, 4.60 mmol)。在室温下，将反应混合物在氮气氛围下搅拌18 h。用水(50 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 100 mL)萃取。合并的有机层用盐水(2 x 50 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用80 g硅胶(230-400目)柱纯化并用18% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到57-6。M/Z (ESI): 405.09 [M+H]+。
57-8的合成：2-(1H-咪唑-1-基)-5-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)吡啶
在0℃下，向5-溴-2-(1H-咪唑-1-基)吡啶(57-11) (1 g, 4.46 mmol)在ACN (40mL)中的搅拌溶液中加入DIPEA (2.339 mL, 13.39 mmol)和碘化铜(I) (0.085 g, 0.446mmol)。将反应混合物脱气并通入氩气鼓泡20 min。然后在0℃下，向该反应混合物中加入三甲基硅乙炔(1.271 mL, 8.93 mmol)和二-(三苯基膦)-氯化钯(0.297 g, 0.446 mmol)。在室温下，将反应混合物在氮气下搅拌16 h。用水(50 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x100 mL)萃取。合并的有机层用盐水(2 x 50 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用80 g硅胶(230-400目)柱纯化并用60% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到57-8。M/Z (ESI): 242.42 [M+H]+。
57-9的合成：(R)-4-(5-((6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙炔基)-6-氟吡嗪-2- 基)-2-(甲氧基甲基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在室温下，向57-6(1.5 g, 3.70 mmol)在DMF (15 mL)中的搅拌溶液中加入K2CO3(1.535 g, 11.10 mmol)和57-8(1.072 g, 4.44 mmol)。将反应混合物脱气并通入氩气鼓泡25 min。然后在室温下，向该反应混合物中加入XPhos Pd G2 (0.291 g, 0.370 mmol)。在80℃下，将反应混合物在密封管中于氮气氛围下搅拌2 h。用水(60 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 85 mL)萃取。合并的有机层用盐水(2 x 30 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用80 g硅胶(230-400目)柱纯化并用6% MeOH/DCM洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到57-9。M/Z (ESI): 494.45 [M+H]+。
57-10：(R)-2-((6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙炔基)-3-氟-5-(3-(甲氧基甲 基)哌嗪-1-基)吡嗪
在0℃下，向57-9(750 mg, 1.520 mmol)在DCM (15 mL)中的搅拌溶液中加入4MHCl的1,4-二噁烷(0.760 mL, 3.04 mmol)溶液。在室温下，将反应混合物在氮气氛围下搅拌48 h。将反应混合物在减压下浓缩。将得到的化合物溶解在10% MeOH/DCM (50 mL)中并加入MP碳酸酯树脂(2 g)反应20 min。通过硅藻土垫过滤反应混合物并用10% MeOH/DCM (2x 20 mL）洗涤。合并的有机层经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用80 g硅胶(230-400目)柱纯化并用12% MeOH/DCM洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到57-10。M/Z (ESI): 394.21 [M+H]+。
57的合成：(R)-2-(4-(5-((6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙炔基)-6-氟吡嗪-2- 基)-2-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)嘧啶
在室温下，向57-10(100 mg, 0.254 mmol)在1,4-二噁烷(1.5 mL)中的搅拌溶液中加入2-氯嘧啶(87 mg, 0.763 mmol)和叔丁醇钠(73.3 mg, 0.763 mmol)。将反应混合物脱气并通入氩气鼓泡20 min。然后在室温下，向该反应混合物中加入RuPhos Pd G2 (19.74mg, 0.025 mmol)。将反应混合物于微波中于150℃下搅拌2 h。用水(25 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 45 mL)萃取。合并的有机层用盐水(2 x 20 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过40 g硅胶(230-400目)柱纯化并用4% MeOH/DCM洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩。得到的化合物通过制备型HPLC再次纯化(条件:流动相-10mM碳酸氢铵水溶液:MeCN, 柱-X-Bridge, C18 (10X250) mm, 5µ, 流速-6.0 ml/min, 梯度方法:-0/40,5/55,10.3/58,10.4/100,11.9/100,12/40,16/40)。合并纯馏分，减压浓缩并冻干得到57。M/Z (ESI): 472.11 [M+H]+。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) = 8.68-8.73 (m, 1H), 8.60 (s, 1H),8.42 (d,J= 4.8 Hz, 2H), 8.30 (d,J= 5.6 Hz, 1H), 8.21 (dd,J= 8.6 Hz, 2.2 Hz,1H), 8.01 (t,J= 1.2 Hz, 1H), 7.92 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 7.16 (s, 1H), 6.70 (t,J=4.6 Hz, 1H), 4.85-4.99 (m, 1H), 4.40-4.54 (m, 2H), 4.27 (d,J= 12.0 Hz, 1H),3.37-3.52 (m, 5H), 3.22 (s, 3H)。
实施例58
(R)-5-((6-(4H-1,2,4-三唑-4-基)吡啶-3-基)乙炔基)-4-氟-2-(3-(甲氧基甲基)-4-(嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)嘧啶
58-2的合成：(R)-3-(甲氧基甲基)-4-(嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯
在0℃下，向(R)-3-(羟甲基)-4-(嘧啶-4-基)哌嗪-1-甲酸叔丁酯(58-1)(5.00 g,17.0 mmol)在DMF (20 mL)中的搅拌溶液中加入MeI (3.19 mL, 51.0 mmol)和油中60%NaH (612 mg, 25.5 mmol))。将反应混合物在25℃下搅拌1 h。用水(100 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 100 mL)萃取。合并的有机层用盐水(2 x 50 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用80 g硅胶柱纯化并用20% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到58-2。M/Z (ESI): 309.23 [M+H]+。
58-3的合成：(R)-4-(2-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)嘧啶
在0℃下，向58-2(2.10 g, 6.81 mmol)在DCM (20 mL)中的搅拌溶液中加入4M氯化氢的1,4-二噁烷(6.81 mL, 27.2 mmol)溶液。将反应混合物在25℃下搅拌16 h。减压下浓缩反应混合物，残余物用乙醚(2 x 10 mL)洗涤并减压干燥得到58-3。M/Z (ESI):209.18 [M+H]+。
58-8的合成：2,4-二氯-5-(三甲基甲硅烷基)嘧啶
在-20℃下，向5-溴-2,4-二氯嘧啶(10.0 g, 43.9 mmol)在THF (150 mL)中的搅拌溶液中加入2M异丙基氯化镁(21.9 mL, 43.9 mmol)。将反应混合物在0℃至25℃搅拌3h。然后在-20℃下，向该反应混合物中加入TMS-Cl (16.7 mL, 132 mmol)。然后将反应混合物于氮气氛围下在0℃至25℃搅拌16 h。用NH4Cl(100 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x120 mL)萃取。合并的有机层用盐水(2 x 50 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用120 g硅胶柱纯化并用10% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到58-8。M/Z (ESI): 220.97 [M+H]+。
58-4的合成：(R)-4-氯-2-(3-(甲氧基甲基)-4-(嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)-5-(三甲 基甲硅烷基)嘧啶
在室温下，向58-3(1.20 g, 5.76 mmol)在DMF (30 mL)中的搅拌溶液中加入58-8(1.53 g, 6.91 mmol)和DIPEA (5.02 mL, 28.8 mmol)。将反应混合物于氮气氛围下在25℃下搅拌16 h。用水(100 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 100 mL)萃取。合并的有机层用盐水(2 x 50 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用40 g硅胶柱纯化并用20% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到58-4。M/Z(ESI): 393.30 [M+H]+。
58-5的合成:(R)-4-氯-5-碘-2-(3-(甲氧基甲基)-4-(嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)嘧 啶
在-10℃-0℃下，向58-4(800 mg, 2.04 mmol)在ACN (20 mL)和DMF (5 mL)中的搅拌溶液中加入一氯化碘(197 μL, 3.05 mmol)。将反应混合物于氮气氛围下在0℃下搅拌1 h。用水(80 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 80 mL)萃取。合并的有机层用盐水(2 x10 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用40 g硅胶柱纯化并用30% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到58-5。M/Z (ESI): 446.98[M+H]+。
58-6的合成：(R)-5-((6-(4H-1,2,4-三唑-4-基)吡啶-3-基)乙炔基)-4-氯-2-(3- (甲氧基甲基)-4-(嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)嘧啶
在室温下，向58-5(70.0 mg, 157 μmol)在DMF (1 mL)中的搅拌溶液中加入45-6(45.6 mg, 188 μmol)、K2CO3(65.0 mg, 470 μmol)和CuI (2.98 mg, 15.7 μmol)并用氩气脱气15 min。然后在室温下，向该反应混合物中加入XPhos Palladacycle (12.3 mg, 15.7μmol)。将反应混合物在密封管中在100℃下搅拌16 h。用水(80 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 80 mL)萃取。合并的有机层用盐水(2 x 20 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物用乙醚(2 x 10 mL)洗涤并减压干燥。粗化合物通过制备型HPLC纯化(条件:流动相-10mM碳酸氢铵水溶液:MeCN, 柱-X-Bridge, C18 (10X250) mm, 5µ, 流速-16ml/min, 梯度方法:- 0/35,4/45,8.6/45,8.65/100,11/100,11.05/45,14/45)。合并纯馏分，减压浓缩并冻干得到58-6。M/Z (ESI): 489.14 [M+H]+。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) = 9.34 (s, 2H), 8.64-8.78 (m, 2H),8.54 (s, 1H), 8.19-8.31 ( m, 2H), 7.98 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 6.86 (d,J= 6.0 Hz,1H), 4.19-4.90 (m, 4H), 3.38-3.50 (m, 5H), 3.21 ( s, 3H)。
58的合成：(R)-5-((6-(4H-1,2,4-三唑-4-基)吡啶-3-基)乙炔基)-4-氟-2-(3- (甲氧基甲基)-4-(嘧啶-4-基)哌嗪-1-基)嘧啶
在室温下，向58-6(100.0 mg, 204.5 μmol)在DMSO (2 mL)中的搅拌溶液中加入氟化钾(38.32 μL, 1.636 mmol)。将反应混合物在氮气氛围下于80℃搅拌16 h。用水(50mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 50 mL)萃取。合并的有机层用盐水(2 x 20 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过制备型HPLC纯化(条件:流动相-10mM碳酸氢铵水溶液:MeCN, 柱-X-Bridge, C18 (10X250) mm, 5µ, 流速-16ml/min, 梯度方法:- 0/35,4/45,8.6/45,8.65/100,11/100,11.05/45,14/45)。合并纯馏分，减压浓缩并冻干得到58。M/Z (ESI): 473.14 [M+H]+。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) = 9.35 (d,J= 3.6 Hz, 2H), 8.68-8.82(m, 2H), 8.54 (s, 1H), 8.16-8.35 (m, 2H), 7.97 (d,J= 8.4 Hz, 1H), 6.86 (d,J=6.0 Hz, 1H), 4.20-4.92 (m, 4H), 3.36-3.50 (m, 5H), 3.20 (s, 3H)。
实施例59
(R)-5-((6-(3-氟-4H-1,2,4-三唑-4-基)吡啶-3-基)乙炔基)-2-(3-(甲氧基甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶
59-2的合成：5-溴-2-(3-氯-4H-1,2,4-三唑-4-基)吡啶
在室温下，向5-溴-2-(4H-1,2,4-三唑-4-基)吡啶(59-1) (3 g, 13.33 mmol)在ACN (50 mL)中的搅拌溶液中加入NCS (3 g, 22.47 mmol)。将反应混合物在氩气氛围下于60℃下搅拌16 h。减压浓缩反应混合物。粗化合物通过Biotage用48 g硅胶(230-400目)柱纯化并用45% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到59-2。M/Z (ESI):261.00 [M+H]+。
59的合成：2-(3-氯-4H-1,2,4-三唑-4-基)-5-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)吡啶
在室温下，向59-2(2.5 g, 9.63 mmol)在ACN (40 mL)中的搅拌溶液中加入DIPEA(5 mL, 28.6 mmol)。将反应混合物脱气并通入氩气鼓泡15 min。然后在室温下，向该反应混合物中加入三甲基硅乙炔(2.75 mL, 19.32 mmol)和XPhos Pd G2 (0.758 g, 0.963mmol)。然后将反应混合物在密封管中于在80℃搅拌16 h。减压浓缩反应混合物。粗化合物通过Biotage用80 g硅胶(230-400目)柱纯化并用50% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到59-3。M/Z (ESI): 276.95 [M+H]+。
59-4的合成：(R)-5-((6-(3-氯-4H-1,2,4-三唑-4-基)吡啶-3-基)乙炔基)-2-(3- (甲氧基甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶
在室温下，向59-5(与Int C类似的方法制备) (700 mg, 1.698 mmol)在DMF (10mL)中的搅拌溶液中加入59-3(611 mg, 2.207 mmol)和磷酸三钾(2163 mg, 10.19 mmol)。将反应混合物脱气并通入氩气鼓泡10 min。然后在室温下向该反应混合物中加入氯(2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯基)[2-(2'-氨基-1,1'-联苯基)]钯(II) (134mg, 0.170 mmol)。将反应混合物在密封管中于80℃搅拌2 h。用水(50 mL)淬灭反应混合物,并用硅藻土垫过滤，用DCM (50 mL）洗涤。水层用DCM (2 x 50 mL)萃取，合并的有机层用盐水(50 mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过48 g硅胶(230-400目)柱纯化并用5% MeOH/DCM洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩59-4。M/Z (ESI): 489.20 [M+H]+。
59的合成：(R)-5-((6-(3-氟-4H-1,2,4-三唑-4-基)吡啶-3-基)乙炔基)-2-(3- (甲氧基甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶
在室温下，向59-4(100 mg, 0.205 mmol)在DMSO (1 mL)中的溶液中加入氟化钾(119 mg, 2.045 mmol)。将反应混合物在120℃下搅拌12 h。用冰水(5 mL)淬灭反应混合物，过滤并减压干燥。粗化合物通过制备型HPLC纯化。合并相对纯的馏分，减压浓缩。通过非手性SFC纯化对获得的化合物进行再纯化。M/Z (ESI): 473.16 [M+H]+。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) = 9.05 (s, 1H), 8.75 (dd,J= 2.2 Hz,0.6 Hz, 1H), 8.64 (s, 2H), 8.41 (d,J= 4.8 Hz, 2H), 8.25 (dd,J= 8.4 Hz, 2.4Hz, 1H), 7.78 (d,J= 7.6 Hz, 1H), 6.68 (t,J= 4.8 Hz, 1H), 4.89-4.98 (m, 1H),4.78 (d,J= 13.6 Hz, 1H), 4.48-4.61 (m, 2H), 3.39-3.45 (m, 3H), 3.20 (s, 5H)。
制备型HPLC纯化条件:
仪器ID ANL-MCL5-PREP-023
柱名称XBRIDGE ODS 19250,5um
柱No# XBRIDGE ODS 19250,5um
流动相-A 10mM碳酸氢铵水溶液
流动相-B 乙腈
梯度程序(T/%B) 0/48,2/48,10.20/65,10.25/100,13/100,13.05/48,17/48
非手性SFC纯化条件:
柱: YMC DIOL (4.6250mm)5μm
助溶剂: 甲醇
总流速: 3 mL/min
% CO2: 90
%助溶剂: 10
ABPR: 1500psi
温度: 30℃
表2中包含的化合物由表2中最后一列所示的上述合成步骤通过类似的方法合成。在必要时用市售试剂代替以产生下面的实施例。
表2
放射性标记程序
放射性标记前体的合成:
44-2的合成：(R)-2-((4-(5-((2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-5-基)乙炔基)嘧 啶-2-基)-1-(1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-2-基)甲氧基)乙基4-甲基苯磺酸酯
44-2的合成：(R)-2-((4-(5-((2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-5-基)乙炔基)嘧 啶-2-基)-1-(1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-2-基)甲氧基)乙基4-甲基苯磺酸酯
在0℃下，向44-3(与52-3类似的方法制备) (500 mg, 1.001 mmol)在DCM (5 mL)中的搅拌溶液中加入TEA (0.419 mL, 3.00 mmol)、DMAP (12.23 mg, 0.100 mmol)和对甲苯磺酰氯(477 mg, 2.502 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16 h。用水(100 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (3 x 100 mL)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过制备型HPLC纯化(条件:流动相-10mM碳酸氢铵水溶液:MeCN, 柱-Betasilphenyl hexyl (20X250) mm, 5µ流速-18.0 ml/min, 梯度方法:- 0/49,16/52,16.05/100,19/100,19.05/49,23/49)。合并纯馏分，减压浓缩并冻干得到44-2。M/Z (ESI):654.35 [M+H]+。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) = 8.90 (s, 2H), 8.62 (d,J= 5.2 Hz,4H), 8.42 (s, 1H), 8.06 (s, 1H), 7.75 (d,J= 8.4 Hz, 2H), 7.45 (d,J= 8.0 Hz,2H), 4.85-4.94 (m, 1H), 4.70 (d,J= 13.6 Hz, 1H), 4.48-4.64 (m, 2H), 4.03 (t,J= 4.4 Hz, 2H), 3.92 (s, 3H), 3.50-3.60 (m, 2H), 3.44 (d,J= 6.8 Hz, 2H), 3.36-3.40 (m, 1H), 3.18-3.27 (m, 2H), 2.40 (s, 3H)。
46-7的合成：(R)-2-(4-(5-((2-(3-(甲氧基甲基)-4-(1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1- 基)嘧啶-5-基)乙炔基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-1-基)乙基4-甲基苯磺酸酯
46-8的合成：2-(4-(5-溴嘧啶-2-基)-1H-吡唑-1-基)乙-l-醇
在室温下，向5-溴-2-碘嘧啶(46-3) (1 g, 3.51 mmol)在1,4-二噁烷(8 mL)和H2O (2 mL)中的搅拌溶液中。将反应混合物脱气并通入氩气鼓泡10 min。然后在室温下向该反应混合物中加入2-(4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼杂环戊烷-2-基)-1H-吡唑-1-基)乙-l-醇(0.919 g, 3.86 mmol)、磷酸三钾(2.235 g, 10.53 mmol)和1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(II) (0.257 g, 0.351 mmol)。将反应混合物再次脱气并通入氩气鼓泡2 min。将反应混合物在100℃下搅拌12 h。用水(5 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2x 20 mL)萃取。合并的有机层用盐水(10 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过硅胶柱纯化并用40% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到46-8。M/Z (ESI): 270.90 [M+H]+。
46-10的合成：(R)-2-(4-(5-碘嘧啶-2-基)-2-(甲氧基甲基)哌嗪-1-基)-1,3,5- 三嗪
在0℃下，向36-8(1 g, 2.505 mmol)在DMF (10 mL)中的搅拌溶液中加入碘甲烷(0.711 g, 5.01 mmol)和矿物油中60% NaH (0.200 g, 5.01 mmol)。将反应混合物在室温下搅拌4 h。用水(8 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 50 mL)萃取。合并的有机层用盐水(10 mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过硅胶柱色谱纯化并用30%EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到46-10。M/Z (ESI): 414.18 [M+H]+。
46-9的合成：(R)-(R)-2-(2-(甲氧基甲基)-4-(5-((三甲基甲硅烷基)乙炔基)嘧 啶-2-基)哌嗪-1-基)-1,3,5-三嗪
在室温下，向46-10(680 mg, 1.646 mmol)在ACN (7 mL)中的搅拌溶液中加入DIPEA (0.862 mL, 4.94 mmol)。将反应混合物脱气并通入氩气鼓泡20 min。然后在室温下，向该反应混合物中加入三甲基硅乙炔(323 mg, 3.29 mmol)和XPhos Pd G2 (129 mg,0.165 mmol)。然后将反应混合物在氮气氛围下于80℃搅拌16 h。用水(10 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 50 mL)萃取。合并的有机层用盐水(2 x 10 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用100 g硅胶(100-200目)柱纯化并用50%EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到46-9。M/Z (ESI): 384.32 [M+H]+。
46-11的合成：(R)-2-(4-(5-((2-(3-(甲氧基甲基)-4-(1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪- 1-基)嘧啶-5-基)乙炔基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-1-基)乙-l-醇
在室温下，向46-9(450 mg, 1.173 mmol)在ACN (4 mL)和DMF (1.5 mL)中的搅拌溶液中加入46-8(379 mg, 1.408 mmol)和磷酸三钾(747 mg, 3.52 mmol)。将反应混合物脱气并通入氩气鼓泡15 min。然后在室温下，向该反应混合物中加入XPhos Pd G2 (92 mg,0.117 mmol)。然后将反应混合物在密封管中在氮气氛围下于70℃搅拌18 h。用水(7 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 40 mL)萃取。合并的有机层用盐水(2 x 10 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用40 g硅胶(100-200目)柱纯化并用10% MeOH/DCM洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩。得到的化合物进一步通过制备型HPLC再纯化(条件:流动相-10mM碳酸氢铵水溶液:MeCN, 柱-X-Bridge PACK, C18 (25X150)mm, 5µ流速-20.0 ml/min, 梯度方法0/20,9.5/47.3,9.55/100,12/100,12.05/20,15/20)得到46-11。M/Z (ESI): 500.25 [M+H]+。
46-7的合成：(R)-2-(4-(5-((2-(3-(甲氧基甲基)-4-(1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-1- 基)嘧啶-5-基)乙炔基)嘧啶-2-基)-1H-吡唑-1-基)乙基4-甲基苯磺酸酯
在0℃下，向46-11(120 mg, 0.240 mmol)在DCM (2 mL)中的搅拌溶液中加入TEA(0.100 mL, 0.721 mmol)、DMAP (29.3 mg, 0.240 mmol)和Ts-Cl (114 mg, 0.601mmol)。在室温下，将反应混合物在氮气氛围下搅拌1 h。用水(40 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 70 mL)萃取。合并的有机层用盐水(2 x 40 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用80 g硅胶(230-400目)柱纯化并用3% MeOH/DCM洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩。得到的化合物进一步通过制备型HPLC再纯化(条件:流动相-10mM碳酸氢铵水溶液:MeCN, 柱-X-Bridge, C18 (19X150) mm, 5µ流速-15.0 ml/min,梯度方法- 0/45, 2/45, 12/80, 12.01/100, 15/100, 15.01/45, 18/45)。合并纯馏分，减压浓缩并冻干得到46-7。M/Z (ESI): 654.18 [M+H]+。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) = 8.92 (s, 2H), 8.65 (d,J= 4.8 Hz,4H), 8.35 (s, 1H), 7.99 (d,J= 0.4 Hz, 1H), 7.62 (d,J= 8.4 Hz, 2H), 7.30-7.39(m, 2H), 4.95-5.06 (m, 1H), 4.77 (d,J= 13.6 Hz, 1H), 4.54-4.67 (m, 2H), 4.44(q,J= 3.7 Hz, 4H), 3.45 (d,J= 7.2 Hz, 2H), 3.33-3.40 (m, 1H), 3.15-3.28 (m,5H), 2.31 (s, 3H)。
48-6的合成：(R)-2-(2-((4-(5-((6-(噁唑-5-基)吡啶-3-基)乙炔基)嘧啶-2- 基)-1-(1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-2-基)甲氧基)乙氧基)乙基4-甲基苯磺酸酯
48-5的合成：(R)-2-(2-((4-(5-((6-(噁唑-5-基)吡啶-3-基)乙炔基)嘧啶-2- 基)-1-(1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-2-基)甲氧基)乙氧基)乙-1-醇
向48-4(180 mg, 0.369 mmol)在DMF (2 mL)中的搅拌溶液中通入氩气鼓泡10min。然后在室温下，向该反应混合物中加入48-2(107 mg, 0.443 mmol)、K2CO3(153 mg,1.108 mmol)、碘化铜(I) (7.03 mg, 0.037 mmol)和氯(2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯基)[2-(2'-氨基-1,1'-联苯基)]钯(II) (29.1 mg, 0.037 mmol)。向反应混合物再次通入氩气鼓泡10 min。将反应混合物在80℃下搅拌12 h。用水(100 mL)稀释反应混合物并用EtOAc (3 x 100 mL)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并减压浓缩。粗化合物通过乙醚(2 x 30 mL)研制并减压干燥得到淡黄色固体(5075688-0321-002) (160 mg,0.275 mmol, 74.4% 产率)。从获得的化合物（5075688-0321-002)（160 mg），通过SFC纯化再次纯化30 mg。合并纯馏分并冻干得到48-5。M/Z (ESI): 530.27 [M+H]+。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) = 8.77 (dd,J= 0.8, 2.4 Hz, 1H), 8.65(s, 4H), 8.59 (s, 1H), 8.06 (dd,J= 2, 8.4 Hz, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.83-7.81(m, 1H), 4.96-4.94 (m, 1H), 4.78 (d,J= 13.6 Hz, 1H), 4.60-4.51 (m, 3H), 3.52(d,J= 7.2 Hz, 2H), 3.49-3.44 (m, 2H), 3.43-3.39 (m, 5H), 3.36-3.31 (m, 2H),3.26-3.25 (m, 1H), 3.26-3.16 (m, 1H)。
48-6的合成：(R)-2-(2-((4-(5-((6-(噁唑-5-基)吡啶-3-基)乙炔基)嘧啶-2- 基)-1-(1,3,5-三嗪-2-基)哌嗪-2-基)甲氧基)乙氧基)乙基4-甲基苯磺酸酯
在0℃下，向48-5(130 mg, 0.245 mmol)在DCM (1 mL)中的搅拌溶液中加入TEA(0.103 mL, 0.736 mmol)、DMAP (3.00 mg, 0.025 mmol)和p-TsCl (140 mg, 0.736mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌16 h。用水(100 mL)稀释反应混合物并用EtOAc (3 x100 mL)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥并减压浓缩。粗化合物通过制备型HPLC纯化。合并纯馏分并冻干得到48-6。M/Z (ESI): 684.20 [M+H]+。
制备型HPLC方法:
流动相- 10mM碳酸氢铵水溶液:MeCN
柱-X-Bridge C18 (10X250mm), 5µ流速-7 ml/min
梯度方法-0/52,2/52,7.5/55.5,10/55.5,10.05/100,12/100,12.05/52,16/52。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ (ppm) = 8.79 - 8.76 (m, 1H), 8.63 (s, 4H),8.59 (s, 1H), 8.06 (dd,J= 2.1, 8.3 Hz, 1H), 7.88 (s, 1H), 7.83 (dd,J= 0.8,8.3 Hz, 1H), 7.79 - 7.75 (m, 2H), 7.45 (d,J= 8.0 Hz, 2H), 4.97 - 4.90 (m,1H), 4.77 (br d,J= 13.5 Hz, 1H), 4.63 - 4.51 (m, 2H), 4.08 - 4.05 (m, 2H),3.53 - 3.47 (m, 4H), 3.43 - 3.39 (m, 2H), 3.37 (br d,J= 2.4 Hz, 3H), 3.29 -3.16 (m, 2H), 2.39 (s, 3H)。
52-7的合成：(R)-2-(2-((4-(5-((2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-5-基)乙炔基) 嘧啶-2-基)-1-(嘧啶-2-基)哌嗪-2-基)甲氧基)乙氧基)乙基4-甲基苯磺酸酯
52-4的合成：5-溴-2-((3R)-4-(嘧啶-2-基)-3-((2-(2-((四氢-2H-吡喃-2-基)氧 基)乙氧基)乙氧基)甲基)哌嗪-1-基)嘧啶
在0℃下，向52-1(2.0 g, 5.06 mmol)在DMF (40 mL)中的搅拌溶液中加入油中60% NaH (0.304 g, 7.59 mmol)并在0℃下搅拌30 min。然后在0℃下，向反应混合物中加入2-(2-溴乙氧基)四氢-2h-吡喃(2.116 g, 10.12 mmol)。将反应混合物在80℃下搅拌16h。用水(150 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (3 x 200 mL)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩得到52-4。M/Z (ESI): 525.11 [M+H]+。
52-5的合成：(R)-2-(2-((4-(5-溴嘧啶-2-基)-1-(嘧啶-2-基)哌嗪-2-基)甲氧 基)乙氧基)乙-1-醇
在0℃下，向52-4(2 g, 3.82 mmol)在DCM (30 mL)中的搅拌溶液中加入4M 1,4-二噁烷盐酸盐(3.82 mL, 15.28 mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌3 h。减压浓缩反应混合物。用NaHCO3水溶液稀释残留物并用EtOAc (3 x 80 mL)萃取。合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用25 g硅胶纯化并用35% EtOAc/石油醚洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到52-5。M/Z (ESI): 439.07 [M+H]+。
52-6的合成：(R)-2-(2-((4-(5-((2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-5-基)乙炔基) 嘧啶-2-基)-1-(嘧啶-2-基)哌嗪-2-基)甲氧基)乙氧基)乙-1-醇
在室温下，向52-5(800 mg, 1.821 mmol)在DMF (8 mL)中的搅拌溶液中加入44-1(607 mg, 2.367 mmol)、K2CO3(755 mg, 5.46 mmol)、碘化铜(I) (34.7 mg, 0.182 mmol)和氯(2-二环己基膦基-2',4',6'-三异丙基-1,1'-联苯基)[2-(2'-氨基-1,1'-联苯基)]钯(II) (143 mg, 0.182 mmol)并在室温下用氩气脱气10 min。在80℃下，将反应混合物于密封管中在氮气氛围下搅拌16 h。用水(50 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc (2 x 50 mL)萃取。合并的有机层用盐水(2 x 30 mL)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用100 g硅胶反相RP GOLD柱纯化并用50% ACN/水洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到52-6。M/Z (ESI): 543.71 [M+H]+。
52-7的合成：(R)-(R)-2-(2-((4-(5-((2-(1-甲基-1H-吡唑-4-基)嘧啶-5-基)乙 炔基)嘧啶-2-基)-1-(嘧啶-2-基)哌嗪-2-基)甲氧基)乙氧基)乙基4-甲基苯磺酸酯
在0℃下，向52-6(90 mg, 0.166 mmol)在DCM (1 mL)中的搅拌溶液中加入TEA(0.116 mL, 0.829 mmol)、4-二甲基氨基吡啶(2.026 mg, 0.017 mmol)和p-TsCl (95 mg,0.498 mmol)。将反应混合物在25℃下搅拌16 h。用水(40 mL)淬灭反应混合物并用EtOAc(2 x 40 mL)萃取。合并的有机层用盐水(20 mL)洗涤，经无水Na2SO4干燥，过滤并减压浓缩。粗化合物通过Biotage用100 g硅胶反相RP GOLD柱纯化并用70% ACN/水洗脱化合物。合并纯馏分并减压浓缩得到52-7。M/Z (ESI): 697.37 [M+H]+。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ = 8.89 (s, 2H), 8.61 (s, 2H), 8.36-8.47(m, 3H), 8.05 (d,J= 0.4 Hz, 1H), 7.77 (d,J= 8.4 Hz, 2H), 7.44 (d,J= 8.0 Hz,2H), 6.67 (t,J= 4.8 Hz, 1H), 4.83-4.91 (m, 1H), 4.78 (d,J= 13.6 Hz, 1H),4.47-4.57 (m, 2H), 4.08 (t,J= 4.4 Hz, 2H), 3.92 (s, 3H), 3.50-3.56 (m, 2H),3.34-3.49 (m, 7H), 3.22-3.29 (m, 2H), 2.39 (s, 3H)。
表3中包含的化合物由表3中最后一列所示的上述合成步骤通过类似的方法合成。在必要时用市售试剂代替以制备下面的实施例。
表3
[3H]-1000的合成:[3H]-(S)-6-(1H-咪唑-1-基)-N-(2-(2-甲基-4-(吡啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶-5-基)烟酰胺
中间体ST-A的合成：(S)-2-(2-甲基-4-(吡啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶-5-胺
1000-2的合成：(S)-叔丁基3-甲基-4-(5-硝基嘧啶-2-基)哌嗪-1-甲酸酯
向(S)-叔丁基3-甲基哌嗪-1-甲酸酯(1000-1, 13.6 g, 67.9 mmol)在DMF(150mL)的溶液中加入K2CO3(14.08 g,102 mmol)和2-氯-5-硝基嘧啶(12.46 g,78 mmol)。将混合物在N2氛围下于25℃搅拌12 h。TLC表明起始物质完全消耗。加入水(450 mL)并将混合物在25℃ (rt)下搅拌30 min。通过过滤收集沉淀的固体，用水(100 mL x 3)洗涤并干燥以获得固体1000-2。
1H NMR (500 MHz, 三氯甲烷-d): δ = 9.07 (s, 2H), 5.06 (br s, 1H), 4.67(br s, 1H), 3.91~4.29 (m, 2H), 3.28~3.36 (m, 1H), 3.13 (br s, 1H), 2.83~3.01(m, 1H), 1.45~1.52 (m, 9H), 1.26 (d,J= 6.5 Hz, 3H)
1000-3的合成：(S)-2-(2-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基嘧啶
在0℃下，向1000-2(21 g, 64.9 mmol)在DCM (160 mL)的溶液中加入TFA (40mL)。将混合物在25℃下搅拌2 h。TLC表明大部分起始物质被完全消耗。减压浓缩混合物，得到油状粗产物(S)-2-(2-甲基哌嗪-1-基)-5-硝基嘧啶(25 g,78 mmol)。用DCM(200 mL)和H2O (160 mL)稀释产物。然后向溶液中加入Na2CO3调节pH至7~8。将溶液用 DCM (200 mL2)萃取。有机层经Na2SO4干燥，过滤并浓缩以得到固体1000-3。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6): δ = 9.44 (s, 1H), 8.92~9.10 (m, 1H), 5.13~5.24 (m, 1H), 4.82 (d,J= 14.4 Hz, 1H), 3.31~3.49 (m, 3H), 3.26 (d,J= 7.2 Hz,1H), 3.06 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 1.52 (s, 1H), 1.33 (d,J= 7.2 Hz, 3H). MS (ESI)m/z: 224.0 [M+H]+。
1000-4的合成：(S)-2-(2-甲基-4-(吡啶-2-基)哌嗪-1-基)-5-硝基嘧啶
向1000-3 (2.5 g, 11.20 mmol)在二噁烷(50 mL)中的溶液中加入2-溴吡啶(3.72 g, 23.52 mmol)、Cs2CO3(14.96 g, 45.9 mmol)和氯(2-二环己基膦-2’,6’-二甲氧基-1,1’-联苯基)[2-(2’-氨基-1,1’-联苯基)]钯(II) (0.968 g, 1.344 mmol)。将混合物在氮气氛围下于110℃搅拌12 h。TLC表明大部分起始物质被完全消耗。将混合物过滤并浓缩。残留物用EtOAc (350 mL)和H2O (60 mL)萃取。合并的有机萃取物用盐水(100 mL)洗涤，用无水Na2SO4干燥并过滤。减压浓缩滤液。将残留物用硅胶柱纯化，用15~30% EtOAc/PE洗脱，得到固体1000-4。
1H NMR (400 MHz, 三氯甲烷-d): δ = 9.10 (s, 2H), 8.17~8.24 (m, 1H),7.47~7.59 (m, 1H), 6.62~6.71 (m, 2H), 5.11 (dt,J= 6.4, 3.2 Hz, 1H), 4.74 (dt,J= 13.6, 3.6 Hz, 1H), 4.24 (d,J= 12.8 Hz, 1H), 4.13 (d,J= 13.2 Hz, 1H), 3.53~3.63 (m, 1H), 3.37 (dd,J= 13.2, 4.0 Hz, 1H), 3.12 (td,J= 12.0, 3.6 Hz, 1H),1.34 (d,J= 6.8 Hz, 3H)。MS (ESI) m/z: 301.0 [M+H]+。
(S)-2-(2-甲基-4-(吡啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶-5-胺(Int ST-A)的合成
向1000-4 (2.5 g, 8.32 mmol)在MeOH (40 mL)中的溶液中加入Pd/C (0.2 g,1.879 mmol)。将混合物在H2氛围下于25℃搅拌2 h。TLC表明大部分起始物质被完全消耗。过滤混合物，并用MeOH (3200 mL)洗涤滤饼。减压浓缩合并的有机萃取物得到油状IntST-A。
1H NMR (400 MHz, 三氯甲烷-d): δ = 8.19 (dd,J= 4.8, 1.2 Hz, 1H), 8.01(s, 2H), 7.45~7.50 (m, 1H), 6.66 (d,J= 8.8 Hz, 1H), 6.60 (dd,J= 6.8, 5.2 Hz,1H), 4.76~4.85 (m, 1H), 4.32~4.40 (m, 1H), 4.19~4.26 (m, 1H), 4.10 (dt,J=12.8, 2.0 Hz, 1H), 3.23~3.41 (m, 2H), 3.15 (s, 2H), 3.01~3.08 (m, 1H), 1.22(d,J= 6.8 Hz, 3H)。MS (ESI) m/z: 271.1 [M+H]+。
化合物1000的合成：(S)-6-(1H-咪唑-1-基)-N-(2-(2-甲基-4-(吡啶-2-基)哌嗪- 1-基)嘧啶-5-基)烟酰胺
在25℃下，向Int ST-A(150 mg, 0.555 mmol)和6-(1H-咪唑-1-基)烟酸(157 mg,0.832 mmol)在THF (30 ml)中的搅拌溶液中加入TEA (0.193 ml, 1.387 mmol)和1-丙基膦酸酐(0.495 ml, 0.832 mmol)并在25℃下搅拌16 h。用冷水(10 mL)淬灭反应混合物并用乙酸乙酯(2 x 100 mL)萃取，合并的有机层用盐水(2 x 10 mL)洗涤，经硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩并将粗化合物通过制备型HPLC纯化(流动相-10mM碳酸氢铵水溶液:MeCN, 柱-X-Select C18 (19X250) mm 5µ流速-18ml/min, 梯度方法-0/45, 6.9/76, 6.95/100, 9/100, 9.05/45, 12/45)。合并纯馏分并冻干得到淡黄色固体1000。M/Z (ESI): 442.14 [M+H]+。
1H NMR (400MHz, DMSO-d6) δ: 10.43 (s, 1H), 9.04 (d, J=2.0 Hz, 1H),8.71 (s, 2H), 8.66 (s, 1H), 8.52 (dd, J=8.7, 2.3 Hz, 1H), 8.12 (dd, J=4.9,1.2 Hz, 1H), 8.06 (t, J=1.2 Hz, 1H), 8.01 (d, J=8.6 Hz, 1H), 7.55 (ddd, J=8.6, 7.0, 2.2 Hz, 1H), 7.18 (s, 1H), 6.86 (d, J=8.8 Hz, 1H), 6.60-6.67 (m,1H), 4.85 (dt, J=6.4, 3.2 Hz, 1H), 4.41-4.49 (m, 1H), 4.17-4.31 (m, 2H), 3.28(br d, J=3.7 Hz, 1H), 3.19 (br dd, J=13.1, 3.8 Hz, 1H), 2.90-3.01 (m, 1H),1.16 (d, J=6.6 Hz, 3H)。
在手套箱中，将化合物1000(1.33 mg, 3.0 μmol)溶解于CPME (75 µL)和NMP (25µL)中。将镍预催化剂(ipcADI)NiBr2(6.73 mg)溶解于CPME (670 µL)中，并用NaHBEt3的甲苯溶液(1 M, 25 µL)处理，然后搅拌5分钟。将底物溶液(100 µL)与活性催化剂溶液(200 µL,3.5µmol)在氚化容器(tritiation vessel)中混合，并用便携式Swagelok®阀固定。将该阀连接到Trisorber，并在引入102 mm氚气体之前经历两个冷冻-泵送-解冻循环。将反应物解冻，然后置于45℃的油浴中并搅拌过夜。在废料床上捕获残余氚后，将反应物转移到装有10mL饱和碳酸氢钠水溶液的小瓶中。用二氯甲烷萃取该混合物三次。合并的有机层经硫酸钠干燥并蒸发。将残留物溶解在EtOH中用于LSC和放射-HPLC分析。粗产率：120 mCi; RCP:67%。通过HPLC纯化该物质。将收集的馏分用等体积的水稀释，在一对C18柱上富集并用EtOH洗脱。产率：约20 mL乙醇溶液@3.18mCi/mL。通过质谱测定比活性为44.9 Ci/mmol;C23H17T7N9O [M+H]+的分子量：456.3，实测值：456.0。
HPLC分析型条件
方法:在12分钟内10-95%B,保持3 min, 6 min再平衡
柱: Gemini NX C18, 4.6 x 50 mm, 3.5 mm @ 40oC
流速: 1 mL/min
进样量: 1.0 µL
检测器: UV @ 294 nm
流动相A: 0.05 M pH 10 TEAA，在H2O中
流动相B: CH3CN
产物洗脱时间: 6.32分钟
HPLC制备型分离条件
方法:等度(A:B = 65:35)
柱: Gemini NX C18, 10 x 250 mm @ 40oC
流速: 5 mL/min
进样量: 0.5 mL
检测器: UV @ 295 nm
流动相A: 0.05 M pH 10 TEAA，在H2O中
流动相B: CH3CN
[3H]-2的合成:[3H]-(R,E)-5-(2-(6-(1H-咪唑-1-基)吡啶-3-基)乙烯基)-2-(3-(甲氧基甲基)-4-(嘧啶-2-基)哌嗪-1-基)嘧啶
将实施例编号1(4.55 mg, 10 µmol)与二甲基乙酰胺(0.1 mL)在氮气下在1 mL压封V型小瓶(crimp-sealed V-vial)中混合。在加入五氧化钠(1.4 M, 6.9 µL, 9.7 µmol)后，黄色悬浮液变暗为橙色，但固体未完全溶解。在室温下搅拌30 min后，在氮气下将悬浮液转移至在单独的1 mL压封V型小瓶中的50 mCi [3H]对硝基苯磺酸甲酯(0.6 µmol)中。将小瓶在油浴中加热过夜。将反应在NaHCO3和CH2Cl2的饱和水溶液中分配。将水溶液用CH2Cl2萃取三次。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥并蒸发以通过RP-HPLC分析提供具有24.5mCi、57%放射化学纯度的粗物质。通过半制备型HPLC纯化[3H]-2。将收集的馏分用等体积的水稀释，在一对C18柱上浓缩并用EtOH洗脱。产率：20 mL乙醇溶液@0.28mCi/mL。通过质谱测定比活性为63.0 Ci/mmol; C24H23T3N9O [M+H]+的分子量：462.2，实测值：462.0。
HPLC分析型条件
方法: 在12分钟内10-95%B,保持3 min, 6 min再平衡
柱: Gemini NX C18, 4.6 x 50 mm, 3.5 mm @ 40oC
流速: 1 mL/min
进样量: 3.0 µL
检测器: UV @ 335 nm
流动相A: 0.1% TFA，在H2O中
流动相B: 0.1% TFA CH3CN
产物洗脱时间: 4.43分钟
HPLC制备型分离条件
方法:等度(A:B = 55:45)
柱: Gemini NX C18, 10 x 250 mm @ 40oC
流速: 5 mL/min
进样量: 0.6 mL
检测器: UV @ 340 nm
流动相A: 0.05 M pH 10 TEAA，在H2O中
流动相B: CH3CN
测定方法
用于体外结合测定的人死后组织样品的获取
来自PD患者的冷冻人脑组织购自Analytic Biological Services公司。所述样品是来自临床诊断为晚期PD的捐献者的死后组织。α-突触核蛋白、tau蛋白和淀粉样蛋白负荷通过对冷冻的薄冠状切片的免疫组织化学结合对去污剂不溶性蛋白质部分中蛋白质水平的基于α-Lisa的定量来确定。鉴定出来自一个供体的颞叶皮质的组织样品具有中至高的α-突触核蛋白负荷、低淀粉样蛋白和最小至无tau病理。来自该患者的颞叶皮质的去污剂不溶性部分被用于支持匀浆结合研究。
用于体外结合研究的人脑组织的去污剂不溶性部分的制备
用解剖刀片从颞叶皮层组织中分离出灰质，并用精细解剖剪剪碎。为了制备不溶性部分，将剪碎的组织用玻璃Dounce组织研磨器在冰冷的TBS-TX缓冲液(50mM Tris + 150mM NaCl + 1% Triton X100 + 1mM EDTA + 1片/10mL of Complete蛋白酶抑制剂+ 1片/10mL PHOSSTOP磷酸酶抑制剂片剂)中匀浆。将匀浆以100,000 x g离心45分钟。将沉淀在TBS-TX缓冲液中重悬，使用Polytron在4℃下以最高转速处理30秒。将匀浆以100,000 x g离心45分钟，并将沉淀在TBS-TX缓冲液中重悬。对最终的匀浆进行BCA蛋白测定以确定蛋白浓度。将匀浆等分装于0.5 ml/管中，并保存于-70℃直至使用。
α-突触核蛋白组织匀浆结合测定方法(测定1)
对于α-突触核蛋白置换（displacement）结合测定，将化合物和对照品溶于二甲亚砜(DMSO)中，并通过Echo 655液体处理仪(Beckman Coulter, Indianapolis, IN)使用聚焦声能将其转移到指定的独特条形码化96-孔v-底低吸附聚丙烯微孔板(ThermoScientific, 249946)的指定孔中。在微孔板第2-11列，化合物浓度从高到低，以10-点、3倍递减的方式制备化合物剂量反应曲线。当从1 mM开始时，剂量响应曲线的最终测定浓度范围为1.2 μM至0.061 nM (0.12 % DMSO最终测定浓度, 270 nL/孔)。对照组不包括抑制剂(仅DMSO)，分配到孔A1–D1、A12–D12中以获得最小效力信号，以及将化合物1000以12 μM的最终测定浓度分配到孔E1–H1、E12–H12中以获得最大效力信号。使用配备有96LT一次性尖端头(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)的Bravo自动液相处理平台进行用于分配PD脑匀浆的不溶性部分和放射性配体的液体处理步骤。将PD脑匀浆的不溶性部分在测定缓冲液中稀释至50 μg/mL，并将200 μL分配至测定板，以获得10 μg/孔的最终浓度。将25 μL的(9X) [3H]-1000分配至测定板，以获得3.0 nM的最终测定浓度。将密封的测定板在室温下温和震荡孵育90分钟。使用FilterMate Harvester （PerkinElmer）通过UniFilter-96GF/C微孔板(在4oC下用0.2%聚乙烯亚胺预处理30分钟)快速过滤来终止孵育。随后使用冰冷的杜氏磷酸盐缓冲液(DPBS, Gibco 14190136)以总体积3.75 mL将微孔板洗涤4次，然后在47℃下用真空烘箱(Fisher Scientific Isotemp 285A)干燥90分钟或在室温下过夜。将每个UniFilter-96 GF/C微孔板的底部粘合密封(PerkinElmer 6005199)后，每孔加入50 μL MicroScint-20液体闪烁液(PerkinElmer 6013621)。然后将透明粘合密封膜(TopSeal-APLUS, PerkinElmer 6050185)应用于每个微孔板的顶部并且在MicroBeta2系统(PerkinElmer, 型号: 2450-0120)上1分钟/孔计数。使用IDBS ActivityBase XE Runner(版本9.6.0.148)分析数据，确定Ki值，示于数据表1中(Kd值0.90 nM，配体浓度3.0 nM)。
AD组织中病理性聚集的β淀粉样蛋白的竞争性放射性配体结合(测定2)：
阿尔茨海默病（AD）冷冻人脑样本购自Analytic Biological Services公司。该样品是来自临床诊断为AD的捐献者的死后组织，将大部分白质从额叶皮质中剥离以富集灰质的组织制剂。通过将组织在冰冷的磷酸盐缓冲液(PBS, pH 7.4)中以80 mg湿重组织/ml在4oC下用Polytron的16档位匀浆45秒来制备富含灰质的额叶皮质的脑匀浆。用冰冷的PBS将匀浆进一步稀释为30 mg湿重组织/ml，并如上所述再匀浆一分钟。匀浆以5 ml/管分装并在-70oC下保存直至使用。
本测定中使用放射性配体[3H]-105，其按照ACS Med. Chem. Lett., Vol. 2,498-502页所述制备。
对于热饱和结合测定，在测定缓冲液(PBS加0.1% BSA)加20% DMSO中制备各种浓度的范围为3.9-500 nM的放射性配体[3H]-105。将25 μl放射性配体加入到200 μl粗制脑匀浆（在测定缓冲液中稀释至0.5 mg/ml）中，使放射性配体的终浓度为0.39-50 nM，最终粗制脑匀浆为100 μg湿重/测定孔（孵育、过滤和测定中使用的放射性配体的量描述于下文中）。使用与未标记化合物的自阻断来确定非特异性结合。使用Graphpad/Prism软件分析饱和数据。图1展示了[3H]-105与富含聚集的β-淀粉样蛋白病理的AD组织匀浆的高亲和力饱和结合。图1显示了[3H]-105的热饱和结合实例，其中放射性配体显示了对AD脑匀浆中聚集的β-淀粉样蛋白(aβ)的高亲和力，测得的解离常数为11 nM。该数据支持了该配体在放射性配体结合测定中的用途，用于针对与聚集的β-淀粉样蛋白的结合进行筛选。
在实验2中，将未标记的测试化合物以10 mM溶于DMSO中。在100% DMSO中以1000倍最终测定浓度制备测试化合物的不同浓度的稀释液，将0.225μl等分至测定板中。将脑匀浆在测定缓冲液中从最初的30 mg/ml体积稀释至0.5 mg/ml，将200μl添加到测定板中，最终浓度为100μg湿重/测定孔。在测定缓冲液加20% DMSO中以10倍最终浓度制备[3H]-105，将25μl添加到测定板中，最终测定浓度为3.0 nM。将该板在37℃下孵育90分钟。通过使用Packard Filtermate将结合的配体过滤到GF/B滤板(用0.1% PEI预处理30分钟)，并用pH7.4的2.5 ml冰冷的5 mM Tris洗去未结合的配体，分离未结合的配体与结合的配体。将滤板在57℃下干燥1小时，并向板的每个孔中加入50μl Microscint。使用PerkinElmerTopCount对板计数每孔1分钟的3H cpm。使用IDBS Activity Base分析数据以确定Ki值，如数据表1中所示(Kd值11.0 nM，配体浓度3.5 nM)。
Triton-提取的来自PD组织的α-突触核蛋白（测定1）与Aβ-富集的AD组织（测定2）的放射性配体结合数据——数据表1
ND=未测定
人PD脑组织(切片与匀浆)中[3H]-2的体外结合
为了评估测试的人脑样品中α-突触核蛋白病理(路易体LB和路易神经突LN)的存在，将相邻的人PD脑切片用于放射自显影(ARG)和免疫组化(IHC)研究。使用与PD脑切片的LB和LN结合的放射性标记化合物进行ARG。使用针对LB和LN (LB509)、Aβ (6E10)和p-tau(AT8)的抗体进行IHC。使用人PD脑皮层脑匀浆进行组织匀浆结合。在同一研究中使用来自无神经疾病捐献者的人脑作为对照。
体外放射自显影程序：
帕金森病(PD)的冷冻人脑样本由Banner Sun Health Institute (USA)和SydneyBrain Bank (澳大利亚)通过与Michael J Fox Foundation (MJFF)的合作提供。其他的PD和非PD脑样本购自供应商(Analytic Biological Services Inc.、ABS、和Discovery LifeScience, DLS)。使用冷冻切片机(Leica CM3050)制备冷冻脑切片(14µm厚)并按顺序保存。将组织切片置于Superfrost Plus载玻片(货号5075-FR, Brain Research Laboratories,USA)，在室温下干燥，于-70℃保存在载玻片盒中直到使用。[3H]-2由Merck的放射性化合物标记合成组合成。[3H]-2的比活度为62.95 Ci/mmol。用于体外放射自显影的放射性配体的最终浓度为3 nM。在结合实验的当天，从每组脑样品中选择相邻的切片用于体外放射自显影研究，并将其指定为总结合和非可置换结合（NDB）。将这些切片在生物安全柜中室温下解冻15分钟。在该研究中使用单一浓度的[3H]-2。在不存在竞争剂的情况下定义脑切片中放射性配体的总结合，并且在存在竞争物(1.0µM未标记的自阻断物)的情况下测定非可置换结合(NDB)。首先将脑载玻片在pH7.4的PBS缓冲液中在室温下预孵育15分钟。然后将切片转移到含有上述放射性配体或放射性配体加上竞争剂的新鲜缓冲液中，并在室温下孵育90分钟。通过在冰冷(4℃)的洗涤缓冲液(PBS, pH 7.4)中洗涤切片三次，每次洗涤持续三分钟来终止孵育。洗涤后，将切片在冰冷(4℃)的去离子水中短暂漂洗，然后在室温下通过鼓风机完全干燥。将切片在密封盒中靠着富士磷屏成像板(Fuji Phosphor Image Plate，TR2025)放置，在室温下曝光。曝光三周后，在Amersham Typhoon Imager中扫描板，并使用MCID7.1软件分析扫描的图像。使用[3H]-微量天平(Amersham Biosciences, GE)定量放射性配体结合密度。所有切片结合测定都在指定用于使用人体组织研究的实验室中进行。
图2描绘了[3H]-2与PD脑杏仁核切片的α-突触核蛋白病理的特异性结合。基于IHC研究的LB509 (α-syn)和AT8 (tau)的免疫反应性(IR)，该图在区域A中显示阳性LB509 IR和最小AT8 IR。相反，图2的区域B显示阳性AT8 IR和最小的LB509 IR。通过IHC，[3H]-2结合的放射自显影图像仅与区域A中的独特LB509 IR图谱匹配，而与区域B中的AT8 IR图谱不匹配，表明[3H]-2与PD脑的α-突触核蛋白病理特异性结合。
组织匀浆结合程序：
帕金森病（PD）的冷冻人脑样本由Banner Sun Health Institute (USA)和SydneyBrain Bank (澳大利亚)通过与Michael J Fox Foundation (MJFF)的合作提供。其他的PD和非PD脑样本购自供应商(Analytic Biological Services Inc、ABS和Discovery LifeScience, DLS)。它们来自临床诊断为PD或非PD的捐献者的死后组织。脑皮质的脑匀浆通过在冰冷的pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中匀浆皮质，在Polytron的档位6于4℃下30秒制备。脑匀浆的最终浓度为每1 mL缓冲液30 mg湿重组织。匀浆分装为1 mL/试管，在-70℃下保存直至使用。
[3H]-2由Merck的放射性化合物标记合成组合成。[3H]-2的比活度为62.95 Ci/mmol。对于热饱和结合测定，使用各种浓度的放射性配体，范围为20 nM至0.2 nM。用测定缓冲液(Tris, pH 7.5, 0.1% BSA)将脑匀浆从最初的30 mg/mL体积稀释至2.2 mg/mL的终浓度，并且在测定中使用250 μl/测定管。将未标记的测试化合物以10 mM溶解在DMSO中。用含有2% DMSO的测定缓冲液制备测试化合物的各种浓度的稀释液。在不存在竞争化合物的情况下定义总结合，并且在存在1 μM未标记的自阻断物的情况下测定非可置换结合。将化合物稀释液(10X)添加到含有200 μL脑匀浆稀释液的测定管(25µL/每管,单独)中，并且在室温下预孵育30分钟，然后将放射性配体稀释液(10X)添加到测定管(25µL/每管，单独)中至最终体积为250 μL/管。在37℃下孵育120分钟，然后用Skatron 12孔收集器将测定样品过滤到GF/C过滤器上，设置5 – 5 – 5 (~ 3x2ml)冰冷缓冲液(Tris, pH 7.5)洗涤。在使用前，将用于Skatron收集器的GF/C过滤纸在室温下预浸泡在0.1% BSA中1小时。将过滤器冲压到闪烁瓶中。向每个瓶中加入液体闪烁液(2mL Ultima Gold)，使其浸入过滤器中4小时，并在Perkin Elmer Tri-Carb 2900TR上计数1分钟。用Prism软件进行数据分析。在指定用于使用人体组织的研究的实验室中，根据测定设置一式两份或三份进行所有测定。
数据表2–人帕金森病组织匀浆中[3H]2的体外结合数据
[11C]-2的放射化学合成
在室温下，在氩气下，将在二甲基甲酰胺(50 µL)中的叔丁醇钠2.5M (1.3 µL,3.3 µmol)缓慢加入到在二甲基甲酰胺(250 µL)中的实施例编号1(0.41 mg, 0.93 µmol)中。15分钟后，在室温下将[11C]碘甲烷在反应混合物中鼓泡。将溶液在室温下保持3分钟，加入水(700 µL)，并将粗产物注入半制备型HPLC柱中。使用Luna, 5u, C18, 250X10 mm(Phenomenex)以5 mL/min的流速纯化产物。流动相为乙腈/0.1%甲酸，在15分钟内从20%至50%。收集10-11分钟洗脱的放射性级分，用20 mL注射用水稀释，并加载到Waters Sep-PakClassic C18 cartridge (Waters, Milford, MA, USA)中。用10 mL水漂洗Sep-Pak，然后用乙醇(0.5 mL)洗脱至10 mL无菌小瓶中，并稀释为所需制剂。借助于分析型HPLC系统(Agilent)，使用Gemini,5μ，C18,150 X4.6 mm (Phenomenex)，以1 mL/min的流速测试最终产物的化学和放射化学纯度。流动相是由乙腈/0.1%三氟乙酸在水中组成的混合物，在7分钟内从5%至90%。借助于紫外检测器(254 nm)测定实施例编号2浓度。通过共注射实施例编号2的样品来确定产物的身份，并使用碘化钠检测器(Bioscan)测定放射化学纯度。[11C]-2的保留时间为5.9分钟。
恒河猴中的[11C]-2成像
用氯胺酮I.M. (15 mpk)麻醉禁食的恒河猴(7-11 kg)，并将猴子置于PET扫描仪床上。将I.V.导管插入到右隐静脉中。为了动脉取样，无菌处理右股区域，放置动脉导管并用缝线固定。
随后用异丙酚维持麻醉。诱导剂量为5 mg/kg I.V.，随后在扫描过程期间以0.4-0.6 mg/kg/min的速度输注。动物被插管并置于相机机架内，仰卧，头朝前。在研究期间以约23次呼吸/分钟的速度将动物维持在通气的医用级空气:氧气混合物中。调整通气I:E比率、体积和呼吸速率以将CO2水平维持在约40 mmHg和将SpO2水平维持在95-100%。连接温度探头、脉搏血氧仪、无创血压袖带和潮气末CO2监护仪。通过在动物的背侧和腹侧放置K-模块加热垫来保持体温。在整个扫描过程中使用10 ml/kg/hr的IV乳酸林格氏液维持常规液体治疗。将另一条线放置在较低的隐动脉中用于采样并连接到Instech自动血液采样系统。通过注射泵在2分钟内静脉注射[11C]-2的等分试样，在注射时开始正电子发射成像并持续90分钟。
经由动脉导管将全血样品收集到肝素管中以用于测定全血和血浆中的放射性。将样品离心并且在PET配体注射后20、40、80、100、120和150秒计数20 μl全血和血浆。在3、5、15、30、60和90分钟时采集血液样品(0.8 ml)用于代谢物校正并且测定血浆和全血中的放射性。
图3示出了恒河猴脑中[11C]-2的PET影像的冠状切片。该影像是在注射后30-90分钟内取平均值并且覆盖在脑MRI模板上。这证明了[11C]-2在猴脑中的适当分布。
[18F]-配体的放射化学合成
[18F]-38的放射化学合成
将[18F]氟化物在阴离子交换树脂上浓缩，在使用之前用EtOH (10 mL)冲洗，然后用0.5M K3PO4在H2O (10 mL)中的溶液和H2O (10 mL)冲洗进行预处理。
含[18F]氟化物的阴离子交换树脂用甲磺酸四丁基铵(6.8 mg, 20 μmol)在CH3CN/H2O 1:1 (1.0 mL)中的溶液洗脱，然后用CH3CN (0.5 mL)洗脱至2.5 mL V-形排气小瓶中，并在氩气流下使用常规加热于100℃干燥。加入另外的等分份CH3CN (2 x 0.5 mL)以进行共沸干燥。向含有干燥的[18F]Bu4NF的小瓶中加入38-20(0.9 mg, 1.3 μmol)在DMSO (0.5mL)中的溶液。将反应混合物在100℃下加热10分钟，然后转移至室温下含有H2O (0.8 mL)的小瓶中进行稀释，混合并注射到半制备型高效液相色谱柱上。该产物用Gemini C6-PhenylHexyl, 5 μm, 250x10mm HPLC柱(Phenomonex)纯化，流速为5 ml/min，流动相为37%CH3CN / 10 mM Na2HPO4pH 7.4。将在20.6和21.6分钟之间洗脱的放射性级分收集到含有10% captisol/H2O (0.5 mL)的圆底烧瓶中，在负压下蒸发除去CH3CN并转移到10 mL无菌小瓶中。借助分析型HPLC系统(Agilent)测试最终产物的化学和放射化学纯度，所述分析型HPLC系统使用Luna PFP(2), 3 μm, 150x3.0mm HPLC柱(Phenomonex)，流速为0.7 ml/min，流动相为CH3CN/H2O，梯度为40-50%。借助紫外检测器(254 nm)测定[18F]38的浓度。通过共注射化合物38的样品来确认产物的身份，并使用碘化钠检测器(Bioscan)测定放射化学纯度。[18F]38的保留时间为5.4分钟。
[18F]44的放射化学合成
将[18F]氟化物在阴离子交换树脂上浓缩并在使用前洗脱。将含[18F]氟化物的阴离子交换树脂用Kryptofix 222 (7 mg, 19 µmol)和K2CO3(2.1 mg, 15 µmol)在乙腈/水(80/20, 0.7 ml)中的溶液洗脱并转移至4 ml排气小瓶中。将氟化物在氩气流下于90℃干燥。加入另外的等分份乙腈(2 x 0.5 ml)以在90℃共沸干燥。
将44-2(0.51 mg, 0.78 µmol)在CH3CN (0.5 mL)中的溶液加入到含有干燥的[18F]氟化物的4 ml小瓶中，移除排气管线，并将反应混合物在90℃ (60 W)加热15分钟。冷却至<50℃后，用高效液相色谱洗脱液(~2 mL)稀释反应物，混合并注入半制备型高效液相色谱柱。使用Gemini, C6-Phenyl, 110A, 150X10 mm (Phenomenex)，流速为5 mL/min纯化产品。流动相为乙腈-10 % H2O/Na2HPO4(10 mM)，在15分钟内从30%至70%。
将在15-16分钟之间洗脱的放射性级分收集在含有30% ß-环糊精溶液(1mL)的烧瓶中，在负压下蒸发，用盐水稀释，并转移到无菌容器中。借助于分析型HPLC系统(Agilent)，使用ONYX Monolithic, 5µ, C18, 100x3 mm (Phenomenex)，以1.5 mL/min的流速测试最终产物的化学和放射化学纯度。流动相是由乙腈/0.1%甲酸在水中组成的混合物，在7分钟内从5%至90%。借助于紫外检测器(254 nm)测定[18F]44的浓度。通过共注射化合物44的样品来确认产物的身份，并使用碘化钠检测器(Bioscan)测定放射化学纯度。化合物[18F]44的保留时间为4.1分钟。
[18F]46的放射化学合成
含[18F]氟化物的阴离子交换树脂用四乙基碳酸氢铵(4.2 mg, 22 μmol)在CH3CN/H2O 1:1 (1.0 mL)中的溶液洗脱，然后用CH3CN (0.5 mL)洗脱至2.5 mL V-形排气小瓶中，并在氩气流下使用常规加热于100℃干燥。加入另外的等分份CH3CN (2 x 0.5 mL)以进行共沸干燥。向含有干燥的[18F]Et4NF的小瓶中加入46-21(1.0 mg, 1.4 μmol)在DMSO (0.5mL)中的溶液。将反应混合物在100℃下加热10分钟，然后转移至室温下含有H2O (0.8 mL)的小瓶中进行稀释，混合并注射到半制备型高效液相色谱柱上。使用Gemini C6-PhenylHexyl, 5 μm, 250x10mm HPLC柱(Phenomonex)纯化产物，其流速为5 ml/min，流动相为35% CH3CN / 10 mM Na2HPO4pH 7.4。将在24.1和24.6分钟之间洗脱的放射性级分收集到含有10% captisol/H2O (0.5 mL)的圆底烧瓶中，在负压下蒸发以除去CH3CN并转移到10mL无菌小瓶中。借助于分析型HPLC系统(Agilent)测试最终产物的化学和放射化学纯度，所述分析型HPLC系统使用Luna PFP(2), 3 μm, 150x3.0mm HPLC柱(Phenomonex)，其流速为1.0 ml/min，流动相为CH3CN/H2O，梯度为40-50%。[18F]46的浓度用紫外检测器(254 nm)测定。通过共注射化合物46的样品来确认产物的身份，用碘化钠检测器(Bioscan)测定放射化学纯度。化合物[18F]46的保留时间是4.8分钟。
表4中包含的化合物由上文描述的合成步骤通过类似的方法和前体合成。在必要时用市售试剂代替以产生下面的实施例。
一般方法：
在阴离子交换树脂上浓缩[18F]氟化物，并在使用前洗脱。除非另有明确说明，将含[18F]氟化物的阴离子交换树脂用Kryptofix 222 (7 mg, 19 µmol)和K2CO3(2.1 mg, 15 µmol)在乙腈/水(80/20, 0.7 ml)中的溶液洗脱并转移至4 ml排气小瓶中。将氟化物在氩气流下于90℃干燥。加入另外的等分份乙腈(2 x 0.5 ml)以在90℃共沸干燥。
色谱柱描述：
柱1: Phenomenex Gemini 5 µm C6-Phenyl 110 A 250 x 10 mm
柱2: Onyx Monolithic C18 100x3.0 mm
柱3: Agilent Zorbax Eclipse XDB-C18 9.4x250mm 5µ
柱4: Phenomenex Gemini 5µ C18 150x4.6 mm
虽然已经参照本发明的某些特定实施方案描述和阐明了本发明，但是本领域技术人员将理解，可以对程序和方案进行多种调整、改变、修改、替换、删除或添加而不背离本发明的精神和范围。因此，本发明旨在由所附的权利要求的范围限定，并且这些权利要求应尽可能以合理宽泛的范围予以解释。

Claims (20)

1.式(I)的化合物
或其药学上可接受的盐，其中：
--------可不存在或可代表键；
R独立地选自H或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
Ra独立地选自H、-C1-6烷基、-(CH2)pOR、-(CH2)p卤代或-(CH2)pO(CH2)p卤代；
Rb独立地选自H、-C1-6烷基、杂环基、杂芳基、-(CH2)pOR、-CN、-(CH2)t卤代、-(CH2)sNR2或-O(CH2)p卤代；
Rc独立地选自H、卤素、OR或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
R1选自-(CH2)sOR、-(CH2)sNR2、-(CH2)s[O(Rc 2)p]x-Rc或-(CH2)s卤代；
R2独立地选自H、OR、CN、卤素或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
R3独立地选自-C1-6烷基、杂芳基或杂环基，其中所述烷基、杂芳基或杂环基任选地被选自ORa或Rb的一至三个基团取代；
环A1选自吡啶基、咪唑并嘧啶基、三嗪基、嘧啶基、咪唑并吡啶基、吡嗪基或哒嗪基；
环A2选自嘧啶基、吡啶基、吡嗪基或苯基，其中所述嘧啶基、吡啶基、吡嗪基或苯基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
环A3选自吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯并吡嗪基、三嗪基、吲哚基、咪唑基、噁二唑基、三唑基、噻唑基、异噁唑基、噁唑基、3,4-二氢-2H-吡啶并[3,2,b][1,4]噁嗪或苯基；
m选自0、1或2；
n选自1、2或3；
p独立地选自1、2或3；
r选自1、2或3；
s独立地选自0、1、2、3、4、5或6；
t独立地选自0、1、2、3、4、5或6；以及
x独立地选自1、2、3、4、5或6。
2.根据权利要求1所述的化合物，其具有式IA的结构：
或其药学上可接受的盐，其中：
--------可不存在或可代表键；
R独立地选自H或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
Ra独立地选自H、-C1-6烷基、-(CH2)pOR、-(CH2)p卤代或-(CH2)pO(CH2)p卤代；
Rb独立地选自H、-C1-6烷基、杂环基、杂芳基、-(CH2)pOR、-CN、-(CH2)t卤代、-(CH2)sNR2或-O(CH2)p卤代；
Rc独立地选自H、卤素、OR或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
R1选自-(CH2)sOR、-(CH2)sNR2、-(CH2)s[O(Rc 2)p]x-Rc或-(CH2)s卤代；
R2独立地选自H、OR、CN、卤素或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
R3独立地选自-C1-6烷基、杂芳基或杂环基，其中所述烷基、杂芳基或杂环基任选地被选自ORa或Rb的一至三个基团取代；
X1是N或CH；
X2是N或CH；
环A1选自吡啶基、咪唑并嘧啶基、三嗪基、嘧啶基、咪唑并吡啶基、吡嗪基或哒嗪基；
环A3选自吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯并吡嗪基、三嗪基、吲哚基、咪唑基、噁二唑基、三唑基、噻唑基、异噁唑基、噁唑基、3,4-二氢-2H-吡啶并[3,2,b][1,4]噁嗪或苯基；
m选自0、1或2；
n选自1、2或3；
p独立地选自1、2或3；
r选自1、2或3；
s独立地选自0、1、2、3、4、5或6；
t独立地选自0、1、2、3、4、5或6；以及
x独立地选自1、2、3、4、5或6。
3.根据权利要求1所述的化合物，其具有结构式IB
或其药学上可接受的盐，其中：
--------可不存在或可代表键；
R独立地选自H或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
Ra独立地选自H、-C1-6烷基、-(CH2)pOR、-(CH2)p卤代或-(CH2)pO(CH2)p卤代；
Rb独立地选自H、-C1-6烷基、杂环基、杂芳基、-(CH2)pOR、-CN、-(CH2)t卤代、-(CH2)sNR2或-O(CH2)p卤代；
Rc独立地选自H、卤素、OR或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
R1b选自-[O(Rc 2)p]x-Rc、OR、NR2或卤素；
R2独立地选自H、OR、CN、卤素或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
R3独立地选自-C1-6烷基、咪唑基、吗啉基、三唑基、噁唑基、三嗪基、吡唑基、噻唑基、吡嗪基、异噁唑基、氮杂环丁基、吡咯烷基、四氢三唑并吡嗪基、哌啶基或嘧啶基，其中所述烷基、咪唑基、吗啉基、三唑基、噁唑基、三嗪基、吡唑基、噻唑基、吡嗪基、异噁唑基、氮杂环丁基、吡咯烷基、四氢三唑并吡嗪基、哌啶基或嘧啶基任选地被选自ORa或Rb的一至三个基团取代；
环A1选自吡啶基、咪唑并嘧啶基、三嗪基、嘧啶基、咪唑并吡啶基、吡嗪基或哒嗪基；
环A3选自吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯并吡嗪基、三嗪基、吲哚基、咪唑基、噁二唑基、三唑基、噻唑基、异噁唑基、噁唑基、3,4-二氢-2H-吡啶并[3,2,b][1,4]噁嗪或苯基；
m选自0、1或2；
n选自1、2或3；
p独立地选自1、2或3；
s独立地选自0、1、2、3或4；
t独立地选自0、1、2、3、4、5或6；以及
x独立地选自1、2、3、4、5或6。
4.根据权利要求1所述的化合物，其具有式IC的结构
或其药学上可接受的盐，其中：
--------可不存在或可代表键；
R独立地选自H或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
Ra独立地选自H、-C1-6烷基、杂环基、杂芳基、-(CH2)pOR、-(CH2)p卤代或-(CH2)pO(CH2)p卤代；
Rb独立地选自H、-C1-6烷基、-(CH2)pOR、-CN、-(CH2)t卤代、-(CH2)sNR2或-O(CH2)p卤代；
Rc独立地选自H、卤素、OR或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
R1b选自-[O(Rc 2)p]x-Rc、OR、NR2或卤素；
R2独立地选自H、OR、CN、卤素或-C1-6烷基，其中所述烷基任选地被选自-C1-6烷基、ORa或卤素的一至三个基团取代；
R3独立地选自-C1-6烷基、咪唑基、吗啉基、三唑基、噁唑基、三嗪基、吡唑基、噻唑基、吡嗪基、异噁唑基、氮杂环丁基、吡咯烷基、四氢三唑并吡嗪基、哌啶基或嘧啶基，其中所述烷基、咪唑基、吗啉基、三唑基、噁唑基、三嗪基、吡唑基、噻唑基、吡嗪基、异噁唑基、氮杂环丁基、吡咯烷基、四氢三唑并吡嗪基、哌啶基或嘧啶基任选地被选自ORa或Rb的一至三个基团取代；
环A1选自吡啶基、咪唑并嘧啶基、三嗪基、嘧啶基、咪唑并吡啶基、吡嗪基或哒嗪基；
环A3选自吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、吡咯并吡嗪基、三嗪基、吲哚基、咪唑基、噁二唑基、三唑基、噻唑基、异噁唑基、噁唑基、3,4-二氢-2H-吡啶并[3,2,b][1,4]噁嗪或苯基；
m选自0、1或2；
n选自1、2或3；
p独立地选自1、2或3；
s独立地选自0、1、2、3或4；
t独立地选自0、1、2、3、4、5或6；以及
x独立地选自0、1、2、3、4、5或6。
5.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中环A1选自嘧啶基或吡啶基；
环A3选自吡啶基、吡嗪基、嘧啶基或三嗪基；
m选自0或1；以及
n选自1或2。
6.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中环A1为吡啶基或嘧啶基。
7.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中环A2为嘧啶基。
8.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中环A3选自吡啶基、嘧啶基、吡嗪基或三嗪基。
9.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R1为-(CH2)sOR或-(CH2)s[O(Rc 2)p]x-Rc。
10.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3独立地选自-C1-6烷基、咪唑基、吗啉基、三唑基、噁唑基、三嗪基、吡唑基或异噁唑基，其中所述烷基、咪唑基、吗啉基、三唑基、噁唑基、三嗪基、吡唑基或异噁唑基任选地被选自ORa或Rb的一至三个基团取代。
11.一种化合物，选自：
或其药学上可接受的盐。
12.根据权利要求11所述的化合物，其选自实施例编号1、2、3、4、12、13、17、29、31、32、34、38、43、44、46、48、49、51和52，或其药学上可接受的盐。
13.根据权利要求11所述的化合物，其选自实施例编号1、2、3、12、13、29、32、38、44、46或52，或其药学上可接受的盐。
14.根据权利要求1或11所述的化合物或其药学上可接受的盐，其用选自2H、3H、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、18F、35S、36Cl、82Br、76Br、77Br、123I、124I或131I的同位素标记。
15.根据权利要求1或11所述的化合物或其药学上可接受的盐，其用3H、11C或18F同位素标记。
16.一种药物组合物，包含根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，和至少一种药用赋形剂。
17.一种使用根据权利要求14所述的化合物或其药学上可接受的盐作为显像剂在人类患者中对α-突触核蛋白沉积物成像的方法，包括以下步骤：
a) 使人类患者以仰卧姿势处于PET扫描仪中；
b) 向所述患者施用约0.1至约10 mCi的根据权利要求14所述的化合物；并且
c) 对所述患者的头部的脑区进行发射扫描以鉴定所述患者的脑组织中α-突触核蛋白的聚集。
18.一种测量用于帕金森病的治疗剂的临床疗效的方法，包括以下步骤：
a) 在用所述治疗剂治疗之前，向诊断为患有PD的患者施用根据权利要求14所述的同位素标记的式I化合物，
b) 测量所述患者的脑组织中α-突触核蛋白聚集体形成的量，
c) 在用所述治疗剂治疗之后，向所述患者施用根据权利要求14所述的同位素标记的式I化合物，
d) 测量治疗之后所述患者的脑组织中α-突触核蛋白聚集体形成的量，并且
e) 分析所述治疗剂是否停止或减缓了所述患者的脑组织中α-突触核蛋白聚集体形成的进展。
19.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，用作显像剂。
20.根据权利要求14所述的化合物或其药学上可接受的盐，用作显像剂。
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