CN121087027A - 一种具有稳定皮克林乳液功效的固定化酶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有稳定皮克林乳液功效的固定化酶及其制备方法和应用，包括，将紫胶添加到碱性溶液中，搅拌至紫胶溶解，制成水溶液，调节溶液pH为6～8，充分搅拌使紫胶颗粒均匀分散，干燥得到紫胶纳米颗粒粉末；将紫胶纳米颗粒粉末分散在水或者缓冲溶液中，加入EDC(1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N‑羟基丁二酰亚胺)，再加入脂肪酶后通过偶联反应得到紫胶纳米颗粒固定化酶。本发明制备的天然纳米颗粒固定化酶不仅能够稳定Pickering乳液，乳液在酸碱或者气体刺激下实现可逆乳化‑破乳循环，而且可用于构建植物甾醇酯高效合成反应体系。

Description

一种具有稳定皮克林乳液功效的固定化酶及其制备方法和 应用

技术领域

本发明属于纳米材料领域，涉及一种具有稳定皮克林乳液功效的固定化酶及其制备方法和应用，具体地，涉及一种以天然虫胶纳米颗粒为载体的固定化酶及其制备方法。

背景技术

皮克林乳液是用固体颗粒替代传统表面活性剂而形成的乳液，乳液体系具有极大的油水面积和极强的稳定性，能降低酶与底物的传质阻力，故可应用在两相界面发生的酶催化反应。为了最大限度地利用界面催化作用，减轻界面张力对酶蛋白的变性作用，这就要求固定化酶的材料具有界面活性，通过稳定油水界面形成乳液的方式给脂肪酶提供足够大3的油水界面面积及缩短底物传质距离，并且固定化酶的材料应选择食品原料，具有生物安全性。

传统的固定化方法包括物理吸附、共价键结合、交联结合、包埋固定。物理吸附是利用范德华力或静电引力等作用，将游离酶吸附固定到载体周围的方法，该方法操作简单，条件温和，一般不会引起酶失活或变性，缺点是载体与酶蛋白分子之间几乎没有化学键的形成，致使酶分子易从载体表面脱落导致在回收和再利用过程中酶的损失。共价键结合是通过酶与载体之间形成的共价键实现游离酶固定的一种方法，该方法的优点是酶蛋白分子与载体结合牢固，不易发生脱落或脱附，但是共价键结合过程反应条件苛刻且反应过程剧烈，又普遍发生在酶的活性中心附近，难免会引起酶蛋白四级结构的翻折变形。交联结合是通过双功能或多功能交联剂，在酶蛋白分子与载体之间形成共价键。包埋固定通常把酶分子限定在载体内部，不会破坏酶的空间构象，也不需要与酶的氨基残基发生反应，因此该方法固定的酶回收率较高。但是固定在载体内部的酶与底物之间存在较大的传质阻力，酶促反应的时间也会增加。

纳米材料由于其高表面积而成为新型酶稳定化材料，使酶的活性和稳定性增强。中国专利申请201610964102.4公开了一种固定化酶、固定化酶载体及其制备方法，其中采用包括氧化石墨烯、氧化锌、二氧化锰等几种无机纳米颗粒制备固定化酶。中国专利申请202310626698.7公开了一种耐有机试剂的β-琼胶酶突变体及固定化酶的应用，采用磁性纳米颗粒固定化酶，两者都能改善脂肪酶在中的稳定性。但是这些无机纳米颗粒的制备工艺复杂，回收困难，还可能面临环境残留问题，不适合直接用于食品加工。从食品原料中制备界面活性纳米颗粒并进一步制备固定化酶是目前食品用酶的现实需求。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

本发明的其中一个目的是提供一种具有稳定皮克林乳液功效的固定化酶的制备方法。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种具有稳定皮克林乳液功效的固定化酶的制备方法，包括，

将紫胶添加到碱性溶液中，搅拌至紫胶完全溶解，调节溶液pH为6～8，充分搅拌使紫胶颗粒均匀分散，干燥得到紫胶纳米颗粒粉末；

将紫胶纳米颗粒粉末分散在水或者缓冲溶液中，加入EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基丁二酰亚胺)，再加入脂肪酶后通过偶联反应得到紫胶纳米颗粒固定化酶。

作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述EDC浓度为100mM～10mM，所述NHS浓度为80mM～8mM。

作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述紫胶纳米颗粒粉末与脂肪酶的比例为1:(1～0.5)。

作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述将紫胶纳米颗粒粉末分散在水或者缓冲溶液中，其中，紫胶纳米颗粒粉末与水或者缓冲溶液的比例为1g：(15～20mL)。

作为本发明所述制备方法的一种优选方案，其中：所述加入脂肪酶后通过偶联反应，其中，反应温度为20～30℃，时间为10～14小时。

本发明的再一个目的是提供一种固定化酶在稳定Pickering乳液中的应用，包括，

将固定化酶重新分散，制成质量浓度为0.1％～20％的水相；

按照油水比(0.2～10):1在水相中加入油相；

乳化均匀即得紫胶纳米颗粒固定化酶稳定的Pickering乳液。

作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述油相包括正十二烷、液体石蜡、二氯甲烷、甲苯、辛癸酸甘油酯、游离脂肪酸中的一种或多种。

作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述Pickering乳液在稳定和不稳定之间多次循环，调整pH值为6及以下乳液发生破乳，或在通入CO₂后破乳；

破乳后将pH调节为7～12或者通入N₂和/或空气，混匀后再次形成稳定的Pickering乳液；

乳液循环数次之后液滴形态没有发生明显变化。

本发明的另一个目的是提供一种固定化酶在催化合成植物甾醇酯中的应用，包括，

将植物甾醇溶于脂肪酸后加入固定化酶，置于水浴摇床进行酯化反应，结束后分离纯化，得到植物甾醇酯；

其中，所述植物甾醇与脂肪酸的质量体积比为(0.1～0.3)g：1mL；

所述反应体系的水分含量为50％-70％；

酶制剂的添加量占底物质量的(4～6)％w/v。

作为本发明所述应用的一种优选方案，其中：所述植物甾醇为β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇或菜籽甾醇中的一种或者多种；

所述脂肪酸为月桂酸、豆蔻酸、硬脂肪酸、软脂肪酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸中的一种或多种；

所述水浴摇床的温度为35～55℃，水浴摇床的反应时间为0.5～60h。

本发明有益效果：

(1)本发明采用天然紫胶为原料，制备出来的固定化酶能够稳定Pickering乳液，制备过程简单，成本低，实现紫胶的高附加值的利用。

(2)紫胶纳米颗粒固定化酶稳定的Pickering乳液具有刺激响应特性，乳液在中性和碱性条件下具有较好的稳定性，加入少量的酸或者通入二氧化碳气体，乳状液快速破乳，再加入适量的碱或者通入氮气，乳化后又形成稳定的乳液，液滴和乳液形态不发生明显变化，且能够重复至少30次；

(3)本发明制备的天然纳米颗粒固定化酶可用于植物甾醇酯的高效催化合成，催化反应完成后，乳液体系能够通过气体刺激快速破乳，减少了对设备的腐蚀和盐的累积，进而降低了工业应用的成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1是实施例1中形成的乳液实物图和光学显微镜图像；

图2是实施例1中形成的固定化酶的微观结构图像；

图3是实施2中形成的乳液实物图和光学显微镜图像

图4是实施例3中形成的乳液实物图；

图5是实施例3中形成的乳液光学显微镜图像；

图6是实施例4中pH响应乳液的乳液实物图和光学显微镜图像；

图7是实施例5中气体响应乳液的乳液实物图；

图8是实施例6中不同反应体系下植物甾醇的转化率随时间的变化图；

图9是实施例7中不同水分含量下植物甾醇的转化率随时间的变化图。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

本发明实施例所用原料及其来源：

紫胶购自上海联硕生物科技有限公司；氢氧化钠、盐酸、辛癸酸甘油酯、二氯甲烷、环己烷、甲苯、石油醚、液体石蜡、异辛烷、正己烷、正十二烷等试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

紫胶是一种寄生在树木上的昆虫分泌的树脂物质精制而成的天然聚合物，也被称为虫胶。从结构上看，紫胶主要由含氧酸聚酯组成，包括木桐酸和环状萜酸，分别构成虫胶的疏水成分和亲水成分。此外虫胶被美国食品和药物管理局赋予普遍认为安全的标签，允许其用作食品添加剂。紫胶作为一种天然聚合物，不仅具有可再生性、生物相容性、可降解性和无毒性，还具有成膜性和两亲性等优点。由于其具有独特的结构和特性，已被广泛用于食品工业。目前尚没有与制备紫胶纳米颗粒固定化酶相关的报道。

实施例1

将紫胶添加到碱性溶液中，搅拌至完全溶解(0.5％)，调节溶液pH为6，搅拌使紫胶颗粒均匀分散，冷冻干燥得到紫胶纳米颗粒粉末；

取18毫升MES缓冲溶液(20mM，pH6)，加入1g紫胶纳米颗粒粉末，水浴超声分散，加入1毫升EDC，常温搅拌2小时后加入1毫升NHS，继续搅拌2小时，然后加入0.5g脂肪酶(脂肪酶AY"Amano"400SD，源于柱状假丝酵母(Candidacylindracea)，充分混匀后，在室温下缓慢旋转孵育反应12小时后过滤并收集固体，用磷酸盐缓冲液洗涤后冻干过夜，最终产物是固定化脂肪酶。

采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定溶液中蛋白质剩余含量，从而计算出蛋白质的固载量，结构如图1所示。不同EDC和NHS的浓度会影响蛋白质的固载量，按照图1设置反应过程中EDC和NHS的浓度(EDC浓度为100mM～10mM，NHS浓度为80mM～8mM)，从图1可以看出当EDC浓度为25mM，NHS浓度为20mM时，蛋白质的固载量最高，微观结构如图2所示。

实施例2

称取一定量紫胶纳米颗粒固定化酶加入到水中，充分搅拌溶解后，采用盐酸溶液调节pH至8，稀释固定化酶浓度分别为0.5％，1％，2％，4％，6％，8％，10％，14％，18％，20％，取适量固定化酶水溶液于离心管中，按照1:1油水比加入正十二烷，剪切乳化机仪以15000rpm的搅拌速率剪切混合物1分钟，刚制备的乳液以及放置24小时的乳液实物图参见图3，光学显微镜图像参见图3。从图中可以看出当固定化酶的浓度低至0.5％或1％时，发现它不足以稳定所有油相。新制备的乳剂在外观上是均一的，但在储存30h后出现了不同程度的相分离。显微图片进一步证实固定化酶浓度与液滴大小呈负相关。

实施例3

称取一定量紫胶纳米颗粒固定化酶加入到水中，充分搅拌溶解后，调节溶液pH分别至6，7和8，按照图4中的油水比例分别取水相和油相(正十二烷)于离心管内，涡旋振荡器乳化三分钟，得到Pickering乳液,刚制备的乳液以及放置3天的乳液实物图参见图4，由pH值为7的水相与液体石蜡形成乳液的光学显微镜图像参见图5。

从图4中可以看出无论油水体积比如何，酸性条件(pH 6)下的乳液均不稳定，在乳化后立即观察到完全相分离。相比之下，中性(pH 7)和碱性(pH8)条件能够在所有油水体积比范围(10:1至1:5，v/v)内中形成稳定乳液；在发生轻微相分离之前，这些体系均保持稳定超过48小时。

值得注意的是，从图5中的微观照片可以看出高油分数(油相体积分数≥75％)也没有导致乳液类型的反转，这表明紫胶纳米颗粒固定化酶具有足够的亲水性。这种pH依赖的稳定性与先前对紫胶纳米颗粒乳化特性的描述一致，中性/碱性条件下乳液稳定性的增强与纳米颗粒上去质子化的羧基有关，去质子化的羧基促进了静电排斥，优化了油水界面上的颗粒吸附动力学。

实施例4

称取一定量紫胶纳米颗粒固定化酶加入到水中(2％)，充分搅拌溶解后，调节溶液pH至8，取适量于离心管中，按照1:1油水比分别加入液体石蜡(a)、二氯甲烷(b)、甲苯(c)、辛癸酸甘油酯(d)，涡旋振荡器乳化三分钟后得到Pickering乳液，加入少量的盐酸，乳液破乳，油相和水相分离，然后将乳液的pH重新调回7及以上后，进行乳化后又可以得到稳定的Pickering乳液，重复这样的操作，经过30轮循环后又可以得到稳定的Pickering乳液。循环1次，循环10次以及循环30次的乳液实物图及光学显微镜图像参见图6。

如图6a所示，经过10次循环后，宏观形貌和微观结构未发生明显变化。值得注意的是，尽管观察到液滴尺寸逐渐减小，但这种可逆乳化/破乳循环在30个循环中保持稳定，显示出出色的可恢复性。采用其他油相(二氯甲烷、甲苯和MCT)进行了扩展评估(图6b-d)，在这些体系均表现出出色的pH响应性。

实施例5

称取一定量紫胶纳米颗粒固定化酶加入到水中(2％)，充分搅拌溶解后，调节溶液pH至8，取适量于离心管中，按照1:1油水比分别加入液体石蜡，正十二烷，涡旋振荡器乳化三分钟后得到Pickering乳液，在乳液中通入二氧化碳气体(300mL·min^-1，3min)，静止一段时间后油水相分离，然后在乳液中通入氮气(300mL·min^-1，5min)，乳化后又可以得到稳定的Pickering乳液。循环2次的乳液实物图参见图7。说明紫胶纳米颗粒固定化酶稳定的Pickering乳液具有气体刺激响应特性，能够实现可逆乳化/破乳循环。

实施例6

所述酶制剂催化合成植物甾醇酯：

本实施例中的植物甾醇为松木甾醇(≥70％β-谷甾醇，≤20％菜油甾醇，≤1.5％豆甾醇，≤10％菜籽甾醇，西安海斯夫生物科技有限公司)，脂肪酸为油酸，所述松木甾醇在上述酶制剂的催化作用下与油酸发生酯化反应生成植物甾醇油酸酯，具体过程如下：

先将0.16克植物甾醇溶于1毫升油酸中，无溶剂体系不用加其他溶剂，溶剂体系加入正十二烷(1:1,v/v)，体积比1:1加入pH7的磷酸缓冲，无论是游离脂肪酶1还是固定化酶，其添加量统一为反应底物的5％(w/v)，反应时间60小时，间隔取样，采用高效液相色谱检测植物甾醇的含量，计算植物甾醇的转化率，结果如图8所示。

在所有体系中，植物甾醇的转化率随着时间的推移逐渐增加。在无溶剂体系中，固定化酶催化植物甾醇的最高转化率为78.93±5.46％(60h)。在所有实验条件下，游离脂肪酶催化合成植物甾醇油酸酯的转化率都保持在60％以下。说明固定化酶的催化效率优于游离脂肪酶，这主要归功于Pickering乳液的界面面积增大和传质限制降低。

实施例7

所述酶制剂催化合成植物甾醇酯：

本实施例中的植物甾醇为松木甾醇(≥70％β-谷甾醇，≤20％菜油甾醇，≤1.5％豆甾醇，≤10％菜籽甾醇，西安海斯夫生物科技有限公司)，脂肪酸为油酸，所述松木甾醇在上述酶制剂的催化作用下与油酸发生酯化反应生成植物甾醇油酸酯，具体过程如下：先将植物甾醇溶于油酸中，比例为0.16克比1毫升，无溶剂体系不用加其他溶剂，溶剂体系加入正十二烷(1:1,v/v)，加入pH7的磷酸缓冲，使得水相含量分别为60％和70％，游离脂肪酶溶解在水相，固定化酶溶解在油相，催化剂的添加量统一为反应底物的5％(w/v)；反应时间60小时，间隔取样，采用高效液相色谱检测植物甾醇的含量，计算植物甾醇的转化率，结果如图9所示。如图9所示，当水含量为60％时，无溶剂体系中植物甾醇在12h内的转化率为73.10±2.48％，比水含量为50％时提高了29.43％。然而，过量的水相(70％)使转化率降低到66.51±2.69％。说明反应体系中的水分含量影响催化活性。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种具有稳定皮克林乳液功效的固定化酶的制备方法，其特征在于：包括，

将紫胶添加到碱性溶液中，搅拌至紫胶完全溶解，调节溶液pH为6～8，充分搅拌使紫胶颗粒均匀分散，干燥得到紫胶纳米颗粒粉末；

将紫胶纳米颗粒粉末分散在水或者缓冲溶液中，加入EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)和NHS(N-羟基丁二酰亚胺)，再加入脂肪酶后通过偶联反应得到紫胶纳米颗粒固定化酶。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述EDC浓度为100mM～10mM，所述NHS浓度为80mM～8mM。

3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述紫胶纳米颗粒粉末与脂肪酶的比例为1:(1～0.5)。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述将紫胶纳米颗粒粉末分散在水或者缓冲溶液中，其中，紫胶纳米颗粒粉末与水或者缓冲溶液的比例为1g：(15～20mL)。

5.如权利要求1或5所述的制备方法，其特征在于：所述加入脂肪酶后通过偶联反应，其中，反应温度为20～30℃，时间为10～14小时。

6.权利要求1～6中任一所述的制备方法制得的固定化酶在稳定Pickering乳液中的应用，其特征在于：包括，

将固定化酶重新分散，制成质量浓度为0.1％～20％的水相；

按照油水比(0.2～10):1在水相中加入油相；

乳化均匀即得紫胶纳米颗粒固定化酶稳定的Pickering乳液。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述油相包括正十二烷、液体石蜡、二氯甲烷、甲苯、辛癸酸甘油酯、游离脂肪酸中的一种或多种。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述Pickering乳液在稳定和不稳定之间多次循环，调整pH值为6及以下乳液发生破乳，或在通入CO₂后破乳；

破乳后将pH调节为7～12或者通入N₂和/或空气，混匀后再次形成稳定的Pickering乳液；

乳液循环数次之后液滴形态没有发生明显变化。

9.权利要求1～6中任一所述的制备方法制得的固定化酶在催化合成植物甾醇酯中的应用，其特征在于：包括，

将植物甾醇溶于脂肪酸后加入固定化酶，置于水浴摇床进行酯化反应，结束后分离纯化，得到植物甾醇酯；

其中，所述植物甾醇与脂肪酸的质量体积比为(0.1～0.3)g：1mL；

所述反应体系的水分含量为50％-70％；

酶添加量占底物质量的(4～6)％w/v。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述植物甾醇为β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇或菜籽甾醇中的一种或者多种；

所述脂肪酸为月桂酸、豆蔻酸、硬脂肪酸、软脂肪酸、油酸、亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸中的一种或多种；

所述水浴摇床的温度为35～55℃，水浴摇床的反应时间为0.5～60h。