CN121086956A

CN121086956A - 一株抗梨白纹羽病的高地芽孢杆菌bw65及其在抗病增产提质中的应用

Info

Publication number: CN121086956A
Application number: CN202511620636.0A
Authority: CN
Inventors: 董彩霞; 陆晓彤; 李文瑶; 李培根; 赵玉洁; 徐阳春; 沈其荣
Original assignee: Sanya Research Institute Of Nanjing Agricultural University
Current assignee: Sanya Research Institute Of Nanjing Agricultural University
Priority date: 2025-11-07
Filing date: 2025-11-07
Publication date: 2025-12-09

Abstract

本发明微生物技术领域，具体涉及一株抗梨白纹羽病的高地芽孢杆菌BW65及其在抗病增产提质中的应用，所述菌株分离自桃树根际土壤，分类命名为Bacillus altitudinis BW65。该菌株具有产IAA、固氮、解有机磷与无机磷的能力，可显著促进梨、番茄等植物的生长，改善根系形态，提高生物量与果实品质，并对稻瘟病、链格孢菌、禾谷镰孢菌、褐座坚壳菌等多种病原菌具有拮抗作用。施用该菌剂可提升作物产量与品质，减少化肥与农药使用，适用于生物有机肥制备与绿色农业生产。

Description

一株抗梨白纹羽病的高地芽孢杆菌BW65及其在抗病增产提质中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株抗梨白纹羽病的高地芽孢杆菌 BW65及其在抗病增产提质中的应用。

背景技术

在现代农业生产中，植物生长促进、果实品质提升以及病害防控是提高农产品产量和质量的关键环节。长期以来，人们主要依赖化学肥料和农药来实现这些目标。虽然这些化学手段在短期内效果显著，但其长期和大量的使用已导致一系列严峻问题，包括土壤结构破坏、肥力下降、生态环境污染以及病原菌产生抗药性等，严重制约了农业的可持续发展。

近年来，随着生物技术的发展，利用植物根际有益微生物来促进生长、提高抗逆性及防治土传病害的绿色防控技术日益受到重视。其中，芽孢杆菌属（Bacillus）微生物因其具有抗逆性强、繁殖快、易于生产储存等优点，成为研究和应用的热点。高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）作为芽孢杆菌属的一种，被报道具有多种生物活性，在植物生长促进和病害生物防治方面展现出潜在的应用价值。

然而，目前对高地芽孢杆菌菌株资源的挖掘仍不够充分，特别是针对梨树等重要经济作物病害具有高效拮抗作用，并兼具显著促生和改善果实品质功能的特定菌株的系统性研究和应用报道尚属匮乏。现有技术中缺乏能够综合解决抗病、增产和提质问题的有效微生物技术方案，这限制了高地芽孢杆菌在绿色农业中的进一步开发与应用。因此，分离筛选获得具有多重优良农艺性状的高地芽孢杆菌新菌株，并开发其应用技术，对于减少化学投入品的使用、推动农业可持续发展具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一株具有多重益生功能的高地芽孢杆菌（Bacillus altitudinis）新菌株BW65。本发明的另一目的在于提供所述高地芽孢杆菌BW65在防治植物病害、促进植物生长、提高作物产量及改善果实品质中的应用。该菌株能高效分泌植物生长素（IAA），具备固氮、溶解有机磷和无机磷的能力，对包括梨白纹羽病病原菌（褐座坚壳菌）在内的多种植物病原真菌具有显著的拮抗作用，可开发为高效的微生物肥料和生物农药，为农业绿色生产提供新的技术支撑。

为了达到上述目的，本发明筛选出一株高地芽孢杆菌 Bacillus altitudinis 菌株BW65，其分类命名为：Bacillus altitudinis BW65，其保藏编号为CCTCC NO：M20251608；该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为为2025年7 月 15 日。

本发明还提供包含所述的高地芽孢杆菌 Bacillus altitudinis 菌株BW65的菌剂。

本发明还提供所述高地芽孢杆菌 Bacillus altitudinis 菌株BW65或所述菌剂在制备生物有机肥中的应用。

本发明还提供所述高地芽孢杆菌 Bacillus altitudinis 菌株BW65或所述菌剂在促进植物生长中的应用。

本发明还提供所述高地芽孢杆菌 Bacillus altitudinis 菌株BW65或所述菌剂在改善植物果实品质中的应用。

进一步说明，所述植物为梨和/或番茄。

本发明还提供所述高地芽孢杆菌 Bacillus altitudinis 菌株BW65或所述菌剂在在制备防控植物病原菌的生防制剂中的应用。

进一步说明，所述植物病原菌为稻瘟病病原菌、链格孢菌、禾谷镰孢菌和/或褐座坚壳菌。

本发明还提供所述高地芽孢杆菌 Bacillus altitudinis 菌株BW65或所述菌剂在产IAA、固氮、解有机磷和/或无机磷中的应用。

本发明还提供应用所述高地芽孢杆菌 Bacillus altitudinis 菌株BW65或所述菌剂促进植物生长的方法，所述方法为：将高地芽孢杆菌 Bacillus altitudinis 菌株BW65菌悬液浇灌至植物幼苗根际。

进一步说明，所述菌悬液的终浓度为10⁷CFU/g土。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

本发明筛选得到的高地芽孢杆菌BW65具有多种促生与病原菌拮抗功能。该菌株能分泌IAA、固氮、溶解有机磷与无机磷，有效促进植物对养分的吸收与利用。通过盆栽与田间试验证实，BW65可显著提升梨与番茄幼苗的生物量、株高、茎粗与叶绿素含量，改善根系形态，增加根长、根表面积、根体积与根尖数。此外，BW65能显著提高番茄果实的单果重、纵径、横径、总糖与可溶性固形物含量，降低可滴定酸含量，改善果实内外品质。平板对峙试验表明，BW65对稻瘟病、链格孢菌、禾谷镰孢菌、褐座坚壳菌等多种病原菌具有明显拮抗作用。田间应用显示，BW65可提高梨树单株产量与单果重，降低坏果率，减少果实腐烂。因此，该菌株可作为生物有机肥与生物防治剂的重要原料，减少化学肥料与农药的依赖，推动绿色农业可持续发展。

附图说明

图1为菌株BW65的菌落形态图。

图2为菌株BW65的系统发育树图。

图3 为菌株BW65的促生能力分析结果图。

图4 为菌株BW65对梨幼苗生长的表型结果图。

图5 为菌株BW65对梨幼苗根系影响的表型结果图。

图6 为菌株BW65对番茄幼苗生长的表型结果图。

图7 为菌株BW65对番茄幼苗根系影响的表型结果图。

图8 为菌株BW65对番茄果实品质的影响结果图。

图9 为菌株BW65与多种病原菌的平板对峙试验结果图。

图10 为菌株BW65在田间应用中对梨果实产量和品质的影响结果图。

具体实施方式

本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。

本说明书（包括任何附加权利要求、摘要）中公开的任一特征，除非特别叙述，每个特征只是一系列等效或类似特征中的一个例子而已。

本实验涉及的培养基、药剂和仪器均可在市面上购买得到。

实施例1。

本实施例为高地芽孢杆菌BW65菌株的筛选、鉴定和生物学特征。

1、菌株BW65的分离与纯化：从无锡阳山桃园的桃树根际采集根际土土1g，加入装有玻璃珠和9ml SM缓冲液的50ml三角瓶中，30℃、170震荡30min获得土壤悬浊液，加入无菌水逐步梯度稀释成10^-5~10^-7的浓度悬液，涂布于TSA培养基30℃培养48h后，通过平板划线法挑取单菌对菌株进行纯化。

2、菌株BW65的鉴定：形态学鉴定具体操作为：将BW65菌株接种于TSA培养基上，置于恒温培养箱培养，培养24h后，观察至培养皿上有圆形菌落出现，无芽孢，菌落湿润，呈奶白色（如图1）。通过系统发育树（如图2），我们发现BW65与非模式菌株Bacillusaltitudinis 41KF2b的16S序列一致，在同一分支，确属高地芽孢杆菌。

本申请人已经将高地芽孢杆菌BW65菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M20251608；保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为为2025年 7 月15 日。

实施例2。

本实施例为高地芽孢杆菌BW65菌株的促生功能研究。

1、菌株产IAA功能的定性测定：将BW65菌株按1%的接种量添加至含有 L-色氨酸的TSB培养基中，30℃ 170 r min^-1振荡48h后，10000 rpm 5 min离心获得上清液，取100μl 上清液与等体积的 Salkowski 比色液进行混合，以100μ未接菌的培养基与等体积的Salkowski比色液混合做空白对照，避光条件下反应30min，溶液颜色变红即说明菌株具有IAA的能力。

2、菌株固氮能力测定：将活化后的BW65菌悬液加10μL到阿须贝固氮培养基上，三重复，28℃培养箱中培养5d，观察培养基上有无晕或透明圈，根据晕或透明圈（D）与菌落直径（d）的比值来判断菌株固氮的能力。

3、菌株溶解无机磷能力测定：将活化后的BW65菌悬液加10μL到PKO无机磷平板上，三重复，28℃培养箱中培养5d，观察培养基上有无晕或透明圈，根据晕或透明圈（D）与菌落直径（d）的比值来判断菌株是否有溶有机磷的能力。

4、菌株溶解有机磷能力测定：将活化后的BW65菌悬液加10μL到蒙金娜有机磷平板上，三重复，28℃培养箱中培养5d，观察培养基上有无晕或透明圈，根据晕或透明圈（D）与菌落直径（d）的比值来判断菌株是否有溶无机磷的能力。

以上促生特性测定结果均为定性试验，有则用+表示，无则用减号（-）表示，结果见表1。

如表1所示，筛选得到的BW65菌株具备产IAA、固氮、解有机磷、无机磷的能力。

实施例3。

本实施例为高地芽孢杆菌BW65菌剂对梨幼苗的促生作用研究。

（1）梨苗育苗：将杜梨种子放置于无菌水中浸泡12h后，加入1%的过氧化氢消毒20min，最后用无菌水清洗干净。消毒好的种子平铺在垫有无菌水浸湿滤纸的培养基中，置于28℃恒温培养箱催芽3-5天，挑选露白的梨苗种子播种到灭菌的育苗基质中育苗。待梨苗培养至2-3片真叶时，选取长势健康且一致的幼苗移栽至灭菌栽培基质花盆中。

（2）BW65菌剂菌悬液的制备：将-80℃甘油管保存的菌株 BW65 在 TSA 培养基上划线纯化，28℃培养 12 h 后，挑取单菌落转接至TSB液体培养基中，并在28℃、170r·min-1的条件下培养过夜以活化菌株。然后按照1%（体积分数）接种量，将种子液接种于新的 TSB液体培养基，28℃、170r·min-1振荡培养12h得到BW65发酵液。调 OD600至1.0，离心后收集菌体，重悬3次，用无菌水稀释成活菌浓度为107CFU/mL 的发酵稀释液待用。

（3）接菌：将制备好的BW65菌剂菌悬液（终浓度为10⁷CFU/g 土）接种至杜梨幼苗根际，以不接菌剂液作为对照处理（CK），每处理6个重复，培养30d后收样测定杜梨表型性状。

试验结果。

1、如图3所示，BW65菌剂可显著促进梨幼苗生长。与对照CK相比，接种BW65菌剂处理的梨幼苗地上部干重、根系干重及总干重分别提高了35.7%、3.6%和26.3%，BW65菌剂处理的梨苗株高、茎粗和SPAD相比CK分别显著提高了62.7%、17.9%和12.9%。

2、如图4所示，BW65菌剂可改善梨幼苗根系形态，根表面积、根长、根体积和根尖数分别提高了8.4%、7.6%、7.8%和9.3%。

实施例4。

本实施例为高地芽孢杆菌BW65菌剂对番茄幼苗的促生作用研究。

（1）番茄育苗：种子处理：取健康的番茄种子，首先放置于无菌水中浸泡24小时；随后用75%的酒精浸泡30秒，再用无菌水冲洗3-5遍；接着，浸泡于2%的次氯酸钠溶液中20分钟，最后用大量无菌水彻底冲洗干净。

催芽及播种：将消毒后的种子平铺在垫有无菌水浸湿滤纸的培养基上，置于28℃恒温培养箱中催芽3-5天。挑选萌发情况良好的种子，播种于灭菌的培养基或无菌基质中进行育苗。

移栽：待育成的番茄基苗长至2-3片真叶且长势均匀后，选取健康一致的幼苗，移栽至灭菌的基质花盆中进行盆栽培养。

（2）接菌处理：制备菌悬液：根据前述方法获得的，制备成Bacillus altitudinisBW65制备成菌悬液，调整其终浓度至10⁷ CFU/g土。

CK组（对照组）：不接种任何菌液，单独培育番茄幼苗。

BW65组：仅接种Bacillus altitudinis BW65菌悬液，浓度为10⁷ CFU/g土。

接菌操作：将制备好的菌悬液均匀接种于番茄幼苗根际。

实验设计：每个处理组设置6个重复，并在相同环境条件下进行培养。

结果采集：培养30天后，对各组番茄幼苗的生长表型进行测定和记录，包括植株高度、根系发育情况、生物量等指标。

试验结果。

1、如图5所示，接种BW65菌剂可显著促进番茄幼苗生长。与对照CK相比，接种BW65菌悬液处理的番茄幼苗地上部鲜重、根系鲜重及总鲜重分别提高了8.5%、192%和16.6%，其茎粗和株高相比CK分别提高了3.5%和16.3%。

2、如图6所示，接种BW65菌剂处理可显著改善番茄根系形态，与对照CK相比，接种BW65菌悬液处理的番茄的根长、根表面积、根尖数和根体积分别提高了61.7%、29.7%、16.8%和5.0%。

实施例5。

本实施例为高地芽孢杆菌BW65菌剂对番茄果实品质的影响的研究。

（2）接菌处理：制备菌悬液：根据前述方法获得的，制备成Bacillus altitudinisBW65制备成菌悬液，调整其终浓度至10⁷CFU/g土。

CK组（对照组）：不接种任何菌液，单独培育番茄幼苗。

BW65组：仅接种Bacillus altitudinis BW65菌悬液，浓度为10⁷CFU/g土。

接菌操作：将制备好的菌悬液均匀接种于番茄幼苗根际。

实验设计：每个处理组设置6个重复，并在相同环境条件下进行培养。之后测定果实品质等相关指标。

试验结果。

1、如图7所示，接种BW65菌悬液可显著改善番茄果实外观品质。与对照CK相比，接种BW65菌悬液处理的番茄果实纵径、横径和单果重分别提高了13.5%、5.9%和81%。

2、如图8所示，接种BW65菌悬液可显著改善番茄果实内在品质。与对照CK相比，接种BW65菌悬液处理的番茄果实含水率、总糖含量和可溶性固形物含量分别提高了0.9%、12.3%和16.7%；接种BW65菌悬液处理的番茄果实中的可滴定酸相比CK处理显著降低了12.2%。

实施例6。

本实施例为高地芽孢杆菌BW65菌株在田间的应用效果研究。

为探究BW65菌剂对果实品质的影响，选取10棵树龄相同的丰水梨果树作为试验对象，随机分配成2组，每组5棵树。

接菌处理：制备菌悬液：根据前述方法获得的，制备成Bacillus altitudinisBW65制备成菌悬液，调整其终浓度至10⁷ CFU/g土。

CK组（对照组）：每棵树设置2个施菌点，每个坑施入蒸馏水1L，共施入蒸馏水3次。

BW65组：每棵树设置2个施菌点，每个坑施入Bacillus altitudinis BW65菌悬液1L，浓度为10⁷ CFU/g土，分别是25年6月10日（幼果期），7月9日和7月21日（膨大期）共接菌3次。

其他管理方案相同。

结果采集：最后一次施菌液30天后，对各组丰水梨果树进行采收果实，测定和记录果实坏果发生率，果实横径和纵径，果实可溶性固形物含量和酸度等指标。

单株果实产量、果实数量和单果重测定结果如表2所示：

注：不同标记字母表示显著差异。

通过试验结果图10看，CK的坏果数量多且程度严重，而接菌BW65处理，改善了这一现象。田间结果表明，接种BW65果树的果实横径和纵径相较CK都有显著提高，单个果实的重量增加（平均260.8g），增幅达12.4%，商品性提高。BW65处理其平均单株产量为22.3kg，比CK有一定的提高。同时，BW65的坏果发生率得到了显著降低，相较CK，降低了43.9%，有效地解决田间果实的腐烂程度，具有一定的抗病性。其次，BW65提高了果实的可溶性固形物含量，酸度相较CK降低了23.5%。

实施例7。

本实施例为高地芽孢杆菌BW65菌株与多种病原菌的平板对峙试验。

配置PDA培养基培养多种病原菌，随后将活化好的供试病原真菌菌株制成5mm的菌饼，转接到新的PDA平板中央，在病原菌四周点接1μl OD₆₀₀为0.80的BW65菌液，待菌液变干后，再将平板放到28℃的培养箱中培养，以四周点接无菌水为对照组，每个处理做三个重复，培养5d后观察平板现象并拍照。

结果：如图9所示，表明BW65菌株能明显地拮抗稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、链格孢菌（Alternaria alternata）和禾谷镰孢菌以及褐座坚壳菌（白纹羽），由此可知，BW65菌株具有一定的抗病作用。

综上试验证明：本申请人筛选得到的高地芽孢杆菌BW65菌株具有良好的产IAA、固氮、解有机磷、解无机磷能力，并能显著促进梨和番茄幼苗生长，改善根系形态，提升植株生物量。具体表现为，与对照相比，接种BW65菌剂处理的梨幼苗地上部干重、根系干重及总干重分别提高了35.7%、3.6%和26.3%，株高、茎粗和SPAD值分别显著提高了62.7%、17.9%和12.9%；番茄幼苗地上部鲜重、根系鲜重及总鲜重分别提高了8.5%、192%和16.6%，茎粗和株高相比CK分别提高了3.5%和16.3%。此外，菌株BW65对稻瘟病菌、链格孢菌、禾谷镰孢菌以及褐座坚壳菌（白纹羽）等病原菌具有明显拮抗作用。盆栽试验表明，接种BW65菌悬液可显著提高杜梨和番茄的地上部干重、根系干重、株高、茎粗等生长指标，并能改善番茄果实的外观与内在品质，如果实纵径、横径、单果重、总糖含量和可溶性固形物含量显著提升，酸度降低。田间应用效果研究显示，接种BW65的果树平均单株产量和平均单果重显著提高，坏果发生率显著降低，果实可溶性固形物含量提高，酸度降低。该菌株可用于制备生物菌剂或生物有机肥，减少化学肥料使用，促进绿色农业发展。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis 菌株BW65，其分类命名为：Bacillus altitudinis BW65，其保藏编号为CCTCC NO：M20251608；该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2025年 7 月 15 日。

2.包含如权利要求1所述的高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis 菌株BW65的菌剂。

3.如权利要求1所述高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis菌株BW65或权利要求2所述菌剂在制备生物有机肥中的应用。

4.如权利要求1所述高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis菌株BW65或权利要求2所述菌剂在促进植物生长中的应用。

5.如权利要求1所述高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis 菌株BW65或权利要求2所述菌剂在改善植物果实品质中的应用。

6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述植物为梨和/或番茄。

7.如权利要求1所述高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis 菌株BW65或权利要求2所述菌剂在制备防控植物病原菌的生防制剂中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物病原菌为稻瘟病病原菌、链格孢菌、禾谷镰孢菌和/或褐座坚壳菌。

9.如权利要求1所述高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis菌株BW65或权利要求2所述菌剂在产IAA、固氮、解有机磷和/或无机磷中的应用。

10.应用如权利要求1所述高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis菌株BW65或权利要求2所述菌剂促进植物生长的方法，其特征在于，所述方法为：将高地芽孢杆菌Bacillus altitudinis 菌株BW65菌悬液和/或菌剂浇灌至植物幼苗根际；所述植物为梨和/或番茄。