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CN121079405A - 用于基因组编辑的组合物和方法 - Google Patents

用于基因组编辑的组合物和方法

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CN121079405A
CN121079405A CN202480014012.1A CN202480014012A CN121079405A CN 121079405 A CN121079405 A CN 121079405A CN 202480014012 A CN202480014012 A CN 202480014012A CN 121079405 A CN121079405 A CN 121079405A
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CN
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cell
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CN202480014012.1A
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O·阿尔瓦雷斯
M-Y·李
B·B·麦迪逊
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Bosida Treatment Co
Original Assignee
Bosida Treatment Co
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Publication date
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Abstract

本发明公开了用于在选定位点处进行功能性遗传修饰的方法和组合物。本发明还提供了细胞群体，其包含一种或多种外源多核苷酸的靶向整合和/或在一个或多个选定基因座处的插入缺失。

Description

用于基因组编辑的组合物和方法
相关申请
本申请要求2023年2月21日提交的美国临时申请号63/486,165的优先权和权益。该申请的内容以引用方式整体并入本文。
电子序列表的引用
电子序列表(POTH-075_001WO_SeqList_ST26.xml；大小137,714字节；以及创建日期：2024年2月12日)的内容以引用方式整体并入本文。
技术领域
本公开涉及遗传编辑和基因组工程改造的领域。更特别地，本公开涉及用于靶向遗传修饰的组合物和方法。
背景技术
基因组编辑是指用于活生物体的遗传信息(基因组)的靶向特定修饰的策略和技术。基因组工程改造是一个活跃的研究领域，因为它具有广泛的可能应用，特别是在人类健康领域中，例如用以纠正携带有害突变的基因或用以探索基因的功能。经发展用以将转基因插入活细胞的早期技术常常受限于新序列插入基因组中的位置的随机性。与早期技术相比，常见的基因组编辑策略允许修饰DNA的特定区域，从而增加校正或插入的精度。虽然这些平台提供了更大程度的再现性，以及经降低的基因组中随机插入和缺失的非预期效应水平，但仍然存在局限性。需要开发在基因组编辑方面具有卓越功效的基因编辑平台和融合蛋白。还需要使用此类基因编辑平台来开发安全且有效的供体细胞，该供体细胞支持涉及再生医学和/或免疫肿瘤学相关疾病的细胞疗法治疗。
发明内容
本公开提供了一种多肽，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。本公开还提供了编码多肽的多核苷酸、包含多肽的载体，以及包含载体和至少一种药用赋形剂或稀释剂的药物组合物。
本公开还提供了一种修饰多个细胞的基因组中的靶序列的方法，该方法包括向未经修饰的细胞的群体引入组合物，该组合物包含：a)多肽，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；或多核苷酸，其编码SEQ ID NO:35的多肽；以及b)至少一种指导RNA(gRNA)，从而在基因组中的靶序列处生成修饰，并且其中与引入有包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的多肽或编码SEQ ID NO:10的多肽的多核苷酸的组合物的多个经修饰的细胞相比，1.1倍至50倍的该多个细胞包含在基因组中的靶序列处的修饰。
在一些方面，与引入有包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的多肽或编码SEQ IDNO:10的多肽的多核苷酸的组合物的多个经修饰的细胞相比，1.2倍至1.8倍的该多个细胞包含在基因组中的靶序列处的修饰。在一些方面，与引入有包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的多肽或编码SEQ ID NO:10的多肽的多核苷酸的组合物的多个经修饰的细胞相比，3倍至40倍的该多个细胞包含在基因组中的靶序列处的修饰。
在一些方面，在基因组中的靶序列处的修饰为缺失、插入、取代、倒位和/或重定位。在一些方面，将组合物包封在至少一种脂质纳米颗粒中，该至少一种脂质纳米颗粒包含：按摩尔计约40.75％的式(I)化合物，
式(I)
按摩尔计约51.75％的胆固醇、按摩尔计约5％的DOPC，以及按摩尔计约2.5％的DMG-PEG2000；其中编码SEQ ID NO:35的多肽的多核苷酸为RNA分子，并且其中该至少一种纳米颗粒中的脂质与RNA分子的比率为约120:1(w/w)。
在一些方面，该多个细胞包括：(a)肝脏细胞，优选地其中肝脏细胞为肝细胞、肝星状细胞、库普弗细胞或肝窦内皮细胞；(b)T细胞，优选地其中T细胞为活化T细胞、静息T细胞或记忆T干细胞(TSCM细胞)；或(c)造血干细胞(HSC)。
本公开还提供了根据本公开的方法中的任何一种方法修饰的细胞。本公开还提供了一种组合物，其包含根据本公开的方法中的任何一种方法修饰的细胞的群体。
本公开还提供了一种治疗有需要的受试者的至少一种疾病或病症的方法，该方法包括向受试者施用至少一种治疗有效量的本文所述的组合物、药物组合物或细胞。在一些方面，该至少一种疾病或病症为肝脏疾病或病症，优选地其中肝脏疾病或病症为：(a)代谢性肝脏病症；(b)尿素循环病症(UCD)，优选地其中UCD为N-乙酰谷氨酸合成酶(NAGS)缺乏症、氨基甲酰磷酸合成酶I缺乏症(CPSI缺乏症)、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症、精氨基琥珀酸合成酶缺乏症(ASSD)(瓜氨酸血症I)、希特林蛋白缺乏症(瓜氨酸血症II)、精氨基琥珀酸裂解酶缺乏症(精氨基琥珀酸尿症)、精氨酸酶缺乏症(高精氨酸血症)、鸟氨酸转位酶缺乏症(HHH综合征)或其任何组合。在一些方面，该至少一种疾病或病症为癌症。在一些方面，该至少一种疾病或病症为血友病A。
本文引用的所有文件，包括任何交叉引用或相关的专利或申请，除非明确排除或以其他方式受到限制，否则出于所有目的以引用方式整体并入本文。对任何文件的引用并不是承认其为关于本文所公开或要求保护的任何发明的现有技术，也不是承认其单独或与任何其他参考文献进行任何组合而教导、建议或公开任何此类发明。此外，在该文件中术语的任何含义或定义与以引用方式并入的文件中同一术语的任何含义或定义相冲突的程度上，以该文件中分配给该术语的含义或定义为准。
具体实施方式
本发明提供了一种用于对基因组进行遗传修饰以包括多核苷酸插入、缺失和/或取代的方法。特别地，本公开通过提供一种用于对细胞基因组进行高效遗传修饰以包括多核苷酸插入、缺失和/或取代的方法来克服与当前技术相关联的问题。这对于对应于疾病表型的基因的修饰是有利的，其对于治疗目的具有重要意义。与当前技术相比，这对于提供更高产率的经修饰的细胞是有利的，其继而对于用于治疗用途的细胞的生产是有利的。
本公开至少部分基于以下发现：与野生型Cas-CLOVER(NLS-dCas9-Clo051-NLS)或常规CRISPR/Cas9系统相比，使用包含Cas-CLOVER的突变体的组合物对细胞进行遗传修饰会产生更高的缺失率。对照其他核酸酶结构域(例如，FokI核酸酶结构域)，对Cas-CLOVER的Clo051内切核酸酶结构域进行的结构建模和序列分析揭示了产生超活跃性的若干保守的氨基酸位置，从而提供功能增强。在保守的α-螺旋-环内的位置处的丝氨酸至脯氨酸修饰产生稳定化效应，因为脯氨酸改变了环的转向并且减少了在环-螺旋的该末端处的自由度。此外，脯氨酸仍然可以在可接受的氢键距离(例如，大约或更小)内与经结合的DNA的磷酸酯主链部分相互作用，从而保留了在该位置处对于野生型Clo051内切核酸酶所观察到的潜在相互作用。使用包含突变型Clo051内切核酸酶或其部分的突变型Cas-CLOVER会引起功能增强，诸如对基因组编辑以及敲入和敲除效率的改善。
因此，本发明提供了一种高效、可靠且靶向的方法，该方法用于瞬时地或稳定地整合一个或多个外源基因并且保持该基因在各种细胞类型中的高活力和功能反应。细胞类型的非限制性实例包括经扩增的iPSC，以及在源自经修饰的iPSC的分化细胞中，包括但不限于HSC(造血干/祖细胞)、T细胞祖细胞、NK细胞祖细胞、T细胞、NKT细胞、NK细胞。这些对于开发支持细胞疗法治疗(例如，再生医学或免疫肿瘤学相关疾病的治疗)的安全且有效的通用供体细胞是有用的。
本公开通过提供包含遗传工程改造的融合分子(例如Cas-CLOVER的突变体)的组合物来克服与当前技术相关联的问题，该组合物用于靶向还原或消除细胞中的基因产物，以用于体内基因疗法。包含本公开的遗传工程改造的融合分子的组合物可用于治疗遗传疾病。非限制性实例包括肝脏疾病、与肝细胞相关联的疾病、镰状细胞病或β地中海贫血。因此，还提供了制备用于体内递送的遗传工程改造的融合分子及其药物制剂(例如，脂质纳米颗粒制剂)的方法。
本公开至少部分基于以下发现：相对于野生型Cas-CLOVER，即使由本公开的突变型Cas-CLOVER所提供的编辑活性的适度倍增(例如，1.5倍至3倍的范围)也可能对体内治疗应用具有显著影响。该增加可以翻译成25％至50％的无用治疗功效指数与75％的有用治疗功效指数之间的差异，其中大多数患病(突变型)或疾病相关等位基因可以为失活的，包括双等位基因编辑。作为非限制性实例，对于HBG基因座靶向，由本公开的突变型Cas-CLOVER所提供的改善的幅度可以跨越关键的治疗阈值，以完全实现胎儿血红蛋白(HbF)表达的活化，这将向镰状细胞病或β地中海贫血的功能校正提供治疗功效。替代性地，突变型Cas-CLOVER的活性增加可以使得所施用的治疗产物的剂量降低，这对耐受性和毒性有益。
用于在选定基因座处进行靶向基因组编辑的方法
基因编辑组合物和方法
经修饰的细胞可以通过将转基因引入细胞中来产生。引入步骤可以包括经由非转座递送系统来递送核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体。
将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、体内、体外或原位引入细胞中可以包括局部递送、吸附、吸收、电穿孔、自旋染(spin-fection)、共培养、转染、机械递送、声波递送、振动递送、磁转染或通过纳米颗粒介导的递送中的一者或多者。将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、体内、体外或原位引入细胞中包括脂质体转染、磷酸钙转染、fugene转染和树状物介导的转染。通过机械转染来将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、体内、体外或原位引入细胞中可以包括细胞挤压、细胞轰击或基因枪技术。通过纳米颗粒介导的转染来将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、体内、体外或原位引入细胞中可以包括脂质体递送、通过胶束来递送和通过聚合物囊泡(polymerosome)来递送。
将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、体内、体外或原位引入细胞中可以包括非病毒载体。非病毒载体可以包含核酸。非病毒载体可以包含质粒DNA、线性双链DNA(dsDNA)、线性单链DNA(ssDNA)、DoggyBoneTMDNA、纳米质粒、微环DNA、单链寡脱氧核苷酸(ssODN)、双链寡核苷酸(dsODN)、单链mRNA(ssRNA)和双链mRNA(dsRNA)。非病毒载体可以包含如本文所述的转座子。
将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、体内、体外或原位引入细胞中可以包括病毒载体。病毒载体可以为非整合非染色体载体。非整合非染色体载体的非限制性实例包括腺相关病毒(AAV)、腺病毒和疱疹病毒。病毒载体可以为整合染色体载体。整合染色体载体的非限制性实例包括腺相关载体(AAV)、慢病毒和γ-逆转录病毒。
将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、体内、体外或原位引入细胞中可以包括载体的组合。载体组合的非限制性实例包括病毒载体和非病毒载体、多个非病毒载体或多个病毒载体。载体组合的非限制性实例包括DNA来源载体和RNA来源载体的组合、RNA和逆转录酶的组合、转座子和转座酶的组合、非病毒载体和内切核酸酶的组合以及病毒载体和内切核酸酶的组合。
基因组修饰可以包括将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、体内、体外或原位引入细胞中，以稳定地整合核酸序列、瞬时地整合核酸序列、产生核酸序列的位点特异性整合或产生核酸序列的偏向整合。核酸序列可以为转基因。
核酸序列或转基因的大小可以为约1kb至约15kb。核酸序列或转基因的尺寸可以为至少1kb、至少2kb、至少3kb、至少4kb、至少5kb、至少6kb、至少7kb、至少8kb、至少9kb、至少10kb、至少11kb、至少12kb、至少13kb、至少14kb、至少15kb。核酸序列或转基因的尺寸可以为约1kb、约2kb、约3kb、约4kb、约5kb、约6kb、约7kb、约8kb、约9kb、约10kb、约11kb、约12kb、约13kb、约14kb或约15kb。
基因组修饰可以包括将核酸序列、转基因和/或基因组编辑构建体离体、体内、体外或原位引入细胞中，以稳定地整合核酸序列。稳定的染色体整合可以为随机整合、位点特异性整合或偏向整合。位点特异性整合可以为非辅助的或辅助的。辅助位点特异性整合与定点核酸酶共同递送。定点核酸酶包含具有5'和3'核苷酸序列延伸的转基因，该核苷酸序列延伸含有相对于基因组整合的位点的上游区域和下游区域的同源性百分比。具有同源核苷酸延伸的转基因通过同源重组、微同源介导的末端连接或非同源末端连接来实现基因组整合。位点特异性整合可以发生在安全港位点处。基因组安全港位点能够以以下方式适应新遗传物质的整合：确保新插入的遗传元件可靠地发挥作用(例如，以治疗有效的表达水平进行表达)，并且不会对宿主基因组造成有害改变，从而对宿主生物体造成风险。潜在的基因组安全港的非限制性实例包括人白蛋白基因的内含子序列、腺相关病毒位点1(AAVS1)、AAV病毒在染色体19上的天然存在的整合位点、趋化因子(C-C基序)受体5(CCR5)基因的位点，以及小鼠Rosa26基因座的人直系同源物的位点。
位点特异性转基因整合可以发生在破坏靶基因的表达的位点处。靶基因表达的破坏可以通过在内含子、外显子、启动子、遗传元件、增强子、抑制子、起始密码子、终止密码子和响应元件处的位点特异性整合来发生。由位点特异性整合所靶向的靶基因的非限制性实例包括TRAC、TRAB、PDI、任何免疫抑制基因以及参与同种异体移植排斥(allo-rejection)的基因。
位点特异性转基因整合可以发生在引起靶基因表达的增强的位点处。靶基因表达的增强可以通过在内含子、外显子、启动子、遗传元件、增强子、抑制子、起始密码子、终止密码子和响应元件处的位点特异性整合来发生。
酶可以用于在宿主基因组中产生链断裂，以促进转基因的递送或整合。酶可以产生单链断裂或双链断裂。断裂诱导酶的非限制性实例包括转座酶、整合酶、内切核酸酶、CRISPR/Cas9、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、Cas-CLOVERTM和CPF1。可以将断裂诱导酶递送至细胞，该断裂诱导酶编码在DNA中、编码在mRNA中、作为蛋白质或作为具有指导RNA(gRNA)的核蛋白复合物。断裂诱导酶的非限制性实例描述于PCT/US2016/037922、PCT/US2018/066941、PCT/US2017/054799中，这些专利中的每一者以引用方式整体并入。下面还描述了本公开的示例性突变型Cas-CLOVER断裂诱导酶。
位点特异性转基因整合可以通过载体介导的整合位点偏倚来控制。
位点特异性转基因整合位点可以为非稳定染色体插入。经整合的转基因可以被沉默、去除、切除或进一步修饰。基因组修饰可以为转基因的非稳定整合。非稳定整合可以为瞬时非染色体整合、半稳定非染色体整合、半持久性非染色体插入或非稳定染色体插入。瞬时非染色体插入可以为表染色体的或细胞质的。在一个方面，转基因的瞬时非染色体插入并不整合至染色体中，并且经修饰的遗传物质在细胞分裂期间不进行复制。
基因组修饰可以为转基因的半稳定或持久性非染色体整合。DNA载体编码与核基质蛋白结合的支架/基质附着区(S-MAR)模块，以用于非病毒载体的附加型保留，从而允许在分裂细胞的细胞核中进行自主复制。
基因组修饰可以为转基因的非稳定染色体整合。经整合的转基因可以被沉默、去除、切除或进一步修饰。
通过转基因插入对基因组进行的修饰可以经由宿主细胞定向双链断裂修复(同源定向修复)来发生，该宿主细胞定向双链断裂修复通过同源重组(HR)、微同源介导的末端连接(MMEJ)、非同源末端连接(NHEJ)、转座酶介导的修饰、整合酶介导的修饰、内切核酸酶介导的修饰或重组酶介导的修饰来进行。通过转基因插入对基因组进行的修饰可以经由CRISPR/Cas9、TALEN、ZFN、Cas-CLOVERTM和cpf1来发生。断裂诱导酶的非限制性实例描述于PCT/US2016/037922、PCT/US2018/066941、PCT/US2017/054799中，这些专利中的每一者以引用方式整体并入。本文还描述了本公开的示例性突变型Cas-CLOVER断裂诱导酶。
在涉及插入新的或现有的核苷酸/核酸的基因编辑系统中，除了切割酶(例如，核酸酶、重组酶、整合酶或转座酶)外，还必须将插入工具(例如，DNA模板载体、转座元件(转座子或逆转录转座子))递送至细胞。用于重组酶的此类插入工具的实例可以包括DNA载体。其他基因编辑系统需要连同插入载体一起递送整合酶、连同转座子/逆转录转座子一起递送转座酶等。可以用作切割酶的示例重组酶为CRE重组酶。可以用于插入工具中的整合酶的非限制性实例包括基于病毒的酶，该基于病毒的酶取自包括AAV、γ逆转录病毒和慢病毒的任何数量的病毒。本文更详细地描述了可以用于插入工具中的示例转座子/逆转录转座子。
本公开提供了一种基因编辑组合物和/或包含该基因编辑组合物的细胞。基因编辑组合物可以包含编码DNA结合结构域的序列以及编码核酸酶蛋白或其核酸酶结构域的序列。编码核酸酶蛋白的序列或编码其核酸酶结构域的序列可包含DNA序列、RNA序列或其组合。核酸酶或其核酸酶结构域可包含CRISPR/Cas蛋白、类转录激活因子效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和内切核酸酶中的一者或多者。
示例性dCas9-Clo051融合蛋白
核酸酶或其核酸酶结构域可包含核酸酶失活的Cas(dCas)蛋白和内切核酸酶。内切核酸酶可包含Clo051核酸酶或其核酸酶结构域。基因编辑组合物可包含融合蛋白。融合蛋白可包含核酸酶失活的Cas9(dCas9)蛋白和Clo051核酸酶或Clo051核酸酶结构域。基因编辑组合物可进一步包含指导序列。指导序列包含RNA序列。
本公开提供了包含可操作地连接至效应物的小Cas9(Cas9)的组合物。本公开提供了一种融合蛋白，其包含DNA定位组件和效应物分子、基本由其组成、或由其组成，其中效应物包含小Cas9(Cas9)。本公开的小Cas9构建体可包含含有IIS型内切核酸酶的效应物。具有活性催化位点的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
本公开提供了包含可操作地连接至效应物的小的失活Cas9(dSaCas9)的组合物。本公开提供了一种融合蛋白，其包含DNA定位组分和效应物分子、基本上由其组成、或由其组成，其中效应物包含小的失活Cas9(dSaCas9)。本公开的小的失活Cas9(dSaCas9)构建体可包含含有IIS型内切酶的效应物。dSaCas9包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列，该氨基酸序列包含D10A和N580A突变以使催化位点失活。
本公开提供了包含可操作地连接至效应物的失活Cas9(dCas9)的组合物。本公开提供了一种融合蛋白，其包含DNA定位组分和效应物分子、基本上由其组成、或由其组成，其中效应物包含失活Cas9(dCas9)。本公开的失活Cas9(dCas9)构建体可包含含有IIS型内切酶的效应物。
dCas9可以分离自或源自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)。dCas9可包含在氨基酸位置10和840处具有取代的dCas9，这使催化位点失活。在一些方面，这些取代为D10A和H840A。dCas9可以包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的氨基酸序列。
示例性Clo051核酸酶结构域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成。在一些方面，Clo051核酸酶结构域包含至少一个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代在Clo051核酸酶的α-螺旋-环结构域中。在一些方面，氨基酸取代在SEQ ID NO:5的位置37处。
示例性dCas9-Clo051融合蛋白可以包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成。示例性dCas9-Clo051融合蛋白可以由多核苷酸编码，该多核苷酸包含SEQ ID NO:7的核酸序列、基本上由其组成、或由其组成。编码dCas9-Clo051融合蛋白的核酸可以为DNA或RNA。
示例性dCas9-Clo051融合蛋白可以包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成。示例性dCas9-Clo051融合蛋白可以由多核苷酸编码，该多核苷酸包含SEQ ID NO:9的核酸序列、基本上由其组成、或由其组成。编码dCas9-Clo051融合蛋白的核酸可以为DNA或RNA。
本公开的示例性dCas9-Clo051融合蛋白可以进一步包含至少一个核定位序列(NLS)。在一些实施方案中，本公开的dCas9-Clo051融合蛋白包含至少两个核定位序列。在一些实施方案中，NLS在dCas9-Clo051融合蛋白的N'末端上(NLS-dCas9-Clo051)。在一些实施方案中，NLS在dCas9-Clo051融合蛋白的C末端上(dCas9-Clo051-NLS)。在一些实施方案中，NLS在dCas9-Clo051融合蛋白的N'末端和C'末端上(“NLS-dCas9-Clo051-NLS”或“野生型Cas-CLOVER”)。
NLS-dCas9-Clo051-NLS(“野生型Cas-CLOVER”)融合蛋白可以包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成。
NLS-dCas9-Clo051-NLS氨基酸序列(NLS氨基酸序列加粗并加下划线)
编码NLS-dCas9-Clo051-NLS(“野生型Cas-CLOVER”)融合蛋白的核酸可以为DNA或RNA。在一些实施方案中，NLS-dCas9-Clo051-NLS由mRNA序列编码，该序列包含SEQ ID NO:11、基本上由其组成、或由其组成。
NLS-dCas9-Clo051-NLS mRNA序列(NLS氨基酸序列加粗并加下划线)
示例性突变型Cas-CLOVER融合蛋白
在一些方面，NLS-dCas9-Clo051-NLS(“野生型Cas-CLOVER”)包含至少一个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代位于NLS-dCas9-Clo051-NLS的Clo051结构域中。
在一些方面，SEQ ID NO:10的NLS-dCas9-Clo051-NLS可以在氨基酸位置44处包含至少一个取代。在一些方面，氨基酸取代为S44P。
示例性S44P突变型NLS-dCas9-Clo051-NLS(“S44P Cas-CLOVER”或“S44P CC”或“S44P”)融合蛋白可以包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成。S44P Cas-CLOVER融合蛋白可以由多核苷酸编码，该多核苷酸包含SEQ ID NO:36的核酸序列、基本上由其组成、或由其组成。编码dCas9-Clo051融合蛋白的核酸可以为DNA或RNA。
S44P Cas-CLOVER氨基酸序列(SEQ ID NO:35)
S44P Cas-CLOVER核酸序列(SEQ ID NO:36)
下文示出了野生型Cas-CLOVER氨基酸序列(SEQ ID NO:10)和突变型S44P Cas-CLOVER氨基酸序列(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列比对。
包含基因编辑组合物的细胞可稳定或瞬时表达该基因编辑组合物。
转基因可以包含编码治疗剂的序列。治疗剂可以为当施用于细胞或受试者时提供治疗益处的蛋白质或RNA。治疗剂可以为治疗性蛋白质或治疗性RNA。治疗剂可以为人β-珠蛋白(HBB)、T87Q人β-珠蛋白(HBB T87Q)、BAF染色质重塑复合物亚基(BCL11A)shRNA、胰岛素样生长因子2结合蛋白1(IGF2BP1)、白介素2受体γ(IL2RG)、α-半乳糖苷酶A(GLA)、α-L-艾杜糖醛酸酶(IDUA)、艾杜糖2-硫酸酯酶(IDS)、胱氨酸溶酶体半胱氨酸转运体(CTNS)。转基因可以包含因子VIII或因子IX的序列。转基因可以包含编码嵌合抗原受体(CAR)的序列。转基因可以包含编码非天然存在的嵌合刺激受体(CSR)的序列，该序列包含：(a)包含活化组分的胞外域，其中活化组分分离自或源自第一蛋白质；(b)跨膜结构域；和(c)包含至少一个信号转导结构域的胞内域，其中该至少一个信号转导结构域分离自或源自第二蛋白质；其中第一蛋白质和第二蛋白质不相同。在一个方面，转基因可以包含CAR的序列和CSR的序列。在一个方面，包含CAR或CSR的转基因与BCMA、PSMA、MUC1-C、CD133、c-KIT、CD19或CD20特异性结合。转基因可以包含编码诱导型促凋亡多肽的序列，该序列包含(a)配体结合区、(b)接头和(c)半胱天冬酶多肽，其中诱导型促凋亡多肽不包含非人序列。转基因可以整合至HSC的基因组中。整合可以为稳定的或瞬时的。
因子VIII(FVIII)缺乏症引起血友病A的发展。因子IX(FIX)缺乏症引起血友病B的发展。在本公开的组合物和方法之前，针对血友病B的标准治疗涉及每2天至3天输注重组FIX，费用为每年大约$250,000。与该标准治疗选项形成鲜明对比，本公开的iPSC可以分化成任何细胞类型(包括HSC)并且在人体中保持数十年。
指导RNA可包含与基因组DNA序列内的靶序列互补的序列。基因组DNA序列内的靶序列可为基因组DNA序列的安全港位点内的靶序列。示例性靶序列包括但不限于HBB、TRAC、B2M、TCRb、GAPDH或SOX17。
指导RNA可以包含转座子、质粒或载体上的与至少一个靶序列互补的序列。在一些方面，与指导RNA互补的转座子、质粒或载体上的互补序列位于转基因内，以用于靶向核酸插入。在一些方面，与指导RNA互补的转座子、质粒或载体上的互补序列位于转基因内，以用于靶向核酸插入。在一些方面，转座子、质粒或载体上的互补序列促进与效应物分子结合的gRNA的结合，从而拴系所有组分。在一些方面，效应物分子为Cas-CLOVER。在一些方面，Cas-CLOVER进一步包含至少一个NLS序列。在一些方面，Cas-CLOVER的NLS序列促进将拴系组分定位至细胞核。这促进了将基因编辑所需的所有组分定位至细胞核中(Cas-CLOVER、gRNA和转座子、质粒或载体)，从而增加基因编辑的效率。
gRNA
如本文所用，在Cas-CLOVER系统或CRISPR-Cas9系统的上下文中，术语“指导序列”包含与靶核酸序列具有足够互补性以与靶核酸序列杂交并且引导核酸靶向复合物与靶核酸序列进行序列特异性结合的任何多核苷酸序列。指导序列可以与靶序列形成双链体。双链体可以为DNA双链体、RNA双链体或RNA/DNA双链体。术语“指导分子”和“指导RNA”和“单指导RNA”在本文中可互换使用，以指能够与Cas-CLOVER或CRISPR-Cas蛋白形成复合物的基于RNA的分子，并且包含与靶核酸序列具有足够互补性以与靶核酸序列杂交并且引导复合物与靶核酸序列进行序列特异性结合的指导序列。指导分子或指导RNA可以涵盖具有一个或多个化学修饰(例如，通过化学连接两个核糖核苷酸，或通过用一个或多个脱氧核糖核苷酸替代一个或多个核糖核苷酸)的基于RNA的分子，如本文所述。
如在本文中可互换使用的，术语“靶区域”、“靶序列”或“原间隔序列(protospacer)”是指Cas-CLOVER系统或基于CRISPR/Cas9的系统所靶向的靶基因的区域。Cas-CLOVER或基于CRISPR/Cas9的系统可以包含至少一种gRNA，其中gRNA靶向不同的DNA序列。靶DNA序列可以重叠。Cas-CLOVER系统可以包含至少两个gRNA，其中gRNA靶向不同的DNA序列。靶序列或原间隔序列之后为在原间隔序列的3'端处的PAM序列。不同的II型系统具有不同的PAM要求。例如，酿脓链球菌(S.pyogenes)II型系统使用“NGG”序列，其中“N”可以为任何核苷酸。
指导RNA或Cas-CLOVER蛋白或CRISPR-Cas蛋白的指导RNA可以包含tracr-mate序列(在内源CRISPR系统的上下文中涵盖“直接重复”)和指导序列(在内源CRISPR系统的上下文中也称为“间隔区”)。在一些实施方案中，如本文所述的Cas-CLOVER或CRISPR-Cas系统或复合物不包含和/或不依赖于tracr序列的存在。在某些实施方案中，指导分子可以包含与指导序列或间隔区序列融合或连接的直接重复序列、基本上由其组成、或由其组成。
在某些实施方案中，指导分子的指导序列或间隔区长度为15个至50个核苷酸长度。在某些实施方案中，指导RNA的间隔区长度为至少15个核苷酸长度。在某些实施方案中，间隔区长度为15个至17个核苷酸长度、17个至20个核苷酸长度、20个至24个核苷酸长度、23个至25个核苷酸长度、24个至27个核苷酸长度、27个至30个核苷酸长度、30个至35个核苷酸长度或大于35个核苷酸长度。
在一些实施方案中，指导序列的长度为15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个、66个、67个、68个、69个、70个、71个、72个、73个、74个、75个、76个、77个、78个、79个、80个、81个、82个、83个、84个、85个、86个、87个、88个、89个、90个、91个、92个、93个、94个、95个、96个、97个、98个、99个或100个核苷酸。
在一些实施方案中，选择指导分子的序列(直接重复和/或间隔区)以减少指导分子内的程度二级结构。在一些实施方案中，当最佳地折叠时，核酸靶向指导RNA的约或小于约75％、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、1％或更少的核苷酸参与自互补碱基配对。最佳折叠可以通过任何合适的多核苷酸折叠算法来确定。一些程序基于计算最小吉布斯自由能。此类算法的实例为mFold，如Zuker和Stiegler(Nucleic Acids Res.9(1981),133-148)所述。另一个示例折叠算法为在维也纳大学理论化学研究所处使用质心结构预测算法所开发的在线网络服务器RNAfold(参见例如，A.R.Gruber等人，2008,Cell 106(1):23-24；以及PA Carr和GM Church,2009,Nature Biotechnology 27(12):1151-62)。
如上所述，Cas-CLOVER系统和CRISPR/Cas9系统利用了靶向gRNA和提供Cas-CLOVER系统和基于CRISPR/Cas9的系统的靶向的穿梭gRNA。gRNA可以为两种非编码RNA：crRNA和tracrRNA的融合。sgRNA可以通过交换编码20bp原间隔序列的序列来靶向任何所需DNA序列，该原间隔序列通过与所需DNA靶标的互补碱基配对来赋予靶向特异性。gRNA模拟II型效应物系统中涉及的天然存在的crRNA:tracrRNA双链体。该双链体(其可以包括例如42-核苷酸crRNA和75-核苷酸tracrRNA)用作用于Cas9切割靶核酸的指导物。
在一些实施方案中，gRNA靶向靶基因(例如，HBB、B2M、TRAC或GAPDH基因座)上游的区域，例如，在靶基因上游0至1000bp之间。在一些实施方案中，gRNA靶向靶基因的转录起始位点上游0至50bp、0至100bp、0至150bp、0至200bp、0至250bp、0至300bp、0至350bp、0至400bp、0至450bp、0至500bp、0至550bp、0至600bp、0至650bp、0至700bp、0至750bp、0至800bp、0至850bp、0至900bp、0至950bp或0至1000bp之间的区域。在一些实施方案中，gRNA靶向靶基因上游约100bp、约200bp、约300bp、约400bp、约500bp、约600bp、约700bp、约800bp、约900bp、约1000bp、约1100bp、约1200bp、约1300bp、约1400bp或约1500bp内的区域。
在一些实施方案中，gRNA靶向靶基因(例如，HBB、B2M、TRAC或GAPDH基因座)下游的区域，例如，在靶基因下游0至1000bp之间。在一些实施方案中，gRNA靶向靶基因下游0至50bp、0至100bp、0至150bp、0至200bp、0至250bp、0至300bp、0至350bp、0至400bp、0至450bp、0至500bp、0至550bp、0至600bp、0至650bp、0至700bp、0至750bp、0至800bp、0至850bp、0至900bp、0至950bp或0至1000bp之间的区域。在一些实施方案中，gRNA靶向靶基因下游约100bp、约200bp、约300bp、约400bp、约500bp、约600bp、约700bp、约800bp、约900bp、约1000bp、约1100bp、约1200bp、约1300bp、约1400bp或约1500bp内的区域。
gRNA可以分为靶结合区和Cas9结合区。靶结合区与靶基因中的靶区域杂交。用于设计此类靶结合区的方法是本领域中已知的，参见例如，Doench等人，Nat Biotechnol.(2014)32:1262-7；和Doench等人，Nat Biotechnol.(2016)34:184-91，其以引用方式整体并入本文。设计工具可在以下网站获得：Feng Zhang lab'starget Finder、MichaelBoutros lab's Target Finder(E-CRISP)、RGEN Tools(Cas-OF Finder)、CasFinder和CRISPR Optimal Target Finder。在某些实施方案中，靶结合区的长度可以在约15个与约50个核苷酸之间(长度为约15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个或约50个核苷酸)。在某些实施方案中，靶结合区的长度可以在约19个与约21个核苷酸之间。在一个实施方案中，靶结合区的长度为15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个核苷酸。
在一个实施方案中，靶结合区与靶基因中的靶区域互补，例如完全互补。在一个实施方案中，靶结合区与靶基因中的靶区域实质上互补。在一个实施方案中，靶结合区包含不超过1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个与靶基因中的靶区域不互补的核苷酸。
本公开的示例性sgRNA包含但不限于用于靶向HBB、B2M、TRAC或GAPDH基因座的序列。本公开的示例性sgRNA还包含但不限于用于靶向血红蛋白、白蛋白、TTR、APOC3和PCSK9的序列。本公开的示例性sgRNA包含如表1所示的序列、基本上由其组成、或由其组成。
表1.本公开的示例性sgRNA
包含Cas-CLOVER的基因编辑组合物以及将这些组合物用于基因编辑的方法详细描述于PCT申请号PCT/US2016/037922、PCT/US2018/066941、PCT/US2017/054799、美国专利公开号2017/0107541、2017/0114149、2018/0187185和美国专利号10,415,024中，这些专利中的每一者以引用方式整体并入本文。本文描述了包含突变型Cas-CLOVER的示例性基因编辑组合物和将这些组合物用于基因编辑的方法。
基因编辑工具也可以使用一种或多种基于聚(组氨酸)的胶束来递送至细胞。聚(组氨酸)(例如，聚(L-组氨酸))为一种pH敏感聚合物，这是由于在不饱和氮气上提供孤电子对的咪唑环。即，聚(组氨酸)通过质子化-去质子化具有两性特性。特别地，在某些pH下，含有聚(组氨酸)的三嵌段共聚物可以组装成在表面上具有带正电荷的聚(组氨酸)单元的胶束，从而能够与带负电荷的基因编辑分子络合。使用这些纳米颗粒以pH依赖性方式结合和释放蛋白质和/或核酸可以提供高效和选择性机制，以进行所需基因修饰。特别地，该基于胶束的递送系统提供了相对于带电荷的材料的实质性灵活性，以及大有效载荷容量和纳米颗粒有效载荷的靶向释放。在一个实例中，双链DNA的位点特异性切割通过使用基于聚(组氨酸)的胶束递送核酸酶来实现。不希望受特定理论的束缚，据信在由各种三嵌段共聚物形成的胶束中，疏水性嵌段聚集以形成核心，从而在末端留下亲水性嵌段和聚(组氨酸)嵌段以形成一个或多个包围层。
在一个方面，本公开提供了由亲水性嵌段、疏水性嵌段和带电荷的嵌段制成的三嵌段共聚物。在一些方面，亲水性嵌段可以为聚(环氧乙烷)(PEO)，并且带电荷的嵌段可以为聚(L-组氨酸)。可以使用的示例性三嵌段共聚物为PEO-b-PLA-b-PHIS，其中每个嵌段中重复单元的可变数量因设计而异。
可以用作用于制备三嵌段共聚物的中间体的二嵌段共聚物可以具有亲水性生物相容性聚(环氧乙烷)(PEO)，该聚(环氧乙烷)在化学上与PEG同义，偶联至各种疏水性脂族聚(酸酐)、聚(核酸)、聚(酯)、聚(原酸酯)、聚(肽)、聚(磷腈)和聚(糖)，包括但不限于聚(丙交酯)(PLA)、聚(乙交酯)(PLGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)、聚(ε-己内酯)(PCL)和聚(三亚甲基碳酸酯)(PTMC)。由100％聚乙二醇化表面组成的聚合物胶束具有经改善的体外化学稳定性、加强的体内生物利用度和延长的血液循环半衰期。
聚合物微泡(Polymeric vesicle)、聚合物囊泡(polymersome)和基于聚(组氨酸)的胶束(包括那些包含三嵌段共聚物的胶束)及其制备方法进一步详细描述于美国专利号7,217,427；7,868,512；6,835,394；8,808,748；10,456,452；美国公开号2014/0363496；2017/0000743；和2019/0255191；以及PCT公开号WO 2019/126589中，这些专利中的每一者以引用方式整体并入本文。
基因编辑组合物(例如突变型Cas-CLOVER)也可以使用包含萜烯类脂质化合物的一种或多种脂质纳米颗粒组合物及其制备方法来递送至细胞，如PCT申请号PCT/US2023/061005所述，其以引用方式整体并入本文。
在一些方面，将组合物包封在至少一种脂质纳米颗粒中，该至少一种脂质纳米颗粒包含：按摩尔计约40.75％的萜烯类脂质化合物(例如，HMA-404)、按摩尔计约51.75％的胆固醇、按摩尔计约5％的DOPC和按摩尔计约2.5％的DMG-PEG2000，其中编码突变型Cas-CLOVER的多核苷酸为RNA分子，并且其中该至少一种纳米颗粒中的脂质与RNA分子的比率为约120:1(w/w)。
在一些方面，萜烯类脂质化合物为HMA-404，其具有如下所示的结构：
因此，在一些方面，将基因编辑组合物包封在至少一种脂质纳米颗粒中，该至少一种脂质纳米颗粒包含：按摩尔计约40.75％的HMA-404、按摩尔计约51.75％的胆固醇、按摩尔计约5％的DOPC和按摩尔计约2.5％的DMG-PEG2000，其中编码突变型Cas-CLOVER多肽(例如，SEQ ID NO:35的多肽)的多核苷酸为RNA分子，并且其中该至少一种纳米颗粒中的脂质与RNA分子的比率为约120:1(w/w)。
转座系统
本公开还提供一种组合物，其包含转座子。在一个优选的方面，包含转座子的组合物进一步包含质粒，该质粒包含编码转座酶的核苷酸序列。编码转座酶的核苷酸序列可以为DNA序列或RNA序列。优选地，编码转座酶的序列为mRNA序列。
本公开的转座子可以为piggyBacTM(PB)转座子。在一些方面，当转座子为PB转座子时，转座酶为piggyBacTM(PB)转座酶、piggyBac样(PBL)转座酶或Super piggyBacTM(SPB)转座酶。编码SPB转座酶的序列为mRNA序列。
本公开的转座子可以为Footprint-FreeTM转座子。在一些方面，转座酶为PBx转座酶。编码PBx转座酶的序列为mRNA序列。在一些方面，PBx转座酶促进转座子、质粒或载体中的核酸盒的Footprint-FreeTM去除。
PB转座子以及PB、PBL和SPB转座酶的非限制性实例详细描述于美国专利号6,218,182；美国专利号6,962,810；美国专利号8,399,643和PCT公开号WO 2010/099296、WO 2010/099301、WO 2013/012824中，这些专利中的每一者整体并入本文。
PB、PBL和SPB转座酶识别转座子末端的转座子特异性反向末端重复序列(ITR)，并且将内容物在染色体位点内序列5'-TTAT-3'(TTAT靶序列)处或染色体位点内序列5'-TTAA-3'(TTAA靶序列)处插入ITR之间。PB或PBL转座子的靶序列可包含以下或由以下组成：5'-CTAA-3'、5'-TTAG-3'、5'-ATAA-3'、5'-TCAA-3'、5'AGTT-3'、5'-ATTA-3'、5'-GTTA-3'、5'-TTGA-3'、5'-TTTA-3'、5'-TTAC-3'、5'-ACTA-3'、5'-AGGG-3'、5'-CTAG-3'、5'-TGAA-3'、5'-AGGT-3'、5'-ATCA-3'、5'-CTCC-3'、5'-TAAA-3'、5'-TCTC-3'、5'TGAA-3'、5'-AAAT-3'、5'-AATC-3'、5'-ACAA-3'、5'-ACAT-3'、5'-ACTC-3'、5'-AGTG-3'、5'-ATAG-3'、5'-CAAA-3'、5'-CACA-3'、5'-CATA-3'、5'-CCAG-3'、5'-CCCA-3'、5'-CGTA-3'、5'-GTCC-3'、5'-TAAG-3'、5'-TCTA-3'、5'-TGAG-3'、5'-TGTT-3'、5'-TTCA-3'5'-TTCT-3'和5'-TTTT-3'。PB或PBL转座子系统对于可包含在ITR之间的目的基因无有效载荷限制。
一种或多种PB、PBL和SPB转座酶的示例性氨基酸序列公开于美国专利号6,218,185；美国专利号6,962,810和美国专利号8,399,643中。
如本文所述，在某些实施方案中，本发明以整合缺陷性piggyBac转座子为特征。整合缺陷性意指以比对应的野生型转座子更低的频率整合至宿主基因组中的转座子。在某些示例性实施方案中，本发明的转座子通过常规整合机制来整合。
在某些示例性实施方案中，整合缺陷性piggyBac转座子源自野生型piggyBac序列，SEQ ID NO:16。在示例性实施方案中，整合缺陷性piggyBac转座子包含SEQ ID NO:16的变化，该变化选自R372A或K375A。在某些优选的实施方案中，整合缺陷性piggyBac转座子包含选自SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在某些实施方案中，SEQ ID NO:16的氨基酸变化包含R372A并且对应于SEQ ID NO:17。由SEQ ID NO:17编码的整合缺陷性变体对应于SEQ ID NO:20中CGA至GCA的核苷酸变化，并且对应于SEQ ID NO:21。在其他某些实施方案中，SEQ ID NO:16的氨基酸变化包含K375A并且对应于SEQ ID NO:18。由SEQ ID NO:18编码的整合缺陷性变体对应于SEQ ID NO:20中AAA至GCA的核苷酸变化，并且对应于SEQ ID NO:50。在其他某些实施方案中，SEQ ID NO:2的氨基酸变化包含R372A、K375A并且对应于SEQ ID NO:19。由SEQ ID NO:19编码的整合缺陷性变体对应于SEQID NO:20中CGA至GCA/AAA至GCA的核苷酸变化，并且对应于SEQ ID NO:22。
在示例性实施方案中，整合缺陷性piggyBac转座酶包含SEQ ID NO:16的变化，该变化至少选自R372A或K375A和D450N。在一些方面，PBx转座酶包含与SEQ ID NO:23至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间的任何百分比)相同的氨基酸序列、或由其组成。
在示例性实施方案中，整合缺陷性piggyBac转座酶包含SEQ ID NO:16的变化，该变化至少选自R372A或K375A和D450N。在一些方面，PBx转座酶包含与SEQ ID NO:24至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间的任何百分比)相同的氨基酸序列、或由其组成。
在一些方面，PB转座酶包含与SEQ ID NO:25至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间的任何百分比)相同的氨基酸序列、或由其组成。
PB或PBL转座酶可以包含在SEQ ID NO:25的序列的位置30、165、282或538中的两个或更多个位置处、三个或更多个位置处、或每个位置处具有氨基酸取代的氨基酸序列、或由其组成。转座酶可为SPB转座酶，其包含SEQ ID NO:25的序列的氨基酸序列、或由其组成，其中在位置30处的氨基酸取代可为缬氨酸(V)被异亮氨酸(I)取代，在位置165处的氨基酸取代可为丝氨酸(S)被甘氨酸(G)取代，在位置282处的氨基酸取代可为缬氨酸(V)被甲硫氨酸(M)取代，并且在位置538处的氨基酸取代可为赖氨酸(K)被天冬酰胺(N)取代。在一个优选的方面，SPB转座酶包含与SEQ ID NO:26至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间的任何百分比)相同的氨基酸序列、或由其组成。
在其中转座酶在位置30、165、282和/或538处包含上述突变的某些方面，PB、PBL和SPB转座酶可以在SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:26的序列的位置3、46、82、103、119、125、177、180、185、187、200、207、209、226、235、240、241、243、258、296、298、311、315、319、327、328、340、421、436、456、470、486、503、552、570和591中的一个或多个位置处进一步包含氨基酸取代，如PCT公开号WO 2019/173636和PCT/US2019/049816中更详细地描述的。
PB、PBL或SPB转座酶可分离自或源自昆虫、脊椎动物、甲壳类动物或尾索动物，如PCT公开号WO 2019/173636和PCT/US2019/049816中更详细地描述的。在优选的方面，PB、PBL或SPB转座酶分离自或源自昆虫粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(GenBank登录号AAA87375)或家蚕(Bombyx mori)(GenBank登录号BAD11135)。
超活跃PB或PBL转座酶是一种比其来源的天然存在的变体活性更高的转座酶。在一个优选的方面，超活跃PB或PBL转座酶分离自或源自家蚕(Bombyx mori)或热带爪蟾(Xenopustropicalis)。超活跃PB或PBL转座酶的实例公开于美国专利号6,218,185；美国专利号6,962,810，美国专利号8,399,643和WO 2019/173636中。超活跃氨基酸取代的列表公开于美国专利号10,041,077中。
在一些方面，PB或PBL转座酶为整合缺陷型的。整合缺陷型PB或PBL转座酶为可以切除其相应转座子的转座酶，但其以比相应的野生型转座酶更低的频率整合切除的转座子。整合缺陷型PB或PBL转座酶的实例公开于美国专利号6,218,185；美国专利号6,962,810，美国专利号8,399,643和WO 2019/173636中。整合缺陷型氨基酸取代的列表公开于美国专利号10,041,077中。
在一些方面，PB或PBL转座酶与核定位信号融合。与核定位信号融合的PB或PBL转座酶的实例公开于美国专利号6,218,185；美国专利号6,962,810，美国专利号8,399,643和WO 2019/173636中。
本公开的转座子可以为睡美人转座子。在一些方面，当转座子为睡美人转座子时，转座酶为睡美人转座酶(例如，如美国专利号9,228,180中所公开)或超活跃睡美人(SB100X)转座酶。在一个优选的方面，睡美人转座酶包含与SEQ ID NO:27至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间的任何百分比)相同的氨基酸序列、或由其组成。在一个优选的方面，超活跃睡美人(SB100X)转座酶包含与SEQ ID NO:28至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间的任何百分比)相同的氨基酸序列、或由其组成。
本公开的转座子可以为Helraiser转座子。示例性Helraiser转座子包括Helibat1，其包含与SEQ ID NO:29至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间的任何百分比)相同的核酸序列、或由其组成。在一些方面，当转座子为Helraiser转座子时，转座酶为Helitron转座酶(例如，如WO 2019/173636中所公开的)。在一个优选的方面，Helitron转座酶包含与SEQ ID NO:30至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间的任何百分比)相同的氨基酸序列、或由其组成。
本公开的转座子可以为Tol2转座子。在一些实施方案中，示例性Tol2转座子(其包含反向重复序列、近末端序列和Tol2转座酶)包含与SEQ ID NO:31至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间的任何百分比)相同的核酸序列、或由其组成。在一些方面，当转座子为Tol2座子时，转座酶为Tol2转座酶(例如，如WO 2019/173636中所公开的)。在一个优选的方面，Tol2转座酶包含与SEQ ID NO:32至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间的任何百分比)相同的氨基酸序列、或由其组成。
本公开的转座子可以为TcBuster转座子。在一些方面，当转座子为TcBuster转座子时，转座酶为TcBuster转座酶或超活跃TcBuster转座酶(例如，如WO 2019/173636中所公开的)。TcBuster转座酶可包含天然存在的氨基酸序列或非天然存在的氨基酸序列、或由其组成。在一个优选的方面，TcBuster转座酶包含与SEQ ID NO:33至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间的任何百分比)相同的氨基酸序列、或由其组成。编码TcBuster转座酶的多核苷酸可包含天然存在的核酸序列或非天然存在的核酸序列、或由其组成。在一个优选的方面，TcBuster转座酶由多核苷酸编码，该多核苷酸包含与SEQ ID NO:34至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间的任何百分比)相同的核酸序列、或由其组成。
在一些方面，与野生型TcBuster转座酶相比，突变型TcBuster转座酶包含一个或多个序列变异，如PCT公开号WO 2019/173636和PCT/US2019/049816中更详细地描述的。
转座子可以为纳米转座子。纳米转座子可以包含以下项、基本上由以下项组成、或由以下项组成：(a)编码转座子插入的序列，该序列包括编码第一反向末端重复序列(ITR)的序列、编码第二反向末端重复序列(ITR)的序列以及ITR内序列；(b)编码主链的序列，其中编码主链的序列包括编码具有1个与450个之间的核苷酸(包括端点)的复制起点的序列，和编码具有1个与200个之间的核苷酸(包括端点)的选择性标志物的序列，以及(c)ITR间序列。在一些方面，(c)的ITR间序列包括(b)的序列。在一些方面，(a)的ITR内序列包括(b)的序列。
具有1个与200个之间的核苷酸(包括端点)的选择性标志物可以包含编码蔗糖选择性标志物的序列。编码蔗糖选择性标志物的序列可以包括编码RNA-OUT序列的序列。编码RNA-OUT序列的序列可以包含137个碱基对(bp)、或由其组成。具有1个与200个之间的核苷酸(包括端点)的选择性标志物可以包含编码荧光标志物的序列。具有1个与200个之间的核苷酸(包括端点)的选择性标志物可以包含编码细胞表面标志物的序列。
编码具有1个与450个之间的核苷酸(包括端点)的复制起点的序列可以包括编码微型复制起点的序列。在一些方面，编码具有1个与450个之间的核苷酸(包括端点)的复制起点的序列包括编码R6K复制起点的序列。R6K复制起点可以包括R6Kγ复制起点。R6K复制起点可以包括R6K微型复制起点。R6K复制起点可以包括R6Kγ微型复制起点。R6Kγ微型复制起点可以包含281个碱基对(bp)、或由其组成。
在纳米转座子的一些方面，编码主链的序列不包含重组位点、切除位点、连接位点或其组合。在一些方面，纳米转座子和编码主链的序列两者均不包含重组位点、切除位点、连接位点或其组合的产物。在一些方面，纳米转座子和编码主链的序列两者均不源自重组位点、切除位点、连接位点或其组合。
在纳米转座子的一些方面，重组位点包含由重组事件产生的序列。在一些方面，重组位点包含序列，该序列为重组事件的产物。在一些方面，重组事件包含重组酶(例如，重组酶位点)的活性。
在纳米转座子的一些方面，编码主链的序列不进一步包括编码外来DNA的序列。
在纳米转座子的一些方面，ITR间序列不包含重组位点、切除位点、连接位点或其组合。在一些方面，ITR间序列不包含重组事件、切除事件、连接事件或其组合的产物。在一些方面，ITR间序列不源自重组事件、切除事件、连接事件或其组合。在一些方面，ITR间序列包括编码外来DNA的序列。在一些方面，ITR内序列包括编码绝缘子的至少一个序列和编码能够在哺乳动物细胞中表达外源序列的启动子的序列。哺乳动物细胞可以为人细胞。在一些方面，ITR内序列包括编码绝缘子的第一序列、编码能够在哺乳动物细胞中表达外源序列的启动子的序列，和编码绝缘子的第二序列。在一些方面，ITR内序列包括编码绝缘子的第一序列、编码能够在哺乳动物细胞中表达外源序列的启动子的序列、多腺苷(polyA)序列，和编码绝缘子的第二序列。在一些方面，ITR内序列包括编码绝缘子的第一序列、编码能够在哺乳动物细胞中表达外源序列的启动子的序列、至少一个外源序列、多腺苷(polyA)序列，和编码绝缘子的第二序列。
纳米转座子更详细地描述于PCT/US2019/067758中，其以引用方式整体并入本文。
载体系统
本公开的载体可以为病毒载体或重组载体。病毒载体可以包括分离自或源自逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒或其任何组合的序列。病毒载体可以包含分离自或源自腺相关病毒(AAV)的序列。病毒载体可以包含重组AAV(rAAV)。示例性腺相关病毒和重组腺相关病毒包含两个或更多个反向末端重复(ITR)序列，其顺式紧邻编码本公开的scFv或CAR的序列。示例性腺相关病毒和重组腺相关病毒包括但不限于所有血清型(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9)。示例性腺相关病毒和重组腺相关病毒包括但不限于含有一种血清型的基因组和另一种血清型(例如，AAV2/5、AAV-DJ和AAV-DJ8)的衣壳的自互补AAV(scAAV)和AAV杂交体。示例性腺相关病毒和重组腺相关病毒包括但不限于rAAV-LK03。
本公开的载体可以为纳米颗粒。纳米颗粒载体的非限制性实例包括核酸(例如，RNA、DNA、合成核苷酸、经修饰的核苷酸或其任何组合)、氨基酸(L-氨基酸、D-氨基酸、合成氨基酸、经修饰的氨基酸或其任何组合)、聚合物(例如，聚合物囊泡)、胶束、脂质(例如，脂质体)、有机分子(例如，碳原子、片、纤维、管)、无机分子(例如，磷酸钙或金)或其任何组合。纳米颗粒载体可以被动地或主动地传输跨过细胞膜。
本文所公开的细胞递送组合物(例如，转座子、载体)可以包含编码治疗性蛋白质或治疗剂的核酸。治疗性蛋白质的实例包括PCT公开号WO 2019/173636和PCT/US2019/049816中公开的那些。
核酸分子
本公开的核酸分子可以呈RNA的形式(诸如mRNA、hnRNA、tRNA或任何其他形式)，或呈DNA的形式(包括但不限于通过克隆获得的或合成产生的cDNA和基因组DNA)，或其任何组合。DNA可以为三链、双链或单链或其任何组合。DNA或RNA的至少一条链的任何部分可以为编码链(也被称为正义链)，或者其可以为非编码链(也被称为反义链)。
本公开的分离的核酸分子可以包括包含开放阅读框(ORF)的核酸分子，其任选地具有一个或多个内含子，例如但不限于至少一个scFv的至少一个指定部分；包含针对与靶蛋白结合的蛋白质支架或环区域的编码序列的核酸分子；以及包含与上述那些序列实质上不同但由于遗传密码的简并性仍编码如本文所述和/或如在本领域中已知的蛋白质支架的核苷酸序列的核酸分子。当然，遗传密码在本领域中是众所周知的。因此，对于本领域技术人员，生成编码本公开的特定scFv的此类简并核酸变体将是常规的。参见例如，Ausubel等人，同上，并且此类核酸变体包括在本公开中。
如本文所指示，本公开的核酸分子可以包括但不限于：编码scFv片段本身的氨基酸序列的那些核酸分子；整个蛋白质支架或其部分的编码序列；scFv、片段或部分的编码序列，以及额外序列，诸如具有或不具有前述额外的编码序列的至少一个信号前导肽或融合肽的编码序列，诸如至少一个内含子，连同额外的非编码序列，包括但不限于在转录、mRNA加工(包括剪接和聚腺苷酸化信号)(例如，核糖体结合和mRNA的稳定性)中起作用的非编码5'和3'序列，诸如转录的非翻译序列；编码额外氨基酸的额外编码序列，诸如提供额外功能的那些额外编码序列。因此，编码蛋白质支架的序列可以与标志物序列(诸如编码促进纯化包含蛋白质支架片段或部分的融合蛋白支架的肽的序列)融合。
与如本文所述的多核苷酸选择性杂交的多核苷酸
本公开提供了在选择性杂交条件下与本文所公开的多核苷酸杂交的分离的核酸。因此，多核苷酸可以用于分离、检测和/或量化包含此类多核苷酸的核酸。例如，本公开的多核苷酸可以用于鉴定、分离或扩增沉积文库中的部分或全长克隆。多核苷酸可以为基因组或cDNA序列，其分离自人或哺乳动物核酸文库，或以其他方式与来自人或哺乳动物核酸文库的cDNA互补。
优选地，cDNA文库包含至少80％全长序列、优选地至少85％或90％全长序列、并且更优选地至少95％全长序列。cDNA文库可以进行归一化，以增加罕见序列的表示。低或中等严格杂交条件通常(但不仅限于)与相对于互补序列具有减少的序列同一性的序列一起采用。对于更大同一性的序列，可以任选地采用中等和高严格条件。低严格条件允许具有约70％序列同一性的序列的选择性杂交，并且可以被采用以鉴定直系同源序列或旁系同源序列。
任选地，多核苷酸将编码由本文所述的多核苷酸所编码的蛋白质支架的至少一部分。多核苷酸包含核酸序列，该核酸序列可以被采用以用于选择性杂交至编码本公开的蛋白质支架的多核苷酸。参见例如，Ausubel，同上；Colligan，同上，其各自以引用方式整体并入本文。
核酸的构建
本公开的分离的核酸可使用本领域中众所周知的(a)重组方法、(b)合成技术、(c)纯化技术和/或(d)它们的组合来制备。
核酸可以方便地包含除本公开的多核苷酸以外的核苷酸序列。例如，可将包含一个或多个内切酶限制位点的多克隆位点插入核酸中，以帮助分离多核苷酸。另外，可插入可翻译序列以帮助分离本公开的翻译后多核苷酸。例如，六组氨酸标志物序列提供了一种纯化本公开的蛋白质的便捷手段。本公开的核酸(不包括编码序列)任选地为用于克隆和/或表达本公开的多核苷酸的载体、衔接子或接头。
可将另外的序列加入此类克隆和/或表达序列中，以优化它们在克隆和/或表达中的功能，以帮助分离多核苷酸，或改善多核苷酸向细胞中的引入。克隆载体、表达载体、衔接子和接头的使用在本领域中是众所周知的。(参见例如，Ausubel，同上；或Sambrook，同上)。
用于构建核酸的重组方法
本公开的分离的核酸组合物(诸如RNA、cDNA、基因组DNA或其任何组合)可使用本领域技术人员已知的任何数量的克隆方法获自生物来源。在一些方面，将在严格条件下选择性地与本公开的多核苷酸杂交的寡核苷酸探针用于鉴定cDNA或基因组DNA文库中的所需序列。RNA的分离以及cDNA和基因组文库的构建是本领域普通技术人员众所周知的。(参见例如，Ausubel，同上；或Sambrook，同上)。
核酸筛选和分离方法
可使用基于本公开的多核苷酸序列的探针来筛选cDNA或基因组文库。探针可用于与基因组DNA或cDNA序列杂交，以分离相同或不同生物体中的同源基因。本领域技术人员将理解，可在测定中采用各种严格程度的杂交；并且杂交或洗涤介质可能是严格的。随着杂交条件变得越来越严格，探针与靶标之间必须具有更大程度的互补性才能形成双链体。严格程度可通过温度、离子强度、pH和部分变性溶剂(诸如甲酰胺)的存在中的一者或多者来控制。例如，可通过改变反应物溶液的极性来方便地改变杂交的严格程度，例如，在0％至50％范围内操纵甲酰胺的浓度。可检测结合所需的互补性程度(序列同一性)将根据杂交介质和/或洗涤介质的严格程度而变化。互补性程度最佳地将为100％、或70％至100％、或其中的任何范围或值。然而，应该理解，探针和引物的微小序列变化可通过降低杂交和/或洗涤介质的严格程度来补偿。
RNA或DNA的扩增方法在本领域中是众所周知的，并且基于本文提供的教导和指导，可根据本公开使用，而无需过多的实验。
已知的DNA或RNA扩增方法包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)和相关扩增过程(参见例如，授予Mullis等人的美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188；授予Tabor等人的美国专利号4,795,699和4,921,794；授予Innis的美国专利号5,142,033；授予Wilson等人的美国专利号5,122,464；授予Innis的美国专利号5,091,310；授予Gyllensten等人的美国专利号5,066,584；授予Gelfand等人的美国专利号4,889,818；授予Silver等人的美国专利号4,994,370；授予Biswas的美国专利号4,766,067；授予Ringold的美国专利号4,656,134)以及RNA介导的扩增，其使用针对靶序列的反义RNA作为模板进行双链DNA合成(授予Malek等人的美国专利号5,130,238，商品名NASBA)，这些参考文献的全部内容通过援引并入本文。(参见例如，Ausubel，同上；或Sambrook，同上。)
例如，可使用聚合酶链式反应(PCR)技术，直接由基因组DNA或cDNA文库扩增本公开的多核苷酸序列和相关基因。PCR和其他体外扩增方法也可用于例如克隆编码待表达的蛋白质的核酸序列、制备核酸以用作探针用于检测样品中是否存在所需mRNA、用于核酸测序或用于其他目的。足以通过体外扩增方法指导技术人员的技术的实例可见于Berger同上；Sambrook，同上；以及Ausubel，同上；以及Mullis等人，美国专利号4,683,202(1987)；以及Innis等人编,PCR Protocols A Guide to Methods and Applications,AcademicPress Inc.,San Diego,Calif.(1990)。用于基因组PCR扩增的可商购获得的试剂盒在本领域中是已知的。参见例如，Advantage-GC基因组PCR试剂盒(Clontech)。另外，例如，T4基因32蛋白质(Boehringer Mannheim)可用于改善长PCR产物的产率。
用于构建核酸的合成方法
本公开的分离的核酸也可通过已知方法通过直接化学合成来制备(参见例如，Ausubel等人，同上)。化学合成一般而言产生单链寡核苷酸，其可通过与互补序列杂交、或以单链为模板通过DNA聚合酶聚合，转化为双链DNA。本领域技术人员将认识到，尽管DNA的化学合成可能限于约100个或更多碱基的序列，但可通过连接较短的序列来获得较长的序列。
表达载体和宿主细胞
本公开还涉及包括本公开的分离的核酸分子的载体、用重组载体进行遗传工程改造的宿主细胞，以及通过重组技术来产生至少一种蛋白质支架，如本领域中所众所周知的。参见例如，Sambrook等人，同上；Ausubel等人，同上，其各自通过援引以其全文并入本文。
多核苷酸可任选地连接至含有选择性标志物的载体以便在宿主中繁殖。一般而言，将质粒载体引入沉淀物中(诸如磷酸钙沉淀物)，或引入包含带电荷的脂质的复合物中。如果载体是病毒，则可使用适当的包装细胞系对其进行体外包装，然后将其转导到宿主细胞中。
DNA插入片段应可操作地连接至适当的启动子。表达构建体将进一步含有用于转录起始、终止的位点，以及在转录区中用于翻译的核糖体结合位点。由构建体表达的成熟转录物的编码部分将优选地包括在适当地定位在待翻译的mRNA末端处的起始和终止密码子(例如，UAA、UGA或UAG)处起始的翻译，其中UAA和UAG是哺乳动物或真核细胞表达所优选的。
表达载体将优选地但任选地包括至少一种选择标志物。此类标志物包括例如但不限于氨苄青霉素、zeocin(Sh bla基因)、嘌呤霉素(pac基因)、潮霉素B(hygB基因)、G418/遗传霉素(neo基因)、DHFR(编码二氢叶酸还原酶并且赋予对甲氨蝶呤的抗性)、霉酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS，美国专利号5,122,464；5,770,359；5,827,739)、杀稻瘟菌素(bsd基因)、真核细胞培养的抗性基因以及氨苄青霉素、zeocin(Sh bla基因)、嘌呤霉素(pac基因)、潮霉素B(hygB基因)、G418/遗传霉素(neo基因)、卡那霉素、壮观霉素、链霉素、羧苄青霉素、博来霉素、红霉素、多粘菌素B或用于在大肠杆菌和其他细菌或原核生物中培养的四环素抗性基因(上述专利通过援引以其全文并入本文)。上述宿主细胞的适当培养基和条件在本领域中是已知的。合适的载体对于本领域技术人员而言将是显而易见的。可通过磷酸钙转染、DEAE-右旋糖酐介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他已知的方法将载体构建体引入宿主细胞中。本领域中描述了此类方法，诸如Sambrook，同上，第1至4章和第16至18章；Ausubel，同上，第1、9、13、15、16章。
表达载体将优选地但任选地包括至少一种选择性细胞表面标志物，用于分离通过本公开的组合物和方法修饰的细胞。本公开的选择性细胞表面标志物包括表面蛋白、糖蛋白、或将一种细胞或细胞亚群与另一种定义的细胞亚群区分开来的蛋白质组。优选地，选择性细胞表面标志物将通过本公开的组合物或方法修饰的那些细胞与未通过本公开的组合物或方法修饰的那些细胞区分开来。此类细胞表面标志物包括例如但不限于“指定簇”或“分类决定簇”蛋白质(通常缩写为“CD”)，诸如截短或全长形式的CD19、CD271、CD34、CD22、CD20、CD33、CD52或其任何组合。细胞表面标志物进一步包括自杀基因标志物RQR8(PhilipB等人Blood.2014年8月21日；124(8):1277-87)。
表达载体将优选地但任选地包括至少一种选择性药物抗性标志物，用于分离通过本公开的组合物和方法修饰的细胞。本公开的选择性耐药标志物可包括野生型或突变型Neo、DHFR、TYMS、FRANCF、RAD51C、GCS、MDR1、ALDH1、NKX2.2或其任何组合。
本公开的至少一种蛋白质支架可以以经修饰的形式(诸如融合蛋白)表达，并且不仅可以包括分泌信号，还可以包括额外的异源功能区。例如，可以将额外的氨基酸的区域(特别是带电荷的氨基酸)添加至蛋白质支架的N末端，以在纯化期间或在随后的处理和储存期间改善在宿主细胞中的稳定性和持久性。此外，可以将肽部分添加至本公开的蛋白质支架，以促进纯化。可以在最终制备蛋白质支架或其至少一个片段之前去除此类区域。此类方法描述于许多标准实验室手册，诸如Sambrook，同上，第17.29至17.42章和第18.1至18.74章；Ausubel，同上，第16、17和18章中。
本领域的普通技术人员了解可用于表达编码本公开的蛋白质的核酸的许多表达系统。替代性地，本公开的核酸可以通过在含有编码本公开的蛋白质支架的内源DNA的宿主细胞中打开(通过操纵)来在宿主细胞中进行表达。此类方法在本领域中是众所周知的，例如，如美国专利号5,580,734、5,641,670、5,733,746和5,733,761所述，其以引用方式整体并入本文。
可用于产生蛋白质支架、其指定部分或变体的细胞培养物的示例为如在本领域中已知的细菌、酵母和哺乳动物细胞。哺乳动物细胞系统通常将呈细胞的单层的形式，尽管也可以使用哺乳动物细胞悬浮液或生物反应器。在本领域中已经开发了许多能够表达完整糖基化蛋白质的合适宿主细胞系，并且该合适宿主细胞系包括COS-1(例如，ATCC CRL 1650)、COS-7(例如，ATCC CRL-1651)、HEK293、BHK21(例如，ATCC CRL-10)、CHO(例如，ATCC CRL1610)和BSC-1(例如，ATCC CRL-26)细胞系、Cos-7细胞、CHO细胞、hep G2细胞、P3X63Ag8.653、SP2/0-Ag14、293细胞、HeLa细胞等，其可容易地从例如American TypeCulture Collection,Manassas,Va.(www.atcc.org)购得。优选的宿主细胞包括淋巴来源的细胞，诸如骨髓瘤细胞和淋巴瘤细胞。特别优选的宿主细胞为P3X63Ag8.653细胞(ATCC登录号CRL-1580)和SP2/0-Ag14细胞(ATCC登录号CRL-1851)。在一个优选的方面，重组细胞为P3X63Ab8.653或SP2/0-Ag14细胞。
用于这些细胞的表达载体可以包括以下表达控制序列中的一者或多者，诸如但不限于：复制起点；启动子(例如，晚期或早期SV40启动子、CMV启动子(美国专利号5,168,062；5,385,839)、HSV tk启动子、pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子、EF-1α启动子(美国专利号5,266,491)、至少一种人启动子；增强子和/或处理信息位点，诸如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点(例如，SV40大T Ag poly A加成位点)和转录终止子序列。参见例如，Ausubel等人，同上；Sambrook等人，同上。可用于产生本公开的核酸或蛋白质的其他细胞是已知的和/或可获得的，例如，来自American Type Culture Collection Catalogue ofCell Lines and Hybridomas(www.atcc.org)或其他已知来源或商业来源。
当采用真核宿主细胞时，通常将聚腺苷酸化或转录终止子序列并入载体中。终止子序列的实例为来自牛生长激素基因的聚腺苷酸化序列。还可以包括用于准确剪接转录物的序列。剪接序列的实例为来自SV40的VP1内含子(Sprague等人，J.Virol.45:773-781(1983))。此外，可以将用以控制宿主细胞中的复制的基因序列并入载体中，如在本领域中已知的。
scFv纯化
可以通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收并且纯化scFv，该方法包括但不限于蛋白A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水相互作用色谱法、亲和色谱法、羟基磷灰石色谱法和凝集素色谱法。也可以采用高效液相色谱法(“HPLC”)以用于纯化。参见例如，Colligan,Current ProtocolsinImmunology,or Current Protocolsin Protein Science,John Wiley&Sons,NY,N.Y.,(1997-2001)，例如，第1、4、6、8、9、10章，其各自以引用方式整体并入本文。
本公开的scFv包括纯化产物、化学合成程序的产物以及通过重组技术从原核或真核宿主产生的产物，该原核或真核宿主包括例如大肠杆菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。取决于重组生产程序中采用的宿主，本公开的蛋白质支架可以为糖基化的或可以为非糖基化的。此类方法描述于许多标准实验室手册中，诸如Sambrook，同上，第17.37至17.42节；Ausubel，同上，第10、12、13、16、18和20章，Colligan,Protein Science，同上，第12至14章中，其全部以引用方式整体并入本文。
氨基酸密码
构成本公开的蛋白质支架的氨基酸通常被缩写。氨基酸名称可以通过以下方式来指示：通过其单个字母代码、其三个字母代码、名称或如在本领域中众所周知的三个核苷酸密码子来指定氨基酸(参见Alberts,B.等人，Molecular Biology of The Cell，第三版，Garland Publishing,Inc.,New York,1994)。本公开的蛋白质支架可以包括来自自发突变和/或人操作的一个或多个氨基酸取代、缺失或添加，如本文所指定。本公开的蛋白质支架中的对功能必不可少的氨基酸可以通过在本领域中已知的方法来鉴定，该方法为诸如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(例如，Ausubel，同上，第8、15章；Cunningham和Wells,Science244:1081-1085(1989))。后一种程序在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变。然后测试所得突变型分子的生物活性，诸如但不限于至少一种中和活性。对蛋白质支架结合至关重要的位点也可以通过结构分析来鉴定，该结构分析为诸如结晶、核磁共振或光亲和标记(Smith等人，J.Mol.Biol.224:899-904(1992)和de Vos等人，Science 255:306-312(1992))。
如本领域技术人员将理解的，本公开包括本公开的至少一种生物活性蛋白质支架。生物活性蛋白质支架具有天然(非合成)、内源或相关和已知蛋白质支架的比活度的至少20％、30％或40％、并且优选地至少50％、60％或70％、并且最优选地至少80％、90％或95％至99％或更多的比活度。酶活性和底物特异性的测定和量化的方法是本领域技术人员众所周知的。
在另一方面，本公开涉及如本文所述的蛋白质支架和片段，其通过有机部分的共价连接来修饰。此类修饰可以产生具有经改善的药代动力学特性(例如，增加的体内血清半衰期)的蛋白质支架片段。有机部分可以为直链或支链亲水性聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。在特定方面，亲水性聚合物基团可以具有约800道尔顿至约120,000道尔顿的分子量，并且可以为聚烷烃二醇(例如，聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG))、碳水化合物聚合物、氨基酸聚合物或聚乙烯吡咯烷酮，并且脂肪酸或脂肪酸酯基团可以包含约八个至约四十个碳原子。
本公开的经修饰的蛋白质支架和片段可以包含与抗体直接地或间接地共价键合的一个或多个有机部分。与本公开的蛋白质支架或片段键合的每个有机部分均可以独立地为亲水性聚合物基团、脂肪酸基团或脂肪酸酯基团。如本文所用，术语“脂肪酸”涵盖单羧酸和二羧酸。作为本文所使用的术语，“亲水性聚合物基团”是指与溶于辛烷相比更可溶于水的有机聚合物。例如，与溶于辛烷相比，聚赖氨酸更可溶于水。因此，本公开涵盖通过聚赖氨酸的共价连接来修饰的蛋白质支架。适用于修饰本公开的蛋白质支架的亲水性聚合物可以为直链的或支链的，并且包括例如聚烷烃二醇(例如，PEG、单甲氧基-聚乙二醇(mPEG)、PPG等)、碳水化合物(例如，右旋糖酐、纤维素、寡糖、多糖等)、亲水性氨基酸的聚合物(例如，聚赖氨酸、聚精氨酸、聚天冬氨酸等)、聚烷烃氧化物(例如，聚环氧乙烷、聚环氧丙烷等)和聚乙烯吡咯烷酮。优选地，修饰本公开的蛋白质支架的亲水性聚合物作为单独分子实体具有约800道尔顿至约150,000道尔顿的分子量。例如，可以使用PEG5000和PEG20,000，其中下标为聚合物的平均分子量(以道尔顿为单位)。亲水性聚合物基团可以被一个至约六个烷基、脂肪酸或脂肪酸酯基团取代。可以通过采用合适的方法来制备被脂肪酸或脂肪酸酯基团取代的亲水性聚合物。例如，包含胺基团的聚合物可以偶联至脂肪酸或脂肪酸酯的甲酸酯，并且脂肪酸或脂肪酸酯上的活化甲酸酯(例如，用N,N-羰基二咪唑活化)可以偶联至聚合物上的羟基基团。
适用于修饰本公开的蛋白质支架的脂肪酸和脂肪酸酯可以为饱和的，或可以含有一个或多个不饱和单元。适用于修饰本公开的蛋白质支架的脂肪酸包括例如正十二烷酸酯(C12，月桂酸酯)、正十四烷酸酯(C14，肉豆蔻酸酯)、正十八烷酸酯(C18，硬脂酸酯)、正二十碳酸酯(C20，花生酸酯)、正二十二烷酸酯(C22，山嵛酸酯)、正三十烷酸酯(C30)、正四十烷酸酯(C40)、顺式-Δ9-十八烷酸酯(C18，油酸酯)、所有顺式-Δ5,8,11,14-二十碳四烯酸酯(C20，花生四烯酸酯)、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等。合适的脂肪酸酯包括包含直链或支链低级烷基基团的二羧酸的单酯。低级烷基基团可以包含一个至约十二个、优选地一个至约六个碳原子。
经修饰的蛋白质支架和片段可以使用合适的方法(诸如通过与一种或多种改性剂反应)来制备。作为本文所使用的术语，“改性剂”是指包含活化基团的合适的有机基团(例如，亲水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)。“活化基团”为可以在适当条件下与第二化学基团反应从而在改性剂与第二化学基团之间形成共价键的化学部分或官能团。例如，胺反应性活化基团包括亲电基团，诸如甲苯磺酸酯、甲磺酸酯、卤代(氯、溴、氟、碘)、N-羟基琥珀酰亚胺酯(NHS)等。可以与硫醇反应的活化基团包括例如马来酰亚胺、碘乙酰基、丙烯酰基、吡啶基二硫化物、5-硫醇-2-硝基苯甲酸硫醇(TNB-硫醇)等。醛官能团可以偶联至含胺或酰肼的分子，并且叠氮化物基团可以与三价磷基团反应以形成磷酰胺键或磷酰亚胺键。用以将活化基团引入分子的合适方法在本领域中是已知的(参见例如，Hermanson,G.T.,BioconjugateTechniques,Academic Press:San Diego,Calif.(1996))。活化基团可以与有机基团(例如，亲水性聚合物、脂肪酸、脂肪酸酯)直接键合，或通过接头部分(例如，二价C1-C12基团，其中一个或多个碳原子可以被杂原子(诸如氧、氮或硫)替代)与该有机基团键合。合适的接头部分包括例如四甘醇、—(CH2)3—、—NH—(CH2)6—NH—、—(CH2)2—NH—和—CH2—O—CH2—CH2—O—CH2—CH2—O—CH—NH—。包含接头部分的改性剂可以例如通过在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)的存在下使单-Boc-烷基二胺(例如，单-Boc-乙二胺、单-Boc-二氨基己烷)与脂肪酸反应以在游离胺和脂肪酸甲酸酯之间形成酰胺键来产生。可以通过用三氟乙酸(TFA)进行处理来从产物中去除Boc保护基团，以暴露伯胺，该伯胺可以如所述偶联至另一个甲酸酯，或者可以与马来酸酐反应，并且所得产物环化以产生脂肪酸的活化的马来酰亚胺衍生物。(参见例如，Thompson等人，WO 92/16221，其全部教导以引用方式并入本文。)
本公开的经修饰的蛋白质支架可以通过使蛋白质支架或片段与改性剂反应来制备。例如，可以通过采用胺反应性改性剂(例如PEG的NHS酯)以非位点特异性方式将有机部分与蛋白质支架键合。包含有机部分(该有机部分与本公开的蛋白质支架的特定位点键合)的经修饰的蛋白质支架和片段可以使用合适的方法制备，该合适的方法为诸如反向蛋白质水解(Fisch等人，Bioconjugate Chem.,3:147-153(1992)；Werlen等人，BioconjugateChem.,5:411-417(1994)；Kumaran等人，Protein Sci.6(10):2233-2241(1997)；Itoh等人，Bioorg.Chem.,24(1):59-68(1996)；Capellas等人，Biotechnol.Bioeng.,56(4):456-463(1997))，和描述于以下文献中的方法：Hermanson,G.T.,Bioconjugate Techniques,Academic Press:San Diego,Calif.(1996)。
本公开的细胞和经修饰的细胞
本公开的细胞和经修饰的细胞可以为哺乳动物细胞。细胞和经修饰的细胞为人细胞。本公开的细胞和经修饰的细胞可以为免疫细胞。本公开的免疫细胞可以包含iPSC、淋巴祖细胞、自然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞(T细胞)、记忆T干细胞(TSCM细胞)、中央记忆T细胞(TCM)、干细胞样T细胞、B淋巴细胞(B细胞)、抗原呈递细胞(APC)、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞、髓系祖细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、血小板、红血球、红细胞(RBC)、巨核细胞或破骨细胞。
免疫前体细胞可以包括可以分化成一种或多种类型的免疫细胞的任何细胞。免疫前体细胞可以包括可以自我更新并且发育成免疫细胞的多能干细胞。免疫前体细胞可以包括造血干细胞(HSC)或其后代。免疫前体细胞可以包括可以发育成免疫细胞的前体细胞。免疫前体细胞可以包括造血祖细胞(HPC)。
造血干细胞(HSC)为多能的、自我更新的细胞。所有来自淋巴谱系和髓谱系的分化血细胞均起源于HSC。HSC存在于成人骨髓、外周血、动员外周血、腹膜透析流出物和脐带血中。
HSC可以分离自或源自原代或培养干细胞。HSC可以分离自或源自胚胎干细胞、多能干细胞、多潜能干细胞、成体干细胞或诱导性多潜能干细胞(iPSC)。
免疫前体细胞可以包含HSC或HSC后代细胞。HSC后代细胞的非限制性实例包括多能干细胞、淋巴祖细胞、自然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞(T细胞)、B淋巴细胞(B细胞)、髓系祖细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞和巨噬细胞。
通过所公开的方法产生的HSC可以保留“原始”干细胞的特征，该“原始”干细胞虽然分离自或源自成体干细胞，并且虽然致力于单个谱系，但共享胚胎干细胞的特征。例如，通过所公开的方法产生的“原始”HSC在分裂后保留其“干性”并且不分化。因此，作为一种过继细胞疗法，通过所公开的方法产生的“原始”HSC不仅补充它们的数量，还进行体内扩增。当作为单剂量进行施用时，通过所公开的方法产生的“原始”HSC可以为治疗有效的。
原始HSC可以为CD34+。原始HSC可以为CD34+和CD38-。原始HSC可以为CD34+、CD38-和CD90+。原始HSC可以为CD34+、CD38-、CD90+和CD45RA-。原始HSC可以为CD34+、CD38-、CD90+、CD45RA-和CD49f+。原始HSC可以为CD34+、CD38-、CD90+、CD45RA-和CD49f+。
可以根据所公开的方法修饰原始HSC、HSC和/或HSC后代细胞，以表达外源序列(例如，嵌合抗原受体或治疗性蛋白质)。经修饰的原始HSC、经修饰的HSC和/或经修饰的HSC后代细胞可以被正向分化以产生经修饰的免疫细胞，该经修饰的免疫细胞包括但不限于经修饰的T细胞、经修饰的自然杀伤细胞和/或经修饰的B细胞。
经修饰的免疫或免疫前体细胞可以为NK细胞。NK细胞可以为从淋巴祖细胞分化的细胞毒性淋巴细胞。经修饰的NK细胞可以源自经修饰的造血干/祖细胞(HSPC)或经修饰的HSC。在一些方面，未活化的NK细胞源自消耗CD3的白细胞去除术(含有CD14/CD19/CD56+细胞)。
经修饰的免疫或免疫前体细胞可以为B细胞。B细胞为一种在细胞表面上表达B细胞受体的淋巴细胞。B细胞受体与特定抗原结合。经修饰的B细胞可以源自经修饰的造血干/祖细胞(HSPC)或经修饰的HSC。
本公开的经修饰的T细胞可以源自经修饰的造血干/祖细胞(HSPC)或经修饰的HSC。与传统的生物制剂和化疗药物不同，所公开的经修饰的T细胞具有在抗原识别后快速繁殖的能力，从而潜在地消除了重复治疗的需要。为了实现这一点，在一些实施方案中，经修饰的T细胞不仅驱动初始反应，而且还作为活的记忆T细胞的稳定群体持续存在于患者体内，以防止潜在的复发。替代性地，在一些方面，当非所需时，经修饰的T细胞不会持续存在于患者体内。
一直致力于开发不会通过抗原非依赖性(tonic)信号传导来引起T细胞衰竭的抗原受体分子，以及开发含有早期记忆T细胞(尤其是记忆干细胞(TSCM)或干细胞样T细胞)的经修饰的T细胞产物。本公开的干细胞样经修饰的T细胞表现出最大的自我更新能力和多能能力，以衍生中央记忆(TCM)T细胞或TCM样细胞、效应记忆(TEM)和效应T细胞(TE)，从而产生更好的肿瘤根除和经长期修饰的T细胞植入。线性分化途径可能负责生成这些细胞：初始T细胞(TN)>TSCM>TCM>TEM>TE>TTE，其中TN为直接产生TSCM的亲代前体细胞，然后该TSCM继而直接产生TCM等。本公开的T细胞的组成可以包含每个亲本T细胞亚群中的一者或多者，其中TSCM细胞为最丰富的(例如，TSCM>TCM>TEM>TE>TTE)。
免疫细胞前体可以分化成或能够分化成早期记忆T细胞、干细胞样T细胞、初始T细胞(TN)、TSCM、TCM、TEM、TE或TTE。免疫细胞前体可以为本公开的原始HSC、HSC或HSC后代细胞。免疫细胞可以为早期记忆T细胞、干细胞样T细胞、初始T细胞(TN)、TSCM、TCM、TEM、TE或TTE。
本公开的经修饰的细胞
本公开的方法(例如，使用突变型Cas-CLOVER组合物)可以修饰和/或产生经修饰的免疫细胞的群体，其中至少0.01％、至少0.02％、至少0.03％、至少0.04％、至少0.05％、至少0.06％、至少0.07％、至少0.08％、至少0.09％、至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或100％的群体的该多个细胞包含转基因或编码转基因的序列，并且其中经修饰的细胞尚未经受富集方案。在一些实施方案中，经修饰的细胞使用富集方案来进一步富集。
本公开的方法(例如，使用突变型Cas-CLOVER组合物)可以修饰和/或产生经修饰的细胞的群体，该经修饰的细胞的群体具有在基因组中的选定位点处的在靶序列处的修饰。在一些实施方案中，与尚未使用本公开的方法(例如，使用野生型Cas-CLOVER或使用CRISPR/Cas9系统)生成的经修饰的细胞的数量相比，本公开的方法可以产生约1.1倍至约50倍的经修饰的细胞的群体，该经修饰的细胞的群体具有在基因组的选定位点处的在靶序列处的修饰。
在一些实施方案中，与尚未使用本公开的方法(例如，使用野生型Cas-CLOVER或使用CRISPR/Cas9系统)生成的经修饰的细胞的数量相比，本公开的方法可以产生约1倍至约2倍、约2倍至约3倍、约3倍至约4倍、约4倍至约5倍、约5倍至约6倍、约6倍至约7倍、约7倍至约8倍、约8倍至约9倍、约9倍至约10倍、约10倍至约15倍、约15倍至约20倍、约20倍至约25倍、约25倍至约30倍、约30倍至约35倍、约35倍至约40倍、约40倍至约45倍或约45倍至约50倍的经修饰的细胞的群体，该经修饰的细胞的群体具有在基因组的选定位点处的在靶序列处的修饰。在一些实施方案中，与尚未使用本公开的方法(例如，使用CRISPR/Cas9系统)生成的经修饰的细胞(例如，免疫细胞或肝细胞)的群体相比，本公开的方法(例如，使用Cas-CLOVER系统)可以产生约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或约10倍的经修饰的细胞的群体，该经修饰的细胞的群体具有在基因组的选定位点处的在靶序列处的修饰。在一些实施方案中，与尚未使用本公开的方法(例如，使用CRISPR/Cas9系统)生成的经修饰的细胞(例如，免疫细胞或肝细胞)的群体相比，本公开的方法(例如，使用Cas-CLOVER系统)可以产生约1倍、约1.2倍、约1.3倍、约1.4倍、约1.5倍、约1.6倍、约1.7倍、约1.8倍、约1.9倍或约2倍的经修饰的细胞的群体，该经修饰的细胞的群体具有在基因组的选定位点处的转基因。
本公开的方法(例如，使用突变型Cas-CLOVER组合物)可以修饰和/或产生经修饰的细胞的群体，该经修饰的细胞的群体具有转基因或在基因组中的选定位点处编码转基因的序列。在一些实施方案中，与尚未经受本公开的方法(例如，使用野生型Cas-CLOVER或使用CRISPR/Cas9系统)的经修饰的细胞的数量相比，本公开的方法可以产生约1倍至约2倍、约2倍至约3倍、约3倍至约4倍、约4倍至约5倍、约5倍至约6倍、约6倍至约7倍、约7倍至约8倍、约8倍至约9倍、约9倍至约10倍的经修饰的细胞的群体，该经修饰的细胞的群体具有在基因组的选定位点处的转基因。在一些实施方案中，与尚未经受本公开的方法(例如，使用野生型Cas-CLOVER或使用CRISPR/Cas9系统)的经修饰的细胞的群体相比，本公开的方法(例如，使用突变型Cas-CLOVER组合物)可以产生约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或约10倍的经修饰的细胞的群体，该经修饰的细胞的群体具有在基因组的选定位点处的转基因。
本公开的方法(例如，使用突变型Cas-CLOVER组合物)可以修饰和/或产生经修饰的细胞(例如，免疫细胞或肝细胞)的群体，该经修饰的细胞的群体具有转基因或在基因组中的选定位点处编码转基因的序列。在一些实施方案中，与尚未经受本公开的方法(例如，使用野生型Cas-CLOVER或使用CRISPR/Cas9系统)的经修饰的细胞的数量相比，本公开的方法(例如，使用突变型Cas-CLOVER组合物)可以产生约1倍至约2倍、约2倍至约3倍、约3倍至约4倍、约4倍至约5倍、约5倍至约6倍、约6倍至约7倍、约7倍至约8倍、约8倍至约9倍、约9倍至约10倍的活的经修饰的细胞的群体。在一些实施方案中，与尚未经受本公开的方法(例如，使用野生型Cas-CLOVER或使用CRISPR/Cas9系统)的经修饰的细胞的群体相比，本公开的方法(例如，使用突变型Cas-CLOVER组合物)可以产生约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约7倍、约8倍、约9倍或约10倍的活的经修饰的细胞的群体。
本公开的方法可以修饰和/或产生经修饰的细胞的群体(例如，免疫细胞或肝细胞)，其中至少0.01％、至少0.02％、至少0.03％、至少0.04％、至少0.05％、至少0.06％、至少0.07％、至少0.08％、至少0.09％、至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或100％的群体的该多个细胞包含转基因或编码转基因的序列，并且其中经修饰的细胞尚未经受富集方案。在一些实施方案中，经修饰的细胞使用富集方案来进一步富集。
包含转基因或编码转基因的序列的群体的多个经修饰的细胞(例如，免疫细胞或肝细胞)，其中至少0.01％、至少0.02％、至少0.03％、至少0.04％、至少0.05％、至少0.06％、至少0.07％、至少0.08％、至少0.09％、至少0.1％、至少0.2％、至少0.3％、至少0.4％、至少0.5％、至少0.6％、至少0.7％、至少0.8％、至少0.9％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％、至少99.9％或100％的群体的该多个细胞包含转基因或编码转基因的序列，并且其中经修饰的细胞尚未经受富集方案。在一些实施方案中，经修饰的细胞使用富集方案来进一步富集。
本文其他地方公开了产生和/或扩增免疫细胞或免疫前体细胞(例如，所公开的经修饰的免疫细胞)的组合物和方法，以及用于保持或增强免疫细胞或免疫前体细胞(例如，所公开的经修饰的免疫细胞)的细胞活力和/或干细胞样表型的水平的缓冲液。
本公开的细胞和经修饰的免疫细胞可以为自体细胞或同种异体细胞。同种异体细胞被工程改造，以防止在向受试者施用后对植入产生不良反应。同种异体细胞可以为任何类型的细胞。同种异体细胞可以为干细胞，或可以源自干细胞。同种异体细胞可以为分化的体细胞。
表达嵌合抗原受体的方法
本公开提供了在细胞的表面上表达CAR的方法。该方法包括：(a)获得细胞群体；(b)在足以将CAR转移跨过细胞群体中的至少一个细胞的细胞膜的条件下，使细胞群体与包含CAR或编码CAR的序列的组合物进行接触，从而生成经修饰的细胞群体；(c)在适用于整合编码CAR的序列的条件下，培养经修饰的细胞群体；以及(d)从在细胞表面上表达CAR的经修饰的细胞群体中扩增和/或选择至少一个细胞。
在一些方面，细胞群体可以包含白细胞和/或CD4+和CD8+白细胞。细胞群体可以包含呈优化比率的CD4+与CD8+白细胞。CD4+与CD8+白细胞的优化比率并非天然存在于体内。细胞群体可以包含肿瘤细胞。
在一些方面，足以将CAR或编码CAR、转座子或载体的序列转移跨过细胞群体中的至少一个细胞的细胞膜的条件包括以下项中的至少一者：以指定电压施加一个或多个电脉冲、缓冲液以及一种或多种补充因子。在一些方面，适用于整合编码CAR的序列的条件包括以下项中的至少一者：缓冲液和一种或多种补充因子。
缓冲液可以包括PBS、HBSS、OptiMEM、BTXpress、Amaxa Nucleofector、人T细胞核转染缓冲液或其任何组合。该一种或多种补充因子可以包括：(a)重组人细胞因子、趋化因子、白介素或其任何组合；(b)盐、矿物质、代谢物或其任何组合；(c)细胞培养基；(d)细胞DNA传感、代谢、分化、信号转导、一种或多种凋亡途径或其组合的抑制剂；和(e)修饰或稳定一种或多种核酸的试剂。重组人细胞因子、趋化因子、白介素或其任何组合可以包含IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-γ、IL-1α/IL-1F1、IL-1β/IL-1F2、IL-12p70、IL-12/IL-35p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/F异二聚体、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32β、IL-32γ、IL-33、LAP(TGF-β1)、淋巴毒素-α/TNF-β、TGF-β、TNF-α、TRANCE/TNFSF11/RANK L或其任何组合。盐、矿物质、代谢物或其任何组合可以包括HEPES、烟酰胺、肝素、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺、MEM非必需氨基酸溶液、抗坏血酸、核苷、FBS/FCS、人血清、血清替代品、抗生素、pH调节剂、Earle's盐、2-巯基乙醇、人转铁蛋白、重组人胰岛素、人血清白蛋白、Nucleofector PLUS Supplement、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、乳糖酸钠、甘露醇、琥珀酸钠、氯化钠、CINa、葡萄糖、Ca(NO3)2、Tris/HCl、K2HPO4、KH2PO4、聚乙烯亚胺、聚乙二醇、泊洛沙姆188、泊洛沙姆181、泊洛沙姆407、聚乙烯吡咯烷酮、Pop313、冠-5或其任何组合。细胞培养基可以包括PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGroDC培养基、CTS OpTimizer T细胞扩增SFM、TexMACS培养基、PRIME-XV T细胞扩增培养基、ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基或其任何组合。细胞DNA传感、代谢、分化、信号转导、一种或多种凋亡途径或其组合的抑制剂包括TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型干扰素、促炎性细胞因子、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNA pol III、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、半胱天冬酶1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3A的抑制剂，糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)(例如TWS119)的抑制剂，或其任何组合。此类抑制剂的实例可以包括巴佛洛霉素、氯喹、奎纳克林、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK或其任何组合。修饰或稳定一种或多种核酸的试剂包括pH修饰剂、DNA结合蛋白、脂质、磷脂、CaPO4、具有或不具有NLS序列的净中性电荷DNA结合肽、TREX1酶或其任何组合。
扩增步骤和选择步骤可以同时或依序发生。扩增可以在选择之前发生。扩增可以在选择之后发生，并且任选地，进一步(即，第二)选择可以在扩增之后发生。同时扩增和选择可以同时发生。扩增步骤和/或选择步骤可以进行10天至14天(包括端点)的时间段。
扩增可以包括使经修饰的细胞群体的至少一个细胞与抗原接触，以通过CAR刺激该至少一个细胞，从而生成经扩增的细胞群体。抗原可以呈现在底物的表面上。底物可以具有任何形式，包括但不限于表面、孔、珠粒或其多者，以及基质。底物可以进一步包含顺磁性或磁性组分。抗原可以呈现在底物的表面上，其中底物为磁珠，并且其中磁体可以用于从经修饰的和经扩增的细胞群体中去除或分离磁珠。抗原可以呈现在细胞或人工抗原呈递细胞的表面上。人工抗原呈递细胞可以包括但不限于肿瘤细胞和干细胞。
在其中转座子或载体包含选择基因的一些方面，选择步骤包括使经修饰的细胞群体的至少一个细胞与选择基因赋予其抗性的化合物接触，从而将表达选择基因的细胞鉴定为在选择中存活，并且将未能表达选择基因的细胞鉴定为未能在选择步骤中存活。
本公开提供了包含本文所述的方法的经修饰的、经扩增的和选定的细胞群体的组合物。
用于在细胞的表面上表达CAR的方法的更详细的描述公开于PCT公开号WO 2019/049816和PCT/US2019/049816中。
本公开提供了一种细胞或细胞的群体，其中细胞包含组合物，该组合物包含(a)诱导型转基因构建体，其包含编码诱导型启动子的序列和编码转基因的序列，和(b)受体构建体，其包含编码组成型启动子的序列和编码外源受体(诸如CAR)的序列，其中在将(a)的构建体和(b)的构建体整合至细胞的基因组序列中后，外源受体被表达，并且其中外源受体在结合配体或抗原后转导细胞内信号，该细胞内信号直接地或间接地靶向调节诱导型转基因(a)的表达的诱导型启动子，以修饰基因表达。
组合物可以通过降低基因表达来修饰基因表达。组合物可以通过瞬时修饰基因表达来修饰基因表达(例如，在配体与外源受体结合的持续时间内)。组合物可以急性地修饰基因表达(例如，配体与外源受体可逆地结合)。组合物可以慢性地修饰基因表达(例如，配体与外源受体不可逆地结合)。
外源受体可以包含关于细胞的基因组序列的内源受体。示例性受体包括但不限于细胞内受体、细胞表面受体、跨膜受体、配体门控离子通道和G蛋白偶联受体。
外源受体可以包括非天然存在的受体。非天然存在的受体可以为合成的、经修饰的、重组的、突变的或嵌合的受体。非天然存在的受体可以包含分离自或源自T细胞受体(TCR)的一个或多个序列。非天然存在的受体可以包含分离自或源自支架蛋白质的一个或多个序列。在一些方面，包括其中非天然存在的受体不包含跨膜结构域的那些方面，非天然存在的受体与第二跨膜、膜结合和/或细胞内受体(该受体在与非天然存在的受体接触后转导细胞内信号)相互作用。非天然存在的受体可以包含跨膜结构域。非天然存在的受体可以与转导细胞内信号的细胞内受体相互作用。非天然存在的受体可以包含细胞内信号传导结构域。非天然存在的受体可以为嵌合配体受体(CLR)。CLR可以为嵌合抗原受体(CAR)。
编码诱导型启动子的序列包括编码NFκB启动子的序列、编码干扰素(IFN)启动子的序列或编码白介素-2启动子的序列。在一些方面，IFN启动子为IFNγ启动子。诱导型启动子可以分离自或源自细胞因子或趋化因子的启动子。细胞因子或趋化因子可以包含IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL10、IL12、IL13、IL17A/F、IL21、IL22、IL23、转化生长因子β(TGFβ)、集落刺激因子2(GM-CSF)、干扰素γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、LTα、穿孔素、颗粒酶C(Gzmc)、颗粒酶B(Gzmb)、C-C基序趋化因子配体5(CCL5)、C-C基序趋化因子配体4(Ccl4)、C-C基序趋化因子配体3(Ccl3)、X-C基序趋化因子配体1(Xcl1)或LIF白介素6家族细胞因子(Lif)。
诱导型启动子可以分离自或源自包含参与细胞分化、活化、衰竭和功能的表面蛋白的基因的启动子。在一些方面，基因包括CD69、CD71、CTLA4、PD-1、TIGIT、LAG3、TIM-3、GITR、MHCII、COX-2、FASL或4-1BB。
诱导型启动子可以分离自或源自参与CD代谢和分化的基因的启动子。诱导型启动子可以分离自或源自Nr4a1、Nr4a3、Tnfrsf9(4-1BB)、Sema7a、Zfp36l2、Gadd45b、Dusp5、Dusp6和Neto2的启动子。
在一些方面，诱导型转基因构建体包含或驱动以下项的表达：抑制性检查点信号下游的信号传导组分、转录因子、细胞因子或细胞因子受体、趋化因子或趋化因子受体、细胞死亡或凋亡受体/配体、代谢传感分子、赋予对癌症疗法的敏感性的蛋白质，以及致癌基因或肿瘤抑制基因。其非限制性实例公开于PCT公开号WO 2019/173636和PCT申请号PCT/US2019/049816。
本公开提供了产生经修饰的T细胞的群体的方法，该方法包括以下项、基本上由以下项组成、或由以下项组成：将包含本公开的CAR的组合物或编码该CAR的序列引入至多个原代人T细胞中，以产生多个经修饰的T细胞。本公开提供了包含通过该方法所产生的经修饰的T细胞的群体的组合物。在一些方面，至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的群体表达本公开的CAR。
转座子和载体组合物
本公开提供了用于将治疗性蛋白质(抗体(例如，scFv)或CAR(例如，包含scFv))递送至细胞或细胞的群体的组合物和方法。用于将本公开的组合物递送至细胞或细胞的群体的组合物的非限制性实例包括转座子或载体。因此，本公开提供了包含治疗性蛋白质(抗体(例如，scFv)或CAR(例如，包含scFv))的转座子或包含治疗性蛋白质(抗体(例如，scFv)或CAR(例如，包含scFv))的载体。
包含本公开的治疗性蛋白质的转座子或包含本公开的治疗性蛋白质的载体可以进一步包含编码诱导型促凋亡多肽的序列。替代性地或另外地，一个转座子或一个载体可以包含本公开的治疗性蛋白质，并且第二转座子或第二载体可以包含编码本公开的诱导型促凋亡多肽的序列。本文更详细地描述了诱导型促凋亡多肽。
包含本公开的治疗性蛋白质的转座子或包含本公开的治疗性蛋白质的载体可以进一步包含编码嵌合刺激受体(CSR)的序列。替代性地或另外地，一个转座子或一个载体可以包含本公开的CAR，并且第二转座子或第二载体可以包含编码本公开的CSR的序列。本文更详细地描述了嵌合刺激受体。
包含本公开的治疗性蛋白质的转座子或包含本公开的治疗性蛋白质的载体可以进一步包含编码重组HLA-E多肽的序列。替代性地或另外地，一个转座子或一个载体可以包含本公开的治疗性蛋白质，并且第二转座子或第二载体可以包含编码重组HLA-E多肽的序列。本文更详细地描述了重组HLA-E多肽。
包含本公开的治疗性蛋白质的转座子或包含本公开的治疗性蛋白质的载体可以进一步包含选择基因。选择基因可以编码对细胞活力和存活必不可少的基因产物。当受到选择性细胞培养条件的挑战时，选择基因可以编码对细胞活力和存活必不可少的基因产物。选择性细胞培养条件可以包括对细胞活力或存活有害的化合物，并且其中基因产物赋予该化合物抗性。选择基因的非限制性实例包括neo(赋予对新霉素的抗性)、DHFR(编码二氢叶酸还原酶并且赋予对甲氨蝶呤的抗性)、TYMS(编码胸苷酸合成酶)、MGMT(编码O(6)-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶)、多药耐药基因(MDR1)、ALDH1(编码醛脱氢酶1家族，成员A1)、FRANCF、RAD51C(编码RAD51 Paralog C)、GCS(编码葡萄糖神经酰胺合成酶)、NKX2.2(编码NK2 Homeobox 2)或其任何组合。
在一个优选的方面，选择基因编码DHFR突变蛋白酶。DHFR突变蛋白酶包含SEQ IDNO:37的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成。DHFR突变蛋白酶由多核苷酸编码，该多核苷酸包含SEQ ID NO:38或SEQ ID NO:39的核酸序列、基本上由其组成、或由其组成。DHFR突变蛋白酶的氨基酸序列可以进一步包含在位置80、113或153中的一个或多个位置处的突变。DHFR突变蛋白酶的氨基酸序列可以包含以下项中的一者或多者：在位置80处的苯丙氨酸(F)或亮氨酸(L)的取代、在位置113处的亮氨酸(L)或缬氨酸(V)的取代，以及在位置153处的缬氨酸(V)或天冬氨酸(D)的取代。
包含本公开的CAR的转座子或包含本公开的CAR的载体可以进一步包含至少一种自切割肽。例如，自切割肽可以位于CAR(例如，包含scFv)与诱导型促凋亡多肽之间；或者，自切割肽可以位于CAR(例如，包含scFv)与由选择基因所编码的蛋白质之间。
包含本公开的CAR的转座子或包含本公开的CAR的载体可以进一步包含至少两种自切割肽。例如，第一自切割肽位于CAR上游或紧接其上游，并且第二自切割肽位于CAR下游或紧接其下游；或者，第一自切割肽和第二自切割肽位于CAR的侧翼。例如，第一自切割肽位于诱导型促凋亡多肽上游或紧接其上游，并且第二自切割肽位于诱导型促凋亡多肽下游或紧接其下游；或者，第一自切割肽和第二自切割肽位于诱导型促凋亡多肽的侧翼。例如，第一自切割肽位于由选择基因所编码的蛋白质上游或紧接其上游，并且第二自切割肽位于由选择基因所编码的蛋白质下游或紧接其下游；或者，第一自切割肽和第二自切割肽位于由选择基因所编码的蛋白质的侧翼。
诱导型促凋亡多肽
本文所公开的诱导型促凋亡多肽优于现有的诱导型多肽，因为本公开的诱导型促凋亡多肽具有低得多的免疫原性。诱导型促凋亡多肽为重组多肽，并且因此为非天然存在的。此外，序列经重组以产生诱导型促凋亡多肽，该诱导型促凋亡多肽不包含宿主人免疫系统可识别为“非自身”的非人序列，并且因此在接受诱导型促凋亡多肽的受试者、包含诱导型促凋亡多肽的细胞、或者包含诱导型促凋亡多肽或包含诱导型促凋亡多肽的细胞的组合物中诱导免疫反应。
本公开提供了包含配体结合区、接头和促凋亡肽的诱导型促凋亡多肽，其中诱导型促凋亡多肽不包含非人序列。在某些方面，非人序列包含限制位点。在某些方面，配体结合区可以为多聚体配体结合区。在某些方面，促凋亡肽为半胱天冬酶多肽。半胱天冬酶多肽的非限制性实例包括半胱天冬酶1、半胱天冬酶2、半胱天冬酶3、半胱天冬酶4、半胱天冬酶5、半胱天冬酶6、半胱天冬酶7、半胱天冬酶8、半胱天冬酶9、半胱天冬酶10、半胱天冬酶11、半胱天冬酶12和半胱天冬酶14。优选地，半胱天冬酶多肽为半胱天冬酶9多肽。半胱天冬酶9多肽可以为截短的半胱天冬酶9多肽。诱导型促凋亡多肽可以为非天然存在的。当半胱天冬酶为半胱天冬酶9或截短的半胱天冬酶9时，诱导型促凋亡多肽也可以被称为“iC9安全开关”。
诱导型半胱天冬酶多肽可以包含(a)配体结合区、(b)接头和(c)半胱天冬酶多肽，其中诱导型促凋亡多肽不包含非人序列。在某些方面，诱导型半胱天冬酶多肽包含(a)配体结合区、(b)接头和(c)截短的半胱天冬酶9多肽，其中诱导型促凋亡多肽不包含非人序列。
配体结合区可以包含FK506结合蛋白12(FKBP12)多肽。包含FK506结合蛋白12(FKBP12)多肽的配体结合区的氨基酸序列可以包含在序列的位置36处的修饰。该修饰可以为在位置36处用缬氨酸(V)取代苯丙氨酸(F)(F36V)。FKBP12多肽可以包含与SEQ ID NO:40至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间的任何百分比)相同的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成。FKBP12多肽可以由多核苷酸编码，该多核苷酸包含与SEQ ID NO:41至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间的任何百分比)相同的核酸序列、或由其组成。
接头区可以包含与SEQ ID NO:42至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间的任何百分比)相同的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成，或者接头区可以由多核苷酸编码，该多核苷酸包含与SEQ ID NO:43至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间的任何百分比)相同的核酸序列、或由其组成。在一些方面，编码接头的核酸序列不包含限制位点。
截短的半胱天冬酶9多肽可以包含在序列的位置87处不包含精氨酸(R)的氨基酸序列。替代性地或另外地，截短的半胱天冬酶9多肽可以包含在序列的位置282处不包含丙氨酸(A)的氨基酸序列。截短的半胱天冬酶9多肽可以包含与SEQ ID NO:44至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间的任何百分比)相同的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成，或者截短的半胱天冬酶9多肽可以由多核苷酸编码，该多核苷酸包含与SEQ ID NO:45至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间的任何百分比)相同的核酸序列、或由其组成。
在某些方面，当多肽包含截短的半胱天冬酶9多肽时，诱导型促凋亡多肽包含与SEQ ID NO:46至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间的任何百分比)相同的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成，或者诱导型促凋亡多肽由多核苷酸编码，该多核苷酸包含与SEQ ID NO:47至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间的任何百分比)相同的核酸序列、或由其组成。
在某些方面，当多肽包含截短的半胱天冬酶9多肽时，诱导型促凋亡多肽包含与SEQ ID NO:48至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间的任何百分比)相同的氨基酸序列、基本上由其组成、或由其组成，或者诱导型促凋亡多肽由多核苷酸编码，该多核苷酸包含与SEQ ID NO:49至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％(或其间的任何百分比)相同的核酸序列、或由其组成。
诱导型促凋亡多肽可以在本领域中已知的任何启动子的转录调控下在细胞中表达，该启动子能够起始和/或调控诱导型促凋亡多肽在该细胞中的表达。
诱导型促凋亡多肽的活化可以通过例如由诱导剂介导的化学诱导二聚化(CID)来完成，以产生有条件地控制的蛋白质或多肽。促凋亡多肽不仅为诱导型的，而且由于不稳定二聚化剂的降解或单体竞争性抑制剂的施用，这些多肽的诱导也是可逆的。
诱导型促凋亡肽和诱导这些肽的方法详细描述于美国专利公开号WO 2019/0225667和PCT公开号WO 2018/068022。
制剂、剂量和施用方式
本公开提供了本文所述组合物的制剂、剂量和施用方法。
所公开的组合物和药物组合物可进一步包含任何合适的助剂中的至少一种，诸如但不限于稀释剂、粘结剂、稳定剂、缓冲剂、盐、亲脂性溶剂、防腐剂、佐剂等。优选药用助剂。此类无菌溶液的非限制性实例和制备方法在本领域中是众所周知的，诸如但不限于Gennaro编,Remington'sPharmaceutical Sciences,第18版,Mack Publishing Co.(Easton,Pa.)1990以及“Physician's Desk Reference”,第52版,Medical Economics(Montvale,N.J.)1998.可常规地选择适用于本领域中众所周知的或如本文所述的蛋白质支架、片段或变体组合物的施用方式、溶解度和/或稳定性的药用载体。
适合使用的药物赋形剂和添加剂的非限制性实例包括蛋白质、肽、氨基酸、脂质和碳水化合物(例如，糖，包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡糖；衍生糖，诸如糖醇、醛糖酸、酯化糖等；以及多糖或糖聚合物)，其可单独或组合存在，单独或组合占重量或体积的1％至99.99％。蛋白质赋形剂的非限制性实例包括血清白蛋白，诸如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白等。也可用于缓冲容量的代表性氨基酸/蛋白质组分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿斯巴甜等。一种优选的氨基酸是甘氨酸。
适用于使用的碳水化合物赋形剂的非限制性实例包括单糖，诸如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖等；二糖，诸如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖等；多糖，诸如棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、右旋糖酐、淀粉等；以及糖醇，诸如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇山梨糖醇(葡萄糖醇)、肌醇等。优选地，碳水化合物赋形剂为甘露醇、海藻糖和/或棉子糖。
组合物还可包括缓冲剂或pH调节剂；典型地，缓冲剂是由有机酸或碱制备的盐。代表性缓冲剂包括有机酸盐，诸如柠檬酸、抗坏血酸、葡萄糖酸、碳酸、酒石酸、琥珀酸、乙酸或邻苯二甲酸的盐；三羟甲基氨基甲烷、盐酸氨丁三醇或磷酸盐缓冲剂。优选的缓冲剂为有机酸盐，诸如柠檬酸盐。
此外，所公开的组合物可以包括聚合物赋形剂/添加剂，诸如聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖(一种聚合物糖)、葡萄糖结合剂(例如，环糊精，诸如2-羟丙基-β-环糊精)、聚乙二醇、调味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯，诸如“TWEEN 20”和“TWEEN 80”)、脂质(例如，磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如，胆固醇)和螯合剂(例如，EDTA)。
可使用许多已知和开发的方式施用治疗有效量的本文所公开的组合物或药物组合物。施用方式的非限制性实例包括推注、颊面、输注、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、病灶内、肌内、心肌内、鼻内、眼内、骨内、骨盆内、盆腔内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、宫内、肿瘤内、静脉内、膀胱内、经口、肠胃外、直肠、舌下、皮下、透皮或阴道方式。
本公开的组合物可制备用于肠胃外(皮下、肌内或静脉内)或任何其他施用，特别地呈液体溶液或悬浮液的形式；用于在阴道或直肠施用中使用，特别是以半固体形式，诸如但不限于乳膏和栓剂；用于颊部或舌下施用，诸如但不限于呈片剂或胶囊的形式；或鼻内施用，诸如但不限于呈粉剂、滴鼻剂或气雾剂或某些药剂的形式；或者透皮施用，诸如但不限于凝胶、软膏、洗剂、混悬剂或贴剂递送系统，其中使用化学增强剂诸如二甲基亚砜来修饰皮肤结构或提高透皮贴剂中的药物浓度(Junginger等人，收录于“Drug PermeationEnhancement”中，Hsieh,D.S.编，第59-90页(Marcel Dekker,Inc.New York 1994)；或使用氧化剂，该氧化剂能够将含有蛋白质和肽的制剂施用至皮肤上(WO 98/53847)；或施加电场以形成瞬时运输途径，诸如电穿孔，或提高带电荷药物通过皮肤的流动性，诸如电离子透入疗法；或施加超声波，诸如超声促渗(美国专利号4,309,989和4,767,402)(上述出版物和专利以引用方式整体并入本文)。
对于肠胃外施用，本文所公开的任何组合物均可与药用肠胃外载体联合或单独配制为溶液、混悬剂、乳剂、颗粒、粉末或冻干粉。用于胃肠外施用的制剂可含有作为常见赋形剂的无菌水或盐水、聚亚烷基二醇(诸如聚乙二醇)、植物源性油、氢化萘等。注射用水性或油性混悬剂可根据已知方法使用适当的乳化剂或增湿剂和悬浮剂来制备。注射剂可为无毒、非口服的稀释剂，诸如水溶液、无菌注射溶液或溶剂中的混悬剂。作为可用的载体或溶剂，可使用水、林格氏溶液、等渗盐水等；作为普通溶剂或悬浮溶剂，可使用无菌不挥发油。出于这些目的，可使用任何种类的不挥发性油和脂肪酸，包括天然或合成或半合成的脂肪油或脂肪酸；天然或合成或半合成的单甘油酯或双甘油酯或三甘油酯。胃肠外施用是本领域中已知的，并且包括但不限于常规注射方式、如美国专利号5,851,198中所述的气压无针注射装置以及如美国专利号5,839,446中所述的激光穿孔装置。
用于口服施用的制剂依赖于佐剂(例如，间苯二酚和非离子表面活性剂，诸如聚氧乙烯油基醚和正十六烷基聚乙烯醚)的共同施用以人工增加肠壁的渗透性，以及酶抑制剂(例如，胰蛋白酶抑制剂、二异丙基氟磷酸(DFF)和屈里赛多(trasylol))的共同施用以抑制酶降解。用于递送亲水剂(其包含蛋白质和蛋白质支架)以及旨在用于口服、颊部、粘膜、鼻、肺、阴道跨膜或直肠施用的至少两种表面活性剂的组合的制剂描述于美国专利号6,309,663中。用于口服施用的固体形式剂型的活性成分化合物可以与至少一种添加剂混合，该至少一种添加剂包括蔗糖、乳糖、纤维素、甘露醇、海藻糖、棉子糖、麦芽糖醇、右旋糖酐、淀粉、琼脂、精氨酸盐、几丁质、壳聚糖、果胶、黄蓍胶、阿拉伯树胶、明胶、胶原蛋白、酪蛋白、白蛋白、合成或半合成聚合物和甘油酯。这些剂型还可以含有其他类型的添加剂，例如，非活性稀释剂，润滑剂诸如硬脂酸镁、对羟基苯甲酸酯，防腐剂诸如山梨酸、抗坏血酸、α-生育酚，抗氧化剂诸如半胱氨酸，崩解剂，粘结剂，增稠剂，缓冲剂，甜味剂，调味剂，芳香剂等。
片剂和丸剂可以进一步加工成肠溶制剂。用于口服施用的液体制剂包括乳剂、糖浆剂、酏剂、混悬剂和允许用于医疗用途的溶液制剂。这些制剂可以含有通常用于所述领域中的非活性稀释剂，例如水。脂质体也已经被描述为用于胰岛素和肝素的药物递送系统(美国专利号4,239,754)。最近，混合氨基酸(类蛋白)的人工聚合物的微球已经被用于递送药物(美国专利号4,925,673)。此外，描述于美国专利号5,879,681和美国专利号5,871,753中并且用于口服递送生物活性剂的载体化合物是本领域中已知的。
对于肺部施用，优选地，本文所述的组合物或药物组合物以有效到达肺或鼻窦的下呼吸道的粒度递送。可通过本领域中已知的用于通过吸入施用治疗剂的多种吸入或鼻腔装置中的任一种来递送组合物或药物组合物。这些能够将雾化制剂沉积在患者鼻窦腔或肺泡中的装置包括定量吸入器、雾化器(例如，喷射雾化器、超声波雾化器)、干粉发生器、喷雾器等。所有此类装置均可使用适合于施用的制剂，用于将本文所述的组合物或药物组合物分配在气雾剂中。此类气雾剂可包含溶液(水性和非水性两者)或固体颗粒。此外，可以通过在压力下迫使至少一种蛋白质支架的悬浮液或溶液通过喷嘴来产生包含本文所述的组合物或药物组合物的喷雾。在定量吸入器(MDI)中，推进剂、本文所述的组合物或药物组合物、以及任何赋形剂或其他添加剂作为包括液化压缩气体的混合物包含在小罐中。计量阀的致动将混合物以气雾剂的形式进行释放、该气雾剂优选地含有尺寸范围小于约10μm、优选地约1μm至约5μm、并且最优选地约2μm至约3μm的颗粒。有关肺部施用、制剂和相关装置的更详细的描述公开于PCT公开号WO 2019/049816中。
对于通过粘膜表面的吸收，组合物包括含有多个亚微米颗粒、粘膜粘附大分子、生物活性肽和水性连续相的乳剂，其通过实现乳剂颗粒的粘膜粘附来促进通过粘膜表面的吸收(美国专利号5,514,670)。适合施加本公开的乳剂的粘膜表面可包括角膜、结膜、颊、舌下、鼻、阴道、肺、胃、肠和直肠施用途径。用于阴道或直肠施用的制剂(例如，栓剂)可含有例如聚亚烷基二醇、凡士林、可可脂等作为赋形剂。用于鼻内施用的制剂可为固体并且含有例如乳糖作为赋形剂，或者可为滴鼻剂的水性或油性溶液。对于颊部施用，赋形剂包括糖、硬脂酸钙、硬脂酸镁、预胶化淀粉等(美国专利号5,849,695)。有关粘膜施用和制剂的更详细的描述公开于PCT公开号WO 2019/049816中。
对于透皮施用，本文所公开的组合物或药物组合物被包封在递送装置中，诸如脂质体或聚合物纳米颗粒、微粒、微胶囊或微球(除非另有说明，否则统称为微粒)。已知有许多合适的装置，包括由合成聚合物制成的微粒，诸如聚羟基酸，诸如聚乳酸、聚乙醇酸及其共聚物、聚原酸酯、聚酐和聚磷腈，以及天然聚合物，诸如胶原蛋白、聚氨基酸、白蛋白和其他蛋白质、海藻酸盐和其他多糖，以及它们的组合(美国专利号5,814,599)。有关透皮施用、制剂和合适装置的更详细的描述公开于PCT公开号WO 2019/049816中。
可希望将所公开的化合物在较长时间段(例如，通过单次施用持续一周至一年的时间段)内递送给受试者。可利用各种缓释、储库或植入剂型。例如，剂型可以含有在体液中具有低程度溶解度的化合物的药用无毒盐，例如(a)与多元酸的酸加成盐，该多元酸为诸如磷酸、硫酸、柠檬酸、酒石酸、鞣酸、帕莫酸、藻酸、聚谷氨酸、萘单磺酸或二磺酸、聚半乳糖醛酸等；(b)具有多价金属阳离子(诸如锌、钙、铋、钡、镁、铝、铜、钴、镍、镉等)或具有由例如N,N'-二苄基-乙二胺或乙二胺形成的有机阳离子的盐；或(c)(a)和(b)的组合，例如鞣酸锌盐。此外，所公开的化合物或优选地相对不溶性盐(诸如刚才描述的那些)可以被配制在凝胶中，例如，具有例如芝麻油的单硬脂酸铝凝胶，其适用于注射。特别优选的盐为锌盐、鞣酸锌盐、帕莫酸盐等。用于注射的另一种类型的缓释储库型制剂将含有经分散以用于包封在缓慢降解的、无毒的、非抗原性聚合物(诸如聚乳酸/聚乙醇酸聚合物)中的化合物或盐，例如如美国专利号3,773,919所述。化合物或优选地相对不溶性盐(诸如上文描述的那些)也可以被配制在胆固醇基质硅橡胶颗粒中，其特别地用于动物中。额外的缓释、储库型或植入制剂(例如，气体或液体脂质体)是在文献中已知的(美国专利号5,770,222和“Sustainedand Controlled Release Drug Delivery Systems”，J.R.Robinson编，Marcel Dekker,Inc.,N.Y.,1978)。
此类剂型在本领域中是众所周知的。参见例如：Wells等人编,PharmacotherapyHandbook,第2版,Appleton and Lange,Stamford,Conn.(2000)；PDR Pharmacopoeia,Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000,Deluxe Edition,Tarascon Publishing,LomaLinda,Calif.(2000)；Nursing 2001Handbook of Drugs,第21版,Springhouse Corp.,Springhouse,Pa.,2001；Health Professional's Drug Guide 2001,Shannon,Wilson,Stang编,Prentice-Hall,Inc,Upper Saddle River,N.J.优选的剂量可任选地包括约0.1至99mg/kg/次施用和/或100至500mg/kg/次施用，或其任何范围、值或分数，或每次单次或多次施用实现约0.1至5000μg/ml血清浓度，或其任何范围、值或分数。本文所公开的组合物或药物组合物的优选剂量范围为约1mg/kg受试者体重、至多约3mg/kg受试者体重、约6mg/kg受试者体重或约12mg/kg受试者体重。
替代性地，所施用的剂量可根据已知因素诸如特定药剂的药效特征及其施用方式和途径；接受者的年龄、健康状况和体重；症状的性质和程度；同期联合治疗的种类、治疗频率和期望的效果而变化。通常，活性成分的剂量可以为每公斤体重约0.1毫克至100毫克。通常，每次施用每公斤0.1毫克至50毫克、并且优选地0.1毫克至10毫克或以缓释形式施用会有效获得所需结果。
作为非限制性实例，人或动物的治疗可使用单次、输注或重复剂量，作为本文所公开的组合物或药物组合物的一次性或定期剂量(每天约0.1至100mg/kg或其任何范围、值或分数)在第1至40天中的至少一天、或者替代性地或另外地在第1至52周中的至少一天、或者替代性地或另外地在第1至20年中的至少一年、或其任何组合来提供。
适用于内部施用的剂型通常含有每单位或容器约0.001毫克至约500毫克的活性成分。在这些药物组合物中，活性成分通常将以组合物的总重量计约0.5重量％至99.999重量％的量存在。
有效量可以包含每单次(例如，推注)、多次或连续施用约0.001至约500mg/kg的量，或实现每单次、多次或连续施用0.01至5000μg/ml血清浓度的血清浓度，或其中的任何有效范围或值，如使用本文所述或相关领域中已知的已知方法所完成和确定的。
在其中要向有需要的受试者施用的组合物为如本文所公开的经修饰的细胞的方面，细胞可以在约1x103个与1x1015个细胞之间；约1x104个与1x1012个细胞之间；约1x105个与1x1010个细胞之间；约1x106个与1x109个细胞之间；约1x106个与1x108个细胞之间；约1x106个与1x107个细胞之间；或约1x106个与25x106个细胞之间施用。在一个方面，施用的细胞在约5x106个与25x106个细胞之间。
所公开的组合物和药物组合物的药用赋形剂、制剂、剂量和施用方法的更详细的描述公开于PCT公开号WO 2019/049816中。
使用本公开的组合物的方法
本公开提供了所公开的组合物或药物组合物用于治疗细胞、组织、器官、动物或受试者中的疾病或疾患的用途，如本领域中已知的或如本文中所述，使用所公开的组合物和药物组合物，例如，向细胞、组织、器官、动物或受试者施用或接触治疗有效量的组合物或药物组合物。在一个方面，受试者为哺乳动物。优选地，受试者为人类。术语“主体”和“患者”在本文中可互换使用。
本公开提供了一种用于调节或治疗细胞、组织、器官、动物或受试者中的至少一种恶性疾病或疾患的方法。优选地，恶性疾病为癌症。恶性疾病或病症的非限制性实例包括白血病、急性白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性淋巴细胞白血病、B细胞、T细胞或FABALL、急性髓系白血病(AML)、急性髓系白血病、慢性髓系白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、淋巴瘤、霍奇金氏病、恶性淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卡波西氏肉瘤、结肠直肠癌(colorectalcarcinoma)、胰腺癌、鼻咽癌、恶性组织细胞增多病、副肿瘤综合征/恶性高钙血症、实体瘤、膀胱癌、乳腺癌、结肠直肠癌(colorectal cancer)、子宫内膜癌、头部癌、颈部癌、遗传性非息肉病性癌、霍奇金氏淋巴瘤、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、睾丸癌、腺癌、肉瘤、恶性黑色素瘤、血管瘤、转移性疾病、癌症相关骨吸收、癌症相关骨痛等。
本公开的组合物可以用于治疗疾病或病症，该疾病或病症包括但不限于：骨硬化病、帕金森氏病、亨特综合征、镰状细胞病、严重联合免疫缺陷、α-甘露糖苷贮积症、铁粒幼细胞贫血、常染色体隐性高IgE综合征、原发性骨髓纤维化、皮肤血管炎、X连锁原卟啉症、岩藻糖苷贮积症、Maroteaux Lamy综合征、WAS相关病症、慢性肉芽肿、重型地中海贫血、遗传性血管性水肿、遗传性淋巴水肿、高IgM综合征、弗里德里希氏共济失调、Charcot MarieTooth病、苯丙酮尿症、甲基丙二酸血症、肾上腺脑白质营养不良、Kugelberg Welander综合征、视网膜色素变性、脑积水、IV型遗传性感觉和自主神经病变、III型粘多糖贮积症、角膜营养不良、红细胞生成性原卟啉症、法布里病、Werdnig-Hoffman病、低磷酸酯酶症、寇特氏病、范可尼贫血、尼曼皮克病、克里格勒-纳贾尔综合征、血友病A、血友病B、脑白质营养不良、桑德霍夫病、Usher综合征、沃尔曼病、杜普伊特伦氏挛缩、沃尔夫勒姆综合征、X连锁肌管性肌病、卡纳万病、埃勒斯-当洛斯综合征、大疱性表皮松解、成骨不全、短肠综合征、巨大轴突神经病变、阵发性夜间血红蛋白尿、费伦-麦克德米德综合征、视网膜劈裂症、β-地中海贫血、低磷酸酯酶症、丙酸血症、胆固醇酯贮积病、胱氨酸贮积症、II型糖原贮积病庞贝病、黏多醣贮积症(MPS I H-S Hurler-Scheie)、黏多醣贮积症(II型(亨特综合征))，以及黏多醣贮积症(IV型(Morquio))。
本公开的组合物可以用于通过使用编码外源核酸序列或外源氨基酸序列的治疗性转基因来治疗疾病或病症。对于某些疾病或病症，治疗性转基因可以包括[疾病(治疗性转基因)：β-地中海贫血(HBB T87Q、BCL11AshRNA、IGF2BP1)、镰状细胞病(HBB T87Q、BCL11AshRNA、IGF2BP1)、血友病A(因子VIII)、血友病B(因子IX)、X连锁严重联合免疫缺陷(白介素2受体γ(IL2RG))、低磷酸酯酶症(组织非特异性碱性磷酸酶(TNAP))、骨硬化病(TCIRG1)、II型糖原累积病(庞贝病)(α葡萄糖苷酶(GAA))、α-半乳糖苷酶A缺乏症(法布里病)(α-半乳糖苷酶A(GLA))、I型粘多糖贮积症(MPS I)(α-L-艾杜糖苷酶)(IDUA))、II型粘多糖贮积症(MPS II)(艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS))、IIIA型粘多糖贮积症(MPS IIIA)(磺基葡糖胺磺基水解酶(SGSH))、IIIB型粘多糖贮积症(MPS IIIB)(N-α-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAGLU))、IV A型粘多糖贮积症(MPS IVA)(Morquio)(N-乙酰半乳糖胺-6-硫酸硫酸酯酶(GALNS))、IVB型粘多糖贮积症(MPS IVB)β-半乳糖苷酶(GLB1(β-半乳糖苷酶(GLB1))、胆固醇酯累积病(CESD)(溶酶体酸性脂肪酶(LIPA))、胱氨酸贮积症(胱氨酸转运蛋白溶酶体胱氨酸转运体(CTNS))、X连锁慢性肉芽肿病(X-CGD)(CYBB)、Wiskott-Aldrich综合征(WAS)(WAS)、X连锁肾上腺脑白质营养不良(X-ALD)(ABCD1)、异染性脑白质退化症(MLD)(ARSA)、苯丙酮尿症(PAH)、甲基丙二酸血症(MMUT)、丙酸血症(PCCA、PCCB)、视网膜色素变性(RPE65)、Usher综合征(MYO7A)和戈谢病(GBA)。
在优选的方面，恶性疾病或病症的治疗包括过继细胞疗法。例如，在一个方面，本公开提供了表达至少一种所公开的抗体(例如，scFv)和/或包含抗体(例如，scFv)的CAR的经修饰的细胞，该经修饰的细胞已经被选择和/或扩增以用于施用于有需要的受试者。经修饰的细胞可以被配制用于在任何温度(包括室温和体温)下储存。经修饰的细胞可以被配制用于冷冻保存和随后解冻。经修饰的细胞可以被配制在药用载体中，以用于从无菌包装中直接施用于受试者。经修饰的细胞可以被配制在具有细胞活力和/或CAR表达水平的指标的药用载体中，以确保细胞功能和CAR表达的最低水平。可以将经修饰的细胞与一种或多种试剂以规定密度配制在药用载体中，以抑制进一步扩增和/或防止细胞死亡。
任一者可以包括向需要此类调节、治疗或疗法的细胞、组织、器官、动物或受试者施用有效量的本文所公开的任何组合物或药物组合物。此类方法可任选地包括用于治疗此类疾病或疾患的共同施用或组合疗法，其中施用本文所公开的任何组合物或药物组合物进一步包括在至少一种化疗剂之前、同时和/或之后施用(例如，烷化剂、有丝分裂抑制剂、放射性药物)。
在一些方面，受试者在施用后不会发生移植物抗宿主(GvH)和/或宿主抗移植物(HvG)。在一个方面，施用是全身性的。全身性施用可为本领域已知的并且在本文中详细描述的任何手段。优选地，全身性施用是通过静脉内注射或静脉内输注来进行的。在一个方面，施用是局部的。局部施用可为本领域已知的并且在本文中详细描述的任何手段。优选地，局部施用是通过肿瘤内注射或输注、脊柱内注射或输注、脑室内注射或输注、眼内注射或输注、或骨内注射或输注。
在一些方面，治疗有效剂量为单剂量。在一些方面，单剂量为同时制造的至少2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个剂量或其间任何数量的剂量中的一者。在一些方面，其中组合物为自体细胞或同种异体细胞，剂量为足以使细胞植入和/或持续足够时间以治疗疾病或疾患的量。
在一个实例中，本公开提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，该方法包括向受试者施用包含抗体(例如，scFv)或包含抗体(例如，scFv)的CAR的组合物，抗体或CAR与肿瘤细胞上的抗原特异性结合。在其中组合物包含经修饰的细胞或细胞群体的方面，细胞或细胞群体可以为自体的或同种异体的。
在本文所述的治疗方法的一些方面，可修改或终止治疗。具体地，在其中用于治疗的组合物包含诱导型促凋亡多肽的方面，可通过使细胞与诱导剂接触来选择性地诱导细胞凋亡。例如，可响应于恢复的体征或疾病严重程度/进展降低的体征、疾病消退/停止的迹象和/或不良事件的发生来修改或终止治疗。在一些方面，方法包括施用诱导剂的抑制剂以抑制细胞疗法的修改的步骤，从而恢复细胞疗法的功能和/或有效性(例如，当疾病的体征或症状再次出现或严重程度增加和/或不良事件得到消退时)。
定义
如本公开全文所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“和”及“该/所述”包括复数个所指对象。因此，例如，提及“一种方法”包括多种此类方法，并且提及“剂量”包括提及本领域技术人员已知的一个或多个剂量及其等同物，等等。
术语“约”或“大致”是指在如本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围内，所述可接受误差范围将部分地取决于如何测量或确定该值，例如测量系统的局限性。例如，“大约”可意指在1倍或多倍标准偏差内。替代性地，“约”可意指给定值的至多20％、或至多10％、或至多5％或至多1％的范围。替代性地，特别是关于生物系统或过程，该术语可以意指在某一值的某一数量级内，优选地在5倍以内，并且更优选地在2倍以内。在本申请和权利要求书中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则应认为术语“约”意指在该特定值的可接受误差范围内。
本公开提供了分离的或基本上纯化的多核苷酸或蛋白质组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或蛋白质、或其生物活性部分实质上或基本上不含如天然存在的环境中所见的通常伴随或与多核苷酸或蛋白质相互作用的组分。因此，当通过重组技术生产时，分离的或纯化的多核苷酸或蛋白质实质上不含其他细胞物质或培养基，或者当通过化学合成时，实质上不含化学前体或其他化学物质。最佳地，“分离的”多核苷酸不含在该多核苷酸所源自的生物体的基因组DNA中天然侧接多核苷酸的序列(最佳地为蛋白质编码序列)(即，位于该多核苷酸的5'和3'端的序列)。例如，在各种方面，分离的多核苷酸可含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，该核苷酸序列天然地侧接多核苷酸所源自的细胞的基因组DNA中的多核苷酸。实质上不含细胞材料的蛋白质包括具有少于约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)的污染蛋白质的蛋白质制剂。当本公开的蛋白质或其生物活性部分经重组生产时，最佳地，培养基表示少于约30％、20％、10％、5％或1％(以干重计)的化学前体或非目的蛋白质的化学物质。
本公开提供了所公开的DNA序列的片段和变体以及由这些DNA序列编码的蛋白质。如本公开全文所用，术语“片段”是指DNA序列的一部分或氨基酸序列的一部分，并因此是指由其编码的蛋白质的一部分。包含编码序列的DNA序列片段可编码保留天然蛋白质的生物活性的蛋白质片段，并因此保留对如本文所述的靶DNA序列的DNA识别或结合活性。替代性地，可用作杂交探针的DNA序列片段一般而言不编码保留生物活性的蛋白质或不保留启动子活性。因此，DNA序列的片段可在至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸并且至多为本公开的全长多核苷酸的范围内。
本公开的核酸或蛋白质可通过模块化方法来构建，该模块化方法包括在靶载体中预组装单体单元和/或重复单元，其随后可组装成最终目标载体。本公开的多肽可包含本公开的重复单体，并且可通过模块化方法，通过在目标载体中预组装重复单元(其随后可组装成最终的目标载体)来构建。本公开提供了通过该方法生产的多肽以及编码这些多肽的核酸序列。本公开提供了包含编码通过该模块化方法生产的多肽的核酸序列的宿主生物和细胞。
术语“结合”是指大分子之间(例如，蛋白质与核酸之间)的序列特异性的非共价相互作用。只要相互作用作为一个整体为序列特异性的，则并非结合相互作用的所有组分均需要为序列特异性的(例如，与DNA主链中的磷酸酯残基的接触)。
术语“包括”旨在意指组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其他要素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由...组成”应意指当用于预期目的时，排除对该组合具有任何重要意义的其他要素。因此，基本上由如本文中所定义的元件组成的组合物不排除微量污染物或惰性载体。“由……组成”应意指排除其他成分的微量元素以外的部分和实质性方法步骤。这些过渡术语中的每一个所定义的方面均在本公开的范围内。
术语“表位”是指多肽的抗原决定簇。表位可以包含空间构象中的三个氨基酸，该空间构象对于表位是独特的。通常，表位由至少4个、5个、6个或7个此类氨基酸组成，并且更通常地，由至少8个、9个或10个此类氨基酸组成。确定氨基酸的空间构象的方法是本领域中已知的，并且包括例如X射线晶体学和二维核磁共振。
如本文所用，“表达”是指多核苷酸借以转录成mRNA的过程和/或经转录的mRNA随后借以翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。如果多核苷酸源自基因组DNA，则表达可包括真核细胞中mRNA的剪接。
“基因表达”是指将基因中含有的信息转化为基因产物。基因产物可为基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、shRNA、微RNA、结构RNA或任何其他类型的RNA)或由mRNA翻译产生的蛋白质。基因产物还包括通过诸如加帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑等过程修饰的RNA，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、十四烷基化和糖基化等过程修饰的蛋白质。
基因表达的“调节”或“调控”是指基因活性的改变。表达的调节可包括但不限于基因活化和基因抑制。
“可操作地连接的”或其等同形式(例如，“可操作地连接”)意指两个或更多个分子彼此相对定位，使得它们能够相互作用，以影响一个或两个分子或其组合所具有的功能。
本发明公开了非共价连接的组分以及制备和使用非共价连接的组分的方法。各种组分可采用如本文所述的各种不同的形式。例如，非共价连接(即，可操作地连接)的蛋白质可用于实现暂时的相互作用，以避免本领域中的一个或多个问题。非共价连接的组分(诸如蛋白质)缔合和解离的能力使得官能性缔合仅在或主要在需要此类缔合以实现所需活性的情况下实现。该键合可持续足够长的时间以实现所需的效果。
本发明公开了一种将蛋白质引导至生物体基因组中特定基因座的方法。该方法可包括提供DNA定位组分以及提供效应物分子的步骤，其中该DNA定位组分和该效应物分子能够经由非共价键合可操作地连接。
“靶位点”或“靶序列”为定义结合分子将结合的核酸部分的核酸序列，前提条件是存在足够的结合条件。
术语“核酸”或“寡核苷酸”或“多核苷酸”是指共价连接在一起的至少两个核苷酸。单链的描绘还定义了互补链的序列。因此，核酸还可涵盖所描绘的单链的互补链。本公开的核酸还涵盖保留相同结构或编码相同蛋白质的实质上相同的核酸及其互补物。
本公开的探针可包含能够在严格杂交条件下与靶序列杂交的单链核酸。因此，本公开的核酸可以指在严格杂交条件下杂交的探针。
本公开的核酸可以为单链或双链的。即使分子的大部分是单链的，本公开的核酸也可以含有双链序列。即使分子的大部分是双链的，本公开的核酸也可以含有单链序列。本公开的核酸可包括基因组DNA、cDNA、RNA或其杂交体。本公开的核酸可含有脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的组合。本公开的核酸可含有碱基的组合，所述碱基包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、异胞嘧啶和异鸟嘌呤。本公开的核酸可合成以包含非天然氨基酸修饰。本公开的核酸可通过化学合成方法或通过重组方法获得。
本公开的核酸(无论是其完整序列还是其任何部分)均可以为非天然存在的。本公开的核酸可含有一个或多个非天然存在的突变、取代、缺失或插入，使得整个核酸序列为非天然存在的。本公开的核酸可含有一个或多个重复的、倒置的或重复的序列，其所得序列并非天然存在的，使得整个核酸序列为非天然存在的。本公开的核酸可含有非天然存在的修饰的、人工的或合成的核苷酸，使得整个核酸序列为非天然存在的。
由于遗传密码的冗余，多个核苷酸序列可编码任何特定的蛋白质。本文设想到所有此类核苷酸序列。
如本公开全文所用，术语“可操作地连接”是指基因的表达处于与其空间连接的启动子的控制之下。启动子可定位于在其控制下的基因的5'(上游)或3'(下游)。启动子与基因之间的距离可与该启动子和其所控制的基因(启动子所来源的基因)之间的距离大致相同。可适应启动子与基因之间距离的变化而不会丧失启动子功能。
如本公开全文所用，术语“启动子”是指能够赋予、活化或增强细胞中核酸表达的合成或天然来源的分子。启动子可包含一个或多个特定的转录调控序列，以进一步增强表达和/或改变其空间表达和/或时间表达。启动子还可包含远端增强子或抑制子元件，其可位于距转录起始位点数千个碱基对的位置。启动子可源自包括病毒、细菌、真菌、植物、昆虫和动物的来源。启动子可在发生表达的细胞、组织或器官方面、或在表达发生的发育阶段方面、或响应于外部刺激(诸如生理应激、病原体、金属离子或诱导剂)组成性或区别性调控基因组分的表达。启动子的代表性实例包括噬菌体T7启动子、噬菌体T3启动子、SP6启动子、lac操纵子启动子、tac启动子、SV40晚期启动子、SV40早期启动子、RSV-LTR启动子、CMV IE启动子、EF-1α启动子、CAG启动子、SV40早期启动子或SV40晚期启动子和CMV IE启动子。
如本公开全文所用，术语“实质上互补”是指第一序列与第二序列的补体在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540个或更多个核苷酸或氨基酸的区域内至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％同一，或者两个序列在严格杂交条件下杂交。
如本公开全文所用，术语“实质上相同”是指第一序列和第二序列在8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、180、270、360、450、540个或更多个核苷酸或氨基酸的区域内(或者在核酸方面)至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％或99％相同(如果第一序列与第二序列的补体实质上互补)。
如本公开全文所用，术语“变体”当用于描述核酸时，是指(i)参考核苷酸序列的一部分或片段；(ii)参考核苷酸序列的补体或其部分；(iii)与参考核酸或其补体实质上相同的核酸；或(iv)在严格条件下与参考核酸、其补体或与其实质上相同的序列杂交的核酸。
如本公开全文所用，术语“载体”是指含有复制起点的核酸序列。载体可为病毒载体、噬菌体、细菌人工染色体或酵母人工染色体。载体可为DNA或RNA载体。载体可为自我复制的染色体外载体，并且优选地为DNA质粒。载体可包含氨基酸与DNA序列、RNA序列或DNA和RNA序列两者的组合。
如本公开全文所用，术语“变体”当用于描述肽或多肽时，是指由于氨基酸的插入、缺失或保守取代而在氨基酸序列上有所不同，但保留至少一种生物活性的肽或多肽。变体还可意指具有与参考蛋白质实质上相同的氨基酸序列的蛋白质，其中该参考蛋白质的氨基酸序列保留至少一种生物活性。
氨基酸的保守取代，即，将氨基酸用具有相似特性的不同氨基酸替代(例如，亲水性、程度和带电荷区域的分布)，在本领域中公认为典型地涉及微小变化。如本领域中所理解的，这些微小变化可部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定。Kyte等人,J.Mol.Biol.157:105-132(1982)。氨基酸的亲水指数是基于对其疏水性和电荷的考虑。具有相似亲水指数的氨基酸可被取代，并且仍保留蛋白质功能。在一方面，具有±2的亲水指数的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可用于揭示将导致蛋白质保留生物功能的取代。在肽的背景下考虑氨基酸的亲水性允许计算该肽的最大局部平均亲水性，这是一种已被报道与抗原性和免疫原性具有良好相关性的可用的量度。美国专利号4,554,101，其通过援引以其全文并入本文。
具有相似亲水性值的氨基酸的取代可导致肽保留生物活性，例如免疫原性。可用彼此具有在±2以内的亲水性值的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值两者均受到该氨基酸特定侧链的影响。与该观察结果一致，与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于氨基酸的相对相似性，以及特定而言这些氨基酸的侧链，如疏水性、亲水性、电荷、大小和其他特性所揭示的。
如本文所用，“保守”氨基酸取代可以如下表A、B或C中所示进行定义。在一些方面，融合多肽和/或编码此类融合多肽的核酸包括已通过修饰编码本公开的多肽的多核苷酸而引入的保守取代。氨基酸可根据物理特性以及对二级和三级蛋白质结构的贡献进行分类。保守取代是将一种氨基酸用另一种具有相似特性的氨基酸取代。示例性保守取代在表A中列出。
表A--保守取代I
替代性地，保守氨基酸可按照Lehninger的描述(Biochemistry，第二版；WorthPublishers,Inc.NY，N.Y.(1975)，第71-77页)进行分组，如表B所示。
表B--保守取代II
替代性地，示例性保守取代在表C中列出。
表C--保守取代III
应当理解，本公开的多肽旨在包括携带一个或多个氨基酸残基的插入、缺失或取代或其任何组合、以及除氨基酸残基的插入、缺失或取代之外的修饰的多肽。本公开的多肽或核酸可含有一个或多个保守取代。
如本公开全文所用，术语“多于一个”上述氨基酸取代是指2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个或更多个所述氨基酸取代。术语“多于一个”可以指2、3、4或5个所述氨基酸取代。
本公开的多肽和蛋白质(无论是其完整序列还是其任何部分)均可以为非天然存在的。本公开的多肽和蛋白质可含有一个或多个非天然存在的突变、取代、缺失或插入，使得整个氨基酸序列为非天然存在的。本公开的多肽和蛋白质可含有一个或多个重复的、倒置的或重复的序列，其所得序列并非天然存在的，使得整个氨基酸序列为非天然存在的。本公开的多肽和蛋白质可含有非天然存在的修饰的、人工的或合成的氨基酸，使得整个氨基酸序列为非天然存在的。
如本公开全文所用，“序列同一性”可通过使用用于对两个序列进行blast的独立可执行BLAST引擎程序(bl2seq)，使用默认参数来确定，该程序可从美国国家生物技术信息中心(NCBI)ftp站点获取(Tatusova和Madden,FEMS Microbiol Lett.,1999,174,247-250；其通过援引以其全文并入本文)。当术语“相同”或“同一性”在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中使用时，是指在每个序列的特定区域内，指定百分比的残基是相同的。百分可比通过最佳地比对两个序列、比较两个序列的指定区域、确定两个序列中存在相同残基的位置的数目以得到匹配位置的数目、将匹配位置的数目除以指定区域中的位置总数并且将该结果乘以100以得到序列同一性百分比来计算。在两个序列具有不同长度或者比对产生一个或多个交错末端并且指定的比较区域仅包括单个序列的情况下，单个序列的残基包括在计算的分母中，但不包括在分子中。当比较DNA和RNA时，胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)可被视为是等同的。特性鉴别可手动进行，或使用计算机序列算法(诸如BLAST或BLAST 2.0)来进行。
如本公开全文所用，术语“内源”是指与靶基因或引入该靶基因的宿主细胞天然地相关联的核酸或蛋白质序列。
如本公开全文所用，术语“外源”是指与靶基因或引入该靶基因的宿主细胞非天然地相关联的核酸或蛋白质序列，包括天然存在的核酸的非天然存在的多个拷贝，例如，DNA序列，或位于非自然存在的基因组位置的天然存在的核酸序列。
本公开提供了将包含DNA序列的多核苷酸构建体引入宿主细胞中的方法。所谓“引入”旨在以构建体能够进入宿主细胞内部的方式将多核苷酸构建体呈递给细胞。本公开的方法不依赖于用于将多核苷酸构建体引入宿主细胞中的特定方法，只要多核苷酸构建体能够进入宿主的一个细胞的内部即可。用于将多核苷酸构建体引入细菌、植物、真菌和动物中的方法是本领域中已知的，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。
如本文所用，术语“约”或“大约”是指与参考数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相比变化高达15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施方案中，术语“约”或“大约”是指与参考数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相比约±15％、±10％、±9％、±8％、±7％、±6％、±5％、±4％、±3％、±2％或±1％的数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的范围。
如本文所用，术语“实质上”或“基本上”是指与参考数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度相比约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度。在一个实施方案中，术语“基本上相同”或“实质上相同”是指与参考数量、水平、值、数量、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度大约相同的数量、水平、值、数字、频率、百分比、尺寸、大小、量、重量或长度的范围。
如本文所用，术语“实质上不含”和“基本上不含”可互换使用，并且当用于描述组合物诸如细胞群体或培养基时，是指不含指定物质或其来源的组合物，诸如95％不含、96％不含、97％不含、98％不含、99％不含指定物质或其来源，或通过常规方法测量不可检测到。术语“不含”或“基本上不含”组合物中的某种成分或物质也意味着没有此类成分或物质(1)以任何浓度包含在组合物中，或(2)在功能上惰性但以低浓度包含在组合物中。在提及不存在组合物的特定物质或其来源的情况下，类似的含义可应用于术语“不存在”。
在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”、“包含”和“含有”应被理解为暗示包括所陈述的步骤或要素或者步骤或要素组，但不排除任何其他步骤或要素或者步骤或要素组。在特定实施方案中，术语“包括”、“具有”、“含有”和“包含”同义地使用。
所谓“由...组成”意指包括且限于短语“由...组成”之后的任何内容。因此，短语“由...组成”指示所列出的要素是必需的或强制性的，并且可能不存在其他要素。
“基本上由...组成”是指包括在该短语之中列出的任何要素，并且限于不干扰或有助于在本公开中针对所列出的要素而指定的活性或作用的其他元素。因此，短语“基本上由...组成”指示所列出的要素是必需的或强制性的，但是没有其他要素是任选的并且可以存在也可以不存在，这取决于它们是否影响所列要素的活性或作用。
在整个说明书中对“一个实施方案”、“实施方案”、“特定实施方案”、“相关实施方案”、“某个实施方案”、“另外的实施方案”或“进一步的实施方案”的引用或它们的组合意指结合该实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方案中。因此，贯穿本说明书各处出现的上述短语不一定全部指相同实施方案。此外，具体特征、结构或特性可在一个或多个实施方案中以任何合适的方式组合。
术语“离体”通常是指在生物体外发生的活动，例如在生物体外人工环境中的活组织中或活组织上进行的实验或测量，优选地对自然条件的改变最小。在特定实施方案中，“离体”程序涉及取自生物体并且在实验室装置中培养的活细胞或组织，该程序通常在无菌条件下，并且通常持续几个小时或至多约24小时，但包括至多48小时或72小时或更长时间，这具体取决于情况。在某些实施方案中，可以收集并且冷冻此类组织或细胞，然后将其解冻以用于离体处理。使用活细胞或组织来进行持续时间超过几天的组织培养实验或程序通常被认为是“体外”，尽管在某些实施方案中，该术语可以与离体互换使用。
术语“体内”通常是指在生物体内发生的活动。
如本文所用，术语“重新编程”或“去分化”或“增加细胞效能”或“增加发育效能”是指增加细胞的效能或将细胞去分化至较低分化状态的方法。例如，与在非重新编程状态下的同一细胞相比，具有增加的细胞效能的细胞具有更多的发育可塑性(即，可以分化成更多的细胞类型)。换句话说，经重新编程的细胞为与在非重新编程状态下的同一细胞相比，在较低分化状态下的细胞。
如本文所用，术语“诱导性多潜能干细胞”或iPSC意指干细胞由分化的成体、新生儿或胎儿细胞产生，这些细胞已经被诱导或改变，即，被重新编程为能够分化成所有三个胚层或真皮层：中胚层、内胚层和外胚层的组织的细胞。所产生的iPSC并不是指存在于自然界中的细胞。
如本文所用，术语“受试者”是指任何动物，优选地人类患者、牲畜或其他驯化动物。
“多潜能性因子”或“重新编程因子”是指能够单独或与其他药剂组合增加细胞的发育效能的药剂。多潜能性因子包括但不限于能够增加细胞的发育效能的多核苷酸、多肽和小分子。示例性多潜能性因子包括例如转录因子和小分子重新编程剂。
“培养”或“细胞培养”是指细胞在体外环境中的维持、生长和/或分化。“细胞培养基”、“培养基(media)”(每种情况下的单数“培养基(medium)”)、“补充剂”和“培养基补充剂”是指培养细胞培养物的营养组成。
“培养”或“保持”是指在组织或身体外，例如在无菌塑料(或涂覆塑料)细胞培养皿或培养瓶中维持、繁殖(生长)和/或分化细胞。“培养”或“保持”可以利用培养基作为营养、激素和/或有助于繁殖和/或维持细胞的其他因素的来源。
术语“造血干/祖细胞”、“造血干细胞”、“造血祖细胞”或“造血前体细胞”是指致力于造血谱系但能够进一步造血分化，并且包括多能造血干细胞(成血细胞)、髓系祖细胞、巨核细胞祖细胞、红血球祖细胞和淋巴祖细胞的细胞。造血干/祖细胞(HSC)为产生所有血细胞类型的多能干细胞，该血细胞类型包括髓谱系(单核细胞和巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、红血球、巨核细胞/血小板、树突状细胞)和淋巴谱系(T细胞、B细胞、NK细胞)。如本文所用，术语“定形造血干细胞”是指能够产生成熟髓系细胞和淋巴细胞两种类型(包括T细胞、NK细胞和B细胞)的CD34+造血细胞。造血细胞还包括产生原始红血球、巨核细胞和巨噬细胞的原始造血细胞的各种亚群。
如本文所用，术语“T淋巴细胞”和“T细胞”可互换使用，并且是指在胸腺中完成成熟并且在免疫系统中具有各种作用的主要类型的白细胞，该各种作用包括体内特定外来抗原的鉴定和其他免疫细胞的活化和灭活。T细胞可以为任何T细胞，诸如经培养的T细胞，例如原代T细胞，或来自经培养的T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupT1等，或从哺乳动物获得的T细胞。T细胞可以为CD3+细胞。T细胞可以为任何类型的T细胞并且可以属于任何发育阶段，包括但不限于CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞(例如，Th1和Th2细胞)、CD8+T细胞(例如，细胞毒性T细胞)、外周血单核细胞(PBMC)、外周血白细胞(PBL)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、记忆T细胞、初始T细胞、调控T细胞、γδT细胞(γδT细胞)等。其他类型的辅助T细胞包括以下细胞：诸如Th3(Treg)、Th17、Th9或Tfh细胞。其他类型的记忆T细胞包括以下细胞：诸如中央记忆T细胞(Tcm细胞)、效应记忆T细胞(Tem细胞和TEMRA细胞)。T细胞还可以是指遗传工程改造的T细胞，诸如经修饰以表达T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。T细胞也可以从干细胞或祖细胞分化。
如本文所用，术语“分离的”等是指已经从其原始环境分离的细胞或细胞的群体，即，分离的细胞的环境实质上不含如在“未分离的”参考细胞存在的环境中发现的至少一种组分。该术语包括从一些或所有组分中去除的细胞，因为它存在于其自然环境(例如组织、活检)中。该术语还包括从至少一种、一些或所有组分中去除的细胞，因为该细胞存在于非天然存在的环境(例如培养物、细胞悬浮液)中。因此，分离的细胞与至少一种组分(包括其他物质、细胞或细胞群体)部分或完全分离，因为它存在于自然界中或因为它生长、储存或维持于非天然存在的环境中。分离的细胞的特定实例包括部分纯的细胞、实质上纯的细胞和在非天然存在的培养基中培养的细胞。分离的细胞可以从以下方式获得：将所需细胞或其群体与环境中的其他物质或细胞分离，或从环境中去除一个或多个其他细胞群体或亚群。如本文所用，术语“纯化”等是指增加纯度。例如，纯度可以增加至至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。
如本文所用，术语“编码”是指多核苷酸(诸如基因、cDNA或mRNA)中核苷酸的特定序列的固有特性，以用作在生物过程中用于合成其他聚合物和大分子的模板，该其他聚合物和大分子具有经定义的核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的序列或经定义的氨基酸的序列中的任一者以及由此产生的生物特性。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。编码链(其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常提供于序列表中)和非编码链(其用作用于基因或cDNA的转录的模板)两者均可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
“构建体”是指大分子或者分子的复合物，其包含待在体外或体内递送至宿主细胞的多核苷酸。如本文所用，“载体”是指能够将外来遗传物质递送或转移至靶细胞的任何核酸构建体，该外来遗传物质可以在该靶细胞处进行复制和/或表达。如本文所用，术语“载体”包括待递送的构建体。载体可以为线性或环状分子。载体可以为整合的或非整合的。主要类型的载体包括但不限于质粒、附加型载体、病毒载体、粘粒和人工染色体。病毒载体包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、仙台病毒载体等。
所谓“整合”意指将构建体的一个或多个核苷酸稳定地插入细胞基因组中，即，共价连接至细胞染色体DNA内的核酸序列。所谓“靶向整合”意指将构建体的核苷酸在预先选择的位点或“整合位点”处插入细胞的染色体或线粒体DNA。如本文所用，术语“整合”进一步是指涉及以下项的过程：插入构建体的一个或多个外源序列或核苷酸，在整合位点处具有或不具有内源序列或核苷酸的缺失。在其中在插入位点处存在缺失的情况下，“整合”可以进一步包括用该一个或多个插入的核苷酸替代内源序列或缺失的核苷酸。
如本文所用，术语“外源”旨在意指将参考分子或参考活性引入宿主细胞中。可以例如通过将编码核酸引入宿主遗传物质中，诸如通过整合至宿主染色体中或作为非染色体遗传物质诸如质粒来引入该分子。因此，在用于提及编码核酸的表达时，该术语是指将呈可表达形式的编码核酸引入细胞中。术语“内源”是指存在于宿主细胞中的参考分子或活性。类似地，在用于提及编码核酸的表达时，该术语是指包含在细胞内并且未被外源引入的编码核酸的表达。
如本文所用，“目的基因”或“目的多核苷酸序列”为当置于适当的调控序列的控制下时，转录成RNA并且在一些情况下在体内翻译成多肽的DNA序列。目的基因或多核苷酸可以包括但不限于原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如，哺乳动物)DNA的基因组DNA序列，以及合成DNA序列。例如，目的基因可以编码miRNA、shRNA、天然多肽(即，存在于自然界中的多肽)或其片段；变体多肽(即，与天然多肽具有小于100％序列同一性的天然多肽的突变体)或其片段；经工程改造的多肽或肽片段、治疗性肽或多肽、成像标志物、选择性标志物等。
如本文所用，术语“多核苷酸”是指任何长度的核苷酸的聚合物形式，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或者其类似物。多核苷酸的序列由四个核苷酸碱基组成：腺嘌呤(A)；胞嘧啶(C)；鸟嘌呤(G)；胸腺嘧啶(T)；并且当多核苷酸为RNA时，胸腺嘧啶为尿嘧啶(U)。多核苷酸可以包括基因或基因片段(例如，探针、引物、EST或SAGE标签)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA、核糖体RNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、支链多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、核酸探针和引物。多核苷酸也是指双链分子和单链分子两者。
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指具有由肽键来共价连接的氨基酸残基的分子。多肽必须含有至少两个氨基酸，并且对多肽的氨基酸的最大数量没有限制。如本文所用，术语是指短链(例如，其在本领域中也通常称为肽、寡肽和低聚物)和长链(其在本领域中通常称为多肽或蛋白质)两者。“多肽”包括例如生物活性片段、实质上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然多肽、重组多肽、合成多肽或其组合。
“可操作地连接的”是指单个核酸片段上的核酸序列的关联，使得一个片段的功能受到另一个片段的影响。例如，当启动子能够影响编码序列或功能RNA的表达(即，编码序列或功能RNA处于启动子的转录控制之下)时，该启动子与编码序列或功能RNA可操作地连接。编码序列可以在正义取向或反义取向上可操作地连接至调控序列。
如本文所用，术语“增强的治疗特性”是指与相同一般细胞类型的典型免疫细胞相比，经增强的细胞的治疗特性。例如，与典型的、未经修饰和/或天然存在的NK细胞相比，具有“增强的治疗特性”的NK细胞将具有增强的、经改善的和/或加强的治疗特性。免疫细胞的治疗特性可以包括但不限于细胞植入、运输、归巢、活力、自我更新、持久性、免疫反应调控和调节、存活和细胞毒性。免疫细胞的治疗特性还表现为：抗原靶向受体表达；其HLA呈递或缺乏；对肿瘤微环境的抗性；诱导旁观者免疫细胞和免疫调节；改善在靶(on-target)特异性并且减少肿瘤外(off-tumor)效应；对治疗(诸如化学疗法)的抗性。
如本文所用，术语“接合子”是指一种分子，例如融合多肽：该分子能够形成免疫细胞(例如T细胞、NK细胞、NK T细胞、B细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞和肿瘤细胞)之间的连接；并且活化免疫细胞。接合子的实例包括但不限于双特异性T细胞接合子(BiTE)、双特异性杀伤细胞接合子(BiKE)、三特异性杀伤细胞接合子、或多特异性杀伤细胞接合子，或与多种免疫细胞类型相容的通用接合子。
如本文所用，术语“安全开关蛋白”是指经设计用于预防细胞疗法的潜在毒性或其他不良影响的经工程改造的蛋白质。在一些情况下，安全开关蛋白表达被有条件地控制，以解决已经将编码安全开关蛋白的基因永久并入其基因组的经移植的经工程改造的细胞的安全性问题。该有条件的调控可以为可变的，并且可能包括通过小分子介导的翻译后活化以及组织特异性和/或时序性转录调控来进行的控制。安全开关可以介导凋亡的诱导、蛋白质合成的抑制、DNA复制、生长停滞、转录和转录后遗传调控，和/或抗体介导的消耗。在一些情况下，安全开关蛋白由外源分子(例如前药)活化，该外源分子在被活化时触发治疗细胞的凋亡和/或细胞死亡。安全开关蛋白的实例包括但不限于自杀基因，诸如半胱天冬酶9(或半胱天冬酶3或7)、胸苷激酶、胞嘧啶脱氨酶、B细胞CD20、经修饰的EGFR及其任何组合。在该策略中，在发生不良事件时施用的前药由自杀基因产物来活化并且杀伤转导细胞。
如本文所用，术语“药用活性蛋白质或肽”是指能够对生物体实现生物和/或药物作用的蛋白质或肽。药用活性蛋白质具有针对疾病的治愈性或姑息性特性，并且可以被施用以减轻、缓解、缓和、逆转或减少疾病的严重程度。药用活性蛋白质还具有预防特性，并且用于预防疾病的发作或用于在此类疾病或病理状况出现时减少其严重程度。药用活性蛋白质包括整个蛋白质或肽或其药用活性片段。它还包括蛋白质或肽的药用活性类似物或者蛋白质或肽的片段的类似物。术语药用活性蛋白质也是指合作地或协同地作用以提供治疗益处的多种蛋白质或肽。药用活性蛋白或肽的实例包括但不限于受体、结合蛋白、转录和翻译因子、肿瘤生长抑制蛋白、抗体或其片段、生长因子和/或细胞因子。
如本文所用，术语“信号传导分子”是指调节、参与、抑制、活化、减少或增加细胞信号转导的任何分子。信号转导是指通过沿着最终触发细胞中生化事件的途径募集蛋白质复合物，以化学修饰的形式传输分子信号。信号转导途径是本领域中众所周知的，并且包括但不限于G蛋白偶联受体信号传导、酪氨酸激酶受体信号传导、整合素信号传导、收费门(tollgate)信号传导、配体门控离子通道信号传导、ERK/MAPK信号传导途径、Wnt信号传导途径、cAMP依赖性途径和IP3/DAG信号传导途径。
如本文所用，术语“靶向模式”是指被遗传并入细胞中以促进抗原和/或表位特异性的分子(例如，多肽)，该抗原和/或表位特异性包括但不限于i)与独特嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)相关的抗原特异性，ii)与单克隆抗体或双特异性接合子相关的接合子特异性，iii)经转化的细胞的靶向，iv)癌症干细胞的靶向，和v)在不存在特定抗原或表面分子的情况下的其他靶向策略。
如本文所用，术语“特异性的”或“特异性”可以用于是指分子(例如，受体或接合子)与靶分子选择性结合的能力，与非特异性或非选择性结合相反。
如本文所用，术语“过继细胞疗法”是指如本文所用的基于细胞的免疫疗法，该基于细胞的免疫疗法涉及自体或同种异体淋巴细胞的输注，该自体或同种异体淋巴细胞被鉴定为在所述输注之前已经离体扩增的T细胞或B细胞(经过或未经遗传修饰)。
如本文所用，“治疗上足够的量”在其含义内包括无毒但足够和/或有效量的特定治疗和/或药物组合物，其是指提供所需治疗效果。所需的确切量因受试者而异，这取决于以下因素：诸如患者的一般健康状况、患者的年龄以及病况的阶段和严重程度。在特定实施方案中，治疗上足够的量足以和/或有效地减轻、减少和/或改善与正在治疗的受试者的疾病或病况相关联的至少一种症状。
如在iPSC和由此分化的衍生非多潜能细胞的基因组编辑或修饰、或非多潜能细胞和由此重新编程的衍生iPSC的基因组编辑或修饰的上下文中使用的，“功能性”是指(1)在基因水平处，成功敲入、敲除、敲下基因表达，转基因或受控基因表达，诸如在所需细胞发育阶段处的诱导型或时序性表达，其通过直接基因组编辑或修饰、或通过经由与初始基因组工程改造的起始细胞的分化或该起始细胞的重新编程而“传递(passing-on)”来实现；或(2)在细胞水平处，成功去除、添加或改变细胞功能/特征，其经由(i)通过直接基因组编辑而在所述细胞中获得的基因表达修饰，(ii)通过经由与经初始基因组工程改造的起始细胞的分化或该起始细胞的重新编程而“传递”来在所述细胞中保持的基因表达修饰；(iii)由于基因表达修饰而产生的所述细胞中的下游基因调控，该基因表达修饰仅出现在所述细胞的早期发育阶段，或仅出现在起始细胞中，该起始细胞经由分化或重新编程来产生所述细胞；或(iv)在成熟细胞产物内显示的增强的或新获取的细胞功能或属性，其初始源自在iPSC、祖细胞或去分化细胞起源处进行的基因组编辑或修饰。
“HLA缺陷型”，包括HLA-I类缺陷型或HLA-II类缺陷型或两者，是指缺乏以下项的细胞、或不再保持以下项的细胞、或具有表面表达水平减少的以下项的细胞：包含HLA I类蛋白质异二聚体和/或HLA II类异二聚体的完全MHC复合物，使得减弱或减少的水平低于由其他细胞或由合成方法来自然可检测的水平。HLA I类缺乏症可以通过功能性缺失HLA I类基因座的任何区域(染色体6p21)或者缺失或减少HLA I类相关基因的表达水平来实现，该相关基因包括但不限于β-2微球蛋白(B2M)基因、TAP 1基因、TAP 2基因和Tapasin。HLA II类缺乏症可以通过功能性缺失或HLA-II相关基因的减少来实现，该相关基因包括但不限于RFXANK、CIITA、RFX5和RFXAP。在本发明之前，尚不清楚HLA复合物缺乏或改变的iPSC是否具有在保留经调节的活性的能力的同时进入发育、成熟并且生成功能性分化细胞。此外，在本发明之前，尚不清楚HLA复合物缺乏的分化细胞是否可以在具有HLA复合物缺乏症的同时重新编程为iPSC并且保持为多潜能干细胞。在细胞重新编程、维持多潜能性和分化期间中的意料之外的失败可能与以下方面相关：该方面包括但不限于发育阶段特异性基因表达或其缺乏、对HLA复合物呈递的要求、所引入的表面表达模式的蛋白质脱落、对适当和高效克隆重新编程的需要，以及对分化方案的重新配置的需要。
实例
实例1-Cas-CLOVER中的S44P突变产生相对于野生型Cas-CLOVER的增加的体外基因编辑活性
该实例说明，与野生型Cas-CLOVER序列相比，在Clo051核酸酶结构域中携带S44P突变的Cas-CLOVER氨基酸序列在若干细胞系中显示出增加的体外基因编辑活性。
Huh7细胞系中的基因编辑
将Huh7细胞以5E5个细胞/ml的密度接种在12孔板中，并且根据制造商的说明用包含靶向白蛋白基因、APOC3基因或TTR基因的内含子的非饱和量0.2μg/ml的gRNA对、0.5μg/ml的野生型Cas-CLOVER mRNA(由SEQ ID NO:11的核酸序列所编码)或包含S44P突变的Cas-CLOVER mRNA(由SEQ ID NO:36的核酸序列所编码)和15μl/ml的lipofectaminemessengerMAX试剂(Thermo Fisher,Inc)的混合物进行转染。48小时后，去除培养基，将细胞裂解，并且根据制造商的说明使用QuickExtract试剂盒(Lucigen Corp.)来从细胞提取物中分离基因组DNA。
然后通过设计位于特定靶序列的侧翼的引物，使用PCR来分析分离的基因组DNA：白蛋白-Fwd：AAGACGTGTGTGGGGATCAG(SEQ ID NO:51)和白蛋白-Rev：GAGCAAAGGCAATCAACACCC(SEQ ID NO:52)；APOC3-Fwd：ctcagccctgctctttcctc(SEQ ID NO:53)和APOC3-Rev：ctcgcaggatggataggcag(SEQ ID NO:54)；TTR-Fwd：attgaaccccaagaaccacat(SEQ ID NO:55)和TTR-Rev：ctgcctcctagattcaaggg(SEQ ID NO:56)。将PCR产物分离，并且通过直接Sanger测序来确定DNA序列。使用ICE分析(SynthegoCorp.)来量化野生型和S44P Cas-CLOVER基因编辑率的插入缺失率。Huh7细胞系中的野生型和S44P的插入缺失百分比在表2中示出。
表2.Huh7细胞系中的插入缺失百分比
白蛋白 APOC3 TTR
Huh7 WT Cas-CLOVER 48 42 34
Huh7 S44P Cas-CLOVER 60 34 22
如表2所示，S44P突变体的体外活性与这些细胞系中野生型Cas-CLOVER序列的体外活性类似。
HepG2细胞系中的基因编辑
根据制造商的说明使用Lonza Nucleofector来将包含靶向白蛋白基因、APOC3基因或TTR基因的内含子的非饱和量0.2μg/ml的gRNA对、0.5μg/ml的野生型Cas-CLOVER mRNA(由SEQ ID NO:11的核酸序列所编码)或包含S44P突变的Cas-CLOVER mRNA(由SEQ ID NO:36的核酸序列所编码)的混合物电穿孔至5E5个HepG2细胞中。将电穿孔细胞以5E6个细胞/ml的密度接种并且在培养基中孵育48小时。48小时后，去除培养基，将细胞裂解，并且根据制造商的说明使用QuickExtract试剂盒(Lucigen Corp.)来从细胞提取物中分离基因组DNA。
然后通过设计位于特定基因靶序列的侧翼的引物，使用PCR来分析分离的基因组DNA：白蛋白-Fwd：AAGACGTGTGTGGGGATCAG(SEQ ID NO:51)和白蛋白-Rev：GAGCAAAGGCAATCAACACCC(SEQ ID NO:52)；APOC3-Fwd：ctcagccctgctctttcctc(SEQ ID NO:53)和APOC3-Rev：ctcgcaggatggataggcag(SEQ ID NO:54)；TTR-Fwd：attgaaccccaagaaccacat(SEQ ID NO:55)和TTR-Rev：ctgcctcctagattcaaggg(SEQ ID NO:56)。将PCR产物分离，并且通过直接Sanger测序来确定DNA序列。使用ICE分析(SynthegoCorp.)来量化野生型和S44P Cas-CLOVER基因编辑率的插入缺失率。HepG2细胞系中的野生型和S44P Cas-CLOVER变体的插入缺失百分比在表3中示出。
表3.HepG2细胞系中的插入缺失百分比
白蛋白 APOC3 TTR
HepG2 WT Cas-CLOVER 40 57 12
HepG2 S44P Cas-CLOVER 39 82 22
如表3所示，与野生型Cas-CLOVER序列相比，S44P突变引起APOC3和TTR基因座处的插入缺失率改善至大约1.4倍至1.8倍。
HPSC中的基因编辑
根据制造商的说明使用Lonza Nucleofector来将包含非饱和量0.2μg/ml的靶向HBG1基因的gRNA对(SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:68)以及1.5μg/ml或4.0μg/ml的野生型Cas-CLOVER mRNA(由SEQ ID NO:11的核酸序列所编码)或包含S44P突变的Cas-CLOVERmRNA(由SEQ ID NO:36的核酸序列所编码)的混合物电穿孔至5E5个HSPC细胞中。将电穿孔细胞以5E6个细胞/ml的密度接种并且在具有10％ FBS培养基的DMEM中孵育48小时。48小时后，去除培养基，将细胞裂解，并且根据制造商的说明使用QuickExtract试剂盒(LucigenCorp.)来从细胞提取物中分离基因组DNA。
对于HSPC细胞，使用下一代测序(“NGS”)来测量在HBG基因座处的基因编辑。简而言之，使用位于HBG1基因外显子1(以加下划线的字体示出)的侧翼的DNA引物来使基因组DNA样品经受PCR扩增，该外显子进一步含有Illumina部分衔接子：Fwd ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCAGTATCCTCTTGGG GG(SEQ ID NO:57)；和Rev GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACCTCAGACGTTCCAG AAGC(SEQ ID NO:58)。所得PCR扩增子使用含有Illumina P5和P7序列(Illumina Corp)和独特索引序列(New England Biolabs)的引物来经历第二PCR反应。将最终扩增子以等摩尔浓度汇集，并且根据制造商(Illumina Corp)按照Amplicon-seq的标准程序使用Miseq台式测序仪来进行分析。使用CRISPResso2程序来分析序列数据，以确定每个样品中的插入/缺失的频率。结果如表4所示。
表4.插入和缺失的频率
浓度(μg/ml) 野生型Cas-CLOVER S44P Cas-CLOVER
1.5 18 22
4.0 37 49
如表4所示，与野生型Cas-CLOVER序列相比，S44P突变引起在HPSC中HBG1基因座处在每种浓度下的插入缺失率的适度改善。
实例2-Cas-CLOVER中的S44P突变产生相对于野生型Cas-CLOVER的增加的体内基因编辑活性
该实例说明，与野生型Cas-CLOVER相比，在Clo051核酸酶结构域中携带S44P突变的Cas-CLOVER氨基酸序列在多个基因组基因座处显示出增加的体内基因编辑活性。
Psck9基因编辑
A.LNP制备
为了配制脂质纳米颗粒(LNP)，将各个百分比的萜烯类脂质HMA-404、磷脂DOPC、结构脂质胆固醇(Chol)和1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(DMG-PEG2000；AvantiPolar Lipids,Alabaster,Alabama,USA)合并以制备LNP组合物。将RNA分子包封在脂质纳米颗粒中，该脂质纳米颗粒包含按摩尔计约40.75％的HMA-404、按摩尔计约51.75％的胆固醇、按摩尔计约5％的DOPC和按摩尔计约2.5％的DMG-PEG2000。纳米颗粒中的脂质与核酸的比率为约120:1(重量/重量)，并且总脂质为25mM。
化合物HMA-404
化合物HMA-404如PCT申请号PCT/US2023/061005所述进行制备。将粗品通过硅胶快速色谱法纯化(洗脱剂：5％ MeOH/DCM)。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ4.38–4.12(m,16H),2.90–2.78(m,4H),2.71(t,J＝6.8Hz,8H),2.61(s,3H),2.57–2.36(m,12H),2.35–2.04(m,4H),2.01–1.62(m,17H),1.60–0.96(m,45H),0.94–0.67(m,30H)。
使用(TriLink Corp)将mRNA分子进一步加帽，并且将mRNA中的所有胞苷残基用5-甲基胞苷(5-MeC)取代。
通过将脂质溶于200-proof HPLC级乙醇中，制备单独的25mg/ml储备溶液，并且将储备溶液储存在-80℃，直至配制。在配制时，将脂质储备溶液短暂地平衡至室温，然后放置在保持在50℃至55℃的温度范围内的加热板上。随后，将热脂质原液合并，以得到所需的最终摩尔百分比。
将靶向小鼠pcsk9基因的第一外显子的一对gRNA(SEQ ID NO:59和SEQ ID NO:60)以及编码5'-CleanCap-5MeC-Cas-CLOVER(SEQ ID NO:69)或5'-CleanCap-5MeC-Cas-CLOVER S44P(SEQ ID NO:70)并且待并入LNP中的mRNA的1mg/ml溶液单独添加至150mM乙酸钠缓冲液(pH5.2)，以形成储备溶液并且保持在冰上。根据制造商的说明，使用仪器(Precision Nanosystems,Vancouver,BC,Canada)将脂质相与微流体芯片内的水相mRNA混合，以形成包含包封mRNA的LNP组合物。用于mRNA包封的Nanoassemblr过程参数如表5所示。
表5.Nanoassemblr过程参数
总流速(ml/min) 脂质相:水(RNA)相(v/v)
20 1:3
然后将所得mRNA LNP组合物转移至截留分子量(MWCO)为8kDa至10kDa的RepligenFloat-A-Lyzer透析装置(Spectrum Chemical Mfg.Corp,CA,USA),并通过磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析处理(透析液：透析缓冲剂体积至少1:200v/v)，pH为7.4，在4℃下过夜(或者可替代地在室温下至少4小时)，以去除25％乙醇并实现完全的缓冲剂交换。在一些实验中，将LNP在超速离心机中以约4100xg旋转的Ultra-4离心过滤装置MWCO-30kDa(Millipore Sigma,USA)中进一步浓缩。然后将mRNA LNP储存在4℃直至进一步使用。LNP的平均粒度直径为大约70nm。
B.试点研究
向成年雌性BALB/C小鼠(n＝2/组)静脉内共施用一对靶向psck9的gRNA(SEQ IDNO:59和SEQ ID NO:60)以及编码5'-CleanCap-5MeC-Cas-CLOVER(SEQ ID NO:69)或5'-CleanCap-5MeC-Cas-CLOVER S44P(SEQID NO:70)的mRNA，该mRNA以1.0mg/kg在实例2，第A节中的LNP组合物中配制。将一组小鼠用作为阴性对照的媒介物(PBS,ThermoFisherScientific,USA)进行处理。
施用后七天，将小鼠安乐死，并且从经治疗和未经治疗的小鼠的肝脏中分离DNA。简而言之，将肝脏在安乐死后切除，在液氮中快速冷冻，与裂解缓冲液(在200μL裂解缓冲液中的15mg组织+10μL蛋白酶K)混合，并且使用Triple-Pure锆珠(Fisher Scientific)在TissueLyser II(Qiagen)中粉碎。将匀浆组织在56℃下孵育30分钟，并且根据制造商的说明，使用来自New England Biolabs的Monarch基因组DNA纯化试剂盒来进行柱纯化。在50μL的洗脱缓冲液(10mM Tris-Cl,pH 8.5)中进行最终DNA洗脱。通过测量260nm和280nm处的吸光度来评估DNA样品的浓度和纯度。
通过Droplet Digital PCR(ddPCR)使用含有与Cas-CLOVER靶位点杂交的荧光探针的Drop-off测定来测量针对被递送至小鼠的Cas-CLOVER和Cas-CLOVER S44P mRNA所观察到的基因编辑程度。在经治疗的小鼠的肝脏中psck9基因座处的野生型Cas-CLOVER和Cas-CLOVER S44P的插入缺失百分比在表6中示出。
表6.在小鼠肝脏中Pcsk9基因座处的插入缺失百分比
浓度(mg/kg) PBS对照 Cas-CLOVER WT Cas-CLOVER S44P
1.0 0 15 29
如表6所示，与野生型Cas-CLOVER相比，携带S44P突变的Cas-CLOVER引起插入缺失百分比增加至约1.9倍，这表明S44P突变体的体内活性得到改善。
C.随访研究
向成年雌性BALB/C小鼠(n＝2/组)静脉内共施用一对靶向psck9的gRNA(SEQ IDNO:59和SEQ ID NO:60)以及编码5'-CleanCap-5MeC-Cas-CLOVER(SEQ ID NO:69)或5'-CleanCap-5MeC-Cas-CLOVER S44P(SEQ ID NO:70)的mRNA，该mRNA以0.75mg/kg或1.5mg/kg在实例2A中的LNP组合物中配制。将一组小鼠用作为阴性对照的媒介物(PBS,ThermoFisher Scientific,USA)进行处理。
施用后七天，将小鼠安乐死，并且从来自每个组中的小鼠的五种组织类型中分离DNA：肝脏、心脏、脾脏、肺和肾脏。简而言之，将肝活检在安乐死后切除，在液氮中快速冷冻，与裂解缓冲液(在200μL裂解缓冲液中的15mg组织+10μL蛋白酶K)混合，并且使用Triple-Pure锆珠(Fisher Scientific)在TissueLyser II(Qiagen)中粉碎。将匀浆组织在56℃下孵育30分钟，并且根据制造商的说明，使用来自New England Biolabs的Monarch基因组DNA纯化试剂盒来进行柱纯化。在50μL的洗脱缓冲液(10mM Tris-Cl,pH 8.5)中进行最终DNA洗脱。通过测量260nm和280nm处的吸光度来评估DNA样品的浓度和纯度。
通过Droplet Digital PCR(ddPCR)使用含有与Cas-CLOVER靶位点杂交的荧光探针的Drop-off测定来测量针对被递送至小鼠的Cas-CLOVER和Cas-CLOVER S44P mRNA所观察到的基因编辑程度。在经治疗的小鼠的肝脏中psck9基因座处的野生型Cas-CLOVER和Cas-CLOVER S44P的插入缺失百分比在表7中示出。
表7.在小鼠肝脏的pcsk9基因座处的插入缺失百分比
浓度(mg/kg) PBS对照 Cas-CLOVER WT Cas-CLOVER S44P
0.75 0 0.2 8.0
1.5 0 11.4 33.8
如表7所示，与野生型Cas-CLOVER相比，携带S44P突变的Cas-CLOVER引起插入缺失百分比增加至约3倍至40倍之间，这表明S44P突变体的体内活性得到改善。

Claims (16)

1.一种多肽，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列。
2.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1所述的多肽。
3.一种载体，其包含根据权利要求2所述的多核苷酸。
4.一种药物组合物，其包含：根据权利要求3所述的载体；以及至少一种药用赋形剂或稀释剂。
5.一种修饰多个细胞的基因组中的靶序列的方法，所述方法包括向未经修饰的细胞的群体引入组合物，所述组合物包含：
a)多肽，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列；或多核苷酸，其编码SEQ ID NO:35的多肽；以及
b)至少一种指导RNA(gRNA)，
从而在所述基因组中的所述靶序列处生成修饰，并且
其中与引入有包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的多肽或编码SEQ ID NO:10的多肽的多核苷酸的组合物的多个经修饰的细胞相比，1.1倍至50倍的所述多个细胞包含在所述基因组中的所述靶序列处的所述修饰。
6.根据权利要求5所述的方法，其中与引入有包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的多肽或编码SEQ ID NO:10的多肽的多核苷酸的组合物的多个经修饰的细胞相比，1.2倍至1.8倍的所述多个细胞包含在所述基因组中的所述靶序列处的所述修饰。
7.根据权利要求5所述的方法，其中与引入有包含含有SEQ ID NO:10的氨基酸序列的多肽或编码SEQ ID NO:10的多肽的多核苷酸的组合物的多个经修饰的细胞相比，3倍至40倍的所述多个细胞包含在所述基因组中的所述靶序列处的所述修饰。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中在所述基因组中的所述靶序列处的所述修饰为缺失、插入、取代、倒位和/或重定位。
9.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中将所述组合物包封在至少一种脂质纳米颗粒中，所述至少一种脂质纳米颗粒包含：
按摩尔计约40.75％的HMA-404的化合物，
按摩尔计约51.75％的胆固醇，
按摩尔计约5％的DOPC，以及
按摩尔计约2.5％的DMG-PEG2000；
其中HMA-404在以下结构中示出：
其中编码SEQ ID NO:35的多肽的多核苷酸为RNA分子，并且其中至少一种纳米颗粒中的脂质与RNA分子的比率为约120:1(w/w)。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的方法，其中所述多个细胞包括：
(a)肝脏细胞，优选地其中所述肝脏细胞为肝细胞、肝星状细胞、库普弗细胞或肝窦内皮细胞；
(b)T细胞，优选地其中所述T细胞为活化T细胞、静息T细胞或记忆T干细胞(TSCM细胞)；或
(c)造血干细胞(HSC)。
11.一种细胞，其根据权利要求2至10中任一项所述的方法被修饰。
12.一种组合物，其包含根据权利要求5至10所述的方法修饰的细胞的群体。
13.一种治疗有需要的受试者的至少一种疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者施用至少一种治疗有效量的根据权利要求4所述的药物组合物、根据权利要求11所述的细胞或根据权利要求12所述的组合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述至少一种疾病或病症为肝脏疾病或病症，优选地其中所述肝脏疾病或病症为：
(a)代谢性肝脏病症；
(b)尿素循环病症(UCD)，优选地其中所述UCD为N-乙酰谷氨酸合成酶(NAGS)缺乏症、氨基甲酰磷酸合成酶I缺乏症(CPSI缺乏症)、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)缺乏症、精氨基琥珀酸合成酶缺乏症(ASSD)(瓜氨酸血症I)、希特林蛋白缺乏症(瓜氨酸血症II)、精氨基琥珀酸裂解酶缺乏症(精氨基琥珀酸尿症)、精氨酸酶缺乏症(高精氨酸血症)、鸟氨酸转位酶缺乏症(HHH综合征)或其任何组合。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述至少一种疾病或病症为癌症。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述至少一种疾病或病症为血友病A。
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