CN121057574A - 用于预防和/或治疗皮肤色素沉着的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了用于皮肤增亮以及用于预防和/或治疗皮肤色素沉着障碍的组合物。本文还提供了用于预防和/或治疗皮肤色素沉着障碍、用于抑制表皮黑素细胞中黑色素产生和/或促进真皮成纤维细胞中黑色素降解的方法和用途，以及用于提亮肤色的非治疗性方法。

Description

用于预防和/或治疗皮肤色素沉着的组合物和方法

技术领域

本公开涉及用于预防和/或治疗皮肤色素沉着障碍以及用于非治疗性皮肤增亮的组合物。本公开还涉及用于治疗皮肤色素沉着障碍、用于抑制表皮黑素细胞中黑色素产生和/或促进真皮成纤维细胞中黑色素降解的方法和用途，以及用于皮肤增亮的非治疗性方法。

背景技术

黑色素生成是由黑素细胞在黑素体中发生的过程，涉及一系列酶促和化学反应以产生黑色素色素，所述过程主要发生在皮肤的表皮层。皮肤色素沉着过度是人类中常见的病症，主要由不受控的黑色素生成导致黑色素过度合成和储存引起。黑色素产生增加可由多种因素触发，包括过度日晒、荷尔蒙变化、皮肤炎症和年龄，以及许多其他生物过程(Nieuweboer-Krobotova,2013)。

由太阳的UVA和UVB射线以及高能可见光引起的氧化应激是日晒引起的皮肤色素沉着过度的主要原因，其导致皮肤上出现小而颜色加深的斑点，称为日晒斑。主要在面部出现的较大色素沉着斑块，称为黄褐斑，在女性中尤为常见，据认为是在性激素(如雌激素和孕酮)刺激黑色素过度产生时发生，日晒也会加剧这种情况。炎症后色素沉着是指由于炎症爆发或皮肤损伤导致不受控的黑色素生成过程而引起的皮肤变暗。这些以及其他色素沉着性皮肤病症可显著影响个体的外观，并可能导致情绪和心理困扰以及生活质量下降。

皮肤包括多层，包括表皮(外层)、真皮和皮下层。这些层的结构依赖于由各种细胞类型和大分子组成的复杂生物网络的形成和维持。分隔表皮层和真皮层的是基底膜，表皮基底细胞附着于其上。构成细胞外基质中大分子的主要蛋白质家族包括：胶原蛋白、弹性蛋白、粘附糖蛋白和蛋白聚糖(Lattouf et al.,2014)，它们在皮肤的弹性、紧致度和结构中发挥作用。

由于色素沉着过度这一重要问题，对黑色素生成抑制剂的需求不断增长。许多现有的局部色素沉着过度治疗基于加速表皮更新，其依赖于从皮肤外层去除黑色素。此类治疗包括去角质剂(exfoliating agent)(例如AHA或BHA)、起到抑制黑色素合成之作用的抗色素沉着过度剂(包括曲酸和氢醌)、起到延缓黑素体从黑素细胞转移到角质形成细胞之作用的黑素体阻滞剂(例如烟酰胺)，以及起到延缓皮肤炎症之作用的抗炎剂(例如硬脂醇甘草亭酸酯)，以及任意上述剂的组合。

尽管上述局部治疗在提亮肤色方面有效，但它们在治疗色素沉着障碍方面通常效果较差。这是由于它们的作用方式主要作用于表皮黑变病。此外，目前市场上许多用于治疗色素沉着过度的产品可能含有与潜在不良反应相关的成分，包括氢醌和曲酸。作为上述局部治疗的替代方案，包括采用纳秒脉冲宽度技术的调Q激光在内的面部激光治疗被认为是增亮或消除真皮黑素细胞增多症的有效方法，但这些治疗昂贵且具有侵入性(Watanabe,2014)。

仍然需要高度安全有效的抗色素沉着过度的组合物，其能够解决现有技术的一个或多个局限和缺点。

发明内容

现已发现，加强真皮-表皮连接(DEJ)有助于减少与黑素细胞色素沉着过度相关的真皮因子的移动，并减少黑素体渗漏到真皮中，从而获得更明亮的肤色。还已确定，胶原蛋白IV和胶原蛋白VII的水平与改善的DEJ结构完整性呈正相关。进一步发现，活性剂：N-乙酰-L-谷氨酰胺酰-L-α-天冬氨酰-L-缬氨酰-L-组氨酸(乙酰四肽-9)和N-乙酰-L-脯氨酰-L-脯氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酸(乙酰四肽-11)的组合，或N-乙酰-L-丙氨酰-L-亮氨酰-L-组氨酰-L-赖氨酰-L-缬氨酰-L-赖氨酰胺(乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐)，增强DEJ中胶原蛋白IV和胶原蛋白VII的产生。还已确定，当将抗坏血酸衍生物与所述肽一起施用时，实现了协同效应，在改善DEJ结构完整性时，在减少皮肤色素沉着方面提供优异的效果。

因此，在第一方面，提供用于预防和/或治疗皮肤色素沉着过度障碍和/或美容皮肤美白的组合物，所述组合物包含：

a)N-乙酰-L-谷氨酰胺酰-L-α-天冬氨酰-L-缬氨酰-L-组氨酸(乙酰四肽-9)或其盐，和N-乙酰-L-脯氨酰-L-脯氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酸(乙酰四肽-11)或其盐；以及

b)抗坏血酸衍生物或其盐；

其中，N-乙酰-L-谷氨酰胺酰-L-α-天冬氨酰-L-缬氨酰-L-组氨酸或其盐与N-乙酰-L-脯氨酰-L-脯氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酸或其盐的重量比为10:1至1:10。

在一些实施方案中，组分a)中存在的活性剂以N-乙酰-L-谷氨酰胺酰-L-α-天冬氨酰-L-缬氨酰-L-组氨酸与N-乙酰-L-脯氨酰-L-脯氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酸的重量比为5:1至1:5存在，或者任选地以N-乙酰-L-谷氨酰胺酰-L-α-天冬氨酰-L-缬氨酰-L-组氨酸与N-乙酰-L-脯氨酰-L-脯氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酸的重量比为2:1至1:2存在。

在一些实施方案中，组分b)选自下组：3-O-乙基抗坏血酸、2-O-乙基抗坏血酸、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸四异棕榈酸酯、抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸磷酸酯钠、辛酰基2-甘油基抗坏血酸酯、3-甘油基抗坏血酸酯、双甘油基抗坏血酸酯、己基3-甘油基抗坏血酸酯、肉豆蔻基3-甘油基抗坏血酸酯和月桂基甘油基抗坏血酸酯。在一些实施方案中，组分b)是3-O-乙基抗坏血酸。在其他实施方案中，组分b)是抗坏血酸葡糖苷。

在一些实施方案中，组分a)中存在的活性剂N-乙酰-L-谷氨酰胺酰-L-α-天冬氨酰-L-缬氨酰-L-组氨酸和N-乙酰-L-脯氨酰-L-脯氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酸各自独立地以下列量存在于所述组合中：所述组合物重量的0.0001％至1％，任选地所述组合物重量的0.0005％至0.005％，任选地所述组合物重量的0.001％至0.002％。

在一些实施方案中，组分b)的存在量为所述组合物重量的0.1％至10％，任选地所述组合物重量的0.2％至8％，任选地所述组合物重量的1％至2％。

在一些实施方案中，所述组合物不含除组分a)和b)之外的任何抗色素沉着过度剂。

在一些实施方案中，所述组合物用于局部施用。

在一些实施方案中，所述组合物包含一种或多种药学上或化妆品上合适的赋形剂。

在一些实施方案中，所述组合物包含以下一种或多种：抗炎剂、防晒剂、抗氧化剂、脱屑剂(desquamation agent)和去角质剂。

在一些实施方案中，所述组合物呈霜剂、洗剂、精华液、糊剂、蜡、液体、半固体组合物或可喷雾组合物的形式。

在第二方面，提供预防、治疗和/或减少个体的与皮肤色素沉着障碍相关的症状的方法，或者抑制个体的表皮黑素细胞中黑色素产生和/或促进个体的真皮成纤维细胞中黑色素降解的方法，或者用于个体的皮肤美白和/或增亮的非治疗性方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如所述第一方面所定义的组合物。

在第三方面，提供如本文所定义的所述第一方面的组合物用于制备药物的用途，所述药物用于预防、治疗和/或减少与皮肤色素沉着障碍相关的症状，或者用于抑制表皮黑素细胞中黑色素产生和/或促进真皮成纤维细胞中黑色素降解。

在第四方面，提供如本文所定义的所述第一方面的组合物，其用于预防、治疗和/或减少与皮肤色素沉着障碍相关的症状，或者用于抑制表皮黑素细胞中黑色素产生和/或促进真皮成纤维细胞中黑色素降解。

在第五方面，提供用于预防和/或治疗皮肤色素沉着过度障碍和/或美容皮肤美白的组合物，所述组合物包含：

a)N-乙酰-L-丙氨酰-L-亮氨酰-L-组氨酰-L-赖氨酰-L-缬氨酰-L-赖氨酰胺(乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐)或其盐；以及

b)抗坏血酸或者其衍生物和/或其盐。

在一些实施方案中，所述组分b)选自下组：3-O-乙基抗坏血酸、2-O-乙基抗坏血酸、L-抗坏血酸、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸四异棕榈酸酯、抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸磷酸酯钠、辛酰基2-甘油基抗坏血酸酯、3-甘油基抗坏血酸酯、双甘油基抗坏血酸酯、己基3-甘油基抗坏血酸酯、肉豆蔻基3-甘油基抗坏血酸酯和月桂基甘油基抗坏血酸酯。在一些实施方案中，组分b)是抗坏血酸葡糖苷。在一些实施方案中，组分b)是3-O-乙基抗坏血酸。

在一些实施方案中，组分a)的存在量为所述组合物重量的0.0001％至1％，任选地所述组合物重量的0.0005％至0.005％，任选地所述组合物重量的0.001％至0.002％。

在一些实施方案中，组分b)的存在量为所述组合物重量的0.1％至10％，任选地所述组合物重量的0.5％至8％，任选地所述组合物重量的1％至2％。

在一些实施方案中，所述第五方面的组合物用于局部施用。

在一些实施方案中，所述第五方面的组合物包含一种或多种药学上或化妆品上合适的赋形剂。

在一些实施方案中，所述第五方面的组合物包含以下一种或多种：抗炎剂、防晒剂、抗氧化剂、脱屑剂和去角质剂。

在一些实施方案中，所述第五方面的组合物呈霜剂、洗剂、精华夜、糊剂、蜡、液体、半固体组合物或可喷雾组合物的形式。

在第六方面，提供预防、治疗和/或减少个体的与皮肤色素沉着障碍相关的症状的方法，或者抑制个体的表皮黑素细胞中黑色素产生和/或促进个体的真皮成纤维细胞中黑色素降解的方法，或者用于个体的皮肤美白和/或增亮的非治疗性方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的N-乙酰-L-丙氨酰-L-亮氨酰-L-组氨酰-L-赖氨酰-L-缬氨酰-L-赖氨酰胺(乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐)或其盐。

在第七方面，提供N-乙酰-L-丙氨酰-L-亮氨酰-L-组氨酰-L-赖氨酰-L-缬氨酰-L-赖氨酰胺(乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐)或其盐用于制备药物的用途，所述药物用于预防、治疗和/或减少与皮肤色素沉着障碍相关的症状，或者用于抑制表皮黑素细胞中黑色素产生和/或促进真皮成纤维细胞中黑色素降解。

在第八方面，提供N-乙酰-L-丙氨酰-L-亮氨酰-L-组氨酰-L-赖氨酰-L-缬氨酰-L-赖氨酰胺(乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐)或其盐，其用于预防、治疗和/或减少与皮肤色素沉着障碍相关的症状，或者用于抑制表皮黑素细胞中黑色素产生和/或促进真皮成纤维细胞中黑色素降解。

在第九方面，提供预防、治疗和/或减少个体的与皮肤色素沉着障碍相关的症状的方法，或者抑制个体的黑色素产生和/或促进个体的真皮成纤维细胞中黑色素降解的方法，或者用于个体的皮肤美白和/或增亮的非治疗性方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如本文所定义的第五方面的组合物。

在第十方面，提供如本文所定义的第五方面的组合物用于制备药物的用途，所述药物用于预防、治疗和/或减少与皮肤色素沉着障碍相关的症状，或者用于抑制表皮黑素细胞中黑色素产生和/或促进真皮成纤维细胞中黑色素降解。

在第十一方面，提供如本文所定义的第五方面的组合物，其用于预防、治疗和/或减少与皮肤色素沉着障碍相关的症状，或者用于抑制表皮黑素细胞中黑色素产生和/或促进真皮成纤维细胞中黑色素降解。

在一些实施方案中，当如本文所定义的方法、用途或组合物用于预防和/或治疗皮肤色素沉着过度障碍时，所述障碍选自下组：皮肤色素沉着过度、黄褐斑、日光性雀斑样痣、太田痣、伊藤痣和先天性真皮黑素细胞增多症。

具体实施方式

定义

除非另有具体定义，否则本文使用的所有技术和科学术语应被认为具有与本领域(例如，化学、生物学等)普通技术人员的通常理解相同的含义。

本公开提及某些文件的全部内容通过引用并入本文。如果本公开的教导与那些文件的内容之间存在任何不一致的教导，则以本公开的教导为准。

应理解，如果本文提及任何现有技术出版物，此类提及并不构成承认所述出版物构成本领域普通常识的一部分。

如本文所用，术语“和/或”，例如“X和/或Y”应理解为意指“X和Y”或“X或Y”，并应理解为明确支持两种含义或任一种含义。

如本文所用，术语“约”，除非另有说明，是指所指定值的+/-10％。

在整个说明书中，除非另有具体说明或上下文另有要求，对单个步骤、物质组成、步骤之组或物质组成之组的提及应被理解为包含那些步骤、物质组成、步骤之组或物质组成之组中的一个和多个(即一个或多个)。因此，如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数方面，除非上下文另有明确规定。例如，提及“一个”包括单个以及两个或更多个；提及“一种”包括单种以及两种或更多种；提及“该”包括单个以及两个或更多个，依此类推。

除非另有说明，本文中使用的术语如“第一”、“第二”等仅用作标签，并不旨在对所引用的项目施加顺序、位置或层次要求。此外，提及“第二”项目并不要求或排除编号较低的项目(例如，“第一”项目)和/或编号较高的项目(例如，“第三”项目)的存在。

如本文所用，短语“……中的至少一个”，当与一列项目一起使用时，意指所列项目中的一个或多个的不同组合可以被使用，并且可能仅需要所述列表中项目中的一个。所述项目可以是特定对象、事物或类别。换句话说，“……中的至少一个”意指可以使用来自所述列表的任何项目组合或任何数量的项目，但并非所述列表中的所有项目都是必需的。例如，“项目A、项目B和项目C中的至少一个”可以意指项目A；项目A和项目B；项目B；项目A、项目B和项目C；或项目B和项目C。在某些情况下，“项目A、项目B和项目C中的至少一种”可以意指，例如但不限于，两个项目A、一个项目B和十个项目C；四个项目B和七个项目C；或某些其他合适的组合。

如本文所用，“包含(comprise)”一词及其其他形式，例如“包含(comprising)”和“包含(comprises)”，意指包括但不限于，并且并非旨在排除例如其他添加剂、组分、整数或步骤。

如本文所用，术语“个体”是指易患疾病或病症的任何生物体。例如，所述个体可以是动物、哺乳动物、灵长类动物、家畜(例如，绵羊、牛、马、猪)、伴侣动物(例如，狗、猫)或实验动物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠、仓鼠)。在一个实施方案中，所述个体是哺乳动物。在一个实施方案中，所述个体是人。在一个实施方案中，所述个体是非人动物。

如本文所用，术语“治疗”包括减轻与特定障碍或病症相关的症状。

如本文所用，术语“预防”包括预防特定障碍或病症。

如本文所用，术语“抗色素沉着过度剂”是指具有抑制黑色素生成活性的剂。不希望受理论束缚，所述抑制活性可以例如通过抑制酪氨酸酶活性或其蛋白质表达起作用。酪氨酸酶是一种存在于植物和动物组织中的含铜酶，其通过氧化催化酪氨酸产生黑色素和其他色素。

本公开还包括本说明书中提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物(单独或共同地)，以及所述步骤或特征的任何和所有组合、或其中的任何两种或更多种。

除非另有具体说明或上下文另有要求，否则本文描述的本公开的每个实施方案相应地适用于其他每一个实施方案。

组合物

如上所述，本公开涉及这样的组合物，其可用于预防和/或治疗皮肤色素沉着障碍，和/或可用于非治疗性目的(例如美容皮肤美白和/或增亮)，例如通过抑制表皮黑素细胞中黑色素产生和/或促进真皮成纤维细胞中黑色素降解。所述组合物含有特定的肽或肽组合，当与抗坏血酸、或者其衍生物和/或其盐组合使用时，可出乎意料地有效减少表皮和真皮黑色素。

申请人出乎意料地发现，与增强皮肤光滑度和紧致度相关的抗衰老剂可有效减少皮肤色素沉着，并且当与抗坏血酸衍生物组合使用时特别有效。已确定胶原蛋白IV和VII表达增加、真皮-表皮连接加强和皮肤色素沉着减少之间存在相关性。总之，已发现本文公开的抗黑色素生成剂促进成纤维细胞产生胶原蛋白IV和VII以加强真皮-表皮连接，从而抑制黑素细胞中由真皮因子诱导的黑色素生成以及黑素体从表皮渗漏到真皮。

因此，在第一方面，提供用于预防和/或治疗皮肤色素沉着过度障碍和/或美容皮肤美白的组合物，所述组合物包含：

a)N-乙酰-L-谷氨酰胺酰-L-α-天冬氨酰-L-缬氨酰-L-组氨酸(乙酰四肽-9)或其盐和N-乙酰-L-脯氨酰-L-脯氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酸(乙酰四肽-11)或其盐；以及

b)抗坏血酸衍生物或其盐；

其中，N-乙酰-L-谷氨酰胺酰-L-α-天冬氨酰-L-缬氨酰-L-组氨酸或其盐与N-乙酰-L-脯氨酰-L-脯氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酸或其盐的重量比为10:1至1:10。

有利地，本发明人已表明，N-乙酰-L-谷氨酰胺酰-L-α-天冬氨酰-L-缬氨酰-L-组氨酸和N-乙酰-L-脯氨酰-L-脯氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酸以及3-O-乙基抗坏血酸在真皮黑素细胞增多症的皮肤模型中协同作用以抑制表皮中的黑色素生成活性，进而减少内化黑素体的成纤维细胞中的黑色素含量，并增加胶原蛋白IV和胶原蛋白VII的表达，从而加强真皮-表皮连接。

第一方面的组合物包含肽N-乙酰-L-谷氨酰胺酰-L-α-天冬氨酰-L-缬氨酰-L-组氨酸(乙酰四肽-9)和N-乙酰-L-脯氨酰-L-脯氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酸(乙酰四肽-11)。这些肽可以通过任何合适的途径制备，并且例如从(US2019/0336429)中已知。

该肽可以通过任何合适的方式制备，或从商业来源获得。用于获得该肽的商业来源包括但不限于巴斯夫(BASF)(商品名：)。

N-乙酰-L-谷氨酰胺酰-L-α-天冬氨酰-L-缬氨酰-L-组氨酸的化学结构如下所示：

N-乙酰-L-脯氨酰-L-脯氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酸的化学结构如下所示：

在一些实施方案中，使用乙酰四肽-9。在一些实施方案中，使用乙酰四肽-9的盐形式。

在一些实施方案中，使用乙酰四肽-11。在一些实施方案中，使用乙酰四肽-11的盐形式。

合适的盐包括与有机酸或无机酸或者有机酸或无机碱形成的盐。示例性酸加成盐包括但不限于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸式磷酸盐、异烟酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸式柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、单宁酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡糖酸盐、葡糖醛酸盐、糖二酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即1,1′-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐)。示例性碱加成盐包括但不限于铵盐、碱金属盐(例如钾盐和钠盐)、碱土金属盐(例如钙盐和镁盐)以及与有机碱形成的盐，所述有机碱例如二环己胺、N-甲基-D-葡糖胺、吗啉、硫代吗啉、哌啶、吡咯烷、单-、二-或三-低级烷基胺(例如乙基-、叔丁基-、二乙基-、二异丙基-、三乙基-、三丁基-或二甲基-丙基胺，或单-、二-或三-羟基低级烷基胺，例如单-、二-或三乙醇胺。

所述第一方面的组合物包含抗坏血酸衍生物和/或其盐。在一些实施方案中，使用抗坏血酸衍生物。在一些实施方案中，使用抗坏血酸盐。在一些实施方案中，使用抗坏血酸衍生物的盐。

抗坏血酸衍生物和/或其盐的实例包括3-O-乙基抗坏血酸(3-EAA)、2-O-乙基抗坏血酸、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸四异棕榈酸酯、抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸磷酸酯钠、辛酰基-2-甘油基抗坏血酸酯、3-甘油基抗坏血酸酯、双甘油基抗坏血酸酯、己基3-甘油基抗坏血酸酯、肉豆蔻基3-甘油基抗坏血酸酯和月桂基甘油基抗坏血酸酯。

在所述第一方面的一些实施方案中，所述抗坏血酸衍生物和/或其盐是3-O-乙基抗坏血酸(3-EAA)。3-O-乙基抗坏血酸的化学结构如下所示：

3-O-乙基抗坏血酸可以通过任何合适的方式制备，或从商业来源获得。获得3-O-乙基抗坏血酸的商业来源包括但不限于日本精细化学株式会社(Nippon Fine ChemicalCo.Ltd.)(商品名：抗坏血酸乙酯)、Corum Inc.(商品名：Et-VCTM)、Kimika,LLC(商品名：Neosome OL EAA)、Sigma-Aldrich和Naturalis SRL(商品名：Nio-VCS)。

在所述第一方面的一些实施方案中，所述抗坏血酸衍生物和/或其盐是抗坏血酸葡糖苷。抗坏血酸葡糖苷的化学结构如下所示：

抗坏血酸葡糖苷可以通过任何合适的方式制备，或从商业来源获得。获得抗坏血酸葡糖苷的商业来源包括但不限于Sigma-Aldrich、DKSH(商品名：AA2G)、SpecChem(商品名：SpecWhite 02)、Macrocare(商品名：V2G)、Kimika,LLC(商品名：iVit Glucoside C)等。

N-乙酰-L-谷氨酰胺酰-L-α-天冬氨酰-L-缬氨酰-L-组氨酸(乙酰四肽-9)或其盐与N-乙酰-L-脯氨酰-L-脯氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酸(乙酰四肽-11)或其盐的重量比范围为10:1至1:10。

在一些实施方案中，乙酰四肽-9与乙酰四肽-11的重量比为10:1至1:10，或9:1至1:9，或8:1至1:8，或7:1至1:7，或6:1至1:6，或5:1至1:5，或4:1至1:4，或3:1至1:3，或2:1至1:2，或约1:1。在一些实施方案中，乙酰四肽-9与乙酰四肽-11的重量比为1:1至1:1.5，或1:1.1至1:1.3，或约1:1.2。

在一些实施方案中，乙酰四肽-9以下列量存在于所述组合物中：所述组合物重量的0.00001％至1％，或所述组合物重量的0.00001％至0.01％，或所述组合物重量的0.00035％至0.0013％，或所述组合物重量的0.0009％至0.0011％，或所述组合物重量的约0.001％。

在一些实施方案中，乙酰四肽-11以下列量存在于所述组合物中：所述组合物重量的0.00001％至1％，或所述组合物重量的0.00001％至0.01％，或所述组合物重量的0.000525％至0.00165％，或所述组合物重量的0.0009％至0.0014％，或所述组合物重量的约0.0012％。

在一些实施方案中，乙酰四肽-9以所述组合物重量的0.00001％至1％的量存在于所述组合物中，且乙酰四肽-11以所述组合物重量的0.00001％至1％的量存在于所述组合物中。在一些实施方案中，乙酰四肽-9以所述组合物重量的0.00001％至0.01％的量存在于所述组合物中，且乙酰四肽-11以所述组合物重量的0.00001％至0.01％的量存在于所述组合物中。在一些实施方案中，乙酰四肽-9以所述组合物重量的0.00035％至0.0013％的量存在于所述组合物中，且乙酰四肽-11以所述组合物重量的0.000525％至0.00165％的量存在于所述组合物中。在一些实施方案中，乙酰四肽-9以所述组合物重量的0.0009％至0.0011％的量存在于所述组合物中，且乙酰四肽-11以所述组合物重量的0.0009％至0.0014％的量存在于所述组合物中。在一些实施方案中，乙酰四肽-9以所述组合物重量的约0.001％的量存在于所述组合物中，且乙酰四肽-11以所述组合物重量的约0.0012％的量存在于所述组合物中。

在一些实施方案中，所述组合物包含抗坏血酸衍生物和/或其盐，其量为：所述组合物重量的0.01％至20％，或所述组合物重量的0.1％至10％，或0.1％至9％，或0.1％至8％，或0.1％至7％，或0.1％至6％，或0.1％至5％，或0.2％至10％，或0.2％至9％，或0.2％至8％，或0.5％至8％，或0.5％至5％，或0.5％至3％，或0.5％至2.5％，或0.5％至2％，或1％至2％，或约0.5％，或约1％。

在一些实施方案中，本公开的组合物包含3-O-乙基抗坏血酸，其量为：所述组合物重量的0.1％至10％，或0.1％至9％，或0.1％至8％，或0.1％至7％，或0.1％至6％，或0.1％至5％，或0.2％至10％，或0.2％至9％，或0.2％至8％，或0.5％至8％，或0.5％至5％，或0.5％至3％，或0.5％至2.5％，或0.5％至2％，或1％至2％。

在一些实施方案中，本公开的组合物包含抗坏血酸葡糖苷，其量为：所述组合物重量的0.1％至10％，或0.1％至9％，或0.1％至8％，或0.1％至7％，或0.1％至6％，或0.1％至5％，或0.2％至10％，或0.2％至9％，或0.2％至8％，或0.5％至8％，或0.5％至5％，或0.5％至3％，或0.5％至2.5％，或0.5％至2％，或1％至2％。

在一些实施方案中，乙酰四肽-9以所述组合物重量的0.0009％至0.0011％的量存在于所述组合物中，乙酰四肽-11以所述组合物重量的0.0009％至0.0014％的量存在于所述组合物中，并且3-O-乙基抗坏血酸以按重量计0.5％至2％的量存在。

在一些实施方案中，乙酰四肽-9以所述组合物重量的约0.001％的量存在于所述组合物中，乙酰四肽-11以所述组合物重量的约0.0012％的量存在于所述组合物中，并且3-O-乙基抗坏血酸以按重量计约0.5％或按重量计约1％的量存在。在一些实施方案中，乙酰四肽-9以所述组合物重量的0.0009％至0.0011％的量存在于所述组合物中，乙酰四肽-11以所述组合物重量的0.0009％至0.0014％的量存在于所述组合物中，并且抗坏血酸葡糖苷以按重量计0.5％至2％的量存在。

在一些实施方案中，乙酰四肽-9以所述组合物重量的约0.001％的量存在于所述组合物中，乙酰四肽-11以所述组合物重量的约0.0012％的量存在于所述组合物中，并且抗坏血酸葡糖苷以按重量计约0.5％或重量约1％的量存在。

在一些实施方案中，所述组合物包含各自独立地按重量计0.0005％至0.005％的活性剂N-乙酰-L-谷氨酰胺酰-L-α-天冬氨酰-L-缬氨酰-L-组氨酸(乙酰四肽-9)和N-乙酰-L-脯氨酰-L-脯氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酸(乙酰四肽-11)作为组分a)，并且包含0.2％至8％的3-O-乙基抗坏血酸作为组分b)，并且任选地其中组分a)与组分b)的重量比为1:16000至1:40，或1:1600至1:400，或约1:1000。

在另一个方面，提供用于预防和/或治疗皮肤色素沉着过度障碍和/或美容皮肤美白的组合物，所述组合物包含：

a)N-乙酰-L-丙氨酰-L-亮氨酰-L-组氨酰-L-赖氨酰-L-缬氨酰-L-赖氨酰胺(乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐)；以及

b)抗坏血酸或者其衍生物和/或其盐。

有利地，本发明人已表明，N-乙酰-L-丙氨酰-L-亮氨酰-L-组氨酰-L-赖氨酰-L-缬氨酰-L-赖氨酰胺(乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐)和抗坏血酸葡糖苷或其盐在真皮黑素细胞增多症的皮肤模型中协同作用，以抑制表皮中的黑色素生成活性，同时减少真皮中内化黑素体的成纤维细胞中的黑色素含量，并增加胶原蛋白IV和胶原蛋白VII的表达，从而加强真皮-表皮连接。

在一些实施方案中，使用乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐。在一些实施方案中，使用乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐的盐形式。

N-乙酰-L-丙氨酰-L-亮氨酰-L-组氨酰-L-赖氨酰-L-缬氨酰-L-赖氨酰胺(乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐)的化学结构如下所示：

该肽可以通过任何合适的方式制备，并且例如从(US2022/0062145A1)中已知。

该肽可以通过任何合适的方式制备，或从商业来源获得。用于获得该肽的商业来源包括但不限于Lipotrue(商品名：Versillin^TM)。

在一些实施方案中，乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐以下列量存在于所述组合物中：所述组合物重量的0.00001％至1％，或所述组合物重量的0.00001％至0.01％，或所述组合物重量的0.0004％至0.0015％，或所述组合物重量的0.00035％至0.0013％，或所述组合物重量的0.0009％至0.0011％，或所述组合物重量的约0.001％。

所述组合物包含抗坏血酸衍生物和/或其盐。在一些实施方案中，使用抗坏血酸衍生物。在一些实施方案中，使用抗坏血酸盐。在一些实施方案中，使用抗坏血酸衍生物的盐。

抗坏血酸衍生物和/或其盐的实例包括3-O-乙基抗坏血酸(3-EAA)、2-O-乙基抗坏血酸、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸四异棕榈酸酯、抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸磷酸酯钠、辛酰基-2-甘油基抗坏血酸酯、3-甘油基抗坏血酸酯、双甘油基抗坏血酸酯、己基3-甘油基抗坏血酸酯、肉豆蔻基3-甘油基抗坏血酸酯和月桂基甘油基抗坏血酸酯。

在一些实施方案中，所述抗坏血酸衍生物和/或其盐是3-O-乙基抗坏血酸(3-EAA)。

在一些实施方案中，所述抗坏血酸衍生物和/或其盐是抗坏血酸葡糖苷。

在一些实施方案中，所述组合物包含下列量的抗坏血酸衍生物和/或其盐：所述组合物重量的0.01％至20％，或所述组合物重量的0.1％至10％，或0.1％至9％，或0.1％至8％，或0.1％至7％，或0.1％至6％，或0.1％至5％，或0.2％至10％，或0.2％至9％，或0.2％至8％，或0.5％至8％，或0.5％至5％，或0.5％至3％，或0.5％至2.5％，或0.5％至2％，或1％至2％，或约0.5％，或约1％。

在一些实施方案中，本公开的组合物包含下列量的3-O-乙基抗坏血酸：所述组合物重量的0.1％至10％，或0.1％至9％，或0.1％至8％，或0.1％至7％，或0.1％至6％，或0.1％至5％，或0.2％至10％，或0.2％至9％，或0.2％至8％，或0.5％至8％，或0.5％至5％，或0.5％至3％，或0.5％至2.5％，或0.5％至2％，或1％至2％。

在一些实施方案中，本公开的组合物包含下列量的抗坏血酸葡糖苷：所述组合物重量的0.1％至10％，或0.1％至9％，或0.1％至8％，或0.1％至7％，或0.1％至6％，或0.1％至5％，或0.2％至10％，或0.2％至9％，或0.2％至8％，或0.5％至8％，或0.5％至5％，或0.5％至3％，或0.5％至2.5％，或0.5％至2％，或1％至2％。

在一些实施方案中，乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐以所述组合物重量的0.0009％至0.0011％的量存在于所述组合物中，并且3-O-乙基抗坏血酸以按重量计0.5％至2％的量存在。

在一些实施方案中，乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐以所述组合物重量的约0.001％的量存在于所述组合物中，并且3-O-乙基抗坏血酸以按重量计约0.5％或按重量计约1％的量存在。

在一些实施方案中，乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐以所述组合物重量的0.0009％至0.0011％的量存在于所述组合物中，并且抗坏血酸葡糖苷以按重量计0.5％至2％的存在。

在一些实施方案中，乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐以所述组合物重量的约0.001％的量存在于所述组合物中，并且抗坏血酸葡糖苷以按重量计约0.5％或按重量计约1％的量存在。

在一些实施方案中，所述组合物包含各自独立地按重量计0.0005％至0.005％的活性剂N-乙酰-L-丙氨酰-L-亮氨酰-L-组氨酰-L-赖氨酰-L-缬氨酰-L-赖氨酰胺(乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐)作为组分a)，并且包含0.2％至8％的抗坏血酸葡糖苷作为组分b)，并且任选地其中组分a)与组分b)的重量比1:16,000至1:40，或1:1600至1:400，或约1:1000。

在所述组合物的一些实施方案中，所述组合物可包括其他加强真皮-表皮连接完整性的组分。实例包括棕榈酰三肽-38、棕榈酰三肽-5、肌肽、棕榈酰三肽-1、棕榈酰四肽-7、环四肽-24氨基环己烷甲酸酯、三肽-10瓜氨酸和棕榈酰五肽-4。

在一些实施方案中，所述组合物可包含类视黄醇和/或其衍生物(例如，triretinoin、视黄醇、视黄醛、视黄酯、羟基频哪酮视黄酸酯)。

在一些实施方案中，所述组合物可包含烟酰胺和/或其衍生物。

在一些实施方案中，所述组合物可包含腺苷和/或其衍生物。

在一些实施方案中，所述组合物可包含积雪草(Centella asiatica)提取物。

虽然在有些实施方案中，其他抗色素沉着过度剂和/或其他皮肤增亮剂可与组分a)和b)一起使用，但也已发现，包含a)和b)作为仅有的抗色素沉着过度剂的相对简单的配方提供了出乎意料的有效效果。因此，在一些其他实施方案中，所述组合物不含除a)和b)之外的任何抗色素沉着过度剂。在一些实施方案中，所述组合物不含除a)和b)之外的任何皮肤增亮剂。在一些实施方案中，所述组合物由或基本上由组分a)和b)以及一种或多种载体和/或赋形剂组成。

本公开的组合物可视情况加以配制以用于任何所需的给药方法。例如，本公开的组合物可配制成适合局部施用于皮肤的局部组合物。

本公开的组合物还可额外地包含其他添加剂。例如，本公开的组合物可包含已知的额外化妆品或药物物质。在一些实施方案中，所述组合物由或基本上由组分a)和b)、一种或多种载体和/或赋形剂以及任选的一种或多种不是抗色素沉着过度剂或皮肤增白剂的额外化妆品或药物物质组成。

CTFA化妆品成分手册第二版(1992年)描述了护肤行业常用的多种非限制性化妆品和药物成分，这些成分可适用于本公开的组合物中。合适的配方成分实例包括：抗氧化剂、粘合剂、生物添加剂、缓冲剂、着色剂、增稠剂、珠光剂、聚合物、收敛剂、硅酮、气味吸收剂、胶凝剂(例如亲水或亲脂胶凝剂)、香料、保湿剂、填充剂、溶剂、遮光剂、皮肤增亮剂、皮肤晒黑剂、香水、调理剂、去角质剂、增溶剂(例如甲基丙二醇)、防晒剂、维生素、着色剂、pH调节剂(例如氢氧化钠)、防腐剂(例如乙基己基甘油、苯氧乙醇或羟基苯乙酮)、流变改性剂、发泡剂、表面活性剂、润肤剂、天然提取物、精油、皮肤感觉剂、头皮舒缓剂和头皮愈合剂。

本公开的组合物还可包含其他皮肤调理剂，包括但不限于维生素或其衍生物以及含有维生素或其衍生物的大胶囊或微胶囊、化妆品肽、植物提取物、多酚化合物、防晒添加剂、防晒剂、感官添加剂或质地改良剂、天然提取物和精油。

在一些实施方案中，本公开的组合物包含以下中的一种或多种：抗炎剂、防晒剂、抗氧化剂、脱屑剂和去角质剂。所述组合物可与一种或多种其他组分一起配制，这些组分对治疗皮肤病症是有利的，例如，透明质酸和/或芦荟凝胶。

在一些实施方案中，所述组合物包含药学上或化妆品上可接受的载体或媒介物，和/或包含一种或多种赋形剂。

所述药学上或化妆品上可接受的媒介物可以是任何药学上或化妆品上可接受的媒介物，包括药学上和/或皮肤病学上可接受的载体，包括表面活性剂。药学上和/或皮肤病学上可接受的载体优选与皮肤、指甲、粘膜、组织和/或头发相容，并且可包括任何满足这些要求的常规使用的药物或皮肤病学载体。所述载体和/或媒介物可有助于将抗坏血酸、或者其衍生物和/或其盐、或抗色素沉着过度剂配制成合适的药物或化妆品制剂。本领域普通技术人员可容易地选择此类载体。载体包括但不限于润肤剂、乳化剂和流变改性剂。

适用于本公开组合物的媒介物或载体中的润肤剂包括，例如，苯甲酸C12-15烷基酯、PPG-3肉豆蔻基醚、液体石蜡和二甲硅油。适用于本公开组合物的媒介物或载体中的乳化剂包括，例如，丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、鲸蜡硬脂醇聚醚-20(Ceteareth-20)(鲸蜡硬脂醇，鲸蜡硬脂醇的聚乙二醇醚)。适用于本公开组合物的媒介物或载体中的流变改性剂包括，例如，卡波姆、聚丙烯酸甘油酯，以及丙烯酸酯/丙烯酸C10-30烷基酯(acrylates/C10-30 alkyl acrylate)交联聚合物。其他合适的载体包括但不限于矿物油、液体石蜡、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯和/或聚氧丙烯化合物、乳化蜡、失水山梨醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60(聚氧乙烯(20)失水山梨醇单硬脂酸酯)、鲸蜡酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇、透明质酸钠、透明质酸和水。

对于局部给药，本公开的组合物可以任何合适的形式提供，例如所述组合物可配制成软膏、液体、洗剂、糊剂、泡沫、喷雾剂、精华液、面膜、凝胶、水凝胶或透皮贴剂、免洗型和冲洗型洗剂或爽肤水(toner)、皮肤安瓿(skin ampoules)、皮肤清洁剂、面部和眼部卸妆液、免洗护发素或头发维生素、头发定型助剂、沐浴露/沐浴乳、洁肤皂(toilet bar)、止汗剂、除臭剂、脱毛剂、所有彩色化妆品(包括但不限于口红和粉底)、免晒美黑剂或防晒洗剂、洗发水、护发素、生发水、摩丝、凝胶、脂质体或其他局部适用的形式。

软膏和霜剂可以例如用水性或油性基质配制，并添加合适的增稠剂、乳化剂和/或胶凝剂(例如水包油乳液、油包水乳液或硅油包水乳液)。洗剂可以用水性或油性基质配制，并且通常还含有一种或多种乳化剂、稳定剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂、着色剂或防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯氧乙醇)。软膏、霜剂、洗剂等也可以配制成包含C1-3-烷氧基化油和蜡(例如，乙氧基化植物油、乙氧基化霍霍巴油/蜡、乙氧基化羊毛脂油、乙氧基化椰子油、乙氧基化可可脂)。

任何含有水的化妆品(即霜剂、凝胶、洗剂等)都有可能滋生细菌、酵母和霉菌，因此在某些实施方案中可能需要防腐剂。适用于本公开组合物的示例性防腐剂包括乙基己基甘油、苯氧乙醇、氯苯甘醚和焦亚硫酸钠。示例性润肤剂包括苯甲酸C12-15烷基酯、PPG-3肉豆蔻基醚、月桂酰基肌氨酸异丙酯、甘油和双-PEG-18甲基醚二甲基硅烷。示例性保湿剂是1,2-己二醇或甜菜碱。示例性流变改性剂包括丙烯酸羟乙酯、丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、或它们的混合物。

在一些实施方案中，本公开的组合物包含以下中的一种或多种：水、苯甲酸烷基酯、PPG-3肉豆蔻基醚、丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物、乙基己基甘油、苯氧乙醇、甲基丙二醇、甜菜碱、小核菌胶(sclerotium gum)、聚丙烯酰二甲基牛磺酸钠、EDTA二钠、透明质酸钠、双-PEG-18甲基醚二甲基硅烷、PEG-12二甲硅油、甘油、氯苯甘醚、焦亚硫酸钠、乳酸、碳酸二辛酯和聚丙烯酸酯交联聚合物-6。

本公开的组合物可以是适合局部使用的组合物。在一些实施方案中，所述组合物用于局部施用。

所述局部使用可以例如通过将组分a)和b)掺入免洗型或冲洗型产品中来实现，所述产品施用于人体主要用于改善皮肤外观和一般美学益处。本文所用的“皮肤”意在包括哺乳动物(尤其是人类)的外表面，包括皮肤、头皮和头发。本公开组合物的使用可以例如通过掺入免洗型组合物中来实现。

所述组合物可以是液体、洗剂、霜剂、泡沫、磨砂膏、凝胶、肥皂块、爽肤水的形式，或通过器具施用或通过任何材料形式的面膜、垫或贴片施用。此类组合物的非限制性实例包括免洗型皮肤洗剂和霜剂，呈水包油/硅油乳液、油/硅油包水乳液和复合型乳液、精华液、洗发水、护发素、沐浴露、洁肤皂、止汗剂、除臭剂、脱毛剂、口红、粉底、睫毛膏、防晒洗剂、软膏、喷雾剂、糊剂、摩丝、泡沫、凝胶、脂质体或其他局部适用的形式。

在一些实施方案中，本公开的组合物呈霜剂、洗剂、糊剂、蜡、液体、半固体组合物或可喷雾组合物的形式。

在所述组合物为喷雾形式的情况下，所述载体合适地是水，并且所述组合物还可包含诸如苯甲醇的防腐剂(例如，量为0.1-5重量％)、诸如丙二醇的助溶剂(例如，量为1-20重量％)和诸如PEG-40氢化蓖麻油的表面活性剂(例如，量为1-20重量％)。

在所述组合物为洗剂形式的情况下，它们可例如在合适的乳化剂存在下进一步包含水。合适的乳化剂的实例是鲸蜡硬脂醇聚醚-20(Ceteareth-20)、PEG-100硬脂酸酯、硬脂酸甘油酯、鲸蜡硬脂醇硫酸钠。所述组合物还可包含呈酯和/或烃和/或硅酮和/或植物油形式的润肤剂，以及香料、防腐剂(例如苯甲醇，含量为例如0.1％-10％)和保湿剂和/或赋形剂(例如甘油，含量为例如0.5％-10％，以及环甲硅油，含量为在0.1％-20％)。

当所述组合物为软膏形式时，它们可例如进一步包含常规软膏基质，活性成分添加至其中。所述软膏基质可以是石蜡，例如软石蜡，或软石蜡和液体石蜡的组合。也可使用其他软膏基质，例如聚亚烷基二醇(如聚乙二醇或聚丙二醇)基质。软膏组合物的其他可能组分包括乳化蜡(例如，量为1％-40％，优选5％-40％)，以及任选存在的一种或多种防腐剂。

当所述组合物为液体皂形式时，可使用任何已知的液体皂。优选的液体皂的关键成分是皂化脂肪酸，其源自棕榈仁油或椰子油。液体皂基质的pH可调节至适合局部使用的pH。

当所述组合物为无水霜剂时，可使用任何合适的霜剂基质。优选的霜剂基质是凡士林霜剂和/或天然植物油和蜡，并引入稠度因子(consistency factor)。

当所述组合物为洗发水或护发素时，除活性成分外，它们可例如还包含表面活性剂、增稠剂、pH调节剂/缓冲剂、美学添加剂、水、调理剂、防腐剂和保湿剂/维生素中的一种或多种。洗发水还可包含本领域技术人员已知的，在包含于洗发水配方中或用于治疗色素沉着障碍的药物组合中时具有某些优势的其他活性成分。洗发水可包含主要表面活性剂以提供瞬时泡沫，用于通过去除污垢和其他杂质来清洁头发。可包含次要表面活性剂以提供稳定的泡沫并降低主要表面活性剂的刺激性。可使用包含带电的亲水头基和长疏水烷基链尾的表面活性剂。表面活性剂被配置为降低污垢和头发之间界面的表面张力，并允许污垢被输送到水性介质中，从而从头发和头皮上冲洗掉。根据某些实施方案，可包含在洗发水中的表面活性剂的实例包括月桂醇聚醚硫酸酯钠(sodium laureth sulphate)、月桂醇聚醚硫酸酯铵(ammonium laureth sulfate)和椰油酰羟乙磺酸钠。助表面活性剂的实例包括椰油酰胺MEA和椰油酰胺丙基甜菜碱。合适的增稠或悬浮剂包括卡波姆和PEG 150二硬脂酸酯。可包含所述增稠剂，以在储存期间稳定洗发水和/或防止颜料和硅酮沉降或结块。合适的pH调节剂或缓冲剂包括柠檬酸、酒石酸和氢氧化钠。所述pH调节剂或缓冲剂被配置为使洗发水对皮肤温和。较低的pH值可使头发紧致并产生光泽，并保护表面活性剂免于水解，因此，所述pH值

有利地，组分a)和b)可制备成稳定的局部组合物并施用于皮肤。

因此，组分a)和/或b)可以例如以包封形式提供在所述组合物中。有利地，所述包封技术可用于保护和增强透皮递送。合适的包封技术可选自下组：脂质体、类脂质体(niosome)、纳米乳液和环糊精包合技术。合适的包封技术可通过本领域已知的任何方式生产，并不限于本公开。

包封材料可例如包含乳化剂和助乳化剂。所述乳化剂可选自具有不同脂肪链的甘油酯，包括但不限于柠檬酸甘油酯、乳酸甘油酯、肉豆蔻酸甘油酯、月桂酸甘油酯、亚油酸甘油酯、油酸甘油酯或它们的任何组合，或任何混合的脂肪酸甘油酯，包括柠檬酸酯、乳酸酯、肉豆蔻酸酯、月桂酸酯、亚油酸酯和/或油酸酯。在一个实施方案中，所述乳化剂是柠檬酸甘油酯/乳酸甘油酯/亚油酸甘油酯/油酸甘油酯(柠檬酸、乳酸、亚油酸和油酸与甘油的混合酯)。在一些实施方案中，所述助乳化剂是二聚甘油酯或多聚甘油酯，选自但不限于二聚甘油单油酸酯、多聚甘油单油酸酯、多聚甘油单亚油酸酯或它们的任何组合。在特定实施方案中，所述助乳化剂是二聚甘油单油酸酯。

如果使用，所述稳定剂可例如选自可溶解所述乳化剂的任何种类的有机物质。合适的实例包括醇或二醇，包括但不限于乙醇、异丙醇、丙二醇、戊二醇、辛乙二醇，特别是戊二醇。

治疗性和非治疗性方法及用途

本公开进一步涉及使用本文所述的组合物和剂治疗皮肤色素沉着障碍以及减少真皮成纤维细胞中黑色素的方法和用途。所述组合物可用于以安全和非侵入性方式治疗、控制、预防和改善皮肤色素沉着过度。如上所述，现已发现皮肤真皮层中的成纤维细胞参与摄取黑素体，并且黑色素可保留在成纤维细胞中并且可以较慢速度降解，从而导致肤色持续较深。有利地，本发明人的新发现已成为一种通过加强真皮-表皮连接来抑制黑素细胞中由真皮因子诱导的黑色素生成，从而治疗色素沉着过度的策略。因此，已确定抗坏血酸衍生物(如3-O-乙基抗坏血酸和抗坏血酸葡糖苷)与某些肽组合，提供优异的抗色素沉着过度特性，在减少成纤维细胞中黑色素含量方面提供优异效果。例如，已证明3-O-乙基抗坏血酸与N-乙酰-L-谷氨酰胺酰-L-α-天冬氨酰-L-缬氨酰-L-组氨酸和N-乙酰-L-脯氨酰-L-脯氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酸在人真皮黑素细胞增多症皮肤模型中协同抑制表皮中的黑色素生成活性并减少内化黑素体的成纤维细胞中的黑色素含量。

除了减少成纤维细胞中的黑色素含量外，包含抗坏血酸衍生物和/或其盐以及肽的组合物还可通过替代机制起到促进脱色的作用，所述替代机制包括但不限于自噬活性(其加速表皮和真皮皮肤层中的黑色素清除)和噬黑素细胞的吞噬活性(其有助于表皮和真皮皮肤层中的黑素体清除)。

黑素体被证明通过肌动蛋白依赖性内吞过程被真皮成纤维细胞内化。在正常的皮肤生理学中，角质形成细胞中内化的黑素体可以分化并脱落或通过去角质剂(如乙醇酸、水杨酸等)去除。然而，与表皮中的角质形成细胞不同，成纤维细胞中内化的黑素体保留在真皮中并以较慢的速度降解，这可导致持续的较深色皮肤斑点。因此，本发明人已确定，促进成纤维细胞中黑色素的清除以及通过增加胶原蛋白IV和胶原蛋白VII的表达来加强真皮-表皮连接，已成为治疗色素沉着过度的一种新策略。

有利地，在如本文所定义的方法中施用本公开的组合物显示对重建皮肤的组织活力和成纤维细胞的细胞活力具有最小的负面影响，这表明由本公开的组合物介导的，实现黑色素减少的抑制活性并非由于细胞毒性作用。

因此，在一个方面，提供预防、治疗和/或减少个体的与皮肤色素沉着障碍相关的症状的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如本文所定义的组合物。

还提供一种减少个体真皮成纤维细胞中黑色素的方法，包括向所述个体施用有效量的如本文所定义的组合物。

在另一个方面，提供如本文所定义的组合物用于制备药物的用途，所述药物用于预防、治疗和/或减少个体的与皮肤色素沉着障碍相关的症状。

还提供如本文所定义的组合物用于制备药物的用途，所述药物用于减少个体的真皮成纤维细胞中的黑色素。

在另一个方面，提供如本文所定义的组合物，其用于预防、治疗和/或减少与皮肤色素沉着障碍相关的症状。

在另一个方面，提供如本文所定义的组合物，其用于减少真皮成纤维细胞中的黑色素。

在一些实施方案中，所述组合物用于促进皮肤增亮。在一些实施方案中，所述组合物用于治疗皮肤色素沉着过度。在一些实施方案中，所述组合物通过促进胶原蛋白IV和/或胶原蛋白VII的蛋白质表达来增强真皮-表皮连接。

本公开的组合物可用于治疗皮肤色素沉着障碍，包括但不限于皮肤色素沉着过度、黄褐斑、日光性雀斑样痣、太田痣、伊藤痣和先天性真皮黑素细胞增多症、炎症后色素沉着过度或色素沉着过度、进行性色素性紫癜、黑棘皮症和色素失禁症。

在一些实施方案中，所述皮肤色素沉着障碍选自下组：皮肤色素沉着过度、黄褐斑、日光性雀斑样痣、太田痣、伊藤痣和先天性真皮黑素细胞增多症。

在一些实施方案中，所述组合物局部施用于个体的皮肤。

在一些实施方案中，所述个体是人类个体。在一些实施方案中，所述个体是成年个体。在一些实施方案中，所述个体是年龄至少30岁、至少35岁、至少40岁、至少45岁、至少50岁、至少55岁或至少60岁的人类个体。在一些实施方案中，所述个体是男性。在一些实施方案中，所述个体是女性。

本公开还涉及用于皮肤增亮的非治疗性方法，例如，本公开的组合物可在化妆品用途中用于提亮肤色。

因此，在一个方面，提供个体皮肤增亮的非治疗性方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如本文所定义的组合物。

在一些实施方案中，所述组合物局部施用于个体的皮肤。

本公开的组合物可以例如是待施用于个体外表面的局部组合物。在特定实施方案中，所述外表面可以是个体的头皮、面部、手臂、腿部或躯干中的一个或多个。有利地，本公开的组合物显示出有效的皮肤生物利用度，允许皮肤渗透以提亮肤色，这已在人体皮肤渗透和功效研究以及真皮黑素细胞增多症的仿生皮肤模型中得到证明。

在一些实施方案中，本公开的组合物每天施用一次、或每天施用两次、或每天施用三次、或每天施用四次，例如持续足以带来色素沉着过度所需改善水平的时间段。或者，可以较低频率使用所述组合物，如果这样会提供所需效果的话。例如，它可以每隔一天施用一次，或每周一次、两次、三次或四次施用，或者临时或根据需要施用。

例如，使用者可以直接将本公开的组合物局部施用于期望减少色素沉着的皮肤上，方式是轻轻按摩本公开的组合物以进入所需区域。在一些实施方案中，在两次施用之间，本公开的组合物保留在期望减少色素沉着的皮肤或其他区域上。

本公开组合物的局部施用可持续任何合适的时间段。例如，在几天到几周内，使用者可观察到色素沉着减少。有利地，用本公开组合物进行的局部治疗可通过在例如短至4周的产品施用期间显著减少已识别的色素沉着过度的肤色来证明抗色素沉着过度效果。

应理解，施用本公开组合物的频率会根据所需效果而变化。在一些实施方案中，治疗和/或美容改善的程度会有所不同，并且可能与所用组合物的总量成正比。可以以足以带来色素沉着过度所需改善水平的任何量和任何频率施用所述组合物。

例如，所述组合物可以以下列量的肽施用：约1ppm至约10000ppm，或约2ppm至约2000ppm，或约3ppm至约1000ppm，或约4ppm至约500ppm，或约5ppm至约100ppm，或约5ppm至约50ppm，或约10ppm至约25ppm，或约10ppm至约20ppm。

当局部施用时，本公开的组合物可通过喷涂、点涂、擦拭、摩擦或按摩施用于待治疗区域，例如面部。例如，在一个实施方案中，本公开的组合物可以以液体、洗剂、霜剂、泡沫、精华液、软膏、粉底、磨砂膏、凝胶、肥皂块、爽肤水的形式提供，或通过器具施用或通过任何材料形式的面膜、垫或贴片、或者其他免洗型产品制剂施用，其优选可至少每天施用。

组合物的制备

本公开的组合物可通过本领域技术人员已知的任何合适方法制备。

在一些实施方案中，所述组合物被制备成适合局部使用的组合物。

在一些实施方案中，所述组合物被制备成乳液。例如，本公开的组合物可通过组合水相和脂质相，然后进行均质化来制备。

所述组合物可包含起到增强其他成分吸收进入皮肤之作用的合适溶剂或剂、保湿剂和抗刺激剂、用于产生具有皮肤平滑和舒缓特性的凝胶基质的胶质、乳液稳定和粘度控制剂、起到防止制剂变质之作用的剂、吸湿剂、润肤剂、头发/皮肤调理剂、有助于改善护肤配方整体质地和触感(finish)的剂、胶凝剂、防腐剂、有助于减少毛孔粗大、老年斑和色素沉着过度之外观的剂(包括乳酸)，并将该混合物进行均质化。

在一些实施方案中，通过组合可增强其他成分吸收进入皮肤的合适溶剂(例如甲基丙二醇)、保湿剂和抗刺激剂(例如甜菜碱)、天然胶质(例如小核菌胶)、乳液稳定和粘度剂(例如聚丙烯酰二甲基牛磺酸钠)、抗变质剂(例如EDTA二钠)、吸湿剂(例如透明质酸钠)、水分散性硅酮(例如双-PEG-18甲基醚二甲基硅烷，其可充当润肤剂并具有额外的增泡特性)、头发/皮肤调理剂(例如PEG-12二甲硅油)、选自苯甲酸C12-15烷基酯、PPG-3肉豆蔻基醚和甘油的其他合适的润肤剂、选自丙烯酸羟乙酯/丙烯酰二甲基牛磺酸钠共聚物的胶凝剂、减少毛孔粗大、老年斑和色素沉着过度之外观的剂(包括乳酸)、选自乙基己基甘油和苯氧乙醇的防腐剂、抗氧化剂(包括焦亚硫酸钠)、杀生物剂(包括氯苯甘醚)以及去离子水，并将该混合物进行均质化，从而将所述组合物制备成适合局部使用的组合物。

本领域技术人员会理解，除了所具体描述的之外，可对本文公开的内容进行变型和修改。应理解，本公开包括所有此类变型和修改。

实施例

通过以下非限制性实施例进一步说明本公开。

实施例1：研究真皮-表皮连接完整性、其在皮肤色素沉着过度中的作用及相关生物标志物的鉴定

1.1目的

了解真皮-表皮连接(DEJ)完整性在皮肤色素沉着过度中的作用，并鉴定可用作神经调节蛋白诱导的皮肤色素沉着过度之指标的相关生物标志物。

1.2方法

1.2.1通过比较老年人和年轻人皮肤研究DEJ完整性在皮肤色素沉着过度中的作用

从获得四份来自两名年轻供体和两名老年供体的离体皮肤外植体用于本研究。在开始实验前，将皮肤在提供的组织培养基中于37℃、5％CO₂条件下平衡一小时。平衡后，用新鲜培养基替换培养基。然后将神经调节蛋白(R&D Systems,Abingdon,UK)(一种真皮黑色素生成因子)以500ng/ml的终浓度添加到外植体培养物中并孵育过夜。然后用新鲜维持培养基替换培养基，并再次向培养基中添加神经调节蛋白。重复该培养过程三次，然后收获皮肤外植体，使用Fontana-Masson染色试剂盒(Abcam,Cambridge,UK)进行黑色素定量。

1.2.2鉴定与用金属蛋白酶-3(MMP-3)处理的离体年轻人皮肤中神经调节蛋白诱导的色素沉着过度相关的DEJ完整性的生物标志物

从获得来自两名年轻供体的离体皮肤外植体用于本研究。在开始实验前，将外植体在提供的专有组织培养基中平衡一小时。平衡后，用新鲜培养基替换培养基。然后向外植体培养物中加入浓度为500ng/mL的神经调节蛋白和500ng/ml的基质金属蛋白酶-3(MMP-3)(R&D Systems,Abingdon,UK)，并孵育过夜。重复该过程三次，然后收获皮肤外植体，使用Fontana-Masson组织学染色进行黑色素定量。还使用免疫荧光染色法对胶原蛋白IV和胶原蛋白VII进行染色，并使用NIS-Elements成像软件(Nikon,Japan)量化目标蛋白表达水平。

1.3结果与讨论

据推测，老年人皮肤中真皮黑色素生成因子诱导的皮肤色素沉着过度发生率更高，这是因为DEJ受损，其作用是促进神经调节蛋白穿过以在表皮的黑素细胞中发挥其促黑色素生成作用。据报道，老年人皮肤中DEJ蛋白显著减少(Langton et al.,2016)。为了研究DEJ损伤是否在促进真皮黑色素生成因子诱导的皮肤色素沉着过度中起作用，在培养基中用神经调节蛋白(真皮黑色素生成因子之一)处理老年人和年轻人皮肤以诱导皮肤色素沉着过度。表1显示，用神经调节蛋白处理的老年人皮肤比其对应的年轻人皮肤具有显著更高的黑色素强度。这表明DEJ的完整性确实在调节真皮因子进入表皮的移动中起作用。

确定了与神经调节蛋白诱导的皮肤色素沉着过度相关的涉及DEJ损伤的生物标志物。MMP-3(基质降解酶-1)可以降解多种底物，包括DEJ中的细胞外基质成分，胶原蛋白IV和胶原蛋白VII。本研究中使用MMP-3在年轻人皮肤中诱导DEJ损伤，以便研究潜在的生物标志物。表1.2中提供的证据表明，用MMP-3处理并由神经调节蛋白诱导的测试皮肤样品显示出黑色素水平增加。还发现MMP-3显著降低了胶原蛋白IV和VII的表达。该观察结果验证了这两种蛋白可用作评估DEJ完整性的生物标志物。

表1.1.神经调节蛋白对老年和年轻人皮肤外植体的黑色素强度的影响。

数据表示为两次独立实验的平均值±标准误(n＝2)。###p<0.001，与未处理对照相比，经学生t检验。统计显著性由P值表示，*p<0.05，老年人与年轻人皮肤相比，经学生t检验。

表1.2.MMP-3对年轻皮肤外植体中神经调节蛋白诱导的黑色素水平以及胶原蛋白IV和胶原蛋白VII表达的影响。

数据表示为两次独立实验的平均值±标准误(n＝2)。统计显著性由P值表示，*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001，与未处理对照相比，使用单因素方差分析。

4.结论

DEJ完整性在神经调节蛋白诱导的皮肤色素沉着过度中起重要作用，胶原蛋白IV和胶原蛋白VII是评估DEJ完整性的有用生物标志物。

实施例2：研究乙酰四肽-11和乙酰四肽-9的组合、或乙酰SH-六肽-5酰胺乙酸盐在减少DEJ受损皮肤黑色素水平中的作用

2.1目的

研究乙酰四肽-11、乙酰四肽-9和乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐在减少DEJ受损的皮肤外植体中黑色素的作用。

2.2方法

2.2.1制剂制备

如下制备测试和对照制剂：预混合相A和相B各自的成分(表2.1)，然后将相A和相B溶液合并并在2500rpm下均质化5分钟。然后，将预混合的相C成分添加到包含相A和相B的溶液中，并在100-200rpm下搅拌30分钟。

表2.1.按相列出的制剂成分

2.2.2制剂对DEJ受损离体皮肤中神经调节蛋白诱导的色素沉着过度的局部处理

从获得来自两份年轻供体的离体皮肤外植体用于本研究。在开始实验前，将皮肤在提供的组织培养基中平衡一小时。平衡后，用新鲜培养基替换培养基。然后，向培养基中加入500ng/ml的神经调节蛋白(真皮黑色素生成因子)和150ng/ml的金属蛋白酶-3(MMP-3，用于降解DEJ)，并将外植体孵育过夜。用补充有500ng/ml神经调节蛋白和500ng/ml MMP-3的新鲜培养基替换培养基。将表2.1中列出的局部处理施用于皮肤，并在37℃、5％ CO₂条件下保留四小时。四小时后，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗掉处理产品，并将皮肤外植体在37℃、5％ CO₂条件下孵育过夜。第二天，在没有MMP-3的情况下重复产品处理和清洗步骤，然后收获皮肤外植体，使用Fontana-Masson染色进行黑色素定量。还使用免疫荧光染色法对胶原蛋白IV和胶原蛋白VII进行染色，并使用NIS-Elements成像软件(Nikon,Japan)量化蛋白质表达。

2.3结果与讨论

如表2.2所示，与阴性对照制剂基质(制剂1)相比，制剂2(包含活性剂乙酰四肽9和11)和制剂3(包含活性剂乙酰SH-六肽5酰胺乙酸盐)显著减少了DEJ受损皮肤外植体中神经调节蛋白诱导的黑色素水平。同时，在制剂2和制剂3处理的皮肤样品中观察到胶原蛋白VII表达的显著升高。与对照样品(制剂1)相比，确定了在制剂2和制剂3的情况下各自观察到的黑色素减少效果与胶原蛋白VII表达之间的相关性。与对照样品(制剂1)相比，在制剂2和制剂3处理的皮肤样品中也观察到胶原蛋白IV表达的一些升高。

表2.2.在DEJ损伤的皮肤外植体中，比较活性剂，即制剂2和制剂3(AA2G和ASH5AA)在具有神经调节蛋白诱导的皮肤色素沉着过度的皮肤中减少黑色素的功效以及对胶原蛋白IV和VII表达的影响。

数据表示为两次独立实验的平均值±标准误(n＝2)。统计显著性由P值表示，*p<0.05，**p<0.01,****p<0.0001,与制剂1相比，使用单因素方差分析。

2.4结论

活性剂乙酰四肽-11和乙酰四肽-9的组合，或乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐是有用的活性成分，减少年轻供体来源、具有MMP-3诱导的DEJ损伤的人皮肤外植体中的皮肤黑色素水平，并促进胶原蛋白VII显著表达。

实施例3：评估包含活性剂3-EAA、乙酰四肽-11和乙酰四肽-9的局部施用水性组合物在临床和离体样品中治疗色素沉着过度的功效

3.1目的

研究包含活性剂3-O-乙基抗坏血酸(3-EAA)、乙酰四肽-11和乙酰四肽-9的局部制剂减少色素沉着过度(在具有MMP-3诱导的DEJ损伤的离体人皮肤外植体的神经调节蛋白诱导的皮肤色素沉着过度中，通过测量黑色素水平来测定)以及治疗临床试验参与者的皮肤之功效。

3.2方法

3.2.1制剂制备

如下制备测试和对照制剂：通过将每种成分依次加入水溶液中并在100-200rpm下搅拌15分钟直至完全溶解，来预混合相A成分(表3.1)。混合相B中的所有成分直至完全溶解，然后加入相A溶液中并在100-200rpm下搅拌5分钟。最后，将防腐剂(氨甲基丙醇和氯苯甘醚、甘油、苯氧乙醇)添加到相A/B溶液中，并在100-200rpm下再搅拌5分钟。

表3.1.按相列出的制剂成分

3.2.2制剂对DEJ受损离体皮肤中神经调节蛋白诱导的色素沉着过度的局部处理

本实验使用表3.1中列出的制剂，按照本说明书中的方法2.2.2进行。

3.2.3临床试验

在具有12名试验参与者的临床试验中评估了产品制剂4和5减少色素沉着过度的功效。参与者是年龄41至54岁、具有明显皮肤色素沉着的女性。在本研究中，指示招募的参与者局部施用制剂5，每天两次，持续一个月。使用VISIA肤质分析系统(Canfield,USA)在基线(T₀)和自产品施用首日起4周后(T_4w)记录所定义的皮肤治疗区域的肤色。此外，标记色素沉着治疗区域的肤色，并通过测定代表性正常(clear)皮肤区域与同一个体的色素沉着皮肤治疗区域之间的个体拓扑角度(ITA°)差异进行进一步分析。较低的ΔITA°表明治疗区域增亮且皮肤均匀性改善。

3.3结果与讨论

如表3.2所示，与未处理对照相比，用制剂5局部处理显著降低了具有MMP-3诱导DEJ损伤的皮肤外植体中神经调节蛋白诱导的皮肤色素沉着过度的黑色素水平。同时，与未处理的皮肤外植体相比，在用制剂5处理的皮肤外植体中观察到胶原蛋白IV和VII表达显著增加。观察到处理后黑色素水平与胶原蛋白IV和VII水平呈负相关。

表3.2.评估制剂5(3-EAA、AT-11和AT-9)在具有神经调节蛋白诱导的皮肤色素沉着过度之皮肤中减少黑色素的功效以在具有DEJ损伤的皮肤外植体中对胶原蛋白IV和VII表达的影响。

数据表示为两次独立实验的平均值±标准误(n＝2)。统计显著性由P值表示，*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001，与未处理对照相比，使用单因素方差分析。

为了评估临床环境中的抗色素沉着过度功效，表3.2所示结果表明，制剂5的局部处理减少了已确定的色素沉着皮肤测试区域与正常对照皮肤区域之间的肤色差异。在局部施用前立即和施用制剂5后4周测量肤色。

表3.3制剂5对色素沉着斑点增亮的效果，其通过同一个体正常皮肤区域与色素沉着皮肤区域之间的个体拓扑角度差异(ΔITA°)确定。

所有值表示为测试试验参与者组的平均值±标准误(n＝12)。统计显著性由P值表示，*p<0.05，与基线(T₀)相比，应用Wilcoxon配对符号秩检验。

3.4结论

与未处理对照相比，局部施用包含3-EAA、AT-11和AT-9的制剂5有效降低具有神经调节蛋白诱导的皮肤色素沉着过度的DEJ损伤人皮肤外植体中的黑色素水平。该活性剂组合是皮肤色素沉着过度的有用治疗方法，并已在人类临床试验参与者中显示，在4周后肤色增亮。

实施例4：评估包含活性剂3-EAA、乙酰四肽-11和乙酰四肽-9的局部施用水性组合物在皮肤外植体中治疗色素沉着过度的功效和可重复性

4.1.目的

评估和验证包含活性剂3-EAA、AT-11和AT-9的局部施用制剂在MMP-3诱导DEJ损伤的离体人皮肤外植体样品中的抗色素沉着过度活性和可重复性。

4.2.方法

4.2.1制剂制备

如下制备测试和对照制剂：通过将每种成分依次加入水溶液中并在100-200rpm下搅拌15分钟直至完全溶解，预混合相A成分(表4.1)。混合相B中的所有成分直至完全溶解，然后加入相A溶液中并在100-200rpm下搅拌5分钟。最后，将防腐剂(氯苯甘醚和苯氧乙醇)添加到相A/B溶液中，并在100-200rpm下再搅拌5分钟。

表4.1.按相列出的制剂成分

4.2.2制剂对DEJ损伤离体皮肤中神经调节蛋白诱导的色素沉着过度的局部处理

本实验使用表4.1中列出的制剂，按照本说明书中的方法2.2.2进行。

4.3.结果与讨论

如表4.2所示，与对照制剂6(不含活性剂)相比，制剂7的局部处理显著降低了具有神经调节蛋白诱导的DEJ损伤的皮肤外植体中的黑色素水平。同时，与制剂6处理的皮肤外植体相比，在制剂7处理的皮肤外植体中观察到胶原蛋白IV和VII表达显著升高。包含活性剂3-EAA、AT-11和AT-9之组合的制剂7在DEJ损伤的皮肤中显示出减少黑色素的显著功效，并增强了对细胞外基质的功能和稳定性至关重要的蛋白质(即胶原蛋白IV和胶原蛋白VII)的表达。

表4.2.评估制剂5(3-EAA、AT-11和AT-9)在具有神经调节蛋白诱导的皮肤色素沉着过度的皮肤中减少黑色素的功效和可重复性以及在DEJ损伤的皮肤外植体中对胶原蛋白IV和VII表达的影响。

数据表示为两次独立实验的平均值±标准误(n＝2)。统计显著性由P值表示，*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001，与未处理对照组相比，使用单因素方差分析。

4.4结论

与未处理对照组相比，局部施用包含3-EAA、AT-11和AT-9的制剂7重复有效地减少具有神经调节蛋白诱导的皮肤色素沉着过度和DEJ损伤的人皮肤外植体中的黑色素水平。在重复实验中证实了制剂7对皮肤增亮的功效。在测试浓度下局部施用时，该活性剂组合是治疗皮肤色素沉着过度的有用方法。

实施例5：评估包含活性剂抗坏血酸葡糖苷(AA2G)和乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐(ASH5AA)的局部施用乳液组合物治疗皮肤色素沉着过度的功效

5.1.目的

研究包含AA2G和ASH5AA的局部制剂减少色素沉着过度的功效(在具有MMP-3诱导的DEJ损伤的离体人皮肤外植体的神经调节蛋白诱导的皮肤色素沉着过度中，通过测量黑色素水平来测定)。

5.2.方法

5.2.1制剂制备

通过在70℃至75℃下分别在单独的容器中预混合相A和相B成分(表5.1)直至均匀分散来制备测试和对照制剂。然后将相B加入相A中，并在3500rpm下搅拌15分钟。在60℃下将相C混合直至完全溶解并加入相A/B溶液中，在3500rpm下搅拌5分钟。然后，在45℃下将相D混合直至完全溶解并加入相A/B/C溶液中，在100-200rpm下搅拌5分钟。最后，将相E中的成分依次加入相A/B/C/D溶液中，并在100-200rpm下搅拌30分钟。

表5.1.按相列出的制剂成分

5.2.2制剂对DEJ损伤离体皮肤中神经调节蛋白诱导的色素沉着过度的局部处理

本实验使用表5.1中列出的制剂，按照本说明书中的方法2.2.2进行。

5.3.结果与讨论

如表5.2所示，与未处理对照相比，局部施用制剂8或制剂9显著降低了具有MMP-3诱导的DEJ损伤的皮肤外植体中神经调节蛋白诱导的皮肤色素沉着过度的黑色素水平。然而，制剂9(包含活性剂AA2G和ASH5AA)显示出比在制剂8(不含活性剂的制剂，即“基质制剂”)处理的样品中所观察到的更大的黑色素减少。此外，与基质制剂(制剂8)相比，制剂9显著增加了胶原蛋白IV和VII的表达。总之，在制剂9处理的样品中，黑色素水平与胶原蛋白IV和VII水平的负相关最强。

表5.2.评估制剂9(AA2G和ASH5AA)在具有神经调节蛋白诱导的皮肤色素沉着过度的皮肤中减少黑色素的功效以及在DEJ损伤的皮肤外植体中对胶原蛋白IV和VII表达的影响。

数据表示为两次独立实验的平均值±标准误(n＝2)。统计显著性由P值表示，*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001，与未处理对照组相比，使用单因素方差分析。

5.4结论

与未处理对照组相比，包含抗坏血酸葡糖苷和乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐的局部施用制剂在降低具有神经调节蛋白诱导的皮肤色素沉着过度和DEJ损伤的人皮肤外植体中黑色素水平方面是有用的。

实施例6：3-EAA与乙酰四肽-11和乙酰四肽-9在离体皮肤外植体中的协同抗色素沉着过度作用

6.1.目的

研究3-EAA与乙酰四肽-11和乙酰四肽-9组合在局部施用时，在具有神经调节蛋白诱导的皮肤色素沉着过度和DEJ损伤的离体人皮肤外植体中减少色素沉着过度的可能协同作用。

6.2.方法

6.2.1制剂制备

如下制备测试和对照制剂：通过将每种成分依次加入水溶液中并在100-200rpm下搅拌15分钟直至完全溶解，来预混合相A成分(表6.1)。混合相B中的所有成分直至完全溶解，然后加入相A溶液中并在100-200rpm下搅拌5分钟。最后，将防腐剂(氨甲基丙醇和氯苯甘醚、甘油、苯氧乙醇)添加到相A/B溶液中，并在100-200rpm下再搅拌5分钟。

表6.1.按相列出的制剂成分

6.2.2制剂对DEJ损伤离体皮肤中神经调节蛋白诱导的色素沉着过度的局部处理

本实验使用表6.1中列出的制剂，按照本说明书中的方法2.2.2进行。

6.3.结果与讨论

如表6.2所示，在人DEJ损伤皮肤外植体中，与未处理对照相比，所有测试的制剂均显著降低黑色素并显著增强胶原蛋白IV和胶原蛋白VII表达。正如预期的那样，包含乙酰四肽-11和乙酰四肽-9的制剂12或包含3-EAA的制剂13在DEJ损伤皮肤中显示出显著的黑色素减少。有趣的是，制剂11包含一半剂量的活性剂(无论是3-EAA，还是乙酰四肽-11和乙酰四肽-9)，分别显示出比制剂13或制剂12更高的黑色素减少。总之，这表明3-EAA、乙酰四肽-11和乙酰四肽-9的组合在减少具有皮肤DEJ损伤的人皮肤外植体中黑色素方面具有协同作用。

表6.2.制剂对皮肤外植体中神经调节蛋白诱导的皮肤黑色素减少以及胶原蛋白IV和VII表达的局部功效。

数据表示为两次独立实验的平均值±标准误(n＝2)。统计显著性由P值表示，*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001，与未处理对照组相比，使用单因素方差分析。

6.4结论

与未处理对照相比，活性剂3-O-乙基抗坏血酸(3-EAA)与乙酰四肽-11和乙酰四肽-9组合使用时，在减少神经调节蛋白诱导的皮肤色素沉着过度和DEJ损伤的人皮肤外植体中的黑色素水平方面具有协同作用。

实施例7：比较具有抗坏血酸衍生物的水性制剂和乳液制剂作为整体抗色素沉着过度方法在体外减少真皮黑色素的作用

7.1.目的

在体外皮肤真皮黑素细胞增多症模型中，研究和比较选定的活性剂与抗坏血酸衍生物组合在减少真皮黑色素方面的功效。

7.2.方法

7.2.1水性制剂制备

如下制备测试和对照制剂：通过将每种成分依次加入水溶液中并在100-200rpm下搅拌15分钟直至完全溶解，来预混合相A成分(表7.1)。混合相B中的所有成分直至完全溶解，然后加入相A溶液中并在100-200rpm下搅拌5分钟。最后，将防腐剂(氨甲基丙醇和氯苯甘醚、甘油、苯氧乙醇)添加到相A/B溶液中，并在100-200rpm下再搅拌5分钟。

表7.1.按相列出的制剂成分--水性制剂

7.2.2乳液制剂制备

通过在70℃至75℃下分别在单独的容器中预混合相A和相B成分(表7.2)直至均匀分散来制备测试和对照制剂。然后将相B加入相A中，并在3500rpm下搅拌15分钟。将在60℃下相C混合直至完全溶解并加入相A/B溶液中，在3500rpm下搅拌5分钟。然后，在45℃下将相D混合直至完全溶解并加入相A/B/C溶液中，在100-200rpm下搅拌5分钟。最后，将相E中的成分依次加入相A/B/C/D溶液中，并在100-200rpm下搅拌30分钟。

表7.2.按相列出的制剂成分--乳液制剂

7.2.3制备具有内化黑素体的成纤维细胞

将小鼠黑色素瘤细胞B16-F10(ATCC,USA)以5x 10⁵细胞的浓度接种在T75组织培养瓶中，并在补充有10％胎牛血清(FBS)、丙酮酸钠(1mM)、L-谷氨酰胺(2mM)、链霉素(50μg/ml)和青霉素(50U/ml)的完全杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM；Nacalai,Japan)中，于37℃、5％ CO₂条件下维持5天。然后，将培养基在300xg下离心以沉淀细胞碎片，并收获在上清液中的黑素体，称为：黑素体条件培养基。

在另一个培养瓶中，将人皮肤成纤维细胞HS-68细胞(ATCC,USA)以7x 10⁵的密度接种在T25组织培养瓶中，并在补充有10％ FBS、丙酮酸钠(1mM)、L-谷氨酰胺(2mM)、链霉素(50μg/ml)和青霉素(50U/ml)的DMEM培养基中，于37℃、5％ CO₂条件下维持24小时。然后，用黑素体条件培养基替换培养基，并再培养24小时。最后，使用MTT测定法(NacalaiTesque,Japan)测定处理后的成纤维细胞的细胞活力。此外，用胰蛋白酶处理经黑素体条件培养基处理的成纤维细胞，并通过在10,000xg下离心10分钟来收获。去除上清液，收集细胞沉淀。通过用1M NaOH(Merck,Germany)重悬收集的细胞以裂解，并在80℃下孵育1小时。最后，将裂解的样品在3000xg下离心5分钟，收集上清液用于黑色素和蛋白质定量。

7.2.4在共培养模型中对重建皮肤和具有内化黑素体的成纤维细胞进行局部处理

将人皮肤成纤维细胞HS-68细胞以1x 10⁵细胞/孔的浓度接种在12孔悬挂顶板中，并在5％ CO₂和37℃下培养24小时。然后，用黑素体条件培养基替换培养基，并再培养24小时。同一天，将含有黑素细胞的重建皮肤(Melanoderm；Mattek,USA)用长效维持培养基(LLMM，来自Mattek,USA)维持，并在37℃和5％ CO₂下培养过夜。第二天，弃去黑素体条件培养基并用PBS冲洗。然后将Melanoderm重建皮肤添加到含有经黑素体条件培养基处理的成纤维细胞的12孔悬挂顶板中进行共培养。共培养系统在LLMM培养基中维持，并将每种测试和对照制剂局部施用于皮肤，孵育两小时。然后用PBS洗掉制剂。更换培养基，并且每2天施用一次局部处理，总共持续7天。最后，用胰蛋白酶处理成纤维细胞并收获用于黑色素定量。使用MTT测定测定处理后的皮肤和成纤维细胞的细胞活力。

7.2.5黑色素和总蛋白定量

简言之，将150μL含黑色素的所收集上清液用45μL过氧化氢(Merck,Germany)处理，并在室温避光条件下孵育。然后，将样品在3000xg下离心5分钟，收集上清液，并使用Cytation 5多模式读板仪(Biotek Instrument,USA)在470nm激发波长和550nm发射波长下测量所收集上清液的荧光强度。样品中的黑色素量根据新鲜制备的黑色素系列稀释液(Sigma,USA)的标准曲线(0-100μg/ml)计算。此外，根据制造商的说明，通过Bradford测定和CBB溶液(Nacalai Tesque,Japan)定量总蛋白。最后，将黑色素含量归一化为总蛋白含量，并表示为每毫克蛋白质中的总黑色素(μg)。

7.3.结果与讨论

如表7.3所示，水性制剂，即制剂15(仅包含乙酰四肽-11和乙酰四肽-9)显示成纤维细胞中黑色素含量减少不显著。相反，制剂14(同时包含抗坏血酸衍生物(3-EAA)和活性剂乙酰四肽-11和乙酰四肽-9)显示成纤维细胞中黑色素含量显著减少。

类似地，如表7.4所示，乳液制剂显示出与水制剂相同的趋势。即，制剂17(仅包含乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐)显示成纤维细胞中黑色素含量减少不显著。同样，相反，制剂16(包含抗坏血酸衍生物(抗坏血酸葡糖苷)和乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐)显示成纤维细胞中黑色素含量显著减少。

总之，当抗坏血酸衍生物与其他活性剂(即乙酰四肽-11和乙酰四肽-9或乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐)一起施用时，抗色素沉着过度的效果更有效。共同施用导致真皮黑色素显著减少。

表7.3.所选水性制剂对真皮黑素细胞增多症仿生皮肤模型中黑素体内化成纤维细胞中黑色素含量的影响。

所有数据均归一化为未处理对照，并表示为三次独立实验的平均值±标准误(n＝3)。统计显著性由P值表示，*p<0.05，**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001，与未处理对照组相比，使用单因素方差分析。

表7.4.所选乳液制剂对真皮黑素细胞增多症仿生皮肤模型中黑素体内化成纤维细胞中黑色素含量的影响。

所有数据均归一化为未处理对照，并表示为三次独立实验的平均值±标准误(n＝3)。统计显著性由P值表示，*p<0.05，**p<0.01,***p<0.001,****p<0.0001，与未处理对照组相比，使用单因素方差分析。

7.4结论

在体外皮肤真皮黑素细胞增多症模型中，肽(乙酰四肽-11和乙酰四肽-9，或乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐)显示真皮黑色素减少，但与未处理对照组相比，减少的黑色素水平并不显著。然而，当每种活性剂与抗坏血酸衍生物(3-EAA或抗坏血酸葡糖苷)组合时，在体外皮肤真皮黑素细胞增多症模型中黑色素水平的减少是显著的。这表明这些制剂是皮肤增亮或皮肤色素沉着障碍的有用且有前景的治疗方法。

参考文献

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Watanabe,S.(2014)Facial Dermal Melanocytosis.Austin J Dermatolog 1(2),1006.

Claims (30)

1.一种组合物，其包含：

a)N-乙酰-L-谷氨酰胺酰-L-α-天冬氨酰-L-缬氨酰-L-组氨酸(乙酰四肽-9)或其盐，和N-乙酰-L-脯氨酰-L-脯氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酸(乙酰四肽-11)或其盐；以及

b)抗坏血酸衍生物或其盐；

其中，N-乙酰-L-谷氨酰胺酰-L-α-天冬氨酰-L-缬氨酰-L-组氨酸或其盐与N-乙酰-L-脯氨酰-L-脯氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酸或其盐的重量比为10:1至1:10。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中组分a)中包含的活性剂以N-乙酰-L-谷氨酰胺酰-L-α-天冬氨酰-L-缬氨酰-L-组氨酸与N-乙酰-L-脯氨酰-L-脯氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酸的重量比为5:1至1:5存在，或者任选地以N-乙酰-L-谷氨酰胺酰-L-α-天冬氨酰-L-缬氨酰-L-组氨酸与N-乙酰-L-脯氨酰-L-脯氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酸的重量比为2:1至1:2存在。

3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中组分b)选自下组：3-O-乙基抗坏血酸、2-O-乙基抗坏血酸、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸四异棕榈酸酯、抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸磷酸酯钠、辛酰基2-甘油基抗坏血酸酯、3-甘油基抗坏血酸酯、双甘油基抗坏血酸酯、己基3-甘油基抗坏血酸酯、肉豆蔻基3-甘油基抗坏血酸酯和月桂基甘油基抗坏血酸酯。

4.根据权利要求3所述的组合物，其中组分b)是3-O-乙基抗坏血酸或抗坏血酸葡糖苷。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的组合物，其中N-乙酰-L-谷氨酰胺酰-L-α-天冬氨酰-L-缬氨酰-L-组氨酸和N-乙酰-L-脯氨酰-L-脯氨酰-L-酪氨酰-L-亮氨酸各自独立地以下列量存在于所述组合中：所述组合物重量的0.0001％至1％，任选地所述组合物重量的0.0005％至0.005％，任选地所述组合物重量的0.001％至0.002％。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中组分b)的存在量为所述组合物重量的0.1％至10％，任选地所述组合物重量的0.2％至8％，任选地所述组合物重量的1％至2％。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述组合物不含除组分a)和b)之外的任何抗色素沉着过度剂。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述组合物适合局部施用。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含一种或多种药学上或化妆品上合适的赋形剂。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含以下一种或多种：抗炎剂、防晒剂、抗氧化剂、脱屑剂和去角质剂。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述组合物呈霜剂、洗剂、精华液、糊剂、蜡、液体、半固体组合物或可喷雾组合物的形式。

12.一种预防、治疗和/或减少个体的与皮肤色素沉着障碍相关的症状的方法，或者一种抑制个体的表皮黑素细胞中黑色素产生和/或促进个体的真皮成纤维细胞中黑色素降解的方法，或者一种用于个体的皮肤美白和/或增亮的非治疗性方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如权利要求1至11中任一项所述的组合物。

13.如权利要求1至11中任一项所述的组合物用于制备药物的用途，所述药物用于预防、治疗和/或减少与皮肤色素沉着障碍相关的症状，或者用于抑制表皮黑素细胞中黑色素产生和/或促进真皮成纤维细胞中黑色素降解。

14.根据权利要求1至11中任一项所述的组合物，其用于预防、治疗和/或减少与皮肤色素沉着障碍相关的症状，或者用于抑制表皮黑素细胞中黑色素产生和/或促进真皮成纤维细胞中黑色素降解。

15.一种组合物，其包含：

a)N-乙酰-L-丙氨酰-L-亮氨酰-L-组氨酰-L-赖氨酰-L-缬氨酰-L-赖氨酰胺(乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐)或其盐；以及

b)抗坏血酸或者其衍生物和/或其盐。

16.根据权利要求15所述的组合物，其中组分b)选自下组：3-O-乙基抗坏血酸、2-O-乙基抗坏血酸、L-抗坏血酸、抗坏血酸葡糖苷、抗坏血酸四异棕榈酸酯、抗坏血酸磷酸酯镁、抗坏血酸磷酸酯钠、辛酰基2-甘油基抗坏血酸酯、3-甘油基抗坏血酸酯、双甘油基抗坏血酸酯、己基3-甘油基抗坏血酸酯、肉豆蔻基3-甘油基抗坏血酸酯和月桂基甘油基抗坏血酸酯。

17.根据权利要求16所述的组合物，其中组分b)是抗坏血酸葡糖苷或3-O-乙基抗坏血酸。

18.根据权利要求15至17中任一项所述的组合物，其中组分a)的存在量为所述组合物重量的0.0001％至1％，任选地所述组合物重量的0.0005％至0.005％，任选地所述组合物重量的0.001％至0.002％。

19.根据权利要求15至18中任一项所述的组合物，其中组分b)的存在量为所述组合物重量的0.1％至10％，任选地所述组合物重量的0.5％至8％，任选地所述组合物重量的1％至2％。

20.根据权利要求15至19中任一项所述的组合物，其中所述组合物适合局部施用。

21.根据权利要求15至20中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含一种或多种药学上或化妆品上合适的赋形剂。

22.根据权利要求15至21中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含以下一种或多种：抗炎剂、防晒剂、抗氧化剂、脱屑剂和去角质剂。

23.根据权利要求15至22中任一项所述的组合物，其中所述组合物呈霜剂、洗剂、精华液、糊剂、蜡、液体、半固体组合物或可喷雾组合物的形式。

24.一种预防、治疗和/或减少个体的与皮肤色素沉着障碍相关的症状的方法，或者一种抑制个体的表皮黑素细胞中黑色素产生和/或促进个体的真皮成纤维细胞中黑色素降解的方法，或者一种用于个体的皮肤美白和/或增亮的非治疗性方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的N-乙酰-L-丙氨酰-L-亮氨酰-L-组氨酰-L-赖氨酰-L-缬氨酰-L-赖氨酰胺(乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐)或其盐。

25.N-乙酰-L-丙氨酰-L-亮氨酰-L-组氨酰-L-赖氨酰-L-缬氨酰-L-赖氨酰胺(乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐)或其盐用于制备药物的用途，所述药物用于预防、治疗和/或减少与皮肤色素沉着障碍相关的症状，或者用于抑制黑色素产生和/或促进真皮成纤维细胞中黑色素降解。

26.N-乙酰-L-丙氨酰-L-亮氨酰-L-组氨酰-L-赖氨酰-L-缬氨酰-L-赖氨酰胺(乙酰sh-六肽-5酰胺乙酸盐)或其盐，其用于预防、治疗和/或减少与皮肤色素沉着障碍相关的症状，或者用于抑制黑色素产生和/或促进真皮成纤维细胞中黑色素降解。

27.一种预防、治疗和/或减少个体的与皮肤色素沉着障碍相关的症状的方法，或者一种抑制个体的表皮黑素细胞中黑色素产生和/或促进个体的真皮成纤维细胞中黑色素降解的方法，或者一种用于个体的皮肤美白和/或增亮的非治疗性方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的如权利要求15至23中任一项所述的组合物。

28.如权利要求15至23中任一项所述的组合物用于制备药物的用途，所述药物用于预防、治疗和/或减少与皮肤色素沉着障碍相关的症状，或者用于抑制表皮黑素细胞中黑色素产生和/或促进真皮成纤维细胞中黑色素降解。

29.根据权利要求15至23中任一项所述的组合物，其用于预防、治疗和/或减少与皮肤色素沉着障碍相关的症状，或者用于抑制表皮黑素细胞中黑色素产生和/或促进真皮成纤维细胞中黑色素降解。

30.根据权利要求12-14和24至29中任一项所述的方法、用途或用于所述用途的组合物，其中所述皮肤色素沉着障碍选自下组：皮肤色素沉着过度、黄褐斑、日光性雀斑样痣、太田痣、伊藤痣和先天性真皮黑素细胞增多症。