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CN121038816A - 新多肽 - Google Patents

新多肽

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Publication number
CN121038816A
CN121038816A CN202480029468.5A CN202480029468A CN121038816A CN 121038816 A CN121038816 A CN 121038816A CN 202480029468 A CN202480029468 A CN 202480029468A CN 121038816 A CN121038816 A CN 121038816A
Authority
CN
China
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binding
seq
fusion protein
conjugate
binding polypeptide
Prior art date
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Pending
Application number
CN202480029468.5A
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English (en)
Inventor
埃琳·贡内里乌松
苏珊娜·柯林特
乔金·尼尔森
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Affibody AB
Original Assignee
Affibody AB
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Filing date
Publication date
Application filed by Affibody AB filed Critical Affibody AB
Publication of CN121038816A publication Critical patent/CN121038816A/zh
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    • A61K51/04—Organic compounds
    • A61K51/08—Peptides, e.g. proteins, carriers being peptides, polyamino acids, proteins
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Abstract

本披露涉及一类对B7‑H3具有结合亲和力的经工程化的多肽，并且提供了包含序列EKX3X4ALX7EIX10X11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LNX29X30或与其具有至少93%同一性的序列的B7‑H3结合多肽。本披露还涉及这样的B7‑H3结合多肽作为治疗剂、预后剂、诊断剂和/或治疗诊断剂的用途。

Description

新多肽
技术领域
本披露涉及一类对B7-H3具有结合亲和力的工程化多肽。本披露还涉及这样的B7-H3结合多肽作为治疗剂、预后剂、诊断剂和/或治疗诊断剂的用途。
背景技术
B7-H3生物学
B7-H3（CD276），作为B7家族的成员，是I型跨膜蛋白。此家族的其他成员包括CD80（B7-1）、CD86（B7-2）和PD-L1（B7-H1）。B7家族蛋白及其受体的总体作用是充当免疫应答的共调节因子。据报道，B7-H3在免疫系统中既具有共刺激功能也具有共抑制功能，并在先天免疫应答和适应性免疫应答中均起作用。然而，大多数报道表明，B7-H3是主要在先天免疫应答中起作用的共抑制因子。研究表明，B7-H3抑制TH1应答、CD4/CD8 T细胞活化和增殖、IFNγ产生并降低转录因子活性，从而关闭T细胞应答（Kontos等人, 2021, Clin CancerRes [临床癌症研究] 27, 1227-1235）。
在结构上，B7-H3（45-66 kDa）由细胞外Ig样结构域、跨膜区和短细胞内区构成。B7-H3以两种同种型存在，这两种亚型基于细胞外Ig样结构域的数量表示为4Ig-B7-H3和2Ig-B7-H3。在人类中，由于外显子复制，细胞外结构域由单对免疫球蛋白可变结构域（IgV）和免疫球蛋白恒定结构域（IgC）（2IgB7-H3）或两对相同的免疫球蛋白（4IgB7-H3）组成。小鼠只有2IgB7-H3变体。可溶性B7-H3（sB7-H3；大约37 kDa）由可变剪接，或更常见地，由金属蛋白酶介导的从细胞表面切割而产生。短细胞内结构域没有已知的信号传导。需要进一步的研究来定义和表征B7-H3受体相互作用并阐明其生理作用，这可能有助于对B7-H3相互作用组抑制剂的设计。（Kanchan等人, 2022, Biochim Biophys Acta Rev Cancer [生物化学与生物物理学报-癌症评论] 1877(5),188783）。
B7-H3具有广泛的mRNA表达谱，而稳态下的蛋白质表达有限，这表明存在重要的转录后控制机制。蛋白质表达可以在免疫细胞和非免疫细胞两者中被发现。免疫细胞上的表达相当低，但可以被诱导，尤其是在抗原呈递细胞（APC）上。已在静息成纤维细胞、成骨细胞和内皮细胞以及肾上腺、胰腺、肝、结肠、胃、胎盘、睾丸和前列腺组织中检测到正常非免疫细胞中的表达（Du等人, 2019 Cancer Cell [癌细胞] 35, 221-237）。虽然正常组织中的表达较低，但肿瘤组织经常显示升高水平的B7-H3。在利用B7-H3结合分子进行靶向疗法或作为诊断工具的背景下，肿瘤与健康组织之间的这种差异是重要的（Kontos等人, 同上，以及其中的参考文献）。
癌症中的B7-H3
据描述，B7-H3通过几种不同的机制促成肿瘤发生，这些机制包括促侵袭、促血管生成、促增殖、抗凋亡和代谢重编程（综述于Castellanos等人, 2017, Immunol [免疫学]6, 66-75）中。
B7-H3过表达在60%-90%的患者肿瘤组织中被发现，例如神经母细胞瘤、髓母细胞瘤、胶质瘤、黑色素瘤、白血病以及乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、胃癌、胰腺癌、肾癌和结直肠癌。高表达与肿瘤进展和不良临床结局相关。该表达可以在基质（包括肿瘤相关脉管系统）中以及在肿瘤细胞上均被发现。组织染色显示B7-H3在肿瘤细胞和肿瘤基质的膜、细胞质和细胞核中表达。在结肠癌中，B7-H3的核染色与不良临床结局强烈相关（Ingebrigtsen等人, 2012, Int J Cancer [国际癌症杂志] 131, 2528-2536），这表明肿瘤组织中B7-H3的表达模式的潜在复杂性。
在对1342个肿瘤组织和245个正常组织的分析中，Seaman等人证明了B7-H3在一系列肿瘤组织中的表达，并且重要的是，在肿瘤基质中的表达甚至更高。健康组织不显示B7-H3表达或仅显示中度B7-H3表达，最高表达在肝中被发现（Seaman等人, 2017, CancerCell [癌细胞] 31, 501-515）。在这项研究中，65%的测试的正常组织呈B7-H3阴性，33%呈弱阳性，并且仅1%呈中等阳性。对于肿瘤组织，仅27%的肿瘤细胞和6%的基质细胞被发现呈B7-H3阴性，而30%的肿瘤细胞和51%的基质细胞显示出最高的表达评分，其余百分比分布在弱表达和中等表达之间。这强调了B7-H3在多种肿瘤类型上的总体高表达，以及在肿瘤基质细胞上的显著表达。此外，B7-H3的高表达与转移强烈相关，并且已在晚期癌症患者的血清中观察到sB7-H3（Kanchan等人, 同上）。因此，基于关于B7-H3在许多不同肿瘤类型中过表达（疾病侵袭性和转移的潜在标志物）的可用信息，它似乎在靶向放射疗法、体内诊断应用以及B7-H3作为诊断和预后的非侵入性靶标的用途方面是有吸引力的蛋白质。
B7-H3靶向分子的临床和临床前开发
几种抗B7-H3单克隆抗体或抗体-药物缀合物正处于临床开发中，用于治疗各种肿瘤（综述于Kontos等人, 同上，以及Kasten等人, 2020, Curr Med Chem [当代医学化学]27, 4016-4038中）。这些包括依诺妥珠单抗（enoblituzumab）（一种经Fc优化的靶向B7-H3的单克隆抗体，其使用抗体依赖性细胞毒性来杀死肿瘤细胞）；MGC018、DS-7300a、BAT8009（携带对表达B7-H3的肿瘤的细胞毒性有效载荷的抗体-药物缀合物）；MVC-280/TAK280（靶向B7-H3和CD3的双特异性抗体）；以及奥博妥单抗（omburtamab）（8H9，又名Omblastys®；一种经放射性标记的单克隆B7-H3抗体，其获FDA优先审评，用于治疗患有神经母细胞瘤CNS/软脑膜转移的儿科患者）。在临床试验中，奥博妥单抗已通过以下方式施用：脑室内施用，通过向CNS中的肿瘤正压输注；腹膜内施用，用于治疗促结缔组织增生性小圆细胞肿瘤；以及鞘内施用，用于治疗患有难治性、复发性或晚期CNS或软脑膜疾病的患者。
奥洛他单抗（orlotamab），一种靶向B7-H3和CD3的双特异性抗体，正处于临床开发中，但由于观察到肝酶增加而中止，肝酶增加被认为是由奥洛他单抗与T细胞上的CD3的相互作用触发的细胞因子释放的结果。
来自Burvenich等人的结果支持了将靶向B7-H3的抗体用于诊断目的的可能性，Burvenich等人证明了锆-89标记的靶向B7-H3的人源化单克隆抗体DS-5573a的特异性肿瘤定位（Burvenich等人, 2018, Theranostics [治疗诊断学] 8, 4199-4209）。
迄今为止，除了单克隆抗体Omblastys®之外，尚未发现其他针对B7-H3的经临床探索的放射疗法。如上所描述，其并非被开发用于全身递送。
由于分子的组织渗透率与其大小呈负相关，因此相对大的抗体分子固有地具有较差的组织分布和渗透能力。因此，它可能不是用于在治疗环境中将放射性同位素递送至实体瘤的最佳靶向部分。此外，尽管由于抗体对大量可能的抗原具有高亲和力和特异性而广泛用于各种常规情况，比如用于分析、纯化、诊断和治疗目的，但它们仍然具有缺点。这样的缺点包括聚集倾向和长的全身半衰期，在靶向放射疗法的情况下，后者会增加损伤健康组织的风险。当用于诊断（例如成像）目的时，单克隆抗体由于其长半衰期而同样具有缺点，长半衰期导致对比度不足，除非允许足够的时间以使未结合抗体的水平下降。因此，单克隆抗体对于治疗和诊断用途并不总是最佳的。
基于Z支架并与B7-H3结合的多肽也已有报道。使用基于细胞的选择系统，Stern等人鉴定出了具有适度B7-H3亲和力的B7-H3结合多肽（表示为AC2；Kd 310 nM），其可以被进一步优化以生成具有更高亲和力（Kd 0.9 - 20 nM）的B7-H3结合物（Stern等人, 2019,ACS Comb Sci [ACS组合科学] 21, 207-222；还参见WO 2020041626）。通过将AC2与吲哚菁绿（Bam等人, 2019, Bioconjug Chem [生物共轭化学] 30, 1677-1689）或微气泡（Bam等人, 2020, Clin Cancer Res [临床癌症研究] 26, 2140-2150）缀合，可以证明使用靶向B7-H3的Z支架变体使肿瘤可视化的可行性。此外，经修饰以在C-末端包含基于肽的含半胱氨酸的螯合剂并用99mTc标记的AC12最近被用于表达B7-H3的肿瘤的临床前成像（Oroujeni等人, 2022, Pharmaceutics [药剂学], 14(9):1780）。
分别对AC2和AC12的临床前体内评估表明，对B7-H3的亲和力不足以转化为临床用途，尤其是在改善临床成像中的敏感性和特异性方面（Bam等人, 2019 同上, Bam等人,2020 同上，以及Oroujeni等人, 2022 同上）。这些多肽还具有不令人满意的免疫原性谱。
从上文可以清楚地看出，持续需要提供对B7-H3具有高亲和力和特异性的药剂以用于高对比度成像和脱靶效应，以及具有低免疫原性的药剂以确保安全且耐受良好的治疗剂。
发明内容
本披露的目标是提供新的B7-H3结合剂，其可以例如用于治疗、预后和诊断应用。
本披露的目标是提供一种分子，其允许例如各种形式的癌症的有效疗法，包括治疗诊断应用，同时减轻当前疗法的上述和其他缺点。
此外，本披露的目标是提供一种分子，其适合于预后和诊断应用，例如涉及各种形式的癌症的预后和诊断应用。
对于技术人员来说，从本披露内容中显而易见的这些和其他目标，通过如所附权利要求中所要求的以及如本文中一般披露的不同方面来实现。
因此，在本披露的第一方面，提供了一种B7-H3结合多肽，其包含B7-H3结合基序BM，该基序由选自以下的氨基酸序列组成：
i) EKX3X4ALX7EIX10X11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LNX29 X30（SEQ ID NO:567）
其中，彼此独立地，
X3选自I和V；
X4选自A、D、E、G、H、K、L、M、N、Q、S、T和Y；
X7选自A、G、H和S；
X10选自I和V；
X11选自N和W；
X16选自N和T；
X17选自H和Y；
X18选自A、D、E、G、H、N、Q、S和T；
X20选自I和V；
X21选自K和R；
X25选自A、E、F、H、L和W；
X26选自K和S；
X29选自A、D和E；
X30选自A、D和H；以及
ii) 与i) 中定义的序列具有至少93%同一性的氨基酸序列。
在一个实施方案中，提供了一种B7-H3结合多肽，其包含B7-H3结合基序BM，该基序由选自以下的氨基酸序列组成：
i) EKX3X4ALX7EIX10X11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LNX29 X30（SEQ ID NO:567）
其中，彼此独立地，
X3选自I和V；
X4选自A、D、E、G、H、K、L、M、N、Q、S、T和Y；
X7选自A、G、H和S；
X10选自I和V；
X11选自N和W；
X16选自N和T；
X17选自H和Y；
X18选自A、D、E、G、H、N、Q、S和T；
X20选自I和V；
X21选自K和R；
X25选自A、E、F、H、L和W；
X26选自K和S；
X29选自A、D和E；
X30选自A、D和H；以及
ii) 与i) 中定义的序列具有至少93%同一性的氨基酸序列，条件是，如果X4是Y或X18是G，则X26是K。
在一个实施方案中，提供了一种B7-H3结合多肽，其中，在序列i) 中，
X3选自I和V；
X4选自A、D、E、G、H、K、L、M、N、Q、S、T和Y；
X7选自A、G、H和S；
X10选自I和V；
X11选自N和W；
X16选自N和T；
X17选自H和Y；
X18选自A、D、E、G、H、N、Q、S和T；
X20选自I和V；
X21选自K和R；
X25选自A、E、F、H、L和W；
X26选自K和S；
X29选自A、D和E；并且
X30选自A、D和H。
在一个实施方案中，提供了一种B7-H3结合多肽，其中，在序列i) 中，
X3选自I和V；
X4选自D、E、G、H、K、L、M、N、Q、S、T和Y；
X7选自A、G、H和S；
X10选自I和V；
X11选自N和W；
X16选自N和T；
X17选自H和Y；
X18选自A、D、E、G、H、N、Q、S和T；
X20选自I和V；
X21选自K和R；
X25选自A、E、F、H、L和W；
X26选自K和S；
X29选自A、D和E；并且
X30选自A、D和H。
在一个实施方案中，提供了一种B7-H3结合多肽，其中，在序列i) 中，
X3选自I和V；
X4选自D、G、K、L、M、N、S、T和Y；
X7选自A、G、H和S；
X10是I；
X11选自N和W；
X16是T；
X17是Y；
X18选自A、D、E、H、N、Q、S和T；
X20选自I和V；
X21选自K和R；
X25选自A、E、H和W；
X26是K；
X29选自A、D和E；并且
X30选自A、D和H。
在又另一个实施方案中，提供了一种B7-H3结合多肽，其中，在序列i) 中，
X3是I；
X4选自K和S；
X7选自G和S；
X10是I；
X11是W；
X16是T；
X17是Y；
X18选自E、N和Q；
X20是I；
X21是K；
X25选自A和H；
X26是K；
X29选自A和D；并且
X30选自A和D。
符号“Xn”和“Xm”在本文中用于指示在本文定义的各种氨基酸序列中位置n和m的氨基酸，其中n和m通常是整数，指示如从所述序列的N-末端开始计算的所述序列内氨基酸的位置。在其他氨基酸序列中，n和m可以是小写字母，其仅指示“Xn”和“Xm”残基的内部顺序，即使其他残基可以散布在它们之间。作为前者的实例，X4和X7分别指示从序列i) 的N-末端开始，位置4和位置7的氨基酸。
在根据第一方面的实施方案中，提供了多肽，其中序列i) 中的Xn独立地选自根据表1的一组可能的残基。技术人员将理解，Xn可以选自列出的可能的残基组中的任何一组，并且该选择独立于Xm（其中n≠m）中氨基酸的选择。因此，可以将表1位置Xn中任何列出的可能的残基与表1任何其他可变位置中任何列出的可能的残基独立地组合。
技术人员将理解，表1应如下阅读：在根据第一方面的一个实施方案中，提供了一种多肽，其中序列i) 中的氨基酸残基“Xn”选自“可能的残基”。因此，表1披露了本披露的第一方面的几个特定且个性化的实施方案。例如，在根据第一方面的一个实施方案中，提供了一种多肽，其中序列i) 中的X7选自A、G、H和S，并且在根据第一方面的另一个实施方案中，提供了一种多肽，其中序列i) 中的X7选自G和S。为免生疑问，所列实施方案可以在又其他实施方案中自由组合。例如，一个这样的组合实施方案是多肽，其中X7选自G和S，而X18选自E、N和Q，并且X25选自A和H等。
表1
在定义B7-H3结合多肽的亚类的更特定实施方案中，序列i) 满足九个条件I-IX中的至少五个：
I. X3是I；
II. X10是I；
III. X11选自N和W；
IV. X16是T；
V. X17是Y；
VI. X20是I
VII. X21是K
VIII. X25选自A、E和H；以及
IX. X26是K
在根据第一方面的B7-H3结合多肽的一些实例中，序列i) 满足九个条件I-IX中的至少六个。更特定地，序列i) 可以满足九个条件I-IX中的至少七个，比如九个条件I-IX中的至少八个，比如九个条件I-IX中的全部。
在根据第一方面的B7-H3结合多肽的一些实施方案中，X10是I，X17是Y并且X21是K。在一些实施方案中，X10是I，X17是Y并且X20是I。在一些实施方案中，X11是W，X17是Y并且X20是I。在一些实施方案中，X3是I，X10是I并且X17是Y。在一些实施方案中，X3是I，X17是Y并且X21是K。在一些实施方案中，X3是I，X10是I并且X21是K。
如下面的实验部分中所详细描述的，对B7-H3结合多肽变体的选择导致鉴定出许多属于本披露第一方面中定义的类别的单独B7-H3结合基序（BM）序列。根据该方面，这些序列构成序列i) 或ii) 的单独实施方案。单独B7-H3结合基序的序列对应于SEQ ID NO:1-535中的氨基酸位置8-37。在根据该第一方面的B7-H3结合多肽的一个实施方案中，序列i)对应于选自由SEQ ID NO:1-535组成的组的序列中位置8至位置37的序列。在根据该第一方面的B7-H3结合多肽的另一个实施方案中，序列i) 对应于选自由SEQ ID NO:1-21和480-535组成的组的序列中位置8至位置37的序列。在一个实施方案中，序列i) 对应于选自由SEQ ID NO:1-21组成的组的序列中位置8至位置37的序列。在一个实施方案中，序列i) 对应于选自由SEQ ID NO:1-3组成的组的序列中位置8至位置37的序列。在一个实施方案中，序列i) 对应于SEQ ID NO:1中位置8至位置37的序列。在一个实施方案中，序列i) 对应于SEQ ID NO:2中位置8至位置37的序列。在一个实施方案中，序列i) 对应于SEQ ID NO:3中位置8至位置37的序列。
如技术人员将认识到的，任何多肽的功能，比如本披露多肽的B7-H3结合能力，依赖于多肽的三级结构。因此，对多肽中的氨基酸序列进行微小的改变而不影响其功能是可能的。因此，本披露涵盖B7-H3结合多肽的经修饰变体，其保留了B7-H3结合特性。
这样，本披露涵盖B7-H3结合多肽，其包含与如i) 中所定义的多肽具有93%或更高同一性，比如96%或更高同一性的氨基酸序列。例如，可能的是，属于氨基酸残基的某个功能分组（例如疏水、亲水、极性等）的氨基酸残基可以与来自同一功能组的另一个氨基酸残基交换。
在一些实施方案中，可以在如本文披露B7-H3结合多肽序列的任何位置进行这样的改变。在其他实施方案中，这样的改变可以仅在非可变位置进行，也称为支架氨基酸残基。在这样的情况下，可变位置不允许改变。在其他实施方案中，这样的变化可以仅在可变位置。
根据这样的“可变位置”的一个预期定义，这些是如上定义的序列i) 中用“X”表示的位置。
根据另一个预期定义，“可变位置”是在选择之前在Z变体的选择文库中随机化的那些位置，并且因此可以是例如序列i) 中的位置2、3、4、6、7、10、11、17、18、20、21、25、28、29和30。“可变位置”的该定义不包括位置16和26，它们在这种情况下是支架位置，尽管在每个位置中允许是两个替代方案之一。参考Nord等人 (1995), Prot Eng [蛋白质工程] 8:601-608以及Löfblom等人 (2010), FEBS Letters [欧洲生化学会联合会快报], 584:2670-2680。如同本披露的B7-H3结合Z变体，Nord等人和Löfblom等人披露的多肽也基于来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureuss）的蛋白A的结构域B的Z衍生物的支架，尽管针对其他靶标。如Nord等人（参见例如图4）所示，位置23（对应于本发明B7-H3结合基序中的位置16）和33（对应于本发明B7-H3结合基序中的位置26）的氨基酸分别是N和S。还如Löfblom等人所示，在位置23和33分别具有氨基酸残基N和S的多肽（对应于本发明B7-H3结合基序中的位置16和26；参见Löfblom等人的图2），以及在位置23和33分别具有氨基酸残基T和K的多肽，均具有得以维持的基本结构和功能。因此，在“可变位置”这一定义的上下文中，位置16和26处的氨基酸残基形成共同支架的一部分，并且预期在支架位置16具有N或T，并且在支架位置26具有S或K。
如整个说明书中使用的术语“同一性%”可以例如计算如下。使用CLUSTAL W算法将查询序列与靶标序列比对（Thompson等人, 1994, Nucleic Acids Research [核酸研究],22: 4673-4680）。在对应于最短比对序列的窗口进行比较。在一些情况下，比对序列中最短的可能是靶标序列。在其他情况下，比对序列中最短的可能是查询序列。比较每个位置处的氨基酸残基，并将查询序列中与靶标序列具有相同对应关系的位置百分比报告为同一性%。
在另一个实施方案中，提供了一种B7-H3结合多肽，其包含结合基序序列，该基序序列对应于选自由SEQ ID NO:1-535组成的组的序列中位置8至位置37的序列；或与其具有93%或更高同一性，比如与其具有96%同一性的序列。
在一些实施方案中，如上定义的BM“形成”三螺旋束蛋白结构域的一部分。这被理解为意味着BM的序列被“插入”或“嫁接”到原始三螺旋束结构域的序列上，使得BM替代了原始结构域中的类似结构基序。例如，不希望被理论所束缚，BM被认为构成了三螺旋束的三个螺旋中的两个，并且因此可以替代任何三螺旋束内的这样的双螺旋基序。如技术人员将认识到的，必须进行用两个BM螺旋替代三螺旋束结构域的两个螺旋，以便不影响多肽的基本结构。也就是说，根据本发明的该实施方案，多肽的Cα主链的整体折叠与其形成一部分的三螺旋束蛋白结构域的折叠基本上相同，例如具有相同顺序的相同二级结构元件等。因此，如果根据该实施方案的多肽具有与原始结构域相同的折叠，则根据本披露的BM“形成三螺旋束结构域的一部分”，这意味着基本结构特性是共有的，这些特性例如导致相似的CD谱。技术人员知道相关的其他参数。
在特定实施方案中，B7-H3结合基序（BM）因此形成三螺旋束蛋白结构域的一部分。例如，在所述三螺旋束蛋白结构域内，BM可以基本上构成两个具有互连环的α螺旋。在特定实施方案中，所述三螺旋束蛋白结构域选自细菌受体结构域。在一些实施方案中，三螺旋束蛋白结构域选自来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的结构域或其衍生物。这样的结构域的非限制性实例是来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的五个不同的三螺旋结构域，比如结构域B，及其衍生物。在一些实施方案中，三螺旋束蛋白结构域是蛋白Z的变体，其来源于葡萄球菌蛋白A的结构域B（Wahlberg E等人, 2003, PNAS [美国国家科学院院刊] 100(6):3185-3190）。
在一些实施方案中，如本文披露的B7-H3结合多肽形成三螺旋束蛋白结构域的一部分，B7-H3结合多肽包含结合模块（BMod），该结合模块的氨基酸序列选自：
iii)K-[BM]-PSQSXaXbLLXcEAKKLXdXeXfQ（SEQ ID NO:568）；
其中[BM]是根据本文任何定义的B7-H3结合基序；
Xa选自A和S；
Xb选自E和N；
Xc选自A、S和C；
Xd选自E、N和S；
Xe选自D、E和S；并且
Xf选自A和S；以及
iv)与iii) 中定义的序列具有至少93%同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述多肽在生产和储存期间以及在体内可以有利地表现出高结构稳定性，比如对化学修饰、物理条件变化和蛋白水解的抗性。
如上所讨论，与上述氨基酸序列相比包含微小变化（这些变化不会对多肽的三级结构和功能产生很大影响）的多肽也在本披露的范围内。因此，在一些实施方案中，序列iv)与由iii) 定义的序列具有至少93%，比如至少95%、比如至少97%同一性。
在一个实施方案中，序列iii) 中的Xa是A。
在一个实施方案中，序列iii) 中的Xa是S。
在一个实施方案中，序列iii) 中的Xb是N。
在一个实施方案中，序列iii) 中的Xb是E。
在一个实施方案中，序列iii) 中的Xc是A。
在一个实施方案中，序列iii) 中的Xc是S。
在一个实施方案中，序列iii) 中的Xc是C。
在一个实施方案中，序列iii) 中的Xd是E。
在一个实施方案中，序列iii) 中的Xd是N。
在一个实施方案中，序列iii) 中的Xd是S。
在一个实施方案中，序列iii) 中的Xe是D。
在一个实施方案中，序列iii) 中的Xe是E。
在一个实施方案中，序列iii) 中的Xe是S。
在一个实施方案中，序列iii) 中的XdXe选自EE、ES、SD、SE和SS。
在一个实施方案中，序列iii) 中的XdXe是ES。
在一个实施方案中，序列iii) 中的XdXe是SE。
在一个实施方案中，序列iii) 中的XdXe是SD。
在一个实施方案中，序列iii) 中的Xf是A。
在一个实施方案中，序列iii) 中的Xf是S。
在一个实施方案中，在序列iii) 中，Xa是A；Xb是N；Xc是A，并且Xf是A。
在一个实施方案中，在序列iii) 中，Xa是S；Xb是E；Xc是A，并且Xf是A。
在一个实施方案中，在序列iii) 中，Xa是A；Xb是N；Xc是C，并且Xf是A。
在一个实施方案中，在序列iii) 中，Xa是S；Xb是E；Xc是S，并且Xf是S。
在一个实施方案中，在序列iii) 中，Xa是S；Xb是E；Xc是C，并且Xf是S。
在一个实施方案中，在序列iii) 中，Xa是A；Xb是N；Xc是A；XdXe是ND，并且Xf是A。
在一个实施方案中，在序列iii) 中，Xa是S；Xb是E；Xc是A；XdXe是ND，并且Xf是A。
在一个实施方案中，在序列iii) 中，Xa是A；Xb是N；Xc是C；XdXe是ND，并且Xf是A。
在一个实施方案中，在序列iii) 中，Xa是S；Xb是E；Xc是S；XdXe是ND，并且Xf是S。
在一个实施方案中，在序列iii) 中，Xa是S；Xb是E；Xc是C；XdXe是ND，并且Xf是S。
在一个实施方案中，在序列iii) 中，Xa是A；Xb是N；Xc是A；XdXe是SE，并且Xf是A。
在一个实施方案中，在序列iii) 中，Xa是S；Xb是E；Xc是A；XdXe是SE，并且Xf是A。
在一个实施方案中，在序列iii) 中，Xa是A；Xb是N；Xc是C；XdXe是SE，并且Xf是A。
在一个实施方案中，在序列iii) 中，Xa是S；Xb是E；Xc是S；XdXe是SE，并且Xf是S。
在一个实施方案中，在序列iii) 中，Xa是S；Xb是E；Xc是C；XdXe是SE，并且Xf是S。
在一个实施方案中，在序列iii) 中，Xa是A；Xb是N；Xc是A；XdXe是SD，并且Xf是A。
在一个实施方案中，在序列iii) 中，Xa是S；Xb是E；Xc是A；XdXe是SD，并且Xf是A。
在一个实施方案中，在序列iii) 中，Xa是A；Xb是N；Xc是C；XdXe是SD，并且Xf是A。
在一个实施方案中，在序列iii) 中，Xa是S；Xb是E；Xc是S；XdXe是SD，并且Xf是S。
在一个实施方案中，在序列iii) 中，Xa是S；Xb是E；Xc是C；XdXe是SD，并且Xf是S。
在另外的实施方案中，序列iii) 对应于选自由SEQ ID NO:1-535组成的组的序列中位置7至位置55的氨基酸序列。在一个实施方案中，序列iii) 对应于选自由SEQ ID NO:1-21和480-535组成的组的序列中位置7至位置55的氨基酸序列。在另一个实施方案中，序列iii) 对应于选自由SEQ ID NO:1-21组成的组的序列中位置7至位置55的氨基酸序列。在一个实施方案中，序列iii) 对应于选自由SEQ ID NO:1-3组成的组的序列中位置7至位置55的氨基酸序列。在又另一个实施方案中，序列iii) 对应于SEQ ID NO:1中位置7至位置55的氨基酸序列。在又另一个实施方案中，序列iii) 对应于SEQ ID NO:2中位置7至位置55的氨基酸序列。在又另一个实施方案中，序列iii) 对应于SEQ ID NO:3中位置7至位置55的氨基酸序列。
此外，在另外的实施方案中，提供了如本文所描述的B7-H3结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
v)YA-[BMod]-AP（SEQ ID NO:569）；
其中[BMod]是如上定义的B7-H3结合分子；以及
vi)与由v) 定义的序列具有至少86%同一性的氨基酸序列。
如上所讨论，与上述氨基酸序列相比包含微小变化（不会对三级结构及其功能产生很大影响）的多肽也落入本披露的范围内。因此，在一些实施方案中，如上定义的B7-H3结合多肽可以例如具有序列vi)，该序列vi) 与由v) 定义的序列具有至少86%，比如至少88%、比如至少90%、比如至少92%、比如至少94%、比如至少96%、比如至少98%同一性。
在一些实施方案中，B7-H3结合基序可以形成包含选自以下的氨基酸序列的多肽的一部分：
VDAKYAK-[BM]-PSQSSELLSEAKKLNDSQAPK（SEQ ID NO:570）；
AEAKFAK-[BM]-PSQSSELLSEAKKLSESQAPK（SEQ ID NO:571）；
AEAKYAK-[BM]-PSQSSELLSEAKKLNDSQAPK（SEQ ID NO:572）；
AEAKFAK-[BM]-PSQSSELLSEAKKLNDSQAPK（SEQ ID NO:573）；
AEAKFAK-[BM]-PSQSSELLSEAKKLNESQAPK（SEQ ID NO:574）；
AEAKYAK-[BM]-PSQSSELLSEAKKLSESQAPK（SEQ ID NO:575）；
ADNNFNK-[BM]-PSQSANLLSEAKKLNESQAPK（SEQ ID NO:576）；
ADNKFNK-[BM]-PSQSANLLAEAKKLNDAQAPK（SEQ ID NO:577）；
ADNKFNK-[BM]-PSVSKEILAEAKKLNDAQAPK（SEQ ID NO:578）；
ADAQQNNFNK-[BM]-PSQSTNVLGEAKKLNESQAPK（SEQ ID NO:579）；
AQHDE-[BM]-PSQSANVLGEAQKLNDSQAPK（SEQ ID NO:580）；
VDNKFNK-[BM]-PSQSANLLAEAKKLNDAQAPK（SEQ ID NO:581）；
AEAKYAK-[BM]-PSESSELLSEAKKLNKSQAPK（SEQ ID NO:582）；
VDAKYAK-[BM]-PSQSSELLAEAKKLNDAQAPK（SEQ ID NO:583）；
VDAKYAK-[BM]-PSQSSELLAEAKKLNDSQAPK（SEQ ID NO:584）；
VDAKYAK-[BM]-PSQSSELLSEAKKLSESQAPK（SEQ ID NO:585）；
VDAKYAK-[BM]-PSQSSELLSEAKKLESSQAPK（SEQ ID NO:586）；
VDAKYAK-[BM]-PSQSSELLAEAKKLNKAQAPK（SEQ ID NO:587）；以及
AEAKYAK-[BM]-PSQSSELLAEAKKLNKAQAPK（SEQ ID NO:588）；
其中[BM]是如上定义的B7-H3结合基序。
在一个实施方案中，提供了如本文所描述的B7-H3结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
vii)VDAKYAK-[BM]-PSQSSELLSEAKKLNDSQAPK（SEQ ID NO:570）；
其中[BM]是如本文定义的B7-H3结合基序；以及
viii)与由vii) 定义的序列具有至少86%同一性的氨基酸序列。
在另外的实施方案中，提供了如本文所描述的B7-H3结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
ix)AEAKFAK-[BM]-PSQSSELLSEAKKLSESQAPK（SEQ ID NO:571）；
其中[BM]是如本文定义的B7-H3结合基序；以及
x)与由ix) 定义的序列具有至少86%同一性的氨基酸序列。
在另外的实施方案中，序列ix) 选自由SEQ ID NO:15-16、420-424、427-428、430-436、438-444和480-535组成的组。
在另一个另外的实施方案中，提供了如本文所描述的B7-H3结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
xi)AEAKYAK-[BM]-PSQSSELLSEAKKLNDSQAPK（SEQ ID NO:572）；
其中[BM]是如本文定义的B7-H3结合基序；以及
xii)与由xi) 定义的序列具有至少86%同一性的氨基酸序列。
在另一个另外的实施方案中，序列xi) 选自由SEQ ID NO:1-13、17-418和446-479组成的组。在另一个实施方案中，序列xi) 选自由SEQ ID NO:1-13和SEQ ID NO:17-21组成的组。在另一个实施方案中，序列xi) 选自由SEQ ID NO:1-3组成的组。在另一个实施方案中，序列xi) 是SEQ ID NO:1。在另一个实施方案中，序列xi) 是SEQ ID NO:2。在另一个实施方案中，序列xi) 是SEQ ID NO:3。
在另一个另外的实施方案中，B7-H3结合多肽包含选自以下的氨基酸序列：
xiii)AEAKFAK-[BM]-PSQSSELLSEAKKLNESQAPK（SEQ ID NO:573）；
其中[BM]是如本文定义的B7-H3结合基序；以及
xiv)与由xiii) 定义的序列具有至少86%同一性的氨基酸序列。
在另一个另外的实施方案中，序列xiii) 选自SEQ ID NO:14、425-426、429、437和445。
在一个实施方案中，提供了如本文所描述的第一方面的B7-H3结合多肽，其能够与B7-H3结合，使得与B7-H3的相互作用的KD值为至多1 × 10-6 M，例如至多5 × 10-7 M、例如至多1 × 10-7 M、例如至多5 × 10-8 M、例如至多1 × 10-8 M。
本说明书中使用的术语“B7-H3结合”和“对B7-H3的结合亲和力”是指多肽的特性，其可以例如通过ELISA、通过动力学排除测定（KinExA®）和/或通过各种基于传感器的技术，比如表面等离子体共振（SPR）技术、生物层干涉测量（BLI；例如Octet®）和石英晶体微量天平（QCM）技术进行测试。
例如，如以下实验部分所描述，可以在实验中测试B7-H3结合亲和力，其中将多肽样品捕获在经抗体涂覆的ELISA板上，并添加生物素化的B7-H3，随后添加链霉亲和素缀合的HRP。添加TMB底物，并且使用多孔读板仪来测量在450 nm处的吸光度。然后，技术人员可以解释通过这样的实验获得的结果，以建立多肽对B7-H3的结合亲和力的至少一种定性测量。如果期望的是定量量度，例如确定相互作用的EC50值（半数最大有效浓度），还可以使用ELISA。使用如上所描述的ELISA测量多肽对连续稀释的生物素化的B7-H3的应答。然后，技术人员可以对通过这样的实验获得的结果进行解读，并且可以使用例如GraphPad Prism 5和非线性回归根据结果计算EC50值。
也可通过上述不同的基于传感器的方法确定结合相互作用的亲和力，例如定义为平衡解离常数（KD）。重要的是，由于这些技术实时测量结合，因此还可以评估相互作用的动力学特性，包括缔合速率（ka）和解离速率（kd）。一种这样的技术基于表面等离子体共振（SPR）。在此，将B7-H3或其片段固定在传感器芯片上，并且通过连续稀释制备要确定亲和力的多肽的样品并将其注射在芯片上。替代性地，将要测试的多肽固定在仪器的传感器芯片上，并且使含有B7-H3或其片段的样品通过芯片。结合值可例如在Biacore（思拓凡公司（Cytiva））、Sierra（布鲁克公司（Bruker））、Carterra（卡特拉公司（Carterra））或ProteOnXPR 36（伯乐公司（Bio-Rad））仪器中定义。然后，可使用例如仪器制造商提供的BiacoreInsight评价软件的1:1朗缪尔（Langmuir）结合模型或其他合适的模型和软件根据结果计算KD值和/或动力学常数。类似地，B7-H3的结合动力学和亲和力也可通过BLI进行评估，该BLI是一种分析从两个表面反射的白光的干涉图样的光学分析技术：生物传感器尖端上的固定蛋白质层和内部参考层。通过BLI技术的测量可以例如在Octet® HTX系统（赛多利斯公司（Sartorius）中进行，并且数据由仪器制造商提供的适当模型和软件进行监测和分析。
也可以使用基于QCM技术的连续流动系统获得B7-H3结合亲和力的量度。为监测结合相互作用，将相互作用的分子或其片段之一固定在传感器表面上，并将含有另一个分子的样品注入传感器表面。信号输出以频率（Hz）给出，并与传感器表面的质量变化直接相关。通过QCM技术的动力学测量可以例如在Attana A200®（阿塔纳公司（Attana））仪器中进行。数据由Attester软件收集，然后可以使用例如1:1朗缪尔结模型根据结果计算KD值，随后在仪器制造商提供的评估软件或其他合适软件中进行处理。
用于确定对B7-H3的结合亲和力的另一种方法是动力学排除测定（KinExA®；萨皮达因仪器公司（Sapidyne Instruments Inc）；Darling和Brault, 2004, Assay and DrugDev Tech [检测和药物开发技术] 2(6):647-657），其用于测量溶液中未修饰分子之间的平衡结合亲和力和动力学。对于亲和力分析，平衡解离常数KD和缔合率ka是实验确定的，而解离率kd可以基于等式kd = KD ka来计算。
KinExA® KD分析需要一个相互作用配偶体（例如，滴定的结合配偶体）固定在固相中，然后一旦达到平衡，将该固相用作探针来捕获溶液中游离的另一个相互作用配偶体（例如，恒定结合配偶体）。对于每个实验，将具有一个结合配偶体的恒定浓度和另一个结合配偶体的滴定浓度的一系列溶液进行平衡。然后将溶液短暂暴露于固相，并且捕获一部分游离的恒定结合配偶体并用荧光二级分子进行标记。与固相的短接触时间小于溶液中预先形成的复合物的解离所需的时间，这意味着溶液与固相滴定的结合配偶体之间的竞争被“动力学排除”。由于固相仅用作每个样品中游离恒定结合配偶体的探针，因此在测量期间溶液平衡不会改变。从捕获的游离恒定结合配偶体生成的信号计算KD值，这些信号与平衡样品中游离恒定结合配偶体的浓度成正比。可以使用KinExA® Pro软件和最小二乘法分析来分析数据，以将KD和活性结合位点浓度（ABC）的最佳解拟合到代表化学计量相关模型的曲线，例如1:1可逆双分子相互作用。
可以按与平衡分析类似的格式进行经由KinExA®的结合动力学确定，除了测量是“预平衡”收集的，并且结合信号是时间和滴定的结合配偶体总浓度的函数。存在可用于确定ka的两种方法。“直接法”将滴定和恒定结合配偶体的浓度保持不变，并随时间探测溶液。随着样品向平衡方向移动，溶液中游离恒定结合配偶体的数量将减少。“注射法”保持温育时间和一个配偶体的浓度固定，同时滴定另一个配偶体的浓度。随着滴定的结合配偶体的浓度增加，随着更多复合物的形成，游离恒定结合配偶体的量将减少。
如本披露中使用的术语“白蛋白结合”和“对白蛋白的结合亲和力”是指多肽的一种特性，其可以例如通过ELISA、SPR、BLI、QCM和/或KinExA®，以与上文针对B7-H3所描述的实例类似的方式进行测试。
技术人员将理解，根据本文披露的任何方面，可以对B7-H3结合多肽进行各种修饰和/或添加，以便在不脱离本披露范围的情况下，使多肽适应特定的应用。例如，在一个实施方案中，提供了如本文所描述的B7-H3结合多肽，该多肽在C末端和/或N末端处延伸了和/或包含另外的氨基酸。这样的多肽应理解为在多肽链中的最前和/或最后位置处具有一个或多个另外的氨基酸残基的多肽。因此，B7-H3结合多肽可以包含任何合适数量的另外的氨基酸残基，例如至少一个另外的氨基酸残基。每个另外的氨基酸残基均可以单独或共同添加，以便例如改善和/或简化多肽的生产、纯化、体内或体外稳定、偶联或检测。这样的另外的氨基酸残基可以包含一个或多个为化学偶联目的而添加的氨基酸残基。其中一个实例是添加半胱氨酸残基。另外的氨基酸残基还可以提供用于多肽纯化或检测的“标签”，比如His6标签、(HisGlu)3标签（“HEHEHE”标签）或”myc”（c-myc）标签或”FLAG”标签，用于与对该标签特异的抗体或在His6标签的情况下的固定化金属亲和色谱（IMAC）相互作用。
在一个实施方案中，提供了如本文所描述的B7-H3结合多肽，其在C-末端和/或N-末端处包含另外的氨基酸。例如，在如本文披露的B7-H3结合多肽的一个实施方案中，它由本文披露的任一种序列组成，具有0至30个另外的C-末端和/或N-末端残基，比如0至25个、比如0至20个、比如0至15个、比如0至10个、比如0至7个另外的C-末端和/或N-末端残基。在一个实施方案中，B7-H3结合多肽由本文披露的任一种序列组成，具有0至25个、比如0至15个、比如0至4个、比如3个另外的C-末端残基。
在一个另外的实施方案中，提供了如本文所描述的B7-H3结合多肽，其在C-末端和/或N-末端处包含另外的氨基酸，其中所述另外的氨基酸改善多肽的产生、纯化、体外或体内的稳定化、偶联或检测。
如上所讨论的另外的氨基酸可以通过化学缀合（使用已知的有机化学方法）或通过任何其他方式与B7-H3结合多肽偶联，比如将B7-H3结合多肽表达为融合蛋白或以任何其他方式直接或经由接头（例如氨基酸接头）连接。
此外，另外的多肽结构域可以提供另一个B7-H3结合部分。因此，在另外的实施方案，提供了一种呈多聚体形式的B7-H3结合多肽。所述多聚体被理解为包含至少两个如本文披露的B7-H3结合多肽作为单体单元，这些单体单元的氨基酸序列可以是相同的或不同的。多肽的多聚体形式可以包含合适数量的结构域，每个结构域均具有B7-H3结合基序，并且每个结构域均在多聚体内形成单体。这些结构域可以具有相同的氨基酸序列，但替代性地，它们可以具有不同的氨基酸序列。换言之，本发明的B7-H3结合多肽可以形成同源或异源多聚体，例如同源或异源二聚体。在一个实施方案中，提供了一种B7-H3结合多肽，其中所述单体单元共价偶联在一起。在另一个实施方案中，所述B7-H3结合多肽单体单元被表达为融合蛋白。在一个实施方案中，提供了呈二聚体形式的B7-H3结合多肽。在一个特定实施方案中，所述二聚体形式是同源二聚体形式。在另一个实施方案中，所述二聚体形式是异源二聚体形式。在这一点上，为了清楚起见，在整个本披露中，术语“B7-H3结合多肽”用于涵盖呈所有形式的B7-H3结合多肽，即包括单体和多聚体形式两者。
如上所讨论的另外的氨基酸可以例如包含一个或多个另外的多肽结构域。另一个多肽结构域可以为B7-H3结合多肽提供另一种功能，比如另一种结合功能、或酶功能、或毒性功能或荧光信号传导功能、或其组合。
此外，可能有益的是，如本文定义的B7-H3结合多肽是包含第二部分或另外的部分的融合蛋白或缀合物的一部分。这样的蛋白质中融合多肽或缀合物的第二部分和一个或多个另外的部分可以适当地具有期望的生物活性。
因此，在本披露的第二方面，提供了一种融合蛋白或缀合物，其包含：
-由根据第一方面的B7-H3结合多肽组成的第一部分；以及
-由具有期望的生物活性的多肽组成的第二部分。
在一个实施方案中，所述融合蛋白或缀合物可以额外地包含另外的部分，其包含期望的生物活性，这些生物活性可以与第二部分的生物活性相同或不同。
期望的生物活性的非限制性实例包括治疗活性、结合活性和酶促活性。在一个实施方案中，提供了根据第二方面的融合蛋白，其中所述生物活性是治疗活性。在一个实施方案中，提供了根据第二方面的融合蛋白，其中所述生物活性是结合活性。在一个实施方案中，提供了根据第二方面的融合蛋白，其中所述生物活性是酶促活性。
在一个实施方案中，具有期望的生物活性的第二部分是治疗活性多肽。治疗活性多肽的非限制性实例是生物分子，比如选自由人内源性酶、激素、生长因子、趋化因子、细胞因子和淋巴因子组成的组的分子。
在本披露第一方面或第二方面的一个实施方案中，提供了一种B7-H3结合多肽、包含抗癌剂的融合蛋白或缀合物。在第二方面的一个实施方案中，融合蛋白或缀合物中的所述第二部分是抗癌剂。在此背景下使用的抗癌剂的非限制性实例包括选自由以下组成的组的药剂：奥瑞他汀、蒽环类、卡奇霉素（calicheamicin）、康普瑞汀（combretastatin）、多柔比星、多卡霉素（duocarmycin）、CC-1065抗肿瘤抗生素、依特那斯汀（ecteinsascidin）、格尔德霉素（geldanamycin）、美登素类（maytansinoid）、甲氨蝶呤、真菌毒素、紫杉醇、蓖麻毒素、布甘宁（bouganin）、吉洛宁（gelonin）、假单胞菌外毒素38（PE38）、白喉毒素（DT）及其类似物和其衍生物及其组合。本领域技术人员将理解，抗癌剂的非限制性实例包括所述药剂的所有可能的变体，例如药剂奥瑞他汀旨在包括例如奥瑞他汀E、奥瑞他汀F、奥瑞他汀PE及其衍生物。
在本披露的第二方面的一个实施方案中，提供了一种B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中第二部分的所述生物活性是结合活性。在一个实施方案中，所述结合活性是白蛋白结合活性，其增加融合蛋白或缀合物的体内半衰期和/或改变融合蛋白或缀合物的生物分布特性。在一个实施方案中，提供了如本文所描述的融合蛋白，其中所述结合活性增加融合蛋白或缀合物的体内半衰期。在另一个实施方案中，提供了如本文所描述的融合蛋白，其中所述结合活性改变融合蛋白或缀合物的生物分布特性。在一个实施方案中，结合活性用于阻断生物活性。结合活性的非限制性实例是增加融合蛋白或缀合物的体内半衰期、改变融合蛋白或缀合物的生物分布特性的结合活性，和/或用于例如阻断、抑制、活化、增强、拮抗生物活性或使生物活性激动的结合活性。这样的结合活性的一个实例是增加融合蛋白或缀合物的体内半衰期的结合活性。在所述融合蛋白或缀合物的一个实施方案中，所述融合蛋白或缀合物的体内半衰期长于B7-H3结合多肽本身的体内半衰期。在一个实施方案中，与B7-H3结合多肽本身的体内半衰期相比，所述体内半衰期增加到至少10倍，比如至少25倍、比如至少50倍、比如至少75倍、比如至少100倍。这样的结合活性的另一个实例是改变融合蛋白或缀合物的生物分布特性的结合活性。在所述融合蛋白或缀合物的一个实施方案中，所述融合蛋白或缀合物的生物分布特性发生改变，使得融合蛋白或缀合物在肾中的保留量低于B7-H3结合多肽本身。在一个实施方案中，与B7-H3结合多肽本身的保留相比，所述保留减少到至多1/2，比如至多1/4、比如至多1/6、比如至多1/8、比如至多1/10、比如至多1/15。
如讨论的，融合蛋白或缀合物可以包含至少一个对靶标具有结合活性的另外的部分。在一个具体的实施方案中，所述靶标是白蛋白，与其结合增加了所述融合蛋白或缀合物的体内半衰期。在一个这样的实施方案中，所述白蛋白结合活性由链球菌蛋白G或其衍生物的白蛋白结合结构域（ABD）提供。因此，所述融合蛋白可以例如包含如本文定义的呈单体或多聚体形式（比如同源二聚体或异源二聚体形式）的B7-H3结合多肽和链球菌蛋白G或其衍生物的ABD。链球菌蛋白G的ABD的衍生物是本领域技术人员已知的，例如根据WO 2009/016043、WO 2012/004384和WO 2014/048977，均通过援引特此并入。ABD可以例如包含选自由SEQ ID NO:547、548和631组成的组的氨基酸序列。在一个实施方案中，ABD包含SEQ IDNO:547。在另一个实施方案中，ABD包含SEQ ID NO:548。在另外的实施方案中，ABD包含SEQID NO:631。应该理解的是，所述白蛋白结合结构域（ABD）可以位于B7-H3结合多肽的C-末端处和/或B7-H3结合多肽的N-末端处。
在本披露的该方面的特定实施方案中，使用本披露的特定多肽作为B7-H3结合部分、白蛋白结合部分和接头序列（进一步参见下文），融合蛋白或缀合物包含选自由SEQ IDNO:550-566和SEQ ID NO:632-634组成的组的氨基酸序列（或由该氨基酸序列组成）。在一个实施方案中，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO:550-557组成的组。在另一个实施方案中，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO:558-560组成的组。在另一个实施方案中，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO:561-563组成的组。在另一个实施方案中，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO:564-566组成的组。在另一个实施方案中，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO:632-634组成的组。在一个实施方案中，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO:557、560、563和566组成的组。在特定实施方案中，所述氨基酸序列是SEQ ID NO:557。在另一个特定实施方案中，所述氨基酸序列是SEQ ID NO:560。在特定实施方案中，所述氨基酸序列是SEQ IDNO:563。在特定实施方案中，所述氨基酸序列是SEQ ID NO:566。在一个实施方案中，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO:555、558、561和564组成的组。在特定实施方案中，所述氨基酸序列是SEQ ID NO:555。在另一个特定实施方案中，所述氨基酸序列是SEQ ID NO:558。在特定实施方案中，所述氨基酸序列是SEQ ID NO:561。在特定实施方案中，所述氨基酸序列是SEQ ID NO:564。在一个实施方案中，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO:556、559、562和565组成的组。在特定实施方案中，所述氨基酸序列是SEQ ID NO:556。在另一个特定实施方案中，所述氨基酸序列是SEQ ID NO:559。在特定实施方案中，所述氨基酸序列是SEQ ID NO:562。在特定实施方案中，所述氨基酸序列是SEQ ID NO:565。在一个实施方案中，所述氨基酸序列选自由SEQ ID NO:632、633和634组成的组。在特定实施方案中，所述氨基酸序列是SEQ ID NO:632。在另一个特定实施方案中，所述氨基酸序列是SEQ ID NO:633。在特定实施方案中，所述氨基酸序列是SEQ ID NO:634。
在另一个实施方案中，提供了一种融合蛋白或缀合物，其中具有期望的结合活性的所述第二部分是基于蛋白Z的蛋白质，来源于来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的B结构域，对除B7-H3之外的靶标具有结合亲和力。
在另一个实施方案中，提供了如本文所描述的融合蛋白或缀合物，其中所述第二部分选自由以下组成的组：人内源性酶、激素、生长因子、趋化因子、细胞因子和淋巴因子。
在另一个实施方案中，提供了一种融合蛋白或缀合物，其中具有期望的结合活性的所述第二部分是抗体或其抗原结合片段。众所周知，抗体是免疫球蛋白分子，其能够通过免疫球蛋白分子上的至少一个抗原识别位点特异性结合靶标（抗原），比如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽或其他。如本文所用，术语“抗体或其抗原结合片段”不仅涵盖全长或完整的多克隆或单克隆抗体，还涵盖其抗原结合片段，例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fab3、Fv及其变体、包含一个或多个抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、微抗体、二抗体、三抗体、四抗体、线性抗体、单链抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体）和包含所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其他经修饰的构型，包括抗体的糖基化变体、抗体和共价修饰的抗体的氨基酸序列变体。经修饰的抗体及其抗原结合片段的进一步的实例包括纳米抗体、AlbudAb、DART（双亲和力重靶向）、BiTE（双特异性T细胞衔接子）、TandAb（串联双抗体）、DAF（双重作用Fab）、二合一抗体、SMIP（小型模块免疫药物）、FynomAb（与抗体融合的fynomer）、DVD-Ig（双可变结构域免疫球蛋白）、CovX抗体（肽修饰的抗体）、双抗体和三功能抗体（triomAb）。抗体及其抗原结合片段的变体的列表不应被视为限制性的，并且技术人员知道其他合适的变体。
在一个实施方案中，所述至少一种抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：全长抗体、Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、单链Fab（scFab）片段、Fc片段、Fv片段、单链Fv（scFv）片段、(scFv)2、scFv-Fc构建体和结构域抗体。在一个实施方案中，所述至少一种抗体或其抗原结合片段选自全长抗体、Fab片段和scFv片段。在一个特定实施方案中，所述至少一种抗体或其抗原结合片段是全长抗体。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体及其抗原结合片段。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段对抗原（例如与癌症相关的抗原）具有亲和力。
如本文披露的缀合物可以通过将如本文所描述的至少一个B7-H3结合多肽或融合蛋白与至少一个另外的部分缀合来产生。技术人员知道缀合方法，比如常规化学缀合方法，例如使用带电的琥珀酰亚胺酯或碳二亚胺。
技术人员知道融合蛋白的构建通常包括在待融合的功能部分之间使用接头，并且存在具有不同特性的不同种类的接头，比如柔性氨基酸接头、刚性氨基酸接头和可切割氨基酸接头。接头可用于例如增加融合蛋白的稳定性或改善其折叠、增加表达、改善生物活性、实现靶向和改变融合蛋白的药代动力学。因此，在一个实施方案中，提供了根据本文披露的任何方面的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其进一步包含至少一个接头，比如至少一个选自柔性氨基酸接头、刚性氨基酸接头和可切割氨基酸接头的接头。在一个实施方案中，所述接头布置在所述B7-H3结合多肽与另外的多肽结构域之间。在一个实施方案中，接头布置在如本文披露的两个B7-H3结合多肽或结构域之间；例如在如本文披露的B7-H3结合结构域与白蛋白结合结构域之间；或在如本文披露的B7-H3结合结构域与结合并非B7-H3的不同靶标的Z变体之间；或例如在如本文披露的B7-H3结合结构域与抗体或其抗原结合片段之间。当连接的结构域需要一定程度的移动或相互作用时，柔性接头经常用于本领域，并且在一些实施方案中可能特别有用。这样的接头通常由小的、非极性（例如G）或极性（例如S或T）氨基酸组成。一些柔性接头主要由G和S残基的区段组成，例如 (GGGGS)p。调整拷贝数“p”可用于优化接头，以实现功能部分之间的适当分离或维持必要的部分间相互作用。除了G和S接头之外，其他柔性接头是本领域已知的，比如含有另外的氨基酸残基（比如T和A）以保持柔性的G和S接头，以及提高溶解性的极性氨基酸残基。接头的另外的非限制性实例分别包括AGS、ASGS（SEQ ID NO:589）、GAPGGGGS（SEQ ID NO:590）、GAPGGGGSGGGGSGGGGSTSA（SEQ ID NO:591）、GGGGSLVPRGSGGGGS（SEQ ID NO:592）、(GS)3（SEQ ID NO:593）、(GS)4（SEQID NO:594）、(GS)8（SEQ ID NO:595）、GGSGGHMGSGG（SEQ ID NO:596）、GGSGGSGGSGG（SEQ IDNO:597）、GGSGG（SEQ ID NO:598）、GGSGGGGG（SEQ ID NO:599）、GGGSEGGGSEGGGSEGGG（SEQID NO:600）、AAGAATAA（SEQ ID NO:601）、GGGGG（SEQ ID NO:602）、GGSSG（SEQ ID NO:603）、GSGGGTGGGSG（SEQ ID NO:604）、GSGSGSGSGGSG（SEQ ID NO:605）、GSGGSGGSGGSGGS（SEQ IDNO:606）、GSGGSGSGGSGGSG（SEQ ID NO:607）、GGGGSAS（SEQ ID NO:608）和GT。技术人员知道其他合适的接头。
在一个实施方案中，所述接头是包含甘氨酸（G）、丝氨酸（S）和/或苏氨酸（T）残基的柔性接头。在一个实施方案中，所述接头具有选自 (GnSm)p和 (SnGm)p的通式，其中独立地，n = 1-7，m = 0-7，n + m ≤ 8并且p = 1-7。在一个实施方案中，n = 1-5。在一个实施方案中，m = 0-5。在一个实施方案中，p = 1-5。在更特定的实施方案中，n = 4，m = 1并且p= 1-5。在一个实施方案中，所述接头选自由以下组成的组：S4G（SEQ ID NO:609）、(S4G)3（SEQ ID NO:610）和 (S4G)4（SEQ ID NO:611）。在一个实施方案中，所述接头选自由以下组成的组：G4S（SEQ ID NO:612）、(G4S)2（SEQ ID NO:613）、(G4S)3（SEQ ID NO:614）、(G4S)4（SEQ ID NO:615）和 (G4S)5（SEQ ID NO:616）。在一个特定实施方案中，所述接头是G4S。在另一个实施方案中，所述接头是 (G4S)2。在另一个实施方案中，所述接头是 (G4S)3。在另一个实施方案中，所述接头是 (G4S)5。
在另一个实施方案中，所述接头是包含丙氨酸（A）、谷氨酸（E）、赖氨酸（K）、脯氨酸（P）和/或苏氨酸（T）残基的刚性接头。接头的非限制性实例包括A(EAAAK)4A（SEQ ID NO:635）、A(EAAAK)5A（SEQ ID NO:617）、(KEAAA)4KAK（SEQ ID NO:636）、(KEAAA)5KAK（SEQ IDNO:618）和 (TP)8（SEQ ID NO:619）。
关于上文对根据本披露掺入B7-H3结合多肽的融合蛋白或缀合物的描述，应注意，第一部分、第二部分和另外的部分的命名是为了清楚起见，一方面用于区分根据本发明的一种或多种B7-H3结合多肽，且另一方面用于区分表现出相同或其他功能的部分。这些名称并不意图是指融合蛋白或缀合物的多肽链中不同结构域的实际顺序。类似地，命名第一单体单元和第二单体单元是为了清楚起见，以区分所述单元。因此，例如，所述第一部分（或单体单元）可以无限制地出现在本披露的融合蛋白或缀合物的N-末端、中间或C-末端处。
上述方面还涵盖多肽，其中根据第一方面的B7-H3结合多肽或根据第二方面的融合蛋白或缀合物中包含的B7-H3结合多肽进一步包含标记。在另外的实施方案中，所述标记选自由以下组成的组：荧光染料和金属、发色染料、化学发光化合物、生物发光蛋白、酶、放射性核素、放射性粒子和预靶向识别标签。本领域技术人员将熟悉的这样的标记例如可以用于检测多肽。
在一些实施方案中，经标记的B7-H3结合多肽作为融合蛋白或缀合物（还包含具有期望的生物活性的第二部分或另外的部分）中的一部分存在。在一些情况下，标记可以仅与B7-H3结合多肽偶联，并且在一些情况下，可以与B7-H3结合多肽和融合蛋白或缀合物的第二部分两者偶联。此外，还可能的是，标记可以与第二部分偶联，而不与B7-H3结合部分偶联。因此，在又另一个实施方案中，提供了包含第二部分的B7-H3结合多肽，其中所述标记仅与第二部分偶联。因此，当提及经标记的多肽时，应理解为提及如本文所描述的多肽的所有方面，包括B7-H3结合多肽、包含B7-H3结合多肽的融合蛋白和缀合物。
最近显示了使用预靶向识别标签对Z变体多肽进行间接标记（Westerlund等人,2015, Bioconjugate Chem [生物缀合物化学] 26:1724-1736）。类似地，本披露提供了用预靶向部分标记的如本文所描述的B7-H3结合多肽，其然后可以用于用与预靶向部分互补的部分间接标记。在一个实施方案中，提供了如本文所描述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其包含能够与补体缔合以形成互补的预靶向部分对的预靶向识别标签，这些互补的预靶向部分对例如选自链霉亲和素（亲和素）/生物素、寡核苷酸/互补寡核苷酸（比如DNA/互补DNA、RNA/互补RNA）、硫代磷酸酯核酸/互补硫代磷酸酯核酸和肽核酸/互补肽核酸以及吗啉核酸/互补吗啉核酸。在另外的实施方案中，所述预靶向识别标签是肽核酸标签。在另外的实施方案中，所述预靶向识别标签是10-20聚体肽核酸序列，比如15聚体肽核酸序列。当包含预靶向部分时，本披露的B7-H3结合剂能够与互补预靶向部分缔合，并且这样的互补预靶向部分然后可以包含或附着于合适的放射性核素。技术人员知道用于治疗、诊断和/或预后目的的合适的放射性核素。这样的放射性核素可以经由螯合环境螯合到所述互补预靶向部分，如下面针对B7-H3结合剂的一般描述。
大多数放射性核素具有金属性质，并且金属典型地不能与蛋白质和肽中存在的元素形成稳定的共价键。出于这个原因，用放射性金属标记蛋白质和肽是通过使用螯合剂（即多齿配体，其与金属离子形成非共价化合物，称为螯合物）进行的。在B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物的实施方案中，通过提供螯合环境能够掺入放射性核素，通过该螯合环境放射性核素可以与多肽配位、螯合或复合。
螯合剂的一个实例是聚氨基聚羧酸类型的螯合剂。可以区分两类这样的聚氨基聚羧酸螯合剂：大环和无环螯合剂。
在一个实施方案中，提供了一种B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其包含由聚氨基聚羧酸螯合剂提供的螯合环境，该螯合剂经由半胱氨酸残基的硫醇基团或赖氨酸残基的胺基团与B7-H3结合多肽缀合。
针对铟、镓、钇、铋、放射性锕系元素和放射性镧系元素的放射性同位素最常用的大环螯合剂是DOTA（1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸）的不同衍生物。在一个实施方案中，B7-H3结合多肽、呈异源二聚体形式的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物的螯合环境由DOTA或其衍生物提供。更特别地，在一个实施方案中，本披露涵盖的螯合多肽通过使DOTA衍生物1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三-乙酸-10-马来酰亚胺基乙基乙酰胺（马来酰亚胺基单酰胺-DOTA）与所述多肽反应获得。在一个实施方案中，本披露涵盖的螯合多肽通过使DOTA衍生物DOTAGA（2,2',2''-(10-(2,6-二氧代四氢-2H20-吡喃-3-基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸）与所述多肽反应获得。另外，1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸（NOTA）及其衍生物可以用作螯合剂。因此，在一个实施方案中，B7-H3结合多肽、呈异源二聚体形式的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物的螯合环境由NOTA或其衍生物提供。在一个实施方案中，本披露涵盖的螯合多肽通过使NOTA衍生物NODAGA（2,2'-(7-(1-羧基-4-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-4-氧代丁基)-1,4,7-三唑烷-1,4-二基)乙酰乙酸）与所述多肽反应获得。
最常用的无环聚氨基聚羧酸螯合剂是DTPA（二乙烯三胺五乙酸）的不同衍生物。因此，具有由二乙烯三胺五乙酸或其衍生物提供的螯合环境的多肽、融合蛋白或缀合物也由本披露涵盖。
螯合剂的另一个实例是N3S螯合剂，其是一种基于肽的四齿螯合剂。如术语N3S所示，这样的螯合剂的四个连接或配位基团由三个氮原子和一个硫原子形成，适当地由多肽链中的连续氨基酸残基提供。在N3S螯合剂中，N和S原子在空间上排列以提供用于放射性金属络合或附着的合适的“口袋”。
在一个实施方案中，提供了第一方面的B7-H3结合多肽、第二方面的融合蛋白或缀合物，其包含由基于肽的螯合剂提供的螯合环境，其中编码基于肽的螯合剂的肽序列位于所述B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物的C-末端。
技术人员知道用于包含在根据本披露的B7-H3结合分子的多肽链中的合适的基于肽的螯合剂。例如，在一个特定实施方案中，编码基于肽的螯合剂的肽序列选自由以下组成的组：-GGGC（SEQ ID NO:620）、-GSEC（SEQ ID NO:621）、-GGSC（SEQ ID NO:622）、-GGEC（SEQID NO:623）、-GGKC（SEQ ID NO:624）和-KVDC（SEQ ID NO:625）。在特定实施方案中，编码基于肽的螯合剂的肽序列是-GGGC。
在其中多肽、融合蛋白或缀合物被显像剂（例如放射性药剂）直接或间接标记（例如经由如上所述的预靶向）的实施方案中，可以使用成像设备，比如通过获取放射性计数或辐射密度图像或其衍生物（比如辐射浓度）来测量组织中（比如肿瘤组织中）存在的经标记多肽的量。在一个实施方案中，提供了一种经放射性标记的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其由如本文所描述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物的放射性螯合物和放射性核素组成。在更特定的实施方案中，所述放射性核素适用于医学成像。在另一个特定实施方案中，所述放射性核素适用于疗法。适于直接标记根据本文披露的任何方面的B7-H3结合剂或适于通过标记互补预靶向部分进行间接标记的放射性核素的非限制性实例包括225Ac、72As、212Bi、213Bi、76Br、55Co、61Cu、64Cu、67Cu、18F、[18F]AIF、19F、66Ga、67Ga、68Ga、166Ho、110mIn、111In、123I、124I、131I、177Lu、51Mn、52mMn、52Mn、212Pb、149Pm、186Re、188Re、44Sc、153Sm、149Tb、152Tb、155Tb、161Tb、99mTc、45Ti、227Th、86Y、90Y和89Zr。
在其中所述放射性核素适用于医学成像的一个实施方案中，所述放射性核素选自由以下组成的组：72As、76Br、55Co、61Cu、64Cu、18F、[18F]AIF、19F、66Ga、67Ga、68Ga、110mIn、111In、123I、124I、131I、177Lu、51Mn、52mMn、52Mn、186Re、188Re、44Sc、149Tb、152Tb、155Tb、161Tb、99mTc、45Ti、86Y和89Zr。
在其中所述放射性核素适用于疗法的另一个实施方案中，所述放射性核素选自由以下组成的组：225Ac、212Bi、213Bi、67Cu、166Ho、177Lu、212Pb、149Pm、186Re、188Re、153Sm、149Tb、161Tb、227Th和90Y。
在一个实施方案中，在这样的测量中使用的成像设备是正电子发射体层成像（PET）设备，在这种情况下，选择放射性核素使得其适用于PET。技术人员知道适用于与PET一起使用的放射性核素。例如，PET放射性核素选自由以下组成的组：72As、76Br、55Co、61Cu、64Cu、18F、[18F]AIF、66Ga、68Ga、110mIn、44Sc、152Tb、45Ti、86Y和89Zr。在一个实施方案中，提供了如本文所描述的经放射性标记的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中所述核素适于与PET一起使用，并且选自由以下组成的组：72As、76Br、55Co、61Cu、64Cu、18F、[18F]AIF、66Ga、68Ga、110mIn、44Sc、152Tb、45Ti、86Y和89Zr。
在另一个实施方案中，所使用的成像设备是单光子发射计算机断层扫描（SPECT）设备，在这种情况下，选择放射性核素使得其适用于SPECT。技术人员知道适用于与SPECT一起使用的放射性核素。例如，SPECT放射性核素选自由以下组成的组：67Ga、111In、123I、131I、177Lu、155Tb、99mTc。在另一个实施方案中，提供了如本文所描述的经放射性标记的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中所述核素适于与SPECT一起使用，并且选自由以下组成的组：67Ga、111In、123I、131I、177Lu、155Tb、99mTc。
在另一个实施方案中，所述核素适用于医学成像，并且螯合环境由如本文所描述的基于肽的螯合剂提供。在更特定的实施方案中，放射性核素选自由以下组成的组：99mTc、51Mn、52mMn、52Mn、186Re和188Re。在特定实施方案中，适用于医学成像的放射性核素是99mTc。
在替代性实施方案中，所述放射性核素适用于疗法，并且螯合环境由如本文所描述的基于肽的螯合剂提供。在更特定的实施方案中，放射性核素选自由186Re和188Re组成的组。在特定实施方案中，适用于疗法的放射性核素是188Re。
在根据第二方面的经放射性标记的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物的这些实施方案中，放射性核素经由C-末端-GGGC序列提供的螯合环境与B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物复合。
因此，在一个实施方案中，提供了如本文所描述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其包含直接或间接放射性核素标记，比如选自由72As、76Br、55Co、61Cu、64Cu、18F、[18F]AIF、19F、66Ga、67Ga、68Ga、110mIn、111In、123I、124I、131I、177Lu、44Sc、99mTc、45Ti、86Y和89Zr组成的组、比如由68Ga、110mIn、18F、152Tb、155Tb、45Ti、44Sc、61Cu、66Ga、64Cu、55Co、72As、86Y、89Zr、124I和76Br组成的组的放射性核素，比如18F。
在一些实施方案中，经标记的B7-H3结合多肽作为融合蛋白或缀合物（还包含具有期望的生物活性的第二部分）中的一部分存在。在一些情况下，标记可以仅与B7-H3结合多肽偶联，并且在一些情况下，可以与B7-H3结合多肽和融合蛋白或缀合物的第二部分两者偶联。此外，还可能的是，标记可以仅与第二部分偶联，而不与B7-H3结合部分偶联。因此，在又另一个实施方案中，提供了一种包含第二部分的B7-H3结合多肽，其中所述标记仅与第二部分偶联。
当提及经标记的多肽时，应理解为提及如本文所描述的多肽的所有方面，包括B7-H3结合多肽、包含B7-H3结合多肽的融合蛋白和缀合物。因此，经标记的多肽可以仅含有B7-H3结合多肽和例如放射性核素，其可以与B7-H3结合多肽螯合或共价偶联，或者含有B7-H3结合多肽、放射性核素和第二部分，比如具有期望的生物活性（例如治疗功效）的小分子。经标记的多肽可以含有呈异源二聚体形式的B7-H3结合多肽和例如放射性核素，其可以与B7-H3结合多肽螯合或共价偶联，或者含有呈异源二聚体形式的B7-H3结合多肽、治疗性放射性核素和第二部分，比如具有期望的生物活性（例如治疗功效）的小分子。进一步，如本文所描述的放射性核素可以用于多种目的，即，所述放射性核素可以同时满足适用于疗法的放射性核素的容量和适用于医学成像的放射性核素的容量。因此，经放射性核素标记的分子被认为适合作为治疗诊断剂，其是同时适用于疗法和医学成像的分子。如本文所用，术语“治疗诊断（theranostic）”可以与术语“诊疗（theragnostic）”互换使用。此外，技术人员将理解，治疗诊断或诊疗分子也可以理解为1) 用相同放射性核素进行标记以用于成像和疗法两者（如先前所述）的相同分子，比如多肽或融合蛋白；2) 使用相同分子，比如多肽或融合蛋白，但用不同放射性核素进行标记以用于成像和疗法；和/或3) 使用不同分子，比如不同多肽或不同融合蛋白，各自用不同放射性核素进行标记以用于成像和疗法。这样，也可以满足治疗诊断的特性，其中一种放射性核素可以适用于治疗，而另一种放射性核素可以适用于医学成像。本领域技术人员将能够基于本文的教导创建许多其他可能的变体。经标记的多肽或融合蛋白可同时适用于疗法，以及用于检测和监测治疗应答的目的的医学成像。进一步可设想的是，除了放射性核素之外的有效载荷可以经由半胱氨酸残基缀合，比如细胞毒性有效载荷。可以与半胱氨酸残基缀合的细胞毒性有效载荷的一些实例是：美登素类，比如DM1和DM4；奥瑞他汀，比如单甲基奥瑞他汀E（MMAE）和单甲基奥瑞他汀F（MMAF）；DNA损伤剂，比如多卡霉素、吡咯并苯并二氮杂䓬（PBD）和卡奇霉素；喜树碱，比如SN-38；紫杉烷；微管溶素（tubulysin）；STING激动剂；TLR激动剂；拓扑异构酶II抑制剂；小干扰RNA；反义寡核苷酸；和蛋白质降解剂有效载荷。
在本披露的进一步方面，提供了编码如本文所描述的B7-H3结合多肽或融合蛋白的多核苷酸；包含所述多核苷酸的表达载体；以及包含所述表达载体的宿主细胞。本披露还涵盖产生如上所述的B7-H3结合多肽或融合蛋白的方法，该方法包括在允许所述多肽从其表达载体表达的条件下培养所述宿主细胞，并分离该多肽。
替代性地，本披露的B7-H3结合多肽或融合蛋白可以通过使用具有受保护的反应性侧链的氨基酸和/或氨基酸衍生物进行的非生物肽合成来产生，该非生物肽合成包括
-逐步偶联这些氨基酸和/或这些氨基酸衍生物以形成如本文所描述的具有受保护的反应性侧链的多肽或融合蛋白，
-从该多肽或融合蛋白的这些反应性侧链上去除保护基团，以及
-在水溶液中折叠该多肽或融合蛋白。
在另一方面，提供了一种组合物，其包含如本文所描述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物以及至少一种药学上可接受的赋形剂或载剂。在一个实施方案中，所述组合物进一步包含至少一种另外的活性剂，比如至少两种另外的活性剂，比如至少三种另外的活性剂。可证明在这样的组合中有用的另外的活性剂的非限制性实例是如本文结合本披露的第一方面和第二方面所述的抗癌剂。
本披露B7-H3结合多肽的小尺寸和稳健性赋予其优于基于常规单克隆抗体的疗法的几个优点。这样的优点包括在配制、施用方式（比如替代施用途径）、以高于抗体的摩尔剂量施用以及没有Fc介导的副作用方面的优点。
应当理解，根据本披露的B7-H3结合多肽本身典型地可用作治疗剂、诊断剂和/或预后剂。例如，可以通过拮抗B7-H3作用来实现治疗效果。
因此，在本披露的一个方面，提供了如本文所描述的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其用作（例如体内用作）药物、诊断剂和/或预后剂。
在一个实施方案中，提供了所述B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其作为药物使用。在更特定的实施方案中，提供了如本文所描述的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其作为药物使用，其中所述多肽、融合蛋白、结合物或组合物在体内调节B7-H3功能。如本文所用，术语“调节”是指改变活性，比如部分地抑制或完全抑制B7-H3功能。
在一个实施方案中，提供了所述B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其作为诊断剂和/或作为预后剂使用。在另一个实施方案中，提供了所述B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其作为体内诊断剂和/或作为体内预后剂使用。在更特定的实施方案中，提供了如本文所描述的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其作为体内诊断剂使用。在另一个更特定的实施方案中，提供了如本文所描述的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其作为体内预后剂使用。在另一个特定实施方案中，提供了如本文所描述的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其作为诊断剂使用，其中所述诊断用途在体外中进行。在另一个特定实施方案中，提供了如本文所描述的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其作为预后剂使用，其中所述预后用途在体外中进行。
在一个实施方案中，提供了如本文所描述的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其用于在B7-H3相关病症或疾病的治疗、预后或诊断中使用。
如本文所用，术语“B7-H3相关病症或疾病”是指其中B7-H3作用起作用和/或其中靶向或调节（例如抑制）B7-H3可能是有益的任何病症、疾病或病状。这样的病症、疾病或病状可选自由癌症组成的组。非限制性实例包括乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、肝癌（包括肝细胞癌）、肺癌（包括非小细胞肺癌）、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肾细胞癌、肉瘤（包括骨肉瘤）、尿路上皮细胞癌、神经母细胞瘤、胶质瘤（包括胶质母细胞瘤和弥漫性内生型脑桥胶质瘤）、黑色素瘤、白血病和间皮瘤。
在一个实施方案中，提供了一种B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其用于在B7-H3相关病症或疾病的治疗、诊断或预后中使用，其中所述B7-H3相关病症或疾病是癌症。在一个实施方案中，所述癌症是选自由以下组成的组的癌症：乳腺癌；宫颈癌；结直肠癌；子宫内膜癌；食道癌；胃癌；肝癌，包括肝细胞癌；肺癌，包括非小细胞肺癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；肾细胞癌；肉瘤，包括骨肉瘤；尿路上皮细胞癌；神经母细胞瘤；胶质瘤，包括胶质母细胞瘤和弥漫性内生型脑桥胶质瘤；黑色素瘤；白血病；和间皮瘤。在特定实施方案中，所述癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、胰腺癌和肉瘤。
应当理解，所述B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物可以用作唯一治疗剂、诊断剂或预后剂或用作伴随治疗剂、伴随诊断剂和/或伴随预后剂。
因此，在治疗用途的一个实施方案中，施用治疗有效量的如本文所描述的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物以及至少一种第二种药物物质（比如抗癌剂）是有益的。
本披露的药剂被设想用于口服、局部、静脉内、腹膜内、皮下、肺部、透皮、肌内、鼻内、口腔、舌下或栓剂施用。特别是对于诊断成像应用和放射治疗应用，优选经由静脉内或皮下途径施用。因此，在本披露的另一方面，提供了如本文所描述使用的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其中施用选自由以下组成的组：口服、局部、静脉内、腹膜内、皮下、肺、透皮、肌内、鼻内、颊、舌下或栓剂施用，比如皮下施用，比如静脉内施用。
在本披露的另一方面，提供了一种治疗B7-H3相关病症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的如本文所描述的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物。
在一个实施方案中，提供了一种治疗B7-H3相关病症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的如本文所描述的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其中所述B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物在体内调节B7-H3功能。
在本披露的进一步的方面，提供了一种检测样品中B7-H3的存在的方法，该方法包括提供疑似含有B7-H3的样品，使所述样品与本文提供的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物接触，并检测B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物的结合，以指示样品中B7-H3的存在。
在本披露的另一方面，提供了一种用于确定受试者中B7-H3的存在的方法，该方法包括以下步骤：
a)使受试者或从受试者分离的样品与如本文所描述的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物接触；以及
b)获得与已结合在所述受试者体内或与所述样品结合的该B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物的量相对应的值。
在本披露的另一方面，提供了如本文所描述的用于确定受试者中B7-H3的存在的方法，该方法是用于医学成像的方法，在该方法中：
-步骤a) 包括向受试者全身施用所述B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物；
-所述B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物包含适于医学成像的放射性核素标记；并且
-步骤b) 包括使用医学成像仪器获得该受试者的身体的至少一部分的一个或多个图像，所述一个或多个图像指示体内该放射性核素的存在。
在所述用于医学成像的方法的一个实施方案中，所述B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物包含如本文所描述的预靶向识别标签，或者所述组合物包含这样的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，并且步骤a) 进一步包括使受试者与用可检测标记（比如放射性核素标记）标记的互补预靶向部分接触。
在相关方面，提供了一种体内诊断方法，该方法包括以下步骤：
-使受试者与如本文所描述的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物接触；
-检测该B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物的结合，以指示该受试者中B7-H3的存在；以及
-使用所获得的信息来建立诊断。
在另一个相关方面，提供了一种体内预后方法，该方法包括以下步骤：
-使受试者与如本文所描述的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物接触；
-检测该B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物的结合，以指示该受试者中B7-H3的存在；以及
-使用所获得的信息来建立预后。
在相关方面，提供了一种体外诊断方法，该方法包括以下步骤：
-提供疑似含有B7-H3的样品；
-使所述样品与如本文所描述的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物接触；
-检测该B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物的结合，以指示该样品中B7-H3的存在；以及
-使用所获得的信息来建立诊断。
在另一个相关方面，提供了一种体外预后方法，该方法包括以下步骤：
-提供疑似含有B7-H3的样品；
-使所述样品与如本文所描述的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物接触；
-检测该B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物的结合，以指示该样品中B7-H3的存在；以及
-使用所获得的信息来建立预后。
上述方面可以包括进一步的步骤，使得所描述的方法是在治疗之前、期间或之后对受试者的监测过程的一部分。因此，在相关实施方案中，提供了如本文所描述的体内或体外诊断或预后方法，该方法进一步包括以下步骤：
-重复检测步骤，其中所述检测在受试者中、在相同提供的样品中或在不同提供的样品中以间隔在若干时间点进行，作为在治疗之前、期间或之后对受试者的监测的一部分。
在另一个实施方案中，提供了如本文所描述的体外诊断或体外预后方法，该方法进一步包括将与结合的B7-H3结合多肽的量相对应的值与参考值进行比较。
在另一个实施方案中，所述诊断或预后涉及B7-H3相关病症或疾病。
在用于体内诊断和体内预后的方法中的每一种方法的一个实施方案中，所述B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物包含如本文所描述的预靶向识别标签，或者所述组合物包含这样的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，并且接触步骤进一步包括使受试者与用可检测标记（比如用放射性核素标记）标记的互补预靶向部分接触。
技术人员将理解，涉及如本文所描述的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物用于疾病或病症的治疗、诊断或预后的用途的任何描述对于本披露的相关治疗、诊断、成像、预后或治疗诊断方法同样相关。为了简洁起见，这里将不再重复这样的描述。
虽然已参考各种示例性方面和实施方案描述本发明，但本领域技术人员将理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可作出各种变化，并且等效物可取代其要素。另外，在不脱离本发明的基本范围的情况下，可进行许多修改以使特定情形或分子适应本发明的教导。因此，意图是本发明不限于所设想的任何特定实施方案，而是本发明将包括落入所附权利要求的范围内的所有实施方案。
附图说明
图1示出了在如实施例4中所述的单循环动力学筛选中通过表面等离子体共振分析的四种His6-Z变体与B7-H3(2Ig)-Fc结合的传感图的实例。ZBH480（顶部实线）、ZBH482（中间实线）和ZBH481（底部实线）以及参考序列ZAC12（虚线）。
图2示出了如实施例4中所述通过荧光强度评价的所指示的Z变体与表达B7-H3的SKOV-3细胞的结合。将细胞分别与浓度递减（从500 nM至32 pM）的 (A) 重组产生的His6-Z变体和 (B) 合成的Z变体一起温育。
图3示出了如实施例4中所述收集的圆二色性（CD）光谱的实例。(A) 在ZBH480热诱导变性之前（虚线）和之后（实线）收集的CD光谱以及 (B) ZBH480的解链曲线。
图4示出了如实施例4中所述通过表面等离子体共振分析的Z变体ZBH538与来自(A) 人（B7-H3(2Ig)-Fc）、(B) 食蟹猴（cB7-H3(4Ig)-Fc）、(C) 小鼠（mB7-H3(2Ig)-Fc）和(D) 大鼠（rB7-H3(2Ig)-Fc）的Fc融合型B7-H3结合的传感图的实例。将Z变体以四种浓度（0.56 nM（底部虚线）、1.67 nM、5 nM和15 nM（顶部实线））注射到捕获在蛋白A芯片表面上的Fc融合型B7-H3蛋白上。
图5示出了在如实施例7中所述的单循环动力学筛选中通过表面等离子体共振分析的来自第二次成熟的六种His6-Z变体（灰色实线；ZBH001、ZBH002、ZBH003、ZBH007、ZBH009和ZBH011）与B7-H3(2Ig)-Fc结合的传感图的实例。平行分析的参考变体ZAC12（黑色虚线）和来自第一次成熟的ZBH481（黑色实线）被包括在内，用于比较。
图6示出了如实施例7中所述通过荧光强度评价的六种His6-Z变体与表达B7-H3的SKOV-3细胞的结合。将细胞分别与浓度递减（500 nM至21 pM）的相应的指示His6-Z变体一起温育。平行分析的参考变体ZAC12（空心圆圈）和来自第一次成熟的ZBH481（空心方块）被包括在内，用于比较。
图7示出了如实施例7中所述收集的圆二色性（CD）光谱的实例。(A) 在ZBH001热诱导变性之前（虚线）和之后（实线）收集的CD光谱以及 (B) ZBH001的解链曲线。
图8示出了如实施例8中所述的二聚体多肽ZBHD01（灰色虚线）对比单体Z变体ZBH538（黑色实线）结合B7-H3的SPR分析。将变体注射到捕获在蛋白A芯片上的B7-H3（B7-H3(4Ig)-Fc）上。
图9示出了二聚体多肽ZBHD01对比单体Z变体ZBH538与SKOV-3细胞的结合，如实施例8中所述，二者各自以递减的浓度（555 nM至28 pM）温育。
图10示出了如实施例10中所述研究的 (A) 99mTc-ZBH536、(B) 99mTc-ZBH538、(C)99mTc-ZBH539和 (D) 参考99mTc-ZAC12c对BT474和SKOV-3细胞的体外结合特异性。对于B7-H3的预饱和，在添加经标记的缀合物之前添加200倍摩尔过量的未标记的Z变体。将数据相对于每个细胞系的非封闭细胞的细胞相关放射性的平均值进行归一化。数据表示为三个样品的平均值±SD。
图11示出了 (A) 99mTc-ZBH536、(B) 99mTc-ZBH538、(C) 99mTc-ZBH539和 (D) 参考99mTc-ZAC12c与SKOV-3细胞结合的相互作用图。在经标记的缀合物与SKOV-3细胞缔合和解离期间，从细胞结合活性的LigandTracer测量获得输入数据。对于99mTc-ZBH536、99mTc-ZBH538和99mTc-ZBH539，在两种不同浓度（1和3 nM）下测量结合，对于99mTc-ZAC12c，在三种不同浓度（2、6和18 nM）下测量结合。一式两份地进行测量。
图12示出了在注射后4 h，雌性NMRI小鼠的不同器官和组织中所指示的经99mTc标记的Z变体的比较性生物分布。将3 µg经标记的缀合物（60 kBq）注射到尾静脉中。数据表示为每克组织施用的活性（注射的探针）的百分比（% ID/g），并且是来自四只小鼠的平均值±SD。
图13示出了在携带SKOV-3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中，注射后4 h，所指示的经99mTc标记的Z变体的 (A) 生物分布和 (B) 肿瘤与器官比值。将3 µg经标记的缀合物（60 kBq）注射到尾静脉中。数据表示为% ID/g，并且是来自四只小鼠的平均值±SD。
图14示出了注射后4 h，SKOV-3（B7-H3阳性）和Ramos（B7-H3阴性）异种移植物中99mTc-ZBH538的摄取。数据表示为%ID/g，并且是来自四只小鼠的平均值±SD。在非配对t检验中获得P值。
图15示出了注射后4 h，在携带B7-H3阳性SKOV-3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中 (A) 99mTc-ZBH536、(B) 99mTc-ZBH538、(C) 99mTc-ZBH539和 (D) 参考99mTc-ZAC12c的成像。将3 µg经标记的Z变体（6 MBq）注射到尾静脉中。箭头指向肿瘤（T）和肝（L）。
图16示出了注射后4 h，在携带B7-H3阴性Ramos异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中 (A) 99mTc-ZBH536、(B) 99mTc-ZBH538、(C) 99mTc-ZBH539的成像。将3 µg经标记的Z变体（6 MBq）注射到尾静脉中。箭头指向肿瘤（T）。
图17示出了 (A) 111In-ZBH538和 (B) 参考111In-ZAC12c结合SKOV-3细胞的相互作用图。在经标记的缀合物与SKOV-3细胞缔合和解离期间，从细胞结合活性的LigandTracer测量获得输入数据。在三种不同浓度下测量结合：对于111In-ZBH538，1、3和9nM；对于111In-ZAC12c，2、6和18 nM。一式两份地进行测量。
图18示出了在携带SKOV-3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中，注射后4 h (A) 和24 h (B)，111In-ZBH538和参考111In-ZAC12c的生物分布。
图19示出了在携带SKOV-3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中，注射后4 h (A) 和24 h (B)，111In-ZBH538和参考111In-ZAC12c的肿瘤与器官比值。
图20示出了在携带SKOV-3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中，注射后4 h，经111In标记和经99mTc标记的ZBH538和参考ZAC12c的直接比较的 (A) 生物分布和 (B) 肿瘤与器官比值。
图21示出了在携带 (A) B7-H3阳性SKOV-3异种移植物和 (B) B7-H3阴性Ramos异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中，注射后4 h，111In-ZBH538和参考111In-ZAC12c的成像。箭头指向肿瘤（T）和肝（L）。
图22示出了ABD融合型多肽ZBHD02-ZBHD09结合B7-H3的SPR分析。传感图显示在固定化的B7-H3(4Ig)-His上注射45 nM的变体。
图23示出了ABD融合型多肽ZBHD02、ZBHD07、ZBHD08和ZBHD09结合分别结合HSA和MSA的SPR分析结果。
图24示出了通过荧光强度评价的ABD融合型多肽ZBHD02-ZBHD09与表达B7-H3的SKOV-3细胞的结合。将细胞分别与浓度递减（500 nM至0.16 nM）的相应的指示多肽一起温育。
图25示出了ABD融合型Z变体在携带SKOV3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中的生物分布。(A) 注射后48 h，177Lu-ZBHD02、177Lu-ZBHD07、177Lu-ZBHD08和177Lu-ZBHD09。(B) 注射后24、48和168 h，177Lu-ZBHD02。
图26示出了在携带B7-H3阳性SKOV-3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中，注射后48 h，(A) 177Lu-ZBHD02、(B) 177Lu-ZBHD07、(C) 177Lu-ZBHD08和 (D) 177Lu-ZBHD09的成像。
图27示出了在携带 (A) B7-H3阳性SKOV-3异种移植物和 (B) B7-H3阴性Ramos异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中，注射后48 h，177Lu-ZBHD02的成像。箭头指向肿瘤（T）。
图28示出了Z变体的体内B7-H3特异性。注射后2 h，分别在SKOV-3（B7-H3阳性）和Ramos（B7-H3阴性）异种移植物中，(A) 68Ga-ZBH001、(B) 68Ga-ZBH002、(C) 68Ga-ZBH003和(D) 参考68Ga-ZAC12的摄取。数据表示为%ID/g，并且是来自四只小鼠的平均值±SD。
图29示出了在携带SKOV-3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中，注射后2 h，所指示的经68Ga标记的Z变体的 (A) 生物分布和 (B) 肿瘤与器官比值。将2 µg经标记的缀合物（400 kBq）注射到尾静脉中。数据表示为% ID/g，并且是来自四只小鼠的平均值±SD。
图30示出了在携带B7-H3阳性SKOV-3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中，注射后2h，(A) 68Ga-ZBH003、(B) 68Ga-ZBH001、(C) 68Ga-ZBH002和 (D) 参考68Ga-ZAC12的成像。
图31示出了在携带 (A) B7-H3阳性SKOV-3异种移植物和 (B) B7-H3阴性Ramos异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中，注射后，68Ga-ZBH003的成像。箭头指向肿瘤（T）。
实施例
概述
以下实施例披露了基于噬菌体展示技术的靶向B7-H3的新型Z变体分子的开发。对如本文所描述的所选的多肽进行测序，并将它们的氨基酸序列以指示的序列标识符列于序列列表中。这些实施例进一步描述了对这些所选B7-H3结合多肽、其变体和衍生物以及包含它们的融合蛋白的表征，并展示了它们的体外和体内功能性。
实施例中使用的各种B7-H3蛋白列于表2中。
表2：用于选择、筛选和表征B7-H3结合多肽的B7-H3蛋白
实施例1
B7-H3结合Z变体的成熟文库的设计和构建
概述
在本实施例中，部分地基于先前通过酵母展示技术鉴定的四种B7-H3结合变体设计噬菌体选择文库，如Stern等人, 同上，以及WO 2020041626中所述。成熟文库含有大约6×109个单独克隆。
材料和方法
亲和力成熟B7-H3文库的设计和构建：部分地基于Stern等人, 同上中描述的四个B7-H3结合序列设计文库。根据主要基于SEQ ID NO:541-544中定义的Z变体的结合基序的策略，Z分子支架中13个表面暴露的位置偏向某些氨基酸残基。文库设计在表3中示出，其指示13个随机位置中的每个位置中使用的氨基酸百分比。
表3：B7-H3成熟文库的设计
使用TRIM技术生成了具有互补的3’-末端的两个寡核苷酸，一个正向互补和一个反向互补。寡核苷酸是从艾拉生物技术有限公司（Ella Biotech GmbH）（德国马丁斯里德）订购的。
在这种情况下，文库的构建基本上如早期所述（例如，PCT公开WO 2017/072280）在表示为pAY04242的载体中进行，但存在以下例外：1) 每次电穿孔使用大约270 ng转化到电感受态大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）XL-1 Blue细胞（安捷伦科技公司（Agilenttechnologies），目录号200268）中；2) 将细胞在电穿孔后合并，在37°C下在回收培养基（卢赛根公司（Lucigen））中温育60 min，然后在2 L TSB-YE培养基[30 g/L胰蛋白酶大豆肉汤；5.0 g/L酵母提取物]中培养大约8 h，该培养基补充有10 µg/mL四环素和100 µg/mL羧苄青霉素。基本上如WO 2009/077175中所述，通过测序对文库质量和氨基酸的分布进行验证。在该文库中，将白蛋白结合结构域（ABD，来自链球菌菌株G148的蛋白G的结构域GA3；SEQ IDNO:548）用作与Z变体的融合配偶体。
文库噬菌体储备液的制备：将来自含有噬菌粒文库的甘油储备液的细胞接种到补充有100 µg/mL羧苄青霉素、10 µg/mL四环素和1%葡萄糖的3 L TSB [30 g/L胰蛋白酶大豆肉汤]中，并在70 rpm和37°C下培养，直至在600 nm处的光密度（OD600）达到0.79。使用50倍摩尔过量的M13K07辅助噬菌体（新英格兰生物实验室（New England Biolabs））感染培养物，并将细胞在37°C下温育1.5 h。将细胞沉淀并重悬于补充有100 µg/mL羧苄青霉素、25 µg/mL新霉素和0.1 mM异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷（IPTG）的3 L TSB+YE中。将培养物在30°C和70 rpm下温育，并在20 h后收获。通过离心去除培养物中的细胞。将噬菌体颗粒使用聚乙二醇/氯化钠（PEG/NaCl）从上清液中沉淀两次，并基本上如Grönwall等人, 2007 JBiotechnol [生物技术杂志] 128:162-183中所述过滤，最后溶解在磷酸盐缓冲盐水（PBS：Dulbecco’s Gibco DPBS；9.6 mM磷酸盐、138 mM NaCl、2.67 mM KCl，pH 7.4）和甘油中。将噬菌体储备液储存在-80°C下直至在选择中使用。
结果
文库构建：基于Stern等人, 同上中描述的四个B7-H3结合变体设计文库。所设计的文库的理论大小为7.3 × 1015个Z变体。在转化到大肠杆菌XL-1 Blue细胞后，通过滴定来确定文库的实际大小为6 × 109个转化子。通过对96个转化子进行测序并通过将其实际序列与理论设计进行比较来测试文库质量。对单独文库成员的序列分析验证了密码子的分布符合理论设计。文库命名为Zlib008B7-H3.I。
实施例2
B7-H3结合Z变体的选择和筛选
概述
在本实施例中，使用Z变体的成熟噬菌体文库，将人B7-H3的两个不同的重组产生的细胞外结构域用作噬菌体展示选择中的靶标。将选定的克隆批量克隆在由T7启动子驱动的表达载体中，进行DNA测序，在大肠杆菌中产生，并在ELISA（酶联免疫吸附测定）中针对B7-H3进行测定。
材料和方法
B7-H3结合Z变体的噬菌体展示选择：将如实施例1中所述设计和构建的文库Zlib008B7-H3.I的噬菌体储备液用于针对两种不同生物素化的B7-H3靶标蛋白b-B7-H3(4Ig)-His_1和b-B7-H3(4Ig)-His_2的选择（参见表2）。在第一个循环中，在轨道1-2中使用链霉亲和素珠（SA珠，Speedbead magnetic SA，思拓凡公司）的固相进行选择，或在轨道3-10中使用溶液法进行选择。在循环3中，使用中性亲和素珠（NA珠，Speedbead magnetic NA，思拓凡公司）。随着选择的进行，根据靶标浓度和洗涤次数和/或洗涤时间进一步划分轨道1-4。
为了减少背景结合物的量，在循环1-2中使用SA珠进行预选择，并且在循环3中使用NA珠进行预选择。在预选择期间，将噬菌体储备液与涂覆的珠一起在RT下温育30-40min。将预选择或选择中使用的珠用补充有3%牛血清白蛋白（BSA，西格玛公司（Sigma））和0.1% Tween20（PBSTB）的PBS预封闭，并且使用的所有试管均为不粘型（预封闭的1.5 ml试管（Protein LoBind），艾本德公司（Eppendorf））。
在37°C下在PBSTB中进行选择。选择时间介于20-120 min分钟之间，然后在循环3中将靶标-噬菌体颗粒复合物捕获在SA珠和NA珠上。对于固相选择，在选择之前，生物素化的B7-H3已固定在SA珠上。最后，将具有靶-噬菌体颗粒复合物的不同珠用补充有0.1%Tween-20（PBST0.1%）的PBS洗涤，每次洗涤大约30 s。在Eppendorf管中或在使用KingFisher Deepwell 96板（赛默飞世尔公司（Thermo Fisher））的KingFisher Duo仪器（赛默飞世尔公司）中或其组合中手动进行选择步骤、珠粒封闭、预选择和洗涤步骤。除上述操作之外，还在用于选择之前，将一些轨道中的噬菌体储备液加热至70°C。
表4示出了选择策略的综述，该策略描述了在连续循环中随着靶标浓度的降低和洗涤次数的增加而增加的严格性。如WO 2009/077175所述进行洗脱。
表4：使用成熟文库Zlib008B7-H3.I针对B7-H3进行选择的概述
噬菌体颗粒的扩增和制备：如下进行不同选择循环之间的噬菌体颗粒的扩增。将大肠杆菌菌株XL-1 Blue用于噬菌体扩增，并且M13K07辅助噬菌体以55-65倍过量使用。在37°C下，将XL-1 Blue在补充有1%葡萄糖和1 µg/mL四环素的TSB培养基（胰蛋白酶大豆肉汤，30 g/L）中培养至早期对数期，并之后用噬菌体颗粒进行感染。与噬菌体颗粒量相比，使用22-2500倍过量的细菌。在37°C下感染30 min，之后通过添加补充有1%葡萄糖、1 µg/mL四环素和200 µg/mL羧苄青霉素的TSB培养基将培养基体积加倍。在37°C下温育大约1 h后，添加辅助噬菌体并在37°C下温育1.5 h。将重复感染的细菌通过离心沉淀，并重悬于补充有25µg/mL新霉素和0.1 mM IPTG（异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷）的50 mL TSB+YE培养基中，并在30°C下温育过夜。将过夜培养物沉淀，并将上清液中的噬菌体颗粒用PEG/NaCl沉淀两次。最后，将噬菌体颗粒重悬浮于选择缓冲液中，然后进入下一个选择循环。
批量克隆：在最后一个选择循环中，将对数期细菌用洗脱液感染，并在补充有0.1µg/mL羧苄青霉素的TSB中于37°C下生长过夜。将每个培养物沉淀，并使用QIAprep SpinMiniprep（凯杰公司（Qiagen））制备质粒DNA。将每个质粒制备物单独用于使用标准分子克隆方法以批量方式将噬菌体选择的变体亚克隆至T7启动子驱动的表达载体，并具有N-末端His6-标签。将经转化的大肠杆菌T7E2细胞（基因桥公司（GeneBridges））铺到补充有0.2 g/L新霉素和1%葡萄糖的TBAB琼脂板（30 g/L胰蛋白酶血琼脂基质，奥克赛德公司（Oxoid））上。将Z基因片段亚克隆到T7启动子驱动的表达载体中，产生经编码的序列MGSSHHHHHHLQ-[ZBH####]（SEQ ID NO:626）。ZBH####是指单独的58个氨基酸残基的B7-H3结合Z变体的序列。
用于ELISA的Z变体的产生：通过将来自经亚克隆和转化的选定变体的单个菌落接种到深孔板（瑞宁公司（Rainin），Mettler Toledo Liquidator金字塔状孔底2.2 mL）补充有100 µg/mL氨苄青霉素和0.175 mM IPTG的1.2 mL TSB-YE培养基中来产生Z变体。将板在37°C下旋转温育17-19 h。将细胞通过离心沉淀，重悬于250 µL的2× PBST0.05%（补充有0.05%Tween20的2× PBS）中，并在90°C下温育7 min。使用96孔深滤板（AcroPrep滤板，颇尔实验室公司（Pall Laboratories））过滤经热处理的悬浮液。具有提取物的可溶性部分的经过滤的上清液（经热处理的（HT）裂解液）含有与His6融合的Z变体，表示为MGSSHHHHHHLQ-[ZBH####]（SEQ ID NO:626）。对所有单独挑选的克隆进行DNA测序。
针对B7-H3的Z变体的ELISA筛选：将384孔ELISA板（格瑞纳公司（Greiner））用20 µL稀释在PBS中的3 µg/mL抗His6小鼠抗体（Abcam目录号18184）在4°C下包被过夜。将孔用PBST0.05%洗涤4次，然后用50 µL的PBS（赛默科技公司（Thermo Scientific））中的Blocker®酪蛋白在RT下封闭1.5 h。将孔用PBST0.05%洗涤4次，然后将在PBST中以1:20稀释的20 µLHT裂解液添加到相应的孔中，并在RT下温育1 h和20 min。作为阳性对照，将使用ZAC12（SEQID NO:543）制备的HT裂解液（其克隆方式与测试变体相同）一式两份地添加到每个板上。作为阴性对照，添加使用与无关靶标结合的Z变体制备并克隆为Z-His6的HT裂解液。将上清液倒出，并将孔用PBST0.05%洗涤4次。然后，将20 µL稀释在PBS中的Blocker®酪蛋白中的浓度为5 nM、1.7 nM、0.56 nM和0 nM的生物素化的Fc融合型B7-H3（b-B7-H3(4Ig)-Fc）添加到每个孔中。将板在RT下温育1 h和20 min，然后如上所述洗涤。将在PBS中的Blocker®酪蛋白中以1:30000稀释的链霉亲和素缀合的HRP（赛默科技公司）添加到孔中，并将板温育45 min。如上所述洗涤后，向孔中添加20 µL TMB底物（1-Step Ultra TMB-ELISA Pierce，赛默飞世尔科技公司（ThermoFisher Scientific）），并根据制造商的建议处理板。使用多孔板读取器（EnSpire，珀金埃尔默公司（Perkin Elmer））测量在450 nm处的吸光度。
结果
B7-H3结合Z变体的噬菌体展示选择：在使用成熟文库Zlib008B7-H3.I进行一个或四个循环的针对生物素化的B7-H3的噬菌体展示选择后，获得单独克隆。
测序：在一个或四个选择循环后，对获得的克隆进行测序。每个变体被赋予唯一的识别号####，并且单独的变体在本文中被称为ZBH####。选定的58个氨基酸残基长的Z变体的氨基酸序列在序列表中作为SEQ ID NO:480-535列出。推导的B7-H3结合基序在每个序列中从残基8延伸至残基37。预测在这些Z变体的每一个中构成完整三螺旋束的49个氨基酸残基长多肽的氨基酸序列从残基7延伸至残基55。
针对B7-H3的Z变体的ELISA筛选：将在一个和四个选择循环后获得的克隆作为经热处理的可溶性粗样品在96孔板中产生，并在ELISA中筛选B7-H3结合活性。列出为（SEQ IDNO:480-535）的Z变体被证明在5 nM B7-H3的靶标浓度下给出介于0.55和3.2 AU之间的应答，对应于空白对照的至少3倍。结合物对分别为1.7 nM或0.57 nM的生物素化的B7-H3的浓度的对应应答被证明分别给出介于0.28和3.1 AU之间和介于0.15和2.0 AU之间的应答。ZAC12的平均应答分别为5 nM：2.25 AU，1.7 nM：1.53 AU和0.57 nM：0.76 AU。
实施例3
B7-H3结合Z变体的产生
概述
本实施例描述了用于亚克隆和产生带His标签的Z变体、与His标签和TEV（烟草蚀纹病毒）蛋白酶切割位点融合的Z变体以及与ABD融合的Z变体的一般程序，这些程序将在随后的表征实验中使用。还描述了使用肽合成来产生Z变体。
材料和方法
具有His6标签的Z变体的亚克隆：将编码单体参考Z变体的DNA（SEQ ID NO:541-545）作为来自ATUM公司（加利福尼亚州纽瓦克）的经密码子优化的和合成的基因订购。将合成的Z基因片段亚克隆到T7启动子驱动的表达载体中，产生经编码的序列MGSSHHHHHHLQ-[ZBH####]（SEQ ID NO:626）。
与可切割的His6标签融合的Z变体的亚克隆：使用标准分子生物学策略将B7-H3结合Z变体的单体形式亚克隆到T7启动子驱动的载体中，分别产生经编码的序列MGSSHHHHHHSSGVDLGTENLYFQG-[ZBH###]-C（SEQ ID NO:627）。在TEV蛋白酶处理后，所得序列为形式G-[ZBH###]-C（SEQ ID NO:628）。
从GeneArt（赛默飞世尔科技公司，美国马萨诸塞州）订购了编码表示为ZBHD01（SEQ ID NO:549）的Z变体的二聚体形式的基因，作为在定制质粒中克隆的经密码子优化的和合成的基因。将Z变体克隆为具有His6标签和TEV蛋白酶切割位点的融合蛋白。将合成的二聚体Z基因片段亚克隆到T7启动子驱动的表达载体中，产生经编码的序列MGSSHHHHHHSSGVDLGTENLYFQG-[ZAC12m]-GAPGGGGSGGGGSGGGGSTS-[ZAC12mc]（SEQ ID NO:629）。在TEV蛋白酶处理后，所得序列为形式G-[ZAC12m]-GAPGGGGSGGGGSGGGGSTS-[ZAC12mc]（SEQ ID NO:630）。
与ABD融合的Z变体的亚克隆：从GeneArt（赛默飞世尔科技公司GENEART有限公司（TermoFisher Scientific GENEART GmbH），德国雷根斯堡）订购了一组变体，其具有在多肽内的不同位置（在N-末端、C-末端或在两个Z部分之间）掺入的ABD部分（PP013；SEQ IDNO:547）并在各部分之间插入不同接头（长度和类型），作为定制载体中的克隆基因。所有构建体均含有用于后续缀合的C-末端半胱氨酸。经编码的蛋白质的形式为ZBH481-G4SAS-PP013-C（ZBHD02；SEQ ID NO:550）、GS-PP013-(G4S)2-ZBH481-C（ZBHD03；SEQ ID NO:551）、ZBH481-(G4S)5-ZBH481-G4SAS-PP013-C（ZBHD04；SEQ ID NO:552）、ZBH481-(G4S)3-ZBH481-G4SAS-PP013-C（ZBHD05；SEQ ID NO:553）、GS-PP013-(G4S)2-ZBH481-(G4S)5-ZBH481-C（ZBHD06；SEQ ID NO:554）、ZBH481-(G4S)3AS-PP013-(G4S)3-ZBH481-C（ZBHD07；SEQ ID NO:555）、ZBH481-A(EAAAK)4AGS-PP013-(KEAAA) 4KAKGS-ZBH481-C（ZBHD08；SEQ ID NO:556）、ZBH481-(TP)8-PP013-(TP)8-ZBH481-C（ZBHD09；SEQ ID NO:557）。
Z变体的表达：通常，将Z变体在接种有大肠杆菌T7E2克隆的预培养物的自诱导培养基（过夜表达TB，诺瓦根公司（Novagen））中表达，这些克隆携带具有每个B7-H3结合Z变体的经序列验证的基因片段的质粒。在通过离心收获细胞之前，将培养物（3-200 ml）在37°C和150或300 rpm下温育16 h。
通过0.6 L规模的补料分批培养产生与ABD融合的Z变体。将培养物用大肠杆菌T7E2克隆的预培养物接种至最终OD600为0.1，然后在37°C下培养，这些克隆携带具有每个多肽的经序列验证的基因片段的质粒。培养开始后17.5小时，将温度降至31°C，然后在18 h后用IPTG诱导，并表达9 h。总共27 h后，将培养物冷却至低于18°C，并通过离心收获细胞。
细胞破坏：通过已知方法，使用热处理、超声处理或FastPrep-24™仪器（MP生物医学公司（MP Biomedicals））破坏细胞。将来自FastPrep-24™的细胞碎片和残留二氧化硅球（如适用）™通过离心去除，并将上清液立即用于纯化或储存在-20°C下直至纯化。
在96孔板形式中纯化与His6标签（+/-TEV切割位点）融合的Z变体：将通过离心澄清的裂解液施加到内部预填充有75 µL Ni琼脂糖HP（思拓凡公司）并用结合缓冲液（20 mM磷酸钠、0.5 M NaCl、20 mM咪唑，pH 7.4）平衡的His MultiTrap HP板（思拓凡公司）或1 mL过滤板（1.2 µm，Acroprep）上。在用洗涤缓冲液（20 mM磷酸钠、0.5 M NaCl、60 mM咪唑，pH7.4）洗涤后，将His6标签融合型Z变体用洗脱缓冲液（20 mM磷酸钠、0.5 M NaCl、500 mM咪唑，pH 7.4）洗脱。使用离心力进行所有的洗涤和洗脱步骤。使用PD MultiTrap G-25脱盐板（思拓凡公司），进行缓冲液交换为PBS。
TEV蛋白酶切割，然后在96孔板形式中进行反向IMAC纯化：将与His6标签和TEV蛋白酶切割位点融合的B7-H3结合Z变体与带His6标签的TEV蛋白酶以25:1的Z变体:TEV蛋白酶摩尔比在4°C下过夜温育，并添加DTT至2 mM终浓度。将补充有20 mM咪唑的经温育的样品施加到预填充有用结合缓冲液平衡的150 µL Ni琼脂糖HP（思拓凡公司）的1 mL滤板（1.2 µm，Acroprep）上。使用离心力将经TEV蛋白酶切割的Z变体收集在流通液中，而带His标签的材料与IMAC树脂结合。使用PD MultiTrap G-25脱盐板（思拓凡公司），使用离心力将缓冲液交换为相关缓冲液（PBS或0.1 M HAc）。
与His6标签融合的Z变体的纯化：将通过离心澄清的裂解液施加到1 mL HisGraviTrap IMAC柱（思拓凡公司）上。通过用洗涤缓冲液洗涤去除污染物，随后用洗脱缓冲液洗脱Z变体。对于纯度低于95%（基于SDS-PAGE）或被认为适用的构建体，使用反相色谱法（RPC）进行第二纯化步骤。将每个Z变体加载到用RPC溶剂A（0.1%三氟乙酸（TFA）、10%乙腈（ACN）、90%水）预平衡的1或3 mL Resource 15RPC柱（思拓凡公司）上。在用RPC溶剂A洗涤柱后，将结合蛋白用18倍柱体积（CV）的0-60% RPC溶剂B（0.1% TFA、80% ACN、20%水）的线性梯度洗脱。然后使用PD-10脱盐柱（思拓凡公司）将缓冲液交换为PBS。
与His6标签和TEV蛋白酶切割位点融合的Z变体的纯化：将与His6标签和TEV蛋白酶切割位点融合的B7-H3结合Z变体如前一节中所述纯化，其中将1 mM DTT添加到用于含有C-末端半胱氨酸的Z变体的所有缓冲液中。此外，包括用于在通过RPC进行纯化之前切割标签的步骤：将Z变体的缓冲液交换为PBS，并在4°C下与带His标签的TEV蛋白酶以25:1或30:1的Z变体:TEV蛋白酶摩尔比过夜温育，并添加DTT至2 mM终浓度。将补充有20 mM咪唑的经温育的样品施加在用结合缓冲液平衡的1 mL His GraviTrap IMAC柱（思拓凡公司）上。将经TEV蛋白酶切割的Z变体收集在流通液中，而带His标签的材料与IMAC树脂结合。通过反相色谱法（RPC）进一步纯化未加标签的Z变体，并将缓冲液交换为PBS，如前一节所述，或交换为0.2M NaAc pH 6.0（若后续需进行缀合）。
与ABD融合的Z变体的纯化：将相应的细胞沉淀物重悬于纯化缓冲液（50 mM磷酸钠、200 mM NaCl、1 mM EDTA，pH 7.0）中，随后添加DENARASE®（c-Lecta；1 µL/g沉淀物）和DTT（终浓度20 mM）。在通过超声处理破坏细胞、通过离心和过滤澄清后，将上清液施加到HiScale 10柱上，该柱填充有包含固定化的抗ABD配体（内部开发）的树脂，连接至ÄKTAAvant 25系统（思拓凡公司）。在用纯化缓冲液洗涤后，用0.1 M HAc、1 mM EDTA（pH 3.1）洗脱ABD融合型Z变体。向各洗脱液中添加10% ACN，然后通过基本上如上所述进行的RPC进一步纯化，但使用20 ml SOURCE 30RPC柱（思拓凡公司）。
具有或不具有ABD的Z变体的DOTA缀合：使用PD-10脱盐柱，将具有独特C-末端半胱氨酸的每个经纯化的多肽的缓冲液交换为缀合缓冲液（0.2 M NaAc、2 mM EDTA，pH 6，用Chelex® 100树脂处理）。以4倍摩尔过量添加马来酰亚胺基-单-酰胺-DOTA（大环化合物公司（Macrocyclics），目录号B-272），并将每个样品在22°C和600 rpm下温育60 min，然后使用PD-10脱盐柱将缓冲液交换为0.2 M NaAc，pH 6（用Chelex® 100树脂处理）。将用于放射性标记的样品同样地缀合，但在缀合缓冲液中省略EDTA，并进行另外两轮缓冲液交换。
Z变体的NOTA缀合：根据上述用于DOTA缀合的方法，将具有独特C-末端半胱氨酸的Z变体与NOTA（凯美科技公司（CheMatech），目录号C101）缀合，但在24°C和450 rpm下温育90min。
Z变体的肽合成：Z变体的子集（ZBH536-ZBH539，SEQ ID NO:536-539，和参考变体ZAC12c，SEQ ID NO:540）使用Fmoc/tBu策略通过固相肽合成而产生，由合同制造商巴亨公司（Bachem）（英国圣海伦斯）作为合成肽执行。合成的Z变体的位置56-58的C-末端氨基酸（最初分别为A、P和K）各自突变为氨基酸残基G。此外，将氨基酸C添加到C-末端。
一般蛋白质表征：通过在280 nm处的吸光度测量确定蛋白质浓度。通过用考马斯蓝染色的SDS-PAGE对纯度进行分析，并且使用HPLC-MS分析确认每种经纯化的Z变体的身份。
结果
B7-H3结合Z变体的产生：具有His6标签或具有His6标签和TEV蛋白酶切割位点的B7-H3结合Z变体和与ABD融合的Z变体在大肠杆菌中成功地表达为可溶性基因产物，并使用亲和色谱法纯化，在一些情况下，然后通过RPC进行纯化。在适用的情况下，通过TEV蛋白酶切割步骤去除His6标签。通过化学合成成功地产生了包含C-末端GGGC序列的单体Z变体。每个最终蛋白质制剂的SDS-PAGE分析示出，这些主要含有B7-H3结合Z变体。通过HPLC-MS分析分别确认了每个Z变体、ABD融合型Z变体和缀合变体的正确身份和分子量。
实施例4
对经纯化的B7-H3结合Z变体的表征
概述
在本实施例中，在结合特性方面评估如实施例3中所述产生的N-末端带His6标签的Z变体（SEQ ID NO:480-535），并且还对子集进行了稳定性研究。表面等离子体共振（SPR）和生物层干涉测量（BLI）用于表征Z变体与人B7-H3的相互作用。使用表达B7-H3的MCF-7和SKOV-3细胞评估体外细胞结合。通过圆二色性（CD）光谱学分析解链温度和二级结构含量。化学合成的Z变体（SEQ ID NO:536-539和参考SEQ ID NO:540）也用于测量与来自其他物种的B7-H3的相互作用。
材料和方法
针对B7-H3的SPR koff筛选：使用Biacore 8K仪器（思拓凡公司）确定His6-Z变体相对于Fc融合型B7-H3（B7-H3(2Ig)-Fc）的解离速率常数（koff）。将B7-H3(2Ig)-Fc在HBS-EP+中稀释至10 nM，并捕获在蛋白A芯片（思拓凡公司）上的流动池2上，从而产生大约430 RU的捕获水平。将浓度为1 nM和5 nM的His6-Z变体用作分析物，并同时注射在流动池1和2上。缔合时间为120 s（30 µL/min），并且解离时间为300 s（30 µL/min）。将HBS-EP+用作运行缓冲液，并将10 mM甘氨酸-HCl pH 1.5（30 s / 30 µL/min的两次脉冲）用作再生缓冲液。测定温度为30°C。在使用Biacore Insight评价软件进行评价之前，从传感图中减去参考池（流动池1）和空白循环注射（HBS-EP+）。
针对B7-H3的SPR单循环动力学筛选：使用Biacore 8K仪器（思拓凡公司）在单循环动力学运行中确定His6-Z变体相对于Fc融合型B7-H3（B7-H3(2Ig)-Fc）的亲和力（KD）。将B7-H3(2Ig)-Fc在HBS-EP+中稀释至10 nM，并捕获在蛋白A芯片（思拓凡公司）上的流动池2上，从而产生大约430 RU的捕获水平。将浓度为0.56、1.67、5和15 nM的His6-Z变体用作分析物，并同时注射在流动池1和2上。缔合时间为120 s（50 µL/min），并且解离时间为300 s（50µL/min）。将HBS-EP+用作运行缓冲液，并将10 mM甘氨酸-HCl pH 1.5（30 s / 30 µL/min的两次脉冲）用作再生缓冲液。测定温度为25°C。在使用Biacore Insight评价软件进行评价之前，从传感图中减去参考池（流动池1）和空白循环注射（HBS-EP+）。
BLI动力学筛选：使用BLI在Octet HTX仪器（赛多利斯公司）中确定结合B7-H3的His6-Z变体的亲和力（KD）和动力学值（Kon和Koff）。在实验中，将His6-Z变体在1× KB缓冲液（在PBS中稀释的10× Octet动力学缓冲液）中稀释至0.5 µg/mL的浓度，并加载到抗His生物传感器（Octet® Anti-Penta-HIS（HIS1K）生物传感器）上，持续300 s。对于参考样品，使用8 nM hB7-H3(2Ig)-Fc或1× KB缓冲液在400 s期间进行缔合。在1× KB缓冲液中在400s期间进行解离。在每个循环之间，抗His生物传感器在10 mM甘氨酸-HCl pH 1.5中再生（6×2 s）。在整个实验期间使用1000 rpm的振荡速度和30°C的测定温度。在使用OctetAnalysis Studio 12.2软件进行评价之前，从传感图中减去参考样品（1× KB缓冲液）。
细胞结合测定：在第一筛选实验中，测试了His6-Z变体与表达B7-H3的MCF-7细胞的结合。将细胞置于V底96孔板（0.2 × 106个细胞/孔）中，并在4°C下与50 nM单一浓度的His6-Z变体一起温育1 h。将每个变体一式两份地测试。在含有1%胎牛血清（FBS）的PBS中洗涤1次后，通过添加浓度为4 µg/mL的抗Z多克隆抗体并在4°C下温育1 h，然后添加1:2000稀释的Alexa488缀合的山羊抗兔IgG并在4°C下温育1 h来鉴定His6-Z的结合。在FBS中洗涤2次后，通过多模式读板器（茵斯贝公司（Enspire））测量荧光强度。
在第二个实验中，针对与表达B7-H3的SKOV-3细胞的结合，测试成熟His6-Z变体（n= 7）的选择。如上文针对MCF-7细胞所述进行实验，但His6-Z变体以从500 nM至32 pM的递减浓度温育。将每个变体一式三份地测试。绘制结合曲线，并使用软件GraphPad Prism确定EC50值。
在第三实验中，测试化学合成的Z变体（SEQ ID NO:536-539和参考变体SEQ IDNO:540）与表达B7-H3的SKOV-3细胞的结合。使用与上文针对SKOV-3细胞所述的方法相同的方法。将每个Z变体一式四份地测试。
圆二色性（CD）光谱学分析：将His6-Z变体的选择在PBS中稀释至0.5 mg/mL。在20°C下获得250-195 nm处的CD光谱。另外，进行可变温度测量（VTM）以确定解链温度（Tm）。在VTM中，在温度从20°C升至90°C时（其中温度斜率为5°C/min），在221 nm处测量吸光度。在加热程序后，在20°C下获得新的CD谱，以研究Z变体的重新折叠能力。CD测量是在Jasco J-810分光偏振仪（杰斯科斯堪的纳维亚公司（Jasco Scandinavia AB））上，使用具有光程长度为1 mm的比色皿进行的。
针对来自不同物种的B7-H3的SPR分析：使用Biacore 8K仪器（思拓凡公司）分析化学合成的Z变体（SEQ ID NO:536-539和参考变体SEQ ID NO:540）与来自人（B7-H3(2Ig)-Fc）、食蟹猴（cB7-H3(4Ig)-Fc）、小鼠（mB7-H3(2Ig)-Fc）和大鼠（rB7-H3(2Ig)-Fc）的Fc融合型B7-H3的结合。将Fc融合型B7-H3变体在HBS-EP+中稀释至10 nM，并捕获在蛋白A芯片（思拓凡公司）上的流动池2上，从而导致人、食蟹猴、小鼠和大鼠的捕获水平分别为大约270、250、260和320 RU。将浓度为0.56 nM、1.67 nM、5 nM和15 nM的His6-Z变体用作分析物，并同时注射在流动池1和2上。缔合时间为120 s（50 µL/min），并且解离时间为300 s（50 µL/min）。将HBS-EP+用作运行缓冲液，并将10 mM甘氨酸-HCl pH 1.5（30 s / 30 µL/min的两次脉冲）用作再生缓冲液。测定温度为30°C。在使用Biacore Insight评价软件进行评价之前，从传感图中减去参考池（流动池1）和空白循环注射（HBS-EP+）。
结果
针对B7-H3的SPR koff筛选：在Biacore 8K仪器中，通过在具有固定化的B7-H3(2Ig)-Fc的表面上注射两种浓度的经纯化的Z变体，对His6-Z变体与B7-H3的相互作用进行分析。基于来自在B7-H3表面上注射的5 nM浓度的每种选定B7-H3结合物的数据的解离速率常数（koff）在表5中给出。
针对B7-H3的SPR单循环动力学筛选：在Biacore 8K中使用SPR分析经纯化的Z变体的子集针对B7-H3的单循环动力学筛选。将B7-H3(2Ig)-Fc捕获在蛋白A芯片上，并在表面上以四种浓度注射Z变体。估计亲和力（KD）并显示在表5中。针对四种B7-H3结合Z变体（ZBH480-ZBH482，SEQ ID NO:480-482，和参考变体ZAC12，SEQ ID NO:543）与B7-H3(2Ig)-Fc获得的传感图的实例显示在图1中。
BLI动力学筛选：通过将His6-Z变体加载到抗His生物传感器上，然后在hB7-H3(2Ig)-Fc中缔合，在Octet HTX仪器中分析His6-Z变体与B7-H3的相互作用。解离速率常数（koff）在表5中给出。
细胞结合测定：在第一个筛选实验中，通过荧光强度评价His6-Z变体与表达B7-H3的MCF-7细胞的结合。将细胞与一种浓度的经纯化的Z变体一起温育，然后与抗Z pAb和Alexa488缀合的抗兔IgG一起温育，用于检测。荧光强度在488和6677（任意单位）之间变化。表5中给出了所选结合物（在细胞测定、Biacore或Octet筛选测定中优于ZAC12）的平均荧光值的汇总。在第二个实验中，通过荧光强度评价七种成熟的His6-Z变体与表达B7-H3的SKOV-3细胞的结合。将细胞与递减浓度的经纯化的Z变体（范围从500 nM至32 pM）一起温育，然后与抗Z pAb和Alexa488缀合的抗兔IgG一起温育，用于检测。计算的平均EC50值汇总在表6中，并且来自一个代表性实验的曲线显示在图2A中。在第三个实验中，通过荧光强度评价四种合成的Z变体与表达B7-H3的细胞的结合。使用抗Z pAb和Alexa488缀合的抗兔IgG将细胞与递减浓度的合成的Z变体（范围从500 nM至32 pM）一起温育。平均EC50值汇总在表7中，并且来自一个代表性实验的曲线显示在图2B中。
表5：来自SPR分析、BLI分析和细胞测定的筛选数据
1两次测量的平均值
2三次测量的平均值
3细胞结合测定中的增加倍数
n.d：未确定
表6：His6-Z变体与SKOV-3细胞结合的细胞结合数据
表7：合成的Z变体与SKOV-3细胞结合的细胞结合数据
CD分析：对于具有His6标签的九个B7-H3结合Z变体确定的CD光谱示出所有的变体在20°C下均具有α-螺旋结构，正如根据在208和222 nm处的典型最小值判断。在将加热至90°C之前和之后测量的光谱叠加时，所有Z变体都出现了可逆折叠。解链温度（Tm）汇总在表8中。His6-ZBH480在加热至90°C之前和之后的示例性CD光谱显示在图3A中，并且其解链曲线显示在图3B中。
表8：针对带His6标签的Z变体确定的解链温度（Tm）
针对来自不同物种的B7-H3的SPR分析：在Biacore 8K仪器中，通过在捕获在蛋白A芯片表面上的B7-H3(2Ig)-Fc、cB7-H3(4Ig)-Fc、mB7-H3(2Ig)-Fc和rB7-H3(2Ig)-Fc上注射四种浓度的经纯化的Z变体，分析化学合成的Z变体（ZBH536-ZBH539，SEQ ID NO:536-539，和参考变体ZAC12c，SEQ ID NO:540）与来自人、食蟹猴、小鼠和大鼠的B7-H3的相互作用。Z变体显示出对来自不同物种的B7-H3的大致相同的结合。针对一种B7-H3结合多肽（ZBH538，SEQ ID NO:538）与人、食蟹猴、小鼠和大鼠B7-H3获得的传感图显示在图4中。
实施例5
两个B7-H3结合Z变体的成熟文库的设计和构建
概述
在本实施例中，基于在上述第一选择中鉴定出的B7-H3结合变体设计了两个新文库。新的成熟文库分别含有大约5.2 × 108个和5.9 × 108个单独克隆。
材料和方法
两个B7-H3亲和力成熟文库的设计：基于如实施例1-4中所述选择、生产和表征的B7-H3结合Z变体的序列设计两个新文库。根据基于在第一次成熟中鉴定的Z变体（并且包括SEQ ID NO:480-535中定义的那些）的结合基序的策略，Z分子支架中13个表面暴露的位置偏向某些氨基酸残基。13个不同位置内的变异性在两个文库之间相同。然而，它们在三个支架位置上有所不同。一个文库设计有Y5、N52和D53（相对于全长Z变体序列进行编号），而另一个文库设计有位置F5、S52和E53。此外，两个文库在BM内的以下两个支架位置中都含有变异性：X29和X30（相对于本文定义的BM进行编号）。新文库的设计在表9中示出，其中指示了15个随机位置的每个位置中使用的氨基酸百分比。
表9：B7-H3成熟文库的设计
使用TRIM技术生成了具有互补的3’-末端的两个寡核苷酸，一个正向互补和一个反向互补。这些寡核苷酸是从艾拉生物技术有限公司（德国马丁斯里德）订购的。
如实施例1所述在载体pAY02592和pAY04242中进行文库的构建，但存在以下例外：1) 将文库转化到电感受态XL-1 Blue细胞中；2) 然后将经转化的细胞合并，并在37°C下在1 L TSB-YE培养基中培养6.5 h，该培养基补充有2%葡萄糖、10 g/mL四环素和100 g/mL氨苄青霉素。如实施例1中所述，通过测序对文库质量和氨基酸的分布进行验证。
噬菌体储备液的制备：对于每个文库，基本上如实施例1所述在1.5 L培养基中进行噬菌体储备液培养和制备。使用PEG/NaCl，将噬菌体颗粒从上清液沉淀两次，并如实施例1中所述进行过滤，并最终溶解于PBS和甘油中。将噬菌体储备液储存在-80°C下直至在选择中使用。
结果
文库构建：基于实施例1-4中所述的一组B7-H3结合变体设计了两个新文库。所设计的文库的理论大小为4.5 × 107个Z变体。两个文库的实际大小分别为大约5.2 × 108和5.9 × 108，在转化到大肠杆菌XL-1 Blue细胞后通过滴定确定。通过对每文库192个转化子进行测序并通过将其实际序列与理论设计进行比较来测试文库质量。对单独文库成员的序列分析验证了密码子的分布符合理论设计。文库命名为Zlib009B7-H3.I和Zlib008B7-H3.II。
实施例6
亲和力成熟的B7-H3结合Z变体的第二选择和筛选
概述
在本实施例中，使用Z变体的两个不同的B7-H3成熟噬菌体文库，将B7-H3用作噬菌体展示选择中的靶标。将选定的克隆批量克隆在由T7启动子驱动的表达载体中，进行DNA测序，在大肠杆菌中产生，并通过ELISA和SPR针对不同的靶标蛋白进行测定。
材料和方法
B7-H3结合Z变体的噬菌体展示选择：使用新产生的成熟文库的噬菌体储备液进行噬菌体展示选择。针对生物素化的b-B7-H3(4Ig)-Fc和b-B7-H3(4Ig)-His_1的选择在所有轨道的溶液中进行，并且基本上如实施例2中所述，使用表10中所述的具体条件。
在循环1、2和4中使用链霉亲和素包被的SpeedBeads作为固相进行洗涤，而在循环3中使用中性亲和素珠。在循环1中手动进行洗涤，并且在循环2-4中手动和/或在KingFisher Duo仪器中进行洗涤。在RT、37°C或50°C下并使用预封闭的管（ProteinLowBind，艾本德公司）进行选择。为了降低非特异性结合的程度，使用链霉亲和素包被的SpeedBeads作为固相在循环1-2中进行预选择。在一些轨道中，将生物素化的Fc（杰克逊免疫实验室公司（Jackson ImmunoResearch Laboratories））在用于预选择之前包被在珠上（轨道15、21和22）。此外，在一些轨道中，将噬菌体储备液在70°C下预热15 min，然后在13000 rpm下离心，然后用于选择（轨道9、16、25、32、41和50）。
随着选择的进行，根据靶标浓度和洗涤次数和/或洗涤时间进一步划分轨道。
表10：使用成熟文库针对B7-H3进行选择的概述
噬菌体颗粒的扩增和制备：如实施例1和2中所述进行噬菌体储备液制备和在选择循环之间的噬菌体扩增。将对数期细菌用来自所选轨道（循环2-4）的洗脱液感染，并将培养物的池用于基本上如实施例2中所述对所选变体进行批量克隆。
用于结合分析的Z变体的产生：产生Z变体，并如实施例2中所述制备每个单独变体的HT裂解液。具有提取物的可溶性部分的最终过滤的上清液含有与His6融合的Z变体，表示为MGSSHHHHHHLQ-[ZBH###]（SEQ ID NO:626）。ZBH###是指单独的58个氨基酸残基的B7-H3结合Z变体的序列。
Z变体的ELISA筛选：在一组ELISA测定中，对Z变体与B7-H3的结合进行分析。在第一测定中，针对靶标浓度0.6 nM下的生物素化的B7-H3（b-B7-H3(4Ig)-Fc）分析每个Z变体。如实施例2中所述进行ELISA。在第二测定中，针对浓度为1.8、0.6、0.2和0 nM的生物素化的b-B7-H3(4Ig)-Fc，对结合物的选定子集进行ELISA。在第三测定中，使用0.6 nM的靶标浓度并使用96孔板对结合物的另一个选定子集进行ELISA。在该测定中，还针对浓度为12 nM的生物素化的无关靶标蛋白分析了结合物的子集。作为阳性对照，在针对四种浓度的生物素化的b-B7-H3(4Ig)-Fc的ELISA实验中使用ZAC12（SEQ ID NO:543）。使用多孔板读取器（EnSpire（珀金埃尔默公司））测量在450 nm处的吸光度。
使用HT裂解液的针对捕获的B7-H3的SPR koff筛选：出于排名目的，建立筛选实验以估计作为HT裂解液产生的His6-Z变体的子集（n = 1674）的解离速率常数（koff）。基本上如实施例4中所述针对捕获在蛋白A芯片上的Fc融合型B7-H3（B7-H3(2Ig)-Fc）并使用Biacore 8K仪器进行实验。
针对B7-H3的捕获的Z变体的SPR动力学筛选：在Biacore 8K中使用SPR分析Z变体的子集（n = 93）与B7-H3的结合。将HT裂解液中的每个Z变体捕获在固定在CM5芯片表面上的抗His Ab（Abcam目录号ab18184）上，并针对在HBS-EP+中稀释至30 nM的B7-H3(4Ig)-Fc进行分析。将HBS-EP+用作运行缓冲液，并将10 mM甘氨酸-HCl pH 2.0（20 s / 30 µL/min的两次脉冲）用作再生缓冲液。测定温度为30°C。
测序：在ELISA和SPR筛选的同时，对所有克隆进行DNA测序。
结果
成熟的B7-H3结合Z变体的噬菌体展示选择：在两个、三个和四个循环的针对生物素化的B7-H3的噬菌体展示选择后，获得单独克隆。
Z变体的ELISA筛选：在两个至四个选择循环后获得的克隆在96孔板中产生，并针对B7-H3筛选结合活性。在第一测定中，如果在0.6 nM B7-H3下，应答是背景应答的3倍（高于0.2 AU），则认为结合物是阳性的。在第二测定和第三测定中，如果在0.6 nM下，平均应答是背景应答的3倍（高于0.2 AU），并且在其他浓度下具有良好的靶标依赖性应答，则认为结合物是阳性的。
使用HT裂解液的针对捕获的B7-H3的SPR koff筛选：通过在捕获的Fc融合型B7-H3蛋白上注射HT裂解液，在Biacore 8K仪器中的解离速率筛选实验中分析Z变体与B7-H3的相互作用。经发现其解离速率曲线排名为对照Z变体ZAC12的至少两倍好的Z变体入围。
针对B7-H3的捕获的Z变体的SPR动力学筛选：在Biacore 8K中使用SPR分析HT裂解液中的Z变体的子集对B7-H3的亲和力筛选。将HT裂解液中的Z变体捕获在固定化的抗His6抗体上，并将B7-H3作为分析物注射，并评估动力学应答。该测定用于根据亲和力对结合物进行排名。经发现从第一次成熟起其解离速率曲线排名等于或优于对照Z的Z变体（ZBH481；SEQ ID NO:481）入围。
测序：在三个至四个选择循环后，对获得的克隆进行测序。每个变体被赋予唯一的识别号###，并且单独的变体被称为ZBH###。在上述SPR筛选排名之后入围的58个氨基酸残基长的Z变体的氨基酸序列在序列表中作为SEQ ID NO:1-479列出。推导的B7-H3结合基序在每个序列中从残基8延伸至残基37。预测在这些Z变体的每一个中构成完整三螺旋束的49个氨基酸残基长多肽的氨基酸序列从残基7延伸至残基55。似乎在批量克隆期间使用的引物产生了一些意外的但仍有功能的Z支架变体。除了分别具有氨基酸Y5、N52和D53（SEQ IDNO:1-13、17-418、446-479）和氨基酸F5、S52和E53（SEQ ID NO:15-16、420-424、427-428、430-436、438-444、480-535）的经设计的变体之外，还鉴定了具有F5、N52和E53（SEQ ID NO:14、425-426、429、437、445）的变体和具有F5、N52和D53（SEQ ID NO:419）的一个变体。
实施例7
对第2代成熟的B7-H3结合Z变体的表征
概述
在本实施例中，进一步表征如实施例6中所述选择的成熟Z变体的子集（n = 21）。使用SPR评估以类似于实施例3的方式产生的N-末端带His6标签的Z变体（SEQ ID NO:1-21）与B7-H3的结合，并且在细胞结合测定中测试进一步的子集和/或使用CD光谱进行稳定性和二级结构评价。
材料和方法
针对B7-H3的Z变体的SPR结合动力学：使用SPR在Biacore 8K仪器（思拓凡公司）中运行Z变体的子集（n=21）针对B7-H3的单循环动力学筛选。将来自第一次成熟的ZBH481（SEQID NO:481）和参考变体ZAC12（SEQ ID NO:543）包括在测定中，用于进行比较。根据制造商的建议，通过胺偶联将B7-H3(4Ig)-His固定到CM5芯片（思拓凡公司）表面的羧化葡聚糖层上。将表面1活化，然后去活化并用作参考。将每个Z变体在芯片表面上以0.33、1、3、9和27nM的浓度注射，保持165 s，然后解离720 s（流速为50 µl/min）。使用50 mM NaOH（20 s /30 µL/min的两个脉冲）使芯片表面再生。将HBS-EP+用作运行和稀释缓冲液。测定温度为25°C。减去参考表面和空白循环注射（HBS-EP+），并将曲线拟合到Biacore Insight评价软件（思拓凡公司）中的动力学1:1结合模型，以估计结合特性（kon、koff和KD）。
细胞测定：如实施例4中针对SKOV-3细胞所述进行实验，但His6-Z变体以从500 nM至21 pM的递减浓度温育。将每个变体一式三份地测试。将来自第一次成熟的ZBH481（SEQID NO:481）和参考变体ZAC12（SEQ ID NO:543）包括在测定中，用于进行比较。绘制结合曲线，并使用软件GraphPad Prism确定EC50值。
CD光谱分析：对于His6-Z变体的子集（n = 9），对每个Z变体进行VTM以确定Tm，并且在加热至90°C之前和之后在20°C下收集250-195 nm处的CD光谱，如实施例4中所述。
结果
针对B7-H3的Z变体的Biacore结合动力学：在Biacore 8K中使用SPR分析Z变体的子集针对B7-H3的单循环动力学筛选。在固定化的B7-H3上以五种浓度注射Z变体，并估计结合特性（kon、koff和KD）。结果汇总在表11中。针对六种B7-H3结合多肽与B7-H3(4Ig)-His获得的传感图的实例显示在图5中。与参考变体ZAC12以及先前成熟的变体ZBH481相比，所有分析的Z变体均显示出改善的结合。
细胞测定：通过荧光强度评价六种His6-Z变体与表达B7-H3的SKOV-3细胞的结合。将细胞与递减浓度的经纯化的Z变体（范围从500 nM至21 pM）一起温育，然后与抗Z pAb和Alexa488缀合的抗兔IgG一起温育，用于检测。计算的平均EC50值汇总在表11中，并且结合曲线显示在图6中。与参考变体ZAC12以及先前成熟的变体ZBH481相比，所有新的成熟Z变体均显示出改善的细胞结合。
表11：通过SPR确定的动力学值和根据SKOV-3细胞结合测定计算的EC50值的汇总
n.d：未确定
CD分析：对于具有His6标签的九个B7-H3结合Z变体确定的CD光谱示出所有的变体在20°C下均具有α-螺旋结构，正如根据在208和222 nm处的典型最小值判断。在加热至90°C后，Z变体中的五个（ZBH001-ZBH004和ZBH008）显示出完全可逆的折叠，Z变体中的两个（ZBH007和ZBH009）显示出几乎可逆的折叠，而两个Z变体（ZBH011和ZBH012）似乎对剧烈加热至90°C敏感。解链温度（Tm）汇总在表12中。将ZBH001加热至90°C之前和之后的示例性CD光谱显示在图7A中。ZBH001的对应解链曲线显示在图7B中。
表12：针对带His6标签的Z变体确定的解链温度（Tm）
实施例8
二聚体形式的多肽的体外评估
概述
为了测试是否可以通过掺入另外的B7-H3结合部分来实现改善的功效，如实施例3中所述构建和产生二聚体多肽ZBHD01（SEQ ID NO:549），并通过SPR分析和与SKOV-3细胞的结合在结合测定中进行研究。
材料和方法
SPR分析：使用Biacore 8K仪器（思拓凡公司）研究二聚体多肽ZBHD01和单体Z变体ZBH538（SED ID NO:538；包括在内用于比较）与B7-H3(4Ig)-Fc的结合。将B7-H3(4Ig)-Fc在HBS-EP+中稀释至2 nM，并捕获在蛋白A芯片（思拓凡公司）上的流动池2上，从而产生大约45RU的捕获水平。将二聚体多肽和单体Z变体中的每一者以40 nM的浓度用作分析物，同时注射在流动池1和2上。缔合时间为120 s（50 µL/min），并且解离时间为600 s（50 µL/min）。将HBS-EP+用作运行缓冲液，并将10 mM甘氨酸-HCl pH 1.5（30 s / 30 µL/min的两次脉冲）用作再生缓冲液。测定温度为25°C。在使用Biacore Insight评价软件进行评价之前，从传感图中减去参考池（流动池1）和空白循环注射（HBS-EP+）。
细胞测定：如实施例4中针对SKOV-3细胞所述进行实验，但多肽ZBHD01或ZBH538以从555 nM至28 pM的递减浓度温育。将每个变体一式两份地测试。绘制结合曲线，并使用软件GraphPad Prism确定EC50值。
结果
SPR分析：在Biacore 8K仪器中使用SPR定性分析二聚体多肽ZBHD01和单体Z变体ZBH538与B7-H3的结合。在捕获在蛋白A芯片上的B7-H3上注射变体，并比较结合曲线。分别针对ZBHD01和ZBH538与B7-H3(4Ig)-Fc结合获得的传感图显示在图8中，并且示出了二聚体多肽的显著较慢的解离速率。
细胞测定：通过荧光强度评价ZBHD01和ZBH538与表达B7-H3的SKOV-3细胞的结合。将细胞与浓度递减的二聚体或单体变体（范围从555 nM至28 pM）一起温育，然后与抗Z pAb和Alexa488缀合的抗兔IgG一起温育，用于检测。计算的平均EC50值汇总在表13中，并且结合曲线显示在图9中，其显示二聚体形式的EC50值提高到大约3.8倍。
表13：二聚体多肽与SKOV-3细胞的细胞结合数据以及与单体Z变体的比较
实施例9
B7-H3结合Z变体的放射性标记
概述
本实施例描述了随后在实施例10-12和14-15中描述的实验中使用的B7-H3结合Z变体的放射性标记。
材料和方法
用99mTc标记：将Z变体ZBH536（SEQ ID NO:536）、ZBH538（SEQ ID NO:538）、ZBH539（SEQ ID NO:539）和参考Z变体ZAC12c（SEQ ID NO:540）（均具有独特C-末端半胱氨酸的）用99mTc进行位点特异性标记。如前所述（Ahlgren等人, 2010, Nucl Med Biol [核医学与生物学] 37:539-546）制备含有75 µg氯化锡(II)二水合物（弗卢卡化工公司（FlukaChemika））、5 mg葡萄糖酸钠盐（塞尔苏斯实验室公司（Celsus Laboratories））和100 µg乙二胺四乙酸四钠盐（EDTANa4）（西格玛奥德里奇公司（Sigma-Aldrich））的冻干标记试剂盒。通过用无菌0.9%氯化钠（马林克罗特公司（Mallinckrodt））洗脱Ultra TechneKow发生器（马林克罗特公司），获得作为高锝酸盐的99mTc。通过向100 µg Z变体中添加溶解在120 µL脱气PBS中的冻干试剂盒的内容物来进行每个Z变体的放射性标记。向反应混合物中添加80µL（200-300 MBq）的99mTc-高锝酸盐，并将小瓶脱气以保护混合物免于氧化。将反应小瓶充分涡旋并在90°C下温育1 h。
用111In标记：如实施例3中所述对Z变体ZBH538（SEQ ID NO:538）和参考Z变体ZAC12c（SEQ ID NO:540）进行DOTA缀合，并用111In进行位点特异性标记。将30 µL的0.2 MNH4OAc（pH 5.5）添加至ZBH538-DOTA和ZAC12c-DOTA（40 µg/22 µL，溶解在0.2 M NH4OAc中，pH 5.5）。将混合物与[111In]InCl3（库瑞姆制药公司（Curium Pharma）；20-40 MBq）一起在90°C下温育1小时。为了去除松散结合的111In，将EDTANa4（5 mg/mL，在Milli-Q水中）以500倍摩尔过量添加到反应混合物中，并在90°C下温育10 min。使用NAP-5柱进行纯化，预平衡，并用PBS中的1% BSA洗脱。
用68Ga标记：通过用0.1 M HCl对68Ge/68Ga发生器（埃克特与齐格勒股份有限公司（Eckert and Ziegler AG））进行分级洗脱，获得镓-68。将具有最高放射性浓度的洗脱液用于标记。将在0.2 M NaAc pH 6中的各为40 µg的NOTA缀合的Z变体ZBH001（SEQ ID NO:1）、ZBH002（SEQ ID NO:2）、ZBH003（SEQ ID NO:3）和参考Z变体ZAC12（SEQ ID NO:543）（均为形式G-[ZBH###]-C（SEQ ID NO:628））与100 µL的1.25 M NaAc（pH 3.6）混合。添加发生器洗脱液（100 µl，80 MBq），并将混合物在60°C下温育10 min。使用NAP-5柱进行纯化，预平衡，并用PBS中的1% BSA洗脱。
用177Lu标记：将50 µg在0.2 M NaAc pH 6中的每个DOTA缀合的ABD融合型Z变体ZBHD02（SEQ ID NO: 550）、ZBHD07（SEQ ID NO: 555）、ZBHD08（SEQ ID NO: 556）和ZBHD09（SEQ ID NO: 557）与70 µL的0.2 M乙酸钠pH 6.25（不含金属）混合。加入50 MBq的177LuCl3（珀金埃尔默公司），并将混合物在75°C下温育1 h。为了去除松散结合的放射性核素，添加1000倍过量的EDTANa4，并将混合物在75°C下温育10 min。使用NAP-5柱进行纯化，预平衡，并用PBS中的1% BSA洗脱。
放射性标记的评价：通过即时薄层色谱法（ITLC-SG）（安捷伦科技公司）分析每种Z变体的放射化学产率。
为了交叉验证radio-ITLC数据，在配备有L-2130泵、UV检测器（L-2400）和串联耦合的辐射流量检测器（比奥斯卡公司（Bioscan））的LaChrom Elite®系统（VWR日立公司（VWRHitachi））上进行RP-HPLC。使用分析柱（Vydac RP C18柱，300 Å；3×150 mm；5 µm）进行经标记的化合物的纯度分析。RP-HPLC条件如下：溶剂A = H2O中的10 mM TFA，溶剂B =乙腈中的10 mM TFA；在220 nm处进行UV检测；梯度洗脱：在5%至70% B下0-15 min，在70%至95% B下15-18 min，在5% B下19-20 min；并且流速为1.0 mL/min。
为了评估经99mTc标记的缀合物的体外稳定性，将新鲜标记的Z变体（10 µL，4 µg）中的每一个的级分与过量的PBS（40 µL）一起在37°C下温育1小时。为了评价经68Ga和177Lu标记的缀合物的体外稳定性，将新鲜标记的化合物中的每一个的级分与过量的EDTA一起温育：经68Ga标记的缀合物在37°C下在1000摩尔过量的EDTA下温育2 h，而经177Lu标记的缀合物在RT下在500摩尔过量的EDTA下温育1 h。也在PBS中进行温育作为对照。将测试一式三份地运行。如上所述，通过ITLC-SG监测放射性核素的释放。
结果
用99mTc标记：将B7-H3结合Z变体用99mTc成功标记，其中放射化学产率超过95%，并且RHT小于5%。
经99mTc标记的缀合物的比活性为3 MBq/µg（摩尔活性为18.9 GBq/µmol）。所有经99mTc标记的缀合物在过量PBS存在下在37°C下温育1 h期间是稳定的。观察到99mTc的释放小于5%。
放射性标记和体外稳定性测试的结果汇总于表14A中。在RP-HPLC分析中，经标记的Z变体（通过放射性检测器测量）的11-12 min的保留时间与未标记的多肽（通过UV检测器测量）相同。这证实了经标记的缀合物的真实性。
表14A：99mTc放射性标记和体外稳定性的结果
用111In标记：将DOTA缀合的ZBH538和参考Z变体ZAC12c用111In成功标记，其中放射化学产率超过91%。在NAP-5柱上纯化后，放射化学纯度超过98%。
用68Ga标记：将NOTA缀合的B7-H3结合Z变体用68Ga成功标记，其中放射化学产率超过约88%。在NAP-5柱上纯化后，放射化学纯度超过99%。所有经68Ga标记的缀合物的比活性为1.2 MBq/µg。Z变体在用1000倍摩尔过量的EDTA温育长达2 h期间表现出高稳定性。放射性标记和体外稳定性测试的结果汇总于表14B中。在RP-HPLC分析中，每个Z变体在10-12 min的保留时间处仅观察到一个主峰。
表14B：68Ga放射性标记和体外稳定性的结果
用177Lu标记：在75°C下EDTA处理10 min后，将DOTA缀合的ABD融合型Z变体用177Lu成功标记，其中放射化学产率超过约86%。在NAP-5柱上纯化后，放射化学纯度超过98%。所有经177Lu标记的缀合物的比活性为1 MBq/µg。Z变体在用500倍摩尔过量的EDTA温育长达1 h期间表现出高稳定性。放射性标记和体外稳定性测试的结果汇总于表14C中。在RP-HPLC分析中，每个ABD融合型Z变体在约12 min的保留时间处仅观察到一个主峰。
表14C：177Lu放射性标记和体外稳定性的结果
实施例10
经99mTc标记的B7-H3结合Z变体的体外评估
概述
本实施例描述了在实施例11中描述的动物研究中使用变体之前，用于评价经99mTc标记的缀合物的结合和特异性的基于细胞的体外测定。
材料和方法
细胞培养：均从美国典型培养物保藏中心（ATCC）获得的卵巢癌SKOV-3和乳腺癌BT-474细胞系被用作表达B7-H3的阳性细胞系。使用Ramos淋巴瘤细胞系（ATCC）作为非B7-H3表达阴性对照细胞系。将B7-H3特异性抗体（小鼠IgG1；研发系统公司，目录号MAB1027）用于通过使用BD Quantibrite珠（碧迪生物科学公司（BD Biosciences））对表达进行滴定和定量而对不同细胞系的受体表达水平进行排名。经估计，SKOV-3、BT-474和Ramos的B7-H3表达水平分别为68000（高）、45000（中）和250（低）个受体/细胞（Oroujeni等人, 2022,Pharmaceutics [药剂学] 14:1780）。在补充有10%胎牛血清（对于BT-474为20%胎牛血清）、2 mM L-谷氨酰胺、100 IU/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的RPMI培养基（流体实验室公司（Flow Laboratories））中培养细胞。将细胞以106个细胞/培养皿的密度接种在细胞培养皿（直径35 mm）中。将一组三个培养皿用于体外结合特异性评估。
体外结合特异性：在每个三个对照培养皿中，将SKOV-3和BT-474细胞用200倍过量的每种未标记的Z变体预饱和15 min，然后添加经标记的缀合物。将预饱和培养皿和不饱和培养皿两者中的细胞与经标记的缀合物（10 nM）一起在加湿培养箱（5% CO2，37°C）中温育1h。弃去培养基，并用冷的无血清培养基洗涤细胞，然后添加胰蛋白酶-EDTA溶液（0.5 mL/培养皿）并将细胞再温育10 min。将脱离的细胞用0.5 mL完全培养基稀释，重悬，并转移至级分管。使用配备有3英寸NaI（TI）孔检测器的自动γ-光谱仪（2480 Wizard，瓦拉公司（Walla））测量细胞的放射性，并计算细胞结合的放射性。通过非配对双尾t检验分析数据。
体外结合亲和力：使用LigandTracer Yellow仪器（里奇维尤仪器公司（RidgeviewInstruments））测量经99mTc标记的Z变体与细胞上的B7-H3受体的结合动力学，如前所述（Björke等人, 2006 Appl. Radiat. Isot.[应用辐射与同位素], 64:901-905）。将SKOV-3细胞接种在细胞培养皿（直径89 mm，NunclonTM，NUNC A/S）的局部区域上。在RT下进行测量以防止内化。记录99mTc-ZBH536、99mTc-ZBH538和99mTc-ZBH539在1和3 nM下的摄取曲线，以及99mTc-ZAC12c在2、6和18 nM下的摄取曲线，之后取出放射性培养基并用新鲜的非放射性培养基替换，并记录解离曲线。使用Interaction Map软件（里奇维尤诊断公司（RidgeviewDiagnostics））分析数据，以计算缔合速率、解离速率和平衡解离常数（KD）。将分析一式两份地进行。
结果
体外结合特异性：使用饱和实验测试经99mTc标记的缀合物的B7-H3结合特异性。当将细胞用过量的未标记的抗B7-H3Z变体预饱和时，结合显著（p < 5×10-5）降低（图10），这证明结合是B7-H3介导的。
体外结合亲和力：使用LigandTracer Yellow仪器实时测量的经99mTc标记的缀合物与SKOV-3细胞的结合动力学呈现在图11和表15中。使用1:2模型实现了经放射性标记的缀合物与SKOV-3细胞系结合的最佳拟合，这表明与B7-H3存在两种类型的相互作用。所有变体均显示出低纳摩尔范围内的KD2值。99mTc-ZBH538显示出低皮摩尔范围内的KD1值（KD1 = 28± 1.3 pM，权重% = 12），即具有表观最高亲和力的变体。
表15：经99mTc标记的Z变体与表达B7-H3的SKOV-3细胞相互作用的表观动力学参数
实施例11
经 99mTc标记的B7-H3结合Z变体的体内生物分布和成像研究
概述
使用放射性核素分子成像监测B7-H3表达可以取代活检取样，从而提供非侵入性、可重复的替代方案，还允许同时检测转移瘤中的B7-H3。本实施例描述了用B7-H3结合Z变体ZBH536（SEQ ID NO:536）、ZBH538（SEQ ID NO:538）、ZBH539（SEQ ID NO:539）和参考Z变体ZAC12c（SEQ ID NO:540）（均用99mTc标记）在非肿瘤小鼠和荷瘤小鼠两者中进行的体内生物分布研究。
材料和方法
动物处理：根据实验室动物工作的国家立法进行动物实验。已获乌普萨拉动物研究伦理委员会（Ethical Committee for Animal Research in Uppsala）批准。
在非荷瘤小鼠中的生物分布：将3 µg经99mTc标记的Z变体（60 kBq，100 µL，在PBS中）静脉内注射到雌性NMRI小鼠（平均体重为36.5 ± 6.4 g）的尾静脉中。4 h后，通过过量麻醉溶液（每克体重20 μL溶液：氯胺酮，10 mg/mL；甲苯噻嗪，1 mg/mL）实施安乐死。随后进行心脏穿刺，并收集血液样品。收集器官和组织样品并称重。使用带有NaI（TI）检测器的γ光谱仪（2480 Wizard，瓦拉公司）以及每只动物的三个标准品和空注射器测量器官放射性。将器官的摄取值计算为每克组织的注射剂量百分比（%ID/g）。使用GraphPad Prism（Windows版本6；GraphPad软件公司（GraphPad Software））通过非配对双尾t检验和ANOVA分析数据，以确定显著差异（p < 0.05）。
在荷瘤小鼠中的生物分布：在携带B7-H3阳性SKOV-3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中评价生物分布和靶向特性。为了建立异种移植物，将SKOV-3细胞（107个细胞/小鼠）皮下注射到雌性BALB/c nu/nu小鼠的右后腿中。作为特异性对照，将B7-H3阴性Ramos细胞（5×106个细胞/小鼠）皮下植入雌性BALB/c nu/nu小鼠的左后腿上。在细胞植入后三周进行实验。平均动物体重为19.1 ± 1.9 g。SKOV-3和Ramos异种移植物的平均肿瘤重量分别为0.10 ± 0.08 g和0.09 ± 0.07 g。将经99mTc标记的Z变体（3 µg，60 kBq，100 µL，在PBS中）注射到每组四只荷瘤小鼠的尾静脉中。为了测试B7-H3特异性积累，向一组携带B7-H3阴性Ramos异种移植物的动物注射每种缀合物的相同肽和活性剂量。在注射后4 h测量生物分布，并如上文针对NMRI小鼠所述进行和分析。
体内成像：为了确认生物分布结果，进行了小型动物SPECT/CT成像。向一只SKOV-3异种移植小鼠和一只Ramos异种移植小鼠静脉内注射6 MBq/3 µg经99mTc标记的Z变体。在注射后4 h使用nanoScan SPECT/CT扫描仪（美迪索医学影像系统公司（Mediso MedicalImaging Systems））对小鼠进行成像。在将小鼠置于相机中之前立即通过CO2窒息而使其安乐死。按以下参数进行计算机断层扫描（CT）采集：能量峰值为50 kV，670 µA，480个投影，并且采集时间为2.29 min。按以下参数进行SPECT采集：99mTc能量峰值为140 keV，窗口宽度为20%，矩阵为256×256，并且采集时间为1 h。使用Nucline 2.03软件（美迪索医学影像系统公司）实时重建CT图像。使用TeraTomo™ 3D SPECT重建技术重建SPECT原始数据。
结果
在非荷瘤小鼠中的生物分布：经99mTc标记的Z变体在注射后4 h在NMRI小鼠中的生物分布结果呈现在图12和表16中。生物分布数据证明，血液浓度无显著差异。观察到99mTc-ZBH538在几乎所有器官和组织中的摄取较少。与参考变体99mTc-ZAC12c相比，99mTc-ZBH536、99mTc-ZBH538和99mTc-ZBH539的肝脏摄取以及脾摄取显著降低；所有放射性缀合物的肾脏摄取水平相同。
表16.经99mTc标记的Z变体在注射后4 h在雌性NMRI小鼠中的生物分布。数据表示为%ID/g；来自4只小鼠的平均值±SD
具有内容物的胃肠道（GI）和屠体的数据以每份整体样品的注射剂量%表示。
在荷瘤小鼠中的生物分布：经99mTc标记的Z变体在注射后4 h在携带SKOV-3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中的生物分布结果呈现在图13A和表17中。肿瘤与器官比值呈现在图13B和表18中。99mTc-ZBH536的肿瘤摄取（2.15 ± 1.01%ID/g）、99mTc-ZBH538的肿瘤摄取（1.54 ± 0.19%ID/g）和99mTc-ZBH539的肿瘤摄取（3.19 ± 0.21%ID/g）高于参考变体99mTc-ZAC12c的肿瘤摄取（1.04 ± 0.08%ID/g）。99mTc-ZBH538显示出最低的血液浓度（0.06± 0.01%ID/g），并且与其他放射性缀合物相比，在肝（0.26 ± 0.02%ID/g）和骨（0.006 ±0.001%ID/g）中的摄取显著（p < 0.05）更少。与99mTc-ZBH538的肾脏摄取（10.37 ± 1.34%ID/g）和99mTc-ZAC12c的肾脏摄取（10.30 ± 1.13%ID/g）相比，99mTc-ZBH539显示出显著（p< 0.05）更少的肾脏摄取（5.85 ± 0.28%ID/g）。生物分布概况导致与99mTc-ZBH536的肿瘤与血液比值（11.3 ± 4.2）和99mTc-ZAC12c的肿瘤与血液比值（11.0 ± 0.5）相比，99mTc-ZBH538的肿瘤与血液比值（25.7 ± 2.5）显著（p < 0.05）更高。99mTc-ZBH538的肿瘤与肝比值（5.9 ± 0.8）显著（p < 0.05）高于其他放射性缀合物。
此外，注射后4 h，与B7-H3阴性Ramos异种移植物相比，B7-H3阳性SKOV-3异种移植物中99mTc-ZBH538的摄取显著（p < 5 × 10-5）更高（图14），这支持了体内肿瘤积累是B7-H3特异性的。
表17.在携带SKOV-3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中注射经99mTc标记的B7-H3靶向Z变体后4 h的生物分布。数据表示为%ID/g；来自4只小鼠的平均值±SD
具有内容物的胃肠道（GI）和屠体的数据以每份整体样品的注射剂量%表示。
表18.在携带SKOV-3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中注射经99mTc标记的B7-H3靶向Z变体后4 h的肿瘤与器官比值。数据表示为%ID/g；来自4只小鼠的平均值±SD
体内成像：nanoSPECT/CT成像的结果（图15）证明了在注射经99mTc标记的Z变体后4h，表达B7-H3的SKOV-3肿瘤中B7-H3表达的高对比度可视化。特别是对于99mTc-ZBH538，观察到肝中较少的活性积累。B7-H3阴性Ramos异种移植物中的活性摄取显著低于SKOV-3异种移植物（图16），这证实了B7-H3介导的这些示踪剂在体内的结合。
实施例12
经111In标记的B7-H3结合Z变体的体外和体内评估
概述
本实施例描述了在荷瘤小鼠中的体外表征以及体内生物分布研究，其用B7-H3结合Z变体ZBH538（SEQ ID NO:538）和参考Z变体ZAC12c（SEQ ID NO:540）进行，这些变体各自用111in标记。对于经99mTc标记的缀合物，基本上如实施例10和11中所述进行实验。为了更可靠地比较与放射性标记本身有关的差异（独立于可能影响生物分布的动物生理学的小鼠批次间变异性），使用用99mTc标记的相同变体在体内进行并排评价。
材料和方法
体外评估：基本上如实施例10中所述进行用于评价经111In标记缀合物的结合特异性和结合亲和力的基于细胞的体外测定。为了通过LigandTracer测量确定结合亲和力，记录111In-ZBH538在1、3和9 nM下的摄取曲线，以及111In-ZAC12c在2、6和18 nM下的摄取曲线。
在荷瘤小鼠中的生物分布：如实施例11中所述制备分别携带SKOV-3和Ramos异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠。平均动物体重为17.8 ± 1.3 g。SKOV-3和Ramos异种移植物的平均肿瘤重量分别为0.10 ± 0.06 g和0.7 ± 0.4 g。将经111In标记的Z变体（3 µg，20kBq，100 µL，在PBS中）注射到每组四只荷瘤小鼠的尾静脉中。为了测试B7-H3特异性积累，向一组携带B7-H3阴性Ramos异种移植物的动物注射每种缀合物的相同肽和活性剂量。在携带SKOV-3异种移植物的小鼠中，在注射后4和24 h测量生物分布，并且在携带Ramos异种移植物的小鼠中，在注射后4 h测量生物分布。为了比较，向两组小鼠的尾部注射99mTc-ZBH538和99mTc- ZAC12c（3 µg，60 kBq，100 µL，在PBS中），并在注射后4 h进行生物分布测量。
体内成像：向两只携带SKOV-3的异种移植小鼠分别静脉内注射1-2 MBq/3 µg经111In标记的ZBH538和ZAC12c。为了证实体内特异性，向两只携带Ramos异种移植物的小鼠静脉内注射相同活性剂量的每种经放射性标记的Z变体。如实施例11中所述，在注射后4 h使用nanoScan SPECT/CT扫描仪对小鼠进行成像。
结果
体外结合特异性：使用饱和实验测试经111In标记的缀合物的B7-H3结合特异性。当将细胞用过量的未标记的抗B7-H3Z变体预饱和时，结合显著（p < 5 × 10-5）降低，这证明结合是B7-H3介导的。
体外结合亲和力：使用LigandTracer Yellow仪器实时测量的经111In标记的缀合物与SKOV-3细胞的结合动力学呈现在图17和表19中。使用1:1模型实现了经111In标记的缀合物与SKOV-3细胞系结合的最佳拟合，从而产生在亚纳摩尔范围内的KD。
表19：经111In标记的Z变体与表达B7-H3的SKOV-3细胞相互作用的表观动力学参数
在荷瘤小鼠中的生物分布：经111In标记的Z变体在注射后4 h和24 h在携带SKOV-3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中的生物分布结果呈现在图18A-B和表20中。肿瘤与器官比值呈现在图19A-B和表21中。111In-ZBH538在注射后4和24 h的肿瘤摄取分别为3.63 ±0.31和0.78 ± 0.18%ID/g，这显著（p < 0.05）高于111In-ZAC12c的对应的肿瘤摄取（在注射后4和24 h分别为1.80 ± 0.49和0.37 ± 0.13%ID/g）。与111In- ZAC12c在研究的两个时间点的肝脏摄取（分别为6.43±1.05和4.07 ± 0.21%ID/g）相比，111In-ZBH538在研究的两个时间点显示出显著（p < 0.05）更低的肝脏摄取（分别为1.07 ± 0.08和0.80 ±0.02%ID/g）。观察到两种放射性缀合物随时间推移从血液和几乎所有器官及组织中快速清除活性。
表20.在携带SKOV-3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中注射经111In标记的B7-H3靶向Z变体后4 h和24 h的生物分布。数据表示为%ID/g；来自4只小鼠的平均值±SD
具有内容物的胃肠道（GI）和屠体的数据以每份整体样品的注射剂量%表示。
测得的肿瘤与器官比值显示，在注射后4和24 h，与111In- ZAC12c的肿瘤与器官比值（分别为20.60 ± 7.10和20.41±6.75）相比，111In-ZBH538的肿瘤与器官比值显著（p <0.05）更高（分别为31.09 ± 2.9和43.18 ± 13.82）。由于几乎所有器官和组织中的摄取随时间推移减少，因此与24 h相比，两种放射性缀合物均在4 h时观察到更高的肿瘤与器官比值。与111In- ZAC12c相比，111In-ZBH538通常在注射后4 h显示出更高的肿瘤与器官比值。例如，111In-ZBH538的肿瘤与肝比值（3.40±0.49）和肿瘤与骨比值（168.57±29.09）显著高于111In-ZAC12c（分别为0.28 ± 0.05和100.00 ± 29.43），使得111In-ZBH538更有利于在成像的早期时间点对骨和肝转移进行成像。
表21.在携带SKOV-3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中注射经111In标记的B7-H3靶向Z变体后4 h和24 h的肿瘤与器官比值。数据表示为%ID/g；来自4只小鼠的平均值±SD
经111In标记的和经99mTc标记的Z变体在注射后4 h在荷瘤小鼠中的生物分布的头对头比较结果呈现在图20和表22-23中。数据表明，与两种经99mTc标记的缀合物（99mTc-ZBH538：1.59 ± 0.19%ID/g和99mTc-ZAC12c：0.84 ± 0.18%ID/g）相比，111In-ZBH538在肿瘤中的摄取显著（p < 0.05）更高（3.63 ± 0.31%ID/g）。与111In-ZAC12c的肝脏摄取（6.43± 1.05%ID/g）以及99mTc-ZAC12c的肝脏摄取（2.70 ± 0.30%ID/g）相比，111In-ZBH538的肝脏摄取（1.07 ± 0.08%ID/g）显著（p < 0.05）更低。99mTc-ZBH538在几乎所有器官和组织中显示出最低摄取，包括肿瘤摄取。111In标记和99mTc标记的肾脏摄取差异是由于放射性标记的残留和非残留特性之间的差异。
表22.在携带SKOV-3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中注射经111In和99mTc标记的B7-H3靶向Z变体后4 h的比较性生物分布。数据表示为%ID/g；来自4只小鼠的平均值±SD
具有内容物的胃肠道（GI）和屠体的数据以每份整体样品的注射剂量%表示。
这样的生物分布概况导致与两种经99mTc标记的缀合物（99mTc-ZBH538：15.74 ±4.13和99mTc-ZAC12c：4.11 ± 0.87）相比，111In-ZBH538的肿瘤与血液比值（31.09 ±2.91）显著（p < 0.05）更高。111In-ZBH538的肿瘤与肝比值（3.40 ± 0.49）和99mTc-ZBH538的肿瘤与肝比值（4.17 ± 0.60）没有显著差异。
表23.在携带SKOV-3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中注射经111In和99mTc标记的B7-H3靶向Z变体后4 h的肿瘤与器官比值。数据表示为%ID/g；来自4只小鼠的平均值±SD
体内成像：在注射后4 h，携带B7-H3阳性SKOV-3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中111In-ZBH538和111In-ZAC12c的nanoSPECT/CT成像结果（图21A）证实了离体生物分布数据。观察到与111In-ZAC12c相比，111In-ZBH538的活性在肝中的较少积累并且在肿瘤中的较高积累。此外，B7-H3阴性Ramos异种移植物中的活性摄取显著低于SKOV-3异种移植物（图21B），这证实了B7-H3介导的这些经111In标记的缀合物在体内的结合。
实施例13
对ABD融合型B7-H3结合Z变体的体外表征
概述
对于体内用途，延长多肽的半衰期可能是令人期望的，并且实现这一点的一种方法是通过与ABD部分融合。本实施例描述了对以不同形式构建的八种DOTA缀合的ABD融合型Z变体（ZBHD02-ZBHD09；SEQ ID NO: 550-557）的体外表征，这些不同的形式涉及1) ABD部分的放置；2) B7-H3结合Z部分的数量；以及和3) 这些部分之间的接头的设计。如实施例3中所述克隆和产生多肽，并通过SPR分析和与SKOV-3细胞的结合在结合测定中进行研究。
材料和方法
SPR分析-与B7-H3的结合：使用SPR在Biacore 8K中运行与B7-H3结合的多肽的多循环动力学（MCK）筛选。根据制造商的建议，通过胺偶联将B7-H3(4Ig)-His固定到CM5芯片（思拓凡公司）表面的羧化葡聚糖层上。将表面1活化，然后去活化并用作参考。将每种多肽在芯片表面上以15、45和135 nM的浓度注射，保持150 s，然后解离720 s（流速为50 µl/min）。使用50 mM NaOH（20 s / 30 µL/min的两个脉冲）使芯片表面再生。将HBS-EP+用作运行和稀释缓冲液。测定温度为25°C。在使用Biacore Insight评价软件进行评价之前，从传感图中减去参考池（流动池1）和空白循环注射（HBS-EP+）。
SPR分析-与白蛋白的结合：使用与上一节中描述的类似的MCK分析。将HSA（阿勒贝迪克斯公司（Albumedix），目录号205-005）和MSA（西格玛奥德里奇公司，目录号A3559）分别固定在CM5芯片上。将多肽ZBHD02（SEQ ID NO:550）、ZBHD07（SEQ ID NO:555）、ZBHD08（SEQID NO:556）和ZBHD09（SEQ ID NO:557）以1.6、8、40、200和1000 nM的浓度在芯片表面上注射，保持400 s，然后解离4 h（流速为30 µl/min）。
细胞测定：通过荧光强度评价多肽与表达B7-H3的SKOV-3细胞的结合。如实施例4中针对SKOV-3细胞所述进行实验，但将多肽以从500 nM至0.16 nM的递减浓度并在1.5 µMHSA存在下温育。
结果
SPR分析-与B7-H3的结合：在Biacore 8K中使用SPR分析与B7-H3结合的多肽的多循环动力学筛选。在固定化的B7-H3上以三种浓度注射多肽。针对八种所分析的B7-H3结合多肽ZBHD02-ZBHD09（SEQ ID NO: 550-557）与B7-H3(4Ig)-His获得的传感图的实例显示在图22中。
SPR分析-与白蛋白的结合：所有四种测试的多肽显示出对HSA的保留的和相似的结合动力学值以及对MSA的相似的结合动力学值（图23）。如预期的，与HSA结合相比，观察到MSA结合的更快解离速率和更低的KD。
细胞测定：针对ABD融合型多肽与表达B7-H3的SKOV-3细胞的结合计算的EC50值汇总在表24中，并且结合曲线显示在图24中。
表24：ABD融合型Z变体与SKOV-3细胞结合的细胞结合数据
与实施例8中描述的观察结果一致，SPR和细胞测定分析均表明，与含有一个Z部分的ABD融合多肽（ZBHD02和ZBHD03）相比，关于Z部分为二聚体的ABD融合多肽（ZBHD04-ZBHD09）显示出更强的与B7-H3的结合。
实施例14
经177Lu标记的ABD融合型B7-H3结合Z变体的体外和体内评估
概述
本实施例描述了在荷瘤小鼠中的体外表征以及体内生物分布研究，其用实施例13中评估的ABD融合型B7-H3结合Z变体的子集进行：ZBHD02（SEQ ID NO:550）、ZBHD07（SEQ IDNO:555）、ZBHD08（SEQ ID NO:556）和ZBHD09（SEQ ID NO:557），这些变体各自如实施例9中所述用177Lu标记。
材料和方法
体外评估：基本上如实施例10中所述进行用于评价经177Lu标记ABD融合型Z变体的结合特异性和结合亲和力的基于细胞的体外测定。为了通过LigandTracer测量确定结合亲和力，在存在和不存在100 nM HSA的情况下，记录1和3 nM下的摄取曲线。
在荷瘤小鼠中的生物分布：制备分别携带SKOV-3和Ramos异种移植物的BALB/Cnu/nu小鼠，并在细胞植入后两周进行生物分布测量，基本上如实施例11中所述。平均动物体重为18.5 ± 0.7 g。平均肿瘤重量为0.4 ± 0.2。将经177Lu标记的ABD融合型Z变体（468pmol，260 kBq，100 µL，在PBS中）注射到每组四只SKOV-3异种移植小鼠的尾静脉中。注射后48 h测量生物分布。
对177Lu-ZBHD02（SEQ ID NO:550）进行了另外的生物分布研究，其也在24和168 h时进行了评估。向两组四只携带SKOV3异种移植物的小鼠注射177Lu-ZBHD02（468 pmol，260kBq，100 µL，在PBS中）。
体内成像：向一组四只SKOV-3异种移植小鼠分别静脉内注射3 MBq的177Lu-ZBHD02、177Lu-ZBHD07、177Lu-ZBHD08和177Lu-ZBHD09。为了确认体内特异性，向一只Ramos异种移植小鼠和一只SKOV-3异种移植小鼠静脉内注射3 MBq的177Lu-ZBHD02。在两个实验中，使用NanoScan SC在注射后48 h收集nanoSPECT/CT图像。使用50 keV的X射线能量进行CT采集；使用能量窗口50-62、103-124和188-230 keV获得20-min SPECT螺旋扫描。使用Tera-Tomo™ 3D SPECT软件来重建数据。
结果
体外结合特异性：使用饱和实验测试经177Lu标记的ABD融合型Z变体的B7-H3结合特异性。当将细胞用200倍过量的未标记的抗B7-H3Z变体预饱和时，结合显著（p < 0.05）降低，这证明结合是B7-H3介导的。
体外结合亲和力：使用LigandTracer Yellow仪器实时测量的经177Lu标记的ABD融合型Z变体与SKOV-3细胞的结合动力学呈现在表25中。使用1:2模型实现了结合的最佳拟合。与含有单个Z部分的变体（ZBHD02）相比，对于含有两个Z部分的变体（ZBHD07、ZBHD08和ZBHD09）观察到更高的亲和力结合（更低的KD），这与实施例13中针对对应的未标记的变体所呈现的结果一致。
表25：经177Lu标记的ABD融合型Z变体与表达B7-H3的SKOV-3细胞相互作用的表观平衡解离常数（KD）
在荷瘤小鼠中的生物分布：四种经177Lu标记的ABD融合型Z变体在注射后48 h在携带SKOV-3肿瘤的小鼠中的生物分布的头对头比较结果呈现在图25A和表26中。数据表明，177Lu-ZBHD02的肿瘤摄取（19.64 ± 0.77%ID/g）显著（p < 0.05）高于177Lu-ZBHD08的肿瘤摄取（13.13 ± 1.15%ID/g）和177Lu-ZBHD09的肿瘤摄取（13.95 ± 0.52%ID/g）。177Lu-ZBHD02的肾脏摄取（16.44 ± 1.46%ID/g）显著（p < 0.05）低于177Lu-ZBHD08的肾脏摄取（19.77 ± 2.07%ID/g）和177Lu-ZBHD09的肾脏摄取（23.99 ± 2.30%ID/g）。在肝脏摄取方面未观察到显著差异。177Lu-ZBHD02和177Lu-ZBHD07的血液浓度显著（p < 0.05）高于177Lu-ZBHD08的血液浓度。
表26：在携带SKOV-3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中注射经177Lu标记的B7-H3靶向ABD融合型Z变体后48 h的比较性生物分布。数据表示为%ID/g；来自4只小鼠的平均值±SD
具有内容物的胃肠道（GI）和屠体的数据以每份整体样品的注射剂量%表示。
177Lu-ZBHD02在另外的时间点（注射后24和168 h）的生物分布呈现在图25B和表27中。随着时间的推移，从血液和正常器官和组织（比如肺、胃、肌肉和骨）中的清除是迅速的。注射后24 h，肿瘤摄取为20.29 ± 3.14%ID/g，保留长达48 h（19.64 ± 0.77%ID/g），随后在注射后168 h降低至12.61 ± 2.46%ID/g。在注射后24 h（14.84 ± 0.61%ID/g）和48 h（16.44 ± 1.46%ID/g）之间，未观察到肾脏摄取的显著差异，但在168 h（5.97 ± 1.03%ID/g）时，肾中的活性已显著（p < 0.05）下降。基于血液、肾、肿瘤和骨的曲线下面积，肿瘤与血液、肿瘤与肾和肿瘤与骨的比值分别为3.5、1.4和10.6。
表27：在携带SKOV-3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中注射177Lu-ZBHD02后24、48和168 h的生物分布。数据表示为%ID/g；来自4只小鼠的平均值±SD
具有内容物的胃肠道（GI）和屠体的数据以每份整体样品的注射剂量%表示。
体内成像：在注射后48 h，携带B7-H3阳性SKOV-3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中的nanoSPECT/CT成像结果（图26）证实了离体生物分布数据。即，与其他变体相比，观察到177Lu-ZBHD02在肿瘤中的较高积累和在肾中的较低积累。此外，B7-H3阳性SKOV-3异种移植物（图27A）中的活性摄取显著高于B7-H3阴性Ramos异种移植物（图27B），这证实了B7-H3介导的体内结合。
综上所述，与包含两个Z部分的177Lu-ZBHD07、177Lu-ZBHD08和177Lu-ZBHD09相比，尽管具有单个Z部分的177Lu-ZBHD02以较低的亲和力与B7-H3结合，但其显示出更好的生物分布概况。
实施例15
第2代成熟的B7-H3结合Z变体的体外和体内评估
概述
本实施例描述了在荷瘤小鼠中的体外细胞结合特异性以及体内生物分布研究，其用B7-H3结合Z变体ZBH001（SEQ ID NO:1）、ZBH002（SEQ ID NO:2）、ZBH003（SEQ ID NO:3）和参考Z变体ZAC12（SEQ ID NO:543）进行，这些变体各自为形式G-[ZBH###]-C（SEQ ID NO:628）、如实施例3中所述进行NOTA缀合并如实施例9中所述用68Ga标记。
材料和方法
体外结合特异性：基本上如实施例10中所述进行用于评价经68Ga标记的Z变体的结合特异性的基于细胞的体外测定。
在荷瘤小鼠中的生物分布：制备分别携带SKOV-3和Ramos异种移植物的BALB/Cnu/nu小鼠，并在细胞植入后三周进行生物分布测量，基本上如实施例11中所述。平均动物体重为18.2 ± 1.2 g。SKOV-3和Ramos异种移植物的平均肿瘤重量分别为0.11 ± 0.04和0.41 ± 0.17 g。将经68Ga标记的Z变体（2 µg，400 kBq，100 µL，在PBS中）注射到每组四只SKOV-3异种移植小鼠的尾静脉中。为了测试B7-H3特异性积累，向一组携带B7-H3阴性Ramos异种移植物的小鼠注射相同的肽和剂量。注射后2 h测量生物分布。
体内成像：为了确认生物分布结果，进行了小型动物PET/CT成像。向一只SKOV-3异种移植小鼠静脉内注射2.5 MBq的相应Z变体。另外，向一只Ramos异种移植小鼠注射2.5MBq 68Ga ZBH003。在注射后2 h使用PET/CT扫描仪（美迪索医学影像系统公司）对小鼠进行成像。在将小鼠置于相机中之前立即通过CO2窒息而使其安乐死。在PET采集后立即使用相同的床位使用nanoScan SPECT/CT（美迪索医学影像系统公司）进行CT采集。进行30 min的PET扫描，然后按以下参数进行CT检查：CT-能量峰值为50 keV，670 A，480个投影，采集时间为2.29 min。使用Tera-Tomo™ 3D重建引擎将PET数据重建为静态图像。使用Nucline 2.03软件（美迪索医学影像系统公司）中的滤波反投影实时重建CT原始文件。将PET和CT文件融合并呈现为最大强度投影（MIP）。
结果
体外结合特异性：使用饱和实验测试经68Ga标记的Z变体的体外B7-H3结合特异性。当将细胞用200倍过量的未标记的抗B7-H3Z变体预饱和时，结合显著（p < 0.05）降低，这证明结合是B7-H3特异性的。
在荷瘤小鼠中的生物分布：在携带人癌症异种移植物的裸小鼠中的生物分布表明，注射后2 h，与B7-H3阴性Ramos异种移植物相比，B7-H3阳性SKOV-3异种移植物中经68Ga标记的Z变体的肿瘤摄取显著（p < 0.05）更高（图28），这证明体内肿瘤积累是B7-H3特异性的。
注射后2 h在携带SKOV-3异种移植物的小鼠中的生物分布结果呈现在图29A和表28中。所有三种新变体68Ga-ZBH003（8.96 ± 1.16%ID/g）、68Ga-ZBH001（6.61 ± 0.41%ID/g）和68Ga-ZBH002（7.25 ± 1.56%ID/g）的肿瘤摄取均显著（p < 0.05）高于参考变体68Ga-ZAC12的肿瘤摄取（3.24 ± 0.77%ID/g）。与新变体相比，参考变体68Ga-ZAC12显示出显著（p< 0.05）更低的肝脏摄取。肿瘤与器官比值呈现在图29B和表29中。
表28：在携带SKOV-3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中注射经68Ga标记的B7-H3靶向Z变体后2 h的比较性生物分布。数据表示为%ID/g；来自4只小鼠的平均值±SD
具有内容物的胃肠道（GI）和屠体的数据以每份整体样品的注射剂量%表示。
表29：在携带SKOV-3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中注射经68Ga标记的B7-H3靶向Z变体后2 h的肿瘤与器官比值。数据表示为%ID/g；来自4只小鼠的平均值±SD
体内成像：在注射后2 h，携带B7-H3阳性SKOV-3异种移植物的BALB/C nu/nu小鼠中经68Ga标记的Z变体的nanoPET/CT成像结果（图30）证实了离体生物分布数据，即所有三种新变体均显示出比参考变体ZAC12更高的肿瘤摄取。观察到与其他变体相比，68Ga ZBH003在肿瘤中的活性积累明显更高。此外，B7-H3阳性SKOV-3异种移植物（图31A）中68Ga ZBH003的活性摄取显著高于B7-H3阴性Ramos异种移植物（图31B），这证实了B7-H3介导的体内结合。
实施方案的项目化列表
1.一种B7-H3结合多肽，其包含B7-H3结合基序BM，该基序由选自以下的氨基酸序列组成：
i) EKX3X4ALX7EIX10X11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LNX29 X30（SEQ ID NO:567）
其中，彼此独立地，
X3选自I和V；
X4选自A、D、E、G、H、K、L、M、N、Q、S、T和Y；
X7选自A、G、H和S；
X10选自I和V；
X11选自N和W；
X16选自N和T；
X17选自H和Y；
X18选自A、D、E、G、H、N、Q、S和T；
X20选自I和V；
X21选自K和R；
X25选自A、E、F、H、L和W；
X26选自K和S；
X29选自A、D和E；
X30选自A、D和H；以及
ii) 与i) 中定义的序列具有至少93%同一性的氨基酸序列。
2.根据项目1所述的B7-H3结合多肽，其中在序列i) 中，
X3选自I和V；
X4选自D、E、G、H、K、L、M、N、Q、S、T和Y；
X7选自A、G、H和S；
X10选自I和V；
X11选自N和W；
X16选自N和T；
X17选自H和Y；
X18选自A、D、E、G、H、N、Q、S和T；
X20选自I和V；
X21选自K和R；
X25选自A、E、F、H、L和W；
X26选自K和S；
X29选自A、D和E；并且
X30选自A、D和H。
3.根据任一前述项目所述的B7-H3结合多肽，其中在序列i) 中，
X3选自I和V；
X4选自D、G、K、L、M、N、S、T和Y；
X7选自A、G、H和S；
X10是I；
X11选自N和W；
X16是T；
X17是Y；
X18选自A、D、E、H、N、Q、S和T；
X20选自I和V；
X21选自K和R；
X25选自A、E、H和W；
X26是K；
X29选自A、D和E；并且
X30选自A、D和H。
4.根据任一前述项目所述的B7-H3结合多肽，其中在序列i) 中，
X3是I；
X4选自K和S；
X7选自G和S；
X10是I；
X11是W；
X16是T；
X17是Y；
X18选自E、N和Q；
X20是I；
X21是K；
X25选自A和H；
X26是K；
X29选自A和D；并且
X30选自A和D。
5.根据项目1所述的B7-H3结合多肽，其中序列i) 对应于选自由SEQ ID NO:1-535组成的组的序列中位置8至位置37的序列。
6.根据项目5所述的B7-H3结合多肽，其中序列i) 对应于选自由SEQ ID NO:1-21和480-535组成的组的序列中位置8至位置37的序列。
7.根据项目6所述的B7-H3结合多肽，其中序列i) 对应于选自由SEQ ID NO:1-21组成的组的序列中位置8至位置37的序列。
8.根据项目7所述的B7-H3结合多肽，其中序列i) 对应于选自由SEQ ID NO:1-3组成的组的序列中位置8至位置37的序列。
9.根据项目8所述的B7-H3结合多肽，其中序列i) 对应于SEQ ID NO:1中位置8至位置37的序列。
10.根据项目8所述的B7-H3结合多肽，其中序列i) 对应于SEQ ID NO:2中位置8至位置37的序列。
11.根据项目8所述的B7-H3结合多肽，其中序列i) 对应于SEQ ID NO:3中位置8至位置37的序列。
12.根据任一前述项目所述的B7-H3结合多肽，其中所述结合基序形成三螺旋束蛋白结构域的一部分。
13.根据项目12所述的B7-H3结合多肽，其中所述结合基序在所述三螺旋束蛋白结构域内基本上构成具有互连环的两个α螺旋。
14.根据项目12或13所述的B7-H3结合多肽，其中所述三螺旋束蛋白结构域选自细菌受体结构域。
15.根据项目12-14中任一项所述的B7-H3结合多肽，其中所述三螺旋束蛋白结构域选自来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的结构域或其衍生物。
16.根据任一前述项目所述的B7-H3结合多肽，其包含结合模块（BMod），该结合模块的氨基酸序列选自：
iii)K-[BM]-PSQSXaXbLLXcEAKKLXdXeXfQ（SEQ ID NO:568）；
其中[BM]是如项目1-11中任一项所定义的B7-H3结合基序；
Xa选自A和S；
Xb选自E和N；
Xc选自A、S和C；
Xd选自E、N和S；
Xe选自D、E和S；并且
Xf选自A和S；以及
iv)与iii) 中定义的序列具有至少93%同一性的氨基酸序列。
17.根据项目16所述的B7-H3结合多肽，其中序列iii) 对应于选自由SEQ ID NO:1-535组成的组的序列中位置7至位置55的氨基酸序列。
18.根据项目17所述的B7-H3结合多肽，其中序列iii) 对应于选自由SEQ ID NO:1-21和480-535组成的组的序列中位置7至位置55的氨基酸序列。
19.根据项目18所述的B7-H3结合多肽，其中序列iii) 对应于选自由SEQ ID NO:1-21组成的组的序列中位置7至位置55的氨基酸序列。
20.根据项目19所述的B7-H3结合多肽，其中序列iii) 对应于选自由SEQ ID NO:1-3组成的组的序列中位置7至位置55的氨基酸序列。
21.根据项目20所述的B7-H3结合多肽，其中序列iii) 对应于序列SEQ ID NO:1中位置7至位置55的氨基酸序列。
22.根据项目20所述的B7-H3结合多肽，其中序列iii) 对应于序列SEQ ID NO:2中位置7至位置55的氨基酸序列。
23.根据项目20所述的B7-H3结合多肽，其中序列iii) 对应于序列SEQ ID NO:3中位置7至位置55的氨基酸序列。
24.根据任一前述项目所述的B7-H3结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
v)YA-[BMod]-AP（SEQ ID NO:569）；
其中[BMod]是根据项目16-23中任一项所定义的；以及
vi)与由v) 定义的序列具有至少86%同一性的氨基酸序列。
25.根据任一前述项目所述的B7-H3结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
vii)VDAKYAK-[BM]-PSQSSELLSEAKKLNDSQAPK（SEQ ID NO:570）；
其中[BM]是如项目1-11中任一项所定义的；以及
viii)与由vii) 定义的序列具有至少86%同一性的氨基酸序列。
26.根据项目1-23中任一项所述的B7-H3结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
ix)AEAKFAK-[BM]-PSQSSELLSEAKKLSESQAPK（SEQ ID NO:571）；其中[BM]是如项目1-11中任一项所定义的；以及
x)与由ix) 定义的序列具有至少86%同一性的氨基酸序列。
27.根据项目26所述的B7-H3结合多肽，其中序列ix) 选自由SEQ ID NO:15-16、420-424、427-428、430-436、438-444和480-535组成的组。
28.根据项目1-23中任一项所述的B7-H3结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
xi)AEAKYAK-[BM]-PSQSSELLSEAKKLNDSQAPK（SEQ ID NO:572）；其中[BM]是如项目1-11中任一项所定义的；以及
xii)与由xi) 定义的序列具有至少86%同一性的氨基酸序列。
29.根据项目28所述的B7-H3结合多肽，其中序列xi) 选自由以下组成的组：SEQID NO:1-13、17-418和446-479。
30.根据项目29所述的B7-H3结合多肽，其中序列xi) 选自由SEQ ID NO:1-13和17-21组成的组。
31.根据项目30所述的B7-H3结合多肽，其中序列xi) 选自由SEQ ID NO:1-3组成的组。
32.根据项目31所述的B7-H3结合多肽，其中序列xi) 是SEQ ID NO:1。
33.根据项目31所述的B7-H3结合多肽，其中序列xi) 是SEQ ID NO:2。
34.根据项目31所述的B7-H3结合多肽，其中序列xi) 是SEQ ID NO:3。
35.根据项目1-23中任一项所述的B7-H3结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
xiii)AEAKFAK-[BM]-PSQSSELLSEAKKLNESQAPK（SEQ ID NO:574）；其中[BM]是如项目1-11中任一项所定义的；以及
xiv)与由xiii) 定义的序列具有至少86%同一性的氨基酸序列。
36.根据项目35所述的B7-H3结合多肽，其中序列xiii) 是SEQ ID NO:14、425-426、429、437和445。
37.根据任一前述项目所述的B7-H3结合多肽，其能够与B7-H3结合，使得与B7-H3相互作用的KD值为至多1 × 10-6 M，例如至多5 × 10-7 M、例如至多1 × 10-7 M、例如至多5 × 10-8 M、例如至多1 × 10-8 M。
38.根据任一前述项目所述的B7-H3结合多肽，其在C-末端和/或N-末端处包含另外的氨基酸。
39.根据项目38所述的B7-H3结合多肽，其中所述另外的氨基酸改善该多肽的产生、纯化、体外或体内稳定化、偶联或检测。
40.根据任一前述项目所述的呈多聚体形式的B7-H3结合多肽，其包含至少两个B7-H3结合多肽单体单元，这些单体单元的氨基酸能够相同或不同。
41.根据项目40所述的B7-H3结合多肽，其中所述B7-H3结合多肽单体单元共价偶联在一起。
42.根据项目40所述的B7-H3结合多肽，其中所述B7-H3结合多肽单体单元被表达为融合蛋白。
43.根据项目40-42中任一项所述的B7-H3结合多肽，其呈二聚体形式。
44.一种融合蛋白或缀合物，其包含：
-由根据任一前述项目所述的B7-H3结合多肽组成的第一部分；以及
-由具有期望的生物活性的多肽组成的第二部分。
45.根据项目44所述的融合蛋白或缀合物，其中所述期望的生物活性是治疗活性。
46.根据项目44所述的融合蛋白或缀合物，其中所述期望的生物活性是结合活性。
47.根据项目44所述的融合蛋白或缀合物，其中所述期望的生物活性是酶促活性。
48.根据项目46所述的融合蛋白或缀合物，其中所述结合活性是白蛋白结合活性，其增加该融合蛋白或缀合物的体内半衰期和/或改变该融合蛋白或缀合物的生物分布特性。
49.根据项目48所述的融合蛋白或缀合物，其中所述第二部分包含链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域或其衍生物。
50.根据项目49所述的融合蛋白或缀合物，其中所述白蛋白结构域包含选自由SEQID NO:547、548和631组成的组的氨基酸序列。
51.根据项目50所述的融合蛋白或缀合物，其包含选自由SEQ ID NO:550-566和SEQ ID NO:632-634组成的组的氨基酸序列。
52.根据项目51所述的融合蛋白或缀合物，其包含选自由SEQ ID NO:550-557组成的组的氨基酸序列。
53.根据项目51所述的融合蛋白或缀合物，其包含选自由SEQ ID NO:558-560组成的组的氨基酸序列。
54.根据项目51所述的融合蛋白或缀合物，其包含选自由SEQ ID NO:561-563组成的组的氨基酸序列。
55.根据项目51所述的融合蛋白或缀合物，其包含选自由SEQ ID NO:564-566组成的组的氨基酸序列。
56.根据项目51所述的融合蛋白或缀合物，其包含选自由SEQ ID NO:632-634组成的组的氨基酸序列。
57.根据项目51所述的融合蛋白或缀合物，其包含选自由SEQ ID NO:557、560、563和566组成的组的氨基酸序列。
58.根据项目51所述的融合蛋白或缀合物，其包含选自由SEQ ID NO:555、558、561和564组成的组的氨基酸序列。
59.根据项目51所述的融合蛋白或缀合物，其包含选自由SEQ ID NO:556、559、562和565组成的组的氨基酸序列。
60.根据项目51所述的融合蛋白或缀合物，其包含选自由SEQ ID NO:632、633和634组成的组的氨基酸序列。
61.根据项目46所述的融合蛋白或缀合物，其中所述结合活性起作用以阻断生物活性。
62.根据项目45所述的融合蛋白或缀合物，其中该第二部分是治疗活性多肽。
63.根据项目62所述的融合蛋白或缀合物，其中该第二部分是抗癌剂。
64.根据项目44-47和61-63中任一项所述的融合蛋白或缀合物，其中该第二部分选自由以下组成的组：人内源性酶、激素、生长因子、趋化因子、细胞因子和淋巴因子。
65.根据项目44-47中任一项所述的融合蛋白或缀合物，其中该第二部分选自由以下组成的组：抗体及其抗原结合片段。
66.根据项目65所述的融合蛋白或缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：全长抗体、Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段、单链Fab（scFab）片段、Fc片段、Fv片段、单链Fv（scFv）片段、(scFv)2、scFv-Fc构建体和结构域抗体。
67.根据项目66所述的融合蛋白或缀合物，其中所述至少一种抗体或其抗原结合片段选自由以下组成的组：全长抗体、Fab片段和scFv片段。
68.根据项目67所述的融合蛋白或缀合物，其中所述至少一种抗体或其抗原结合片段是全长抗体。
69.根据项目65-68中任一项所述的融合蛋白或缀合物，其中所述抗体或其抗原结合片段对抗原，例如与癌症相关的抗原，具有亲和力。
70.根据任一前述项目所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其进一步包含至少一个接头，比如至少一个选自柔性氨基酸接头、刚性氨基酸接头和可切割氨基酸接头的接头。
71.根据任一前述项目所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其进一步包含标记。
72.根据项目71所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中所述标记选自由以下组成的组：荧光染料和金属、发色染料、化学发光化合物和生物发光蛋白、酶、放射性核素、放射性粒子和预靶向识别标签。
73.根据任一前述项目所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其包含由聚氨基聚羧酸螯合剂提供的螯合环境，该螯合剂经由半胱氨酸残基的硫醇基团或赖氨酸残基的胺基团与该B7-H3结合多肽缀合。
74.根据项目71所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中该聚氨基聚羧酸螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸、二乙烯三胺五乙酸或其衍生物。
75.根据项目1-72中任一项所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其包含由基于肽的螯合剂提供的螯合环境，其中代表该基于肽的螯合剂的肽序列位于所述B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物的C-末端。
76.根据项目75所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中代表该基于肽的螯合剂的所述C-末端肽序列选自由以下组成的组：-GGGC（SEQ ID NO:620）、-GSEC（SEQ IDNO:621）、-GGSC（SEQ ID NO:622）、-GGEC（SEQ ID NO:623）、-GGKC（SEQ ID NO:624）和-KVDC（SEQ ID NO:625）。
77.根据项目76所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中代表该基于肽的螯合剂的所述C-末端肽序列是-GGGC（SEQ ID NO:620）。
78.根据项目72所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其包含能够与补体缔合以形成互补的预靶向部分对的预靶向识别标签，所述对例如选自链霉亲和素（亲和素）/生物素、寡核苷酸/互补寡核苷酸比如DNA/互补DNA、RNA/互补RNA、硫代磷酸酯核酸/互补硫代磷酸酯核酸和肽核酸/互补肽核酸以及吗啉核酸/互补吗啉核酸。
79.根据项目78所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中所述预靶向识别标签是肽核酸标签。
80.根据项目79所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中所述预靶向识别标签是10-20聚体肽核酸序列，比如15聚体肽核酸序列。
81.一种经放射性标记的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其由根据项目73-77中任一项所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物的放射性螯合物和放射性核素组成。
82.根据项目81所述的经放射性标记的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中所述放射性核素适用于医学成像。
83.根据项目82所述的经放射性标记的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中所述放射性核素选自由以下组成的组：72As、76Br、55Co、61Cu、64Cu、18F、[18F]AIF、19F、66Ga、67Ga、68Ga、110mIn、111In、123I、124I、131I、177Lu、51Mn、52mMn、52Mn、186Re、188Re、44Sc、149Tb、152Tb、155Tb、161Tb、99mTc、45Ti、86Y和89Zr。
84.根据项目81所述的经放射性标记的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中所述放射性核素适用于疗法。
85.根据项目84所述的经放射性标记的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其中所述放射性核素选自由以下组成的组：225Ac、212Bi、213Bi、67Cu、166Ho、177Lu、212Pb、149Pm、186Re、188Re、153Sm、149Tb、161Tb、227Th和90Y。
86.一种多核苷酸，其编码根据任一前述项目所述的B7-H3结合多肽或融合蛋白。
87.一种表达载体，其包含根据项目86所述的多核苷酸。
88.一种宿主细胞，其包含根据项目87所述的表达载体。
89.一种产生根据项目1-80中任一项所述的B7-H3结合多肽或融合蛋白的方法，该方法包括
-在允许所述多肽从所述表达载体表达的条件下，培养根据项目88所述的宿主细胞，以及
-分离所述多肽。
90.一种通过使用具有受保护的反应性侧链的氨基酸和/或氨基酸衍生物进行的非生物肽合成产生根据项目1-85中任一项所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物的方法，该非生物肽合成包括
-逐步偶联这些氨基酸和/或这些氨基酸衍生物以形成如本文所描述的具有受保护的反应性侧链的多肽或融合蛋白，
-从该多肽或融合蛋白的这些反应性侧链上去除保护基团，以及
-在水溶液中折叠该多肽、融合蛋白或缀合物。
91.一种组合物，其包含根据项目1-85中任一项所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，以及至少一种药学上可接受的赋形剂或载剂。
92.根据项目91所述的组合物，其进一步包含至少一种另外的活性剂，比如至少两种另外的活性成分，比如至少三种另外的活性成分。
93.根据项目92所述的组合物，其中所述至少一种另外的活性剂是抗癌剂。
94.根据项目1-85中任一项所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据项目91-93中任一项所述的组合物，其作为药物、诊断剂、治疗诊断剂和/或预后剂使用。
95.根据项目94所述使用的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其作为药物。
96.根据项目95所述使用的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其中所述多肽、融合蛋白、缀合物或组合物在体内调节B7-H3功能。
97.根据项目94所述使用的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其作为体内诊断剂和/或作为体内预后剂。
98.根据项目97所述使用的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其作为体内诊断剂。
99.根据项目97所述使用的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其作为体内预后剂。
100.根据项目94-99中任一项所述使用的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其用于B7-H3相关病症或疾病的治疗、预后或诊断。
101.根据项目100所述使用的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其中所述B7-H3相关病症或疾病是癌症。
102.根据项目101所述使用的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组：
乳腺癌；宫颈癌；结直肠癌；子宫内膜癌；食道癌；胃癌；肝癌，包括肝细胞癌；肺癌，包括非小细胞肺癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；肾细胞癌；肉瘤，包括骨肉瘤；尿路上皮细胞癌；神经母细胞瘤；胶质瘤，包括胶质母细胞瘤和弥漫性内生型脑桥胶质瘤；黑色素瘤；白血病；和间皮瘤。
103.根据项目102所述使用的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其中所述癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、胰腺癌和肉瘤。
104.根据项目94-103中任一项所述使用的B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物，其中施用选自由以下组成的组：
口服、局部、静脉内、腹膜内、皮下、肺、透皮、肌内、鼻内、颊、舌下或栓剂施用，比如皮下施用，比如静脉内施用。
105.一种体外诊断的方法，其包括以下步骤：
-提供疑似含有B7-H3的样品；
-使所述样品与根据项目1-83中任一项所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据项目91-93中任一项所述的组合物接触；
-检测该B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物的结合，以指示该样品中B7-H3的存在；以及
-使用所获得的信息来建立诊断。
106.一种体外预后的方法，其包括以下步骤：
-提供疑似含有B7-H3的样品；
-使所述样品与根据项目1-83中任一项所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据项目91-93中任一项所述的组合物接触；
-检测该B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物的结合，以指示该样品中B7-H3的存在；以及
-使用所获得的信息来建立预后。
107.根据项目105-106中任一项所述的体外诊断或体外预后方法，其进一步包括以下步骤：
-重复检测步骤，其中所述检测在相同提供的样品或不同提供的样品中以间隔在若干时间点进行，作为在治疗之前、期间或之后对该受试者的监测的一部分。
108.根据项目106-107中任一项所述的体外诊断或体外预后方法，其进一步包括获得与已结合在所述样品中或与所述样品结合的该B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物的量相对应的值的步骤。
109.根据项目108所述的体外诊断或体外预后方法，其进一步包括将所述值与参考进行比较的步骤。
110.根据项目105-109中任一项所述的体外诊断或体外预后方法，其中所述诊断或预后涉及B7-H3相关病症或疾病。
111.根据项目110所述的体外诊断或体外预后方法，其中所述B7-H3相关病症或疾病是癌症。
112.根据项目111所述的体外诊断或体外预后方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：
乳腺癌；宫颈癌；结直肠癌；子宫内膜癌；食道癌；胃癌；肝癌，包括肝细胞癌；肺癌，包括非小细胞肺癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；肾细胞癌；肉瘤，包括骨肉瘤；尿路上皮细胞癌；神经母细胞瘤；胶质瘤，包括胶质母细胞瘤和弥漫性内生型脑桥胶质瘤；黑色素瘤；白血病；和间皮瘤。
113.根据项目112所述的体外诊断或体外预后方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、胰腺癌和肉瘤。
114.一种检测样品中B7-H3的存在的方法，该方法包括提供疑似含有B7-H3的样品，使所述样品与根据项目1-85中任一项所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据项目91-93中任一项所述的组合物接触，并检测该B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物的结合，以指示该样品中B7-H3的存在。
115.一种用于确定受试者中B7-H3的存在的方法，该方法包括以下步骤：
a)使该受试者或从该受试者分离的样品与根据项目1-85中任一项所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据项目91-93中任一项所述的组合物接触；以及
b)获得与已结合在所述受试者体内或与所述样品结合的该B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物的量相对应的值。
116.根据项目115所述的方法，其中所述B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物是根据项目78-80中任一项所述的，或者所述组合物包含这样的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，并且步骤a) 进一步包括使该受试者与用可检测标记比如放射性核素标记来标记的互补预靶向部分接触。
117.根据项目114-116中任一项所述的方法，其进一步包括将所述值与参考进行比较的步骤。
118.一种治疗B7-H3相关病症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的根据项目1-85中任一项所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据项目91-93中任一项所述的组合物。
119.根据项目118所述的方法，其中所述B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物在体内调节B7-H3功能。
120.根据项目115-119中任一项所述的方法，其中所述方法涉及B7-H3相关病症或疾病。
121.根据项目120所述的方法，其中所述B7-H3相关病症或疾病是癌症。
122.根据项目121所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：
乳腺癌；宫颈癌；结直肠癌；子宫内膜癌；食道癌；胃癌；肝癌，包括肝细胞癌；肺癌，包括非小细胞肺癌；卵巢癌；胰腺癌；前列腺癌；肾细胞癌；肉瘤，包括骨肉瘤；尿路上皮细胞癌；神经母细胞瘤；胶质瘤，包括胶质母细胞瘤和弥漫性内生型脑桥胶质瘤；黑色素瘤；白血病；和间皮瘤。
123.根据项目122所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、胰腺癌和肉瘤。
124.根据项目123所述的方法，其进一步包括以下步骤：
-使该受试者与根据项目78-80中任一项所述的包含预靶向识别标签的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物接触，或与包含这样的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物的组合物接触，以及
-使该受试者与包含放射性核素的互补预靶向部分接触。
125.根据项目115-124中任一项所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物受试者，比如人受试者。
126.根据项目115-125中任一项所述的方法，其中该方法在体内进行。
127.根据项目115所述的方法，其是一种用于医学成像的方法，在该方法中：
-步骤a) 包括向受试者全身施用所述B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物；
-所述B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物包含适于医学成像的放射性核素标记；并且
-步骤b) 包括使用医学成像仪器获得该受试者的身体的至少一部分的一个或多个图像，所述一个或多个图像指示体内该放射性核素的存在。
128.根据项目116所述的方法，其是一种用于医学成像的方法，在该方法中：
步骤a) 包括向受试者全身施用所述B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物或组合物；
-所述B7-H3结合多肽、融合蛋白、缀合物、组合物或预靶向部分包含适于医学成像的放射性核素标记；并且
-步骤b) 包括使用医学成像仪器获得该受试者的身体的至少一部分的一个或多个图像，所述一个或多个图像指示体内该放射性核素的存在。

Claims (16)

1.一种B7-H3结合多肽，其包含B7-H3结合基序BM，该基序由选自以下的氨基酸序列组成：
i) EKX3X4ALX7EIX10X11LPNLX16X17X18QX20X21AFIX25X26LNX29 X30（SEQ ID NO:567）
其中，彼此独立地，
X3选自I和V；
X4选自A、D、E、G、H、K、L、M、N、Q、S、T和Y；
X7选自A、G、H和S；
X10选自I和V；
X11选自N和W；
X16选自N和T；
X17选自H和Y；
X18选自A、D、E、G、H、N、Q、S和T；
X20选自I和V；
X21选自K和R；
X25选自A、E、F、H、L和W；
X26选自K和S；
X29选自A、D和E；
X30选自A、D和H；以及
ii) 与i) 中定义的序列具有至少93%同一性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的B7-H3结合多肽，其中序列i) 对应于选自由SEQ ID NO:1-535组成的组的序列中位置8至位置37的序列。
3.根据任一前述权利要求所述的B7-H3结合多肽，其中所述结合基序形成三螺旋束蛋白结构域的一部分，该三螺旋束蛋白结构域例如选自细菌受体结构域，例如选自来自金黄色葡萄球菌的蛋白A的结构域或其衍生物。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的B7-H3结合多肽，其包含选自以下的氨基酸序列：
xi)AEAKYAK-[BM]-PSQSSELLSEAKKLNDSQAPK（SEQ ID NO:572）；其中[BM]是如权利要求1-2中任一项所定义的；以及
xii)与由xi) 定义的序列具有至少86%同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的B7-H3结合多肽，其中序列xi) 选自由SEQ ID NO:1-13、17-418和446-479组成的组。
6.根据任一前述权利要求所述的B7-H3结合多肽，其能够与B7-H3结合，使得与B7-H3相互作用的KD值为至多1 × 10-6 M，例如至多5 × 10-7 M、例如至多1 × 10-7 M、例如至多5× 10-8 M、例如至多1 × 10-8 M。
7.一种融合蛋白或缀合物，其包含：
-由根据任一前述权利要求所述的B7-H3结合多肽组成的第一部分；以及
-由具有期望的生物活性的多肽组成的第二部分。
8.根据权利要求7所述的融合蛋白或缀合物，其中所述期望的生物活性是结合活性，例如白蛋白结合活性，其增加该融合蛋白或缀合物的体内半衰期和/或改变该融合蛋白或缀合物的生物分布特性。
9.根据权利要求8所述的融合蛋白或缀合物，其中所述第二部分包含链球菌蛋白G的白蛋白结合结构域或其衍生物，例如包含选自由SEQ ID NO:547、548和631组成的组的氨基酸序列。
10.根据权利要求9所述的融合蛋白或缀合物，其包含选自由SEQ ID NO:550-566和632-634组成的组的氨基酸序列。
11.根据任一前述权利要求所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其进一步包含标记，该标记例如选自由以下组成的组：荧光染料和金属、发色染料、化学发光化合物和生物发光蛋白、酶、放射性核素、放射性粒子和预靶向识别标签。
12.根据任一前述权利要求所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其包含螯合环境，该螯合环境由
-聚氨基聚羧酸螯合剂提供，该螯合剂经由半胱氨酸残基的硫醇基团或赖氨酸残基的胺基团与该B7-H3结合多肽缀合，或由
-基于肽的螯合剂提供，其中代表该基于肽的螯合剂的肽序列位于所述B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物的C-末端。
13.一种经放射性标记的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，其由根据权利要求12所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物的放射性螯合物和放射性核素组成。
14.一种多核苷酸，其编码根据任一前述权利要求所述的B7-H3结合多肽或融合蛋白。
15.一种组合物，其包含根据权利要求1-13中任一项所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物，以及至少一种药学上可接受的赋形剂或载剂。
16.根据权利要求1-13中任一项所述的B7-H3结合多肽、融合蛋白或缀合物或根据权利要求15所述的组合物，其作为药物、体内诊断剂、体内治疗诊断剂和/或体内预后剂使用。
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