CN121038806A - 用于转录调控的新颖受体 - Google Patents

Abstract

本文提供了具有新颖跨膜结构域和新颖近膜结构域的嵌合启动受体。还提供了具有新颖跨膜结构域和新颖近膜结构域的嵌合启动受体系统、表达这些受体和系统的细胞，及其使用方法。

Description

用于转录调控的新颖受体

相关申请的交叉引用

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序列表

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背景技术

癌症是一种以细胞不受控制的生长为特征的疾病。已经尝试了许多治疗癌症的方法，包括药物和放射疗法。近期的癌症治疗方法是利用人体自身的免疫细胞来攻击癌细胞。一种有前景的方法是利用从患者获取的T细胞，通过基因工程化来产生嵌合抗原受体或CAR，这种受体蛋白赋予T细胞靶向特定蛋白质的新能力。这些受体是嵌合的，因为它们将抗原结合功能和T细胞活化功能组合到单一受体中。

使用CAR-T细胞的免疫疗法很有前景，因为改良的T细胞具有识别癌细胞的潜力，从而更有效地靶向并破坏它们。

在利用CAR对T细胞进行工程化后，将所得CAR-T细胞引入患者体内以攻击肿瘤细胞。CAR-T细胞可以源自患者自身血液中的T细胞(自体细胞)或来自另一健康供体的T细胞(同种异体细胞)。一旦将CAR-T细胞输注至患者体内，这些细胞就会与它们在细胞上的靶抗原接触。CAR-T细胞与抗原结合并被激活。在抗原接合后，CAR T细胞可以呈指数增殖，起始抗肿瘤细胞因子的产生并靶向杀伤肿瘤细胞。

然而，基于CAR T细胞的免疫疗法仍然存在一些问题和局限性。一些CAR T细胞可与低水平表达靶抗原的正常细胞接合，导致脱靶毒性。T细胞中的合成AND门电路可以通过结合第一抗原并诱导表达对第二抗原起反应的第二受体来操作。根据第二受体的结合亲和力、基础活性或表达水平，可能需要第二蛋白质具有更高或更低水平的“诱导性”才能发挥最佳功能。必须严格控制这一诱导作用，以防止在没有“启动(priming)”抗原的情况下表达第二蛋白质。即使较低量的基础诱导也能导致毒性风险增加。因此，需要另外的启动受体来降低脱靶毒性。

发明内容

在一方面，本文提供了启动受体，所述启动受体在N末端至C末端方向上包含：任选地，对抗原具有结合亲和力的细胞外抗原结合结构域；STS、SNORC、SEM4F、MCP、PLAT2、MMEL1、PLXC1、CSTN2、SIGL9、IRAG1、TIGIT、TNR21、ZP3、SUSD4、DCBD1、HMR1、DISP1、IRPL1、ECSCR或PLXC1跨膜结构域(TMD)，所述TMD包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及包含人或人源化转录效应物的细胞内结构域，其中所述抗原与所述细胞外抗原结合结构域的结合导致在所述一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处裂解。

在一方面，本文提供了启动受体，所述启动受体在N末端至C末端方向上包含：对胎盘/生殖细胞型碱性磷酸酶(ALPG/P)具有结合亲和力的细胞外抗原结合结构域；STS、SNORC、SEM4F、MCP、PLAT2、MMEL1、PLXC1、CSTN2、SIGL9、IRAG1、TIGIT、TNR21、ZP3、SUSD4、DCBD1、IRAG1、HMR1、DISP1、IRPL1、ECSCR或PLXC1跨膜结构域(TMD)，所述TMD包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及包含人或人源化转录效应物的细胞内结构域，其中所述抗原与所述细胞外抗原结合结构域的结合导致在所述一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处裂解。

在一方面，本文提供了启动受体，所述启动受体在N末端至C末端方向上包含：对CD19具有结合亲和力的细胞外抗原结合结构域；间皮素(MSLN)；胎盘/生殖细胞型碱性磷酸酶(ALPG/P)；表皮生长因子受体(EGFR)；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1 (又称为CD2亚群1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子1 (CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III (EGFRvIII)；神经节苷脂G2 (GD2)；神经节苷脂GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟抗原(BCMA)；Tn抗原((TnAg)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；类受体酪氨酸激酶孤儿受体1(ROR1)；类Fms酪氨酸激酶3 (FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72 (TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3 (CD276)；KIT (CD117)；白细胞介素-13受体亚基α-2 (IL-13Ra2或CD213A2)；白细胞介素11受体α (IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21 (睾丸素(Testisin)或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板源性生长因子受体β (PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4 (SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2 (Her2/neu)；细胞表面相关粘蛋白1 (MUC1)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶(Prostase)；前列腺癌肿瘤抗原1 (PCT A-l或半乳凝素8)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变型延伸因子2 (ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞激活蛋白α (FAP)；类胰岛素生长因子1受体(IGF-I受体)；碳酸酐酶IX (CAIX)；蛋白酶体(Prosome、Macropain) β型亚基9 (LMP2)；糖蛋白100 (gp100)；由断裂点簇区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1 (Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2 (EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酰化路易斯粘附分子(sialyl Lewis adhesion molecule，sLe)；神经节苷脂GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；谷氨酰胺转胺酶5 (TGS5)；高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标记物1 (TEM1/CD248)；肿瘤内皮标记物相关蛋白7 (TEM7R)；密封蛋白6 (CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5族成员D (GPRC5D)；X染色体开放阅读框61 (CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；多聚唾液酸；胎盘特异性蛋白1 (PLAC1)；Globo H糖鞘脂的六糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿路上皮分化蛋白(Uroplakin) 2 (UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1 (HAVCR1)；肾上腺素受体β3 (ADRB3)；泛连接蛋白(pannexin) 3 (PANX3)；G蛋白偶联受体20 (GPR20)；淋巴细胞抗原6复合体基因座K9 (LY6K)；嗅觉受体51E2 (OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；威尔姆氏肿瘤蛋白(Wilms tumor protein)(WT1)；癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2 (LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1 (MAGE-A1)；位于染色体12p上的ETS易位变体基因6 (ETV6-AML)；精子蛋白17 (SPA17)；X抗原家族成员1A (XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2 (Tie 2)；黑色素瘤癌症睾丸抗原-1 (MAD-CT-1)；黑色素瘤癌症睾丸抗原-2 (MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53 (p53)；p53突变体；prostein；存活素(surviving)；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1 (PCTA-1或半乳糖凝集素8)，即由T细胞识别之黑色素瘤抗原1 (MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断裂点；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG (跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2) ETS融合基因)；N-乙酰基葡糖氨基转移酶V (NA17)；配对盒蛋白Pax-3 (PAX3)；雄激素受体；细胞周期素B1；v-myc禽类成髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤源性同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C (RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2 (TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；类CCCTC结合因子(锌指蛋白) (BORIS或印记位点调节因子的兄弟蛋白(Brotherof the Regulator of Imprinted Sites))，由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3 (SART3)；配对盒蛋白Pax-5 (PAX5)；前顶体素结合蛋白sp32 (OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4 (AKAP-4)；滑膜肉瘤X断裂点2 (SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾泛在蛋白1 (RU1)；肾泛在蛋白2 (RU2)；天冬酰胺内肽酶(legumain)；人乳头瘤病毒E6 (HPV E6)；人乳头瘤病毒E7 (HPV E7)；肠道羧酸酯酶；突变型热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1 (LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2 (LILRA2)；CD300分子样家族成员f (CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A (CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模体的粘蛋白样激素样受体2 (EMR2)；淋巴细胞抗原75 (LY75)；糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白聚糖(Glypican)-3 (GPC3)；Fc受体样蛋白5 (FCRL5)；或免疫球蛋白λ样多肽1 (IGLL1)；STS、SNORC、SEM4F、MCP、PLAT2、MMEL1、PLXC1、CSTN2、SIGL9、IRAG1、TIGIT、TNR21、ZP3、SUSD4、DCBD1、IRAG1、HMR1、DISP1、IRPL1、ECSCR或PLXC1跨膜结构域(TMD)，这些包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及包含人或人源化转录效应物的细胞内结构域，其中所述抗原与所述细胞外抗原结合结构域的结合引起在一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处裂解。

在一些实施方案中，启动受体还包含PLXA2、NPTN、ALK、DSCAM、CD2、EPHA1、ERMAP、ERBB2、CEA20、KIRR1、C163A、PTPRF、CSPG4、SLAF1、TMIG3、NOTCH1或NOTCH2近膜结构域(JMD)。

在一些实施方案中，本文提供了启动受体，所述启动受体在N末端至C末端方向上包含：任选地，对抗原具有结合亲和力的细胞外抗原结合结构域；包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点的跨膜结构域；PLXA2、NPTN、ALK、DSCAM、CD2、EPHA1、ERMAP、ERBB2、CEA20、KIRR1、C163A、PTPRF、CSPG4、SLAF1或TMIG3近膜结构域(JMD)；以及包含人或人源化转录效应物的细胞内结构域，其中所述抗原与所述细胞外抗原结合结构域的结合导致在所述一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处裂解。

在一方面，本文提供了启动受体，所述启动受体在N末端至C末端方向上包含：对胎盘/生殖细胞型碱性磷酸酶(ALPG/P)具有结合亲和力的细胞外抗原结合结构域；包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点的跨膜结构域；PLXA2、NPTN、ALK、DSCAM、CD2、EPHA1、ERMAP、ERBB2、CEA20、KIRR1、C163A、PTPRF、CSPG4、SLAF1或TMIG3近膜结构域(JMD)；以及包含人或人源化转录效应物的细胞内结构域，其中所述抗原与所述细胞外抗原结合结构域的结合导致在所述一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处裂解。

在一些实施方案中，所述启动受体还包含STS、SNORC、SEM4F、MCP、PLAT2、MMEL1、PLXC1、CLSTN1、CSTN2、SIGL9、IRAG1、TIGIT、TNR21、ZP3、SUSD4、DCBD1、IRAG1、HMR1、DISP1、IRPL1、ECSCR、PLXC1或NOTCH1跨膜结构域，所述结构域包含一个或多个抗原诱导型蛋白水解裂解位点。

在一方面，本文提供了启动受体，所述启动受体在N末端至C末端方向上包含：任选地，对抗原具有结合亲和力的细胞外抗原结合结构域；STS、SNORC、SEM4F、MCP、PLAT2、MMEL1、PLXC1、CLSTN1、CSTN2、SIGL9、IRAG1、TIGIT、TNR21、ZP3、SUSD4、DCBD1、HMR1、DISP1、IRPL1、ECSCR、PLXC1或NOTCH1近膜结构域(JMD)；以及包含人或人源化转录效应物的细胞内结构域，其中所述抗原与所述细胞外抗原结合结构域的结合导致在所述一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处裂解。

在一方面，本文提供了启动受体，所述启动受体在N末端至C末端方向上包含：对胎盘/生殖细胞型碱性磷酸酶(ALPG/P)具有结合亲和力的细胞外抗原结合结构域；STS、SNORC、SEM4F、MCP、PLAT2、MMEL1、PLXC1、CLSTN1、CSTN2、SIGL9、IRAG1、TIGIT、TNR21、ZP3、SUSD4、DCBD1、HMR1、DISP1、IRPL1、ECSCR、PLXC1或NOTCH1跨膜结构域(TMD)，所述TMD包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；PLXA2、NPTN、ALK、DSCAM、CD2、EPHA1、ERMAP、ERBB2、CEA20、KIRR1、C163A、PTPRF、CSPG4、SLAF1、TMIG3、NOTCH1或NOTCH2近膜结构域(JMD)；以及包含人或人源化转录效应物的细胞内结构域，其中所述抗原与所述细胞外抗原结合结构域的结合引起在所述配体诱导型蛋白水解裂解位点处裂解。

在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO: 1-21中的至少一者所示的序列。

在一些实施方案中，近膜结构域包含SEQ ID NO: 22-39中的至少一者所示的序列。

在一些实施方案中，跨膜结构域和近膜结构域包含以下至少一个组合：NOTCH1-PLXA2、CLSTN1-CD2、NOTCH1-NPTN、NOTCH1-ALK、SNORC-NOTCH1、SEM4F-NOTCH2、STS-NOTCH2、MCP-NOTCH1、DCBD1-NOTCH2、IRAG1-C163A、HMR1-NOTCH1、MCP-NOTCH1、DISP1-NOTCH2、IRPL1-NOTCH1、ECSCR-NOTCH1、NOTCH1-PTPRF、NOTCH1-CSPG4、SEM4F-NOTCH2、IRAG1-CD2、SIGL9-CD2、IRAG1-NOTCH1、NOTCH1-SLAF1、NOTCH1-TMIG3、NOTCH1-C163A和PLXC1-EPHA1。

在一些实施方案中，跨膜结构域和近膜结构域包含SEQ ID NO: 40-56中的至少一者所示的序列。

在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域是单克隆抗体、中和抗体、拮抗性抗体、激动剂抗体、多克隆抗体、无海藻糖基化抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、全长抗体和scFv。

在一些实施方案中，细胞外抗原结合结构域是scFv。

在一些实施方案中，ALPG/P细胞外抗原结合结构域包含：可变重(VH)链序列，所述VH链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；和可变轻(VL)链序列，所述VL链序列包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO: 88、89、90、91或92中所示的序列；CDR-H2包含SEQ ID NO: 93、94、95、96或97中所示的序列；CDR-H3包含SEQ ID NO: 98、99或100中所示的序列；CDR-L1包含SEQ ID NO: 101、102或103中所示的序列；CDR-L2包含SEQ ID NO: 104、105或“NA”中所示的序列，并且CDR-L3包含SEQ IDNO: 107或108中所示的序列。

在一些实施方案中，VH链序列包含SEQ ID NO: 110中所示的序列。

在一些实施方案中，VL包含SEQ ID NO: 109中所示的序列。

在一些实施方案中，细胞外结构域包含SEQ ID NO: 76中所示的序列。

在一些实施方案中，转录效应物结构域包含HNF1a/p65结构域或Gal4/VP64结构域。

在一些实施方案中，转录效应物结构域包含SEQ ID NO: 80、81或82中所示的序列。

在一些实施方案中，启动受体还包含位于第一细胞外抗原结合结构域与第一跨膜结构域之间的第一铰链结构域。

在一些实施方案中，所述铰链结构域包含CD8α铰链结构域或截短的CD8α铰链结构域。

在一些实施方案中，启动受体包含SEQ ID NO: 281-300中的至少一者中所示的序列。

在一些实施方案中，启动受体包含SEQ ID NO: 111-132中的至少一者中所示的序列。

在一些实施方案中，在细胞外抗原结合结构域与抗原结合后，启动受体诱导嵌合抗原受体(CAR)的表达。

在一些实施方案中，嵌合抗原受体(CAR)包含对间皮素(MSLN)具有结合亲和力的细胞外抗原结合结构域。

在一方面，本文提供了系统，所述系统包含第一嵌合多肽和第二嵌合多肽，其中所述第一嵌合多肽包含本文所公开的启动受体；并且所述第二嵌合多肽包含嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包含第二细胞外抗原结合结构域。

在一些实施方案中，CAR从N末端至C末端包含：第二细胞外抗原结合结构域；第二跨膜结构域；任选地细胞内共刺激结构域；和细胞内激活结构域。

在一些实施方案中，CAR包含对间皮素(MSLN)具有结合亲和力的细胞外抗原结合结构域。

在一些实施方案中，CAR从N末端至C末端包含：对MSLN具有结合亲和力的第二细胞外抗原结合结构域；第二跨膜结构域；细胞内共刺激结构域；和细胞内激活结构域。

在一些实施方案中，CAR包含第二铰链结构域。

在一些实施方案中，第二铰链结构域包含CD8α铰链结构域或截短的CD8α铰链结构域。

在一些实施方案中，第二跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域。

在一些实施方案中，细胞内共刺激结构域包含4-1BB结构域。

在一些实施方案中，细胞内激活结构域包含CD3ζ结构域。

在一些实施方案中，所述系统还包含自切除2A肽(P2A)。

在一些实施方案中，P2A是在嵌合抗原受体的C末端。

在一些实施方案中，P2A是在启动受体的C末端。

在一些实施方案中，第一细胞外结构域包含能够结合靶细胞的ALPG/P抗原结合结构域，并且第二细胞外结构域包含能够结合靶细胞的MSLN抗原结合结构域。

在一些实施方案中，第二细胞外结构域包含CD19；间皮素(MSLN)；胎盘/生殖细胞型碱性磷酸酶(ALPG/P)；表皮生长因子受体(EGFR)；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1 (又称为CD2亚群1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子1 (CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III (EGFRvIII)；神经节苷脂G2 (GD2)；神经节苷脂GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟抗原(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；类受体酪氨酸激酶孤儿受体1 (ROR1)；类Fms酪氨酸激酶3 (FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72 (TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3 (CD276)；KIT (CD117)；白细胞介素-13受体亚基α-2 (IL-13Ra2或CD213A2)；白细胞介素11受体α (IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21 (睾丸素或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板源性生长因子受体β (PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2 (Her2/neu)；细胞表面相关粘蛋白1 (MUC1)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变型延伸因子2 (ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞激活蛋白α (FAP)；类胰岛素生长因子1受体(IGF-I受体)；碳酸酐酶IX (CAIX)；蛋白酶体(Prosome、Macropain) β型亚基9 (LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断裂点簇区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1 (Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2 (EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酰化路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；谷氨酰胺转胺酶5 (TGS5)；高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标记物1 (TEM1/CD248)；肿瘤内皮标记物相关蛋白7(TEM7R)；密封蛋白6 (CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5族成员D(GPRC5D)；X染色体开放阅读框61 (CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；多聚唾液酸；胎盘特异性蛋白1 (PLAC1)；Globo H糖鞘脂的六糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿路上皮分化蛋白2 (UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1 (HAVCR1)；肾上腺素受体β3 (ADRB3)；泛连接蛋白3 (PANX3)；G蛋白偶联受体20 (GPR20)；淋巴细胞抗原6复合体基因座K9 (LY6K)；嗅觉受体51E2 (OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；威尔姆氏肿瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1 (NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2 (LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1 (MAGE-A1)；位于染色体12p上的ETS易位变体基因6 (ETV6-AML)；精子蛋白17 (SPA17)；X抗原家族成员1A (XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2 (Tie 2)；黑色素瘤癌症睾丸抗原-1 (MAD-CT-1)；黑色素瘤癌症睾丸抗原-2 (MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；存活素；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1 (PCTA-1或半乳糖凝集素8)，即由T细胞识别之黑色素瘤抗原1 (MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断裂点；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG (跨膜丝氨酸蛋白酶2(TMPRSS2) ETS融合基因)；N-乙酰基葡糖氨基转移酶V (NA17)；配对盒蛋白Pax-3 (PAX3)；雄激素受体；细胞周期素B1；v-myc禽类成髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤源性同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C (RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2 (TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；类CCCTC结合因子(锌指蛋白) (BORIS或印记位点调节因子的兄弟蛋白)，由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3 (SART3)；配对盒蛋白Pax-5 (PAX5)；前顶体素结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4 (AKAP-4)；滑膜肉瘤X断裂点2 (SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾泛在蛋白1 (RU1)；肾泛在蛋白2(RU2)；天冬酰胺内肽酶；人乳头瘤病毒E6 (HPV E6)；人乳头瘤病毒E7 (HPV E7)；肠道羧酸酯酶；突变型热休克蛋白70-2 (mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1 (LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2 (LILRA2)；CD300分子样家族成员f (CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2 (BST2)；含EGF样模体的粘蛋白样激素样受体2 (EMR2)；淋巴细胞抗原75 (LY75)；糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白聚糖-3 (GPC3)；Fc受体样蛋白5(FCRL5)；或能够结合靶细胞的免疫球蛋白λ样多肽1 (IGLL1)抗原结合结构域。

在一些实施方案中，靶细胞是人细胞。

在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。

在一些实施方案中，癌症是实体癌或液体癌。

在一些实施方案中，癌症是卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、子宫癌、间皮瘤、宫颈癌或胰腺癌。

在一方面，本文提供了重组核酸系统，所述系统包含至少一个编码本文所公开的启动受体的核苷酸序列。

在一方面，本文提供了重组核酸系统，所述系统包含至少一个编码本文所公开的系统的核苷酸序列。

在一些实施方案中，重组核酸系统还包含诱导型启动子，所述诱导型启动子可操作地连接至编码嵌合抗原受体的核苷酸序列。

在一些实施方案中，重组核酸系统还包含组成型启动子，所述组成型启动子可操作地连接至编码启动受体的核苷酸序列。

在一些实施方案中，重组核酸系统还包含可操作地连接至编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列的诱导型启动子和可操作地连接至编码所述启动受体的核苷酸序列的组成型启动子。

在一些实施方案中，所述核酸系统在5’至3’方向上包含：组成型启动子；编码启动受体的核苷酸序列；诱导型启动子；以及编码嵌合抗原受体的核苷酸序列。

在一些实施方案中，核酸可在5’至3’方向上包含：诱导型启动子；编码嵌合抗原受体的核苷酸序列；组成型启动子；以及编码启动受体的核苷酸序列。

在一些实施方案中，核酸系统还包含与宿主细胞染色体中的插入位点互补的5'同源定向修复臂和3'同源定向修复臂。

在一些实施方案中，重组核酸系统还包含自切除2A肽(P2A)。

在一些实施方案中，P2A是在嵌合抗原受体的3’端。

在一些实施方案中，P2A是在启动受体的3’端。

在一些实施方案中，重组核酸系统还包含土拨鼠肝炎病毒翻译后调控元件(WPRE)。

在一些实施方案中，WPRE在编码嵌合抗原受体的核苷酸序列的3’端且在编码启动受体的核苷酸序列的5’端，或者其中所述WPRE在编码启动受体的核苷酸序列的3’端且在编码嵌合抗原受体的核苷酸序列的5’端。

在一些实施方案中，核酸系统被并入表达盒和/或表达载体中。

在一些实施方案中，表达载体是非病毒载体。

在一方面，本文提供了包含本文所公开的重组核酸系统的非病毒载体。

在一些实施方案中，重组核酸系统的5'端和3'端包含与细胞，任选地原代细胞的基因组中侧接插入位点的基因组序列同源的核苷酸序列。

在一些实施方案中，插入位点位于T细胞受体α恒定区(TRAC)基因座或基因组安全港(GSH)基因座处。

在一方面，本文提供了免疫细胞，所述免疫细胞包含：本文所公开的启动受体；本文所公开的系统；本文所公开的重组核酸系统；和/或本文所公开的非病毒载体。

在一些实施方案中，所述免疫细胞是原代人免疫细胞。

在一些实施方案中，所述原代免疫细胞是自体免疫细胞。

在一些实施方案中，所述原代免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞、T细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、原代T细胞或T细胞祖细胞。

在一些实施方案中，所述原代免疫细胞是原代T细胞。

在一些实施方案中，所述原代免疫细胞是原代人T细胞。

在一些实施方案中，所述原代免疫细胞不含病毒或不包含用于引入重组核酸系统的病毒载体。

在一些实施方案中，所述细胞还包括从患者获得免疫细胞以及在体外引入所述系统、所述重组核酸系统和/或所述非病毒载体。

在一方面，本文提供了原代免疫细胞，所述原代免疫细胞包含至少一种重组核酸，所述重组核酸包含：启动受体，所述启动受体包含细胞外抗原结合结构域；STS、SNORC、SEM4F、MCP、PLAT2、MMEL1、PLXC1、CSTN2、SIGL9、IRAG1、TIGIT、TNR21、ZP3、SUSD4、DCBD1、HMR1、DISP1、IRPL1、ECSCR或PLXC1跨膜结构域，所述跨膜结构域包含一个或多个抗原诱导型蛋白水解裂解位点；近膜结构域(JDM)，和转录因子；以及插入原代免疫细胞的基因组靶区的嵌合抗原受体，并且其中所述原代免疫细胞不包含用于将重组核酸引入原代免疫细胞中的病毒载体。

在一方面，本文提供了原代免疫细胞，所述原代免疫细胞包含至少一种重组核酸，所述重组核酸包含：启动受体，所述启动受体包含细胞外抗原结合结构域、包含一个或多个抗原诱导型蛋白水解裂解位点的跨膜结构域、PLXA2、NPTN、ALK、DSCAM、CD2、EPHA1、ERMAP、ERBB2、CEA20、KIRR1、C163A、PTPRF、CSPG4、SLAF1或TMIG3近膜结构域(JDM)，和转录因子；以及插入原代免疫细胞基因组靶区中的嵌合抗原受体，并且其中所述原代免疫细胞不包含用于将重组核酸引入原代免疫细胞的病毒载体。

在一方面，本文提供了原代免疫细胞，所述原代免疫细胞包含至少一种重组核酸，所述重组核酸包含：启动受体，所述启动受体包含细胞外抗原结合结构域；STS、SNORC、SEM4F、MCP、PLAT2、MMEL1、PLXC1、CLSTN1、CSTN2、SIGL9、IRAG1、TIGIT、TNR21、ZP3、SUSD4、DCBD1、HMR1、DISP1、IRPL1、ECSCR、PLXC1或NOTCH跨膜结构域，所述跨膜结构域包含一个或多个抗原诱导型蛋白水解裂解位点；PLXA2、NPTN、ALK、DSCAM、CD2、EPHA1、ERMAP、ERBB2、CEA20、KIRR1、C163A、PTPRF、CSPG4、SLAF1、TMIG3、NOTCH1或NOTCH2近膜结构域(JDM)，和转录因子；以及插入所述原代免疫细胞的基因组靶区中的嵌合抗原受体，并且其中所述原代免疫细胞不包含用于将重组核酸引入所述原代免疫细胞的病毒载体。

在一方面，本文提供了无病毒的活原代细胞，所述原代细胞包含核糖核蛋白复合物(RNP)-重组核酸复合物，其中所述RNP包含核酸酶结构域和向导RNA，其中所述重组核酸包含：启动受体，所述启动受体包含STS、SNORC、SEM4F、MCP、PLAT2、MMEL1、PLXC1、CLSTN1、CSTN2、SIGL9、IRAG1、TIGIT、TNR21、ZP3、SUSD4、DCBD1、HMR1、DISP1、IRPL1、ECSCR、PLXC1或NOTCH1跨膜结构域，所述跨膜结构域包含一个或多个抗原诱导型蛋白水解裂解位点；PLXA2、NPTN、ALK、DSCAM、CD2、EPHA1、ERMAP、ERBB2、CEA20、KIRR1、C163A、PTPRF、CSPG4、SLAF1、TMIG3、NOTCH1或NOTCH2近膜结构域(JDM)，和转录因子；以及嵌合抗原受体，并且其中所述重组核酸的5’端和3’端包含与所述原代细胞基因组中侧接插入位点的基因组序列同源的核苷酸序列。

在一方面，本文提供了细胞群体，所述细胞群体包含多个本文所公开的免疫细胞。

在一方面，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含本文所公开的免疫细胞或本文所公开的细胞群体，以及药学上可接受的赋形剂。

在一方面，本文提供了药物组合物，所述药物组合物包含本文所公开的重组核酸或本文所公开的非病毒载体，以及药学上可接受的赋形剂。

在一方面，本文提供了编辑免疫细胞的方法，所述方法包括：提供核糖核蛋白复合物(RNP)-重组核酸复合物，其中所述RNP包含核酸酶结构域和向导RNA，其中所述重组核酸包含本文所公开的重组核酸，并且其中所述重组核酸的5'端和3'端包含与免疫细胞基因组中侧接插入位点的基因组序列同源的核苷酸序列；以非病毒方式将RNP-重组核酸复合物引入免疫细胞中，其中所述向导RNA与原代免疫细胞的基因组的靶区特异性杂交，并且其中所述核酸酶结构域裂解靶区以在免疫细胞的基因组中产生插入位点；以及通过将本文所公开的重组核酸插入免疫细胞基因组中的插入位点中来编辑免疫细胞。

在一些实施方案中，以非病毒方式引入包括电穿孔。

在一些实施方案中，所述核酸酶结构域包含CRISPR相关核酸内切酶(Cas)，任选地是Cas9核酸酶。

在一些实施方案中，所述细胞的基因组的靶区是T细胞受体α恒定区(TRAC)基因座或基因组安全港(GSH)基因座。

在一些实施方案中，重组核酸是双链重组核酸或单链重组核酸。

在一些实施方案中，重组核酸是线性重组核酸或环状重组核酸，任选地其中所述环状重组核酸是质粒。

在一些实施方案中，所述免疫细胞是原代人免疫细胞。

在一些实施方案中，所述原代免疫细胞是自体免疫细胞。

在一些实施方案中，原代免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞、T细胞、CD8+ T细胞、CD4+T细胞、原代T细胞或T细胞祖细胞。

在一些实施方案中，所述原代免疫细胞是原代T细胞。

在一些实施方案中，所述原代免疫细胞是原代人T细胞。

在一些实施方案中，免疫细胞是无病毒的。

在一些实施方案中，所述方法还包括从患者获得免疫细胞以及在体外引入重组核酸。

在一方面，本文提供了治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的免疫细胞或本文所公开的药物组合物。

在一些实施方案中，所述疾病是癌症。

在一些实施方案中，癌症是实体癌或液体癌。

在一些实施方案中，癌症是卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、子宫癌、间皮瘤、宫颈癌或胰腺癌。

在一些实施方案中，所述方法还包括向所述受试者同时或先后施用免疫细胞和免疫疗法。

在一方面，本文提供了杀伤、失能、耗竭或抑制受试者体内的靶细胞的方法，所述方法包括向受试者施用本文所公开的免疫细胞，其中所述免疫细胞杀伤、失能、耗竭或抑制靶细胞。

在一些实施方案中，靶细胞表达ALPG/P和MSLN。

在一些实施方案中，靶细胞是癌细胞。

在一方面，本文提供了诱导免疫细胞中嵌合抗原受体与启动受体的表达的方法，所述方法包括：获得免疫细胞，所述免疫细胞包含本文所公开的系统、本文所公开的重组核酸和/或本文所公开的非病毒载体；以及使所述免疫细胞与靶细胞接触，所述靶细胞表达针对上述启动受体的第一抗原，其中所述启动受体与靶细胞上的第一抗原结合将诱导启动受体的激活和嵌合抗原受体的表达。

在一方面，本文提供了调节免疫细胞的活性的方法，所述方法包括：获得免疫细胞，所述免疫细胞包含本文所公开的系统、本文所公开的重组核酸和/或本文所公开的非病毒载体；以及使所述免疫细胞与靶细胞接触，所述靶细胞第一抗原和第二抗原，其中所述启动受体与靶细胞上的第一抗原结合将诱导启动受体的激活和嵌合抗原受体的表达，并且其中所述嵌合抗原受体与靶细胞上的第二抗原结合将调节免疫细胞的活性。

在一些实施方案中，第一抗原是ALPG/P抗原。

在一些实施方案中，第二抗原是MSLN抗原。

附图说明

参考以下描述和附图，将更好地理解本公开的这些和其它特征、方面和优点，在附图中：

图1显示了示例性嵌合启动受体的图。

图2提供了用于启动受体的新跨膜结构域和细胞内近膜结构域的初步筛选命中结果(hit)。

图3A显示了来自供体1的表达指定启动受体的T细胞中的CAR诱导和基础启动受体表达情况。图3B显示了来自供体2的表达指定启动受体的T细胞中的CAR诱导和基础启动受体表达情况。

图4显示了表达指定启动受体的T细胞引起的启动受体诱导的细胞毒性。

图5显示了由额外筛选命中结果得到的启动受体表达和CAR诱导情况。

图6显示了从额外启动受体筛选命中结果得到的启动受体向CAR的转化(周转)。

图7显示了由额外启动受体筛选命中结果得到的CAR诱导和敏感杀伤效应。

图8显示了由额外启动受体筛选命中结果得到的CAR保真度。

图9显示了指定启动受体T细胞的细胞毒性测定的结果。

图10显示了指定启动受体T细胞的CAR诱导与基础杀伤作用的比较。

图11显示了指定启动受体T细胞的活细胞杀伤作用。

图12显示了在启动受体下游表达大型组成性蛋白质的指定启动受体T细胞的活细胞杀伤作用。

具体实施方式

定义

除非另外规定，否则权利要求和说明书中所用的术语是如下文所陈述加以定义。

如本文所用，术语“基因”是指遗传的基本单位，由沿染色体排列的DNA区段组成，其编码特定蛋白质或蛋白质区段。基因通常包括启动子、5'非翻译区、一个或多个编码序列(外显子)、任选的内含子和3'非翻译区。基因还可包含终止子、增强子和/或沉默子。

如本文所用，术语“基因座”是指基因或遗传标志物所在的染色体上特定的、固定的物理位置。

术语“安全港基因座”是指基因或遗传元件可以在不破坏相邻基因的表达或调控的情况下被并入的基因座。这些安全港基因座也称为安全港位点(SHS)。如本文所用，安全港基因座是指“整合位点”或“敲入位点”，在该位点上可以插入编码如本文所定义的转基因的序列。在一些实施方案中，插入的发生伴随着位于整合位点的序列的置换。在一些实施方案中，插入的发生不伴随整合位点处序列的置换。设想的整合位点的实例提供于表E中。

如本文所用，术语“插入物”是指在靶基因座或安全港位点处整合(插入)的核苷酸序列。插入物可用于指使用例如同源定向修复(HDR) CRISPR/Cas9基因组编辑或本领域普通技术人员已知的用于将核苷酸序列插入基因组区域的其他方法，在靶基因座或安全港位点处并入的基因或基因元件。

术语“插入”是指操纵核苷酸序列以引入非天然序列。例如，这可以通过使用限制酶和连接酶来实现，由此可以将感兴趣的DNA序列(通常编码感兴趣的基因)并入另一核酸分子中，并入方式是通过用适当限制酶消化两个分子以产生相容的重叠，然后使用连接酶将这些分子连接在一起。本领域技术人员非常熟悉这些操作，并且可以在Sambrook等人的著作(Sambrook、Fritsch和Maniatis, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”,第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)中找到实例，该文献的全部内容(包括任何附图、图式和表格)特此以引用的方式并入。

“CRISPR/Cas”系统是指一大类用于防御外来核酸的细菌系统。CRISPR/Cas系统存在于众多真细菌和古细菌生物体中。CRISPR/Cas系统包括I型、II型和III型亚型。野生型II型CRISPR/Cas系统利用RNA介导的核酸酶Cas9与向导和激活RNA的复合物来识别和裂解外来核酸。具有向导RNA和激活RNA两者的活性的向导RNA也是本领域中已知的。在一些情况下，这种双重活性向导RNA被称为小向导RNA (sgRNA)。

Cas9同源物存在于多种真细菌中，包括但不限于以下分类群的细菌：放线菌门(Actinobacteria)、产水菌门(Aquificae)、拟杆菌门-绿菌门(Bacteroidetes-Chlorobi)、衣原体门-疣微菌门(Chlamydiae-Verrucomicrobia)、绿弯菌门(Chlroflexi)、蓝菌门(Cyanobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaetes)和热袍菌门(Thermotogae)。示例性Cas9蛋白是化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes) Cas9蛋白。另外的Cas9蛋白及其同源物描述于例如Chylinksi等人, RNA Biol., 2013年5月1日; 10(5): 726–737；Nat. Rev. Microbiol. 2011年6月;9(6): 467-477；Hou等人, Proc Natl Acad Sci U S A. 2013年9月24日;110(39):15644-9；Sampson等人, Nature. 2013年5月9日;497(7448):254-7；以及Jinek等人,Science.2012年8月17日;337(6096):816-21中。Cas9核酸酶结构域可以进行优化以实现高效活性或宿主细胞中稳定性的增强。

如本文所用，术语“Cas9”是指RNA介导的核酸酶(例如源自细菌或古细菌，或由其衍生)。示例性RNA介导的核酸酶包括前述Cas9蛋白及其同源物，并且包括但不限于CPF1(参见例如Zetsche等人，Cell，第163卷，第3期，第759–771页，2015年10月22日)。类似地，如本文所用，术语“Cas9核糖核蛋白”复合物等是指Cas9蛋白与crRNA (例如向导RNA或小向导RNA)之间、Cas9蛋白与反式激活crRNA (tracrRNA)之间、Cas9蛋白与小向导RNA之间的复合物，或其组合(例如包含Cas9蛋白、tracrRNA和crRNA向导RNA的复合物)。

如本文所用，短语“免疫细胞”包括可以产生免疫细胞的所有细胞类型，包括造血细胞，例如造血干细胞、多能干细胞和诱导性多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，免疫细胞是B细胞、巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞、诱导性多能干细胞(iPSC)、人多能干细胞(HSPC)、T细胞或T细胞祖细胞，或树突状细胞。在一些实施方案中，细胞是固有免疫细胞。

如本文所用，在原代细胞或原代干细胞情形中的术语“原代”是指尚未转化或永生化的细胞。此类原代细胞可以被培养、继代培养或传代有限次数(例如培养0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次)。在一些情况下，原代细胞适合体外培养条件。在一些情况下，原代细胞是从生物体、系统、器官或组织分离，任选地经历分选，并且被利用，例如不经培养或继代培养而直接使用。在一些情况下，原代细胞受到刺激、激活或分化。例如，原代T细胞可以通过接触CD3、CD28激动剂、IL-2、IFN-γ或它们的组合(例如在其存在下培养)来激活。

如本文所用，术语“T淋巴细胞”与“T细胞”可互换使用，并且是指在胸腺中完成成熟并鉴别体内某些外来抗原的细胞。这些术语还指在免疫系统中具有各种作用的主要白细胞类型，包括其他免疫细胞的激活和失活。T细胞可以是任何T细胞，诸如培养的T细胞，例如原代T细胞，或来源于培养的T细胞系的T细胞，例如Jurkat、SupT1等，或获自哺乳动物的T细胞。T细胞包括但不限于幼稚T细胞、刺激的T细胞、原代T细胞(例如未培养的T细胞)、培养的T细胞、永生化T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调节性T细胞、自然杀伤T细胞、它们的组合或它们的亚群。T细胞可以是CD3+细胞。T细胞可以是CD4⁺、CD8⁺或CD4⁺和CD8⁺。T细胞可以是任何类型的T细胞、CD4+/CD8+双阳性T细胞、CD4+辅助T细胞(例如Th1和Th2细胞)、CD8+ T细胞(例如细胞毒性T细胞)，外周(包括但不限于)血液单核细胞(PBMC)、外周血白细胞(PBL)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、记忆T细胞、幼稚T细胞、调节性T细胞、γδ T细胞等。它可以是处于任何发育阶段的任何T细胞。其他类型的辅助T细胞包括Th3 (Treg)细胞、Th17细胞、Th9细胞或Tfh细胞。其他类型的记忆T细胞包括中央记忆T细胞(Tcm细胞)、效应记忆T细胞(Tem细胞和TEMRA细胞)等细胞。T细胞还可以指代基因修饰的T细胞，诸如经修饰以表达T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。T细胞也可以从干细胞或祖细胞分化而来。

“CD4 + T细胞”是指在表面表达CD4并与细胞免疫反应相关的T细胞亚群。CD4 + T细胞的特征在于刺激后分泌特性，可包括分泌细胞因子，诸如IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-4和IL-10。“CD4”是一种55 kD的糖蛋白，最初被定义为T淋巴细胞上的分化抗原，但也存在于包括单核细胞/巨噬细胞在内的其他细胞上。CD4抗原是免疫球蛋白超家族的成员，并且是主要组织相容性复合物(MHC) II类限制性免疫反应中的关联识别元件。在T淋巴细胞上，CD4抗原限定了辅助/诱导子亚群。

“CD8 + T细胞”是指在表面上表达CD8的T细胞亚群，受I类MHC限制，并作为细胞毒性T细胞发挥作用。“CD8”分子是存在于胸腺细胞以及细胞毒性和抑制性T淋巴细胞上的分化抗原。CD8抗原是免疫球蛋白超家族的成员，并且是主要组织相容性复合物I类限制性相互作用中的关联识别元件。

如本文所用，短语“造血干细胞”是指一种可以产生血细胞的干细胞。造血干细胞可以产生骨髓或淋巴谱系或其组合的细胞。造血干细胞主要存在于骨髓中，但是它们可以从外周血或其部分中分离出来。各种细胞表面标志物可用于鉴定、分选或纯化造血干细胞。在一些情况下，造血干细胞被鉴定为c-kit⁺和lin^-。在一些情况下，人造血干细胞被鉴定为CD34⁺、CD59⁺、Thy1/CD90⁺、CD38^lo/-、C-kit/CD117⁺、lin^-。在一些情况下，人造血干细胞被鉴定为CD34^-、CD59⁺、Thy1/CD90⁺、CD38^lo/-、C-kit/CD117⁺、lin^-。在一些情况下，人造血干细胞被鉴定为CD133⁺、CD59⁺、Thy1/CD90⁺、CD38^lo/-、C-kit/CD117⁺、lin^-。在一些情况下，小鼠造血干细胞被鉴定为CD34^lo/-、SCA-1⁺、Thy1^+/lo、CD38⁺、C-kit⁺、lin^-。在一些情况下，造血干细胞为CD150⁺CD48^-CD244^-。

如本文所用，短语“造血细胞”是指源自造血干细胞的细胞。造血细胞可以通过从生物体、系统、器官或组织(例如血液或其部分)分离而获得或提供。或者，可以分离造血干细胞并通过分化干细胞来获得或提供造血细胞。造血细胞包括分化成其他细胞类型潜能有限的细胞。此类造血细胞包括但不限于多能祖细胞、谱系限制性祖细胞、共同髓系祖细胞、粒细胞-巨噬细胞祖细胞或巨核细胞-红系祖细胞。造血细胞包括淋巴和骨髓谱系的细胞，诸如淋巴细胞、红细胞、粒细胞、单核细胞和血小板。

如本文所用，术语“构建体”是指分子(包括大分子或多核苷酸)的复合物。

如本文所用，术语“整合”是指将构建体的一个或多个核苷酸稳定插入细胞基因组中，即，共价连接至细胞染色体DNA中的核酸序列的过程。其也可以指整合位点处的核苷酸缺失。在插入位点处存在缺失的情况下，“整合”还可包括用一个或多个插入的核苷酸取代缺失的内源序列或核苷酸。

如本文所用，术语“外源”是指已引入宿主细胞中且不是该细胞原生的分子或活性。例如，可以通过将编码核酸引入宿主遗传物质中，如通过整合到宿主染色体中，或作为非染色体遗传物质诸如质粒，来引入分子。因此，当与编码核酸的表达结合使用时，该术语是指将编码核酸以可表达的形式引入细胞中。术语“内源”是指在自然、未经编辑的条件下存在于宿主细胞中的分子或活性。类似地，当与编码核酸的表达结合使用时，该术语是指包含在细胞内而不是外源性地引入的编码核酸。

术语“异源”指非侧翼序列原生的核酸或多肽序列或结构域，例如，其中未发现异源序列天然偶联至在一端或两端出现的核酸或多肽序列。

术语“同源”指侧翼序列原生的核酸或多肽序列或结构域，例如，其中发现同源序列天然偶联至在一端或两端出现的核酸或多肽序列。

如本文所用，“多核苷酸供体构建体”是指遗传地插入多核苷酸中并且对该多核苷酸而言是外源的核苷酸序列(例如DNA序列)。多核苷酸供体构建体被转录成RNA并任选地被翻译成多肽。多核苷酸供体构建体可包括原核序列、来自真核mRNA的cDNA、来自真核(例如，哺乳动物) DNA的基因组DNA序列，和合成DNA序列。例如，多核苷酸供体构建体可以是miRNA、shRNA、天然多肽(即，天然存在的多肽)或其片段，或变体多肽(例如，与天然多肽具有小于100%序列同一性的天然多肽)或其片段。

如本文所用，术语“互补的”或“互补性”是指核苷酸或核酸之间的特定碱基配对。互补核苷酸一般是A和T (或A和U)以及G和C。本文所描述的向导RNA可以包含与细胞中的基因组序列完美互补或大体上互补(例如具有1-4个错配)的序列，例如DNA靶向序列。

如本文所用，术语“转基因”是指已天然地或通过多种基因工程化技术中的任一种从一种生物体转移到另一种生物体的多核苷酸。其任选地被翻译成多肽。其任选地被翻译成重组蛋白。“重组蛋白”是一种由基因编码的蛋白质——重组DNA——已在支持基因表达和信使RNA翻译的系统中克隆(参见表达系统)。重组蛋白可以是治疗剂，例如治疗本文所公开的疾病或病症的蛋白质。如所用，转基因可以指代编码多肽的多核苷酸。

术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”在本文中可互换使用。

如本文所用，术语“可操作地连接”或“操作性地连接”是指核酸序列与单个核酸片段结合，使得一种功能受另一种功能影响。例如，如果启动子能够影响编码序列或功能性RNA的表达(即，编码序列或功能性RNA在启动子的转录控制下)，则启动子与其可操作地连接。编码序列可以在有义和反义方向上可操作地连接至控制序列。

如本文所用，术语“发育细胞状态”是指，例如，细胞所处的非活性、活性表达、分化、衰老等状态。发育细胞状态还可以指处于前体状态的细胞(例如，T细胞前体)。

如所用，术语“编码”是指编码目标蛋白质或多肽的核酸序列。核酸序列可以是DNA分子或RNA分子。在优选实施方案中，分子是DNA分子。在其他优选实施方案中，分子是RNA分子。当作为RNA分子存在时，其将包含引导宿主细胞的核糖体开始翻译的序列(例如，起始密码子，ATG)和引导核糖体结束翻译的序列(例如，终止密码子)。在起始密码子与终止密码子之间是开放阅读框(ORF)。此类术语是本领域普通技术人员已知的。

如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物受试者。示例性受试者包括人、猴子、狗、猫、小鼠、大鼠、牛、马、骆驼、山羊、兔子、猪和绵羊。在某些实施方案中，受试者为人。在一些实施方案中，受试者患有可用本文所提供的工程化过的细胞或其群体治疗的疾病或疾患。在一些方面，疾病或疾患为癌症。

如本文所用，术语“启动子”是指能够控制编码序列或功能性RNA的表达的核苷酸序列(例如DNA序列)。启动子序列由近端和更远端的上游元件组成，后者元件通常称为增强子。启动子可以完整地源自天然基因，可以由来自天然存在的不同启动子的不同元件组成，并且/或者可包含合成的DNA区段。如本文所设想的，启动子对于感兴趣细胞而言可以是内源的，或者对于感兴趣细胞而言是外源的。本领域技术人员理解不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型中，或在不同的发育阶段，或响应于不同的环境条件诱导基因表达。如本领域已知的，可以根据启动子的强度和/或启动子具有活性的条件来选择启动子，例如，组成型启动子、强启动子、弱启动子、诱导型/抑制型启动子、组织特异性或发育调控启动子、细胞周期依赖性启动子等。

启动子可以是诱导型启动子(例如，热休克启动子、四环素调控启动子、类固醇调控启动子、金属调控启动子、雌激素受体调控启动子等)。启动子可以是组成型启动子(例如，CMV启动子、UBC启动子)。在一些实施方案中，启动子可以是空间限制和/或时间限制的启动子(例如，组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子等)。参见例如美国公开20180127786，其公开内容以全文引用的方式并入本文。

如本文所考虑的，基因编辑可能涉及基因(或核苷酸序列)的敲入或敲除。如本文所用，术语“敲入”是指将DNA序列或其片段添加到基因组中。此类待敲入的DNA序列可包括一个或多个完整基因，可包括与基因或前述基因的任何部分或片段相关的调控序列。例如，可将编码重组蛋白的多核苷酸供体构建体插入携带突变基因的细胞的基因组中。在一些实施方案中，敲入策略涉及用提供的序列取代现有序列，例如用野生型拷贝取代突变等位基因。另一方面，术语“敲除”是指基因或基因表达的消除。例如，可以通过缺失或添加导致阅读框破坏的核苷酸序列来敲除基因。再如，可通过用不相关的(例如，非编码的)序列置换基因的一部分来敲除基因。

如本文所用，术语“非同源末端接合”或NHEJ是指DNA链的切割或切口末端直接接合而不需要同源模板核酸的细胞过程。NHEJ可以导致修复位点处一个或多个核苷酸的添加、缺失、取代或它们的组合。

如本文所用，术语“同源定向修复”或HDR是指通过从同源模板核酸聚合来修复DNA链的切割或缺口末端的细胞过程。因此，原始序列被模板的序列置换。同源模板核酸可以由基因组中其他位置的同源序列(姐妹染色单体、同源染色体，或相同或不同染色体上的重复区域)提供。或者，可以引入外源模板核酸以获得靶位点处特定HDR诱导的序列的变化。通过这种方式，可以在切割位点引入特定的突变。

如本文所用，单链DNA模板或双链DNA模板是指可被细胞用作HDR模板的DNA寡核苷酸。一般来说，单链DNA模板或双链DNA模板具有至少一个与靶位点同源的区域。在一些情况下，单链DNA模板或双链DNA模板具有两个同源区域，位于包含待插入靶切割位点处的异源序列的区域的两侧。

术语“载体”和“质粒”可互换使用，并且如本文所用是指可用于将遗传物质引入细胞中的多核苷酸媒介物。载体可以是线状的或环状的。载体可以整合到宿主细胞的靶基因组中或者在宿主细胞中独立复制。载体可以包含例如复制起点、多克隆位点和/或选择性标志物。表达载体通常包含表达盒。载体和质粒包括但不限于整合载体、原核质粒、真核质粒、植物合成染色体、附加体、粘粒和人工染色体。

如本文所用，在引入核酸或包含核酸的复合物例如RNP-DNA模板复合物的上下文中的短语“引入”是指核酸序列或RNP-DNA模板复合物从细胞外到细胞内的易位。在一些情况下，引入是指核酸或复合物从细胞外到细胞核内的易位。涵盖这种易位的各种方法，包括但不限于电穿孔、与纳米线或纳米管接触、受体介导的内化、经由细胞穿透肽进行的易位、脂质体介导的易位等。

如本文所用，术语“表达盒”是以重组或合成方式产生的多核苷酸构建体，其包含可操作地连接至所选多核苷酸以促进该所选多核苷酸在宿主细胞中的表达的调控序列。例如，调控序列可以促进所选多核苷酸在宿主细胞中的转录，或所选多核苷酸在宿主细胞中的转录和翻译。表达盒可以例如整合到宿主细胞的基因组中或存在于表达载体中。

如本文所用，短语“有需要的受试者”是指表现出和/或被诊断具有如本文所述的疾病或病症的一种或多种症状或体征的受试者。

“化学治疗剂”是指可用于治疗癌症的化学化合物。化学治疗剂包括用于调节、减少、阻断或抑制可促进癌症生长的激素的影响的“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”。

术语“组合物”是指含有例如本文所设想的工程化细胞或蛋白质的混合物。在一些实施方案中，组合物可含有另外的组分，诸如佐剂、稳定剂、赋形剂等。术语“组合物”或“药物组合物”是指呈允许包含在其中的活性成分的生物活性对治疗受试者有效的形式的制剂，并且在药物组合物中提供的量中，其不含有对受试者具有不可接受的毒性的其它组分。

术语“原位”是指在活细胞中发生的与活生物体分开生长的过程，例如，在组织培养物中生长。

术语“体内”是指在活生物体中发生的过程。

如本文所用，术语“离体”一般包括在活组织中或活组织上进行的实验或测量，优选地是在生物体外的人工环境中，优选地是与自然条件的差异极小。

如本文所用，术语“哺乳动物”包括人和非人，并且包括但不限于人、非人灵长类动物、犬科动物、猫科动物、鼠类、牛、马和猪。

在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中，术语“同一性”百分比是指当针对最大对应而进行比较和比对时具有指定百分比的为相同的核苷酸或氨基酸残基的两个或更多个序列或子序列，如使用下文描述的序列比较算法之一(例如，BLASTP和BLASTN或其他技术人员可用的算法)或通过视觉检查来测量。根据应用，“同一性”百分比可以存在于所比较的序列的区上，例如，存在于功能性结构域上，或者可替代地存在于待比较的两个序列的全长上。

对于序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，指定子序列坐标(如果需要的话)，并且指定序列算法程序参数。然后序列比较算法基于指定的程序参数计算一个或多个测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。

供比较的序列的最佳比对可例如通过以下方式进行：Smith和Waterman, Adv.Appl. Math. 2:482 (1981)的局部同源性算法；Needleman和Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)的同源性比对算法；Pearson和Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)的相似性搜索方法；这些算法的计算机实施(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA；Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison,Wis.)；或目视检查(一般参见Ausubel等人，下文)。

适用于确定序列同一性和序列相似性百分比的算法的一个实例是Altschul等人,J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)中描述的BLAST算法。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。

术语“足够的量”意指足以产生所需效果的量，例如足以调节细胞内蛋白质聚集的量。

术语“治疗有效量”是有效改善疾病症状的量。

术语“改善”是指在治疗疾病状态(例如，癌症疾病状态)时的任何治疗方面有益的结果，疾病状态的严重性或进展减轻、缓解或治愈。

如本文所用，术语“有效量”是指足以产生有益或期望结果的化合物(例如本文所描述的组合物、本文所描述的细胞)的量。有效量可以按一次或多次施用、应用或剂量施用，并且不意图限于特定的制剂或施用途径。

如本文所用，术语“治疗”包括引起疾患、疾病、病症等的好转，或改善其症状的任何作用，例如减轻、减少、调节、改善或消除。

术语“调节(modulate/modulation)”是指降低或抑制，或替代地，激活或增加所叙述变量。

术语“增加”和“活化”是指所叙述变量增加10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、100%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。

术语“降低”和“抑制”是指所叙述变量降低10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍或更多。

关于抗体与靶分子的结合，术语“结合”特定抗原(例如多肽靶)或特定抗原上的表位、与特定抗原(例如多肽靶)或特定抗原上的表位“特异性结合”、“特异性结合至”特定抗原(例如多肽靶)或特定抗原上的表位、“对特定抗原(例如多肽靶)或特定抗原上的表位具有特异性”、“选择性结合”特定抗原(例如多肽靶)或特定抗原上的表位和“对特定抗原(例如多肽靶)或特定抗原上的表位具有选择性”意指结合在可测量程度上不同于非特异性或非选择性相互作用(例如与非靶分子的相互作用)。例如，“选择性结合”或“特异性结合”抗原的抗体是以高亲和力结合抗原并且不显著结合其他无关抗原的抗原结合部分。例如，可以通过测量与靶分子的结合并将其同与非靶分子的结合进行比较来测量特异性结合。特异性结合还可通过与对照分子竞争来确定，所述对照分子模拟在靶分子上识别的表位。在这种情况下，如果抗体与靶分子的结合受到对照分子的竞争性抑制，则指示特异性结合。

“亲和力”是指分子(例如抗体)的单一结合位点与它的结合配偶体(例如抗原或表位)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指示，否则如本文所用，“亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体与抗原或表位)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对它的配偶体Y的亲和力可由解离平衡常数(K_D)表示。以下更详细描述促成解离平衡常数的动力学分量。亲和力可以通过本领域中已知的常用方法来测量，所述方法包括但不限于表面等离子体共振(SPR)技术(例如，BIACORE^®)或生物层干涉测量术(例如，FORTEBIO^®)。

如本文所用的术语“高变区”或“HVR”是指抗体可变结构域的在序列方面高度可变和/或形成结构确定的环(“高变环”)的区域中的每一者。通常，天然四链抗体包含六个HVR；三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含来自高变环和/或来自互补决定区(CDR)的氨基酸残基，所述互补决定区具有最高序列可变性和/或参与抗原识别。除VH中的CDR1之外，CDR通常包含形成高变环的氨基酸残基。高变区(HVR)也被称为“互补决定区”(CDR)，并且这些术语关于可变区的形成抗原结合区的部分在本文中可互换使用。这个特定区域已由Kabat等人, U.S. Dept. of Health and Human Services,Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983)以及由Chothia等人, JMol Biol 196:901-917 (1987)描述，其中当相对于彼此加以比较时，定义包括氨基酸残基的重叠或子组。然而，将任一定义应用来指抗体或其变体的CDR意图在如本文所定义和所用的术语的范围内。涵盖特定CDR的确切残基数目将取决于CDR的序列和大小而变化。鉴于抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员可以常规方式确定哪些残基构成特定CDR。

CDR的氨基酸序列边界可由本领域技术人员使用许多已知编号方案中的任一者来确定，所述编号方案包括由Kabat等人(上文) (“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,1997,J. Mol. Biol., 273:927-948 (“Chothia”编号方案)；MacCallum等人, 1996,J. Mol. Biol.262:732-745 (“Contact”编号方案)；Lefranc等人,Dev. Comp. Immunol.,2003, 27:55-77 (“IMGT”编号方案)；以及Honegge和Plückthun,J. Mol. Biol., 2001,309:657-70 (“AHo”编号方案)描述的那些；所述文献中的每一者以引用的方式整体并入本文。

表A提供通过Kabat、Chothia、AbM、Contact和IMGT鉴定的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的位置。对于CDR-H1，残基编号是使用Kabat和Chothia编号方案提供。

CDR可以例如使用抗体编号软件来指定，诸如可在bioinf.org.uk/abs/abnum/获得并且描述于以全文引用的方式并入的Abhinandan和Martin,Immunology, 2008, 45:3832-3839中的Abnum，以及可在abysis.org/abysis/sequence_input/key_annotation/key_annotation.cgi获得的AbYsis。各种抗体编号方案的描述可见于bioinf.org.uk/abs/info.html。

表A. 根据指定编号方案的CDR中的残基。

当使用Kabat编号惯例进行编号时，取决于CDR的长度，CDR-H1的C末端在H32与H34之间变化。

当提及抗体重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号方案”(例如，如Kabat等人，上文中所报道)。除非另有说明，否则EU编号方案用于提及本文所述的抗体重链恒定区中的残基。

如本文所用，术语“单链”是指包含由肽键线性连接的氨基酸单体的分子。在一个特定所述实施方案中，在单链Fab分子中，Fab轻链的C末端连接于Fab重链的N末端。如本文更详细所述，scFv具有轻链的可变结构域(VL)从它的C末端由多肽链连接于重链的可变结构域(VH)的N末端。或者，scFv包含其中VH的C末端通过多肽链连接于VL的N末端的多肽链。

“Fab片段”(也被称为抗原结合片段)含有轻链的恒定结构域(CL)和重链的第一恒定结构域(CH1)以及分别在轻链和重链上的可变结构域VL和VH。可变结构域包含抗原结合中涉及的互补决定环(CDR，也被称为高变区)。Fab’片段与Fab片段由于在重链CH1结构域的羧基末端添加少量残基而不同，该残基包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。

“F(ab’)₂”片段含有在铰链区附近通过二硫键连接的两个Fab’片段。F(ab’)₂片段可例如通过重组方法或通过完整抗体的胃蛋白酶消化来产生。F(ab’)片段可例如通过用β-巯基乙醇处理来解离。

“Fv”片段包含一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的非共价连接二聚体。

“单链Fv”或“scFv”包括抗体的VH结构域和VL结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。在一个实施方案中，Fv多肽还包含在VH结构域与VL结构域之间的使得scFv能够形成为抗原结合所需的结构的多肽接头。对于scFv的综述，参见Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编, Springer-Verlag, New York,第269-315页(1994)。HER2抗体scFv片段描述于WO93/16185；美国专利第5,571,894号；和美国专利第5,587,458号中。

术语“单结构域抗体”或“sdAb”是指其中抗体的一个可变结构域在不存在另一可变结构域下特异性结合至抗原的分子。单结构域抗体及其片段描述于Arabi Ghahroudi等人,FEBS Letters, 1998, 414:521-526以及Muyldermans等人,Trends in Biochem. Sci., 2001, 26:230-245中，其各自以引用的方式整体并入。单结构域抗体也被称为sdAb或纳米抗体。Sdab十分稳定，并且易于作为融合配偶体与抗体的Fc链一起表达(HarmsenMM, De Haard HJ (2007). "Properties, production, and applications of camelidsingle-domain antibody fragments". Appl. Microbiol Biotechnol. 77(1): 13-22)。

必须指出的是，除非上下文另有明确规定，否则如说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一个/种(a/an)”和“该/所述(the)”包括复数个/种指示物。

逻辑门系统

如本文所用，“逻辑门”、“回路”、“回路受体”、“系统”或“系统受体”是指包含启动受体和嵌合抗原受体的两部分蛋白质表达系统。该系统可以在插入细胞中的至少一个核酸上编码，其中启动受体在细胞中表达。当启动受体与其靶抗原结合时，启动受体的细胞内结构域从跨膜结构域裂解。然后，细胞内结构域能够易位至细胞核中，在细胞核中诱导嵌合抗原受体的表达。

在一方面，本文提供了包含结合至ALPG/P的启动受体和结合至MSLN的嵌合抗原受体的系统，其中启动受体的细胞内结构域的转录因子能够诱导CAR的表达。此类系统可替代地称为“逻辑门”或“回路”。在一些方面，该系统由插入免疫细胞中的核酸转基因编码。该系统可以在包含两个转基因的单个核酸插入物或片段上编码，或者可以在单独编码系统转基因的两个核酸上编码。系统的启动受体和CAR可以以任何顺序放置在单个核酸上。例如，启动受体可以在5'端并且CAR可以在3'端，或者CAR可以在5'端并且启动受体可以在3'端。

组成型启动子可以可操作地连接至编码启动受体的核苷酸序列。诱导型启动子还可以可操作地连接至编码CAR的核苷酸序列。在一些实施方案中，当系统在包含两个转基因的单个核酸插入物或片段上编码时，所述核酸可以在5’至3’方向上包含：组成型启动子；编码启动受体的核苷酸序列；诱导型启动子；和编码嵌合抗原受体的核苷酸序列。或者，所述核酸可在5’至3’方向上包含：诱导型启动子；编码嵌合抗原受体的核苷酸序列；组成型启动子；和编码启动受体的核苷酸序列。

启动受体

以前的syn-notch或hinge-notch受体使用Notch跨膜和近膜结构域。这些已知结构域的使用限制了启动受体可能产生的诱导水平范围。此外，使用Notch1或Notch2跨膜结构域(TMD)和近膜结构域(JMD)具有可检测水平的基础活性。本文提供了降低可检测水平的基础活性的新颖跨膜和近膜结构域。本文所公开的新型启动受体用调节受体诱导能力的新结构域取代了TMD和JMD。

在一些实施方案中，启动受体包含SEQ ID NO: 111-132中所示的序列。

在一些实施方案中，启动受体包含SEQ ID NO: 281-300中的至少一者中所示的序列。

本文提供了启动受体，所述启动受体在N末端至C末端方向上包含：STS、SNORC、SEM4F、MCP、PLAT2、MMEL1、PLXC1、CLSTN1、CSTN2、SIGL9、IRAG1、TIGIT、TNR21, ZP3、SUSD4、DCBD1、HMR1、DISP1、IRPL1、ECSCR或PLXC1跨膜结构域(TMD)，所述TMD包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；和包含人或人源化转录效应物的细胞内结构域，其中所述抗原与所述细胞外抗原结合结构域的结合导致在所述一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处裂解。

本文还提供了启动受体，所述启动受体在N末端至C末端方向上包含：包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点的跨膜结构域；PLXA2、NPTN、ALK、DSCAM、CD2、EPHA1、ERMAP、ERBB2、CEA20、KIRR1、C163A、PTPRF、CSPG4、SLAF1或TMIG3近膜结构域(JMD)；和包含人或人源化转录效应物的细胞内结构域，其中所述抗原与所述细胞外抗原结合结构域的结合导致在所述一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处裂解。

在一些实施方案中，启动受体还包含对抗原具有结合亲和力的细胞外抗原结合结构域。

本文还提供了启动受体，所述启动受体在N末端至C末端方向上包含：对胎盘/生殖细胞型碱性磷酸酶(ALPG/P)具有结合亲和力的细胞外抗原结合结构域；STS、SNORC、SEM4F、MCP、PLAT2、MMEL1、PLXC1、CLSTN1、CSTN2、SIGL9、IRAG1、TIGIT、TNR21、ZP3、SUSD4、DCBD1、IRAG1、HMR1、DISP1、IRPL1、ECSCR或PLXC1跨膜结构域(TMD)，所述TMD包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；以及包含人或人源化转录效应物的细胞内结构域，其中所述抗原与所述细胞外抗原结合结构域的结合导致在所述一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处裂解。

在一些实施方案中，启动受体在N末端至C末端方向上包含：STS、SNORC、SEM4F、MCP、PLAT2、MMEL1、PLXC1、CLSTN1, CSTN2、SIGL9、IRAG1、TIGIT、TNR21、ZP3、SUSD4、DCBD1、IRAG1、HMR1、DISP1、IRPL1、ECSCR或PLXC1跨膜结构域(TMD)，所述TMD包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；和包含人或人源化转录效应物的细胞内结构域，其中所述抗原与所述细胞外抗原结合结构域的结合导致在所述一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处裂解。包含新颖TMD、JMD/STS和细胞内效应物结构域的示例性启动受体序列提供于SEQID NO: 281-300中。在一些实施方案中，启动受体包含SEQ ID NO: 281-300中所示的序列。

本文还提供了启动受体，所述启动受体在N末端至C末端方向上包含：对胎盘/生殖细胞型碱性磷酸酶(ALPG/P)具有结合亲和力的细胞外抗原结合结构域；包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点的跨膜结构域；PLXA2、NPTN、ALK、DSCAM、CD2、EPHA1、ERMAP、ERBB2、CEA20、KIRR1、C163A、PTPRF、CSPG4、SLAF1或TMIG3近膜结构域(JMD)；以及包含人或人源化转录效应物的细胞内结构域，其中所述抗原与所述细胞外抗原结合结构域的结合导致在所述一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处裂解。

在一些实施方案中，启动受体包含特异性结合胎盘碱性磷酸酶(ALPP)的细胞外抗原结合结构域。在一些实施方案中，启动受体包含特异性结合生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG)的细胞外抗原结合结构域。如本文所用，“胎盘/生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)”是指胎盘碱性磷酸酶(ALPP)和生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG)两者。特异性结合ALPG/P的抗原结合结构域能够特异性结合ALPG和/或ALPP。

在本公开的某些方面，启动受体是基于STS、SNORC、SEM4F、MCP、PLAT2、MMEL1、PLXC1、CLSTN1、CSTN2、SIGL9、IRAG1、TIGIT、TNR21、ZP3、SUSD4、DCBD1、IRAG1、HMR1、DISP1、IRPL1、ECSCR、PLXC1或Notch蛋白。天然受体与同源配体(诸如来自Delta蛋白家族的配体)的结合会引起膜内蛋白水解，从而使所述受体的细胞内片段裂解。这一细胞内片段是转录调节因子，它只有在从所述受体裂解时才起作用。裂解可通过ADAM金属蛋白酶和γ分泌酶复合物的顺序蛋白水解而发生。这一细胞内片段进入细胞核并激活细胞-细胞信号传导基因。与天然蛋白质相比，启动受体用使得编码所选蛋白质(诸如CAR)的基因在细胞内片段从启动受体释放时被转录的片段取代天然细胞内片段。

表B提供了得到所述跨膜结构域和近膜结构域的指定人蛋白质的UniProt标识符。

启动受体，如Notch受体具有模块化结构域组织。Notch受体的胞外结构域由负责配体结合的一系列N末端表皮生长因子(EGF)样重复序列组成。在合成的Notch受体或启动受体中，Notch配体结合结构域被结合所选靶配体或抗原的配体结合结构域取代。EGF重复序列之后是三个LIN-12/Notch重复序列(LNR)模块，这些模块是Notch受体所特有的，被广泛报道参与防止受体过早激活。Notchl的异源二聚化(HD)结构域经弗林蛋白酶裂解而分开，使得其N末端部分终止细胞外亚基，而其C末端半部分构成跨膜亚基的起点。在细胞外区域之后，受体具有跨膜区段和细胞内结构域(ICD)，细胞内结构域包括转录调节因子。

在本文所描述的方法、细胞和核酸中可以使用多种形式的启动受体。考虑用于本文的方法和细胞中的一类启动受体包含异源细胞外配体或抗原结合结构域、与包括NRR的Notch受体具有显著序列同一性的连接多肽、TMD和ICD。“Fn Notch”受体包含异源细胞外配体或抗原结合结构域、与Robo受体(诸如哺乳动物Robol、Robo2、Robo3或Robo4)具有显著序列同一性的连接多肽，随后是1、2或3个纤连蛋白重复序列(“Fn”)、TMD和ICD。“Mini Notch”受体包含异源细胞外配体或抗原结合结构域、与Notch受体(缺乏NRR)具有显著序列同一性的连接多肽、TMD和ICD。“Minimal Linker Notch”受体包含异源细胞外配体或抗原结合结构域、与Notch受体(例如合成(GGS)n多肽序列)缺乏显著序列同一性的连接多肽、TMD和ICD。“Hinge Notch”受体包含异源细胞外配体或抗原结合结构域、包含寡聚化结构域(即，促进与合成受体和/或现有宿主受体的二聚化、三聚化或更高级多聚化的结构域)的铰链序列、TMD和ICD。所有这些受体类别都是合成的、重组的，而不是天然存在的。在一些实施方案中，本文所公开的非天然存在的受体结合靶细胞表面展示的配体，它触发受体的蛋白水解裂解以及转录调节因子的释放，所述转录调节因子调节细胞中的定制转录程序。在一些实施方案中，启动受体不包括Notch受体的LIN-12-Notch重复序列(LNR)和/或异源二聚化结构域(HD)。

启动受体细胞外结构域

在一些实施方案中，启动受体细胞外结构域包括受体的配体或抗原结合部分。在一些实施方案中，启动受体细胞外结构域包括结合至一种或多种靶抗原的抗原结合部分。在一些实施方案中，启动受体细胞外结构域包含用于结合一种或多种靶抗原的构件。在一些实施方案中，用于结合一种或多种靶抗原的构件包含抗体和抗原结合片段或其等效物。在一些实施方案中，抗原结合部分包括抗体或其功能性抗原结合片段的一个或多个抗原结合决定簇。在一些实施方案中，抗原结合部分选自抗体、纳米抗体、双抗体、三抗体或微型抗体、F(ab')2片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)和单结构域抗体(sdAb)或其功能性片段。在一些实施方案中，抗原结合部分包含scFv。抗原结合部分可以包括天然存在的氨基酸序列或者可经历工程化、设计或修饰以提供所需的和/或改进的特性，例如增加的结合亲和力。

在一些实施方案中，本文所公开的启动受体包含细胞外结构域，所述细胞外结构域特异性结合CD19；间皮素(MSLN)；胎盘/生殖细胞型碱性磷酸酶(ALPG/P)；表皮生长因子受体(EGFR)；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1 (又称为CD2亚群1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子1 (CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2 (GD2)；神经节苷脂GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟抗原(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；类受体酪氨酸激酶孤儿受体1 (ROR1)；类Fms酪氨酸激酶3 (FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72 (TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3 (CD276)；KIT (CD117)；白细胞介素-13受体亚基α-2 (IL-13Ra2或CD213A2)；白细胞介素11受体α (IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21 (睾丸素或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板源性生长因子受体β (PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4 (SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2 (Her2/neu)；细胞表面相关粘蛋白1 (MUC1)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变型延伸因子2 (ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞激活蛋白α (FAP)；类胰岛素生长因子1受体(IGF-I受体)；碳酸酐酶IX (CAIX)；蛋白酶体(Prosome、Macropain) β型亚基9 (LMP2)；糖蛋白100 (gp100)；由断裂点簇区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1 (Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2 (EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酰化路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；谷氨酰胺转胺酶5 (TGS5)；高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标记物1 (TEM1/CD248)；肿瘤内皮标记物相关蛋白7 (TEM7R)；密封蛋白6 (CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5族成员D (GPRC5D)；X染色体开放阅读框61 (CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；多聚唾液酸；胎盘特异性蛋白1 (PLAC1)；Globo H糖鞘脂的六糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿路上皮分化蛋白2 (UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1 (HAVCR1)；肾上腺素受体β3 (ADRB3)；泛连接蛋白3 (PANX3)；G蛋白偶联受体20 (GPR20)；淋巴细胞抗原6复合体基因座K9 (LY6K)；嗅觉受体51E2 (OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；威尔姆氏肿瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1 (NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2 (LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1 (MAGE-A1)；位于染色体12p上的ETS易位变体基因6 (ETV6-AML)；精子蛋白17 (SPA17)；X抗原家族成员1A (XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2 (Tie 2)；黑色素瘤癌症睾丸抗原-1 (MAD-CT-1)；黑色素瘤癌症睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53 (p53)；p53突变体；存活素；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1 (PCTA-1或半乳糖凝集素8)，即由T细胞识别之黑色素瘤抗原1 (MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断裂点；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG (跨膜丝氨酸蛋白酶2 (TMPRSS2) ETS融合基因)；N-乙酰基葡糖氨基转移酶V (NA17)；配对盒蛋白Pax-3 (PAX3)；雄激素受体；细胞周期素B1；v-myc禽类成髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤源性同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C (RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2 (TRP-2)；细胞色素P450 1B1 (CYP1B1)；类CCCTC结合因子(锌指蛋白)(BORIS或印记位点调节因子的兄弟蛋白)，由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3 (SART3)；配对盒蛋白Pax-5 (PAX5)；前顶体素结合蛋白sp32 (OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4 (AKAP-4)；滑膜肉瘤X断裂点2 (SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾泛在蛋白1 (RU1)；肾泛在蛋白2 (RU2)；天冬酰胺内肽酶；人乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头瘤病毒E7 (HPV E7)；肠道羧酸酯酶；突变型热休克蛋白70-2 (muthsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1 (LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2 (LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A (CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2 (BST2)；含EGF样模体的粘蛋白样激素样受体2 (EMR2)；淋巴细胞抗原75 (LY75)；糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白聚糖-3 (GPC3)；Fc受体样蛋白5 (FCRL5)；或免疫球蛋白λ样多肽1 (IGLL1)。

在一些实施方案中，本文所公开的启动受体包含特异性结合胎盘/生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的细胞外结构域。在一些实施方案中，启动受体细胞外抗原结合结构域特异性结合至生殖细胞型碱性磷酸酶(ALPG，UniProtKB - P10696)。在一些实施方案中，启动受体细胞外结构域包括结合至胎盘碱性磷酸酶(ALPP，UniProtKB - P05187)的抗原结合部分。

本领域已知各种ALPG/P抗体，包括但不限于WO2017095823A1中所公开的抗ALPP抗体，该文献的公开内容特此以全文引用的方式并入。其他ALPP抗体可从商业供应商处获得，例如Abcam的ALPP/870(目录号ab212383)、Thermo Fisher的OTI1H2 (目录号TA506374)和Cell Signaling Technology的3E5C7 (目录号8681)。

启动受体CDR、VH、VL结构域

在一些方面，启动受体细胞外抗原结合结构域包含：可变重(VH)链序列，所述可变重(VH)链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；以及可变轻(VL)链序列，所述可变轻(VL)链序列包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：CDR-H1包含SEQID NO: 88、89、90、91或92中所示的序列；CDR-H2包含SEQ ID NO: 93、94、95、96、97中所示的序列；CDR-H3包含SEQ ID NO: 98、99、100中所示的序列；CDR-L1包含SEQ ID NO: 101、102、103中所示的序列；CDR-L2包含SEQ ID NO: 104、105或“NA”中所示的序列，并且CDR-L3包含SEQ ID NO: 107或108中所示的序列。在一些实施方案中，VH链序列包含SEQ ID NO:110中所示的序列。在一些实施方案中，VL包含SEQ ID NO: 109中所示的序列。在一些实施方案中，细胞外结构域包含SEQ ID NO: 76中所示的序列。

在一些实施方案中，启动受体细胞外抗原结合结构域CDR-H3与SEQ ID NO: 98、99、100的CDR-H3具有至少约50%、75%、80%、85%、90%或95%同一性；CDR-H2与SEQ ID NO: 93、94、95、96、97的CDR-H2具有至少约50%、75%、80%、85%、90%或95%同一性；CDR-H1与SEQ IDNO: 88、89、90、91或92的CDR-H1具有至少约50%、75%、80%、85%、90%或95%同一性；CDR-L3与SEQ ID NO: 107或108的CDR-L3具有至少约50%、75%、80%、85%、90%或95%同一性；CDR-L2与SEQ ID NO: 104、105或“NA”的CDR-L2具有至少约50%、75%、80%、85%、90%或95%同一性，并且CDR-L1与SEQ ID NO: 101、102、103的CDR-L1具有至少约50%、75%、80%、85%、90%或95%同一性。在一些实施方案中，CDR-H3是SEQ ID NO: 98、99、100的CDR-H3，具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；CDR-H2是SEQ ID NO: 93、94、95、96、97的CDR-H2，具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；CDR-H1是SEQ ID NO: 88、89、90、91或92的CDR-H1，具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代；CDR-L3是SEQ ID NO: 107或108的CDR-L3，具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代；CDR-L2是SEQ ID NO: 104、105或“NA”的CDR-L2，具有多达1、2、3或4个氨基酸取代；并且CDR-L1是SEQ ID NO: 101、102、103的CDR-L1，具有多达1、2、3、4、5或6个氨基酸取代。

在一些实施方案中，本文提供的启动受体细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:110中所示VH结构域的一个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含SEQ ID NO: 110所示VH结构域的两个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含SEQ ID NO: 110中所示VH结构域的三个CDR。在一些方面，CDR是Kabat CDR。在一些方面，CDR是Chothia CDR。在一些方面，CDR是AbM CDR。在一些方面，CDR是ContactCDR。在一些方面，CDR是IMGT CDR。

在一些实施方案中，本文提供的启动受体细胞外抗原结合结构域包含与SEQ IDNO: 110中所示VH序列具有至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%同一性的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含SEQ ID NO: 110所提供的VH序列，具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，本段中描述的抗原结合结构域在本文中称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体并非来源于本文所提供的序列，并且可例如根据本文所提供的用于获得抗体或抗原结合结构域的方法重新分离。

在一些实施方案中，本文提供的启动受体细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO:109中所示VL结构域的一个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含SEQ ID NO: 109中所示VL结构域的两个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含SEQ ID NO: 109中所示VL结构域的三个CDR。在一些方面，CDR是KabatCDR。在一些方面，CDR是Chothia CDR。在一些方面，CDR是AbM CDR。在一些方面，CDR是Contact CDR。在一些方面，CDR是IMGT CDR。

在一些实施方案中，本文提供的启动受体细胞外抗原结合结构域包含与SEQ IDNO: 109中所示VL序列具有至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%同一性的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含SEQ ID NO: 109中所提供的VL序列，具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，本段中描述的抗体在本文中称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体并非来源于本文所提供的序列，并且可例如根据本文所提供的用于获得抗体或抗原结合结构域的方法重新分离。

表C提供了根据指定编号方案的例示性ALPG/P抗原结合结构域的VH和VL的CDR序列。

跨膜结构域

如上文所述，启动受体包括包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点的跨膜结构域(TMD)。

在一些实施方案中，跨膜结构域包含STS、SNORC、SEM4F、MCP、PLAT2、MMEL1、PLXC1、CLSTN1、CSTN2、SIGL9、IRAG1、TIGIT、TNR21、ZP3、SUSD4、DCBD1、HMR1、DISP1、IRPL1、ECSCR、PLXC1或NOTCH1跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包含SEQ ID NO: 1-21中所示的序列。

一般来说，适用于本文所公开的嵌合受体的TMD可以是1型跨膜受体的包括至少一个γ分泌酶裂解位点的任何跨膜结构域。有关γ分泌酶复合物及其底物蛋白(包括淀粉样前体蛋白(APP)和Notch)的结构和功能的详细描述可以例如见于Zhang等人最近在Frontiers Cell Neurosci (2014)中发表的一篇综述。

在一些实施方案中，启动受体包含Notch裂解位点，诸如S2或S3。适用于本文所公开的组合物和方法的额外蛋白水解裂解位点包括但不限于ADAM10，即MMP的金属蛋白酶裂解位点，所述MMP选自胶原酶-1、胶原酶-2和胶原酶-3 (MMP-1、MMP-8和MMP-13)、明胶酶A和明胶酶B (MMP-2和MMP-9)、溶基质素1、溶基质素2和溶基质素3 (MMP-3、MMP-10和MMP-11)、基质溶解素(MMP-7)和膜金属蛋白酶(MT1-MMP和MT2-MMP)。适合蛋白酶裂解位点的另一实例是纤溶酶原激活物裂解位点，例如尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)或组织纤溶酶原激活物(tPA)裂解位点。适合蛋白酶裂解位点的另一实例是催乳素裂解位点。uPA和tPA的裂解序列的具体实例包括含Yal-Gly-Arg的序列。可包括在蛋白水解可裂解接头中的蛋白酶裂解位点的另一实例是烟草蚀纹病毒(TEV)蛋白酶裂解位点，例如Glu-Asn-Leu-Tyr-Thr-Gln-Ser(SEQ ID NO: 155)，其中所述蛋白酶在谷氨酰胺与丝氨酸之间裂解。可包括在蛋白水解可裂解接头中的蛋白酶裂解位点的另一实例是肠激酶裂解位点，例如Asp-Asp-Asp-Asp-Lys(SEQ ID NO: 156)，其中裂解在赖氨酸残基之后发生。可包括在蛋白水解可裂解接头中的蛋白酶裂解位点的另一实例是凝血酶裂解位点，例如Leu-Val-Pro-Arg (SEQ ID NO:157)。包含蛋白酶裂解位点的另外的适合接头包括可被以下蛋白酶裂解的序列：PreScission™蛋白酶(一种包含人鼻病毒3C蛋白酶和谷胱甘肽-S-转移酶的融合蛋白)、凝血酶、组织蛋白酶B、爱泼斯坦-巴尔病毒蛋白酶(Epstein-Barr vims proteas)、MMP-3 (溶基质素)、MMP-7 (基质溶解素)、MMP-9；类嗜热菌蛋白酶(thermolysin) MMP、基质金属蛋白酶2 (MMP-2)、组织蛋白酶L；组织蛋白酶D、基质金属蛋白酶1 (MMP-1)、尿激酶型纤溶酶原激活物、膜1型基质金属蛋白酶(MT-MMP)、溶基质素3 (或MMP-11)、嗜热菌蛋白酶、成纤维细胞胶原酶和溶基质素1、基质金属蛋白酶13 (胶原酶-3)、组织型纤溶酶原激活物(tPA)、人前列腺特异性抗原、激肽释放酶(hK3)、中性粒细胞弹性蛋白酶和钙蛋白酶(钙激活中性蛋白酶)。非表达受体的宿主细胞原生的蛋白酶(例如，TEV)可用作进一步的调控机制，其中受体的激活减少，直至蛋白酶被表达或以其他方式提供。另外，蛋白酶可能与肿瘤相关或与疾病相关(表达程度显著高于正常组织中的程度)，并充当独立的调控机制。例如，一些基质金属蛋白酶在某些癌症类型中高度表达。

在一些实施方案中，TMD内的氨基酸取代包括TMD的“GV”基序内的一个或多个取代。在一些实施方案中，此类取代中的至少一种包括对丙氨酸的取代。另外的序列和取代描述于WO2021061872中，该专利特此以全文引用的方式并入。

近膜结构域和终止转移序列

细胞外结构域和跨膜结构域，或跨膜结构域和细胞内结构域可以通过连接多肽，例如近膜结构域或终止转移序列(STS)相互连接。因此，近膜结构域可以存在于启动受体的细胞外部分或启动受体的细胞内部分中。

在一些实施方案中，启动受体还在跨膜结构域与细胞内结构域之间包含近膜结构域(JMD)。细胞内JMD也可称为终止转移序列(STS)。JMD/STS可包含带电的疏脂性序列。不受任何理论的束缚，JMD/STS用作膜锚，并且被认为可防止细胞内结构域进入质膜中。近膜结构域或终止转移序列在启动受体中的用途描述于WO2021061872中，该专利特此以全文引用的方式并入。在一些实施方案中，近膜结构域或终止转移序列相对于跨膜结构域而言是异源的。在一些实施方案中，近膜结构域或终止转移序列与跨膜结构域同源。

在一些实施方案中，近膜结构域选自由以下组成的组：PLXA2、NPTN、ALK、DSCAM、CD2、EPHA1、ERMAP、ERBB2、CEA20、KIRR1、C163A、PTPRF、CSPG4、SLAF1、TMIG3、NOTCH1或NOTCH2近膜结构域。在一些实施方案中，近膜结构域包含选自SEQ ID NO: 22-39中所示序列的序列。

在一些实施方案中，跨膜结构域和近膜结构域由以下组成的组合：NOTCH1-PLXA2、CLSTN1-CD2、NOTCH1-NPTN、NOTCH1-ALK、SNORC-NOTCH1、SEM4F-NOTCH2、STS-NOTCH2、MCP-NOTCH1、DCBD1-NOTCH2、IRAG1-C163A、HMR1-NOTCH1、MCP-NOTCH1、DISP1-NOTCH2、IRPL1-NOTCH1、ECSCR-NOTCH1、NOTCH1-PTPRF、NOTCH1-CSPG4、SEM4F-NOTCH2、IRAG1-CD2、SIGL9-CD2、IRAG1-NOTCH1、NOTCH1-SLAF1、NOTCH1-TMIG3、NOTCH1-C163A和PLXC1-EPHA1。

在一些实施方案中，跨膜结构域和近膜结构域包含选自SEQ ID NO: 40-57中所示序列的序列。在一些实施方案中，跨膜结构域和近膜结构域是由选自SEQ ID NO: 58-75中所示序列的核酸序列编码。

在一些实施方案中，启动受体包含在细胞外结构域与跨膜结构域之间的近膜结构域(JMD)肽。在一些实施方案中，启动受体包含在跨膜结构域与细胞内结构域之间的近膜结构域(JMD)肽。在一些实施方案中，JMD肽包含LWF基序。LWF基序在受体构建体中的用途描述于美国专利第10,858,443号中，该专利据此以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，JMD肽与Notchl、Notch2、Notch3和/或Notch4的JMD具有实质序列同一性。在一些实施方案中，JMD肽与Notchl、Notch2、Notch3和/或Notch4 JMD具有实质序列同一性，但不包括Notch受体的LIN-12-Notch重复序列(LNR)和/或异源二聚化结构域(HD)。在一些实施方案中，JMD肽与Notchl、Notch2、Notch3和/或Notch4 JMD不具有实质序列同一性。在一些实施方案中，JMD肽包括促进受体的二聚体、三聚体或更高级组合的形成的寡聚化结构域。此类JMD肽描述于WO2021061872中，该专利特此以全文引用的方式并入。

铰链

在一些实施方案中，启动受体还包含铰链。可用于启动受体中的铰链接头可以包括含有一个或多个通过分子间二硫键键合促进嵌合多肽的寡聚体形成的多肽基序的寡聚化结构域(例如，铰链结构域)。在这些情形中，在本文所公开的嵌合受体内，铰链结构域一般包括设置于ECD与TMD之间的柔性多肽连接区。因此，铰链结构域提供了ECD与TMD之间的柔性，并且还提供了供两个或更多个嵌合多肽单体之间的分子间二硫键键合以形成寡聚复合物的位点。在一些实施方案中，铰链结构域包括促进本文所公开的嵌合多肽的二聚体形成的基序。在一些实施方案中，铰链结构域包括促进本文所公开的嵌合多肽的三聚体形成的基序(例如，源自OX40的铰链结构域)。适用于本公开的组合物和方法的铰链多肽序列可以是天然存在的铰链多肽序列(例如，来自天然存在的免疫球蛋白的那些序列)或者可以经工程化、设计或修饰以提供所需的和/或改进的特性，例如，调节转录。适合铰链多肽序列包括但不限于源自IgA、IgD和IgG亚类的那些，诸如IgGl铰链结构域、IgG2铰链结构域、IgG3铰链结构域和IgG4铰链结构域，或它们的功能性变体。在一些实施方案中，铰链多肽序列含有一个或多个CXXC基序。在一些实施方案中，铰链多肽序列含有一个或多个CPPC基序(SEQ IDNO: 158)。

铰链多肽序列还可源自CD8α铰链结构域、CD28铰链结构域、CD152铰链结构域、PD-1铰链结构域、CTLA4铰链结构域、OX40铰链结构域，以及它们的功能性变体。在一些实施方案中，铰链结构域包括源自CD8 α铰链结构域或其功能性变体的铰链多肽序列。在一些实施方案中，铰链结构域包括源自CD8α铰链结构域或其功能性变体的铰链多肽序列。在一些实施方案中，铰链结构域包括源自截短的CD8α铰链结构域或其功能性变体的铰链多肽序列。在一些实施方案中，铰链结构域包括源自CD28铰链结构域或其功能性变体的铰链多肽序列。在一些实施方案中，铰链结构域包括源自OX40铰链结构域或其功能性变体的铰链多肽序列。在一些实施方案中，铰链结构域包括源自IgG4铰链结构域或其功能性变体的铰链多肽序列。

在一些实施方案中，启动受体铰链包含SEQ ID NO: 83中所示的序列。

细胞内结构域

在一些实施方案中，启动受体包含来自或源自转录调节因子和/或DNA结合结构域的一个或多个细胞内结构域。在一些实施方案中，细胞内结构域包含HNF1a/p65结构域或Gal4/VP64结构域。在一些实施方案中，细胞内结构域包含SEQ ID NO: 80、81或82中所示的序列。

转录调节因子激活或抑制同源启动子的转录。转录激活因子通常在转录启动子附近与其结合并募集RNA聚合酶以直接启始转录。转录抑制因子与转录启动子结合并在空间上阻碍RNA聚合酶的转录起始。其他转录调节因子根据其结合位置和细胞条件充当激活因子或抑制因子。因此，如本文所用，“转录激活结构域”是指与转录控制元件和/或转录调节蛋白(即，转录因子、RNA聚合酶等)相互作用以增加和/或激活一个或多个基因的转录的转录因子的结构域。转录激活结构域的非限制性实例包括：单纯疱疹病毒VP16激活结构域、VP64 (其为VP16的四聚体衍生物)、HIV TAT、NFkB p65激活结构域、p53激活结构域1和2、CREB (cAMP应答元件结合蛋白)激活结构域、E2A激活结构域、NFAT (活化T细胞核因子)激活结构域、酵母Gal4、酵母GCN4、酵母HAP1、MLL、RTG3、GLN3、OAF1、PIP2、PDR1、PDR3、PHO4、LEU3糖皮质激素受体转录激活结构域、B细胞POU同源结构域蛋白Oct2、植物Ap2或本领域技术人员或普通技术人员已知的任何其他结构域。在一些实施方案中，转录调节因子选自Gal4-VP16、Gal4-VP64、tetR-VP64、ZFHD1-YP64、Gal4-KRAB和HAP1-VP16。在一些实施方案中，转录调节因子是Gal4-VP64。转录激活结构域可以包含野生型或天然存在的序列，或者它可以是原始转录激活结构域的修饰、突变或衍生型式，具有所需的增加和/或激活一个或多个基因的转录的能力。在一些实施方案中，转录调节因子还可包括核定位信号。

在一些实施方案中，启动受体包含一个或多个细胞内“DNA结合结构域”(或“DB结构域”)。此类“DNA结合结构域”是指结合特定DNA序列元件的序列特异性DNA结合结构域。因此，如本文所用，“序列特异性DNA结合结构域”是指具有选择性地结合具有特定预定序列的DNA的能力的蛋白质结构域部分。序列特异性DNA结合结构域可以包含野生型或天然存在的序列，或者它可以是原始结构域的具有结合所需序列的所需能力的修饰、突变或衍生型式。在一些实施方案中，序列特异性DNA结合结构域经工程化以结合所需序列。可用于本文所述的合成蛋白质中的具有序列特异性DNA结合结构域的蛋白质的非限制性实例包括HNF1a、Gal4、GCN4、反向四环素受体、THY1、SYN1、NSE/RU5′、AGRP、CALB2、CAMK2A、CCK、CHAT、DLX6A、EMX1、锌指蛋白或其结构域、CRISPR/Cas蛋白，诸如Cas9、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e (或CasD)、Cash、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas10、Cas10d、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1 (或CasA)、Cse2 (或CasB)、Cse3 (或CasE)、Cse4 (或CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csz1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4，和Cu196，以及TALES。

在使用CRISPR/Cas样蛋白的那些实施方案中，CRISPR/Cas样蛋白可以是野生型CRISPR/Cas蛋白、修饰的CRISPR/Cas蛋白，或野生型或修饰的CRISPR/Cas蛋白的片段。CRISPR/Cas样蛋白可经修饰以增加核酸结合亲和力和/或特异性，改变酶活性，并且/或者改变蛋白质的另一特性。例如，CRISPR/Cas样蛋白的核酸酶(即，DNase、RNase)结构域可以被修饰、缺失或失活。或者，CRISPR/Cas样蛋白可被截短以去除对本文所述系统的功能而言不是必需的结构域。例如，用作DNA结合蛋白或其结构域的CRISPR酶可以相对于相应的野生型酶发生突变，使得突变的CRISPR或其结构域缺乏裂解含有DNA结合结构域靶位点的核酸序列的能力。例如，D10A突变可以与H840A、N854A或N863A突变中的一者或多者组合以产生大体上缺乏所有DNA裂解活性的Cas9酶。

嵌合抗原受体

在另一方面，本文提供了包含启动受体和嵌合抗原受体的系统，所述嵌合抗原受体包含细胞外抗原结合结构域。受体(诸如CAR)的抗原识别结构域可以连接至一种或多种细胞内信号传导组分，诸如在CAR的情况下模拟通过抗原受体复合物(诸如TCR复合物)激活的信号传导组分，和/或通过另一细胞表面受体进行信号传导。因此，在一些实施方案中，细胞外结合组分(例如，配体结合或抗原结合结构域)连接至一个或多个跨膜和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域与细胞外结构域融合。在一个实施方案中，使用天然与受体(例如，CAR)中的结构域之一相缔合的跨膜结构域。在一些情况下，通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，从而最大限度地减少与受体复合物的其他成员的相互作用。

在一些方面，嵌合抗原受体包括包含本文所述的抗原结合结构域的细胞外部分和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv、VH或单结构域VH抗体并且细胞内结构域含有ITAM。在一些方面，细胞内信号传导结构域包括CD3ζ (CD3)链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括连接细胞外结构域和细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。

在另一方面，本文提供了嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含特异性结合至间皮素(MSLN)的细胞外抗原结合结构域。重组CAR可以是包含完全人序列(例如天然人序列)的人CAR。

在一些方面，跨膜结构域含有CD8a或CD28的跨膜部分。细胞外结构域和跨膜可以直接或间接连接。在一些实施方案中，细胞外结构域和跨膜通过间隔区，诸如本文所述的任何间隔区连接。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域，诸如在跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间。在一些方面，T细胞共刺激分子是CD28或4-1BB。

CAR细胞外结构域

在一些实施方案中，CAR细胞外结构域包括受体的配体或抗原结合部分。在一些实施方案中，CAR细胞外结构域包括结合至一种或多种靶抗原的抗原结合部分。在一些实施方案中，CAR细胞外结构域包含用于结合一种或多种靶抗原的构件。在一些实施方案中，用于结合一种或多种靶抗原的构件包含抗体和抗原结合片段或其等效物。在一些实施方案中，抗原结合部分包括抗体或其功能性抗原结合片段的一个或多个抗原结合决定簇。在一些实施方案中，抗原结合部分选自抗体、纳米抗体、双抗体、三抗体或微型抗体、F(ab')2片段、Fab片段、单链可变片段(scFv)和单结构域抗体(sdAb)或其功能性片段。在一些实施方案中，抗原结合部分包含scFv。抗原结合部分可以包括天然存在的氨基酸序列或者可经历工程化、设计或修饰以提供所需的和/或改进的特性，例如增加的结合亲和力。

在一些实施方案中，本文所公开的CAR包含细胞外结构域，所述细胞外结构域特异性结合CD19；间皮素(MSLN)；胎盘/生殖细胞型碱性磷酸酶(ALPG/P)；表皮生长因子受体(EGFR)；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1 (又称为CD2亚群1、CRACC、SLAMF7、CD319和19A24)；C型凝集素样分子1 (CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III (EGFRvIII)；神经节苷脂G2 (GD2)；神经节苷脂GD3 (aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟抗原(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；类受体酪氨酸激酶孤儿受体1 (ROR1)；类Fms酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72 (TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3 (CD276)；KIT (CD117)；白细胞介素-13受体亚基α-2 (IL-13Ra2或CD213A2)；白细胞介素11受体α (IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾丸素或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2)；路易斯(Y)抗原；CD24；血小板源性生长因子受体β (PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4 (SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2 (Her2/neu)；细胞表面相关粘蛋白1 (MUC1)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变型延伸因子2 (ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞激活蛋白α (FAP)；类胰岛素生长因子1受体(IGF-I受体)；碳酸酐酶IX (CAIX)；蛋白酶体(Prosome、Macropain) β型亚基9 (LMP2)；糖蛋白100 (gp100)；由断裂点簇区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒癌基因同源物1 (Abl)组成的癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2 (EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酰化路易斯粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3 (aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；谷氨酰胺转胺酶5 (TGS5)；高分子量黑色素瘤相关抗原(HMWMAA)；邻乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标记物1 (TEM1/CD248)；肿瘤内皮标记物相关蛋白7 (TEM7R)；密封蛋白6 (CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5族成员D (GPRC5D)；X染色体开放阅读框61 (CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；多聚唾液酸；胎盘特异性蛋白1 (PLAC1)；Globo H糖鞘脂的六糖部分(GloboH)；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿路上皮分化蛋白2 (UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1 (HAVCR1)；肾上腺素受体β3 (ADRB3)；泛连接蛋白3 (PANX3)；G蛋白偶联受体20 (GPR20)；淋巴细胞抗原6复合体基因座K9 (LY6K)；嗅觉受体51E2 (OR51E2)；TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)；威尔姆氏肿瘤蛋白(WT1)；癌症/睾丸抗原1 (NY-ESO-1)；癌症/睾丸抗原2 (LAGE-1a)；黑色素瘤相关抗原1 (MAGE-A1)；位于染色体12p上的ETS易位变体基因6 (ETV6-AML)；精子蛋白17 (SPA17)；X抗原家族成员1A (XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2 (Tie 2)；黑色素瘤癌症睾丸抗原-1 (MAD-CT-1)；黑色素瘤癌症睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53 (p53)；p53突变体；存活素；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1 (PCTA-1或半乳糖凝集素8)，即由T细胞识别之黑色素瘤抗原1 (MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断裂点；黑色素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG (跨膜丝氨酸蛋白酶2 (TMPRSS2) ETS融合基因)；N-乙酰基葡糖氨基转移酶V (NA17)；配对盒蛋白Pax-3 (PAX3)；雄激素受体；细胞周期素B1；v-myc禽类成髓细胞瘤病毒癌基因神经母细胞瘤源性同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C (RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2 (TRP-2)；细胞色素P450 1B1 (CYP1B1)；类CCCTC结合因子(锌指蛋白)(BORIS或印记位点调节因子的兄弟蛋白)，由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3 (SART3)；配对盒蛋白Pax-5 (PAX5)；前顶体素结合蛋白sp32 (OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；A激酶锚定蛋白4 (AKAP-4)；滑膜肉瘤X断裂点2 (SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾泛在蛋白1 (RU1)；肾泛在蛋白2 (RU2)；天冬酰胺内肽酶；人乳头瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头瘤病毒E7 (HPV E7)；肠道羧酸酯酶；突变型热休克蛋白70-2 (muthsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关免疫球蛋白样受体1 (LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2 (LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A (CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2 (BST2)；含EGF样模体的粘蛋白样激素样受体2 (EMR2)；淋巴细胞抗原75 (LY75)；糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白聚糖-3 (GPC3)；Fc受体样蛋白5 (FCRL5)；或免疫球蛋白λ样多肽1 (IGLL1)。

在一些实施方案中，本文所公开的CAR包含特异性结合间皮素(MSLN，UniProtKB -H3BR90)的细胞外结构域。本领域已知各种间皮素抗体或抗原片段，包括但不限于WO2006099141A2、US20170267755A1、美国专利号8,206,710、美国专利号9,023,351、美国专利号9,416,190和美国专利号7,943,133中公开的抗间皮素(MSLN)抗体和抗原结合片段，各专利的公开内容特此以全文引用的方式并入。

嵌合抗原受体CDR、VH、VL结构域

在一些方面，启动受体细胞外抗原结合结构域包含：可变重(VH)链序列，所述VH链序列包含三个重链CDR序列CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；和可变轻(VL)链序列，所述VL链序列包含三个轻链CDR序列CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3，其中：CDR-H1包含SEQ ID NO: 133、141、142、143或144中所示的序列，CDR-H2包含SEQ ID NO: 134、145、146、147或148中所示的序列，CDR-H3包含SEQ ID NO: 135、149或150中所示的序列，CDR-L1包含SEQ ID NO: 137、151或152中所示的序列，CDR-L2包含SEQ ID NO: 138或153中所示的序列，并且CDR-L3包含SEQID NO: 139或154中所示的序列。在一些实施方案中，VH链序列包含SEQ ID NO: 136中所示的序列。在一些实施方案中，VL包含SEQ ID NO: 140中所示的序列。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含SEQ ID NO: 78中所示的序列。

在一些实施方案中，CAR细胞外抗原结合结构域CDR-H3与SEQ ID NO: 135、149或150的CDR-H3具有至少约50%、75%、80%、85%、90%或95%同一性，CDR-H2与SEQ ID NO: 134、145、146、147或148的CDR-H2具有至少约50%、75%、80%、85%、90%或95%同一性，CDR-H1与SEQID NO: 133、141、142、143或144的CDR-H1具有至少约50%、75%、80%、85%、90%或95%同一性，CDR-L3与SEQ ID NO: 139或154的CDR-L3具有至少约50%、75%、80%、85%、90%或95%同一性，CDR-L2与SEQ ID NO: 138或153的CDR-L2具有至少约50%、75%、80%、85%、90%或95%同一性，并且CDR-L1与SEQ ID NO: 137、151或152的CDR-L1具有至少约50%、75%、80%、85%、90%或95%同一性。在一些实施方案中，CDR-H3是SEQ ID NO: 135、149或150的CDR-H3，具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；CDR-H2是SEQ ID NO: 134、145、146、147或148的CDR-H2，具有多达1、2、3、4、5、6、7或8个氨基酸取代；CDR-H1是SEQ ID NO: 133、141、142、143或144的CDR-H1，具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代；CDR-L3是SEQ ID NO: 139或154的CDR-L3，具有多达1、2、3、4或5个氨基酸取代；CDR-L2是SEQ ID NO: 138或153的CDR-L2，具有多达1、2、3或4个氨基酸取代；并且CDR-L1是SEQ ID NO: 137、151或152的CDR-L1，具有多达1、2、3、4、5或6个氨基酸取代。

在一些实施方案中，本文提供的CAR细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO: 136中所示VH结构域的一个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含SEQ ID NO: 136中所示VH结构域的两个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含SEQ ID NO: 136中所示VH结构域的三个CDR。在一些方面，CDR是Kabat CDR。在一些方面，CDR是Chothia CDR。在一些方面，CDR是AbM CDR。在一些方面，CDR是ContactCDR。在一些方面，CDR是IMGT CDR。

在一些实施方案中，本文提供的CAR细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:136中所示VH序列具有至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%同一性的VH序列。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含SEQ ID NO: 136中所提供的VH序列，具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，本段中描述的抗原结合结构域在本文中称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体并非来源于本文所提供的序列，并且可例如根据本文所提供的用于获得抗体或抗原结合结构域的方法重新分离。

在一些实施方案中，本文提供的CAR细胞外抗原结合结构域包含SEQ ID NO: 140中所示VL结构域的一个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含SEQ ID NO: 140中所示VL结构域的两个至三个CDR。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含如SEQ ID NO: 140中所示VL结构域的三个CDR。在一些方面，CDR是KabatCDR。在一些方面，Kabat VH CDR是以SEQ ID NO: 133、134和135所示的序列提供，并且Kabat VL CDR是以SEQ ID NO: 137、138和139所示的序列提供。在一些方面，CDR是ChothiaCDR。在一些方面，Chothia VH CDR是以SEQ ID NO: 141、145和135所示的序列提供，并且Chothia VL CDR是以SEQ ID NO: 137、138和139所示的序列提供。在一些方面，CDR是AbMCDR。在一些方面，AbM VH CDR是以SEQ ID NO: 142、146和135所示的序列提供，并且AbM VLCDR是以SEQ ID NO: 137、138和139所示的序列提供。在一些方面，CDR是Contact CDR。在一些方面，Contact VH CDR是以SEQ ID NO: 143、147和149所示的序列提供，并且Contact VLCDR是以SEQ ID NO: 151、153和154所示的序列提供。在一些方面，CDR是IMGT CDR。在一些方面，IMGT VH CDR是以SEQ ID NO: 144、147和149所示的序列提供，并且IMGT VL CDR是以SEQ ID NO: 152和139所示的序列以及序列DT提供。

在一些实施方案中，本文提供的CAR细胞外抗原结合结构域包含与SEQ ID NO:140中所示VL序列具有至少约50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%同一性的VL序列。在一些实施方案中，本文提供的抗原结合结构域包含SEQ ID NO: 140中所提供的VL序列，具有多达1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个或25个氨基酸取代。在一些方面，氨基酸取代是保守性氨基酸取代。在一些实施方案中，本段中描述的抗体在本文中称为“变体”。在一些实施方案中，此类变体例如通过亲和力成熟、定点诱变、随机诱变或本领域中已知或本文所述的任何其他方法来由本文提供的序列获得。在一些实施方案中，此类变体并非来源于本文所提供的序列，并且可例如根据本文所提供的用于获得抗体或抗原结合结构域的方法重新分离。

表D提供了根据指定编号方案的SEQ ID NO: 136的VH和SEQ ID NO: 140的VL的例示性MSLN抗原结合结构域CDR序列。

CAR跨膜结构域

在一些实施方案中，跨膜结构域源自天然来源或合成来源。在天然来源的情况下，在一些方面结构域源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括源自(即，至少包含以下的跨膜区) T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CDS，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD 134，CD137和/或CD154的跨膜区。或者，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成的跨膜结构域主要包含疏水性残基，诸如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体将存在于合成的跨膜结构域的每一端。在一些实施方案中，连接是通过接头、间隔区和/或跨膜结构域完成的。

在一些实施方案中，受体(例如，CAR)的跨膜结构域是人CD28或其变体的跨膜结构域，例如人CD28 (登录号：P10747.1)的27个氨基酸的跨膜结构域。

在一些实施方案中，CAR包含CD8a TMD。在一些实施方案中，CD8a TMD包含SEQ IDNO: 85中所示的序列。

CAR铰链

在一些实施方案中，CAR还包括间隔区，所述间隔区可以是或包括免疫球蛋白恒定区或其变体或修饰型式的至少一部分，诸如铰链区(例如CD8a铰链、IgG4铰链区)，和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，恒定区或部分属于人IgG，诸如IgG4或IgG1。在一些方面，恒定区的部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔区。与不存在间隔区的情况相比，间隔区的长度可增加细胞在抗原结合后的应答性。在一些实例中，间隔区的长度为或约为12个氨基酸，或者长度不超过12个氨基酸。示例性间隔区包括具有至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸、约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸，或约10至15个氨基酸(并且包括任何所列范围的端点之间的任何整数)的那些。在一些实施方案中，间隔区具有约12个或更少的氨基酸、约119个或更少的氨基酸，或约229个或更少的氨基酸。示例性间隔区包括CD8a铰链、单独的IgG4铰链、连接至CH2和CH3结构域的IgG4铰链，或连接至CH3结构域的IgG4铰链。示例性间隔区包括但不限于Hudecek等人(2013) Clin. Cancer Res., 19:3153或国际专利申请公布第WO2014031687号中描述的间隔区。在一些实施方案中，CAR铰链包括CD8a铰链。在一些实施方案中，CD8a铰链包含SEQ ID NO: 84中所示的序列。

在细胞内信号传导结构域中，有通过天然抗原受体模拟或近似信号、通过这种受体与共刺激受体的组合模拟或近似信号和/或通过单独的共刺激受体模拟或近似信号的那些。在一些实施方案中，存在短的寡肽或多肽接头，例如长度为2与10个氨基酸之间的接头，诸如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体，并且所述接头在受体的跨膜结构域与细胞质信号传导结构域之间形成连接。

CAR细胞内结构域

在一些实施方案中，在连结CAR后，受体的细胞质结构域或细胞内信号传导结构域激活免疫细胞(例如，经工程化以表达受体的T细胞)的至少一种正常效应功能或应答。例如，在一些情形下，受体诱导T细胞的功能，诸如细胞溶解活性或T辅助细胞活性，诸如分泌细胞因子或其他因子。在一些实施方案中，例如，如果抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导结构域的截短部分转导效应功能信号，则使用其替代完整的免疫刺激链。在一些实施方案中，一个或多个细胞内信号传导结构域包括T细胞受体(TCR)的细胞质序列，并且在一些方面还包括在自然环境中与所述受体协同作用以在抗原受体接合后启始信号转导的共受体的细胞质序列，和/或此类分子的任何衍生物或变体，和/或具有相同功能能力的任何合成序列。

在一些方面，受体包括调控TCR复合物的初级激活的初级细胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的初级细胞质信号传导序列可含有信号传导基序，该基序称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括源自TCR或CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。在一些实施方案中，CAR中的细胞质信号传导分子含有细胞质信号传导结构域、其部分或源自CD3ζ的序列。

在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含人CD3ζ刺激性信号传导结构域或其功能性变体，诸如人CD3ζ (登录号：P20963.2)的同种型3的112 AA细胞质结构域或如美国专利第7,446,190号或美国专利第8,911,993号中描述的CD3ζ信号传导结构域。

受体，例如CAR，可以包括至少一种细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，受体包括TCR复合物的细胞内组分，诸如介导T细胞激活和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，细胞外结构域连接至一个或多个细胞信号传导模块。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，受体，例如CAR，还包括一种或多种另外分子(诸如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，CAR包括在CD3ζ或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。在一些实施方案中，CAR包含CD3ζ激活结构域，所述CD3ζ激活结构域包含SEQ ID NO: 87中所示的序列。

在一些实施方案中，细胞内结构域包含41BB或其功能性变体或部分的细胞内共刺激信号传导结构域，诸如人4-1BB (登录号Q07011.1)或其功能性变体或部分的含42个氨基酸的细胞质结构域。

在一些实施方案中，受体在细胞质部分包含一个或多个，例如两个或更多个共刺激结构域和激活结构域，例如初级激活结构域。示例性受体包括CD3ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。在一些方面，T细胞共刺激分子是4-1BB。

在一些实施方案中，受体包括共刺激受体(诸如CD28、4-1BB、OX40、DAP10和ICOS)的信号传导结构域和/或跨膜部分。在一些方面，同一受体包括激活性组分和共刺激组分两者。

在某些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含连接至CD3 (例如，CD3ζ)细胞内结构域的CD8a跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含连接至CD3ζ细胞内结构域的4-1BB (CD137，TNFRSF9)共刺激结构域。在一些实施方案中，CAR包含4-1BB共刺激结构域。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构域包含SEQ ID NO: 86中所示的序列。

在一些实施方案中，CAR或其他抗原受体还包括标志物，诸如细胞表面标志物，所述标志物可用于确认细胞的转导或工程化以表达受体，诸如细胞表面受体的截短型式，诸如截短的EGFR (tEGFR)。在一些方面，标志物包括CD34、神经生长因子受体(NGFR)或表皮生长因子受体(例如，tEGFR)的全部或部分(例如，截短形式)。在一些实施方案中，编码标志物的核酸可操作地连接至编码接头序列(诸如可裂解的接头序列或核糖体跳跃序列例如T2A)的多核苷酸。参见WO2014031687。在一些实施方案中，引入编码由T2A核糖体开关分隔开的CAR和EGFRt的构建体可以表达来自同一构建体的两种蛋白质，使得EGFRt可以用作检测表达这种构建体的细胞的标志物。在一些实施方案中，标志物和任选的接头序列可以是如公布的专利公布第WO2014031687号中所公开的任何标志物和接头序列。例如，标志物可以是截短的EGFR (tEGFR)，其任选地连接至接头序列，诸如T2A核糖体跳跃序列。

在一些实施方案中，标志物是分子，例如细胞表面蛋白，非天然存在于T细胞上或非天然存在于T细胞表面上，或其部分。

在一些实施方案中，分子是非自身分子，例如非自身蛋白质，即不被细胞将过继转移到其中的宿主的免疫系统识别为“自身”的分子。

在一些实施方案中，标志物不提供治疗性功能和/或不产生别的作用，除了用作基因工程化的标志物，例如，用于选择成功工程化的细胞。在其他实施方案中，标志物可以是治疗性分子或以其他方式发挥某些所需作用的分子，诸如在体内遇到的细胞的配体，诸如增强和/或阻抑细胞在过继转移和遇到配体后的应答的共刺激或免疫检查点分子。

CAR可包含一个或修饰的合成氨基酸来代替一个或多个天然存在的氨基酸。示例性的修饰的氨基酸包括但不限于氨基环己烷羧酸、正亮氨酸、α-氨基正癸酸、高丝氨酸、S-乙酰氨基甲基半胱氨酸、反式-3-羟脯氨酸和反式-4-羟脯氨酸、4-氨基苯丙氨酸、4-硝基苯丙氨酸、4-氯苯丙氨酸、4-羧基苯丙氨酸、(3-苯基丝氨酸(3-羟基苯丙氨酸、苯基甘氨酸、α-萘基丙氨酸、环己基丙氨酸、环己基甘氨酸、二氢吲哚-2-羧酸、1,2,3,4-四氢异喹啉-3-羧酸、氨基丙二酸、氨基丙二酸单酰胺、N'-苄基-N'-甲基-赖氨酸、N',N'-二苄基-赖氨酸、6-羟赖氨酸、鸟氨酸、α-氨基环戊烷羧酸、α-氨基环己烷羧酸、α-氨基环庚烷羧酸、α-(2-氨基-2-降冰片烷)-羧酸、α,γ-二氨基丁酸、α,γ-二氨基丙酸、高苯丙氨酸和α-叔丁基甘氨酸。

例如，在一些实施方案中，CAR包括抗体或其片段，包括本文所述的单链抗体(sdAb，例如仅含有VH区)、VH结构域和scFv；间隔区，诸如CD8a铰链；CD8a跨膜结构域；4-1BB细胞内信号传导结构域；和CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包括抗体或片段，包括本文所描述的sdAb和scFv；间隔区，诸如CD8a铰链；CD8a跨膜结构域；4-1BB细胞内信号传导结构域；以及CD3ζ信号传导结构域。

可以使用例如位点特异性技术将表达启动受体和CAR系统的转基因引入细胞(诸如T细胞)中。通过转基因(例如启动受体和CAR)的位点特异性整合，转基因可以靶向安全性港基因座或TRAC。有关整合到安全港基因座中的位点特异性技术的实例包括但不限于使用核酸酶进行的同源依赖性工程化和使用Cas9进行的同源非依赖性靶向插入。

工程化细胞可应用于免疫肿瘤学。例如，可以选择启动受体和CAR来靶向不同的特定肿瘤抗原。可以使用此类细胞有效靶向的癌症的实例是血癌或实体癌。在一些实施方案中，免疫细胞疗法可用于治疗实体瘤。

在一些实施方案中，CAR包含SEQ ID NO: 79中所示的序列。

重组核酸和载体

在一些实施方案中，本公开涵盖重组核酸插入物，所述重组核酸插入物包含编码本文所描述的启动受体和/或CAR的一个或多个转基因。在一些实施方案中，插入物编码启动受体转基因。在一些实施方案中，插入物编码嵌合抗原受体转基因。在一些实施方案中，插入物包含启动受体转基因和嵌合抗原受体转基因。

插入物还可以包含自裂解肽。自裂解肽的实例包括但不限于自裂解病毒2A肽，例如猪捷申病毒1 (P2A)肽、明脉扁刺蛾病毒(T2A)肽、马鼻炎A病毒(E2A )肽或口蹄疫病毒(F2A)肽。自裂解2A肽允许从单个构建体表达多个基因产物。(参见，例如，Chang等人“Cleavage efficient 2A peptides for high level monoclonal antibody expressionin CHO cells,”MAbs7(2): 403-412 (2015))。

插入物还可以包含WPRE元件。WPRE元件总体上描述于Higashimoto, T.等人,Gene Ther 14, 1298-1304 (2007)；以及Zufferey, R.等人, J Virol. 1999年4月;73(4):2886-92.，两者据此以引用的方式并入。

重组细胞

本文还提供了重组免疫细胞，所述重组免疫细胞包含至少一个DNA模板，所述至少一个DNA模板以非病毒方式插入细胞的基因组靶区中，其中DNA模板编码本文所描述的启动受体和CAR系统。本文还提供了重组免疫细胞，所述重组免疫细胞包含特异性结合胎盘/生殖细胞碱性磷酸酶(ALPG/P)的启动受体，以及特异性结合MSLN的嵌合抗原受体。

本公开所描述的在靶基因座或安全港位点处包含DNA模板插入物的细胞可称为工程化细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是可以产生多能免疫细胞的任何细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是原代免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞可以是诱导型多能干细胞(iPSC)或人多能干细胞(HSPC)。在一些实施方案中，免疫细胞包含原代造血细胞或原代造血干细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是干细胞、人细胞、原代细胞、造血细胞、适应性免疫细胞、先天免疫细胞、自然杀伤(NK)细胞、T细胞、CD8+细胞、CD4+细胞或T细胞祖细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是调节性T细胞、效应T细胞或幼稚T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD8⁺T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4⁺T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4⁺CD8⁺T细胞。

在一些实施方案中，工程化细胞是干细胞、人细胞、原代细胞、造血细胞、造血干细胞、适应性免疫细胞、先天免疫细胞、T细胞或T细胞祖细胞。本公开中设想的免疫细胞的非限制性实例包括T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、NKT/iNKT细胞、巨噬细胞、骨髓细胞和树突细胞。涵盖于本公开中的干细胞的非限制性实例包括多能干细胞(PSC)、胚胎干细胞(ESC)、诱导性多能干细胞(iPSC)、通过核移植获得的胚胎源性胚胎干细胞(ntES；核移植ES)、雄性生殖干细胞(GS细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、造血干细胞/祖细胞干细胞(HSPC)、体细胞干细胞(成体干细胞)、成血管细胞、神经干细胞、间充质干细胞和其他细胞(包括骨细胞、软骨细胞、肌细胞、心肌细胞、神经元、肌腱细胞、脂肪细胞、胰腺细胞、肝细胞、肾细胞和滤泡细胞等)的干细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是T细胞、NK细胞、iPSC和HSPC。在一些实施方案中，本公开中使用的工程化细胞是体外生长的人细胞系(例如，故意永生化的细胞系、癌细胞系等)。

本文还提供了包含多个免疫细胞的细胞群体。在一些实施方案中，细胞的至少20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、99%或更多的基因组包含本文所描述的启动受体和CAR。

治疗癌症的方法

在另一方面，本文提供了治疗个体的免疫相关疾患(例如癌症)的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含系统的组合物，所述系统包含：启动受体，所述启动受体包含本文所公开的TMD和JMD；以及嵌合抗原受体。在另一方面，本文提供了增强个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含系统的组合物，所述系统包含本文所公开的TMD和JMD；以及嵌合抗原受体。在另一方面，本文提供了诱导个体的免疫细胞(例如T细胞)的细胞溶解活性的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的包含系统的组合物，所述系统包含本文所公开的TMD和JMD，以及嵌合抗原受体。在一些实施方案中，启动受体特异性结合ALPG/P，并且嵌合抗原受体特异性结合至MSLN。

在一些实施方案中，本文提供的方法可用于治疗个体的免疫相关疾患。在一个实施方案中，个体是人。

在一些实施方案中，本文提供的方法(诸如增强免疫应答的方法)可用于治疗癌症，并因此，接受本文所描述的系统的个体患有癌症。在一些实施方案中，癌症是实体癌症。在一些实施方案中，癌症是液体癌症。在一些实施方案中，癌症是免疫逃避性的。在一些实施方案中，癌症是免疫应答性的。在特定实施方案中，癌症是卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、子宫癌、间皮瘤、宫颈癌或胰腺癌。在特定实施方案中，癌症是卵巢癌。

在一些实施方案中，治疗导致癌症体积或大小的减小。在一些实施方案中，与施用抗体之前的癌症体积相比，治疗有效减小癌症体积。在一些实施方案中，治疗导致癌症生长速率降低。在一些实施方案中，与施用抗体之前的癌症生长速率相比，治疗有效降低癌症生长速率。在一些实施方案中，治疗有效消除癌症。

在一些实施方案中，与非癌症细胞相比，启动受体抗原靶(例如启动受体细胞外结构域所结合的抗原)和CAR抗原靶(例如CAR细胞外结构域所结合的抗原)在癌症中以更高的水平表达。在一些实施方案中，与非癌症细胞相比，MSLN和ALPG或ALPP在癌症中以更高的水平表达。MSLN和ALPG/ALPP等启动受体和CAR抗原靶的水平可以通过本领域中已知的任何技术来评估，包括但不限于蛋白质测定或核酸测定，诸如FACS、蛋白质印迹、ELISA、免疫沉淀、免疫组织化学、免疫荧光、放射免疫测定、斑点印迹、免疫检测方法、HPLC、表面等离子体共振、光学光谱法、质谱法、HPLC、qPCR、RT-qPCR、多重qPCR或RT-qPCR、RNA-seq、微阵列分析、SAGE、MassARRAY技术和FISH，以及它们的组合。

免疫调节方法

施用包含系统的细胞的方法可引起免疫应答的调节，所述系统包括本文所公开的包含TMD和JMD的启动受体以及本文所描述的嵌合抗原受体。在一些实施方案中，所述系统包含特异性结合至ALPG/P的启动受体和特异性结合至MSLN的嵌合抗原受体。调节可以是免疫应答的增加或减少。在一些实施方案中，调节是免疫应答增加。

在一方面，施用包含系统的细胞可引起促炎性分子(诸如细胞因子或趋化因子)的诱导，所述系统包括本文所公开的包含TMD和JMD的启动受体，以及嵌合抗原受体。在一些实施方案中，所述系统包含特异性结合至ALPG/P的启动受体和特异性结合至MSLN的嵌合抗原受体。一般来说，诱导的促炎性分子的存在水平高于同种型对照所达到的水平。此类促炎性分子又引起抗肿瘤免疫的激活，包括但不限于T细胞激活、T细胞增殖、T细胞分化、M1样巨噬细胞激活和NK细胞激活。因此，施用系统可以诱导多种抗肿瘤免疫机制，从而引起肿瘤破坏，所述系统包含本文所公开的TMD和JMD，以及嵌合抗原受体。

在另一方面，本文提供了增加个体的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用有效量的细胞，所述细胞包含本文所公开的TMD和JMD，以及嵌合抗原受体。在一些实施方案中，增加受试者的免疫应答的方法包括向所述受试者施用包含系统的细胞，所述系统包含本文所公开的TMD和JMD，以及嵌合抗原受体。在一些实施方案中，启动受体特异性结合至ALPG/P，并且嵌合抗原受体特异性结合至MSLN。

在一些实施方案中，细胞存在于药物组合物中，所述药物组合物还包含药学上可接受的赋形剂。

在本文所描述的增加免疫应答的任何和所有方面，一个或多个特征或功能方面的任何增加或减少或改变都是相较于不包含组合物的细胞而言的，所述组合物包含系统，所述系统包含本文所公开的TMD和JMD，以及嵌合抗原受体。

增加免疫应答可以是增强免疫应答或诱导免疫应答。例如，增加免疫应答涵盖起始或引发免疫应答，或者加强或放大正在进行或现有的免疫应答。在一些实施方案中，治疗诱导免疫应答。在一些实施方案中，诱导的免疫应答是适应性免疫应答。在一些实施方案中，诱导的免疫应答是先天性免疫应答。在一些实施方案中，治疗将增强免疫应答。在一些实施方案中，增强的免疫应答是适应性免疫应答。在一些实施方案中，增强的免疫应答是先天性免疫应答。在一些实施方案中，治疗将增加免疫应答。在一些实施方案中，增加的免疫应答是适应性免疫应答。在一些实施方案中，增加的免疫应答是先天免疫应答。在一些实施方案中，免疫应答是通过施用包含系统的细胞来起始或引发，所述系统包含特异性结合至ALPG/P的启动受体和特异性结合至MSLN的嵌合抗原受体。在一些实施方案中，免疫应答是通过施用包含系统的细胞来增强，所述系统包含特异性结合至ALPG/P的启动受体和特异性结合至MSLN的嵌合抗原受体。

在另一方面，本申请提供了用系统对细胞进行基因编辑，从而调节细胞的免疫功能的方法，所述系统包含特异性结合至ALPG/P的启动受体和特异性结合至MSLN的嵌合抗原受体。所述调节可以增加免疫应答。在一些实施方案中，调节是免疫功能的增加。在一些实施方案中，功能的调节导致MSLN CAR的表达。在一些实施方案中，功能的调节导致包含该系统的细胞的激活。

在一些实施方案中，所述细胞是自然杀伤(NK)细胞、T细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、原代T细胞或T细胞祖细胞。

在一些实施方案中，对包含如本文所述的启动受体和CAR系统的细胞的功能的调节导致细胞刺激天然和活化T细胞的能力增加，方式是例如增加表达启动受体和CAR系统的细胞的细胞因子或趋化因子分泌。在一些实施方案中，功能的调节增强或增加细胞产生细胞因子、趋化因子、CAR或共刺激或激活受体的能力。在一些实施方案中，所述调节增加表达启动受体和CAR系统的细胞的T细胞刺激功能，包括例如细胞触发T细胞受体(TCR)信号传导、T细胞增殖或T细胞细胞因子产生的能力。

在一些实施方案中，增加的免疫应答是细胞因子和趋化因子的分泌。在一些实施方案中，与同种型对照细胞相比，启动受体和CAR系统诱导细胞中至少一种细胞因子或趋化因子的表达增加。在一些实施方案中，所述至少一种细胞因子或趋化因子选自由以下组成的组：IL-2和IFNg。在一些实施方案中，细胞因子或趋化因子是IL-2。在一些实施方案中，细胞因子或趋化因子是IFNg。在一些实施方案中，与未处理的细胞或用同种型对照抗体处理的细胞相比，细胞因子或趋化因子分泌增加约1-100倍，1倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1-10倍、10-20倍、20-30倍、30-40倍、40-50倍、50-60倍、60-70倍、70-80倍、80-90倍或90-100倍。在一些实施方案中，趋化因子是IL-2，并且与未处理的细胞或用同种型对照抗体处理的细胞相比，分泌增加约1-100倍，1倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1-10倍、10-20倍、20-30倍、30-40倍、40-50倍、50-60倍、60-70倍、70-80倍、80-90倍或90-100倍。在一些实施方案中，细胞因子是IFNg，并且与未处理的细胞或用同种型对照抗体处理的细胞相比，分泌增加约1-100倍，1倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、1-10倍、10-20倍、20-30倍、30-40倍、40-50倍、50-60倍、60-70倍、70-80倍、80-90倍或90-100倍。

在一些实施方案中，增加的免疫应答是抗肿瘤免疫细胞募集和激活。

在一些实施方案中，与同种型对照细胞相比，表达启动受体和CAR系统的细胞诱导记忆免疫应答。一般来说，记忆免疫应答是免疫系统在随后暴露于先前遇到的病原体或抗原后产生的保护性免疫应答。示例性记忆免疫应答包括感染或疫苗接种抗原后的免疫应答。一般来说，记忆免疫应答是由T细胞或B细胞等淋巴细胞介导的。在一些实施方案中，记忆免疫应答是针对癌症，包括针对癌细胞生长、增殖或转移的保护性免疫应答。在一些实施方案中，记忆免疫应答抑制、预防或减少癌细胞生长、增殖或转移。

编辑细胞的方法

如本文所用，术语“基因编辑”或“基因组编辑”是指使用人工操纵的核酸酶或“分子剪刀(molecular scissors)”在基因组中插入、置换或移除DNA的一种基因操纵方法。它是阐明序列特异性基因或蛋白质的功能和作用或改变细胞行为(例如用于治疗目的)的有用工具。

当前可用的基因组编辑工具包括锌指核酸酶(ZFN)和转录激活物样效应核酸酶(TALEN)，以在安全港基因座(例如腺相关病毒整合位点1 (AAVS1)安全港基因座)处并入基因。利用phiC31整合酶和Bxb1整合酶的DICE (双整合酶盒交换)系统是一种用于靶整合的工具。此外，成簇规律间隔的短回文重复序列/Cas9 (CRISPR/Cas9)技术可用于靶向基因插入。

位点特异性基因编辑方法可以包括同源依赖性机制或同源非依赖性机制。

在本文所描述的方法中涵盖本领域已知的用于靶向插入基因序列的所有方法以在基因靶或安全港基因座处插入构建体。

本文提供了在不存在病毒载体的情况下将长度大于约5千碱基的核苷酸序列插入细胞基因组中的方法。在一些实施方案中，在不存在病毒载体的情况下，可以将长度大于约5千碱基的核苷酸序列插入原代免疫细胞的基因组中。

将大核酸(例如，大小为大于5千碱基的核酸)整合到细胞中可能受到低整合效率、脱靶效应和/或细胞活力损失的限制。本文描述了用于实现将核苷酸序列(例如，大小为大于约5千碱基的核苷酸序列)整合到细胞的基因组中的方法和组合物。在一些方法中，整合效率增加，脱靶效应减少并且/或者细胞活力损失减少。

利用核酸酶，诸如CRISPR相关系统(Cas)可以将质粒引入免疫细胞中。核酸酶可以按核糖核蛋白形式与靶向免疫细胞基因组上的特定位点的向导RNA (gRNA)一起引入。核酸酶在这个特定位点处切割基因组DNA。所述特定位点可以是基因组中编码内源性免疫细胞受体的部分。因此，在此位点处切割基因组将会使免疫细胞不再表达内源性免疫细胞受体。

质粒可包括与免疫细胞基因组特定位点处的序列互补的5'和3'同源定向修复臂。互补序列位于被核酸酶切割的位点的两侧，这使得质粒可以并入免疫细胞基因组上的特定插入位点处。一旦并入质粒，细胞将表达启动受体。然而，正如所解释的，转基因盒的设计确保以病毒方式递送的回路系统受体在启动受体与其同源配体结合并释放可裂解的转录因子之前不表达CAR。

最初，激活T细胞。T细胞可获自患者。因此，本公开提供了从患者收获免疫细胞诸如T细胞的方法。然后将编码CAR和启动受体的质粒引入T细胞中。有利地，可以使用电穿孔引入本公开的质粒。当通过电穿孔引入质粒时，也可引入核酸酶。通过使用电穿孔，本公开的方法避免了使用病毒载体来引入转基因，这是免疫细胞工程化中的一个已知瓶颈。然后将T细胞扩增并共同培养，以产生足够数量的工程化免疫细胞，用作治疗性治疗。

用于编辑细胞基因组的方法可以包括a)提供Cas9核糖核蛋白复合物(RNP)-DNA模板复合物，所述RNP-DNA模板复合物包含：(i) RNP，其中所述RNP包含Cas9核酸酶结构域和向导RNA，其中所述向导RNA与细胞基因组的靶区特异性杂交，并且其中所述Cas9核酸酶结构域裂解靶区以在细胞基因组中产生插入位点；和(ii)双链或单链DNA模板，其中所述DNA模板的大小大于约200个核苷酸，其中所述DNA模板的5'端和3'端包含与侧接插入位点的基因组序列同源的核苷酸序列，并且其中所述复合物中RNP与DNA模板的摩尔比是约3:1至约100:1；以及b)将所述RNP-DNA模板复合物引入所述细胞中。

在一些实施方案中，本文所述的方法提供至少约20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99%、99.5%、99%或更高的RNP-DNA模板复合物递送效率。在一些情况下，所述效率是根据将RNP-DNA模板引入细胞中后存活的细胞来确定的。在一些情况下，所述效率是根据将RNP-DNA模板引入细胞中的细胞(存活或非存活)的总数来确定的。

再例如，可以通过定量细胞群中基因组编辑细胞的数量(与引入步骤后获得的总细胞或总活细胞相比)来确定递送效率。可以利用各种用于定量基因组编辑的方法。这些方法包括但不限于使用错配特异性核酸酶，例如T7核酸内切酶I；对一个或多个靶基因座进行测序(例如通过对克隆的靶基因座扩增片段进行桑格测序(sanger sequencing))；以及高通量深度测序。

在一些实施方案中，与将裸DNA引入细胞或使用病毒载体将DNA引入细胞后细胞活力的损失相比，细胞活力的损失减少。减少量可以是减少至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或这些百分比之间的任何百分比。在一些实施方案中，与将裸DNA引入细胞或使用病毒载体将DNA引入细胞后的脱靶整合相比，整合的脱靶效应降低。降低量可以是降低至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%或这些百分比之间的任何百分比。

在一些情况下，本文所描述的方法可使引入了RNP-DNA模板的细胞具有高细胞活力。在一些情况下，引入了RNP-DNA模板的细胞的活力是至少约20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99%、99.5%、99%或更高。在一些情况下，引入了RNP-DNA模板的细胞的活力是约20%至约99%、约30%至约90%、约35%至约85%或90%或更高、约40%至约85%或90%或更高、约50%至约85%或90%或更高、约50%至约85%或90%或更高、约60%至约85%或90%或更高，或者约70%至约85%或90%或更高。

在本文所提供的方法中，RNP与DNA模板的摩尔比可以是约3:1至约100:1。例如，摩尔比可以是约5:1至10:1、约5:1至约15:1、5:1至约20:1、5:1至约25:1、约8:1至约12:1、约8:1至约15:1、约8:1至约20:1或约8:1至约25:1。

在一些实施方案中，DNA模板的浓度为约2.5 pM至约25 pM。例如，DNA模板的浓度可为约2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13、13.5、14、14.5、15、15.5、16、16.5、17、17.5、18、18.5、19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23、23.5、24、24.5、25 pM或这些浓度之间的任何浓度。

在一些实施方案中，DNA模板的大小或长度为大于约4.5 kb、5.0 kb、5.1 kb、5.2kb、5.3 kb、5.4 kb、5.5 kb、5.6 kb、5.7 kb、5.8 kb、5.9 kb、6.0 kb、6.1 kb、6.2 kb、6.3kb、6.4 kb、6.5 kb、6.6 kb、6.7 kb、6.8 kb、6.9 kb、7.0 kb、7.1 kb、7.2 kb、7.3 kb、7.4kb、7.5 kb、7.6 kb、7.7 kb、7.8 kb、7.9 kb、8.0 kb、8.1 kb、8.2 kb、8.3 kb、8.4 kb、8.5kb、8.6 kb、8.7 kb、8.8 kb、8.9 kb、9.0 kb、9.1 kb、9.2 kb、9.3 kb、9.4 kb、9.5 kb、9.6kb、9.7 kb、9.8 kb、9.9 kb或10 kb或介于这些大小之间的任何DNA模板大小。例如，DNA模板的大小可为约4.5 kb至约10 kb、约5 kb至约10 kb、约5 kb至约9 kb、约5 kb至约8 kb、约5 kb至约7 kb、约5 kb至约6 kb、约kb 6至约10 kb、约6 kb至约9 kb、约6 kb至约8 kb、约6 kb至约7 kb、约7 kb至约10 kb、约7 kb至约9 kb、约7 kb至约8 kb、约8 kb至约10 kb、约8 kb至约9 kb，或约9 kb至约10 kb。

在一些实施方案中，DNA模板的量为约1 µg至约10 µg。例如，DNA模板的量可以是约1 μg至约2 μg、约1 μg至约3 μg、约1 μg至约4 μg、约1 μg至约5 μg、约1 μg至约6 μg、约1 μg至约7 μg、约1 μg至约8 μg、约1 μg至约9 μg、约1 μg至约10 μg。在一些实施方案中，DNA模板的量是约2 µg至约3 µg、约2 µg至约4 µg、约2 µg至约5 µg、约2 µg至约6 µg、约2µg至约7 µg、约2 µg至约8 µg、约2 µg至约9 µg或2 µg至约10 µg。在一些实施方案中，DNA模板的量是约3 μg至约4 μg、约3 μg至约5 μg、约3 μg至约6 μg、约3 μg至约7 μg、约3 μg至约8 μg、约3 μg至约9 μg或约3 μg至约10 μg。在一些实施方案中，DNA模板的量是约4 μg至约5 μg、约4 μg至约6 μg、约4μg至约7 μg、约4 μg至约8 μg、约4 μg至约9 μg或约4 μg至约10 μg。在一些实施方案中，DNA模板的量是约5 μg至约6 μg、约5 μg至约7 μg、约5 μg至约8 μg、约5 μg至约9 μg或约5 μg至约10 μg。在一些实施方案中，DNA模板的量是约6 μg至约7 μg、约6 μg至约8 μg、约6 μg至约9 μg或约6 μg至约10 μg。在一些实施方案中，DNA模板的量是约7 μg至约8 μg、约7 μg至约9 μg或约7 μg至约10 μg。在一些实施方案中，DNA模板的量是约8 μg至约9 μg或约8 μg至约10 μg。在一些实施方案中，DNA模板的量是约9 µg至约10 µg。

在一些情况下，DNA模板的大小和数量足够大，足以作为裸DNA致死。在一些实施方案中，DNA模板编码异源蛋白质或其片段。在一些实施方案中，DNA模板编码至少一个基因。在一些实施方案中，DNA模板编码至少两个基因。在一些实施方案中，DNA模板编码一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或更多个基因。

在一些实施方案中，DNA模板包括调控序列，例如启动子序列和/或增强子序列，以在插入细胞基因组中后调控异源蛋白质或其片段的表达。

在一些情况下，DNA模板是线性DNA模板。在一些情况下，DNA模板是单链DNA模板。在一些情况下，单链DNA模板是纯单链DNA模板。如本文所使用，“纯单链DNA”是指基本上没有另一条或相反DNA链的单链DNA。“基本上没有”意味着，纯单链DNA中一条DNA链的缺失量比另一条DNA链的缺失量高至少100倍。

在一些情况下，RNP-DNA模板复合物是通过将RNP与DNA模板在约20℃至约25℃的温度下孵育少于约一分钟至约三十分钟而形成的。例如，可以将RNP与DNA模板在约20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃的温度下孵育约5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒、1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、11分钟、12分钟、13分钟、14分钟、15分钟、16分钟、17分钟、18分钟、19分钟、20分钟、21分钟、22分钟、23分钟、24分钟、25分钟、26分钟、27分钟、28分钟、29分钟或30分钟或这些时间之间的任何时间量。在另一实例中，可以将RNP与DNA模板在约20℃至约25℃的温度下孵育少于约一分钟至约一分钟、少于约一分钟至约5分钟、少于约1分钟至约10分钟、约5分钟至10分钟、约5分钟至15分钟、约10至约15分钟、约10分钟至约20分钟，或约10分钟至约30分钟。在一些实施方案中，在将RNP-DNA模板复合物引入细胞中之前，将RNP-DNA模板复合物和细胞混合。

在一些实施方案中，引入RNP-DNA模板复合物包括电穿孔。用于对细胞电穿孔以引入RNP-DNA模板复合物的方法、组合物和装置可包括本文实施例中描述的那些。用于对细胞电穿孔以引入RNP-DNA模板复合物的另外的或替代的方法、组合物和装置可包括WO/2006/001614或Kim, J.A.等人Biosens. Bioelectron. 23, 1353-1360 (2008)中描述的那些。用于对细胞电穿孔以引入RNP-DNA模板复合物的另外的或替代的方法、组合物和装置可包括美国专利申请公布第2006/0094095号；第2005/0064596号；或第2006/0087522号中描述的那些。用于对细胞电穿孔以引入RNP-DNA模板复合物的另外的或替代的方法、组合物和装置可包括Li, L.H.等人Cancer Res. Treat. 1, 341–350 (2002)；美国专利号6,773,669、7,186,559、7,771,984、7,991,559、6485961、7029916；以及美国专利申请公布第2014/0017213号和第2012/0088842号中描述的那些，所有这些参考文献据此以引用的方式并入。用于对细胞电穿孔以引入RNP-DNA模板复合物的另外的或替代的方法、组合物和装置可包括Geng, T.等人J. Control Release 144, 91-100 (2010)；以及Wang, J.等人Lab. Chip10, 2057-2061 (2010)中描述的那些，所有这些参考文献据此以引用的方式并入。

在一些实施方案中，Cas9蛋白可以是活性核酸内切酶形式，使得当作为与向导RNA的复合物的一部分或与DNA模板的复合物的一部分与靶核酸结合时，将双链断裂引入靶核酸中。双链断裂可以通过NHEJ修复以引入随机突变，或通过HDR修复以引入特定突变。各种Cas9核酸酶可用于本文所描述的方法中。例如，可以利用Cas9核酸酶，该核酸酶需要紧邻向导RNA所靶向的区域3'处的NGG原型间隔区邻近基序(PAM)。这种Cas9核酸酶可以靶向基因组中含有NGG序列的任何区域。再例如，具有正交PAM基序要求的Cas9蛋白可用于靶向没有相邻NGG PAM序列的序列。具有正交PAM序列特异性的示例性Cas9蛋白包括但不限于CFP1；Nature Methods 10, 1116-1121 (2013)中描述的那些；以及Zetsche等人, Cell,第163卷,第3期,第759–771页, 2015年10月22日中描述的那些，两者据此以引用的方式并入。

在一些情况下，Cas9蛋白可以是切口酶，使得当作为与向导RNA的复合物的一部分与靶核酸结合时，将双链断裂或切口引入靶核酸中。分别与结构不同的向导RNA结合的一对Cas9切口酶可以靶向靶基因组区域的两个近端位点，并由此将一对近端单链断裂引入靶基因组区域中。切口酶对可以提供增强的特异性，因为脱靶效应可能会产生单个切口，而这些切口一般可以通过碱基切除修复机制进行修复而不会造成损伤。示例性Cas9切口酶包括具有D10A或H840A突变的Cas9核酸酶。

在一些实施方案中，RNP包含Cas9核酸酶。在一些实施方案中，RNP包含Cas9切口酶。在一些实施方案中，RNP-DNA模板复合物包含至少两种结构不同的RNP复合物。在一些实施方案中，所述至少两种结构不同的RNP复合物含有结构不同的Cas9核酸酶结构域。在一些实施方案中，所述至少两种结构不同的RNP复合物含有结构不同的向导RNA。在一些实施方案中，其中所述至少两种结构不同的RNP复合物含有结构不同的向导RNA，每种结构不同的RNP复合物包含Cas9切口酶，并且所述结构不同的向导RNA与靶区的相反链杂交。

在一些情况下，将包含结构不同的核糖核蛋白复合物的多个RNP-DNA模板引入细胞中。例如，Cas9蛋白可以与多个(例如2、3、4、5个或更多，例如2-10、5-100、20-100个)结构不同的向导RNA形成复合物，以将DNA模板靶向插入多个结构不同的靶基因组区域。

在本文所提供的方法和组合物中，细胞包括但不限于真核细胞、原核细胞、动物细胞、植物细胞、真菌细胞等。任选地，细胞是哺乳动物细胞，例如人体细胞。细胞可以在体外、离体或在体内。细胞还可以是原代细胞、生殖细胞、干细胞或前体细胞。前体细胞可以是例如多能干细胞或造血干细胞。在一些实施方案中，细胞是原代造血细胞或原代造血干细胞。在一些实施方案中，原代造血细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，免疫细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是调节性T细胞、效应T细胞或幼稚T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4⁺T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD8⁺T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4⁺CD8⁺T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4^-CD8^-T细胞。还提供了通过本文所述的任何方法修饰的任何细胞的群体。在一些实施方案中，所述方法还包括扩增修饰的细胞群。

在一些情况下，将细胞从受试者取出，使用本文所述的任何方法进行修饰并施用给受试者。在其他情况下，将本文所描述的任何构建体在体内递送给患者。参见例如美国专利第9737604号和Zhang等人“Lipid nanoparticle-mediated efficient delivery ofCRISPR/Cas9 for tumor therapy,”NPG Asia Materials第9期,第e441页(2017)，两者据此以引用的方式并入。

在一些实施方案中，将RNP-DNA模板复合物引入约1 × 10⁵至约2 × 10⁶个细胞中。例如，可以将RNP-DNA模板复合物引入约1 × 10⁵至约5 × 10⁵个细胞、约1 × 10⁵至约1 × 10⁶个细胞、1 × 10⁵至约1.5 × 10⁶个细胞、1 × 10⁵至约2 × 10⁶个细胞、约1 ×10⁶至约1.5 × 10⁶个细胞或约1 × 10⁶至约2 × 10⁶个细胞中。

在一些情况下，本文所述的方法和组合物可用于产生、修饰、使用或控制重组T细胞，诸如嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞)。此类CAR T细胞可用于治疗或预防受试者的癌症、传染病或自身免疫性疾病。例如，在一些实施方案中，将一个或多个基因产物插入或敲入T细胞以表达异源蛋白(例如嵌合抗原受体(CAR)或启动受体)。

插入位点

用于编辑T细胞基因组的方法具体地包括编辑人T细胞基因组的方法，所述方法包括将核酸序列或构建体插入人T细胞中TCR-α亚基(TRAC)基因外显子1的靶区中。在一些实施方案中，靶区位于TRAC基因恒定结构域的外显子1中。在其他实施方案中，靶区位于外显子1、外显子2或外显子3中，在编码TCR-α跨膜结构域的序列的起点之前。

用于编辑T细胞基因组的方法还包括编辑人T细胞基因组的方法，所述方法包括将核酸序列或构建体插入人T细胞中TCR-β亚基(TRBC)基因外显子1中的靶区中。在一些实施方案中，靶区位于TRBC1或TRBC2基因的外显子1中。

用于编辑T细胞基因组的方法具体地包括编辑人T细胞基因组的方法，所述方法包括将核酸序列或构建体插入基因组安全港(GSH)的靶区中。

基因编辑疗法包括例如载体整合和位点特异性整合。位点特异性整合是病毒载体随机整合的一种有前景的替代方法，因为它降低了插入诱变或插入性瘤形成的风险(Kolb等人Trends Biotechnol. 2005 23:399-406；Porteus等人Nat Biotechnol. 2005 23:967-973；Paques等人Curr Gen Ther. 2007 7:49-66)。然而，位点特异性整合仍然面临着诸如低敲入效率、插入瘤形成风险、相邻基因或转基因的不稳定和/或异常表达、低可及性(例如相邻基因的20 kB以内)等挑战。这些挑战可以部分地通过确定和使用安全港基因座或安全港位点(SHS)来解决，这些位点是可以在不破坏相邻基因的表达或调控的情况下整合基因或遗传元件的位点。

最广泛使用的推定人安全港位点是染色体19q上的AAVS1位点，该位点最初被鉴定为复发性腺相关病毒插入的位点。已在同源性的基础上鉴定出其他潜在的SHS，这些位点最先是在其他物种(例如允许的鼠Rosa26基因座的人同源物)或在越来越多的在某些情况下显得非必需的人基因中鉴定出来的。一个推定的这种类型的SHS是CCR5趋化因子受体基因，当它被破坏时会赋予对人免疫缺陷病毒感染的抵抗力。基于病毒整合位点图谱或基因陷阱分析，在人类和其他细胞类型中已经鉴定出其他潜在的基因组SHS，就像最初的鼠Rosa26基因座一样。前三个SHS，即AAVS1、CCR5和Rosa26，与许多蛋白质编码基因和调控元件非常接近。(参见Sadelain, M.等人(2012). Safe harbours for the integration of new DNAin the human genome. Nature reviews Cancer, 12 (1), 51-58，其相关公开内容以引用的方式整体并入本文)。

人19号染色体上的AAVS1 (也称为PPP1R12C基因座)是一个已知的用于承载具有预期功能的转基因(例如DNA转基因)的SHS。它处于位置19q13.42处。它具有开放的染色质结构并且具有转录能力。AAVS1的典型SHS基因座是chr19: 55,625,241–55,629,351。参见Pellenz等人“New Human Chromosomal Sites with "Safe Harbor" Potential forTargeted Transgene Insertion.” Human gene therapy vol. 30,7 (2019): 814-828，其相关公开内容以引用的方式并入本文。下文提供了示例性AAVS1靶gRNA和靶序列：

● AAVS1-gRNA序列(SEQ ID NO: 159)：ggggccactagggacaggatGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT

● AAVS1靶序列(SEQ ID NO: 160)：ggggccactagggacaggat

CCR5位于3号染色体的位置3p21.31，编码HIV-1的主要共受体。破坏CCR5基因中的这一位点有利于HIV/AIDS治疗，并且促进靶向其第三外显子的锌指核酸酶的开发。CCR5的规范SHS基因座是chr3：46,414,443-46,414,942。参见Pellenz等人“New HumanChromosomal Sites with "Safe Harbor" Potential for Targeted TransgeneInsertion.” Human gene therapy vol. 30,7 (2019): 814-828，其相关公开内容以引用的方式并入本文。

小鼠Rosa26基因座对于基因修饰特别有用，因为它可以被高效靶向并在大多数测试细胞类型中表达。Irion等人2007 ("Identification and targeting of the ROSA26locus in human embryonic stem cells." Nature biotechnology 25.12 (2007):1477-1482，其相关公开内容以引用的方式并入本文)鉴定了3号染色体(位置3p25.3)中的人同系物，人ROSA26。人Rosa26 (hRosa26)的规范SHS基因座是chr3：9,415,082-9,414,043。参见Pellenz等人“New Human Chromosomal Sites with "Safe Harbor" Potentialfor Targeted Transgene Insertion.” Human gene therapy vol. 30,7 (2019): 814-828，其相关公开内容以引用的方式并入本文。

安全港位点的另外实例提供于Pellenz等人“New Human Chromosomal Siteswith "Safe Harbor" Potential for Targeted Transgene Insertion.” Human genetherapy vol. 30,7 (2019): 814-828，其相关公开内容以引用的方式并入本文。其他整合位点的实例提供于表E中。

在一些实施方案中，安全港位点允许高转基因表达(足以允许转基因具有功能或治疗感兴趣的疾病)以及转基因在几天、几周或几个月内稳定表达。在一些实施方案中，安全港基因座处基因的敲除给细胞的功能带来益处，或者安全港基因座处的基因在细胞内没有已知功能。在一些实施方案中，安全港基因座在有或没有CD3/CD28刺激的情况下引起体外稳定的转基因表达，且经iGuide-Seq或CRISPR-Seq检测，脱靶裂解可忽略不计；经iGuide-Seq或CRISPR-Seq检测，脱靶裂解相对于其他基因座较少；转基因非依赖性细胞毒性可忽略不计；转基因非依赖性细胞因子表达可忽略不计；转基因非依赖性嵌合抗原受体表达可忽略不计；附近基因的失调或沉默可忽略不计；并且位于癌症相关基因之外。

如所用，“附近基因”可以指代距离安全港基因座(整合位点)约100kB、约125kB、约150kB、约175kB、约200kB、约225kB、约250kB、约275kB、约300kB、约325kB、约350kB、约375kB、约400kB、约425kB、约450kB、约475kB、约500kB、约525kB、约550kB内的基因。

在一些实施方案中，本公开设想包含一个或多个转基因的插入物。转基因可以编码治疗性蛋白、抗体、肽或任何其他目标基因。转基因整合可以导致例如增强的治疗特性。如本文所用，这些增强的治疗特性是指与相同正常细胞类型的典型免疫细胞相比，细胞的增强的治疗特性。例如，与典型的、未修饰的和/或天然存在的T细胞相比，具有“增强的治疗特性”的T细胞具有增强的、改善的和/或增加的治疗结果。免疫细胞的治疗特性可以包括但不限于细胞移植、运输、归巢、活力、自我更新、持久性、免疫应答控制和调控、存活和细胞毒性。免疫细胞的治疗特性还表现在：抗原靶向受体的表达；HLA呈递或其缺乏；对肿瘤内微环境的耐受性；旁观者免疫细胞的诱导和免疫调控；改善的靶特异性并减少；对化学疗法等治疗的抗性。

如本文所用，术语“插入物大小”是指整合(插入)到靶基因座或安全港位点处的核苷酸序列的长度。在一些实施方案中，插入物大小包括至少约4.5千碱基对(kb)至约10千碱基对(kb)。在一些实施方案中，插入物大小包括约5000个核苷酸或更多碱基对。在一些实施方案中，插入物大小包括多达4.5、4.8、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20kbp (千碱基对)或介于之间的大小。在一些实施方案中，插入物大小为大于4.5、4.8、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 kbp或介于之间的大小。在一些实施方案中，插入物大小在4.5-15 kbp的范围内或者是该范围内的任何数字。在一些实施方案中，插入物大小在4.8-8.3 kbp的范围内或者是该范围内的任何数字。在一些实施方案中，插入物大小在5-8.3 kbp的范围内或者是该范围内的任何数字。在一些实施方案中，插入物大小在5-15 kbp的范围内或者是该范围内的任何数字。在一些实施方案中，插入物大小在4.5-20kbp的范围内或者是该范围内的任何数字。在一些实施方案中，插入物大小为5-10 kbp。在一些实施方案中，插入物大小为4.5-10、5-10、6-10、7-10、8-10、9-10 kbp。在一些实施方案中，插入物大小为4.5-11、6-11、7-11、8-11、9-11或10-11 kbp。在一些实施方案中，插入物大小为4.5-12、6-12、7-12、8-12、9-12、10-12或11-12 kbp。在一些实施方案中，插入物大小为4.5-13、6-13、7-13、8-13、9-13、10-13、11-13或12-13 kbp。在一些实施方案中，插入物大小为4.5-14、6-14、7-14、8-14、9-14、10-14、11-14、12-14或13-14 kbp。在一些实施方案中，插入物大小为4.5-15、6-15、7-15、8-15、9-15、10-15、11-15、12-15、13-15或14-15 kbp。在一些实施方案中，插入物大小为4.5-16、6-16、7-16、8-16、9-16、10-16、11-16、12-16、13-16、14-16或15-16 kbp。在一些实施方案中，插入物大小为4.5-17、6-17、7-17、8-17、9-17、10-17、11-17、12-17、13-17或14-17、15-17或16-17 kbp。在一些实施方案中，插入物大小为4.5-18、6-18、7-18、8-18、9-18、10-18、11-18、12-18、13-18、14-18、15-18、16-18或17-18kbp。在一些实施方案中，插入物大小为4.5-19、6-19、7-19、8-19、9-19、10-19、11-19、12-19、13-19、14-19、15-19、16-19、17-19或18-19 kbp。在一些实施方案中，插入物大小为4.5-20、6-20、7-20、8-20、9-20、10-20、11-20、12-20、13-20、14-20、15-20、16-20、17-20、18-20或19-20 kbp。

本公开的插入物是指插入到靶基因座或安全港位点处的核酸分子或多核苷酸。在一些实施方案中，核苷酸序列是DNA分子例如基因组DNA，或者包含脱氧核糖核苷酸。在一些实施方案中，插入物包含较小的DNA片段，诸如质体DNA、线粒体DNA，或以质粒、福斯质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)和/或DNA的任何其他亚基因组区段形式分离的DNA。在一些实施方案中，插入物是RNA分子或者包含核糖核苷酸。插入物中的核苷酸被认为是天然存在的核苷酸、非天然存在的核苷酸和修饰的核苷酸。如本领域技术人员将容易理解的，核苷酸可进行化学或生物化学修饰，或者可含有非天然或衍生化的核苷酸碱基。此类修饰包括例如标记、甲基化、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸、核苷酸间修饰。多核苷酸可以呈任何拓扑构象，包括单链、双链、部分双螺旋、三螺旋、发夹、环状构象和本领域中考虑的其他三维构象。

插入物可以具有编码和/或非编码区。插入物可以包含非编码序列(例如，控制元件，例如启动子序列)。在一些实施方案中，插入物编码转录因子。在一些实施方案中，插入物编码抗原结合受体，诸如单一受体、T细胞受体(TCR)、启动受体、CAR、mAb等。在一些实施方案中，插入物是人序列。在一些实施方案中，插入物是模拟物。在一些实施方案中，插入物是多基因/多模块治疗性盒。多基因/多模块治疗性盒是指具有一种或超过一种受体(例如，合成受体)、其他外源蛋白编码序列、非编码RNA、转录调控元件和/或隔离子序列(insulator sequence)等的插入物或盒。

在一些实施方案中，将核酸序列通过非病毒递送插入T细胞的基因组中。在非病毒递送方法中，核酸可以是裸DNA，或在非病毒质粒或载体中。非病毒递送技术可以是位点特异性整合技术，如本文所描述或本领域技术人员所知。用于整合至安全港基因座中的位点特异性技术包括但不限于使用核酸酶的同源性依赖性工程化和使用Cas9或其他CRISPR核酸内切酶的同源性非依赖性靶向插入。

在一些实施方案中，通过将以下各物引入工程化细胞中来将插入物整合到安全港位点：(a)靶向核酸酶，所述靶向核酸酶裂解安全港位点中的靶区以产生插入位点；和(b)核酸序列(插入物)，其中所述插入物通过例如HDR并入插入位点处。可用于本公开的方法中的非病毒递送技术的实例提供于美国申请第16/568,116号和第16/622,843号中，其相关公开内容以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，整合位点是GS94 (chr11:128340000-128350000)或GS102 (chr15:92830000-92840000)安全港位点。在一些实施方案中，整合位点是选自表E的任一位点。在一些实施方案中，整合位点是选自由GS88-GS120组成的组的任一位点。

所涵盖的整合位点的实例提供于表E中。

表E：sgRNA序列

CRISPR-Cas编辑

基因编辑的一个有效实例是CRISPR-Cas方法(例如CRISPR-Cas9)。这一方法结合使用向导多核苷酸(例如向导核糖核酸或gRNA)和cas核酸内切酶(例如Cas9核酸内切酶)。

如本文所用，称为“Cas核酸内切酶”或具有“Cas核酸内切酶活性”的多肽是指由Cas基因编码的CRISPR相关(Cas)多肽，其中Cas多肽是当可操作地连接至一个或多个向导多核苷酸时可以被裂解的靶DNA序列(参见例如美国专利第8,697,359号)。此定义中还包括保留向导多核苷酸依赖性核酸内切酶活性的Cas核酸内切酶变体。在本文详述的供体DNA插入方法中使用的Cas核酸内切酶是将双链断裂引入DNA中的靶位点处(例如，靶基因座内或安全港位点处)的核酸内切酶。

如本文所用，术语“向导多核苷酸”是指能够与Cas核酸内切酶形成复合物并允许Cas核酸内切酶识别且裂解DNA靶位点的多核苷酸序列。向导多核苷酸可以是单分子或双分子。向导多核苷酸序列可以是RNA序列、DNA序列或其组合(RNA-DNA组合序列)。仅包含核糖核酸的向导多核苷酸也称为“向导RNA”。在一些实施方案中，使用向导RNA (gRNA)与cas核酸内切酶(例如Cas9核酸内切酶)的组合将多核苷酸供体构建体插入安全港基因座处。

向导多核苷酸包括与靶DNA中的核苷酸序列互补的第一核苷酸序列结构域(也称为可变靶向结构域或VT结构域)，以及与Cas核酸内切酶多肽相互作用的第二核苷酸。它可以是包含序列结构域(称为Cas核酸内切酶识别结构域或CER结构域)的双分子(也称为双链向导多核苷酸)。此双分子向导多核苷酸的CER结构域包含沿互补区杂交的两个独立分子组成。这两个独立分子可以是RNA序列、DNA序列和/或RNA-DNA组合序列。

使用CRISPR-Cas方法进行的基因组编辑依赖于由RNA引导的Cas核酸内切酶(例如Cas 9核酸内切酶)诱导的位点特异性DNA双链断裂(DSB)的修复。对这些DSB的同源定向修复(HDR)使得能够通过引入限定的基因组变化(包括碱基取代、序列插入和缺失)实现基因组的精确编辑。常规的基于HDR的CRISPR/Cas9基因组编辑涉及用Cas9、gRNA和供体DNA转染细胞，所述供体DNA含有与感兴趣的基因组基因座匹配的同源臂。

同源非依赖性靶向插入(HITI)采用基于非同源末端连接(NHEJ)的同源非依赖性策略，而且所述方法比HDR更高效。向导RNA (gRNA)靶向插入位点。对于HITI，供体质粒缺乏同源臂，并且DSB修复不会通过HDR途径发生。供体多核苷酸构建体可以被工程化成包括侧接待插入基因或序列的Cas9裂解位点。这使得在供体质粒和基因组靶序列处发生Cas9裂解。靶和供体均具有平端，并且线性化供体DNA质粒被用于NHEJ途径，从而整合到基因组DSB位点中。(参见，例如，Suzuki, K.等人(2016). In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature, 540(7631),144-149，其相关公开内容以引用的方式整体并入本文)。

使用CRISPR-Cas方法进行基因编辑的方法是本领域普通技术人员已知的。(参见例如美国申请第US16/312,676号、第US15/303,722号和第US15/628,533号，其公开内容以引用的方式整体并入本文)。另外，使用核酸内切酶将转基因插入安全港基因座的情况描述于例如美国申请第13/036,343号中，该申请的公开内容以引用的方式整体并入本文。

编码核酸内切酶的向导RNA和/或mRNA(或DNA)可以化学方式连接到一个或多个增强寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取的部分或缀合物。此类部分的非限制性实例包括脂质部分(诸如胆固醇部分)、胆酸、硫醚、巯基胆固醇、脂族链(例如，十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-外消旋-甘油-3-H-膦酸酯)、聚胺或聚乙二醇链、金刚烷乙酸、棕榈基部分和十八胺或己基氨基-羰基-t-羟胆固醇部分。参见例如美国专利公布第20180127786号，其公开内容以引用的方式整体并入本文。

治疗应用

对于治疗应用，将工程化细胞、其群体或其组合物以有效量施用于受试者，通常是哺乳动物，通常是人类。可通过输注(例如，在一段时间内连续输注)或本领域普通技术人员已知的其他施用方式将工程化细胞施用至受试者。

本文提供的工程化细胞不仅可用于基因疗法，还可用于非药物用途，诸如例如动物模型的产生以及表达目标蛋白质的重组细胞系的产生。

本公开的工程化细胞可以是已通过在本文所述的安全港基因座处整合转基因而经修饰的任何细胞，一般是哺乳动物细胞，一般是人细胞。重组细胞部分提供了示例性细胞。

本公开的工程化细胞、组合物和方法可用于治疗应用，诸如CAR T细胞疗法和TCRT细胞疗法。在一些实施方案中，在安全港基因座内插入编码转基因的序列相对于没有插入时的情况保持TCR表达，并在保持TCR功能的同时实现转基因表达。

在一些实施方案中，本公开提供了通过向需要治疗的受试者施用包含本文所述的任何工程化细胞的组合物来治疗受试者的方法。在一些实施方案中，工程化细胞组合物的施用导致所需药理和/或生理作用。这种作用可以是部分或完全治愈疾病和/或由疾病引起的不良作用。在一些实施方案中，治疗涵盖对受试者(例如，哺乳动物，例如人)疾病的任何治疗。此外，治疗可以稳定或减少受试者(例如，患者)的不良临床症状。本文所提供的细胞、其群体或其组合物可以在疾病发生期间或之后施用。

在某些实施方案中，受试者患有可以通过细胞疗法治疗和/或改善的疾病、疾患和/或损伤。在一些实施方案中，需要细胞疗法的受试者是具有损伤、疾病或疾患的受试者，从而引起细胞疗法(例如，将细胞物质施用至受试者的疗法)。然而，经考虑，它可能治疗、改善与损伤、疾病或疾患相关的至少一种症状和/或降低其严重程度。

施用方法

可以施用有效量的构成所述系统的免疫细胞来治疗免疫相关病症，例如癌症。构成所述系统的免疫细胞的适当剂量可基于待治疗的免疫相关病症的类型、构成所述系统的免疫细胞的类型、癌症的严重程度和过程、个体的临床状况、个体的临床史和对治疗的响应，以及主治医师的判断来确定。

药物组合物

本文提供的工程化重组细胞可以作为药物组合物的一部分来施用。除重组细胞中的一者或多者以外，这些组合物还可包含药学上可接受的赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或为本领域技术人员所熟知的其他物质。所述物质应是无毒的，并且不应干扰活性成分的功效。载体或其他物质的确切性质可取决于施用途径，例如口服、静脉内、经皮肤或皮下、经鼻、肌肉内、腹膜内途径。药物组合物可包含一种或多种药物赋形剂。可以使用任何适合的药物赋形剂，并且本领域的普通技术人员能够选择适合的药物赋形剂。因此，以下提供的药物赋形剂旨在说明而非限制。另外的药物赋形剂包括例如描述于以下中的那些：Handbook of Pharmaceutical Excipients, Rowe等人(编)第6版(2009)，其以引用的方式整体并入。

本文涵盖施用另外的治疗剂的各种模式。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂是通过任何适合的施用模式施用。

视待治疗的疾患而定，组合物可单独施用，或与其他治疗组合，同时或依序施用。

药盒和制品

本申请提供了包含本文所述的任何一种或多种系统或细胞组合物以及使用说明书的药盒。使用说明书可以作为包装插页存在于药盒中，存在于药盒的容器或其部件的标签中，或者可以呈数字形式(例如在CD-ROM上，通过互联网上的链接)。药盒可以包括一种或多种基因组靶向核酸、编码基因组靶向核酸的多核苷酸、定点多肽和/或编码定点多肽的多核苷酸。还设想了药盒内的另外组分，例如缓冲液(诸如复原缓冲液、稳定缓冲液、稀释缓冲液)和/或一种或多种对照载体。

在一些实施方案中，试剂盒还含有选自二级抗体、用于免疫组织化学分析的试剂、药学上可接受的赋形剂和说明手册以及它们的任何组合中的任一者的组成部分。在一个具体实施方案中，药盒包含药物组合物，所述药物组合物包含本文所述的抗体组合物中的任何一者或多者以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。

本申请还提供了包括本文所述的抗体组合物或药盒中的任一者的制品。制品的实例包括小瓶(包括密封小瓶)。

实施例

以下是用于进行本公开的特定实施方案的实施例。所述实施例仅出于说明性目的提供，并且不意图以任何方式限制本公开的范围。已努力确保关于所用数值(例如量、温度等)的准确性，但当然应允许一些实验误差和偏差。

除非另外指示，否则本公开的实施将采用在本领域的技能范围内的常规蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术和药理学方法。这些技术在文献中有充分说明。参见，例如，T.E.Creighton,Proteins: Structures and Molecular Properties(W.H. Freeman andCompany, 1993)；A.L. Lehninger,Biochemistry(Worth Publishers, Inc.,本期新增)；Sambrook等人,Molecular Cloning: A Laboratory Manual(第2版, 1989);Methods In Enzymology(S. Colowick和N. Kaplan编, Academic Press, Inc.);Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版(Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company,1990)；Carey和SundbergAdvanced Organic Chemistry第3版(Plenum Press)第A卷和第B卷(1992)。

实施例1：新颖跨膜和近膜结构域的筛选和表征

组合启动受体文库的设计和构建

从Uniprot蛋白质数据库中鉴定出具有约6200个TMD和1250个JMD的文库，并针对哺乳动物表达进行密码子优化。将6200个TMD与两个指定的JMD (NOTCH1和NOTCH2)组合，产生包含12400个变体的TMD文库，并将1250个JMD与8个指定的TMD组合，产生包含10000个变体的JMD文库。将这些变体以寡核苷酸文库形式从Twist Biosciences订购，用带条形码的引物扩增，并克隆到中间克隆载体中，以制备具有CD19结合物(FMC63)和EGFR报告基因的变体。将所述中间文库转化到DH5α大肠杆菌(NEB，目录号：C2987I)中，接种到245 × 245 mmQTrays (Fisher Scientific, #50-842-527)上，并根据期望的库大小进行刮取。进行扩增子NGS以将启动受体变体连接至特定条形码。然后，通过限制性克隆将CAR恒定片段插入中间库质粒中，并将完整文库转化到DH5α大肠杆菌(NEB，目录：C2987I)中。使用Amplicon NGS验证最终质粒文库以确认变体的预期分布。

将文库非病毒整合到原代人T细胞中

使用AutoMACs系统，通过新鲜人血白细胞分离术分离新鲜人T细胞(CD4 + CD8)。在T175烧瓶中，使用CTS Dynabeads(ThermoFisher，目录号：40203D)以1:1的珠粒与细胞比率和1×10⁶个细胞/mL的T细胞浓度激活T细胞。然后，使用Lonza 384孔Nucleofector系统(目录：AAU-1001)对T细胞进行脱珠粒处理，并用混有核糖核蛋白(RNP；Cas9重组蛋白和单向导RNA)的质粒文库DNA进行电穿孔。接着，在TexMACs (Miltenyi Biotec，目录：170-076-309)+ 3%人AB血清(Gemini，目录：100-512)+ 12.5 ng/mL人IL-7 (Mitenyi Biotec，目录：130-095-364)+ 12.5 ng/mL人IL-15 (Miltenyi Biotec，目录：130-095-766)中恢复电穿孔的T细胞。EP后，将细胞在G-rex 6孔板(Wilson Wolf，目录：80240M)中培养5天，并且每48小时补充一次培养基。将TMD和JMD文库电穿孔到200×10⁶个来自两名不同供体的T细胞(每个文库总共400×10⁶个)中。

启动受体文库的汇集筛选

将文库T细胞用抗EGFR APC抗体(BioLegend，352905)染色，与计数珠粒(LifeTechnologies，目录：C36995)混合，并使用Attune NxT流式细胞仪进行测量。根据EGFR+信号估算编辑百分比。然后，将文库T细胞与K562 (亲本细胞)、K562-ALPG low或K562-ALPGhigh在以下人T细胞培养基中共培养24小时：TexMACS + 3%人AB血清+ 15 ug/mL庆大霉素(Gibco，目录：15-750-078)。共培养物设置为效应物:靶比率1:3 (1个编辑T细胞：3个肿瘤细胞)，其中每名供体的每份共培养样品5×10⁶个编辑T细胞。然后，将样品以300xg沉淀5分钟以进行下游NGS分析。文库基因构建体被设计为在紧邻CAR下游具有独特的条形码，以使得靶抗原的启动受体接合在同一mRNA转录物上诱导CAR和条形码。然后，可以进行扩增子NGS测序来对条形码计数并将启动受体与其诱导能力直接联系起来。

NGS读取结果+条形码富集分析

使用RNeasy Plus Midi Kit (Qiagen，目录：75144)从文库共培养样本中分离出RNA。通过以下方式制备测序文库：使用寡核苷酸dT和模板转换寡核苷酸(TSO)引物集进行逆转录，用基因特异性引物扩增cDNA，然后通过最终索引PCR添加i5和i7序列。使用Illumina NovaSeq对含有26 bp变体特异性条形码的扩增子进行深度测序。

计算分析

将条形码读取的FASTQ文件通过聚类流程“Starcode”进行过滤，其中使用的Levenshtein距离为2。然后，使用条形码关联列表将各条形码簇分配到其相应的变体，并计算每个变体的总数。然后，使用差异表达包“EdgeR”分析变体计数以计算富集度。需要在K562-ALPGhi/质粒、K562-ALPGhi/仅T细胞、K562-ALPGhi/K562-亲本、K562-ALPGlow/质粒、K562-ALPGlow/仅T细胞、K562-ALPGlow/K562-亲本比较中进行统计学上显著的富集，以鉴定出选择进行进一步分析的变体。通过去除那些在K562 -亲本/仅T细胞和仅T细胞/质粒比较中显著富集的变体(作为非特异性基础活性的指标)，进一步筛选所选变体。根据这些标准，选出171个变体用于下游阵列分析。

用于头对头比较的阵列筛选设置

将前171个变体克隆到具有ALPG/P scFv结合物(H17E2)和HNF1a-p65或Gal4-VP64转录因子的受体载体中。所述载体还表达带有N末端FLAG标签的恒定4-1BBz CAR。分离原代T细胞，并用抗CD3/抗CD28 dynabeads以1:1的比率激活48小时。通过非病毒转染CRISPR/Cas9系统和各变体的模板DNA，在384孔板中对T细胞进行工程化。转染后五天，通过使用Sartorius iQue® 3分析在启动受体N末端上的myc标签表达来确定细胞计数、启动受体表达和敲入频率。通过添加适量的未编辑T细胞和人T细胞培养基，将每种变体归一化为等效细胞浓度和启动受体阳性率百分比。

从筛选测定选出的命中结果(hit)示于图2中。

CAR诱导能力

为了表征每种启动受体变体的CAR控制和诱导水平，在U型底96孔TC板中，将1.5×10⁴个启动+ T细胞与K562-ALPG+或K562-亲本K562以1:3的比率共培养。48小时后，用抗FLAG BV421 (BioLegend，目录：637322)对共培养物染色，并在Sartorius iQue® 3上通过流式细胞术进行测量。使用FlowJo™软件分析CAR MFI和CAR阳性细胞%。具有NOTCH1_extendedNotch1 TMD/JMD的启动受体用作阳性对照。预测具有OR6K6-NOTCH2或NOTCH1-F174A TMD/JMD的启动受体是非对照物。

由初始组的12个启动受体变体得到的诱导结果示于图3A和3B中，其中原代T细胞来自两名不同的供体(分别为图3A和图3B)。与NOTCH1_extendedNotch1 (NOTCH1-extNOTCH1)相比，NOTCH1_PLXA2、NOTCH1_NPTN和NOTCH1_ALK在与K562-ALPGlow和K562-ALPGhi共培养后表现出略微较低的CAR诱导作用。这些变体在与K562亲本细胞共培养后也表现出略微较低的基础活性。预测的启动受体在两种结合物类型中行为是可重现的。STS_NOTCH2、NOTCH1_PLXA2和SEM4F_NOTCH2启动受体表现出与NOTCH1-extNOTCH1对照(SEQ IDNO: 301和131)类似的诱导水平。STS_NOTCH2表现出比其他启动受体更高的CAR诱导作用。使用CLSTN1_CD2启动受体观察到的基础CAR表达水平高于预期。NOTCH1_ALK启动受体具有较低的诱导水平，且基础活性极小。OR6K6_NOTCH2和NOTCH1_F174A引物受体具有较高的基础活性。

细胞毒性测定

为了确定回路功能、回路敏感性和启动受体抗原细胞毒性依赖性，保持恒定的1:1E:T比率，同时改变靶细胞比率(ALPG/MSLN:MSLN)。在U型底96孔TC板中，将1.5 × 10⁴个表达启动受体的原代T细胞以1:1的比率与100%的K562-ALPG/MSLN细胞、2.5%的K562-ALPG/MSLN和97.5%的K562-MSLN细胞或0%的K562-ALPG/MSLN (例如100%的K562-MSLN)荧光素酶表达细胞共培养。48小时后，将共培养物溶解，并使用Pherastar微孔板读数仪，通过荧光素酶报告基因测定进行分析。

由初始组的12个启动受体变体得到的细胞毒性结果示于图4中。在0%条件下的细胞毒性代表对MSLN+ K562s的抗原非依赖性杀伤。所有汇集的筛选候选物均显示出比丙氨酸突变体对照更高的敏感性。NOTCH1_ALK变体表现出可控的杀伤作用，其中在2.5%条件下具有中等细胞毒性，而在0%条件下具有低杀伤作用。NOTCH1_ALK具有最低水平的启动受体非依赖性细胞毒性。

这种细胞毒性读数结果能够更好地分辨受控与不受控的启动受体候选物。

实施例2：其他新颖跨膜和近膜结构域的筛选和表征

阵列筛选测定

如上所述，对从实施例1汇集的筛选中挑选的顶级启动受体候选物进行进一步阵列筛选。简而言之，将变体克隆到具有HNF1a-p65或Gal4-VP64转录因子和带有N末端FLAG标签的恒定4-1BBz CAR的受体载体中。分离原代T细胞，并用抗CD3/抗CD28 dynabeads以1:1的比率激活48小时。通过非病毒转染CRISPR/Cas9系统和各变体的模板DNA，在384孔板中对T细胞进行工程化。与K562亲本细胞(K562-EFG)共培养后，通过流式细胞术测量启动受体的表达。与K562-ALPGlo细胞共培养后，通过流式细胞术测量CAR的诱导情况。

其他筛选结果示于图5中。基于启动受体的表达相对于具有NOTCH1-extNOTCH1跨膜和近膜结构域的对照启动受体增加，选出三个变体用于启动受体表征：NOTCH1_TMIG3、PLXC1_CD2、PLXC1_EPHA1。

CAR诱导能力

按照以上实施例1所述确定各启动受体变体的CAR控制和诱导水平。

启动受体向CAR的转化(周转率)

周转率是以与K562-ALPGlo细胞共培养72小时后表达的CAR百分比除以与K562-EFG细胞共培养72小时后表达的启动受体百分比计算。这是衡量启动受体到CAR表达的转化效率的量度。与K562-ALPGlo细胞共培养72小时后，通过流式细胞术测量诱导的CAR gMFI，并计算为FLAG荧光的几何平均值。

CAR转化率结果示于图6中。选出五种具有高CAR转化率和诱导CAR gMFI的变体：IRAG1_C163A、MMEL1_NOTCH2、NOTCH1_CSPG4、NOTCH1_C163A、NOTCH1_PTPRF。

CAR诱导和细胞毒性测定

CAR诱导测定：在U型底96孔TC板中，将1 × 10⁴个表达启动受体的原代T细胞以1:3 (E:T)的比率与K562-ALPG细胞共培养，以评估CAR诱导情况。与靶细胞共培养72小时后，通过流式细胞术测量诱导的CAR gMFI。

细胞毒性测定：在U型底96孔TC板中，将1 × 10⁴个表达启动受体的原代T细胞以1:1 (E:T)的比率在异质靶细胞条件(2.5% ALPG/MSLN细胞、97.5%仅MSLN细胞)中共培养，以评估细胞毒性。48小时后，将共培养物溶解并使用Pherastar微孔板读数仪，通过荧光素酶报告基因测定进行分析。

CAR诱导及细胞毒性结果示于图7中。选择具有可变CAR诱导情况的命中结果进行进一步分析。显示敏感杀伤的高诱导物包括NOTCH1_TMIG3、IRAG1_CD2、NOTCH1_C163A、IRAG1_NOTCH1、DISP1_NOTCH2和NOTCH1_PTPRF

CAR保真度

通过测量48小时共培养后靶细胞(K562-MSLN)中的荧光素酶来评估漏杀作用。在U型底96孔TC板中，将1 × 10⁴个表达启动受体的原代T细胞以1:1 (E:T)的比率与K562-MSLN靶细胞共培养48小时。将共培养物溶解，并使用Pherastar微孔板读数仪，通过荧光素酶报告基因测定进行分析。

保真度结果示于图8中。四种变体在两个不同的T细胞供体中具有特别高的保真度(低脱靶杀伤作用)：APP_DAG1、ZP1_NOTCH1、SIGL9_C163A、IRAG1_CD2。

选定变体的细胞毒性比较测定

选择由初始阵列筛选鉴定的一系列新颖TMD和JMD候选物进行进一步头对头比较。在U型底96孔TC板中，将1 × 10⁴个表达启动受体的原代T细胞以1:1的比率与100%的K562-ALPG/MSLN细胞、5%的K562-ALPG/MSLN和95%的K562-MSLN细胞或0%的K562-ALPG/MSLN (例如100%的K562-MSLN)荧光素酶表达细胞共培养。48小时后，将共培养物溶解，并使用Pherastar微孔板读数仪，通过荧光素酶报告基因测定进行分析。

通过选定的启动受体观察到不同水平的异质杀伤作用(图9)。NOTCH1_TMIG3在5%的K562-ALPG/MSLN条件下表现出最高水平的异质杀伤作用，但在0%的K562-ALPG/MSLN条件下也表现出漏杀。

CAR诱导与基础杀伤

CAR诱导测定：在U型底96孔TC板中，将1 × 10⁴个表达启动受体的原代T细胞以1:3 (E:T)的比率与K562-ALPG细胞共培养，以评估CAR诱导情况。与靶细胞共培养72小时后，通过流式细胞术测量诱导的CAR gMFI。

细胞毒性测定：在U型底96孔TC板中，将1 × 10⁴个表达启动受体的原代T细胞以1:1 (E:T)的比率在异质靶细胞条件(2.5% ALPG/MSLN细胞、97.5%仅MSLN细胞)中共培养，以评估细胞毒性。48小时后，将共培养物溶解并使用Pherastar微孔板读数仪，通过荧光素酶报告基因测定进行分析。

结果示于图10中。从阵列筛选2中的一小部分变体中观察到三种不同的表型。PLXC1_EPHA1表现出非常高的保真度(低基础细胞毒性)和低诱导作用。IRAG1_C163A表现出低基础细胞毒性和高CAR诱导作用。NOTCH1_TMIG3表现出高基础细胞毒性和高CAR诱导作用。选择这三种变体进行下游表征。

活细胞杀伤测定

随时间测量活细胞杀伤情况，以比较具有IRAG1_C163A和PLXC1_EPHA1 TMD/JMDs的启动受体与Notch1_extNotch1启动受体(阳性对照)的杀伤动力学。未编辑的T细胞(RNP)用作另外的对照。使用两种靶细胞系：RPMI-ALPG/MSLN和RPMI-MSLNhi。将表达启动受体的原代T细胞以1:1(E:T)的比率与25×10⁴个RPMI-8226-EFG-ALPG/MSLN(vLo/Hi)靶细胞共培养，以评估靶向杀伤灭作用。另外，通过将25×10⁴个RPMI-8226-EFG-MSLN(Hi)靶细胞与表达启动受体的原代T细胞以1:3的E:T比率孵育来评估基础杀伤作用。通过Incucyte测量的GFP强度随时间的变化来评估细胞杀伤作用。

如图11中所示，IRAG1_C163A启动受体对靶细胞的靶向杀伤作用与Notch1_extNotch1启动受体对RPMI-ALPG/MSLN细胞的杀伤作用相当。IRAG1_C163A启动受体在脱靶条件下(RPMI-MSLNhi细胞)也表现出更高的保真度。PLXC1_EPHA1启动受体阻止肿瘤细胞增殖，但与Notch1_extNotch1启动受体相比，其靶向杀伤作用较低。PLXC1_EPHA1启动受体表现出相当大的保真度，与未编辑T细胞(RNP对照)的杀伤匹配。

利用组成型受体测定法确定活细胞杀伤作用

使用同样表达启动受体(截短型EGFR，EGFRt)下游大型组成型蛋白的T细胞重复进行活细胞杀伤测定。所述测定是按以上描述进行。

随着时间的推移测量活细胞杀伤情况，以比较在启动受体下游表达大型组成型蛋白的启动受体变体的杀伤动力学。Notch1_extNotch1启动受体用作基准对照。不希望受理论束缚，已证明包括大型组成性表达的蛋白质可降低启动受体的表达和CAR诱导作用。如图12中所示，与Notch1_extNotch1启动受体基准相比，高诱导性NOTCH1_TMIG3启动受体表现出改善的靶向杀伤力，而漏杀情况并未相应增加。

表1提供了新颖启动受体的额外特征的概述。

总之，汇总筛选产生了超过20对TMD/JMD，其保真度超过基准Notch样启动受体(Notch1_extNotch1)。这些新颖启动受体对以不同水平诱导CAR，由此可形成未来基因回路调谐的工具箱。阵列筛选揭示出多个新的TMD/JMD对，它们具有更高的保真度和与基准受体相当的杀伤作用。发现一种新颖的TMD/JMD对PLXC1_EPHA1，它具有出色的特异性和略微降低的CAR诱导能力。IRAG1_C163A也表现出高特异性和与Notch1_extNotch1基准对照相当的CAR诱导能力。

不希望受理论束缚，添加下游组成性表达的蛋白质可以提高T细胞存活率，但也可能减少回路中其他蛋白质的表达。筛选得到的多种新颖JMD使具有这种额外组成型蛋白的回路中的CAR诱导和细胞毒性能力增加，超过了基准水平。

不希望受理论束缚，这些新颖启动受体TMD/JMD对允许在未来的细胞治疗产品中进行基因回路调谐。高保真度启动受体可以通过限制脱靶杀伤来提高这些产品的安全性，并且可用于诱导有效载荷，所述有效载荷如果全身递送则可能有毒，但如果局部递送，则安全且强效。不希望受理论束缚，高诱导性启动受体可允许具有额外蛋白质组分的更大基因回路，例如促进T细胞存活和增殖的组成型受体。

虽然已经尤其参考优选实施方案和各种替代实施方案示出和描述了本发明，但相关领域的技术人员应理解，可在其中进行形式和细节的各种变化而不偏离本发明的精神和范围。

在本说明书的主体内引用的所有参考文献、授权专利和专利申请都出于所有目的据此以引用的方式整体并入。

非正式序列表

Claims (87)

1.一种启动受体，所述启动受体在N末端至C末端方向上包含：

a. 任选地，对抗原具有结合亲和力的细胞外抗原结合结构域；

b. STS、SNORC、SEM4F、MCP、PLAT2、MMEL1、PLXC1、CSTN2、SIGL9、IRAG1、TIGIT、TNR21、ZP3、SUSD4、DCBD1、HMR1、DISP1、IRPL1、ECSCR或PLXC1跨膜结构域(TMD)，所述TMD包含一个或多个抗原诱导型蛋白水解裂解位点；以及

c. 包含人或人源化转录效应物的细胞内结构域，其中所述抗原与所述细胞外抗原结合结构域的结合导致在所述一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处裂解。

2.如权利要求1所述的启动受体，所述启动受体还包含PLXA2、NPTN、ALK、DSCAM、CD2、EPHA1、ERMAP、ERBB2、CEA20、KIRR1、C163A、PTPRF、CSPG4、SLAF1、TMIG3、NOTCH1或NOTCH2近膜结构域(JMD)。

3.一种启动受体，所述启动受体在N末端至C末端方向上包含：

a. 任选地，对抗原具有结合亲和力的细胞外抗原结合结构域；

b. 跨膜结构域，所述跨膜结构域包含一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点；

c. PLXA2、NPTN、ALK、DSCAM、CD2、EPHA1、ERMAP、ERBB2、CEA20、KIRR1、C163A、PTPRF、CSPG4、SLAF1或TMIG3近膜结构域(JMD)；以及

d. 包含人或人源化转录效应物的细胞内结构域，其中所述抗原与所述细胞外抗原结合结构域的结合导致在所述一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处裂解。

4.如权利要求3所述的启动受体，所述启动受体还包含STS、SNORC、SEM4F、MCP、PLAT2、MMEL1、PLXC1、CLSTN1、CSTN2、SIGL9、IRAG1、TIGIT、TNR21、ZP3、SUSD4、DCBD1、IRAG1、HMR1、DISP1、IRPL1、ECSCR、PLXC1或NOTCH1跨膜结构域，所述跨膜结构域包含一个或多个抗原诱导型蛋白水解裂解位点。

5.一种启动受体，所述启动受体在N末端至C末端方向上包含：

a. 任选地，对抗原具有结合亲和力的细胞外抗原结合结构域；

b. STS、SNORC、SEM4F、MCP、PLAT2、MMEL1、PLXC1、CLSTN1、CSTN2、SIGL9、IRAG1、TIGIT、TNR21、ZP3、SUSD4、DCBD1、HMR1、DISP1、IRPL1、ECSCR、PLXC1或NOTCH1跨膜结构域，所述跨膜结构域包含一个或多个抗原诱导型蛋白水解裂解位点；

c. PLXA2、NPTN、ALK、DSCAM、CD2、EPHA1、ERMAP、ERBB2、CEA20、KIRR1、C163A、PTPRF、CSPG4、SLAF1、TMIG3、NOTCH1或NOTCH2近膜结构域(JMD)；以及

d. 包含人或人源化转录效应物的细胞内结构域，其中所述抗原与所述细胞外抗原结合结构域的结合导致在所述一个或多个配体诱导型蛋白水解裂解位点处裂解。

6. 如权利要求1至5中任一项所述的启动受体，其中所述跨膜结构域包含SEQ ID NO:1-21中的至少一者中所示的序列。

7. 如权利要求1至6中任一项所述的启动受体，其中所述近膜结构域包含SEQ ID NO:22-39中的至少一者中所示的序列。

8.如权利要求1至7中任一项所述的启动受体，其中所述跨膜结构域和所述近膜结构域包含以下至少一个组合：NOTCH1-PLXA2、CLSTN1-CD2、NOTCH1-NPTN、NOTCH1-ALK、SNORC-NOTCH1、SEM4F-NOTCH2、STS-NOTCH2、MCP-NOTCH1、DCBD1-NOTCH2、IRAG1-C163A、HMR1-NOTCH1、MCP-NOTCH1、DISP1-NOTCH2、IRPL1-NOTCH1、ECSCR-NOTCH1、NOTCH1-PTPRF、NOTCH1-CSPG4、SEM4F-NOTCH2、IRAG1-CD2、SIGL9-CD2、IRAG1-NOTCH1、NOTCH1-SLAF1、NOTCH1-TMIG3、NOTCH1-C163A和PLXC1-EPHA1。

9. 如权利要求8所述的启动受体，其中所述跨膜结构域和所述近膜结构域包含SEQ IDNO: 40-56中的至少一者中所示的序列。

10.如权利要求1至9中任一项所述的启动受体，其中所述细胞外抗原结合结构域是单克隆抗体、中和抗体、拮抗性抗体、激动剂抗体、多克隆抗体、无岩藻糖基化抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、全长抗体和scFv。

11.如权利要求10所述的启动受体，其中所述细胞外抗原结合结构域是scFv。

12.如权利要求1至11中任一项的启动受体，其中所述转录效应物结构域包含HNF1a/p65结构域或Gal4/VP64结构域。

13. 如权利要求12所述的启动受体，其中所述转录效应物结构域包含SEQ ID NO: 80、81或82中所示的序列。

14.如权利要求1至13中任一项所述的启动受体，其中所述启动受体还包含定位于第一细胞外抗原结合结构域与第一跨膜结构域之间的第一铰链结构域。

15.如权利要求14所述的启动受体，其中所述铰链结构域包含CD8α铰链结构域或截短的CD8α铰链结构域。

16. 如权利要求1至15中任一项所述的启动受体，其中所述启动受体包含SEQ ID NO:281-300中的至少一者中所示的序列。

17. 如权利要求1至16中任一项所述的启动受体，其中在所述细胞外抗原结合结构域与所述抗原结合后，所述启动受体诱导嵌合抗原受体(CAR)的表达。

18. 一种包含第一嵌合多肽和第二嵌合多肽的系统，其中

a. 所述第一嵌合多肽包含权利要求1至17中任一项所述的启动受体；并且

b. 所述第二嵌合多肽包含嵌合抗原受体(CAR)，所述CAR包含第二细胞外抗原结合结构域。

19.如权利要求18所述的系统，其中所述CAR从N末端至C末端包含：

a. 所述第二细胞外抗原结合结构域；

b. 第二跨膜结构域；

c. 任选地，细胞内共刺激结构域；和

d. 细胞内激活结构域。

20.如权利要求18或19中任一项所述的系统，其中所述CAR包含第二铰链结构域。

21.如权利要求20所述的系统，其中所述第二铰链结构域包含CD8α铰链结构域或截短的CD8α铰链结构域。

22.如权利要求18至21中任一项所述的系统，其中所述第二跨膜结构域包含CD8α跨膜结构域。

23.如权利要求18至22中任一项所述的系统，其中所述细胞内共刺激结构域包含4-1BB结构域。

24.如权利要求18至23中任一项所述的系统，其中所述细胞内激活结构域包含CD3ζ结构域。

25.如权利要求18至24中任一项所述的系统，其中所述系统还包含自切除2A肽(P2A)。

26.如权利要求18至25中任一项所述的系统，其中所述P2A位于所述嵌合抗原受体的C末端。

27.如权利要求18至36中任一项所述的系统，其中所述P2A位于所述启动受体的C末端。

28.如权利要求18至36中任一项所述的系统，其中所述启动受体与靶细胞上第一抗原的结合将诱导所述启动受体的激活和所述嵌合抗原受体的表达，并且其中所述嵌合抗原受体与靶细胞上第二抗原的结合将调节免疫细胞的活性。

29.如权利要求28所述的系统，其中所述靶细胞是人体细胞。

30.如权利要求28或29所述的系统，其中所述靶细胞是癌细胞。

31.如权利要求30所述的系统，其中所述癌症是实体癌症或液体癌症。

32.如权利要求30或31所述的系统，其中所述癌症是卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、子宫癌、间皮瘤、宫颈癌或胰腺癌。

33.一种重组核酸系统，所述重组核酸系统包含至少一个编码权利要求1至17中任一项所述的启动受体的核苷酸序列。

34.一种重组核酸系统，所述重组核酸系统包含至少一个编码权利要求18至32中任一项所述的系统的核苷酸序列。

35.如权利要求34所述的重组核酸，其中所述重组核酸系统包含诱导型启动子，所述诱导型启动子可操作地连接至编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列。

36.如权利要求34或35所述的重组核酸，其中所述重组核酸系统还包含组成型启动子，所述组成型启动子可操作地连接至编码所述启动受体的核苷酸序列。

37.如权利要求34至36中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸系统还包含可操作地连接至编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列的诱导型启动子和可操作地连接至编码所述启动受体的核苷酸序列的组成型启动子。

38.如权利要求34至37中任一项所述的重组核酸，其中所述核酸系统在5’至3’方向上包含：

a. 所述组成型启动子；

b. 编码所述启动受体的核苷酸序列；

c. 所述诱导型启动子；和

d. 编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列。

39.如权利要求34至37中任一项所述的重组核酸，其中所述核酸在5’至3’方向上包含：

a. 所述诱导型启动子；

b. 编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列；

c. 所述组成型启动子；和

d. 编码所述启动受体的核苷酸序列。

40.如权利要求34至39中任一项所述的重组核酸，其中所述核酸系统还包含与宿主细胞染色体中的插入位点互补的5'同源定向修复臂和3'同源定向修复臂。

41.如权利要求34至40中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸系统还包含自切除2A肽(P2A)。

42.如权利要求34至41中任一项所述的重组核酸，其中所述P2A在所述嵌合抗原受体的3’端。

43.如权利要求34至42中任一项所述的重组核酸，其中所述P2A在所述启动受体的3’端。

44.如权利要求34至43中任一项所述的重组核酸，其中所述重组核酸系统还包含土拨鼠肝炎病毒翻译后调控元件(WPRE)。

45.如权利要求44所述的重组核酸，其中所述WPRE在编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列的3’端且在编码所述启动受体的核苷酸序列的5’端，或者其中所述WPRE在编码所述启动受体的核苷酸序列的3’端且在编码所述嵌合抗原受体的核苷酸序列的5’端。

46.如权利要求34至45中任一项所述的重组核酸，其中所述核酸系统被并入表达盒和/或表达载体中。

47.如权利要求46所述的重组核酸，其中所述表达载体是非病毒载体。

48.一种非病毒载体，所述非病毒载体包含权利要求34至47中任一项所述的重组核酸系统。

49.如权利要求48所述的非病毒载体，其中所述重组核酸系统的5’端和3’端包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与侧接细胞，任选地原代细胞的基因组中的插入位点的基因组序列同源。

50.如权利要求49所述的非病毒载体，其中所述插入位点在T细胞受体α恒定区(TRAC)基因座或基因组安全港(GSH)基因座处。

51.一种免疫细胞，所述免疫细胞包含：

a. 权利要求1至17中任一项所述的启动受体；

b. 权利要求18至32中任一项所述的系统；

c. 权利要求33至47中任一项所述的重组核酸系统；和/或

d. 权利要求48至50中任一项所述的非病毒载体。

52.如权利要求51所述的细胞，其中所述免疫细胞是原代人免疫细胞。

53.如权利要求51或52所述的细胞，其中所述原代免疫细胞是自体免疫细胞。

54. 如权利要求52至53中任一项所述的细胞，其中所述原代免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞、T细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、原代T细胞或T细胞祖细胞。

55.如权利要求52至54中任一项所述的细胞，其中所述原代免疫细胞是原代T细胞。

56.如权利要求52至55中任一项所述的细胞，其中所述原代免疫细胞是原代人T细胞。

57.如权利要求52至56中任一项所述的细胞，其中所述原代免疫细胞不含病毒或不包含用于引入所述重组核酸系统的病毒载体。

58.如权利要求52至57中任一项所述的细胞，还包括从患者获得所述免疫细胞以及在体外引入所述系统、所述重组核酸系统和/或所述非病毒载体中。

59.一种原代免疫细胞，所述原代免疫细胞包含至少一种重组核酸，所述至少一种重组核酸包含：启动受体，所述启动受体包含细胞外抗原结合结构域；STS、SNORC、SEM4F、MCP、PLAT2、MMEL1、PLXC1、CSTN2、SIGL9、IRAG1、TIGIT、TNR21、ZP3、SUSD4、DCBD1、HMR1、DISP1、IRPL1、ECSCR或PLXC1跨膜结构域，所述跨膜结构域包含一个或多个抗原诱导型蛋白水解裂解位点；近膜结构域(JDM)，和转录因子；以及插入所述原代免疫细胞的基因组靶区中的嵌合抗原受体，并且其中所述原代免疫细胞不包含用于将所述重组核酸引入所述原代免疫细胞中的病毒载体。

60.一种原代免疫细胞，所述原代免疫细胞包含至少一种重组核酸，所述至少一种重组核酸包含：启动受体，所述启动受体包含细胞外抗原结合结构域、包含一个或多个抗原诱导型蛋白水解裂解位点的跨膜结构域、PLXA2、NPTN、ALK、DSCAM、CD2、EPHA1、ERMAP、ERBB2、CEA20、KIRR1、C163A、PTPRF、CSPG4、SLAF1或TMIG3近膜结构域(JDM)，和转录因子；以及插入所述原代免疫细胞的基因组靶区中的嵌合抗原受体，并且其中所述原代免疫细胞不包含用于将所述重组核酸引入所述原代免疫细胞中的病毒载体。

61.一种原代免疫细胞，所述原代免疫细胞包含至少一种重组核酸，所述至少一种重组核酸包含：启动受体，所述启动受体包含细胞外抗原结合结构域；STS、SNORC、SEM4F、MCP、PLAT2、MMEL1、PLXC1、CLSTN1、CSTN2、SIGL9、IRAG1、TIGIT、TNR21、ZP3、SUSD4、DCBD1、HMR1、DISP1、IRPL1、ECSCR、PLXC1或NOTCH跨膜结构域，所述跨膜结构域包含一个或多个抗原诱导型蛋白水解裂解位点；PLXA2、NPTN、ALK、DSCAM、CD2、EPHA1、ERMAP、ERBB2、CEA20、KIRR1、C163A、PTPRF、CSPG4、SLAF1、TMIG3、NOTCH1或NOTCH2近膜结构域(JDM)，和转录因子；以及插入所述原代免疫细胞的基因组靶区中的嵌合抗原受体，并且其中所述原代免疫细胞不包含用于将所述重组核酸引入所述原代免疫细胞中的病毒载体。

62.一种无病毒的活原代细胞，所述原代细胞包含核糖核蛋白复合物(RNP)-重组核酸复合物，其中所述RNP包含核酸酶结构域和向导RNA，其中所述重组核酸包含：启动受体，所述启动受体包含STS、SNORC、SEM4F、MCP、PLAT2、MMEL1、PLXC1、CLSTN1、CSTN2、SIGL9、IRAG1、TIGIT、TNR21、ZP3、SUSD4、DCBD1、HMR1、DISP1、IRPL1、ECSCR、PLXC1或NOTCH1跨膜结构域，所述跨膜结构域包含一个或多个抗原诱导型蛋白水解裂解位点；PLXA2、NPTN、ALK、DSCAM、CD2、EPHA1、ERMAP、ERBB2、CEA20、KIRR1、C163A、PTPRF、CSPG4、SLAF1、TMIG3、NOTCH1或NOTCH2近膜结构域(JDM)，和转录因子；以及嵌合抗原受体，并且其中所述重组核酸的5’端和3’端包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与侧接所述原代细胞的基因组中的插入位点的基因组序列同源。

63.一种细胞群体，所述细胞群体包含多个如权利要求51至62中任一项所述的免疫细胞。

64.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求51至62中任一项所述的免疫细胞或权利要求63所述的细胞群体，以及药学上可接受的赋形剂。

65.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求33至47中任一项所述的重组核酸或权利要求48至50中任一项所述的非病毒载体，以及药学上可接受的赋形剂。

66.一种编辑免疫细胞的方法，所述方法包括：

a. 提供核糖核蛋白复合物(RNP)-重组核酸复合物，其中所述RNP包含核酸酶结构域和向导RNA，其中所述重组核酸包含权利要求33至47中任一项所述的重组核酸，并且其中所述重组核酸的5’端和3’端包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与侧接所述免疫细胞的基因组中的插入位点的基因组序列同源；

b. 以非病毒方式将所述RNP-重组核酸复合物引入所述免疫细胞中，其中所述向导RNA与所述原代免疫细胞的基因组的靶区特异性杂交，并且其中所述核酸酶结构域裂解所述靶区以产生所述免疫细胞的基因组中的所述插入位点；以及

c. 通过将权利要求33至47中任一项所述的重组核酸插入所述免疫细胞的基因组中的所述插入位点中来编辑所述免疫细胞。

67.如权利要求66所述的方法，其中所述非病毒方式引入包括电穿孔。

68.如权利要求66或67所述的方法，其中所述核酸酶结构域包含CRISPR相关核酸内切酶(Cas)，任选地Cas9核酸酶。

69.如权利要求66至68中任一项所述的方法，其中所述细胞的基因组的所述靶区是T细胞受体α恒定区(TRAC)基因座或基因组安全港(GSH)。

70.如权利要求66至69中任一项所述的方法，其中所述重组核酸是双链重组核酸或单链重组核酸。

71.如权利要求66至70中任一项所述的方法，其中所述重组核酸是线状重组核酸或环状重组核酸，任选地其中所述环状重组核酸是质粒。

72.如权利要求66至71中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是原代人免疫细胞。

73.如权利要求66至72中任一项所述的细胞，其中所述原代免疫细胞是自体免疫细胞。

74. 如权利要求66至73中任一项所述的方法，其中所述原代免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞、T细胞、CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、原代T细胞或T细胞祖细胞。

75.如权利要求66至74中任一项所述的方法，其中所述原代免疫细胞是原代T细胞。

76.如权利要求66至75中任一项所述的方法，其中所述原代免疫细胞是原代人T细胞。

77.如权利要求66至76中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞是不含病毒的。

78.如权利要求66至77中任一项所述的方法，所述方法还包括从患者获得所述免疫细胞以及在体外引入所述重组核酸。

79.一种治疗受试者的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求51至63中任一项所述的免疫细胞或者权利要求64或65所述的药物组合物。

80.如权利要求79所述的方法，其中所述疾病是癌症。

81.如权利要求80所述的方法，其中所述癌症是实体癌症或液体癌症。

82.如权利要求79或80所述的方法，其中所述癌症是卵巢癌、输卵管癌、原发性腹膜癌、子宫癌、间皮瘤、宫颈癌或胰腺癌。

83.如权利要求79至82中任一项所述的方法，所述方法还包括在施用所述免疫细胞的同时或在施用所述免疫细胞之后，向所述受试者施用免疫疗法。

84.一种杀伤、失能、耗竭或抑制受试者体内的靶细胞的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求51至63中任一项所述的免疫细胞，其中所述免疫细胞杀死、失能、耗竭或抑制所述靶细胞。

85.如权利要求83或84所述的方法，其中所述靶细胞是癌细胞。

86.一种诱导免疫细胞中嵌合抗原受体与启动受体的表达的方法，所述方法包括：

a. 获得免疫细胞，所述免疫细胞包含：

i. 权利要求18至32中任一项所述的系统；

ii. 权利要求33至47中任一项所述的重组核酸；和/或

iii. 权利要求48至50任一项所述的非病毒载体；以及

b. 使所述免疫细胞与靶细胞接触，所述靶细胞表达针对所述启动受体的第一抗原，其中所述启动受体与在所述靶细胞上第一抗原的结合将诱导所述启动受体的激活和所述嵌合抗原受体的表达。

87.一种调节免疫细胞的活性的方法，所述方法包括：

a. 获得免疫细胞，所述免疫细胞包含：

i. 权利要求18至32中任一项所述的系统；

ii. 权利要求33至47中任一项所述的重组核酸系统；和/或

iii. 权利要求48至50任一项所述的非病毒载体；以及

b. 使所述免疫细胞与靶细胞接触，所述靶细胞表达第一抗原和第二抗原，其中所述启动受体与在所述靶细胞上的所述第一抗原的结合将诱导所述启动受体的激活和所述嵌合抗原受体的表达，并且其中所述嵌合抗原受体与在所述靶细胞上的所述第二抗原的结合将调节所述免疫细胞的活性。